Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние эпителий-протекторных белков на регенерационные процессы в эпителиальных тканях

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние эпителий-протекторных белков на регенерационные процессы в эпителиальных тканях"

На правах рукописи С

Волкова Анастасия Геннадьевна

ВЛИЯНИЕ ЭПИТЕЛИИ-ПРОТЕКТОРНЫХ БЕЛКОВ НА РЕГЕНЕРАЦИОННЫЕ ПРОЦЕССЫ В ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ТКАНЯХ

03.01.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени Кандидата биологических наук

1 1 'рг /015

005561406

Пущино - 2015

005561406

Работа выполнена в Лаборатории механизмов рецепции Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биофизики клетки Российской академии наук и в Учебном центре "Биология клетки" Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Путинский государственный естественно-научный институт"

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Новосёлов Владимир Иванович

Научный консультант:

Доктор медицинских наук Темнов Андрей Александрович

Официальные оппоненты:

Ланкип Вадим Зиновьевич - доктор биологических наук, профессор, «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий лабораторией биохимии свободнорадикальных процессов.

Гудков Сергей Владимирович - доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, ведущий научный сотрудник лаборатории изотопных исследований.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук

Защита диссертации состоится « 2015 г. в \Ц ч. ЗОмин. на

заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ПНЦ РАН по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан «'£•?> 2015 г.

Учёный секретарь диссертациош Кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема регенерации эпителиальных тканей является одной из ключевых при лечении различных патологических состояний, в частности, повреждения эпителия трахей, бронхов, кишечника. Выявление основных факторов, влияющих на регенерационные процессы, необходимо для создания нового класса лекарственных препаратов эндотелий-протекторного типа.

Ожоги дыхательных путей относятся к категории наиболее тяжёлых патологий, поиск путей лечения травм этого вида - одна из актуальных проблем современной медицины. В 50% случаев ожогов дыхательных путей наблюдается летальный исход. В настоящее время в терапии ожогов органов дыхания самым распространённым и практически единственным лекарственным препаратом является преднизолон - дегидрированный аналог гидрокортизона, подавляющий активность лейкоцитов и макрофагов, что приводит к снижению воспаления. Лечение этим препаратом носит неспецифический характер и сопровождается рядом побочных эффектов: остеопороз, стероидная язва желудка, диабет и изменение массы тела и психического состояния. Кроме того, лечение преднизолоном не приводит к значительному ускорению регенерации эпителиальной ткани.

Одним из поражающих факторов, сопутствующих ингаляционным и многим другим травмам, является высвобождение сверхнормального количества активных форм кислорода (АФК). Лекарственные препараты антиоксидантного действия достаточно широко распространены, их базу составляют низкомолекулярные антиоксиданты, уступающие активностью ферментам-антиоксидантам. Данная работа может стать первым шагом к созданию лекарств на основе антиоксидантных ферментов, намного более эффективных, чем применяемые в настоящий момент препараты. Супероксид-анион и гидроперекиси являются первичными типами АФК. В соответствии с этим был сделан выбор антиоксидантов, включённых в исследование: Мп-ЗОБ, утилизирующая 02*, Ргхб, обладающий пероксидазной активностью, и химерный белок Р5Н, совмещающий субстратные специфичности этих двух ферментов.

Помимо минимизации повреждений, вызываемых гиперпродукцией АФК сразу после травмы, важное значение для эффективной терапии имеет максимальное ускорение регенерации ткани. Принимая во внимание имеющиеся данные о паракринных факторах мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и об их прогенераторных свойствах, мы сделали вывод о возможном позитивном эффекте этих белков на скорость регенерации респираторного эпителия.

Цель исследования. Целью данной работы является изучение эффекта, оказываемого ферментами-антиоксидантами и белками культуральной среды

мезенхимальных стволовых клеток при лечении ожоговых травм органов дыхания.

Основные задачи исследования.

1. Разработать экспериментальную модель контролируемого ожога респираторного эпителия с воспроизводимыми параметрами, определяющими степень поражения.

2. Оценить эффекты, оказываемые различными ферментами-антиоксидантами (супероксиддисмутаза, пероксиредоксин 6 и химерный белок с совмещёнными супероксиддисмутазной и пероксидазной активностями - РБН) при лечении химического ожога на модели острого респираторного поражения.

3. Оценить эффективность применения паракринных факторов мезенхимальных стволовых клеток в качестве активатора пролиферации при лечении поражений респираторного эпителия трахеи.

4. Выявить особенности регенерационных процессов в респираторном эпителии после ожоговой травмы.

Научная новизна работы. В работе показано, что химический ожог приводит к массовой гибели клеток респираторного эпителия и одновременному снижению экспрессии всех ферментов-антиоксидантов. При этом гибель клеток происходит как вследствие некроза, так и по апоптотическому пути. Проницаемость для экзогенных белков эпителия трахеи после химического ожога выше, чем в норме.

Эндотрахеальное введение супероксиддисмутазы после ожога оказывает выраженный негативный эффект на эпителий трахеи, в то время, как применение таким же способом Ргх 6 и химерного белка РБН, обладающего одновременно супероксиддисмутазной и пероксидазной активностями, привело к заметному ускорению регенерации ткани и лучшему её сохранению после ожога. Показан синергизм действия ферментов-антиоксидантов и белков культуральной жидкости МСК.

Описаны два механизма регенерации респираторного эпителия, один из них ранее исследован не был. Классический механизм заключается в пролиферации и дифференцировке базальных клеток, сохраняющихся после ожога благодаря их расположению в нижней части эпителиального слоя. Второй путь, описанный впервые, заключается в образовании в подслизистом слое замкнутых эпителиальных структур и встраивании их в респираторный эпителий. Научно-практическая ценность. Полученные результаты позволяют расширить понимание механизмов регенерации респираторного эпителия. Данные о синергизме терапевтического действия ферментов-антиоксидантов и паракринных факторов мезенхимальных стволовых клеток могут стать основой для разработки эффективного лекарственного средства для лечения повреждений эпителиальной ткани. Результаты исследования особенностей регенерации респираторного эпителия могут стать базой для нового

направления терапии ингаляционных травм.

Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на конференциях: 17-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА, г. Пущино, 21-26 апреля 2013 г.; Международная конференция молодых учёных Экспериментальная и теоретическая биофизика, г. Пущино, 21-23 октября 2013 г.; Стволовые клетки и регенеративная медицина, г. Москва, 18-21 ноября 2013 г.; Ломоносов-2014, г. Москва, 7 -11 апреля 2014 г.; Биология - наука 21 века, г. Пущино, 21-26 апреля 2014 г.; Конгресс Европейского респираторного общества, г. Мюнхен, 6-10 сентября 2014 г.; Биология - наука 21 века, г. Пущино, 20-24 апреля 2015 г.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ферменты-ашпиоксиданты. В экспериментах использовался рекомбинантный человеческий Ргхб, содержащий His-tag-домен, полученный в лаборатории механизмов рецепции ИБК РАН. Данный Ргхб имеет пероксидазную активность и субстратную специфичность, эквивалентную соответствующим характеристикам натурального Ргхб крысы, и не является цитотоксичным. Пероксидазные удельные активности - 120 нмоль/мг/мин по Н202 и 80 нмоль/мг/мин по трет-бутил гидропероксиду.

В работе была использована рекомбинантная бактериальная Mn-супероксиддисмутаза, содержащая His-tag и имеющая супероксиддисмутазную активность 17 ед/мг белка. В состав химерного фермента-антиоксиданта с совмещёнными супероксиддисмутазной и пероксидазной активностями - PSH - входят Mn-SOD и Ргхб [Равин и др., Патент № 2534388; Рис.1]. В генно-инженерную конструкцию также входит последовательность, кодирующая шесть остатков гистидина - His tag. Характеристики гибридного белка PSH (Prx6-SOD-6His): Молекулярный вес -47кДа (Ргхб - 25кДа, Mn-SOD - 22 кДа), пероксидазная активность - 100 нмоль/мин/мг. белка, супероксиддисмутазная активность - 9 ед/мг белка.

Рис. 1. Структура химерного белка PSH, обладающего супероксиддисмутазной и пероксидазной активностями

Белки кулыпуралыюй жидкости мезенхимальных стволовых клеток. Для

выделения мезенхимальных стволовых клеток костный мозг получали из бедренной кости крыс линии Wistar [Темнов и др., Патент 2341279]. Мононуклеарную фракцию клеток костного мозга выделяли на градиенте плотности с использованием стандартного раствора Lympholyte-H. Суспензию мононуклеарных клеток высевали на чашки Петри и культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячий сыворотки. Остеогенная дифференцировка (с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 мкМ дексаметазона, 0,1 мМ аскорбиновой кислоты и 10 нМ (3-глицерофосфата), была подтверждена наличием щелочной фосфатазы в культуре клеток с использованием стандартных реактивов. Хондрогенная дифференцировка (с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 мкМ дексаметазона и 0,1 мкг / мл TGF-P), была подтверждена с использованием окраски альциановым голубым. Адипогенная дифференцировка (с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10 мкМ дексаметазон, 10 мкг/мл инсулина, и 100 мкг/мл IBMX) была подтверждена окрашиванием с использованием Oil Red-O.

После получения клеточного монослоя проводили полную смену культуральной среды и через 3 суток кондиционированную культуральную среду объединяли с лизатом МСК. Содержание белка в кондиционированной среде МСК составила 9,5±0,3 мг/мл. Пероксидазные удельные активности - 40 нмоль/мг/мин по Н2О2 и 25 мкм/мг/мин по трет-бутил гидропероксиду.

Токсичность экзогенных белков. Все исследованные рекомбинантные белки (Ргхб, PSH, SOD), а также белки культуральной жидкости мезенхимальных стволовых клеток (МСК) не оказывали токсического эффекта при их введении непосредственно в неповрежденную трахею (см. Результаты).

Модель термического ожога воздухоносных путей. Термический ожог

верхних дыхательных путей крысы проводили посредством микропарогенератора МПГ-1-05 (разработка ИБК РАН, автор - Санталов Б.Ф.) с аппликацией горячего пара непосредственно в трахею крысы в течение 4-8 секунд. Предварительно животное наркотизировалось путём внутрибрюшинного введения препаратов «Золетил» (2 мг препарата/ 100г. массы животного) и «Рометар» (25 мкл. каждому животному). Животное фиксировали на препарационном столике, раздвигали челюсти с помощью расширителя и вводили зонд парогенератора на расстояние 2-3 мм. от начала трахеи. Скорость подачи пара —1,2 мл/с, температура пара - 70° С.

Модель химического ожога воздухоносных путей.

Химический ожог верхних дыхательных путей проводили путём выдерживания животного в атмосфере насыщенных паров соляной кислоты. Животных анестезировали с помощью анальгина, введённого внутрибрюшинно (20 мг/кг веса крысы) и спустя 15 минут помещали в эксикатор (объем 10 литров) с насыщенными парами соляной кислоты на 15 минут. Для измерения рН в слизи трахеи животных декапитировали, выделяли трахею и измеряли приблизительное значение рН в слизи трахеи с помощью индикаторной бумаги. Анализ рН слизи трахеи показал, что сразу после ожога насыщенными парами соляной кислоты (в пределах 5 минут) рН принимает очень низкие значения (2 -2,5), что и является основным поражающим фактором при ожогах такого типа. В течение часа происходит возвращение рН к нормальному значению.

Эндотрахеальное введение экзогенных белков. Растворы ферментов-антиоксидантов Ргхб, Mn-SOD и PSH, а также раствор белков, выделенных из кондиционированной среды МСК, вводились непосредственно в трахею крысы после ожога. Введение проводилось посредством зонда, соединённого с пипеткой и с помощью подсветки и бинокулярной лупы вставляемого в трахею наркотизированной и зафиксированной на препарационном столе крысы. Объём вводимого крысе раствора составлял 200 мкл, концентрация препарата в нём - 1 мг/мл. Аппликация раствора в трахею осуществлялась в момент вдоха, когда вход в трахею максимально раскрыт.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МОДЕЛЕЙ ТЕРМИЧЕСКОГО И

ХИМИЧЕСКОГО ОЖОГОВ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ КРЫСЫ.

При разработке моделей ожогов верхних дыхательных путей за основу был взят случай ожога средней тяжести. Именно такие ожоговые травмы требуют разработки новых эффективных лекарственных препаратов, в то время как наиболее тяжёлые ожоги лечатся не медикаментозно, а хирургически. Кроме этого, ожоги средней тяжести позволяют проследить динамику развития патологических изменений и регенерационных процессов в эпителии. Сильный

ожог приводит к полной гибели клеток не только слизистого, но и подслизистого слоев.

Стенка здоровой трахеи состоит из хрящевой, подслизистой и слизистой оболочек. Последняя включает в себя реснитчатые клетки (основная масса клеток эпителия), секретирующие клетки и базальные клетки, образующие подобие нижнего слоя в эпителии трахеи (Рис. 2).

Рис. 2. Морфология эпителия здоровой трахеи крысы

Гистологический анализ трахеи после термического ожога показал отсутствие специфичности при воздействии на разные типы клеток. Как реснитчатые, так и секреторные клетки в слизистой оболочке трахеи повреждаются одинаково при ожоговой травме такого типа (Рис. 3).

200 11Ш

Рис. 3. Морфология эпителия трахеи крысы спустя сутки после термического

ожога

Тяжесть химического ожога регулировалась путём изменения времени, в течение которого крыса находилась в атмосфере паров соляной кислоты. Для

создания ожога нужной силы крыса помещалась в эксикатор на 10-15 минут, в зависимости от массы животного.

В отличие от случая ожога горячим паром, при химическом ожоге парами кислоты наблюдается специфичность повреждения клеток эпителия: в первую очередь страдают реснитчатые клетки (Рис. 4). Это связано с тем, что основной поражающий фактор при таком химическом ожоге - резкое понижение рН слизи (до рН 2 — 2,5), а реснитчатые клетки имеют гораздо большую площадь соприкасающейся со слизью поверхности, чем секреторные. Под действием изменившегося рН происходит разрушение мембран ресничек, погруженных в слизь, и, как следствие, гибель всей реснитчатой клетки. Как показывает гистологический анализ, в первые сутки после ожога повреждается до 70% поверхности эпителия.

100 рт

Рис. 4. Морфология эпителия трахеи крысы спустя сутки после химического ожога

При термическом ожоге с использованием микропарогенератора при введении капилляра парогенератора в трахею крысы сложно избежать вариаций глубины введения. Более того, ввиду локальной конденсации пара как в капилляре, так и в трахее, степень повреждения разных участков трахеи может различаться. Как следствие, в данной модели термического ожога степень повреждения разных участков трахеи трудно воспроизводима. В случае химического ожога, когда крыса помещается в эксикатор и вдыхает насыщенные пары соляной кислоты, внутренняя поверхность трахеи крыс повреждается более равномерно и степень тяжести ожога не варьирует от эксперимента к эксперименту. Принимая во внимание лучшую воспроизводимость химического ожога по сравнению с термическим, для дальнейших исследований была выбрана именно эта модель.

Как уже было отмечено, такие тяжёлые травмы, как ожоги, сопровождаются мощным окислительным стрессом. С целью выявления

возможности нейтрализации этого стресса собственными ферментами-антиоксидантами было проведено исследование динамики экспрессии ферментов-антиоксидантов собственной антиоксидантной системы трахеи при ожоге: методом ПЦР был определен уровень экспрессии всех основных ферментов-антиоксидантов как в норме, так и после ожога.

В первые сутки после ожога наблюдается существенное уменьшение экспрессии практически всех ферментов-антиоксидантов (как всех типов пероксидаз, так и супероксидцсмутаз), что, по-видимому, связано с массовой гибелью клеток эпителия (Рис. 5). В то же время повышенный уровень экспрессии каталазы в эпителии трахеи после первых суток после ожога может быть объяснен наличием в соскобе эпителия трахеи большого количества макрофагов, которые сами по себе имеют высокий уровень экспрессии каталазы. На третий день после ожога уровень экспрессии ферментов-антиоксидантов также остается ниже контрольного уровня. На седьмой день после ожога наблюдается очень сильная активация экспрессии всех ферментов-антиоксидантов (в 2-5 раз). Это может быть связано с усиленной регенерацией ткани эпителия трахеи через неделю после ожога и, по-видимому, на данной стадии регенерации эпителиальной ткани антиоксидантная система в клетках эпителия наиболее активна. На 15 день после ожога уровень экспрессии практически всех ферментов-антиоксидантов достигает нормы.

Таким образом, при химическом ожоге в короткий период после травмы происходит уменьшение количества основных ферментов-антиоксидантов, что снижает возможность нейтрализовать окислительный стресс собственными ферментами. Мы предполагаем, что решением этой проблемы может стать использование экзогенных ферментов-антиоксидантов, апплицированных непосредственно в трахею.

ГТероксиредоксины

16 14 12 10 8 6

контроль 1 -й день 3-й день 7-й день 15-й день

I 35

I" 30 06

05 25

1 20 о.

15

Ргх2 РгхЗ Ргх4 Глутатионпероксидазы

Супероксиддисмутазы

I

Хх

5 7

и 6 В. !=

Ы 5

= 4

0

6 з

и

1 2

<ЗРх2 ОРхЗ ОРх7 ОРх8

8СЮ1 вСЮЗ

Рис. 5. Изменение уровня экспрессии в эпителии трахеи крысы основных ферментов-антиоксидантов после химического ожога

2. ПРОНИЦАЕМОСТЬ РЕСПИРАТОРНОГО ЭПИТЕЛИЯ ДЛЯ

ЭКЗОГЕННЫХ БЕЛКОВ В НОРМЕ И ПОСЛЕ ХИМИЧЕСКОГО ОЖОГА.

Так как в последующих экспериментах будут исследованы эффекты различных экзогенных ферментов-антиоксидантов и белков среды МСК при их введении непосредственно в трахею, предварительно были проведены модельные эксперименты по определению степени возможного проникновения этих белков в различные области эпителия трахеи при ожоге. В этих экспериментах качестве индикатора степени проникновения разных белков был использован меченый Р1ТС сывороточный альбумин, который по молекулярному весу приблизительно соответствовал исследуемым в дальнейшем ферментам-антиоксидантам и белкам, входящем в состав паракринных факторов МСК.

Исследование локализации экзогенного меченого альбумина проводили

методом флуоресцентной микроскопии. Раствор меченого Р1ТС белка в количестве 200 мкл был введён крысе эндотрахеально через 30 минут после химического ожога органов дыхания. В качестве контроля крысам, не получавшим ожога, также был введён в трахею раствор меченого белка. Спустя 30 минут был проведён сбор ткани для дальнейших исследований.

На рис. 6 (А) и 6 (Б) видно, что неповреждённый эпителий задерживает

основную массу введённого белка, препятствуя его проникновению дальше слизистого слоя. После химического ожога трахеи проницаемость эпителия этого органа значительно повышается, что приводит к более эффективному проникновению белков (рис. 6В и 6Г). Это объясняется гибелью и слущиванием клеток при ожоге, в то время как в норме клетки эпителия являются препятствием на пути попадающих в воздухоносные пути веществ.

Рис. 6. Проницаемость эпителия трахеи в норме (А, Б) и после химического ожога (В, Г)

3. ЭФФЕКТ ФЕРМЕНТОВ-АНТИОКСИДАНТОВ НА РЕГЕНЕРАЦИОННЫЕ ПРОЦЕССЫ В ЭПИТЕЛИИ ТРАХЕИ ПОСЛЕ ХИМИЧЕСКОГО ОЖОГА.

Гибель клеток эпителия сразу после химического ожога и усиление проницаемости слизистого слоя трахеи способствуют активации продукции АФК. Уровень активных форм кислорода повышается как за счёт эндогенных АФК разрушенных клеток, так и вследствие активации нейтрофилов в эпителии. Кроме того, как показано выше, происходит снижение экспрессии ферментов-антиоксидантов. В соответствии с поставленной задачей оценить эффект ферментов-антиоксидантов при регенерации эпителия трахеи после химического ожога, мы вводили растворы белков эндотрахеально через 30 минут после ожога парами соляной кислоты. Введение препаратов раньше, чем через 30 минут, привело бы к денатурации этих ферментов за счёт кислой среды

в слизи эпителия трахеи. По истечении этого периода времени рН слизи возвращает себе нормальное значение.

Аппликация Mn-SOD в обожженную трахею в концентрации 1 мг/мл через 30 минут после ожога привела к быстрому и полному разрушению эпителия трахеи, которое сопровождалось сильным кровотечением из гортани крысы с последующей смертью животного (Рис. 7). Это может быть объяснено присутствием в тканях обожжённого органа чрезмерно большого количества субстрата SOD - супероксидного радикала, и, как следствие, обильное образование продуктов реакции - гидропероксидов. На фоне пониженной экспрессии пероксидаз после ожога это привело к вторичному разрушению эпителия. Таким образом, использование SOD в качестве возможного лечебного препарата при лечении ожога верхних дыхательных путей может быть исключено, по крайней мере, на первых сроках после ожога.

10Ojjrn

"Ш:

Рис. 7. Морфология эпителия трахеи крысы после химического ожога и эндотрахеальной инсталляции Мп-вОО

Гистологический анализ эпителия трахеи через сутки после химического ожога и аппликации в трахею пероксиредоксина 6 показал существенно большую, по сравнению с контрольным экспериментом, сохранность реснитчатых клеток после ожога (Рис. 8). Плотность реснитчатых клеток на 3 и 7 сутки после ожога также заметно превышает эту величину в ситуации ожога без лечения. Из этого следует, что введение в трахею фермента-антиоксиданта Ргх 6 не только предотвращает гибель реснитчатых клеток, но и способствует регенерации эпителия.

А

Б

20 р^И

Рис. 8. Морфология трахеи крысы через 1 сутки (А), 3 суток (Б) и 7 суток (В) после ожога и эндотрахеальной аппликации Ргх

Аналогичные результаты были получены при аппликации в трахею после ожога химерного белка РБН, обладающего совмещёнными супероксиддисмутазной и пероксидазной активностями (Рис. 9). В сравнении с данными, полученными для Ргхб, морфологический анализ эпителия после введения Р8Н показывает приблизительно такую же сохранность клеток после ожога, но немного более эффективную регенерацию (Табл. 1). Таким образом, аппликация в обожженную трахею как пероксиредоксина 6, так и химерного белка-антиоксиданта Р8Н существенно предотвращает дегенерацию эпителия трахеи, вызванную химическим ожогом.

Рис. 9. Морфология трахеи крысы спустя 1 сутки (А), 3 суток (Б) и 7 суток (В) после химического ожога и эндотрахеальной инсталляции химерного

белка РвН

Таблица. 1. Сохранность эпителия после химического ожога парами соляной кислоты и аппликации в трахею ферментов-антиоксидантов (в процентах от контроля)

Время после ожога 1 день 3 дня 7 дней

Контроль (ожог) 10-20 5-15 40-45

Супероксидисмутаза 0 - -

Пероксиредоксин 6 65-70 70-75 80-85

Пероксиредоксин-супероксидисмутаза 65-70 75-80 85-90

4. ЭФФЕКТ, ОКАЗЫВАЕМЫЙ ПАРАКРИННЫМИ ФАКТОРАМИ МСК НА РЕГЕНЕРАЦИОННЫЕ ПРОЦЕССЫ В ЭПИТЕЛИИ ТРАХЕИ ПОСЛЕ ХИМИЧЕСКОГО ОЖОГА.

В случае применения отдельно взятых белков среды МСК гистологический анализ не выявил существенного позитивного влияния на сохранение и регенерацию эпителиальной ткани (Рис. 10).

Таким образом, для эффективной регенерации эпителия после ожога необходимо, прежде всего, подавление окислительного стресса. Так как собственная пероксидазная активность белков среды МСК низка (см. Материалы), в последующих экспериментах был исследован совместный эффект Ргхб и МСК. Для оценки эффективности совместного действия РБН и белков, выделенных из культуральной жидкости МСК, в трахею крысам после ожога вводилась смесь этих препаратов, в которой каждый из них был представлен в концентрации 1 мг/мл. Последующий морфологический анализ эпителия трахеи показал существенное усиление регенеративных процессов; так, эпителий трахеи выглядит восстановленным уже на 3 сутки после ожога, тогда как под воздействием отдельно взятых ферментов-антиоксидантов такой эффект достигался не ранее 7 дня (Рис. 11).

Рис. 10. Морфология эпителия трахеи крысы через 1 сутки (А), 3 суток (Б) и 7 суток (В) после химического ожога и эндотрахеальной инсталляции белков кондиционированной среды МСК

Д _100 рт

Рис. 11. Морфология эпителия трахеи крысы спустя 1 сутки (А) и 3 суток (Б) после химического ожога и эндотрахеальной инсталляции Р8Н и белков

среды МСК

5. МЕХАНИЗМ РЕГЕНЕРАЦИИ ЭПИТЕЛИЯ ПОСЛЕ ХИМИЧЕСКОГО ОЖОГА.

Одним из ключевых моментов в установлении механизма регенерации эпителия трахеи является выявление типа клеток, играющих ключевую роль в этом процессе. Можно предположить, что при восстановлении такни важное значение имеют локализованные в эпителии трахеи стволовые клетки. Согласно многочисленным литературным данным, пул стволовых клеток в респираторном эпителии трахеи крыс и трахеи и бронхов человека представлен популяцией базальных клеток. Базальные клетки, в отличие от реснитчатых и секреторных клеток, не выступают в просвет трахеи. Эти клетки имеют плоскую форму и небольшой размер. Прилегая к базальной мембране, они образуют подобие нижнего слоя в псевдомногослойном респираторном эпителии. Такое расположение позволяет базальным клеткам избегать гибели при ингаляционных травмах. Так, даже в случае существенной потери реснитчатых и секреторных клеток в результате травмы, сохранившиеся базальные клетки пролиферируют и дифференцируются, восстанавливая эпителий (Рис. 12).

Реснитчатые клетки

Базальные клетки

Секреторные клетки

Рис. 12. Структура респираторного эпителия после ожога. Гибель реснитчатых и секреторных клеток и сохранение популяции базальных клеток

По крайней мере некоторая часть популяции базальных клеток экспрессирует цитокератин 5. С помощью антител к цитокератину 5 нам удалось продемонстрировать место расположения базальных клеток в слизистом слое трахеи и показать, что при гибели реснитчатых и секреторных клеток в результате достаточно сильного ожога, размер популяции базальных клеток не претерпевает существенных изменений (Рис. 13). Таким образом, регенерация респираторного эпителия путём дифференцировки лежащих на базальной мембране базальных клеток - явление неоднократно подтверждённое.

А юо Мт Б --

\ /

/ ~ •

Рис. 13. Выявление базальных клеток с помощью антител к К5 в здоровой трахее (А) и через сутки после химического ожога (Б)

6. ОСОБЕННОСТИ РЕГЕНЕРАЦИОННЫХ ПРОЦЕССОВ В РЕСПИРАТОРНОМ ЭПИТЕЛИИ.

В ходе исследования терапевтического эффекта, оказываемого ферментами-антиоксидантами и белками культуральной жидкости мезенхимальных стволовых клеток на эпителий трахеи после ожога, мы обнаружили присутствие замкнутых структур в подслизистом слое трахеи (Рис. 14). Особенно большое количество таких структур наблюдается после применения одновременно антиоксиданта (Ргх 6 или PSH) и белков среды МСК. В случае аппликации в трахею только пероксиредоксина 6 появление структур тоже было зафиксировано, но в намного меньших количествах.

Рис.14. Обнаружение замкнутых структур в подслизистом слое трахеи крысы после химического ожога и аппликации Ргх 6 и белками среды МСК

Продолжив изучение замкнутых включений в подслизистом слое, мы заметили их морфологическую идентичность респираторному эпителию. При достаточно большом увеличении в этих структурах было обнаружено наличие ресничек (Рис. 15).

41 ъ- %Т 1"ЧВ5аг - - "" »

О** с ^ ***

111\

♦;

» Г:

.Ч>4 Ч- Цр

и лш

X ^ I

Рис. 15. Морфологический анализ замкнутых структур в подслизистом слое трахеи выявил наличие ресничек

Для того, чтобы убедиться в эпителиальной природе замкнутых структур в подслизистом слое трахеи, мы провели иммуногистохимический анализ с применением антител к а-Тубулину, содержащемуся в ресничках (Рис. 17). Анализ выявил наличие а-Тубулина в клетках включений, а также в реснитчатых клетках респираторного эпителия, выстилающего внутреннюю поверхность трахеи. Как видно на рис. 16, реснички обнаружены во включениях разного размера. Таким образом, замкнутые структуры в подслизистом слое трахеи содержат реснитчатые клетки.

Рис. 16. Выявление тубулина в реснитчатых клетках

Помимо реснитчатых клеток, включения содержат муцин-секретирующие клетки. Это было показано с помощью окрашивания срезов трахеи красителем альциановый синий, выявляющим муцин и полисахариды (Рис. 17). Таким образом, была показана аналогичная респираторному эпителию клеточная композиция замкнутых структур подслизистого слоя.

Рис. 17. Выявление муцин-секретирующих клеток в замкнутых структурах в подслизистом слое трахеи

В попытке определить предшественников эпителиальных включений в подслизистом слое трахеи мы провели иммуногистохимический анализ на выявление способных к дифференцировке клеток Клара и базальных клеток в подслизистом слое. Окрашивание срезов трахеи антителами к цитокератину 5, секретируемому базальными клетками, не дало позитивного результата. Окрашивание специфическими антителами на выявление клеток Клара показало присутствие в подслизистом слое этих клеток, сгруппированных в небольшие кольцеобразные кластеры (Рис. 18). Как видно на рис. 18, группы клеток Клара соседствуют с более крупными по размеру эпителиальными структурами, в которых клеток этого типа не выявлено.

Рис. 18. Выявление клеток Клара в подслизистом слое эпителия трахеи крысы после химического ожога

Новый механизм регенерации респираторного эпителия.

В здоровой трахее включения практически не встречаются. На первый день после ожога и аппликации в трахею фермента-антиоксиданта и белков среды МСК включения появляются в небольших количествах, на третий день число включений достигает максимума. К седьмым суткам подслизистый слой почти не содержит замкнутых эпителиальных структур. Возможным объяснением данного феномена является встраивание данных структур в респираторный эпителий. В пользу такой точки зрения свидетельствуют результаты, представленные на рис. 19, который иллюстрируют встраивание эпителиальных структур в респираторный эпителий.

Рис. 19. Встраивание эпителиальных структур из подслизистого слоя трахеи в респираторный эпителий

Пролиферация клеток Клара, обнаруженных в подслизистом слое трахеи, вероятно, простимулирована обильно содержащимися среди белков среды МСК факторами роста. Возможно, по этой причине мы наблюдали эпителиальные замкнутые структуры в трахее только при совместном использовании антиоксиданта и белков, выделенных из кондиционированной среды

мезенхимальных стволовых клеток. Под действием паракринных факторов МСК фуппы клеток Клара разрастаются, образуя крупные конгломераты. В данных конгломератах клетки Клара дифференцируются в реснитчатые клетки, образуя замкнутые структуры респираторного эпителия. В пользу этой точки зрения свидетельствуют литературные данные, согласно которым клетки Клара могут при определенных условиях дифференцироваться в разные клетки реснитчатого эпителия. Такими условиями и могут быть повышенное содержание в составе паракринных факторов кондиционированной среды МСК различных факторов роста и интерлейкина 6.

Образовавшиеся эпителиальные включения продвигаются к базальной мембране, отделяющей слизистый слой от подслизистого, и встраиваются в него. Как следствие, в респираторном эпителии появляется новый, здоровый участок. Цикл существования эпителиальных структур составляет 7-8 дней. Описанный процесс является вторым путём регенерации респираторного эпителия, наряду с механизмом дифференцировки базальных клеток, сохранившихся после травмы в нижнем псевдослое респираторного эпителия (Рис. 20).

Рис. 20. Образование замкнутых эпителиальных структур в подслизистом слое из клеток Клара и встраивание их в респираторный эпителий

Данный способ регенерации эпителия воздухоносных путей описан впервые. Появление замкнутых структур в подслизистом слое наблюдалось и другими исследователями, но входящие их состав реснитчатые клетки описаны

ранее не были, а значит, не была установлена и идентичность этих структур респираторному эпителию. Обнаружение второго механизма регенерации эпителиальной ткани воздухоносных путей имеет большое значение для терапии ингаляционных травм.

Заключение

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при остром повреждении респираторного эпителия, сопровождающемся гибелью реснитчатых и секреторных клеток, происходит угнетение антиоксидантной системы, выраженное в существенном уменьшении экспрессии всех антиоксидантных ферментов. Одновременно с этим в тканях, подвергшихся повреждающему воздействию, запускается активизация продукции активных форм кислорода и развитие окислительного стресса. Таким образом, важнейшей задачей для сохранения ткани эпителия в первые сроки после ожога является восстановление антиоксидантного статуса в трахее. В данной работе для этого были применены ферменты-антиоксиданты, апплицированные непосредственно в трахею крысы после химического ожога. При этом аппликация марганцевой супероксиддисмутазы в обожжённую трахею спровоцировала ещё большие разрушения тканей стенки трахеи и гибель экспериментальных животных. С другой стороны, эндотрахеальное введение пероксиредоксина 6 оказало положительный эффект на сохранение и регенерацию эпителиальной ткани. Это означает, что именно гидропероксиды играют основную роль в разрушении эпителия.

Выбор второго эффективного фермента-антиоксиданта - фермента с совмещенными пероксидазной и супероксиддисмутазной активностями (PSH) -также оправдан. При создании такого химерного белка генно-инженерными методами активные центры как пероксиредоксина, так и супероксиддисмутазы остались открытыми. В результате этого полностью были сохранены как пероксидазная, так и супероксиддисмутазная активности и после эндотрахеальной инсталляции этого белка наблюдается лучшее, по сравнению со случаем применения Ргх 6, сохранение эпителия.

Вторым важным условием для достижения наилучшего терапевтического эффекта является ускорение регенерации эпителия в последующие после травмы дни. В качестве активатора пролиферации были применены белки, выделенные из культуральной жидкости стволовых клеток, обладающие, согласно литературным данным, выраженными прогенераторными свойствами. Аппликация в трахею отдельно взятых белков среды МСК не дала существенного позитивного эффекта на сохранение и регенерацию эпителия после ожога, однако при использовании белков совместно с антиоксидантом Ргх 6 или PSH наблюдается значительное ускорение восстановления респираторного эпителия. Таким образом, подтверждается необходимость

нейтрализации окислительного стресса для эффективной терапии травм эпителия.

Представленные данные показывают, что при ингаляционной травме при использовании ферментов-антиоксидантов и белков культуральной жидкости мезенхимальных клеток регенерация эпителия трахеи идет по двум механизмам. Первый из них, классический, связан с восстановлением эпителия за счет базальных клеток.

Как показано в данной работе, при химическом ожоге популяция базальных клеток сохраняется. По классической схеме, эти клетки образуют тонкий слой плоского эпителия, который постепенно дифференцируется и образует многорядный призматический эпителий; это вызывает стимуляцию пролиферации соседних сохранённых участков.

Второй путь регенерации, который был показан в данной работе, может быть связан с образованием замкнутых эпителиальных структур в подслизистой эпителия трахеи. Данные образования мигрируют в направлении поверхности эпителия и встраиваются в него. Как показано в данной работе, основными предшественниками таких структур могут быть клетки Клара. Клетки Клара также являются клеточной популяцией, способной к самообновлению и могут способствовать восстановлению поврежденного эпителия дыхательных путей, включая эпителий трахеи. Очень важным является тот факт, что клетки Клара могут дифференцироваться во все основные типы клеток респираторного эпителия, включая реснитчатые клетки. Наличие реснитчатых клеток в обнаруженных замкнутых структурах подтверждает данный факт.

Основной вопрос заключается в том, являются ли образующиеся замкнутые структура в подслизистой эпителия трахеи предшественниками секреторных желез, или они представляют собой уже сформировавшийся эпителий, который мигрирует в пораженную часть внешнего эпителия? Обнаружение сформировавшегося и содержащего реснитчатые клетки эпителия внутри подслизистой говорит в пользу второго варианта.

Выводы

1. Разработана модель химического ожога воздухоносных путей, характеризующаяся высокой воспроизводимостью и специфичностью.

2. Химический ожог приводит к массовой гибели клеток респираторного эпителия и одновременному снижению экспрессии всех ферментов-антиоксидантов.

3. Аппликация в пораженную трахею непосредственно после ожога супероксиддисмутазы ускоряет процесс гибели клеток эпителия после ожога

4. Аппликация в пораженную трахею пероксиредоксина 6 (Ргхб) и белка с совмещенными пероксидазной и супероксиддисмутазной активностями

(Р8Н) существенно защищает клетки эпителия трахеи, причем эффект от использования Р8Н был выше, чем Ргхб.

5. Показан синергизм одновременного действия пероксиредоксинов и белков культуральной жидкости мезенхимальных стволовых клеток (МСК) на сохранение и регенерацию эпителия трахеи после ожога.

6. Обнаружен новый способ регенерации эпителия: образование в подслизистом слое трахеи кольцеобразных эпителиальных структур с последующим их встраиванием в респираторный эпителий трахеи.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

1. Sharapov M.G., Volkova A.G., Mubarakshina Е.К., Novoselov V.I.: Antioxidant systems in rat trachea upon thermal and chemical burns of upper airway. The Eur. Respir J., 2013, Vol 42., p.85.

2. Волкова А.Г., Шарапов М.Г., Равин B.K., Гордеева А.Е , Карадулева Е.А., Мубаракшина Э.К., Темнов А.А., Фесенко Е.Е., Новоселов В.И. Эффект различных ферментов-антиоксидантов на регенеративные процессы в эпителии трахеи после химического ожога. Пульмонология, 2014, 12 (2), 84-90.

3. Novoselov V., Volkova A., Sharapov М., Temnov A., Karaduleva Е., Gordeeva A., Soodaeva S., Klimanov I. Effects from application of antioxidant enzymes on the preservation of tracheal epithelium after burn injury. Eur Respir J., 2014, 44, Suppl. 58, 855401

4. A. Temnov, V. Novoselov, A. Volkova, E. Karaduleva, A. Skifas, S. Soodaeva, I. Klimanov, A. Chucalin. Effect from conditioned medium of mesenchymal stem cells and antioxidant enzymes on the processes of regeneration in the trachea. Eur Respir J., 2014. 44, Suppl. 58, P 885.

5. Волкова А. Г. Синергизм фермента-антиоксиданта Prx 6 и белков культуральной жидкости мезенхимальных стволовых клеток при лечении термической ожоговой травмы верхних дыхательных путей. Фундаментальные исследования. 2015, №1, 470-473.

Тезисы

6. Волкова А.Г., Шарапов М.Г.: Антиоксидантные процессы в верхних дыхательных путях крыс после химического ожога: Тез. докл. 17-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА. - Россия, г. Пущино, 21-26 апреля 2013.-405с.

7. Новосёлов В.И., Волкова А.Г., Палутина О.А., Шарапов М.Г.: Anti-inflammatory drugs having endothelium-protective and immune-modulating features based on modified antioxidative enzymes: Тез. докл. IX международный междисциплинарный конгресс НЕЙРОНАУКа ДЛЯ МЕДИЦИНЫ И ПСИХОЛОГИИ. - Судак, Крым, Украина, 3-13 июня 2013.-246с.

8. Sharapov M.G., Volkova A.G., Mubarakshina Е.К., Novoselov V.I.: Antioxidant systems in rat trachea upon thermal and chemical burns of upper airway/The European Respiratory Society Congress.- Barselona, 2013.-p.82.

9. Волкова А.Г., Темнов A.A., Новосёлов В.И.: Эффект действия белков, полученных из культивированных мезенхимальных стволовых клеток и

ферментов-антиоксидантов при лечении термических ожогов органов.: Тез. докл. Стволовые клетки и регенеративная медицина. - МГУ, г. Москва, 18-21 ноября 2013.

10. Волкова А.Г., Шарапов М.Г., Новосёлов В.И.: Влияние пероксиредоксина и супероксиддисмутазы на восстановление эпителиальной ткани в верхних дыхательных путях крысы после химического ожога: Тез. докл. Международная конференция молодых учёных Экспериментальная и теоретическая биофизика. - г. Пущино, 21-23 октября 2013.-8с.

11. Шарапов М.Г., Волкова А.Г., Мубаракшина Э.К., Новосёлов В.И., Соодаева С.К., Климанов И.А.: Состояние антиоксидантных систем трахеиьпосле термического и химического ожога.: Тез. докл. 23 Национальный Конгресс по болезням органов дыхания - г. Казань, 22-15 октября 2013.-456с.

12. Волкова А.Г., Шарапов М.Г., Новосёлов В.И. Действие ферментов-антиоксидантов на эпителий трахеи крысы после химического ожога. Тез. Конф. Ломоносов-2014, секция "Биология", 7-11 апреля 2014г., г. Москва, стр. 341.

13. Волкова А.Г., Темнов A.A., Шарапов М.Г., Новосёлов В.И. Влияние секреторных белков среды мезенхимальных стволовых клеток на регенерационные процессы в эпителии трахеи после химического ожога. Тез. конф. "Биология - наука 21 века", 21-26 апреля 2014 г., г. Пущино, стр. 323.

14. Волкова А.Г., Шарапов М.Г., Новосёлов В.И. Синергизм действия белков, полученных из среды культивированных мезенхимальных стволовых клеток, и ферментов-антиоксидантов при лечении химических ожогов органов дыхания. Тез. конф. "Экспериментальная и теоретическая биофизика", 27-29 октября 2014г., Пущино, стр. 18.

Подписано в печать 03.07.2015г. Печать лазерная

Заказ № 4790 Тираж: 100 экз.

Типография «РкРппЬ) ИНН 503900523316 142290, Пущино, м-н «АБ», 18а (4967) 75-97-84 www.fix-print.ru