Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Регенерационный потенциал слизистой оболочки трахеи при действии низких температур и на фоне применения природных антиоксидантов

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Регенерационный потенциал слизистой оболочки трахеи при действии низких температур и на фоне применения природных антиоксидантов"

На правах рукописи

ГОРБУНОВ МИХАИЛ МИХАЙЛОВИЧ

РЕГЕНЕРАЦИОННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ТРАХЕИ ПРИ ДЕЙСТВИИ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР И НА ФОНЕ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИРОДНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ

06.02.01 Диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и

морфология животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 МАЙ 2013

005058656

Благовещенск - 2013

005058656

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Амурская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии ГБОУ ВПО Амурская ГМА Министерства здравоохранения России Целуйко Сергей Семенович

Официальныеоппоненты;,

Сиразиев Рамазан Закарьянович - доктор биологических наук, профессор ГНУ « Научно-исследовательский институт ветеринарии Восточной Сибири» Россельхозакадемии, заместитель директора по научной работе

Миллер Татьяна Викторовна - кандидат биологических наук, ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет», доцент кафедры зоогигиены и технологии производства продуктов животноводства

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия»

Защита состоится 28 мая 2013 г. в 10°° на заседании диссертационного совета Д 220.027.02 при ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет», 675005 г. Благовещенск, ул. Политехническая, 86. тел.: (416-2) 52-32-06, тел./факс: (416-2)52-62-80.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет».

Автореферат разослан «/5 »

Ученый секретарь диссертационного совета

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы: Организм постоянно приспосабливается к стрессовым факторам окружающей среды. Одним из этих факторов является низкая температура [Кривощеков С.Г. и др., 1993; Bittel J 1998] Неблагоприятные факторы внешней среды оказывают' отрицательное влияние в первую очередь на эпителий воздухоносных путей. Особенно это проявляется при длительном пребывании организма в условиях низкой температуры [Полякова B.C. и др., 2003; Романова Л.К., 1987; Козырева Т.В 2003]. Кроме этого при длительном действии на организм низких температур, наблюдается активизация перекисного окисления липидов и депрессия антиоксидантных систем [Бурлакова Е.Б. и др., 1985; Бородин Е.А., 1992]. '

Многими исследователями, как Дальневосточного региона, так и Сибири активно изучается действие холода на живой организм [Целуйко С.С., 1989; Сизоненко В.А., 1990; Доровских В.А. и др., 2001; Козырева Т.В. и др., 2003; Доровских В.А. и др., 2012; Целуйко С.С. и др., 2012].

Известно, что почти каждая ткань в организме имеет запас стволовых клеток, которые пополняют ее клеточный состав, постоянно уменьшающийся в ходе функциональных перегрузок или болезней [Абрахам Е.Г и др 1991 Викторов И.В. и др., 2002; Корочкин Л.И., 2002; Репин B.C. и др" 2002 Корочкин Л.И., 2003; Красавина Н.П. и др., 2010; Целуйко С.С. и др.', 2010 Stern М.М. et al., 2007]. Состояния, в результате которого, организм справляется с воздействием неблагоприятных факторов окружающей среды за счет вовлечения стволовых клеток, рассматривается как одна из стадий адаптации [Целуйко С.С. и др., 2012; Hong K.U. et al., 2004].

Стволовые клетки способны к активной пролиферации и дифференцировке в другие виды клеток, обеспечивающие естественное обновление тканей путем естественной репарации [Фриденштейн А Я и др 1980; Викторов И.В. и др., 2002; Корочкин Л.И., 2003]. Иными словами' стволовые клетки являются недифференцированными, присутствуют в дифференцированной ткани, обладают способностью к размножению и дальнейшему развитию [Целуйко С.С. и др., 2007]. Клеточные факторы возникающие при холодовом окислительном стрессе повышаясь, стимулируют пролиферацию стволовых клеток, дифференцирующихся в' новый тип эпителия [Чертков И.Л. и др., 1991; Струков А.И. и др. 1993]

Одно из ведущих мест в области профилактики и лечения заболеваний занимают антиоксиданты природного происхождения, среди которых выделяют препараты, полученные на основе растительного сырья В древесине и коре лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина содержаться значительное количество флавоноида - дигидрокверцетина и полисахарида арабиногалактана [Бабкин В.А. и др., 1997; Иванова С.З. и др. 2002]. В результате экспериментального доклинического изучения было доказано, что эти препараты обладают антиоксидантными свойствами

капилляропротекторной и противоотечной активностью, превосходящей другие препараты [Дубровина В.И."и др., 2001; Доровскйх В.А. и др., 2012].

Изучение препаратов, стимулирующих дифференциацию клеток на фоне Солодового воздействия, может помочь найти пути контроля за дифференцировкой клеток и применения их для терапии заболеваний воздухоносных путей.

"" Цель исследования. Целью предоставленной работы является изучение регенерационного потенциала эпителия слизистой оболочки трахеи у экспериментальных животных при воздействии холода и медикаментозной коррекции природными антИоксидантами. " Задачи исследования:

1. Дать сравнительную оценку морфологических показателей1 структур Ьпителия различных отделов трахеи у экспериментальных животных при общем охлаждении организма на фоне введения дигидрокверцетина и арабиногалактана, а также их комбинированного применения.

2. Выявить морфологические проявления повреждающего действия низких температур в каудальном и краниальном отделах трахеи у экспериментальных животных. Обнаружить критерии регенерационного потенциала эпителия слизистой оболочки трахеи у экспериментальных животных (крыс) на фоне длительного холодового воздействия.

3. Сопоставить результаты биохимических показателей перекисного окисления липидов и морфологических изменений различных отделов трахеи, полученных при воздействии на организм низких температур на фоне введения арабиногалактана и дигидрокверцетина.

Научная новизна работы и ценность полученных результатов. На основании полученных морфологических и морфометрических данных исследования расширенны представления о строении эпителия слизистой оболочки трахеи в частности камбиальных клеток трахеи. Разработаны 'Морфологические критерии для оценки структурной организации регенерационного потенциала трахеи лабораторных животных при , охлаждении И критерии оценки воздействия дигидрокверцетина й арабиногалактана на слизистую оболочку трахеи. Проведено комплексное электронно-микроскопическое исследование выявления базальных клеток эпителия в экспериментах с использованием гистохимического метода выявления щелочной фосфатазы. Впервые приведена гистологическая характеристика регенерационного потенциала эпителия слизистой оболочки трахеи на фоне длительного охлаждения при совместном применении дигидрокверцетина и арабиногалактана. Изучен эпителий трахеи на светооптическом, электронномикроскопическом уровнях при воздействии на организм низких температур на фоне введения дигидрокверцетина и . арабиногалактана и сочетанием применении.

Теоретическая и практическая значимость работы. Экспериментальные исследования служат теоретической основой для ' применения в клинической практике дигидрокверцетина и арабиногалактана. В частности, даны рекомендации: по использованию дигидрокверцетина и

арабиногалактана для лечебной коррекции нарушений, возникающих в воздухоносных путях при патологии, особенно в осеннее - зимний период. Фактические данные и теоретические обобщения могут использоваться в научной и педагогической работе ряда лабораторий и кафедр ветеринарных и медицинских вузов. Опубликованные материалы работы используются в учебном процессе и научных исследований кафедр гистологии, эмбриологии, цитологии; госпитальной терапии; фармакологии; ЦНИЛа Амурской ГМА-морфологии и патологии ГНУ Дальневосточный зональный научно-исследовательский ветеринарный институт Россельхозакадемии.

Апробация работы. Основные положения исследования и материалы диссертации представлены и обсуждены на научных конференциях и форумах регионального и международного уровнях: материалы второго съезда врачей пульмонологов Сибири и Дальнего Востока (Благовещенск, 2007); на 4-ом русско-китайском медицинском форуме (Благовещенск,' 2007); региональной научно-практической конференции «Молодежь XXI века: шаг в будущее» (Благовещенск, 2008); на 6-ом российско-китайском фармацевтическом форуме (Благовещенск, 2009); региональной научно-практической конференции «Молодежь XXI века: шаг в будущее» (Благовещенск, 2010); 9-ом китайско-российском биомедицинском форуме (Харбин, 2012). *

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных статей, из них 3 статьи в издательствах, рекомендуемых ВАК.

Объем и структура диссертации. Общий объем диссертации составляет 152 страниц компьютерного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования обсуждения результатов исследований, выводы, практические предложения] список литературы и приложения. Список литературы включает 195 источников, в том числе 57 зарубежных и 138 отечественных. Диссертационная работа содержит 67 рисунков, 10 таблиц.

Основные положения выносимые на защиту:

1. Выявлены особенности морфологических изменений клеток эпителия трахеи, а также участие базальных и промежуточных клеток в регенерации и направленной дифференцировке каудальных и краниальных участков слизистой оболочки трахеи при действии низких температур на организм крыс.

2. Данные морфологического; морфометрического и биохимического исследований доказывают целесообразность применения дигидрокверцетина и арабиногалактана с целью коррекции регенерационного потенциала слизистой оболочки трахеи крыс связанных с действием низких температур.

3. Установлено, что дигидрокверцетин и арабиногалактан позволяют сохранить структуру воздухоносных путей при действии низких температур и снижают показатели перекисного окисления липидов. Сочетанное применение арабиногалактана и дигидрокверцетина усиливают регенерацию в воздухоносных путях и нормализуют интенсивность перекисного окисления липидов и уровень антиоксидантной защиты.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования: Экспериментальная часть выполнена на беспородных белых крысах (Яайш погл^сш) отряда 11ос1е1кпа, которые являются удобной моделью для изучения влияния охлаждения на организм. Исследование проведено на 90 белых беспородных половозрелых крысах-самцах с массой тела 150-200г. При исследовании животные были разбиты на следующие группы (табл.1).

Таблица, 1 — Экспериментальные группы

№ группы Краткая характеристика групп . Кол-во животных

1 Контрольная. Животные содержались в условиях вивария в течение всего эксперимента 15

2 Животные подвергались общему холодовому воздействию в течение 28 дней при Т - 15°С 20

3 В течение двух недель, предшествующих охлаждению, животным перорально вводили дигидрокверцетин из расчета 5мг/100г. Далее животных подвергали общему холодовому воздействию в течение 28 дней по 3 часа ежедневно при Т - 15°С на фоне перорального введения препарата в течение всего эксперимента 18

4 В течение двух недель, предшествующих охлаждению, животным перорально вводили арабиногалактан из расчета 5мг/100г. Далее животных подвергали общему холодовому воздействию в течение 28 дней по 3 часа ежедневно при Т - 15°С на фоне перорального введения препарата в течение всего эксперимента 18

5 В течение двух недель, предшествующих охлаждению, животным перорально вводили дигидрокверцетин и арабиногалактан из расчета по 5мг/100г. Далее животных подвергали общему холодовому воздействию в течение 28 дней по 3 часа ежедневно при Т - 15°С на фоне перорального введения препарата в течение всего эксперимента 19

Животных охлаждали в климатокамере "ILKA" (Feutron, ГДР) при температуре -15С°, по 3 часа ежедневно в течение 28 дней. Объектом нашего исследования были краниальные и каудальные отделы слизистой трахеи. Краниальный отдел трахеи - участок в области 2-7 полукольца, расположенный ниже гортани. Каудальный отдел трахеи - область бифуркации 1 - 5 полукольца выше этой зоны. Режим охлаждения был выбран с учетом возникновения в таких условиях у подопытных животных, выраженных биохимических и морфологических изменений. Парафиновые срезы были окрашены гематоксилином и эозином, полутонкие срезы метиленовым синим по методу Sato [Jlynna X., 1980]. Ультратонкие срезы исследовались на трансмиссионном электронном микроскопе Technai G2 Spirit TWIN (Голландия) и растровом электронном микроскопе «Hitachi S340Ó (Япония). С целью изучения локализации и активности щелочной фосфомоноэстеразы применяли метод электронной гистохимии [Гайер Г., 1974; Репин B.C. и др., 2002]. Проводилось морфологическое описание и

количественная оценка малодифференцированных и специализированных клеток слизистой оболочки трахеи. Микроскопирование и фотографирование осуществлялось на фотомикроскопе «Nikon Microphot FXA» Морфометрические исследования клеток трахеи выполнены в программе «Image Scope Colon).

Биохимическому исследованию подвергались кровь. Для определения продуктов ПОЛ и витамина Е, лиггады из крови экстрагировали по методу Блайя-Дайера (1975). Диеновые коньюгаты определяли методом И. Д. Стальной (1977), гидроперекиси липидов - методом JI. А. Романова и И Д Стальной (1977) в модификации Е.А. Бородина с соавт. (1992), содержание малонового диальдегида - по методу Е.А. Бородина и А.И. Арчакова (1987) Антиоксидантный статус оценивали по активности церулоплазмина по методу В.Г. Колб и B.C. Камышникова (1976) и количество витамина Е по методу Р. Ж. Киселевича и С.И. Скварко (1972).

Статистическую обработку проводили при помощи статистического пакета STATISTICA v. 6.0 for Windows (StatSoft Inc., 1984-2001). Полученные цифровые данные обработаны статистически стандартными параметрическими методами с использованием t-критерия Стьюдента Данные считались достоверно отличающимися при Р<0,05. Все результата исследований представлены в виде графиков и таблиц в тексте диссертации.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Наибольшее внимание при анализе слизистой оболочки трахеи, было обращено, на качественный и количественный состав эпителия, особенности структуры базальных, промежуточных, реснитчатых и бокаловидных клеток, их ультраструктурную характеристику на трансмиссионном и растровом микроскопе, а также особенности регенерации и дифференцировки клеток слизистой оболочки в условиях эксперимента. В ходе исследования в экспериментальных группах, главной задачей явилось не только доказать преимущества комбинированного применения арабиногалактана и дигидрокверцетина при общем охлаждении, но и провести сравнительный анализ с группами животных, которым вышеуказанные препараты применялись каждым в отдельности. Учитывая, что дигидрокверцетин и арабиногалактан проявляют антиоксидантные свойства - это позволило дополнить и объктивизировать биохимическими данными полученные результаты.

3.1 Морфологическая оценка слизистой оболочки краниального и

каудального отделов трахеи интактных крыс

Структурная организация трахеи интактных крыс существенно не отличается от общего плана строения трахеи других млекопитающих и человека. Анализ качественного состава элементов эпителия показал что в каудальном отделе трахеи число малодифференцированных 'клеток

несколько больше по сравнению с краниальным. В зоне бифуркации количество базальных клеток 22,7±0,32%; промежуточных 18,1±0,76%; в краниальном отделе эти показатели соответственно равны 18,87±0,57% и 9,41±0,25% (табл. 2). Назальные клетки полудесмосомами соединяются с базальной мембраной и десмосомами с соседними клетками. [Целуйко С.С., 2012; Blenkinsopp W.K., 1967; Chilton B.C., 1981]. Щелочная фосфатаза является маркером стволовых клеток и в тоже время щелочная фосфатаза выявляет продукты обменных процессов происходящих в клетке. Чем выше активность щелочной фосфатазы, тем сильнее происходят обменные процессы между мембраной базальных клеток и соединительной тканью базальной мембраны [Гайер Г., 1974; Репин B.C. и др., 2002]. Щелочная фосфатаза интенсивно маркирует боковые и апикальные поверхности камбиальных клеток эпителия трахеи (рис.1). В зоне базальной мембраны фермент выявляется в виде мелких гранул разбросанных между тонкими коллагеновыми и эластическими фибриллами. Количество секреторных элементов эпителия доминирует в краниальном отделе 21,66±0,43%; в каудальном их число составляет 14,7±0,70% (табл. 2). Бокаловидные клетки имеют;форму бокала. Базальная часть узкая располагается овальное ядро. Апйкальйая часть расширена и содержит электронногаютные гранулы различного диаметра. На верхушке располагаются небольшие микроворсинки. В цитоплазме выявляются канальцы эндоплазматического ретикулума с большим количеством рибосом [Непомнящих Г.И., 1977; Луценко М.Т., 1978; Красавина Н.П., 2010]. По данным нашего исследования реснитчатые клетки занимают наибольшее количество в общем числе элементов эпителия — краниальный отдел - 50,0±0,82%; каудальный 44,4±0,59%. В структуре реснитчатых клеток хорошо выражены все органеллы. На поверхности ресничек выявляются гликокаликс. При электронной микроскопии хорошо видна базальная мембрана с рыхло упакованными эластическими н ретикулиновыми волокнами между ними пространства, заполненные основным веществом. Основу собственной пластинки составляет рыхлая соединительная ткань [Серов В.В., 1981].

Строение кровеносных сосудов в краниальном и каудальном отделе обычное. Железы представлены клетками конической формы, с округлым ядром, расположенным на базальном полюсе, заполнены секретом средней электронной плотности.

3.2 Морфологическая характеристика слизистой оболочки

краниального и каудалыюго отделов трахеи при общем

охлаждении в течение 28 дней.

Действие холода приводит к повреждению клеток эпителия, что замедляет регенерацию и ускоряет дифференцировку в сторону бокаловидных клеток [Козырева Т.В., 2003; Целуйко С.С., 2007]. Анализируя количественный состав элементов эпителия трахеи в каудальном отделе выявлено, что число. базальных и промежуточных клеток значительно

больше, по сравнению с краниальным отделом (табл. 2). Обращает на себя внимание тот факт, что в области бифуркации трахеи при длительном сроке охлаждения снижается число базальных на 20% и промежуточных клеток на 55% по сравнению с интактными, в то время как в краниальном отделе в те же сроки резко уменьшается количество промежуточных клеток на 90%.

Таблица 2 - Динамика изменений состава эпителия слизистой оболочки в различных отделах трахеи у интактных и экспериментальных крыс % (М±т), п=90.

Эксперименты

Группы

Интактные

Холод

II

Холод+ДКВ

Ш

Краниальный отдел

Холод+Араби-ногалакган

IV

Холод+ДКВ

+Арабино-

галактан

Базальные клетки

Промежуточные клетки

Бокаловидные клетки

Реснитчатые клетки

18,8±0,57

9,4±0,25

21,6±0,43

59,(Ш),82

15,3±0,38**

0,88±0,24**

36,8±0,85**

45,3±1,08**

23,2±0,38**

10,0±0,20**

20,7±0,224

46,1±0,32

Каудальный отдел

21,1±0,23**

9,6±0,15**

22,2±0,35**

46,6±0,28

23,^0,50*"

9,9±0,25*

21,9±0,44**

45,7±0,93

Базальные клетки

Промежуточные клетки

Бокаловидные клетки

Реснитчатые клетки

22,7±0,32

18,1 ±0,76

14,7±0,70

44,4±0,59

18,2±0,25**

8,1±0,22**

27,7±0,94**

45,9±0,81

26,7±0,29**

11,2±0,18**

18,3±0,34**

43,6±0,30*

24,9±0,19**

9,9±0,17**

9,8±0,40

19,2±0,38**

45,6±0,31

25,6±0,75**

18,9±0,71"

45,3±1,15

Примечание: **Р<0,001 уровень доверительной вероятности при сравнении I и II

^"'тт , И "Р<0>001 Уровень доверительной вероятности при сравнении II и Ш, II и IV, Ii и V.

Снижение количества малодифференцированных клеток считают одним из наиболее важных элементов замедления регенерационного потенциала воздухоносных путей при действии низких температур [Милованов А.П., 1983; Целуйко С.С., 2007; Печерский A.B., 2008] При охлаждении идет изменение распределения маркера щелочной фосфатазы камбиальных клеток. Выраженная потеря экспрессии щелочной фосфатазы связано с низким уровнем дифференцировки камбиальных клеток, при котором изменяются взаимосвязи с клеточным окружением и уменьшение метаболизма между камбиальными клетками и базальной мембраной (рис 2) Таким образом, подсчет числа клеток на 100 мкм длины пласта указывает на значительное замедление дифференцировки малодифференцированных клеток эпителия в каудальном отделе по сравнению с краниальным Расширены межклеточные пространства между базальными и промежуточными клетками. Базальная мембрана имеет неравномерную

толщину, участки расширения чередуются с зонами сужения и уплотняются. Клеточная инфильтрация соединительной ткани слизистой и подслизистой оболочек выражено слабо. Инфильтраты в основном локализуются на дорзальной и боковой поверхности трахеи, чаще в подслизистой оболочке. Действие низких температур приводит к увеличению миграции тучных клеток через эпителий, так их число в каудальном отделе трахеи повышается до, 3,2±0,71 (у интактных - 1,2±0,25) на 100 мкм эпителиального пласта. Мигрирующие в эпителий тучные клетки являются важным клеточным элементом ниши, влияющим на дифференцировку базальных клеток [Целуйко С.С., 2011; Donnely G.M., 1989]. Характерно нарастание активности щелочной фосфатазы в тучных клетках, часть из которых мигрирует в эпителий трахеи. В условиях эксперимента окисленные продукты метаболизма, выполняют функцию тканевых токсинов. Активная дегрануляция тучных клеток в эпителии, приводит к освобождению биологически активных веществ, вызывающих повреждение эпителиального барьера, изменяя функциональную активность стволовых клеток, и снижая регенерационный потенциал. Повышение миграции тучных клеток связано с передачей информационного воздействия на «нишу» стволовых клеток через жидкую среду, которая уменьшает количество митозов малодифференцированных клеток в эпителии [Целуйко С.С., 2010; Hong K.U.,2004].

Количество бокаловидных клеток увеличено, цитоплазма секретирующих клеток окрашивается светлее, чем обычно, говорящее об усиленном секреторном процессе [Полякова B.C., 2003]. В эксперименте в краниальном отделе трахеи число бокаловидных клеток постепенно возрастает и увеличивается на 70%, в каудальном отделе трахеи на 88% по сравнению с интактными. Апикальная зона бокаловидных клеток расширена за счет светлых гранул, на поверхности отсутствуют микроворсинки. При растровой микроскопии видны значительные участки выделения секрета. Наблюдается склеивание ресничек, нарушение поперечных волн движения ресничек [Непомнящих Г.И., 1979; Романова Л.К., 1982; КопьеваТ.И., 1989; Бармина Г.В., 1991; Целуйко С.С., 1992; Полякова B.C., 2003; Ailsby R. L., 1973]. Слизистый мелкопористый материал располагается неравномерно на поверхности эпителия. Слизь является продуктом деятельности бокаловидных клеток и трахеальных желез. Важно отметить, что дифференцировка эпителиальных клеток слизистой краниального отдела при охлаждении направлена, преимущественно, в сторону увеличения на 70% числа секреторных элементов. И если в зоне бифуркации незначительно возрастает количество реснитчатых клеток, то в краниальном отделе этот показатель снижается на 30%. На элеюроннограмме реснитчатые клетки увеличены в объеме, их цитоплазма вакуолизирована [Непомнящих Г.И., 1978; КопьеваТ.И., 1989; Целуйко С.С., 2011].

3.3 Морфологическая характеристика слизистой оболочки краниального и каудалыюго отделов трахеи при общем охлаждении в течение 28 дней на фоне введения дигидрокверцетина.

Под воздействием холода на фоне введения дигидрокверцетина в организме крысы число малодифференцированных эпителиальных элементов в области бифуркации и в краниальном отделе трахеи в полтора раза больше, по сравнению с группой подверженной Холодовым воздействием. Анализируя количественный состав элементов эпителия при действии дигидрокверцетина, было отмечено увеличение количества базальных клеток в каудальном на 46% и в краниальном на 51% по сравнению с Холодовым воздействием (табл. 2). Значительно усиливается активность щелочной фосфатазы в мембране базальных клеток. Гранулы реакции располагаются в виде черной полосы на базальном полюсе. Очень четко контурированы границы клеток. Это говорит об усилении метаболических процессов между клетками эпителия и соединительной тканью базальной мембраны, где идет активное деление малодифференцированных клеток, которое указывает на усиление регенерационного потенциала базальных клеток, и изменяет направленность дифференцировки, в сторону уменьшения количества бокаловидных клеток, и сохранения большого числа реснитчатых клеток. При холодовом воздействий на фоне введения дигидрокверцетина наблюдается резкое увеличение показателей промежуточных клеток в каудальном на 38%, и особенно в краниальном отделе, где количество клеток увеличивается в 10 раз по сравнению с действием на организм холодового фактора. При холоде на фоне введения дигидрокверцетина идет значительное уменьшение бокаловидных клеток в краниальном отделе на 56% и каудальном на 34% по сравнению с действие холода в течение 28 дней (табл.2).

Таким образом, дигидрокверцетин проявляя антиоксидантный эффект, оказывает мембранопротекторное действие и стимулирует пролиферацию базальных и промежуточных клеток в сторону уменьшения количества бокаловидных клеток [Милованов А.П., 1983; Трубников Г.А., 1998; Целуйко С.С., 2007; В1сЬо1Г Б.С., 2008].

3.4 Морфологическая характеристика слизистой оболочки краниального и каудалыюго отделов трахеи при общем охлаждении в течение 28 дней на фоне введения арабиногалактана.

Известно, что природный полисахарид арабиногалактан обладает антиоксидантным действием, укрепляет иммунную систему, при патологических состояниях организма активирует метаболизм клеток и участвует как клеточный протектор эпителия различных органов и систем организма [Медведев Ю.В., 2000; Ли О.Н., 2011 ВеПсоуа А., 2001].

Увеличивается количество малодифференцированных клеток на базальной мембране. Это свидетельствует о том, что в слизистой оболочке трахеи ускоряются процессы регенерации за счет базальных и промежуточных клеток [Целуйко С.С. 2011]. Сравнивая показатели полученные при действии холода и применение арабиногалактана на фоне холодового воздействия, мы наблюдаем, что количество базальных клеток увеличивается в краниальном на 37%, в каудальном отделе на 36%. Щелочная фосфатаза активно увеличивается в мембране базальных клеток. Это подчеркивает усиление метаболизма в мембранах малодифференцированных клеток (рис. 3). Повышение маркера стволовых клеток происходит за счет значительного увеличения количества промежуточных и базальных элементов. В области бифуркации количество клеток увеличивается за счет базальных элементов. Количество промежуточных клеток в краниальном отделе трахеи при действии арабиногалактана по сравнению с холодом увеличивается в 9 раз, в каудальном отделе трахеи при действии арабиногалактана наблюдается увеличение на 22% (табл. 2). При действии холода на фоне введения арабиногалактана, происходит значительное уменьшение бокаловидных клеток краниального отдела трахеи на 60%, каудального отдела на 69%. Ультраструктурный анализ выявил, что наблюдается перестройка в каудальном отделе трахеи многорядного мерцательного эпителия в многослойный кубический. В эпителии трахеи появляются выросты состоящие из эпителиальных клеток.

Таким образом, полученные данные позволяют говорить о повышении митотической активности базальных и промежуточных клеток и снижение уровня дифференцировки краниального отдела трахеи под действием арабиногалактана.

3.5 Морфологическая характеристика слизистой оболочки краниального и каудального отделов трахеи при общем охлаждении в течение 28 дней на фоне введения дигидрокверцетина и арабиногалактана.

В условиях данного эксперимента в эпителии слизистой оболочке трахеи, в сравнении с действием холода происходят достоверные изменения морфологических показателей. По нашим данным подобные результаты были получены в работе [Владимиров Ю.А., 2009; Ли О.Н., 2011 Bischoff S.C., 2008; Loke W.M., 2008; Tarahovsky Y.S., 2008; Vladimirov Y.A., 2009] в которой ряд авторов считает, что под действием природных антиоксидантов идет усиление репаративных процессов. Увеличение количества малодифференцированных клеток вызвало комбинированное применение дигидрокверцетина и арабиногалактана, так как количество базальных клеток заметно увеличивается в краниальном на 50% и каудальном на 40% отделе слизистой оболочке трахеи по сравнению с Холодовым воздействием.

Рис. 1,2,3,4. Электроннограммы базального отдела эпителия слизистой оболочки трахеи у крыс. 1-интактные, 2-охлаждение 28 дней, 3-охлаждение 28 дней на фоне арабиногалактана, 4-охлаждение 28 дней на фоне арабиногалактана и ДКВ. Заливка аралдит, эпон. Окраска уранил ацетат, цитрат свинца. Реакция на щелочную фосфомоноэстеразу по Гомори. Увеличение: 45000

В зоне прилегающей к базальной мембране реакция на щелочную фосфатазу положительная. Камбиальные клетки маркируются в виде мелких гранул образующих черные полосы в апикальной и базальной части клеток. На базальной мембране реакция положительная, здесь небольшое число мелких гранул расположенных широкой полосой (рис. 4).

Это говорит об усилении регенерационного потенциала воздухоносных путей за счет увеличения дифференцировки камбиальных клеток и повышении обменных процессов между клетками эпителия и базальной мембраны. Такая же тенденция наблюдалось и со стороны у промежуточных клеток в каудальном увеличивается на 20% и краниальном увеличивается в 9 раз. При исследовании высокодифференцированных клеток применение дигидрокверцетина и арабиногалактана, наблюдается, снижение бокаловидных клеток в краниальном на 40% и каудальном на 31% отделе трахеи по сравнению с животными, которые подвергались только воздействию холода. У реснитчатых клеток в процентном отношении показатели краниального и каудального отдела по сравнению с холодом не изменяются (табл. 2).

На основании полученных экспериментальных данных комбинированное применение дигидрокверцетина и арабиногалактана увеличивает количество малодифференцированных клеток в различных отделах трахеи усиливая регенерацию и оказывая корригирующее влияние на количественный состав эпителия трахеи.

3.6 Анализ показателей реакций перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в крови интактных и экспериментальных крыс

Данные литературы указывают, что при действии на организм низких температур наблюдается активизация реакции перекисного окисления липидов и депрессия антиоксидантных систем [Тюкавкина H.A., 1996; Бабкин В.А., 1997; Areas F.M., 2001; Tarachovsky Y.S., 2008].

Таблица 3. Показатели реакции перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в крови интактных крыс и при эксперименте___

Показатели Интактные Холод Холод+ДКВ Холод+Араби-ногалактан Холод+ДКВ+ Арабино- гапактан

Группы I II III IV V

Диеновые коньюгаты нмоль/мл 20,3±0,8 59,0±7,6** 34±1,6** 36,8±3,7** 25,2±1,4"

Гидроперекись липидов нмоль/мл 24,2±2,4 35,2±1,3** 29,7±1,8* 31,6±0,71* 15,7±0,3**

МДА нмоль/мл 5,0±0,2 7,3±0,5" 5,1±0,3«* 4,3±0,1** 5,2±0,5*

Витамин Е нмоль/мл 40,1±2,3 27,0tl,0** 36,2±2,0** 33,2±2,2* 46,9±1,4**

Церулоплазмин мгЛООмл 37,6±1,9 26,8±1,0** 30,4±0,45** 28,1±0,4 37,9*2,4**

Примечание: **Р<0,001 уровень доверительной вероятности при сравнении I и II групп; *Р<0,05 и **Р<0,001 уровень доверительной вероятности при сравнении II и Ш, II и IV, II и V.

При действии холода содержание диеновых конъюгатов в крови при охлаждении в течение 28 дней достоверно возрастала на 90% по сравнению с интактными животными. Количество гидроперекисей липидов в крови при охлаждении в эти сроки достоверно возрастала на 33%, а также количество МДА достоверно повышалось на 46% по сравнению с интактными животными. Происходит постепенное уменьшение содержание витамина Е на 32% и церулоплазмина на 28%. Из полученных данных, мы видим, что при холодовом воздействии в течение 28 дней содержание витамина Е и церулоплазмина достоверно уменьшается. Диеновые конъюгаты, гидроперекись липидов, МДА наоборот достоверно повышались при продолжительном сроке охлаждения [Доровских В.А., 2001; Владимиров Ю.А., 2009].

При применении дигидрокверцетина на фоне охлаждения, вызывает уменьшение количества диеновых коныогатов в крови на 42%. Уровень гидроперекисей липидов достоверно уменьшался на 16%, идет снижение МДА на 30%. Увеличивается показатели содержание витамина Е на 34% и церулоплазмина на 13% (табл. 3).

В результате воздействия холода в течение 28 дней с применением препарата арабиногалактан мы видим, что препарат вызывает уменьшение количества диеновых коныогатов в крови на 37%. Уровень гидроперекисей липидов достоверно уменьшается на 10%, идет снижение МДА на 41%. Количество церулоплазмина увеличивается на 13%, содержание витамина Е возрастает на 23% (табл. 3).

Совместное применение арабиногалактана и дигидрокверцетина на фоне общего охлаждения вызывает уменьшение количества диеновых коныогатов в трахее на 57%. Уровень гидроперекисей липидов достоверно уменьшался в пределах 55%, идет снижение МДА на 28%, а показатель церулоплазмина возрастает на 41%. Содержание витамина Е увеличивается на 73% (табл. 3).

Дигидрокверцетин, по сравнению с арабиногалактаном, обладает более выраженным антиоксидантным действием, значительно снижая показатели перекисного окисления липидов и увеличивая количество в крови витамина Е и церулоплазмина, но несколько уступает комбинированному действию дигидрокверцетина и арабиногалактана [Корнеева Л.С., 2010]. Снижает показатели перекисного окисления липидов и арабиногалактан, в частности более значительно уменьшается количество малонового диальдегида по сравнению с группами получавшими дигидрокверцетин и арабиногалактаном, а также их сочетанном применении [Ли О.Н., 2011].

Наибольший эффект от применение природных антиоксидантов наблюдался при сочетанном применении дигидрокверцетина и арабиногалактана, так как применение препаратов в комбинации по сравнению с антиоксидантами применяемыми в отдельности достоверно снижало показатели перекисного окисления липидов в особенности количество диеновых конъюгат и гидроперекисей липидов и значительно увеличивало показатели витамина Е и церулоплазмина в крови у животных.

4. ВЫВОДЫ

1.При воздействии низких температур в эпителии слизистой оболочки трахеи наблюдается уменьшение продуктов реакции на щелочную фосфомоноэстеразу, маркера стволовых клеток, что проявляется в снижение числа базальных и особенно промежуточных клеток. Это наиболее выражено в краниальном отделе трахеи. В эпителии появляются очаги метаплазии, расширяются межклеточные пространства, увеличивается число и размер лимфоидных инфильтратов. В обоих отделах трахеи возрастает количество бокаловидных клеток; выявляются изменения ультраструктуры в

реснитчатых клетках: уменьшение высоты и количества ресничек, склеивание их, утрата реснитчатого слоя, в цитоплазме набухание митохондрий. Толщина базальной мембраны неравномерная, в ней уменьшается уровень реакции на щелочную фосфомоноэстеразу, что свидетельствует о снижении уровня обменных процессов между эпителием и рыхлой соединительной тканью.

2.Применение дигидрокверцетина на фоне воздействия холода приводит к увеличению количества базальных и промежуточных клеток, особенно в краниальном отделе, о чем свидетельствует высокая активность щелочной фосфомоноэстеразы в мембранах камбиальных клеток. В обоих отделах трахеи снижается количество бокаловидных клеток, изменения структуры реснитчатых клеток выражены меньше, чем при действии холода. Возрастает активность щелочной фосфомоноэстеразы в базальной мембране эпителия трахеи, что указывает на усиление обменных процессов в тканях.

3.При воздействии арабиногапактана на фоне низких температур в обоих отделах трахеи наблюдается рост числа базальных клеток и снижается количество бокаловидных элементов. Промежуточные клетки преобладают в краниальном отделе. В каудальном отделе трахеи на отдельных участках эпителия выявляются незначительные изменения структуры реснитчатых клеток. Повышается количество продуктов реакции на щелочную фосфомоноэстеразу в базальной мембране эпителия трахеи.

^Комбинированное применение дигидрокверцетина и арабиногалактана при действии низких температур приводит к росту числа базальных клеток, о чем свидетельствует повышение количества гранул на щелочную фосфомоноэстеразу в их мембранах. Возрастает количество промежуточных клеток особенно в краниальном отделе. Морфологические изменения в реснитчатых клетках незначительны, число их примерно такое же как и у интактных животных. Возрастает активность на щелочную фосфомоноэстеразу в базальной мембране эпителия, что свидетельствует об усилении уровня метаболизма в тканях.

5.Сочетанное применение дигидрокверцетина и арабиногалактана, достоверно, уменьшает уровень перекисное окисление липидов, и значительно увеличивает показатели витамина Е и церулоплазмина. Арабиногалактан обладает умеренно выраженным антиоксидантным действием, незначительно снижая количество малонового диальдегида. Дигидрокверцетин уступает комбинированному действию двух антиоксидантов, при этом уменьшение количества гидроперекисей липидов и диеновых конъюгат было более значительным, чем при применении арабиногалактана.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Основные результаты комплексного морфологического, морфометрического и биохимического анализа слизистой оболочки трахеи с оценкой их состояния при действии низких температур и на фоне применения природных антиоксидантов внедрены в программу преподавания на кафедрах медицинских и ветеринарных вузов, ЦНИЛа Амурской государственной медицинской академии.

2. Внедрен метод определения камбиальных клеток путем выявления реакции щелочной фосфатазы методом электронной микроскопии. Позволяющий объективно анализировать регенерационный потенциал малодифференцированных клеток при различных патологических состояниях и коррекции этих нарушений.

3. Применение природных антиоксидантов при длительном воздействии холода позволило выявить эффективность использования их в качестве корригирующего метода, что подтверждается морфологическими и биохимическими результатами.

4. Сочетанное применение природных антиоксидантов оказывает модулирующее влияние на регенерацию эпителия трахеи при длительном охлаждении, что дает основания рекомендовать их для дальнейшего изучения с возможным использованием в качестве средств, облегчающих адаптацию слизистой оболочки верхних дыхательных путях к экстремальным факторам внешней среды.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Целуйко, С.С. Современные взгляды на вопросы дифференЦировки камбиальных и стволовых клеток органов дыхания / С.С. Целуйко, Н.П. Красавина, К.В. Тимофеев, TJI. Огородникова, М.М. Горбунов, Л.С. Корнеева // Материалы II съезда врачей пульмонологов Сибири и Дальнего востока. — Благовещенск, 2007. — С. 146.

2. Tseluyko, S.S. Revealing precancerous stem cells in lung and a mammary gland / S.S. Tseluyko, M.M. Gorbunov, K.V. Timofeev, Т.Е. Kochegarova, O.V. Lysenko // IV Russia and China medical forum «Medical-biological bases of drug therapy in traditional east and up-to-date medicine». - Blagoveshchensk, 2007. — P. 130.

3. Горбунов M.M. Роль стволовых и камбиальных клеток в регенерации / Горбунов М.М. // Материалы девятой региональной научно-практической конференции, посвященной 150 - летию Амурской области «Молодеж 21 века: Шаг в будущее». - Благовещенск, 2008. - С. 17.

4. Gorbunov, М.М. Stem cell of epithelium of a trachea at cold influence against introduction digidroquertcetin / M.M. Gorbunov, S.S. Tseluyko, N.P. Krasavina // The 6th Russia and China Pharmaceuticals Forum «Modern problems of pharmacology, pharmacognosies and pharmaceuticses». — Blagoveshchensk, 2009. - P. 87.

5. Горбунов, М.М. Морфофункциональные критерии оценки клеток эпителия трахеи в эксперименте / М.М. Горбунов // Материалы одиннадцатой региональной научно-практической конференции, посвященной 65 годовщине Победы в Великой Отечественной войне «Молодежь 21 века: Шаг в будущее». — Благовещенск, 2010 — С. 106.

6. Целуйко, С.С. Стволовые клетки в тканях органов при холодовых воздействиях / С.С. Целуйко, Н.П. Красавина, М.М. Горбунов // Сборник научных трудов. К 80 летию со дня рождения профессора Алексея Андреевича Клишова «Вопросы морфологии 21 века». - Санкт - Петербург, 2010.-С. 180.

7. Целуйко, С.С. Стволовые клетки трахеи крыс при длительных холодовых воздействиях / С.С. Целуйко, Н.П. Красавина, М.М. Горбунов // Материалы третьего Международного Симпозиума «Актуальные вопросы клеточных технологий». Журнал «Клеточная трансплантология». - Москва, 2010.-Том 5, №3 - С. 52.

8. Целуйко, С.С. Стволовые клетки трахеи при холодовых воздействиях / С.С. Целуйко, М.М. Горбунов, Д.А. Семенов // Всероссийская научная конференция «Регенеративная биология и медицина». Сборник научных трудов. - Москва, 2011.- С. 160.

9. Целуйко, С.С. Современные взгляды на вопросы пролиферации и дифференцировки стволовых клеток органов дыхания в норме и при холодовых воздействиях / С.С. Целуйко, Н.П. Красавина, Д.А. Семенов, М.М. Горбунов, С.Д. Чжоу, Ц. Ли // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2012. - Вып.45. - С. 98 - 102.

10. Целуйко, С.С., Новый метод изучения ультраструктурной пространственной организации покровного эпителия слизистой оболочки трахеи / С.С. Целуйко, H.A. Вислобоков, П.Р. Казанский, Н.В. Швындина, В .Я. Шкловер, Д.А. Семенов, М.М. Горбунов // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. -2012. - Вып.45. - С. 52 - 53.

11. Gorbunov, М.М. Morphological characteristics of the mucous membrane of the trachea with an overall cooling in the 28 days on the background of dihydroquertcetin / M.M. Gorbunov // The 9 Sino-Russia Biomedical Forum. -Harbin, China, 2012. - P. 180.

Краткий указатель использованных условных сокращений ДКВ - дигидрокверцетин МДА - малоновый диальдегид

Горбунов Михаил Михайлович

Регенерационный потенциал слизистой оболочки трахей при действии низких температур и на фоне введения природных антиоксидантов

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 12.04.2013. Бумага офсетная. Формат 60x90/16. Бумага «Госзнак». Гарнитура тип Тайме. Тираж 100 экз. Заказ № 355. Отпечатано в типографии ООО «Поли-М» г. Благовещенск, ул. Кузнечная, 23

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Горбунов, Михаил Михайлович, Благовещенск

ФГБОУ ВПО ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

04? гН 159П92

На правах рукописи

Горбунов Михаил Михайлович

РЕГЕНЕРАЦИОННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ТРАХЕИ ПРИ ДЕЙСТВИИ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР И НА ФОНЕ ПРИМЕНЕНИЯ

ПРИРОДНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ

06.02.01 Диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -доктор медицинских наук, профессор Целуйко С.С.

Благовещенск - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

Краткий указатель использованных в диссертации условных сокращений..............................................................................5

1 ВВЕДЕНИЕ...........................................................................6

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................12

2.1 Морфологическая характеристика слизистой оболочки трахеи интактных крыс.......................................................................12

2.1.1 Эпителий слизистой оболочки трахеи интактных крыс................12

2.1.2 Физиологическая регенерация эпителиальной выстилки слизистой оболочки воздухоносных путей...........................................................16

2.1.3 Базальная мембрана.............................................................18

2.1.4 Собственная пластинка слизистой...........................................18

2.2 Морфологическая характеристика подслизистой основы...............19

2.3 Кровоснабжение трахеи..........................................................20

2.4 Морфологическая характеристика слизистой оболочки трахеи в патологии..............................................................................21

2.5 Слизистая оболочка трахеи при охлаждении..............................23

2.6 Процессы перекисного окисления липидов в норме и патологии... .25

2.7 Антиоксиданты природного происхождения и их применение в медицине................................................................................26

2.7.1 Дигидрокверцетин его характеристика и применение в медицине................................................................................28

2.7.2 Арабиногалактан его характеристика и применение в медицине.................................................................................30

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.........................................33

3.1 Материал и методы исследования............................................33

3.2 Гистологическая и ультраструктурная характеристика слизистой

и подслизистой оболочки трахеи интактных крыс..............................37

3.3 Морфологическая характеристика слизистой оболочки трахеи крыс при общем охлаждении организма (Т° - 15°С) в течение

28 дней по 3 часа ежедневно..........................................................49

3.4 Морфологическая характеристика слизистой оболочки трахеи крыс при общем охлаждении организма (Т° - 15°С) в течение

28 дней на фоне введения дигидрокверцетина..................................64

3.5 Морфологическая характеристика слизистой оболочки трахеи крыс при общем охлаждении организма (Т° - 15°С) в течение

28 дней по 3 часа на фоне введения арабиногалактана.......................70

3.6 Морфологическая характеристика слизистой оболочки трахеи крыс при общем охлаждении организма (Т° - 15°С) в течение

28 дней по 3 часа на фоне введения дигидрокверцетина и арабиногалактана.................................................................80

3.7 Анализ показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в тканях крыс при общем охлаждении

и на фоне методов коррекции......................................................90

4 Обсуждение полученных результатов.........................................95

4.1 Морфологическая характеристика слизистой оболочки краниального и каудального отделов трахеи интактных крыс.............95

4.2 Морфологическая характеристика слизистой оболочки краниального и каудального отделов трахеи при общем охлаждении

в течение 28 дней....................................................................98

4.3 Морфологическая характеристика слизистой оболочки краниального и каудального отделов трахеи при общем охлаждении

в течение 28 дней на фоне введения дигидрокверцетина.................102

4.4 Морфологическая характеристика слизистой оболочки краниального и каудального отделов трахеи при общем охлаждении

в течение 28 дней на фоне введения арабиногалактана...................106

4.5 Морфологическая характеристика слизистой оболочки краниального и каудального отделов трахеи при общем охлаждении

в течение 28 дней на фоне введения арабиногалактана

и дигидрокверцетина.............................................................110

4.6 Анализ показателей реакции перекисного окисления липидов и антиоксидантой системы в крови интактных

и экспериментальных крыс.....................................................114

5 ВЫВОДЫ.........................................................................118

6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.........................................120

7 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК........................................121

8 ПРЕДЛОЖНИЯ..................................................................142

Краткий указатель использованных в диссертации условных сокращений

АЛТ - аланинаминотрансфераза ACT - аспартатаминотрансфераза АФК - активная форма кислорода БАД - биологически активная добавка ДКВ - дигидрокверцетин ЖКТ - желудочно - кишечный тракт МДА - малоновый диальдегид ПОЛ - перекисное окисление липидов

1 ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Организм постоянно приспосабливается к стрессовым факторам окружающей среды [48]. Одним из них является низкая температура [66, 71, 146]. В связи с деятельностью человека по освоению территорий с суровыми климатогеографическими условиями. Эта проблема заслуживает пристального внимания [4,8,9,66,70,101, 137, 171]. Неблагоприятные факторы воздушной среды оказывают отрицательное влияние в первую очередь на эпителий воздухоносных путей [89, 96]. Особенно это проявляется при длительном пребывании организма в условиях низкой температуры воздуха, а также влияния на организм таких показателей как относительная влажность, скорость воздуха [55, 96, 98]. Под действием неблагоприятных факторов наступает поражение воздухоносных отделов дыхательной системы [79, 125, 136, 149]. Поражение, возникает тогда, когда все механизмы защиты и адаптации задействованы, а резервы использованы [88, 130]. Многими исследователями, как Дальневосточного региона, так и Сибири активно изучается действие холода на живой организм [4, 9, 23, 38, 39, 40, 55, 103, 125, 123, 127, 130]. При воздействии на организм неблагоприятных факторов окружающей среды происходит мобилизация его функциональных и метаболических резервов [77]. На начальных этапах адаптации защитно-компенсаторные процессы протекают на субклеточном уровне и клеточном уровнях и могут приостановить развитие, если их функциональные резервы достаточны [8, 137]. Известно, что почти каждая ткань в организме имеет запас стволовых клеток, которые пополняют ее клеточный состав, постоянно уменьшающийся в ходе функциональных перегрузок или болезней [2, 30, 61, 62, 65, 93, 128, 182]. Состояния, в результате которого, организм справляется с воздействием неблагоприятных факторов окружающей среды за счет вовлечения базальных клеток, рассматривается как одна из стадий адаптации [131, 126, 129, 165].

Кроме этого при длительном действии на организм низких температур, наблюдается активизация перекисного окисления липидов и депрессия

антиоксидантных систем [25, 26, 28]. При повреждении образуются клеточные факторы роста, которые регулируют пролиферацию и дифференцировку клеток в организме способствующих восстановлению дефекта [128, 133, 149]. В результате отмечается повышение доли экспрессии факторов пролиферации, а также повышение доли коммитированных форм стволовых клеток костного мозга [11, 86, 113, 121]. При этом стволовые клетки восполняют потерю специализированных клеток. Стволовые клетки выделены во многих органах и тканях, но их количество незначительно. Из стволовой клетки возникают разные тканевые производные [30, 62, 122, 134, 156]. Иными словами, стволовые клетки являются недифференцированными, присутствуют в дифференцированной ткани, обладают способностью к размножению и дальнейшему развитию [86, 126, 131]. Клеточные факторы, при повреждении ткани постоянно повышаясь, стимулируют пролиферацию стволовых клеток, дифференцирующихся в новый тип эпителия [108, 132]. Хронические заболевания воздухоносных отделов легких в большинстве северных регионов Сибири и Дальнего Востока характеризуются торпидностью течения, вялотекущими обострениями, отсутствием параллелизма между клиническими и морфологическими данными [81, 124, 135]. С учетом специфики патогенеза становится очевидной необходимость индивидуализации лечения, подбор оптимальных лекарств. Комплекс терапевтических мероприятий должен предупредить действие повреждающих факторов, усилить механизмы адаптации, сохраняя на оптимальном уровне процессы саморегуляции. Анализ литературных данных позволяет предположить, что интенсивность перекисного окисления липидов и состояние антиоксидантных систем, являются наиболее важными механизмами, при формировании хронического воспалительного процесса в органах дыхательной системы [57]. Одно из ведущих мест в области профилактики и лечения заболеваний занимают препараты природного происхождения, среди которых выделяют препараты, полученные на основе растительного сырья [41, 63, 115]. В древесине и коре лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина содержаться значительное

количество флавонойдов-дигидрокверцетина, арабиногалактана и дигидрокемпферола [19, 47]. Одной из главных характеристик этой группы соединений является выраженная антиоксидантная активность [39, 41]. Дигидрокверцетин и арабиногалактан активирует процессы регенерации [111]. Таким образом, биофлавонойд дигидрокверцетин и полисахарид арабиногалактан, имеют ценное пищевое и медицинское назначение.

Изучение препаратов стимулирующих дифференциацию клеток на фоне холодового воздействия может помочь найти пути контроля за дифференцировкой клеток и возможность применения их для терапии заболеваний легких.

Настоящая работа выполнена самостоятельно и является составной частью комплексной программы исследований кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии ГБОУ ВПО Амурская ГМА Минздрава Российской Федерации.

Цель исследования. Целью предоставленной работы является изучение регенерационного потенциала эпителия слизистой оболочки трахеи у экспериментальных животных на фоне воздействия холода и применение в ходе эксперимента медикаментозной коррекции природными антиоксидантами.

Задачи исследования:

1. Выявить морфологические проявления повреждающего действия низких температур в каудальном и краниальном отделах трахеи у экспериментальных животных. Определить критерии оценки регенерационного потенциала эпителия слизистой оболочки трахеи у экспериментальных животных (крыс) на фоне длительного холодового воздействия.

2. Дать сравнительную оценку морфологических показателей структур эпителия различных отделов трахеи у экспериментальных животных при общем охлаждении организма на фоне введения дигидрокверцетина и арабиногалактана, а также их комбинированного применения.

3. Сопоставить результаты биохимических показателей перекисного окисления липидов и морфологических изменений различных отделов трахеи,

полученных при воздействии на организм низких температур на фоне введения арабиногалактана и дигидрокверцетина.

Научная новизна и ценность полученных результатов. На основании полученных морфологических и морфометрических данных исследования расширенны представления о строении эпителия слизистой оболочки трахеи в частности камбиальных клеток трахеи. Разработаны морфологические критерии для оценки структурной организации регенерационного потенциала трахеи лабораторных животных при охлаждении и критерии оценки воздействия дигидрокверцетина и арабиногалактана на слизистую оболочку трахеи. Изучено комплексное исследование по выявлению базальных клеток эпителия в экспериментах методом щелочной фосфатазы. Впервые приведена гистологическая характеристика регенерационного потенциала эпителия слизистой оболочки трахеи на фоне длительного охлаждения при совместном применении дигидрокверцетина и арабиногалактана. Проведено изучение эпителия трахеи на светооптическом, электронномикроскопическом, растровом уровнях при воздействии на организм низких температур на фоне введения дигидрокверцетина и арабиногалактана и сочетанном применении.

Теоретическая и практическая значимость работы. Экспериментальные исследования служат теоретической основой для применения в клинической практике дигидрокверцетина и арабиногалактана. В частности даны рекомендации по использованию дигидрокверцетина и арабиногалактана для лечебной коррекции нарушений, возникающих в воздухоносных путях при патологии, особенно в осеннее - зимний период. Фактические данные и теоретические обобщения могут использоваться в научной и педагогической работе ряда лабораторий и кафедр медицинских и ветеринарных вузов, биологических отделений университетов. Опубликованные материалы работы используются в учебном процессе и научных исследований кафедр гистологии, эмбриологии, цитологии; госпитальной терапии; фармакологии; ЦНИЛа Амурской ГМА; в научно-исследовательской работе отдела инновационные методы диагностики и терапии, морфологии и патологии ГНУ

Дальневосточный зональный научно-исследовательский ветеринарный институт Россельхозакадемии.

Апробация работы. Основные положения исследования и материалы диссертации представлены и обсуждены на научных конференциях и форумах регионального и международного уровнях: материалы второго съезда врачей пульмонологов Сибири и Дальнего Востока (Благовещенск, 2007); на 4-ом русско-китайском медицинском форуме (Благовещенск, 2007); региональной научно-практической конференции «Молодежь XXI века: шаг в будущее» (Благовещенск, 2008); на 6-ом российско-китайском фармацевтическом форуме (Благовещенск, 2009); региональной научно-практической конференции «Молодежь XXI века: шаг в будущее» (Благовещенск, 2010); 9-ом китайско-российском биомедицинском форуме (Харбин, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных статей, из них 3 статьи в издательствах, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем диссертации. Общий объем диссертации составляет 149 страниц компьютерного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждения полученных результатов, выводы, практические рекомендации, список литературы и приложения. Список литературы включает 195 источников, в том числе 57 зарубежных и 138 отечественных. Диссертационная работа содержит 67 рисунков, 10 таблиц.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выявлены особенности морфологических изменений базальных клеток эпителия трахеи в регенерации каудальных и краниальных участков слизистой оболочки трахеи при действии низких температур на организм крыс.

2. Данные морфологического, морфометрического и биохимического исследований доказывают целесообразность применения дигидрокверцетина и арабиногалактана с целью коррекции регенерационного потенциала слизистой оболочки трахеи крыс связанных с действием низких температур.

3. Установлено, что наибольшим эффектом, позволяющим сохранить структуру воздухоносных путей при длительном действии низких температур, обладает дигидрокверцетин. Сочетанное применение арабиногалактана и дигидрокверцетина усиливают регенерацию в воздухоносных путях и нормализуют интенсивность перекисного окисления липидов и уровень антиоксидантной защиты.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Морфологическая характеристика слизистой оболочки трахеи

интактных крыс

Стенка трахеи представлена: слизистой оболочкой с эпителиальным покрытием, расположенным на базальной мембране и собственным слоем подслизистой основы, включающей в себя железы, хрящевые полукольца с трахеальной связкой, снаружи окруженные соединительной тканью, которая связывает трахеобронхиальное дерево со структурами средостения.

2.1.1 Эпителий слизистой оболочки трахеи интактных крыс

Эпителий, выстилающий поверхность слизистой оболочки, является однослойным, многорядным, мерцательным и включает в себя различные клеточные элементы [157, 177]. В настоящее время в составе эпителия выделяют следующие типы клеток: 1) базальные, 2) промежуточные, 3) бокаловидные, 4) реснитчатые, 5) клетки Кульчицкого, 6) щеточные [91]. Базальные клетки являются основным источником клеточной пролиферации в интактном эпителии воздухоносных путей [89]. Базальные клетки располагаются на базальной мембране, имеют многоугольную или продолговатую форму. У них округлое, богатое ДНК ядро, занимающее большую часть клетки. Часто они находятся в состоянии митоза [153, 177]. Митохондрии этих клеток мелкие, разбросаны по всей цитоплазме. Канальцы эндоплазматической сети не имеют зернистости. Редко встречаются элементы комплекса Гольджи. Эти клетки имеют многочисленные соединения, снабжены тонофибриллами, за счет которых усиливается контакты между всеми элементами эпителия, расположенными на базальной мембране. Они относятся к малодифференцированным клеткам эпителия [148, 177]. База