Роль пероксиредоксина в регенерационных процессах в верхних дыхательных путях при термической травме

Мубаракшина, Эльвира Кашифовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль пероксиредоксина в регенерационных процессах в верхних дыхательных путях при термической травме
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль пероксиредоксина в регенерационных процессах в верхних дыхательных путях при термической травме"

На правах рукописи

МУБАРАКШИНА ЭЛЬВИРА КАШИФОВНА

РОЛЬ ПЕРОКСИРЕДОКСИНА В РЕГЕНЕРАЦИОННЫХ ПРОЦЕССАХ В ВЕРХНИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЯХ ПРИ ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМЕ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

' 9 НОЯ 2СиЗ

Пущино 2009

Работа выполнена в лаборатории механизмов рецепции Учреждения Российской академии наук Института биофизики клетки РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Новоселов Владимир Иванович

Официальные оппопеиты: доктор биологических наук Гордон Рита Яковлевна доктор биологических наук, Куликов Александр Владимирович

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение

«Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий», (ФГУ РКНПК Росмедтехнологий), г.Москва

Защита диссертации состоится «26» ноября 2009 года в «14.00» часов на заседании диссертационного совета Д.002.038.01 в ИБК РАН по адресу: 142290 г. Пущино Московской области, Институтская ул. 3, ИБК РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН, г. Пущино.

Автореферат разослан «26» сентября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

' Т.И.Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Термическая травма дыхательных путей или ингаляционный ожог относится к категории наиболее тяжелых заболеваний, которые характеризуются сложной цепью общих и местных нарушений. Ингаляционные ожоги встречаются довольно часто и составляют от 3 до 21% от всех ожоговых больных и являются одной из главных причин летальных исходов. Соответственно, поиск эффективных способов лечения данных патологий является одной из актуальных проблем современной медицины.

В ингаляционном ожоге выделяют три основные составляющие, которые вызывают разные патологии и действуют на разные мишени. Это отравление токсинами, вдыхание твердых частиц продуктов горения и, наконец, собственно термический ожог. Если первым двум факторам уделено большое количество исследований, то исследования по термической составляющей ожога дыхательных путей практически отсутствуют.

Известно, что термический фактор (горячий воздух, пар и т.д.) приводит к массовой гибели клеток уже на первой стадии развития патологий, что приводит к развитию мощного окислительного стресса в пораженной ткани [Меныцикова Е.Б. и др. 2008]. В данном случае на первый план выступают собственные антиоксидантные системы защиты, которые должны нейтрализовать избыточную токсичность активных форм кислорода (АФК). Таким образом, исследование функционирования этих ангиоксидантных систем является одним из важных моментов в понимании механизмов развития патологических процессов во время термического ожога. Другим аспектом этого вопроса является проблема уменьшения патологических процессов, а именно, возможность влияния на эффективность антиоксидантной системы для уменьшения последствий термического ожога. Таким образом, в случае термической травмы проблема исследования антиоксидантных систем является особо актуальной.

В случае верхних дыхательных путей антиоксидантная система представлена набором антиоксидантных ферментов, основным из которых является пероксиредоксин 6 (Ргхб). Вклад Ргхб в нейтрализацию АФК в трахее составляет 70% [Новоселов В.И. и др. 1999,2003]. Следует особо отметить, что он способен нейтрализовать неорганические и органические гидропероксиды, а также пероксинитриты. Таким образом, будучи основным антиоксидантом в дыхательных путях, Ргхб определяет поведение антиоксидантной системы в целом.

-3-

а!., 2008.], а также его терапевтическая роль при лечении ран кожи. [Новоселов В.И. и др. 2000, 2003.]. Поэтому исследования по влиянию Ргхб на развития патологического процесса при термической травме является актуальным с медицинской точки зрения. Цель и задачи исследования

Целью данной работы является комплексное исследование термического ожога верхних дыхательных путей, которое включает в себя структурные и биохимические исследования эпителия верхних дыхательных путей. Особое внимание уделено роли Ргхб в регенерационных процессах пораженного эпителия верхних дыхательных путей при термической травме. Задачи:

1. Разработка экспериментальной модели контролируемой термической травмы верхних дыхательных путей с воспроизводимыми параметрами степени поражения эпителия.

2. Разработка методов оценки степени поражения эпителиальных тканей и определение ключевых факторов, участвующих в регенерационных процессах пораженного эпителия.

3. Выявление роли Ргхб в регенерационных процессах пораженного эпителия и возможность его использования в качестве основного компонента лекарственных препаратов противоожогового действия.

Научная новизна

Впервые показано, что при термическом ожоге верхних дыхательных путей происходит активация антиоксидантной системы, характеризующаяся повышенной экспрессией Ргхб на стадии острого воспалительного процесса. Показана ведущая роль бокаловидных клеток эпителия трахеи в защите клеток эпителия от окислительного стресса, которая проявляется в повышенной секреции Ргхб, активирующейся после термической травмы. Введение Ргхб в верхние дыхательные пути (аппликация Ргхб в трахею) способствует уменьшению воспалительного процесса, вызванного термическим ожогом.

Научно-практическая ценность

Результаты данной работы могут быть использованы в медицинской практике при лечении ожогов верхних дыхательных путей. 1) Мониторинг содержания Ргхб в верхних дыхательных путях может указывать на степень развития окислительного стресса в трахее и бронхах. 2) Положительный эффект Ргхб на уменьшение воспалительного процесса может быть основой для создания лекарственных препаратов противоожогового действия.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференция молодых ученых и II школе им. Академика Н.М. Эммануэля. (Москва, 2006), XV международной конференции и дискуссионного научного клуба "Новые информационные технологии в

медицине, биологии, фармакологии и экологии" (Гурзуф, 2007), 11-ой международной Пущинской школе - конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2007), IV Крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Крым, 2008), на Всероссийской конференции молодых ученых «Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты» им. академика Н.М. Эммануэля (Москва, 2008), на 12-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2008).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе, 2 статьи в реферируемых журналах.

Структура н объём диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего ✓"'^источников. Работа изложена нах^^страницах машинописного текста и содержит-З^рисунков и С? таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы.

В работе использовали крыс линии Вистар массой 180-220 г.

В экспериментах по исследованию эффектов пероксиредоксина использовался рекомбинантный человеческий Ргхб, полученный в лаборатории механизмов рецепции ИБК РАН. Данный Ргхб имеет пероксидазную активность и субстратную специфичность, эквивалентную соответствующим характеристикам натурального Ргхб крысы, и не является цитотоксичным.

Кроличьи поликлональные антитела к Ргхб получены в лаборатории механизмов рецепции ИБК РАН, моноклональные антитела к цитокинам и соответствующие коньюгаты фирмы «USBiological», США.

Реактивы для гистологии и иммуногистохимии, а также основные реактивы для биохимических исследований фирмы «Sigma», США, или марки х.ч.

Методы.

Термический ожог верхних дыхательных путей. Животных анестезировали хлорал гидратом (30 мг/100 г веса), фиксировали на препарационном столике, с помощью специального расширителя раздвигали челюсти, под контролем бинокулярной лупы и подсветки в переднюю часть трахеи вводили тонкий зонд от микропарогенератора МПГ-1-05 (разработка ИБК РАН, автор Санталов Б.Ф.) на расстояние 2-3 мм от начала трахеи и

проводили ожог эпителия трахеи (рис. 1). Параметры микропарогенератора - мощность нагревателя - 10 вт; температура пара - 70°С; расход воды - 1 мкл/сек, что соответствует ЗД мл пара с секунду. Время экспозиции 1-30 сек.

Программная система

управления

Источник питания

Электропитание

Рис. 1. Схема устройства МПГ-1-05.

Вола

Насос

Вола

Во вставке - схема введения капилляра в трахею при термическом ожоге.

Проточный испаритель

Капилляр

Трахея

Тефлоновый . капилляр

| Пар

При аппликации в трахею после термического ожога использовали рекомбинантный человеческий Ргхб в концентрации 2 мг/мл, вводимый объем составил 200 мкл (общее количество вводимого Ргхб - 400 мкг на животное).

Через определенное время животных усыпляли (5,5-диэтилбарбитуровая кислота, доза 1,4 г на кг, ip) и выделяли трахею. Для проведения иммуногистохимических и гистологических исследований трахею делили на три части: верхнюю, среднюю и нижнюю. Для проведения биохимических исследований использовался соскоб эпителия трахеи. Тонким шпателем соскабливали верхний слой трахеи (эпителий), смывали 400 мкл фосфатного буфера, полученную суспензию центрифугировали при 14 000 оборотов в течение 10 минут и замораживали до последующего анализа. Анализ всех проб одной серии проводились одномоментно.

Гистологические и илтуногистохимические исследования. Для гистологических и иммуногистохимических методов использовали парафиновые срезы (2-5 мк). Подготовка материала для последующего исследования проводилась по стандартным методам. Срезы получали на микротоме Thermoelectron Corparation (UK). Анализ проводили на световом микроскопе СХ41 (OLYMPUS), срезы фотографировали с помощью цифрового фотоаппарата OLYMPUS и затем изображение обрабатывали на компьютере в программе ImageScope S и Photoshop.

Определение цитокинов и Ргх 6. Цитокины и Ргхб определяли иммуноферментным анализом (ИФА) по стандартному методу с использованием политональных антител к Ргхб и моноклональных коммерческих антител к цитокинам.

Для идентификации Ргхб использовали иммуноблоттинг белков соскоба эпителия трахеи.

Мечение Ргх б флуоресцентным красителем TRITC. Мечение Ргх 6 проводили в 0.1 М карбонатном буфере с помощью тетраметилродамин изоционат хлорид (5(6)-TRITC, mixed isomer, Германия) в соотношении к белку 1:50 в течение 2 часов при комнатной температуре. Несвязанный TRITC отделяли с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-50 (Pharmacia, Швеция) на колонке для мини гель-фильтрации и количество связанного с Ргх 6 TRITC определяли с помощью флуоресценции.

Инактивация Ргхб гидропероксидом водорода. Инактивацию Ргхб проводили 3 мМ раствором гидропероксида водорода в течение часа. Свободный Н202 отделяли с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-50. Степень инактивации Ргхб определяли по его пероксидазной активности. В этих условиях степень инактивации Ргхб составила 100%.

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДДС, иммуноблоттинг и определение концентрации белка проводили стандартными методами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Модель локальной термической травмы верхних дыхательных путей

При разработке модели термической травмы необходимо было стандартизовать основные параметры ожога - это степень ожога и воспроизводимость. Стандартизация ожога была достигнута применением микропарогенератора Mill -1-05, в котором использовался нагретый водяной пар с дозированной по времени экспозиции подачи пара. Подачу нагретого пара проводили непосредственно в трахею наркотизированного животного путем введения в трахею выходного капилляра микропарогенератора (см. Методы). Механического повреждения трахеи не наблюдалось, что было подтверждено последующими гистологическими исследованиями.

Расчеты показывают, что использование данного парогенератора обеспечивает прогревание слоя ткани толщиной 0,1 мм до 60-70 градусов в течение секунды, что соответствует толщине респираторного эпителия.

Согласно расчетам и испытаниям парогенератора было исследовано разное по времени воздействие пара. Степень повреждения определяли по морфологической картине полученных препаратов, что являлось основным критерием оценки состояния эпителиальной ткани.

В норме трахея состоит из слизистой оболочки, где выделяют эпителий и собственную пластинку, слизистая с помощью тонкого подслизистого слоя связана с хрящевой оболочкой (рис.2.). В реснитчатом эпителии различают реснитчатые клетки, бокаловидные, которые составляют 5-10 % от всех клеток эпителия и базальные клетки (Схема. Рис.2). При анализе полученных препаратов показано, что ожог в течение 2 секунд

-7-

вызывает частичное разрушение слизистой оболочки трахеи и наблюдается повышенная секреция бокаловидных клеток, что является защитным механизмом дыхательной системы при повреждении и различных патологиях.

мукоцнлиарный транспорт

1 2

а Ы

[^20

• «ч

,С1

» 34

20 мкм •

20 мкм -

Рис.2. 1- Схема строения реснитчатого эпителия трахеи. Реснитчатый эпителий представлен реснитчатыми, бокаловидными и базальными клетками. В подслизистом слое располагаются слизисто-белковые железы. 2 - Контроль (необожженная трахея), где А - слизистая оболочка трахеи, в которой выделяют эпителий (а) и собственную пластинку (Ь). В - подслизистый слой, где расположены слизисто-белковые железы ((1). С - Фиброзно-хрящевая оболочка. 3 -Изменения структуры реснитчатого эпителия после ожога паром в течение 2 секунд. Стрелочками отмечены секретирующие бокаловидные клетки. 4 - Изменения структуры реснитчатого эпителия после ожога паром в течение 4 секунд.

При экспозиции паром в 4 секунды наблюдаются более значительное повреждение ткани. Эпителий разрушен практически полностью до собственной пластинки, в других частях эпителий уплощается, становится более тонким. В сохранной области усилена секреция бокаловидных клеток. Надо отметить, что благодаря сложной форме внутренней стенки трахеи остаются участки с несильными повреждениями, а иногда и сохранные. Более длительное время экспозиции вызывало сильное повреждение эпителия.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в рассматриваемой модели термического ожога наиболее адекватным временем воздействия пара на трахею, при котором можно рассматривать динамику состояния трахеи, является 4 секунды. Таким образом, была создана экспериментальная модель для исследования ожога верхних

дыхательных путей средней степени тяжести. И все дальнейшие эксперименты проводились при экспозиции пара в течение 4 секунд.

Цитокиновый профиль. Воспалительная реакция сопровождается высвобождением медиаторов воспаления: гуморальными, поступающими из плазмы крови и клеточными, содержащиеся в цитоплазме клеток или вырабатываемыми в ответ на стимуляцию моноцитами, макрофагами, тучными клетками, гранулоцитами, лимфоцитами, тромбоцитами и др. клетками (биогенные амины). Так как наши исследования проводились только на трахее, то мы исследовали только клеточные медиаторы, а именно цитокины. Соответственно, был проведен анализ динамики уровня цитокинов провоспалительных и антивоспалительных цитокинов в период острой фазы воспаления в течении четырех недель (рис.3).

пкг 800 -

600 -

400

200

Контр 1 нед 2 нед 3 нед 4 нед В ИЛИ ПИЛ-4 ЕЗИЛ-6 ОИЛ-8 ИИЛ-10 Ш ФНО-а

Рис.3. Динамика уровня экспрессии цитокинов в соскобе эпителия трахеи после термической травмы. Результаты представлены в количестве цитокинов на мг общего белка соскоба трахеи.

С помощью иммуноферментного анализа в соскобе эпителия трахеи были исследованы цитокины, которые чаще всего используется в медицине: ИЛ 1, ИЛ 4, ИЛ 6, ИЛ В, ИЛ 10 и ФНО-а. Как видно их графика, уровень ИЛ 1, ИЛ 4, ИЛ 6, и ФНО-а остается примерно одинаковым на протяжении всего месяца после ожога и практически не отличается от контроля, что нельзя сказать о уровне ИЛ 8 и ИЛ 10. В контроле ИЛ 8 практически отсутствует, а в течение месяца после ожога его количество увеличивается и остается на

одном уровне, что говорит о продолжающемся воспаление, так как ИЛ 8 является медиатором острой фазы воспаления и мощным хемоаттрактантом и активатором гранулоцитов, моноцитов [Ройт А. и др. 2000, Грачева Л.А. 1996, Baggioliш М., 1992]. Также на протяжении четырех недель после ожога значительно меняется уровень ИЛ 10, который функционирует в противоположном направлении по сравнению с ИЛ-8 и не позволяет перейти воспалительному процессу в неконтролируемое состояние [Грачева Л.А. 1996.]. Соответственно, в дальнейшем мы определяли уровень именно данных цитокинов, как наиболее информативных и отражающих развитие воспалительного процесса.

Динамика экспрессии Ргхб в трахее после термического ожога. Одновременно проводился анализ состояния антиоксидантной системы (АОС) по уровню содержания Ргхб, который является основным антиоксидантом в трахее и бронхах и его поведение фактически показывает поведение АОС [Новосёлов В.И. и др., 2000; Кравченко И.Н. и др., 2000 Новосёлов В.И. и др., 1999].

Рис.4. Иммуногистохимия эпителия трахеи после термического ожога. 1 - контроль; 2 -через сутки после ожога, 3 - через неделю после ожога; 4 - через 2 недели после ожога. Иммуногистохимическое исследование с помощью поликлональных антител к рекомбинантному Ргхб, конъюгат - антикроличьи [§(} с щелочной фосфатазой. Стрелками отмечены секретирующие бокаловидные клетки.

На рис.4 представлены данные по иммуногистохимии эпителия трахеи после термического ожога. Как видно на рисунке, Ргхб локализован преимущественно в бокаловидных клетках эпителия, что хорошо согласуется с ранее высказанных предположениях том, что именно бокаловидные клетки являются основным источником Ргхб. Эта локализация Ргхб в бокаловидных клетках респираторного эпителия сохраняется через сутки, неделю и две

недели после ожога в более сохранных участках эпителия, причем данные клетки при иммуногистохимическом окрашивании интенсивно выявляют Ргхб.

118,0 85,0

47,0 6Л)

20,0

1,2 1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

мкг

2 3 4

Контр 1 нед 2 нед 3 нед 4 нед

Рис.5. Иммуноблоттинг белков соскоба эпителия трахеи до и после термического ожога. Слева - белковые маркеры. 1, 2, 3 - контроль (необожженная трахея); 4, 5 — через сутки после ожога.

Выявление Ргхб проводили с помощью кроличьих поликлональных антител к Ргхб, окрашивание - щелочная фосфатаза.

Рис.6. Уровень экспрессии Ргх б в эпителии трахеи при термическом ожоге с течением времени. Контроль - необожженное животное; через 1 неделю после ожога; через 2 недели после ожога; через 3 недели после ожога; через 4 недели после ожога. Количество Ргхб отнесено к мг общего бежа соскоба эпителия трахеи. N=30

Одновременно иммуноблоттинг белков трахеи показал резкое увеличение количества Ргхб в эпителии уже через сутки после ожога (примерно в два раза относительно контроля, рис.5). Более того, иммуноферментный анализ показал, что высокий уровень Ргхб (в несколько раз выше, чем в контроле) в эпителии трахеи сохраняется, по крайней мере, в течение месяца (рис.б). Это свидетельствует о том, что Ргхб является основным антиоксидантом, вовлеченным в нейтрализацию АФК, образующихся в период воспалительного процесса после ожога.

Влияние экзогенного Ргхб на состояние эпителиальной ткани после термического ожога верхних дыхательных путей

Как было показано выше, резкое увеличение количества Ргхб в первые моменты после ожога свидетельствует о развитие мощного окислительного стресса в эпителии трахеи. По всей видимости, количество собственного Ргхб является недостаточным для нейтрализации вновь образующихся АФК и, соответственно, в настоящей работе была предпринята попытка повысить уровень АОС путем введения экзогенного Ргхб. Следует отметить, что после термического ожога верхних дыхательных путей у крысы развивается сильный отек тканей гортани и трахеи, что не позволяет проводить многократные аппликации Ргхб на первых

стадиях воспалительного процесса. В настоящей работе мы вынуждены были применять однократное введение препаратов Ргхб до развития отека (непосредственно после ожога). С другой стороны, именно введение Ргхб сразу после ожога усиливает АОС в период, когда наблюдается наиболее массовая гибель клеток. В экспериментах использовался рекомбинантный человеческий Ргхб.

Локализация апплицированного Ргхб в пораженной трахее. Для доказательства, того что введенный Ргхб локализован непосредственно в трахеи обожженного животного, было проведено исследование по определению локализации введенного в просвет трахеи меченого Ргхб. (Следует отметить, что введение Ргхб в трахею проводилось под строгим контролем, в противном случае не исключена возможность его введение в пищевод, который находится рядом с трахеей.) Контролем являлась необожженная трахея, где видно, что введенный Ртх б локализуется в основном в слизи, покрывающей клетки эпителия (рис.7).

Рис.7. Локализация апплицированного Ргх б в пораженной трахее. (А) Контроль -необожженная трахея животного, (В) поврежденная трахея животного. Меченый Ргхб вводили в трахею через 50 минут после термического ожога. Выделение трахеи через 20 минут после введения меченого Ргхб. Исследования проводили с помощью конфокального микроскопа Carl Zeiss, (Германия). Флюорохром - TRITC. хбОО.

В случае обожженной трахеи при сильно поврежденном эпителиальном слое меченый белок обнаруживается как между клетками разрушенного эпителия, так и на поверхности базальной мембраны. Полученные данные свидетельствуют о том, что введение Ргхб достигает своей цели, а именно Ргхб находится в поврежденных участках эпителия трахеи и таким образом может защищать клетки поврежденного эпителия от дальнейшего разрушения, вызванного окислительным стрессом.

Эффект аппликации Ргхб в пораженные верхние дыхательные пути. Так как динамика воспалительного процесса в трахее после ожога определяется динамикой уровня цитокинов ИЛ 8 и ИЛ 10, была исследована динамика уровня цитокинов ИЛ 8, ИЛ 10 после

аппликации Ргхб в трахею. Чтобы доказать, что эффект Ргхб будет связан с его пероксидазной активностью были поставлены следующие контроли:

1. введение физраствора, что соответствует процедуре промывки трахеи и бронхов, которая обязательно используется в медицинской практике в ближайшее время после ожога;

2. введение альбумина, что определяет реакцию эпителия на чужеродный белок;

3. введение инактивированного Ргхб, не обладающего пероксидазной активностью; Результаты по влиянию введения физраствора и альбумина в обожженную трахею на

уровень ИЛ В представлены на рис.8. Как видно из рисунка, оба введенных препаратов существенно не влияют на динамику роста количества ИЛ 8. Уровень ИЛ 10 также практически не менялся. Эти данные указывают на то, что как промывка обожженного эпителия физраствором, так и введение нейтрального белка не оказывает существенного влияния на развитие воспалительного процесса в трахее.

20 15 Н 10

5 -\ 0

пкг

□ физ.раствор ■ альбумин

В 800

пкг

□ физ. раствор Ш альбумин

1ч

4ч

10ч 24ч

1ч

4ч

10ч 24ч

Рис.8. Эффект апплицированных физиологического раствора и альбумина на уровень экспрессии ИЛ 8 (А) и ИЛ 10 (В). Результаты представлены в количестве цитокинов на мг общего белка соскоба трахеи.

■ Ргхб ■ неактРгхб

1ч

4ч

10ч 24ч

1ч

4ч

10ч 24ч

Рис.9. Эффект апплицированного Ргхб на уровень экспрессии ИЛ 8 (А) и ИЛ Ю (В). Результаты представлены в количестве цитокинов на мг общего белка соскоба трахеи.

Принципиально другие результаты были получены при аппликации Ргхб в обожженную трахею. В случае введения Ргхб уровень ИЛ 8 был в 2-3 раза меньше в первые

исследованные времена по сравнению с введением физраствора и альбумина, что свидетельствует о сильном уменьшении воспалительного процесса по сравнению с приведенными контролями. Следует отметить, что и инактивированный Ргхб также показал существенно лучшие результаты по сравнению с физраствором и альбумином, хотя и значительно меньшим, чем для активного Ргхб. Аналогичные результаты были получены и для ИЛ 10, что также свидетельствует об уменьшении воспалительного процесса. Положительный эффект инактивированного Ргхб связан, по-видимому, с тем, что его инактивация не была полностью необратимой. Кроме того, как показано в последнее время, Ргхб обладает фосфолипазной активностью, не связанной с его пероксидазной активностью. Возможно, что именно эта активность также может быть вовлечена в противоспалительный процесс, что требует дополнительных исследований. Таким образом, введение Ргх б в трахею в ранние сроки после ожога существенно уменьшает воспалительный процесс.

Время нахождения экзогенного Ргхб в пораженной трахее. С целью доказательства, что именно экзогенный Ргхб в течение всего начального процесса воспаления влияет на течение воспалительного процесса, было определено время нахождения экзогенного Ргхб в пораженной трахее. На рис. 10 представлены данные по количеству Ргхб в соскобе пораженной трахеи после введения экзогенного Ргхб.

Рис.10. Количество суммарного Ргхб (собственного и введенного) в трахее. 1 час после ожога; 4 часа после ожога; 10 часов после ожога; 24 часа после ожога. N=12

Результаты представлены в количестве Ргхб на мг общего белка соскоба трахеи.

Как видно на рисунке, даже через 10 часов после аппликации Ргхб в обожженную трахею, его количество составляет 50% от введенного. То есть в течение всего этого времени мы наблюдаем повышенное содержание Ргхб. Следует отметить, что в данных экспериментах измеряется суммарный Ргхб, как собственный, так и апшшцированный. Повышение количества Ргхб в трахее через 24 часа свидетельствует об усиленном синтезе собственного Ргхб клетками эпителия трахеи, как было показано ранее.

Влияние экзогенного Ргхб на изменение структуры поврежденной эпителиальной ткани трахеи с течением времени. Динамика экспрессии цитокинов после введения экзогенного Ргхб свидетельствует об уменьшение воспалительного процесса. Для

1,8 1 1,6 "

подтверждения этого эффекта были проведены гистологические исследования структуры трахеи. Были исследованы изменения, происходящие в слизистой и подслизистой трахеи в интервале времени от 1 до 4 недель после травмы и введения Ргхб.

Анализ структуры эпителия обожженной трахеи. Через неделю после ожога наблюдаем патологические изменения, отражающие воспаление: расширение сосудистой сети, увеличение проницаемости сосудов и капилляров с выходом форменных элементов крови в эпителиальный пласт, некроз значительного количества клеток цилиндрического эпителия. На сохраненных участках слизистой секретируют бокаловидные клетки. Через 4 недели также наблюдаются все признаки воспаления (Рис.11).

Рис.11. Изменение

^ТК^МГГКСС ^^ структуры

= ¡"С . эпителиальной и

•>. ЗйЕК подслизистои

_ ч V-^ ' V) о - '! V • оболочки после

"V ^ :. «ГУ» ' •*"*■» '- -.:«» ■ - " ожога. А - Через

V. \ - .....неделю после ожога-

-V- ^ ф* ^ ... _^ уу В - через 4 недели

Окрашивание: геметоксилин-эозин.

Рис. 12. Изменение структуры эпителиальной и подслизистой оболочки после ожога и введения инактивированного Ргхб. А - Через неделю после ожога. В - через 4 недели после ожога. Окрашивание: геметоксилин-эозин.

Анализ структуры гистолгических препаратов, с послеожоговым введением инактивированного Ргхб. Через неделю после ожога наблюдаются все признаки острого воспаления: сосуды расширены и переполнены кровью, воспалительный инфильтрат в подслизистом слое, в сосудах и в ткани хорошо видны нейтрофилы. Местами наблюдаются значительные повреждения подслизистого слоя, по-видимому, из-за отечности ткани. Много секретируюших бокаловидных клеток в сохранной части эпителия. После четырех недель менее выраженная сосудистая реакция при наличии признаков воспаления (РисЛ 2).

Анализ структуры гистологических препаратов после введения активного Ргхб. Через неделю после повреждения наблюдаются участки с некрозом ткани, но в целом

структурность ткани сохранена. Кроме того, расширение сосудов с выходом эритроцитов в ткань трахеи (рис. 13) и лимфоцитарный и нейтрофильный инфильтрат в подслизистом слое. Незначительная отечность ткани в данных образцах. В сохранной части эпителия наблюдаются секретирующие бокаловидные клетки. Через 4 недели картина не меняется: идет некроз клеток, расширение сосудистой сети. Но наблюдаются участки с регенерацией и пролиферацией реснитчатого эпителия.

А ' Рис.13. Изменение структуры

- Яг й эпителиальной и подслизистой оболочки после ожога и введения Ргхб.

Ш А-через неделю после ожога (I-

< " * секретирующая бокаловидная клетка; 2 -

* 'дЧР некроз ткани);

»»___ ' „ 0 1 ■' В - через четыре недели (I - некроз ткани;

у - / 2-расширение сосудистой сети.).

* *' / 1 Окрашивание - эозин-гематоксилин.

Сравнительный анализ показал, что введение Ргхб по сравнению с контрольными экспериментами снижает деструктивные явления в эпителиальной ткани, однако не полностью их предотвращает. Следует также отметить, что в данной экспериментальной модели было использовано однократное введение Ргхб, что, вероятно, не полностью нейтрализовало ОС в пораженной трахее.

Тем не менее, использование экзогенного Ргхб оказывает мощное противовоспалительное действие в случае термического ожога и он может быть использован в качестве основы лекарственных препаратов противоожогового действия.

Сравнительная характеристика эффекта преднизолона и Ргхб на поврежденный

эпителий трахеи

Так как предполагается использовать Ргхб в качестве препарата противоожогового действия, необходимо было сравнить его действие с теми препаратами, которые используется в медицинской практике при лечении больных с ожогами верхних дыхательных путей. В данных случаях медики широко применяют преднизолон -дегидрированный аналог гормона гидрокортизона. Влияние преднизолона на состояние

респираторного эпителия в нашей модели также оценивали по гистологическим препаратам обожженной трахеи в интервале времени от одной недели до четырех недель.

Структурный анализ, проведенный после ожога и введения преднизолона (Рис.14), показал признаки активного воспаления через неделю после ожога - сосудистая реакция с выходом лимфоцитов и нейтрофилов в подслизистый слой, гнойный детрит в просвете трахеи, некроз реснитчатого слоя. Однако степень нарушений меньше, чем в контрольных обожженных животных. Через четыре недели после повреждения видны признаки восстановления цилиарного эпителия, но наряду с восстанавливающимся эпителием сохраняются участки поврежденного эпителия. В сохранной части эпителиального покрова функционируют бокаловидные клетки. Таким образом, преднизолон действительно уменьшает воспалительный процесс в обожженной трахее.

Рис. 14. Изменение структуры эпителиальной и подслизистой оболочки после ожога и введения преднизолона. А - через неделю после ожога. В - через четыре недели. Окрашивание - эозин-гематоксилин.

Как свидетельствуют приведенные данные, влияние преднизолона и экзогенного Ргхб на состояние травмированного эпителия почти одинаково. В тоже время применение преднизолона имеет ряд побочных эффектов и противопоказаний в виду того, что он является гормональным препаратом. Для уменьшения побочных эффектов преднизолона, с нашей точки зрения, вполне возможно использовать сочетание Ргхб и преднизолона, что позволит снизить количество применяемого преднизолона при лечении.

Регенерация респираторного эпителия. Образование респираторно-подобных структур внутри эпителия поврежденной трахеи.

При анализе гистологических препаратов внутри эпителия поврежденной трахеи были обнаружены структурные образования, которые не наблюдались при других исследованных моделях патологического состояния респираторного эпителия (химический ожог, острое

воспаление, вызванного бактериальными эндотоксинами). Эти структуры разного размера и различных форм располагаются в подслизистой оболочке эпителиальной ткани трахеи. Из литературы известно, что в поврежденной ткани развивается гиперсекреция слизисто-белковых желез [Wang Ке et al, 2008], что и наблюдается в представленных ниже гистологических препаратах (Рис. 15 А, В). Гиперсекреция слизи слизисто-белковыми железами развивается при различных патологиях дыхательной системы, таких как астма, хронический бронхит и других и является одной из первых линий защиты в дыхательных путях. Увеличение секреции возможно благодаря пролиферации клеток внутри каждого секреторного ацинуса, нежели за счет увеличения количества самих желез [Rogers D.F. et al., 1994].

Рис.15. Образование респираторно-подобных структур внутри эпителия поврежденной трахеи. А - Увеличение слизисто-белковых желез (отмечено стрелочками). В - Слизь в просвете железы. С - Реснитчатые клетки в округлых структурах. Э - Увеличенные в размерах структуры и их слияние. Е - Выход структур в просвет трахеи.

Отличительной особенностью некоторых обнаруженных нами структур является присутствие отчетливо наблюдаемых реснитчатых клеток и секретирующих бокаловидных клеток (Рис.15 С). Данные структуры очень сильно увеличиваются в размерах, занимают большую площадь в подслизистом слое трахеи, кроме того, наблюдаются выход таких структур наружу (рис.15 Б, Е). Исходя из этих данных, мы сделали предположение, что таким образом, по крайней мере частично, происходит восстановление поврежденного многорядного реснитчатого эпителия, которое не наблюдается в других исследованных моделях патологии эпителия трахеи.

Процесс восстановления эпителия воздухоносных путей до конца не ясен. Почти у всех клеток эпителия есть способность пролиферировать в реснитчатые клетки, без которых не может выполняться основной защитный механизм — мукоцилиарный клиренс (ЪаШпеп Ь.А.е! а1,1994]. В литературе описывается восстановление эпителия за счет секреторных клеток, которые способны образовывать эпителий, состоящий из базальных клеток, секреторных и реснитчатых. Тогда как базальные клетки способны дифференцироваться только в базальные и реснитчатые клетки. В нашей модели на основании морфологического анализа препаратов при термическом ожоге верхних дыхательных путей наблюдается не только гиперсекреция слизисто-белковых желез, но и, по-видимому, восстановление эпителия за счет пролиферации и дифференциации секреторных клеток слизистых желез. Возможно, это один из способов восстановления реснитчатого эпителия в случае термической травмы.

Заключение

Как свидетельствуют приведенные данные, наиболее драматические события в эпителии трахеи происходят в ранние сроки после ожога. Именно в этот период (1-2 недели) происходит максимальная гибель клеток эпителия, появление макрофагов и других клеток, ответственных за защитные функции. В то же время, видимых процессов репарации клеток еще не наблюдается. Фактически, именно в этот период в эпителии активируются системы, которые определяют дальнейшее восстановление нормального функционирования клеток эпителия.

Приведенные выше данные указывают на то, что повышение эффективности антиоксидантной защиты респираторного эпителия после термического ожога, может существенно уменьшить степень тяжести поражения эпителия, по крайней мере, на первых стадиях развития патологических процессов в эпителии. Как показывают наши эксперименты, введение в трахею экзогенного Ргхб после ожога приводит к значительно более быстрому восстановлению эпителия. Более того, количество обнаруженных нами образующихся замкнутых структур в подслизистом слое трахеи возрастает при применении

Ргхб. Понижение уровня цитокинов ИЛ8 и ШЛО после введения экзогенного Ргхб при термическом ожоге свидетельствует об уменьшении воспалительного процесса, вызванного ожогом. Таким образом, экспериментально выявлен эффект применения Ргхб при термическом ожоге верхних дыхательных путей. Это совпадает с предыдущими результатами, когда использование Ргхб было эффективным при лечении химических ожогов верхних дыхательных путей, резаных ран и воспалительных процессов, вызванных бактериальными эндотоксинами, то есть, при различных патологиях, имеющих другую этиологию [Новоселов В.И. и др. 2000, 2003.].

При выборе стратегии лечебного процесса важно учитывать необходимость усиления эффективности антиоксидантных систем защиты, о чем свидетельствует использование Ргхб при лечении различных патологий. То, что именно антиоксидантная активность Ргхб является критической, подтверждают эксперименты с использованием инактивированного Ргхб, который дал существенно меньший эффект.

Среди различных антиоксидантов, которые могут применяться при лечении патологий в легких, Ргхб имеет ряд преимуществ. Во-первых, по сравнению с обычными низкомолекулярными антиоксидантами, он существенно эффективнее нейтрализует активные формы кислорода. В отличие от каталазы, Ргхб способен нейтрализовать как неорганические, так и органические гидропероксиды и, соответственно, будет более эффективен, чем каталаза. Глутатионпероксидаза для своего функционирования требует систему восстановления глутатиона, которая, ввиду существенно меньшего содержания глутатинпероксидазы в респираторном эпителии по сравнению с Ргхб, по-видимому, не сможет обеспечить эффективного функционирования экзогенной глутатионпероксидазы. В случае Ргхб, который является мажорным белком эпителия трахеи и бронхов, по всей видимости, в респираторном эпителии частично сохраняются, системы активации Ргхб, что позволяет ему эффективно функционировать. Таким образом, среди природных антиоксидантов, которые могут быть эффективны при лечении различных патологий верхних дыхательных путей, по-видимому, наиболее эффективным является Ргхб.

выводы

1. Разработана модель локального термического ожога трахеи с воспроизводимыми параметрами степени поражения эпителия.

2. Показано, что количество пероксредоксина 6 в трахее увеличивается в 2-5 раз на начальной стадии развития воспалительной реакции после термической травмы.

3. Показана ведущая роль бокаловидных клеток в нейтрализации окислительного стресса, которая проявляется в увеличение секреции пероксиредоксина 6 при повреждении эпителия верхних дыхательных путей.

4. Аппликация пероксиредоксина 6 в трахею в первые моменты после ожога вызывает уменьшение степени воспаления, которая проявляется в уменьшение количества ИЛ8 и ИЛ 10 и в большей сохранности эпителия трахеи.

5. Показана сравнительно одинаковая эффективность использования пероксиредоксина 6 и преднизолона на течение воспалительного процесса при термическом ожоге верхних дыхательных путей.

6. Показана возможность использования пероксиредоксина 6 в качестве основного компонента лекарственного препарата противоожогового действия.

7. Обнаружено образование внутри подслизистой оболочки трахеи специфических структур с клетками аналогичными клеткам, составляющим мерцательный эпителий. Данные структуры, по-видимому, участвуют в регенерации эпителия.

ПУБЛИКАЦИИ

1. Новоселов В.И., Мубаракшина Э.К... Янин В.А, Амелина С.Е., Фесенко Е.Е.. Вклад антиоксидантных систем при регенерации эпителия трахеи после термического ожога верхних дыхательных путей.//Пульмонология, 2008. Т. 6. С.80-83.

2. Сирота Т.В., Сафронова В.Г, Амелина С.Е., Мальцева В.Н., Ахвачева Н.В., Софии А.Д., Янин В.А., Мубаракшина Э.К.. Романова Л.К., Новоселов В.И. Действие отрицательных ионов воздуха на органы дыхания и кровь. // Биофизика. 2008. Т.53. №5, С.886-893.

3. Мубаракшина Э.К.. Амелина С.Е., Янин В.А., Новоселов В.И. Использование пероксиредоксина VI при лечении термических ожогов эпителиальных тканей // Медико-фармацевтический журнал. «Сибирский консилиум» Т.62. №7. 2007. С.61-62.

4. Мубаракшина Э.К.. Амелина С.Е. Термческая травма верхних дыхательных путей: окислительный стресс. В сб. "Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты". Всероссийская конференция молодых ученых и II школа им. Академика Н.М. Эмануэля. МосКва.2006. С.180-182.

5. Мубаракшина Э.К.. Янин В.А., Амелина С.Е., Новоселов В.И.. Лекарственные препараты антиоксидантного действия на основе пероксиредоксинов для лечения воспалительных

-21 -

процессов в респираторном тракте. В сб. "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" Материалы XV Международной конференции и дискуссионного научного клуба. Гурзуф, 2007. С.419-421.

6. Мубаракшина Э.К.. Амелина С.Е., Янин В.А., Новоселов В.И. "Выявление вклада ключевых факторов, участвующих в регенерационных процессах респираторного эпителия". В сб. "Биология наука XXI века". 11-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино 2007. С.264-265.

7. Шарапов М.Г., Мубаракшина Э.К.. Новоселов. В.И. Перспективы использования модифицированных пероксиредоксинов при лечении патологий, связанных с окслительным стрессом. В сб. "Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии" IV крымская конференция, Судак, Крым,Украина, 2008. С.38.

8. Мубаракшина Э.К.. Шарапов М.Г., Янин В.А., Новоселов В.И. Создание нового класса лекарственных препаратов антиоксидантного действия на основе пероксиредоксинов для лечения социально-значимых заболеваний. В сб. «Нейронаука для медицины и психологии», 2008. С.206-208.

9. Мубаракшина Э.К.. Янин В.А., Амелина С.Е., Новоселов В.И "Сравнительная оценка применения пероксиредоксина 6 с традиционными средстваими лечения термических ожогов" В сб. "Биология наука XXI века" 12-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, 2008. С. 142-143.

Подписано в печать:

23.10.2009

Заказ № 2829 Тираж - 90 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мубаракшина, Эльвира Кашифовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 Эпителий воздухоносных путей. Структура и функции

1.1 Носовая полость

1.2 Гортань

1.3 Трахея

1.4 Бронхи

1.5 Состав и функции секрета воздухоносных путей

2 Термические ожоги

2.1 Ингаляционные ожоги

2.3 Обструкция дыхательных путей

2.4 Острый респираторный дистресс синдром и бронхиальная циркуляция

2.5 Пневмония

3 Окислительный стресс при патологиях дыхательной системы

3.1 Источники активных форм кислорода

3.2 Антиоксидантная защита дыхательной системы 34 Супероксид дисмутазы (SODs) и каталаза (CAT) 35 Глутатион пероксидазы (GPxs) 36 Тиоредоксины (Trxs) 37 Пероксиредоксины 38 Каталитический цикл пероксиредоксинов 39 Пероксиредоксин 6 41 Антиоксидантная функция пероксиредоксина

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1 Материалы

2 Методы

2.1 Термический ожог верхних дыхательных путей крыс

2.2 Выделение Ргх 6 методом хроматографии Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-сефарозе

2.3 Приготовление срезов, залитых в эпоксидную смолу

2.4 Приготовление парафиновых срезов

2.5 Получение криосрезов

2.6 Иммуногистохимический анализ

2.7 Получение соскоба респираторного эпителия трахеи крыс

2.8 Определение цитокинов в соскобе трахеи крыс

2.9 Определение пероксиредоксина 6 в соскобе эпителия трахеи

2.10 Мечение пероксиредоксина 6 флуоресцентным красителем

2.11 Инактивация пероксиредоксина 6 гидропероксидом водорода

2.12 Ионнообменнная хромотография

2.13 Электрофорез белков

2.14 Иммуноблоттинг

2.15 Определение антиоксидантной активности пероксиредоксина

2.16 Определение концентрации белка 5 8 III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1 Разработка экспериментальной модели ожоговой травмы верхних дыхательных путей

1.1 Общее положение

1.2 Модель термического ожога верхних дыхательных путей с помощью пара

Изменения морфологии эпителия в результате ожога трахеи

Лейкоцитарная реакция

Динамика развития воспалительного процесса в эпителии

Цитокиновый профиль

Динамика экспрессии Ргхб в трахее после термического ожога

2 Влияние экзогенного Ргхб на состояние эпителиальной ткани после термического ожога верхних дыхательных путей

2.1 Локализация апплицированного Ргхб в пораженной трахее

2.2 Эффект аппликации Ргхб в пораженные верхние дыхательные пути

2.3 Определение введенного Ргхб в пораженной трахее

2.4 Влияние экзогенного Ргхб на изменение структуры поврежденной эпителиальной ткани трахеи с течением времени

Анализ структуры эпителия обожженной трахеи

Анализ структуры гистолгических препаратов, где после ожога вводили инактивированный Ргхб

Анализ структуры гистологических препаратов после введения активного Ргхб

3 Влияние преднизолона на состояние эпителиальной ткани после термического ожога верхних дыхательных путей. Сравнительная характеристика преднизолона и Ргхб

3.1 Преднизолон и его функции

3.2 Влияние преднизолона на состояние эпителиальной ткани после термического ожога паром. Анализ гистологических препаратов

3.3 Сравнительный анализ

4 Регенерация респираторного эпителия. Образование респираторно-подобных структур внутри эпителия поврежденной трахеи

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль пероксиредоксина в регенерационных процессах в верхних дыхательных путях при термической травме"

Известно, что термический фактор (горячий воздух, пар и т.д.) приводит к массовой гибели клеток респираторного эпителия уже на первой стадии развития патологий, что приводит к развитию мощного окислительного стресса в пораженной ткани [Меньщикова Е.Б. и др. 2008]. В данном случае на первый план выступают собственные антиоксидантные системы защиты, которые должны нейтрализовать избыточную токсичность активных форм кислорода (АФК). Таким образом, исследование функционирования этих антиоксидантных систем является одним из важных моментов в понимании механизмов развития патологических процессов во время термического ожога. Следует отметить, что данная проблема практически не изучена. Другим аспектом этого вопроса является проблема уменьшения патологических процессов, а именно, возможность влияния на эффективность антиоксидантной системы для уменьшения последствий термического ожога. Таким образом, в случае термической травмы органов дыхания проблема исследования антиоксидантных систем является особо актуальной.

В этом случае, исследования поведения Ргхб в верхних дыхательных путях в процессе развития патологического процесса при термическом ожоге представляет собой особый интерес. Более того, во многих работах показана защитная роль Ргхб при различных патологиях разных эпителиальных тканей [Kumin A. et al., 2006., Fisher А.В. et al., 2004., Kubo E. et al., 2008.], а также его терапевтическая роль при лечении ран кожи. [Новоселов В.И. и др. 2000, 2003.]. Поэтому исследования по влиянию Ргхб на развития патологического процесса при термической травме верхних дыхательных путей является актуальным с медицинской точки зрения.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мубаракшина, Эльвира Кашифовна

выводы

5. Показана сравнительно одинаковая эффективность использования пероксиредоксина б и преднизолона на течение воспалительного процесса при термическом ожоге верхних дыхательных путей.

6. Показана возможность использования пероксиредоксина б в качестве основного компонента лекарственного препарата противоожогового действия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Показано что повышение эффективности антиоксидантной защиты респираторного эпителия после термического ожога, может существенно уменьшить степень тяжести поражения эпителия, по крайней мере, на первых стадиях развития патологических процессов в эпителии. Как показывают наши эксперименты, введение в трахею экзогенного пероксиредоксина 6 влияет на развитие воспаления, особенно в первые моменты после повреждения, когда воспалению сопутствует мощный окислительный стресс и процессы восстановления эпителия проявляются раньше, чем в просто пораженном эпителии. Более того, количество обнаруженных нами образующихся замкнутых структур в подслизистом слое трахеи возрастает при применении Ргхб. Понижение уровня цитокинов ИЛ8 и ИЛ 10 после введения экзогенного Ргхб при термическом ожоге свидетельствует об уменьшении воспалительного процесса, вызванного ожогом. Таким образом, экспериментально выявлен положительный эффект применения Ргхб при термическом ожоге верхних дыхательных путей. Это совпадает с предыдущими результатами, когда использование Ргхб было эффективным при лечении химических ожогов верхних дыхательных путей, резаных ран и воспалительных^ процессов, вызванных бактериальными эндотоксинами, то есть, при различных патологиях, имеющих другую этиологию [Новоселов В.И. и др. 2000, 2003.].

При выборе стратегии лечебного процесса важно учитывать необходимость усиления антиоксидантных систем защиты, о чем свидетельствует положительный эффект применения Ргхб в различных моделях повреждения верхних дыхательных путей. То, что именно антиоксидантная активность Ргхб является критической, подтверждают эксперименты с использованием инактивированного Ргхб, который дал существенно меньший эффект.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мубаракшина, Эльвира Кашифовна, Пущино

1. Карваял Х.Ф. Парке Д.Х. Ожоги у детей: Пер. с англ. М.: Медицина, 1990.-512 с.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства (Пособие для врачей). Вдвух частях. — 12Le изд., перераб. И доп. М.: Медицина, 1993. 736 с.

3. Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З., Труфакин В.А. Окислительный- стресс: Патологические состояния и заболевания. Новосибирск: АРТА. 2008. 284 с.107

4. Назаров И.П., Мацкевич В.А., Колегова Ж.Н., Артемьев С.А., Таран Т.С. Ожоги. Интенсивная терапия: учебное пособие. Ростов н /Д.: Феникс; Красноярск: Издательские проекты. Высшее образование. 2007. 416 с.

5. Новоселов В.И., Амелина С.Е., Кравченко И.Н., Новоселов С.В., Янин В.А., Садовников В.Б., Фесенко Е.Е. Роль пероксиредоксина VI в- антиоксидантной системе органов дыхания. // Доклады Академии наук. 2000; 375:831-833.

6. Палеев Н.Р. Болезни органов дыхания. / М.: Медицина, 2000.-728 с. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ.- М.:Мир, 2000. 592 с.

7. Саркисов Д.С., Перов Ю.Л. Микроскопическая техника: Руководство. М.: Медицина, 1996. 544 с.

8. Хэм А., Кормак Д. Гистология. Москва, Мир, 1983. Шарапов М.Г., Новоселов В.И., Равин В.К. Клонирование, экспрессия и сравнительный анализ пероксиредоксинов 6 различного происхождения.// Молекулярная биология, 2009; (43)3:505-511.

9. Шарапов М.Г., Равин В.К. Пероксиредоксин 6 шпорцевой лягушки Xenopus laevis: клонирование кДНК, характеристика фермента и экспрессия гена во время развития. // Биохимия, 2009; (74)8:1103-1108.

10. Abdi S., Herndon D. М., Traber L. D. et al. Lung edema formation following inhalation injury: role of the bronchial blood flow. // J. Appl. Physiol. 1991;71:727-743

11. Austin C, Wang D, Ecobrichon D, Dussault G. Characterization of volatile organic compounds in smoke at experimental fires.// J Toxicol Environ Health A. 2001;63:191-206.

12. Bauer V., Bauer F. Reactive oxygen species as mediators of tissue protection and injury.// Gen Physiol Biophys. 1999; 18:7-14.109

13. Birky, M. M., and F. В. Clarke. Inhalation of toxic products from fires. // Bull. N. Y. Acad. Med. 1981; 57:997-1013.

14. Cantin A.M., North S.L., Hubbard R. C., Crystal R.G. Normal alveolar epithelium lining fluid contains high levels of glutation. // J.Appl. Physiol. 1987; 63:152-157.

15. Chang J.W., Jeon H.B., Jeung H.L., Yoo J.S., Chun J.S., Kim J.H., Yoo Y.J. Augmented expression of peroxiredoxin 1 in lung cancer // Biochem Biophys Res Commun 2001; 289(2):507-512.

16. Coraux С., Roux J., Jolly T. and Birembaut P. Epithelial Cell

17. Extracellular Matrix Interactions and Stem Cells in Airway Epithelial

18. Regeneration // ProcAm Thorac Soc 2008; 5:689-694.

19. Cox R.A., Burk A.S., Soejima K.,et al Airway obstruction in sheep withburne and smoke inhalation injuries. // Am J Respir Cell Mol Biol 2003;29:295-302.

20. Cross C.E., Van der Vliet A., O'Neill C.A. et al. Oxidants, antioxdants, and respiratory tract linig fluids.// Environ. Health Perpect. 1994; 102:10. 185-191.

21. Davis B. W., et al. Pulmonary oxygen toxicity: Early reversible changes in human alveolar structures induced by hyperoxia. // N Engl J Med , 1983; 309:878-882.

22. Demling R. H. Smoke Inhalation Lung Injury: An Update // 2008 (http://www.eplasty.com)

23. Demling R.H., DeSanti L., Orgill D.P. Pulmonary problems in the burnpaitient (http://www.burnsurgery.org/Modules/pulmonary/sec 1 .htm)

24. Demling, R. H., C. LaLonde, Y. P. Liu, and D. G. Zhu. 1989. The lunginflammatory response to thermal injury: relationship betweenphysiologic and histologic changes. Surgery 106:52—59

25. Dickinson D. A., Forman H. J. Cellular glutathione and thiolsmetabolism. // Biochem Pharmacol 2002; 64:1019-26.

26. Dirk C., Brown D., Donaldson K., Stone V. The role of fire radicals in thetoxic and inflammatory effects of four different ultrafine particle types. //1.hal Toxicol. 2003; 15:550—2.

27. Douglas A.N. Quantitative study of bronchial mucous gland enlargement. // Thorax 1980; 35: 198-201'.

28. Dreyfuss D., Martin-Lfevre L., Saumon G. Hyperinflation-induced lunginjurymduring alveolar flooding in rats: effect of perfluorocarboneinstillation. II Am J Respir Crit Care Med 1999; 159:1752-1757.1.l

29. Enkhbaatar P., Traber D.L. Pathophysiology of acute lung injury in combined burn and smoke inhalation injury. // Clinical Science 2004; 107: 137-143.

30. Fraser R. G., Pare J. A. R. Diagnosis of diseases of the chest. 3rded. Philadelphia, Saunders. 1990:1973

31. Harkema JR, Hotchkiss JA. In vivo effects of endotoxin on intraepithelial mucosubstances in rat pulmonary airways. Quantitative histochemistry. // Am J Pathol 1992; 141:307-317.112

32. Harper D.R., Ming-Liu К., Kangro H.O. protein blottingA ten years on. // J of Virilogical methods 1990; 30:20-31

33. Herndon, D. N., F. Langner, P. Thompson, H. A. Linares, M. Stein, and D. L. Traber. Pulmonary injury in burned patients. // Surg Clin N Am 1987; 67:31-46.

34. Hemdon, D. N., F. Langner, P. Thompson, H. A. Linares, M. Stein, and D. L. Traber. Pulmonary injury in burned patients. // Surg. Clin. N. Am. 1987; 67:31-46.

35. Hill IR. Reactions to particles in smoke. // Toxicology 1996; 115(1-3):119-122.

36. Jeffery P.K. and Li D. Airway mucosa: secretory cells, mucus and mucin genes. // Eur Respir J1997; 10:1655-1662.

37. Jeffery PK, Reid L. The effect of tobacco smoke with or without phenylmethyloxadiazole (PMO) on rat bronchial epithelium: a light and electron microscopic study. IIJ Pathol 1981; 133:341—359.

38. Johnson N.F. Epithelial progenitor cells in rat trachea. // Am J Respir Cell MolBiol 1990;3:579-585

39. Jones J., McMullen J., Daugherty J. Toxic smoke inhalation: cyanide poisoning in fire victims. // Am JEmerg Med. 1987; 5:318-24. Kaliner M.A. Human nasal respiratory secretions and host defense.// Am Rev Respir Dis 1991; 144:52-56.

40. Kaloudovd Y., Brychta P., Rfhovd H., Suchanek I., Hruba J., SeidlovA D., Hrazdfrovd A., Kubalek V. Inhalation injury // Acta 2000; 42: 115118.

41. Kang S. W., Baines I. C., RJiee S. G. Characterization of a mammalian peroxiredoxin that contains one conserved cysteine. // J. Biol. Chem. 1998; 273:6303- 6311.

42. Kim K., Kim I.H., Lee K.Y., RJiee S.G., Stadtman E.R. The isolation and purification of specific "protector" protein which inhibits enzyme inactivation by a thiol/Fe(III)/02 mixed-function oxidation system // J. Biol. Chem. 1988; 263:4704-4711.

43. Kim, H. S., Manevich, Y., Feinstein, S. I., Рак, J. H., Ho, Y. S.; Fisher, A. B. Induction of 1-cys peroxiredoxin expression by oxidative stress in lung epithelial cells. II Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2003; 285:363369.

44. Kinnula V. L., Thorax. Focus on antioxidant enzymes and antioxidant strategies in smoking related airway diseases // Thorax. 2005; 60(8): 693700.

45. Madjdpour C., Jewell U.R., Knell S. et al. Decreased alveolar oxygen induces lung inflammation. // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2003; 284:360-367.

46. Maksimenko A.V. Experimental antioxidant biotherapy for protection of the vascular wall by modified forms of superoxide dismutase and catalase. // Curr Pharm Des 2005; 11:2007-2016.

47. Mall M.A. Role of cilia, mucus, and airway surface liquid in mucociliary dysfunction: lessons from mouse models. // J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 2008;21(l):13-24.

48. Manevich, Y.; Feinstein, S. I.; Fisher, A. B. Activation of the antioxidant enzyme 1-CYS peroxiredoxin requires glutathionylation mediated by heterodimerization with pi GST. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004; 101:3780-3785.

49. McCall, J. E., Cahill T. J. Respiratory care of the burn patient. // J. Burn Care Rehabil 2005; 26:200-206.

50. McDowell E. M., Becci P. J., Schurch W., Trump B.F. The respiratory epithelium. VII. Epidermoid metaplasia of hamster tracheal epithelium during regeneration following mechanical injury. // J Natl Cancer Inst 1979; 62:995-1008.

51. McDowell E. M., Trump B. F. Conceptual review: histogenesis of preneoplastic and neoplastic lesions in tracheo-bronchial epithelium. // Sur Synth Pathol Res 1983; 2: 235-279.

52. McDowell E.M., Beals T.F. Biopsy pathology of the bronchi. Philadelphia: WB Saunders Company: 1987.

53. McGill, V., A. Kowal-Vern, R. L. Gamelli. Outcome for older burn patients. II Arch Surg 2000;135:320-325.

54. Mitsumoto, A.; Takanezawa, Y.; Okawa, K.; Iwamatsu, A.; Nakagawa, Y. Variants of peroxiredoxins expression in response to hydroperoxide stress. Free Radic. Biol. Med. 2001; 30:625- 635.

55. Moritz A. R., Henniques F. C., McLean R. The effect of inhaled heat on the air passages of the lungs: an experimental investigation. // Am J Pathol 1945; 21:311-331.

56. Nakae H., Tanaka H. Failure to clear cast and secretions following inhalation injury can be dangerous: report of a case. II Burn 2001; 27:189191.

57. Niederman, M. S. Therapy of ventilator-associated pneumonia: what more can we do to use less antibiotics? // Crit. Care Med. 2004; 32:23442345.

58. Pruitt, B. A., Jr., W. G. Cioffi, T. Shimazu, H. Ikeuchi, and A. D. Mason, Jr. Evaluation and management of patients with inhalation injury. // J. Trauma 1990; 30:63-68.

59. Pryer W. Biological effects of cigarette smoke, wood smoke, and the smoke from plastics: the use of electron spin resonance. // Free Radio Biol Med 1992; 13:659-76.

60. Puchelle E., Zahm J., Tournier J. and Coraux C. Airway epithelial repair, regeneration, and remodeling after injury in chronic obstructive pulmonary disease. // The Proceedings of the American Thoracic Society 2006; 3:726-733.

61. Ramzy, P. I., D. N. Hemdon, S. E. Wolf, O. Irtun, J. P. Barret, R. J. Ramirez, and J. P. Heggers. Comparison of wound culture and bronchial lavage in the severely burned child: implications for antimicrobial therapy. II Arch. Surg. 1998; 133:1275-1280.

62. Rliee S.G. H202, a necessary evil for cell signaling // Science. 2006; 312: 1882-1883.

63. Rhee S.G., Bae Y.S., Lee S.-R., Kwon J. Hydrogen peroxide: a key messenger that modulates protein phosphorylation through cysteine oxidation I/Sci. STKE 2000; 53:1-6.

64. Soini Y., Napankangas U., Jarvinen K. et al. Expression of gamma-glutamyl cysteine synthetase in nonsmall cell lung carcinoma. // Cancer 2001;92:2911-2919.

65. Sparling, N. E.; Phelan, S. A. Identification of multiple transcripts for antioxidant protein 2 (Aop2): differential regulation by oxidative stress and growth factors. // Redox Rep. 2003; 8:87- 94;.

66. Spicer S. S., Mochizuki I., Setser M. E., et al. Complex carbohydrates of rat tracheobronchial surface epithelium visualized ultrastructurally. // Am JAnat 1980; 158: 93-103.

67. Spicer S.S., Schulte B.A., Chakrin L.W. Ultrastructural and histochemical observations of respiratory epithelium and gland. // Lung Res 1983; 4:137-156.

68. Teixidor H. S., Novick G., Rubin E. Pulmonary complications in burnpatients. I IJ Can Assoc Radio 1983;3 4:264-270. Thompson P., Herndon D., et al. Effect on mortality of inhalation injury. // Trauma. 1986; 26:163-165.

69. Tiitto L., Kaarteenaho-Wiik R., Sormunen R. et al. Expression of thethioredoxin system in interstitial lung disease. // J Pathol 2003; 201:363-370.

70. Tiitto L.H., Peltoniemi M. J., Kaarteenaho-Wiik R. L. et al. Cell-specific regulation of gamma-glutamylcysteine synthetase in human interstitial lung diseases. // Hum Pathol 2004; 35:832-839.

71. Traber D. L., Herndon D. N., Soejima K. The pathopysiology of inhalation injury. // In D. N. Herndon (ed.), Total burn care. Saunders, London, England. 2005;221-231.

Информация о работе

Мубаракшина, Эльвира Кашифовна
кандидата биологических наук
Пущино, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Роль пероксиредоксина в регенерационных процессах в верхних дыхательных путях при термической травме - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы