Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гипоталамическая нейроэндокринная регуляция структурно-функциональной реорганизации эпителия трахеи и внелёгочных бронхов крыс в условиях взаимодействия про- и эукариот

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Гипоталамическая нейроэндокринная регуляция структурно-функциональной реорганизации эпителия трахеи и внелёгочных бронхов крыс в условиях взаимодействия про- и эукариот"

БЕЗНОСИК Роман Валентинович

ГИПОТАЛАМИЧЕСКАЯ НЕЙРОЭНДОКРИННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РЕОРГАНИЗАЦИИ ЭПИТЕЛИЯ ТРАХЕИ И ВНЕЛЁГОЧНЫХ БРОНХОВ КРЫС В УСЛОВИЯХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРО - И ЭУКАРИОТ

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г 5 ушп

Оренбург-2013

005531672

005531672

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

ГБОУ ВПО «ОрГМА» Минздрава РФ Шевлюк Николай Николаевич.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Полякова Валентина Сергеевна

зав. кафедрой патологической анатомии ГБОУ ВПО «ОрГМА» Минздрава РФ;

доктор медицинских наук, профессор Четвертных Виктор Алексеевич зав. кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «ПГМА имени академика Е.А. Вагнера» Минздрава РФ.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет

им. А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «/$>> сентября 2013 г. в_ /Г часов на заседании диссертационного совета Д. 208.066.04 при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: Россия, 460000, г.Оренбург, ул. Советская, 6, зал заседаний диссертационного совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «ОрГМА» Минздрава РФ.

Автореферат разослан

«А?7>

июля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук профессор

Шевлюк Николай Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования.

Актуальность исследования продиктована важностью теоретического познания направленной регуляции со стороны гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы, при согласованной работе всех органов и систем организма, процессами реактивной компенсаторной адаптации, репаративной регенерации тканей организма с целью восстановления нарушенного гомео-стаза (Поленов A.JL, 1994; Стадников A.A., 2001; Акмаев И.Г., Гриневич В.В., 2003; Карташова O.JL, 2006; Кузнецов СЛ. с соавт., 2009; Стадников A.A., Бухарин О.В., 2012; Bindhu М.Р., Annamalai Р.Т., 2004; Hamdy A.A. et. al., 2010).

Новейшие экспериментальные данные, полученные при изучении особенностей гипоталамических нейросекреторных гуморальных факторов, показали более широкий спектр биологического воздействия нонапептидов на адаптивно-компенсаторные процессы, происходящие в тканях и органах в условиях интервенции различных патогенов, восстановительную регенерацию тканей различных органов и систем (Шаляпина И.Г. с соавт., 2005; Козлова А.Н. с соавт, 2011; Стадников A.A. с соавт, 2010; Вахитов Э.М., 2011; Ермолина Е.В., 2013; Логинова А.К., 2013). Здесь следует подчеркнуть теснейшую взаимосвязь и взаимообусловленность нервных и гуморальных процессов (Селье Г., 1960; Горизонтов П.Д., 1980; Поленов А.Л., 1994; Стадников A.A., 2001; Стадников A.A., Бухарин О.В., 2012).

К настоящему времени в изучении патологических процессов, протекающих при заболеваниях дыхательной системы человека и позвоночных животных, достигнут значительный прогресс, но многие вопросы адаптивных и компенсаторных генетически запрограммированных потенций тканей трахеи и бронхов, а также репаративных гистогенезов после их завершения требуют дополнительных исследований и изучения (Скучалина Л.Н. с соавт., 2001; Черняев А.Л. с соавт., 2001; Holgate S.T., 1993).

Изучение особенностей реактивных изменений и компенсаторных возможностей тканевой системы эпителия воздухоносных путей, ее гисто- и органотипических потенций, характера взаимодействия эпителиоцитов с патогенными бактериями, а также реакции и воздействия органных систем на эпителий трахеи и главных бронхов животных и человека остается и до сих пор весьма актуальным. Необходимость дальнейших исследований гипоталамических регуляторных воздействий на органы дыхательной системы для обеспечения адаптации эпителиоцитов трахеи и бронхов к значительным изменениям внешней среды и меняющимся условиям существования стано-

вится весьма очевидной (Поленов A.JL, Беленький М.А., 1973; Крижановский Г.Н., 2000; Акмаев И.Г. с соавт., 2001; Акмаев И.Г., Гриневич В.В., 2003). Поэтому изучение этих закономерностей стало предметом выполнения научной работы.

Цель исследования: установить роль и значимость гипоталамической нонапептидергической регуляции в процессах структурно-функциональной реорганизации тканевых элементов трахеи и внелёгочных воздухоносных путей в условиях взаимодействия про- и эукариот.

Задачи исследования:

1. В эксперименте изучить адаптивно-компенсаторные процессы в эпителии трахеи и внелегочных бронхов в сопоставлении их с состоянием гипо-таламо-гипофизарной нейросекреторной системы крыс в условиях интратра-хеального введения штаммов золотистого стафилококка, как обладающих антилактоферриновой активностью (АЛфА+), так и без таковой (АЛфА-).

2. Оценить реактивность и пластичность тканевых элементов эпителия трахеи и внелегочных бронхов крыс в условиях электролитического разрушения крупноклеточных ядер гипоталамуса с последующим интратрахеальным инфицированием животных штаммами стафилококка S.aureus, обладающими различными персистентными свойствами.

3. Изучить в эксперименте потенциальные возможности эпителиальных структур трахеи (после инфицирования экспериментальных животных-доноров штаммами золотистого стафилококка, обладающими антилактоферриновой активностью АЛфА+) в условиях их культивирования крысам-реципиентам (как с разрушенными крупноклеточными ядрами гипоталамуса, так и реципиентам без разрушения) по методу Ф.М. Лазаренко (1959).

Научная новизна полученных результатов. Впервые выявлены мор-фофункциональные особенности эпителия трахеи и внелегочных бронхов в условиях интратрахеального инфицирования штаммами стафилококка S.aureus, обладающими антилактоферриновой активностью (АЛфА+) так и без таковой (АЛфА-).

Получены новые данные о характере адаптивных и дезадаптивных изменений структурных элементов эпителия трахеи крыс в условиях интервенции микроорганизмов, в том числе обладающих персистентными свойствами и культивирования in vivo по методу Ф.М.Лазаренко (1959) реципиентам с разрушенными крупноклеточными ядрами гипоталамуса.

Впервые при использовании электролитического разрушения крупноклеточных нейросекреторных ядер гипоталамуса доказана адаптогенная и оптимизирующая роль гуморальных нонапептидов гипоталамуса в реализации

структурами эпителия трахеи и внелёгочных бронхов своего адаптивного, компенсаторного и репаративного потенциала.

Научно — практическая значимость работы. Результаты диссертационного исследования позволяют дополнить существующие представления о позитивной регулирующей роли гуморальных факторов нонапептидергиче-ских нейросекреторных ядер гипоталамуса в обеспечении реактивной адаптивно-компенсаторной реорганизации слизистой трахеи и бронхов, тканевого и клеточного гомеостаза сосудистых и стромальных элементов воздухоносных путей млекопитающих животных в условиях патогенной микробной интервенции.

Новые данные о роли и значимости нейропептидов крупноклеточных ядер гипоталамуса в оптимизации реактивно-приспособительных процессов в тканях эпителия трахеи и бронхов открывают новые перспективы в изучении роли нейроэндокринной регуляции взаимодействий про- и эукариот в условиях инфицирования структурных элементов дыхательных путей.

Полученные результаты создают методологические предпосылки последующим исследованиям для развития нейроэндокринологии, а также совершенствования ее научной базы с целью изыскания эффективных методов лечения заболеваний воздухоносных путей дыхательной системы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Характер и выраженность воспалительно - деструктивных процессов в эпителиальных тканях слизистой трахеи и внелёгочных бронхов в условиях интратрахеального инфицирования имеют прямую зависимость от перси-стентных свойств патогенных микроорганизмов и состояния гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы.

2. Электролитическое разрушение супраоптических либо паравентрику-лярных ядер гипоталамуса существенно ограничивает реализацию трахеоб-ронхиальными структурами своих адаптивных, компенсаторных, репаратив-ных и органотипических потенций.

3. Рассинхронизация фаз нейросекреции нонапептидергических ядер гипоталамуса, ограничение фаз высвобождения нейросекрета из перикарионов в аксоны, а также блокирование высвобождения нейросекреторных продуктов на уровне аксовазальных комплексов в нейрогипофизе, отражают персистент-ный потенциал золотистого стафилококка, обладающего антилактоферрино-вой активностью, которая усугубляет процессы высвобождения нейропептидов в кровоток.

Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии Оренбургской государственной медицинской академии при

изучении темы «Органы дыхательной системы» и в институте усовершенствования врачей МНКЦ имени П.В. Мандрыка МО РФ, а также используются в НИР ПНИЛ «Морфогенез и регенерация клеток и тканей» Оренбургской государственной медицинской академии.

Апробация работы. Основные положения работы были обсуждены на IX Российской конференции иммунологов Урала посвященной 90-летию профессора Л.Я. Эберта (Челябинск, 2011); Российской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы диагностики и лечения болезней органов дыхания» (Оренбург, 2011); Юбилейной сессии, посвященной 90-летию ЦНИИТ РАН «Актуальные вопросы борьбы с туберкулезом» (Москва, 2011); 9-ом съезде фтизиатров России «Туберкулез и болезни легких» (Москва, 2011); III- Эмбриологическом симпозиуме Всероссийского научного медицинского общества анатомов, гистологов, эмбриологов «Закономерности эмбрио-фетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных» (Ханты-Мансийк, 2011); Научной конференции - Сборе главных фтизиатров, пульмонологов главных санитарных врачей Военных округов (флотов) Вооруженных сил РФ (Пушкино, 2012).

Публикации. Основные положения работы изложены в 9 печатных работах, из них 5 в изданиях, рекомендованных ВАК при Минобрнауки РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 2 таблицы и 64 рисунка. Список литературы содержит 225 источников, включающих 169 отечественных и 56 иностранных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Экспериментальная часть работы выполнена на 105 белых беспородных крысах - самцах массой 220-250 г. Все эксперименты выполнялись в соответствии с Международными рекомендациями по проведению биомедицинских исследований с использованием животных, принятыми Международным советом научных обществ (CIOMS) в 1985 г., со статьей XI Хельксинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1964 г.) и правилами лабораторной практики в РФ (приказ МЗ РФ от 19. 06.2003 № 267).

Объектом исследования служили трахея и главные бронхи крыс, нейро-гипофиз, а также фрагменты гипоталамуса, содержащие супраоптические (СО) и паравентрикулярные (ПВ) ядра. Было выполнено 3 серии опытов.

6

В первой серии опытов разработана модель воспалительного процесса в трахее и бронхиальном дереве, для чего:

- 12 животным под эфирным рауш-наркозом с помощью инсулинового шприца интратрахеально вводили 1x109 КОЕ /мл микробных тел штаммов стафилококка S.aureus, обладающих антилактоферриновой активностью, содержащихся в 0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия;

- 12 животным произвели интратрахеальное введение штаммов стафилококка S.aureus, не обладающих антилактоферриновой активностью, концентрацией 1х109 КОЕ /мл, содержащихся в 0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия.

Для контроля использовано 12 интактных животных (по 3 на каждой стадии серии), которым интратрахеально вводили 0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия.

Вывод животных из эксперимента проводили через 1,3,7,21 сут. (по 3 особи).

Во второй серии проведено электролитическое разрушение паравентри-кулярных ядер гипоталамуса по методике A.A. Стадникова и А.Н. Варламова (1983) с последующим (через сутки интратрахеальным введением:

- 9 животным штаммов стафилококка S.aureus, обладающих антилактоферриновой активностью;

- 9 животным штаммов стафилококка S.aureus, не обладающих антилактоферриновой активностью.

Разрушение паравентрикулярных ядер гипоталамуса экспериментального животного осуществляли на базе известной конструкции для трансаурику-лярной гипофизэктомии у крыс (Федотов Б.А. с соавт., 1971) путем введения монополярных нихромных электродов в район ядер и подачи электрического анодного тока (V= 200 В, А = 0,5 - 1,0 мА, t = 5 - 10 с).

Вывод животных из эксперимента проводили на 1,3,7 сутки (по 3 особи на каждой стадии серии).

Для контроля использовано 9 ложнооперированных животных (трепанация черепа без разрушения ядер гипоталамуса) - по 3 особи на каждой стадии серии.

В третьей серии на 42 крысах-самцах проведено органотипическое культивирование фрагментов трахеи инфицированных штаммами S.aureus с различным персистентным потенциалом (АЛфА+ и АЛфА-) интактным крысами-реципиентам и крысам-реципиентам с разрушенными крупноклеточными ядрами гипоталамуса in vivo по методу Ф.М. Лазаренко (1959). Инфицирование достигли путем интратрахеального введения штаммов стафилококка S.aureus, как обладающих антилактоферриновой активностью,

так и без таковой, концентрацией 1х109 КОЕ /мл, содержащихся в 0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия крысам - донорам (6 животных).

Изъятые инфицированные фрагменты трахеи крыс-доноров, измельчались, смешивались с целлоидиновым "песочком" в соотношении 1:2 и помещались в карманы глубиной 1,0 - 2,0 см между фасцией и мышцами передней брюшной стенки крысы - реципиента. Карманы формировали под эфирным рауш-наркозом путем разреза кожи в 1,5-2,0 см длиной параллельно белой линии. Было сформировано по 2 имплантата у каждого животного-реципиента. При этом в качестве реципиентов использовано 36 белых беспородных крыс-самцов.

Вывод крыс из эксперимента осуществлялся путем передозировки эфирного наркоза (введения анестетика в летальной дозе) в утренние часы (10.00-11.00). Материал (имплантаты вышеуказанных органов) был взят для исследования на стадиях 1, 3, 6, 10 сутки культивирования (по 3 культуры каждого органа).

Крысы содержались в условиях вивария, имели свободный доступ к пище и воде за исключением времени эксперимента. Прооперированные животные содержались в тех же условиях вивария.

Исследуемые объекты (кусочки) трахеи и внелёгочных бронхов крыс, а также фрагменты головного мозга (гипоталамус, нейрогипофиз), имплантаты были подвергнуты однотипной гистологической обработке.

При обработке полученного материала были использованы методы световой микроскопии, гистохимии и морфометрии с последующим статистическим анализом количественных данных.

Для светооптических исследований материал фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина, спирт-формоле, жидкости Буэна, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали целлоидин-парафином. Приготовление серийных срезов толщиной 5-6 мкм осуществляли на ротационном микротоме МПС-2. Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином, перйодат-Шифф реакцией по Мак-Манусу + контроль с амилазой.

Для идентификации в имплантатах клеток с признаками пролиферации применяли иммуноцитохимическую реакцию с моноклональными антителами Ю-67 (наборы реактивов фирмы ('Т)ако" Дания).

На первом этапе депарафинированные срезы подвергали высокотемпературной обработке и инкубации с первыми (специфическими) моноклональными антителами, используя наборы реактивов фирм 'Т>ако" (Дания) в рабочем разведении 1:50. Докрашивание ядер проведено 0,5% раствором метиленового зеленого на 0,1 М ацетатном буфере.

На втором этапе осуществляли инкубацию гистосрезов с моноклональ-ными антителами и авидин-биотин-пероксидазным комплексом с последующим выявлением пероксидазы диамин-бензидином. Подготовленные таким образом гистологические срезы докрашивали квасцовым гематоксилином и заключали в бальзам "Intergen" (Канада). Определение Ki-67 позитивных клеток производили методом их визуализации в каждом гистологическом срезе (при стандартном увеличении х 900, не менее 200 клеток) в соответствии с рекомендациями A.A. Жданкиной (2006).

Морфометрические исследования выполнены на препаратах с использованием исследовательского цифрового микроскопа Levenuk D 870 Т и цифровой камеры (Levenuk Digital Camera, 8.0 Мпикс.) с программой «Измерение размеров».

Статистический метод. Полученные цифровые данные обработаны статистически при помощи пакета программ «Statistica 5.5 for Windows» и программного пакета «MS Excel 2003». Производили подсчёт среднеарифметических значений абсолютных и относительных величин (М), ошибок средних величин (ш) и стандартных отклонений (s). Достоверность различий сравниваемых показателей определяли по t-критерию Стьюдента (наиболее популярный в медицинских исследованиях тест на достоверность различий средних величин, сравниваемых выборок). Различия между средними величинами (М±ш) считались достоверными при р<0,05 (95%).

Результаты собственных исследований и их обсуждение

С точки зрения биологического учения о тканях, морфофункциональная реорганизация гистоструктур макроорганизма в условиях интервенции различного рода патогенов, представляет собой сложные и многогранные взаимодействия эукариот с прокариотами. Вся совокупность структурных и функциональных особенностей тканей, которая обнаруживается в различных условиях существования организма, подчиняется закономерностям, заложенным в период фило- и эмбрионального развития (Поленов A.JL, 1994; Барков В.Н. 2004; Вахитов Э.М., 2011; Стадников A.A., Бухарин О.В., 2012).

Структурно-функциональная характеристика эпителия трахеи и внелегочных бронхов крыс в условиях интратрахеального инфицирования штаммами S.aureus, обладающими антилактоферриновой активностью

и без таковой

На основании данных световой микроскопии нами установлено, что в контрольной серии животных (животные, которым интратрахеально вводили

0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия) на всех стадиях эксперимента эпителий трахеи и главных бронхов находился в характерном для интактного животного морфофункционального состояния.

Светооптическая и ультраструктурная оценка состояния нейрогипофиза, супраоптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса показала, что ГГНС контрольных животных на всех стадиях эксперимента находилась в адекватном морфофункциональном состоянии. Это согласуется и с ранее полученными данными исследователей (Поленов А.Л. 1994; Стадников A.A., 2001; Шаляпина В.Г. с соавт., 2005; Стадников A.A., Бухарин О.В., 2012; Laorden М.1.,1997).

Как в супраоптических, так и в паравентрикулярных ядрах преобладали «светлые» функционально-активные НСК. Очевидно, что в них синтез и экструзия нейросекрета были уравновешены.

В условиях интратрахеального введения штаммов стафилококка, не обладающих антилактоферриновой активностью изъятые кусочки трахеи и внелёгочных бронхов экспериментальных животных, позволили получить поэтапные данные, касающиеся морфофункциональной адаптивной реорганизации тканевых эпителиальных структур слизистой оболочки исследуемых участков воздухоносных путей.

Так, через сутки после инфицирования S.aureus выявлено, что морфо-функциональное состояние эпителия трахеи и бронхов в основном сохранилось. Клетки имели межклеточные контакты, хотя в некоторых полях зрения наблюдались нарушения межклеточных соединений. Значащих деструктивных нарушений в мукоцилиарном аппарате трахеи и бронхов не обнаруживалось. Имелись лишь незначительные признаки гиперсекреции мукоцитов. Мы констатируем, что незначительная структурная реорганизация эпителия трахеи и бронхов позволяет сделать вывод о начале воспалительной реакции по типу острого трахеобронхита.

Интратрахеальное введение золотистого стафилококка в дальнейшем оказало существенное влияние на морфологическое состояние эпителия, как трахеи, так и главных бронхов.

На стадиях 3-7 суток в трахее инфицированных экспериментальных животных обнаруживалась слизистая или слизисто-гнойная мокрота. Отмечено набухание (отек) слизистой оболочки в участках воспаления и очаговая гиперплазия в главных бронхах, усилилась секреция слизи. В этих участках базальная мембрана неравномерно утолщена. Появились деструктивно измененные мерцательные клетки, потерявшие значительную часть своих ресничек. Нормальное соотношение числа мерцательных и секреторных клеток изменено в пользу бокаловидных клеток, что привело к частичному

нарушению дренажной функции бронхов. Межклеточные связи в эпителии нарушились с образованием широких просветов, имелись очаги некроза с локальными некробиотическими повреждениями эпителиальных клеток. В этот период наблюдался выраженный альтеративный компонент воспалительно-деструктивного процесса, включая процессы апоптоза, который протекал на фоне интенсивной инфильтрации нейтрофилами, эозинофилами, лимфоцитами, моноцитами. Имела место выраженная экстравазация плазмы и форменных элементов крови.

К 21-м суткам интенсивность воспалительного процесса снизилась. В слизистой оболочке начали проявляться признаки репаративных гистогенезов тканевых структур эпителия трахеи и бронхов воздухоносных путей. Реснитчатые и бокаловидные клетки эпителия восстанавливались за счет базальных (камбиальных) и вставочных клеток. Соотношение мерцательных и секреторных клеток эпителия трахеи и бронхов начало восстанавливаться, что послужило возобновлению очистительной функции воздухоносных путей (Рис.1). Воспалительный процесс угасал, число лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов уменьшилось. Возобновлялись межклеточные контакты.

Следует сказать, что на всех стадиях указанного эксперимента воспалительный процесс носил мозаичный характер. В целом морфологические изменения в слизистой трахеи и внелёгочных бронхов полностью укладывались в картину традиционного течения острого трахеобронхита, описанного в научной литературе (Шмелев Е.И., 2004; Сапа Ю.С.с соавт,, 2005; Noguera А. et al., 2004).

На основании исследований объектов слизистой оболочки трахеи и главных бронхов экспериментальных крыс в условиях интратрахеального

Рис. 1. Фрагмент стенки главного бронха экспериментального животного, интратрахеально инфицированного З.аигеив без антилактоферриновой активности. Стадия эксперимента: 21 сутки. Фиксация: спирт-формол. Окраска: гематоксилин Майера и эозин. Ув. х 400

введения штаммов стафилококка, обладающих антилакгоферриновой активностью, установлено, что значительный персистентный потенциал этих микроорганизмов вызывал в трахее и в бронхах более выраженный воспалительный процесс. Очаги воспаления в данных условиях были размерами больше, чем при инфицировании микроорганизмами, не обладающими антилакгоферриновой активностью.

При оценке реактивной реорганизации в эпителии трахеи и главных бронхов было установлено, что уже через 1- 3 сутки эксперимента воспалительный процесс, в отличие от рассмотренного ранее, характеризовался нарастанием альтеративных деструкций в эпителии трахеи, и бронхов. Соотношение мерцательных и секреторных эпителиальных клеток начало изменяться в пользу гипертрофированных бокаловидных клеток. В очагах воспаления имелись нарушения межклеточных связей эпителиоцитов, особенно в эпителии трахеи. Некоторые мерцательные клетки имели деструктивный вид с потерей ресничек, что привело к нарушениям мукоцилиарного транспорта, а это, в свою очередь, оптимизировало условия для колонизации микроорганизмов и развития патологического процесса.

Стало очевидным, что баланс между про- и противовоспалительными эффектами, который в нормальных условиях поддерживался гуморальными факторами эпителия, значительно нарушен в пользу провоспалительного эффекта, что, вероятнее всего, привело к длительной хронизации патологического процесса (Черняев A.JI. с соавт, 2001).

Из литературы известно, что существенным фактором риска, вызывающим формирование вторичных очагов острого и хронического воспаления воздухоносных путей, является персистирование стафилококков на поверхности слизистых оболочек трахеи и бронхов (Бухарин О.В. с соавт., 1999; Маянский A.M., 1999; Стадников A.A., 2001; Макарова О.В. с соавт., 2005; Ноников В.Е. 2008).

Нами установлено, что в очагах воспаления процесс гиперсекреции бокаловидных клеток переходил в усиленную фазу, граничащую с дистрофией. Мерцательных эпителиальных клеток в этих очагах практически не обнаруживалось. Появились оголенные участки базальной мембраны. В условиях нарушенного микроокружения базальные клетки изменили свою нормальную дифференцировку и регенерацию покровного эпителия, начался процесс замещения реснитчатых и бокаловидных клеток эпителиоцитами плоской полигональной формы.

К 21-м суткам после инфицирования в очагах воспаления произошла существенная смена однослойного многорядного эпителия трахеи двухслойным плоским эпителием, произошла метаплазия эпителия (Рис. 2). В этих

местах собственная пластинка слизистой оболочки бронхов склерозирована, наблюдался скудный инфильтрат.

Рис. 2. Фрагмент стенки трахеи экспериментального животного инфицированного Б.аигеиз с АЛфА+. А. Участок замещения многорядного мерцательного эпителия двухслойным плоским эпителием. Стадия эксперимента: 21 сутки. Фиксация: спирт-формол. Окраска: гематоксилин Майера и эозин. Ув. х 200

Все это свидетельствовало о существенной перестройке эпителия трахеи и бронхов и о переходе патологического процесса в хроническую фазу трахеобронхита, что, по данным литературы, сопровождается частичной утратой способности эпителия синтезировать защитные (барьерные) факторы - лактоферрин, секреторный иммуноглобулин А., и др. (Кокосов А.Н., 2002, 2007).

Обращает на себя внимание то обстоятельство, что морфофункциональ-ная перестройка эпителия трахеи и главных бронхов в случае интервенции штаммов стафилококка Б.аигеш, обладающих антилактоферриновой активностью (АЛфА+), вызвана острым воспалительным процессом, который целиком и полностью зависит от высокой вирулентности, интенсивности и длительности воздействия патогенных микроорганизмов на эпителий трахеи и главных бронхов.

Сравнивая результаты экспериментов при инфицировании экспериментальных животных штаммами стафилококка З.аигеиБ, обладающими антилактоферриновой активностью, с результатами при инфицировании микроорганизмами, не обладающими таковой активностью, отмечаем, что деструктивные изменения в эпителии в первом случае проявились в большей степени и проходили значительно интенсивнее. В эпителии, как трахеи, так и главных бронхов воспалительный процесс был более выраженным. Кровеносные сосуды микроциркуляции трахеи и бронхов ответили более значительной экссудацией плазмы с экстравазацией клеток воспаления.

Что касается степени воспалительной инфильтрации стенки трахеи и главных бронхов, то отмечаем, что она была различной: в трахее она поверхностная, а в главных бронхах она локализовалась в слизистой оболочке и сопровождалась развитием эрозий, изъязвлений. В этом отношении наши данные согласуются с утверждениями А.Л Черняева с соавт., (2001), А.Г. Чучалина. с соавт. (2008), Д.Б. Утешева с соавт. (2010) об инфильтрации при острых воспалительных процессах в трахее и бронхах.

Морфологическое состояние гипоталамо-гипофизарной системы крыс при экспериментальном остром трахеобронхите, вызванном интратрахеальным инфицированием стафилококками 5.аигею с различной антилактоферриновой активностью Оценивая в целом результаты исследования крупноклеточных ядер гипоталамуса экспериментальных крыс, можно сформулировать вывод о важности и ведущей роли гипоталамических нонапептидов в обеспечении тканевой резистентности к воздействиям патологических микроорганимов, в реактивной адаптивной компенсаторной реорганизации гистологических структур эпителия трахеи и главных бронхов экспериментальных животных в целях восстановления нарушенного гомеостаза.

Полученные нами экспериментальные данные подтверждают существующую незамедлительную реакцию гипоталамо-гипофизарного комплекса, принимающего участие в формировании адаптивных реакций эпителия трахеи и главных бронхов, на интервенцию в воздухоносные пути патогенных микроорганизмов.

Мы прослеживали имеющуюся связь между процессами адаптивной реорганизации, происходящими в эпителии слизистых оболочек трахеи и главных бронхов экспериментальных животных при остром воспалении, и процессами, происходящими в крупноклеточных ядрах гипоталамуса этих животных в тот же период времени

На основании морфометрических данных ядер и ядрышек нейросекре-торных клеток паравентрикулярных и супраоптических ядер гипоталамуса экспериментальных животных установлено, что воспалительный процесс в трахее и бронхах вызывал реакцию со стороны крупноклеточных ядер гипоталамуса (Табл.1,2).

Через сутки размеры ядер функционально активных «светлых» нейро-секреторных клеток, а также их ядрышек, как супраоптических, так и паравентрикулярных ядер гипоталамуса уменьшились в размерах. Мы предполагаем, что произошла экструзия имевшегося запаса нейрогормонов нейросекретор-ных клеток через аксовазальные контакты нейрогипофиза в кровоток

Таблица 1. - Морфометрические показатели нейросекреторных клеток

("светлых") супраоптических ядер гипоталамуса крысы, (мкм2)

Вид эксперимента Контрольная серия Сроки наблюдения

1 сут. 3 сут. 7 сут. 21 сут.

Инфиц. без АЛфА- Площадь ядра 173,04 ±0.22 135.57±2.20 355.06±4.34 204.33±0.15 192.43±2.13

Площадь ядрышка 39.04±0.81 17.45±0.02 55.74±0.21 49.82±0.63 42.37±2.21

Инфиц. с АЛфА+ Площадь ядра 173,04±0.22 97.34±0.21 447.49±0.15 393.12±0.11 329.15±0.15

Площадь ядрышка 39.04±0.81 18.31±0.31 46.7±1.32 44.02±0.15 41.12±0.15

Таблица 2. - Морфометрические показатели нейросекреторных клеток

("светлых") паравентрикулярных ядер гипоталамуса крысы, (мкм2)

Вид эксперимента Контрольная серия Сроки наблюдения

1 сут. 3 сут. 7 сут. 21 сут.

Инфиц. без АЛфА- Площадь ядра 204.78±0.71 92.15±0.43 306.59±0.61 289.01±0.08 217.33±0.73

Площадь ядрышка 49.30±1.21 47.30±0.22 54.01±1.13 52.14±0.49 49.91±0.37

Инфиц. с АЛфА+ Площадь ядра 204.78±0.71 135.57±0.37 447.49±0.44 355.56±1.03 293.37±1.13

Площадь ядрышка 49.30±1.21 41.81±1.17 58.33±1.22 56.44±0.09 52.92±0.27

Примечание: Площадь видимого сечения ядра определялась как площадь эллипса.

Площадь видимого сечения ядрышка определялась как площадь круга. Различия между средними величинами (М±т) считались достоверными при р < 0,05 (95%).

На 3 сутки эксперимента данные морфометрических исследований демонстрировали функциональную активизацию нейросекреторных клеток: размеры цитоплазмы, ядер и ядрышек нейросекреторных клеток увеличились до размеров, которые превышали размеры аналогичных ядер и ядрышек контрольных животных. Мы считаем, что это связано с усилением синтеза нейросекрета и с затрудненным выводом его в цитоплазму и аксоны НСК.

Однако уже с 7 суток эти показатели начали возвращаться к своим исходным значениям размеров ядер и ядрышек. Возврат размеров ядер и ядрышек нейросекреторных клеток гипоталамуса к первоначальным у животных, инфицированных S.aureus с антилактоферриновой активностью, носил замедленный (пролонгированный) характер, что свидетельствует о наличии существенной рассинхронизации фаз секреторного цикла НСК.

Значительная активизация секреторного процесса в нейросекреторных клетках привела к износу и дегенерации клеток, в силу чего количество пикноморфных (истощенных) клеток возросло (Рис.3).

Рис. 3. Пикноморфные нейросекреторные клетки паравентрикулярного ядра гипоталамуса крысы, инфицированной S.aureus с АЛфА+. Стадия эксперимента: 7 сутки. Фиксация: спирт - формол. Окраска: гематоксилин Майера и эозин.

Ув.х.400

Отмечено изменение соотношения «светлых» и пикноморфных НСК в пользу последних, некоторые из них дегенерировали, приобретая угловатую, различной степени сжатости форму тела и пикнотические ядра.

В условиях интратрахеального введения стафилококков с антилактофер-риновой активностью АЛфА+ секреторная активность нонапептидергических НСК возросла, они пребывали в состоянии длительной гиперсекреции с сильно гипертрофированными перикарионами. Вероятно произошла блокировка высвобождения гипоталамического нейросекрета в цитоплазму на фоне усиленного формирования нонапептидов.

Существенный дефицит гипоталамических нейрогормонов в гемоцирку-ляции, на наш взгляд, оказал лимитирующий эффект на реализацию тканевыми структурами слизистых оболочек трахеи и бронхов экспериментальных животных своих компенсаторных и приспособительных потенциальных возможностей в условиях их противостояния микробным агентам, обладающим выраженными персистентными свойствами.

Реорганизация эпителия трахеи и внелёгочных бронхов крыс под воздействием штаммов Б.аигеиз с различным антилактоферриновым потенциалом в условиях искусственного разрушения крупно клеточных ядер переднего гипоталамуса

Электролитическое разрушение крупноклеточных ядер гипоталамуса экспериментальных крыс по методике A.A. Стадникова и А.Н. Варламова (1983) с последующим (через сутки) интратрахеальным введением крысам штаммов S.aureus с АЛфА+ и АЛфА-, вызвало значительные воспалительно-деструктивные изменения в эпителии трахеи и главных бронхов, прогрессивно

нарастающие уже с 1-3-х суток наблюдений. Более значительным было кровенаполнение сосудов микроциркуляционного русла трахеи и главных бронхов, развивался выраженный отек их слизистой и подслизистой, произошло неравномерное утолщение базальной мембраны. В значительных очагах стали заметными изменения в функциональном состоянии мукоцили-арного экскалатора, которые произошли вследствие значительной потери как ресничек мерцательными клетками, так и самих клеток. Усилилась секреция слизи бокаловидными клетками и секреторными железами, что привело к увеличению гелевой составляющей в секреторной слизи.

Наши экспериментальные данные подтверждают более значимую степень интенсивности воспалительно-деструктивного процесса в данном эксперименте, нежели в экспериментах без разрушения ядер гипоталамуса, ответные реакции носили более манифестные показатели всех компонентов воспаления в слизистой оболочке трахеи и главных бронхов.

Электролитическое разрушение паравентрикулярных ядер гипоталамуса привело к более выраженной реакции кровеносных и лимфатических сосудов, к увеличению отека и инфильтрации тканей слизистых оболочек лейкоцитами, моноцитами, фибробластами и плазматическими клетками. Нейтрофильные сегментоядерные лейкоциты пронизывали компоненты слизистой оболочки трахеи и бронхов, образуя крупные скопления в бронхиальном содержимом.

При инфицировании животных Б-аигеш с АЛфА+ воспалительная реакция эпителиальных структур главных бронхов на стадии 7 суток носила необратимый дисрегенераторный характер. Наблюдались значительные очаговые структурные повреждения клеток эпителия, завершающиеся его локальной десквамацией. В эпителиальных очагах воспаления произошла необратимая утрата реснитчатых эпителиоцитов, отмечено оголение, набухание, дезорганизация и разрушение структур базальной мембраны (Рис.4).

Наши результаты позволяют в полной мере сделать определенное заключение о том, что разрушение крупноклеточных ядер гипоталамуса вызвало более резкое нарастание деструктивных процессов гистоструктур эпителия, морфофункциональную его дезорганизацию со значительно выраженным гетероморфизмом его элементов. Эпителий трахеи и бронхов в очагах поражения имел значительные разрушения, выраженное деструктивное состояние, что значительно снижало эффективность очистительного процесса в дыхательной системе.

Особенностью данной серии экспериментов явились тяжелые патологические деструктивные процессы в трахее и в главных бронхах, которые напрямую связаны с потерей корригирующего и стимулирующего воздействия

Рис. 4. Фрагменты стенки трахеи (А) и стенки бронха (Б) экспериментального животного, у которого выполнено разрушение крупноклеточных ядер гипоталамуса и инфицирование S.aureus с АЛфА+. Стадия эксперимента: 7 сутки. Фиксация: спирт-формол. Окраска: гематоксилин Майера и эозин. Ув. х.400

гипоталамических нонапептидов на адаптивно-приспособительные реакции эпителия трахеи и бронхов экспериментальных животных. Это оказало лимитирующий эффект на реализацию тканевыми структурами слизистых оболочек трахеи и бронхов экспериментальных животных своих адаптивно-приспособительных потенциальных возможностей, особенно в условиях инфицирования микробными агентами, обладающими антилактоферриновой активностью.

Реактивные изменения инфицированных эпителиальных структур трахеи крысы в условиях имплантации их in vivo по методу Ф.М. Лазаренко Наши наблюдения показали, что в первые сутки культивирования вокруг имплантатов наблюдался вал мигрировавших лейкоцитов, среди которых преобладали сегментоядерные нейтрофилы и моноциты. Наблюдался отек соединительной ткани, а также отмечалась миграция малодифференцирован-ных фибробластов к имплантату.

Воспалительная реакция в зоне имплантата была более выраженной у животных с разрушенными крупноклеточными ядрами передней области гипоталамуса и с инфицированием донорского материала золотистым стафилококком с антилактоферриновой активностью (Рис 5).

Рис. 5. Фрагмент слизистой оболочки трахеи в условиях имплантации in vivo по методу Ф.М. Лазаренко. Реципиент: Крыса с разрушенными ядрами гипоталамуса. А. Скопление нейтрофильных гранулоцитов.

Б. Сохраненные эпителиоциты. Стадия эксперимента: 3 сутки. Фиксация: спирт-формол. Окраска: гематоксилин Майера и эозин. Ув. х 400

В худших условиях трофики оказались центральные зоны имплантатов, здесь уже к третьим суткам культивирования отмечались явления деструкции и некроза клеточных элементов культивируемых фрагментов трахеи. Особенно это было характерно для имплантатов, инфицированных S.aureus с анти-лактоферриновой активностью и у реципиентов с разрушенными ядрами передней области гипоталамуса.

На 3-й - 7-е сутки по поверхности имплантата разрасталась малодиффе-ренцированная соединительная ткань, которая проникала и внутрь периферической зоны имплантата. В этой соединительной ткани отмечалось врастание в имплантат кровеносных капилляров, идущих от кровеносных сосудов реципиента, капилляры располагались, как по поверхности имплантата, так и внутри него.

На 3-й сутки в периферической зоне имплантатов отмечалось формирование эпителиальных почек роста. Камбиальные клетки культивированного эпителия трахеи переходили в пролиферативное состояние и образовывали эпителиальные пролифераты (Рис. 6).

На 6-е сутки культивирования отмечалось перемещение пролифери-рующего эпителия в виде пластов и тяжей по соединительной ткани, а также вступление этого эпителия в период дифференцировки и апитичного функционирования.

На 7-е - 10-е сутки в имплантатах отмечались сформированные эпителиальные трубочки.

Следует отметить, что пролиферативная активность эпителия была менее выраженной у имплантатов, инфицированных стафилококками с антилак-тоферриновой активностью и культивированных в организме реципиентов с разрушенными ядрами передней области гипоталамуса.

Рис.6. Эпителиальный пролиферат (А). Имплантат трахеи крысы, инфицированной интратрахеально штаммами 8.аигеиз с антилактоферриновой активностью АЛфА+. Реципиент: крыса с разрушенными ядрами гипоталамуса. Стадия эксперимента: 3 сутки. Фиксация: спирт-формол. Окраска: гематоксилин Майера и эозин. Ув. х 200

Низкая пролиферативная активность культивируемой эпителиальной ткани в этом случае может быть обусловлена как инфицированием донорского материала высоковирулентным штаммом стафилококка, так и дефицитом гипоталамических нонапептидов у животных - реципиентов.

После 10-х суток культивирования в сформированных эпителиальных трубочках и тяжах отмечались регрессивные изменения и гибель клеточных элементов. Более выраженными эти процессы отмечались в случаях инфицирования имплантатов стафилококками с антилактоферриновой активностью и при культивировании в организм реципиентов с разрушенной передней областью гипоталамуса.

Анализ экспрессии белка Ю-67 в имплантатах показал, что число клеток периферической зоны имплантата, маркируемых Кл-67, нарастало от начала культивирования до 6 суток, а затем снижалось (в связи с деструкцией и гибелью пролиферирующих клеток).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что инфицирование имплантатов штаммом золотистого стафилококка с антилактоферриновой активностью, а также предварительное разрушение крупноклеточных ядер гипоталамуса реципиентов лимитировали реализацию репаративных потенций эпителиальных структур трахеи в условиях культивирования их в организме реципиента по методу Ф.М. Лазаренко.

Выводы

1. Воздействие бактериальных патогенов, в том числе обладающих выраженным персистентным потенциалом, на эпителий трахеи и внелегочных бронхов вызывает структурно-функциональные реорганизации эпителия и

адаптивную реакцию нейросекреторных клеток крупноклеточных ядер гипоталамуса. Нарастание воспалительного процесса в эпителии трахеи и бронхов крыс на 3 - 7 сутки эксперимента вызывает усиление нейросекреции гуморальных факторов нонапептидергическими нейросекреторными центрами гипоталамуса и повышение высвобождения нонапептидов в общий кровоток.

2. В условиях интратрахеального инфицирования животных S.aureus с различной антилактоферриновой активностью, но без разрушения паравен-трикулярных ядер гипоталамуса, на стадии 7 суток происходит частичное восстановление структур и функций эпителия трахеи и внелегочных бронхов, что особенно выражено при инфицировании S.aureus без антилактоферриновой активности.

3. На стадии 7 суток, после воздействия на слизистые оболочки трахеи и бронхов экспериментальных животных микроорганизмов с АЛфА+, установлен факт частичного блокирования высвобождения нейросекрета на уровне аксовазальных контактов, что можно трактовать как интенсивную гиперсекрецию, происходящую на грани истощения пептидергических НСК гипоталамуса (пикноморфные нейросекреторные клетки).

4. В условиях разрушения паравентрикулярных ядер гипоталамуса и воздействия на эпителий трахеи и бронхов экспериментальных животных микроорганизмами S.aureus с АЛфА+ на стадии 7 суток эксперимента, наблюдалась значительная деструкция эпителиальных структур трахеи и внелегочных бронхов экспериментальных животных, были более манифестные показатели всех компонентов воспаления с преобладанием альтерации, включая явления апоптоза.

5. Реализация тканями трахеи и внелегочных бронхов своих гисто - и ор-ганотипических потенций в значительной мере обусловлена воздействиями гипоталамических нонапептидов. Это положение достоверно подтверждается изучением гисто и органотипических возможностей эпителиальных структур в условиях культивирования in vivo, что проявилось в значительном утяжелении воспалительного процесса в имплантатах трахеи и снижением пролифератив-ной акивности культивируемых тканей у экспериментальных животных при электролитическом разрушении паравентрикулярных ядер.

6. Реализация тканями трахеи и внелегочных бронхов своих репаратив-ных потенций обусловлена адаптивными воздействиями гипоталамических нонапептидов на клеточный и тканевой гомеостаз животных, в том числе в условиях инфицирования.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гисто- и цитологические аспекты гипоталамической ненроэндок-рииной регуляции взаимодействий про- и эукариот, реализуемых в эпителиальных структурах трахеи и бронхов крыс // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2011. - № 2/1. - С. 69 - 70 (соавт. Стадников A.A.. Козлова А.Н., Шевлюк H.H.)

2. Структурно-функциональные изменения эпителия трахеи крыс в условиях интратрахеального инфицирования бактериями с различными перси-стентными свойствами // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы диагностики и лечения болезней органов дыхания». Оренбург. - 2011. - С. 22 - 26. (соавт. Вахитов Э.М., Лабутин И.В.)

3. Морфофункциональная реорганизация эпителия трахеи и бронхов крыс в условиях инфицирования организма (нейроэндокринные аспекты) // Морфология. 2011. - Т.140, № 5— С 71 - 72. (соавт. Козлова А.Н., Шевлюк H.H.)

4. О роли персистентного потенциала бактерий в структурно-функциональной реорганизации крупноклеточных ядер гипоталамуса // Информационный архив. 2011. - Т.5, № 2-3. - С.37 - 39 (соавт. Вахитов Э.М., Лабутин И.В.)

5. Особенности реорганизации эпителия слизистой оболочки трахеи и внелегочных бронхов под воздействием бактериальных прокариот с различным персистентным потенциалом // Военно-медицинский журнал. 2012. - Т.ЗЗЗ, № 3. - С. 61 - 62. (соавт. Вахитов Э.М., Шевлюк H.H.)

6. Изменения эпителия слизистой оболочки трахеи и внелегочных бронхов под воздействием бактериальных прокариот // Актуальные вопросы военной фтизиатрии. Сборник научных трудов. Т.1. - Пушкино, 2012. - С. 33 - 34 (соавт. Вахитов Э.М., Шевлюк H.H.)

7. Реорганизация эпителия трахеи и внелегочных бронхов крыс в условиях патологического процесса под влиянием гипоталамической нейроэндок-

ринной регуляции // Актуальные вопросы военной фтизиатрии. Сборник научных трудов. Т.1. - Пушкино, 2012. - С. 34 - 37.

8. Морфофункциональная реорганизация эпителия воздухоносных путей крыс при их интратрахеальном инфицировании бактериями с антилактоферриновой активностью // Вестник Оренбургского Государственного университета. 2012. - №1 (137). - С. 185 - 188 (соавт. Козлова А.Н., Вахитов Э.М., Шевлюк H.H., Лабутин И.В.)

9. Влияние деструкции крупноклеточных ядер гипоталамуса на характер адаптивно-компенсаторной реорганизации эпителия трахеи и главных бронхов крыс в условиях развития экспериментального воспалительного процесса // Военно-медицинский журнал. 2012. - Т.ЗЗЗ, № 7. -С. 59-61.

Отпечатано в типографии «ОренПечать» О.Г.Р.Н. 312565810300101 Формат 60x84 1/16. Бумага офисная. Усл. печ. л. 1.4 Тираж 100 экз. Заказ 092 г. Оренбург, ул. Советская, 27, офис 214