Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно - функциональные изменения гипоталамо –гипофизарно – гонадной системы крыс в условиях воздействия дестабилизирующих факторов

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Структурно - функциональные изменения гипоталамо –гипофизарно – гонадной системы крыс в условиях воздействия дестабилизирующих факторов"

005061705

На правах рукописи

Логинова Анастасия Константиновна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ГИПОТАЛАМО-ГИПОФИЗАРНО-ГОНАДНОЙ СИСТЕМЫ КРЫС В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ ДЕСТАБИЛИЗИРУЮЩИХ ФАКТОРОВ

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология 03.02.03 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

11 2013

Оренбург - 2013

005061705

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

заслуженный деятель наук РФ, доктор биологических наук, профессор Стадников Александр Абрамович

кандидат медицинских наук, доцент Плотников Андрей Олегович

доктор медицинских наук, профессор ГБОУ В ПО УГМА Минздрава России Сазонов Сергей Владимирович

доктор медицинских наук, доцент ИКВС УрО РАН Черкасов Сергей Викторович

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Зашита состоится «jjfc» CCtCtU?2013 г. в/^часов на заседании диссертационного совета Д. 208.066.04 при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6, в конференц-зале (аудитория № 205), телефон: (3532) 40-35-62, факс (3532) 77-24-59, e-mail: orgma_ds2@esoo.ru, официальный сайт: http://orgma.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России.

Автореферат разослан «-2£» с.Л(/£с( 2013 г., автореферат и текст объявления размещены на официальном сайте ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Шевлюк Николай Николаевич

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Стресс, как процесс реализации неспецифических механизмов адаптации в ответ на внешнее раздражение непосредственно связан с возрастанием активности гипоталамо-гипофизарной нейросекре-торной системы (ГГНС) (Поленов А Л., 1994; Акмаев И.Г., 2001; Акмаев И.Г., Гриневич В.В., 2003; Стадников A.A., Бухарин О.В., 2012; Кузнецов СЛ. с соавт., 2009). Действие стрессорных факторов подразумевает не только напряжённость ГГНС, но и наличие ответа в регуляторно-зависимых органах, проявляющегося в соответствующих морфофункционааьных изменениях, определяемых в рамках «болезней адаптации» (Филаретов A.A., 1987).

К стрессорным относят и инфекционные факторы, представленные как самими бактериями, так и продуктами их метаболизма (Семёнов A.B., 2000; Hamdy A.A. et. al., 2010). Успешность адаптивных реакций организма во многом определяется биологическими свойствами микроорганизмов, в частности - наличием у возбудителей персистентных характеристик (Бухарин О.В. с соавт., 2006), а также участием в процессе взаимодействия про- и эукариот нонапептидов гипоталамуса (Стадников A.A., 2001; Стадников A.A., Бухарин О.В., 2012).

На сегодняшний день, большой интерес представляет изучение характера влияния стрессорных факторов на процессы реализации адаптивных реакций в интерстициальных клетках семенников и в эпителии сперматогенного пласта, отражающейся на половой функции в целом (Bindhu М.Р., Annamalai Р.Т., 2004; Bray Т.М., Taylor C.G., 1993; Steinberger, A., Klinefelter G., 1993; Шевлюк H.H. 2005; Шевлюк H.H., Стадников A.A., 2010).

Одним из новых и весьма актуальных направлений в изучении стрессовых воздействий является установление в клетках эукариотических организмов специфического комплекса морфофункциональных изменений, развивающихся под действием бактерий, обладающих персистентными свойствами. На данный момент имеются сведения о морфофункциональных изменениях в клетках эукариот при их взаимодействии с бактериями, обладающими анти-лизоцимной, антикарнозиновой или антилактоферриновой активностью (Бухарин О.В., Немцева Н.В., 2001; Усвяцов Б.Я., Карташова О.Л., 2006).

Что же касается антигистоновой активности, то имеются лишь единичные сведения, касающиеся взаимодействия бактерий (Е. coli) с одноклеточными эукариотами (инфузориями) (Бухарин О.В. и др., 2008).

Обнаруженные эффекты взаимодействия бактерий с антигистоновой активностью с одноклеточными эукариотами позволили сделать предположение о возможной роли этого свойства во взаимодействии бактерий с многоклеточными организмами, в том числе с клетками млекопитающих.

Исследование процессов сперматогенеза может рассматриваться как удобная модель для исследования закономерностей клеточной и репродуктивной биологии, генетики, радиобиологии, не только благодаря тому, что гамето-генез динамично отражает развитие мужских половых клеток, находящихся под строгим генетическим и гормональным контролем, и подчиняющихся строп

пространственно-временной организации (Пальцев М.А., Кветной И.М., 2008), но и за счет интенсивного метаболизма гистоновых белков, являющихся мишенью для антигистоновой активности бактерий (Дедов И.И. с соавт., 2010).

Практическая значимость подобных исследований продиктована необходимостью расшифровки патогенетических механизмов бактериальных инфекций урогенитального тракта мужчин. Следует отметить, что изучению влияния патогенной и условно-патогенной микрофлоры на процесс сперматогенеза уделяется недостаточное внимание. В то же время, многообразие существующих неблагоприятных факторов, способных нарушить процессы пролиферации и дифференцировки мужских половых клеток, обосновывают необходимость дальнейшего изучения диапазона адаптивных и компенсаторных возможностей семенников, особенно в аспекте гипотапамической ноналептидергической ней-роэндокринной регуляции (Шевлюк H.H., Стадников A.A., 2010).

Сегодня представляется особо важным сформировать парадигму адаптации тканевых элементов эукариот к воздействиям прокариот с учетом генетических особенностей, как бактерий, так и организма хозяина. Все, вышеизложенное, послужило обоснованием проведения настоящего исследования.

Цель исследования: установить закономерности адаптивных структурно-функциональных изменений тканевых и клеточных элементов гипоталамо-гипофизарно-гонадной системы крыс-самцов в условиях стрессорных воздействий и бактериального инфицирования Е. coli с различным персистентным потенциалом.

Задачи исследования:

1. Определить характер цитологических изменений нейросекреторных клеток крупноклегочных ядер гипоталамуса крыс - самцов, а также аденоцитов гипофиза в условиях стресса и введения животным бактерий с различными персистентными характеристиками (Е. coli с антигистоновой активностью (АГА+) и без таковой (АГА-).

2. Оценить диапазон реализации гисто- и органотипических потенций сперматогенным эпителием и клетками интерстиция семенников стрессирован-ных, а также инфицированных животных в модельных экспериментах.

3. Установить связь между персистентными характеристиками исследуемых бактерий и особенностями изменений, происходящих в семенниках исследуемых животных.

4. Дать микробиологическую характеристику популяционной изменчивости штамма Е. coli по признаку антигистоновой активности in vitro и in vivo.

Научная новизна полученных результатов. Впервые проведено комплексное гистологическое исследование гипоталамо-гипофизарно-гонадной системы стрессированных крыс в условиях бактериального инфицирования изогенными клонами Е. coli с антигистоновой активностью (АГА+) и без таковой (АГА-). Полученные данные раскрывают закономерности изменений ноналептидергической регуляции со стороны ГГНС в условиях инфицирования

животных изогенным клоном Е. coli АГА+, что обосновывает механизмы структурно-функциональных нарушений эпителиосперматогенных и стромальных структур семенников крыс, связанных с разбапансировкой синтеза и транспорта нейрогормонов супраоптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса.

Установлены закономерности адаптивной структурно-функциональной модификации клеточных элементов гипоталамо - гипофизарно - гонадной системы крыс-самцов в условиях инфицирования Е. coli АГА- на фоне стрессор-ных воздействий, свидетельствующие о достаточно высоком запасе резистентности гаметогенеза к экстремальным воздействиям.

Получены новые факты о негативном влиянии Е. coli АГА+ на спермато-генный эпителий и интерстиций семенников экспериментальных животных, проявляющемся в нарушении сперамотогенеза, явлениях атипии, апоптоза, десквамации половых клеток на фоне дистрофических изменений сустентоци-тов и собственной оболочки семенных извитых канальцев.

С помощью популяционного анализа дана оценка гетерогенности популяции штамма Е. coli по антигистоновой активности, что позволило оценить адаптивную пластичность бактериальной популяции и отобрать изогенные клоны, пригодные для экспериментальной модели.

Впервые на экспериментально-гистологической модели показаны эффекты антигистоновой активности эшерихий, которые могут быть использованы в качестве клинико-лабораторного критерия в прогнозировании исхода воспалительного процесса и влиянии его на фертильность мужских особей.

Научно-практическая значимость работы. Результаты проведенного исследования раскрывают дополнительные аспекты механизмов гипоталамиче-ской нейроэндокринной регуляции сперматогенеза с новых позиций, свидетельствующих об аффинности сперматогенного пласта и интерстиция семенников к воздействиям Е. coli АГА+, проявляющейся в экспериментальных условиях (при нарушениях адекватной гипоталамической нейросекреции) в повреждениях сперматогенеза, реактивных отклонениях процессов целостности тканей гонад, их клеточного обновления, формировании апоптозной доминанты и локальных механизмов контроля межклеточных взаимодействий.

Полученные данные имеют прикладное значение для верификации и прогнозирования исходов инфицированных поражений семенников (гипоспер-матогенез, азооспермия), оценки степени их обратимости, что является важным для профилактики и лечения мужского бесплодия.

Тема данного диссертационного исследования включена в план НИР кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии. Работа «Экспериментальное обоснование эффектов антигистоновой активности бактерий в клетках млекопитающих» удостоена Премии Губернатора Оренбургской области для талантливой молодёжи в 2011 г. Исследования выполнены в том числе при поддержке Гранта Правительства Оренбургской области для талантливой молодёжи (№ 17-г, 2012г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выявлен новый аспект механизма взаимодействия организма-хозяина с микробными агентами, обладающими персистентным свойством, антигистоно-вой активностью, заключающийся в дискоординации между синтетической и регуляторной функциями нонапептидергической ГГНС.

2. Комплексное воздействие стресса и инфицирования животных Е. coli АГА+ приводит к нарушению резистентности пролиферации и дифференци-ровки гамет семенников крыс к экстремальным воздействиям, что проявляется существенными дистрофическими изменениями в сперматогенном эпителии и интерстициальных структурах семенников.

3. Гетерогенность популяции эшерихий по антигистоновому признаку, способствующая персистенции бактерий в организме-хозяине с одной стороны, и обуславливающая реакцию гипотапамо-гипофизарно-гонадной системы - с другой, в совокупности позволяет оценить исход воспалительного процесса и его влияние на фертильность мужских особей.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследований и выводы диссертации используются в учебном процессе на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии, а также микробиологии, вирусологии, иммунологии Оренбургской государственной медицинской академии и при проведении экспериментальных исследований в Лаборатории водной микробиологии ИКВС УрО РАН.

Апробация работы. Результаты диссертации доложены и обсуждены на итоговой научной конференции молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» (г. Москва, 2010); X конгрессе Международной ассоциации морфологов (г. Ярославль, 2010); 64 конференции студентов и молодых учёных «Актуальные проблемы современной медицины» (г. Киев, Украина, 2010); конференции молодых учёных «Актуальные проблемы экологии, гигиены и эпидемиологии», в рамках Дней молодёжной науки в Оренбургской области (г. Оренбург, 2011); I Всероссийской конференции студентов и молодых учёных в рамках «Дней молодежной медицинской науки ОрГМА», посвященной памяти чл.-корр. АМН СССР, профессора Ф.М. Лазаренко (г. Оренбург, 2012); международном конгрессе FASEB (Federal Association of Experimental Biologists) «Experimental biology 2012» (г. Сан-Диего, США, 2012); Всероссийской конференции «Персистенция микроорганизмов» (г. Оренбург, 2012); II Всероссийской конференции студентов и молодых учёных в рамках «Дней молодежной медицинской науки ОрГМА», посвященной памяти чл.-корр. АМН СССР, профессора Ф.М. Лазаренко (г. Оренбург, 2013).

Публикации. Основные положения работы изложены в 12 печатных работах, из них 6 в изданиях, рекомендованных ВАК при Минобрнауки РФ.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав с описанием материала и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 22 таблицы и 34 рисунка. Список литературы содержит 204 источника, включая 111 отечественных и 93 зарубежных работ. 6

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования.

Экспериментальные исследования проводили на половозрелых белых крысах-самцах линии Wistar (81 особь массой 230-250 г). Животных содержали в стандартных клетках (по 3-6 особей) при искусственном освещении (8.00-20.00 - свет, 20.00-8.00 - темнота), комнатной температуре (20-22°С) и свободном доступе к воде и пище. Экспериментальные исследования на животных выполняли в соответствии с требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных.

Было проведено 3 серии опытов, по 27 животных в каждой. В первой серии опытов проводили интраперитонеальное введение бактерий Е. coli с различным уровнем антигистоновой активности (АГА+ и АГА-), во второй серии опытов - бактерии Е. coli АГА+ и АГА- вводили интраперитонеально после однократного стрессирования, в третьей серии опытов — бактерии Е. coli АГА+ и АГА- вводили интратестикулярно. Животным из группы контроля вводили стерильный физраствор.

Инфицирование животных осуществляли с использованием полумиллиардной (5х108 КОЕ/мл) суспензии суточных культур изогенных клонов штамма Е. coli 6В1 (Е. coli 6В1-2 (АГА-) и Е. coli 6В1-8 (АГА+) из коллекции Лаборатории водной микробиологии Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН: интраперитонеально - 1,0 мл, а интратестикулярно - 0,1 мл.

Моделирование иммобилизационно - изоляционного стресса (ИИС) животных проводили однократно в течение 5 часов по методикам Л.С. Калини-ченко (2012) и В.Г. Подковкина, Д.Г. Иванова (2008) в непрозрачных стеклянных камерах цилиндрической формы с отверстиями для доступа воздуха. Размер камер обеспечивал фиксированное положение животного. После завершения стрессирования животных купали и помещали в привычные клетки с доступом пищи и воды.

Микробиологические исследования проводили в асептических условиях. Исследуемый музейный штамм бактерий Е. coli 6В1 культивировали на жидкой (мясо-пептонный бульон) и твердой (1,5% мясо-пептонный агар) питательных средах. Биохимическую идентификацию бактерий проводили при помощи тест-системы фирмы LACHEMA (Чехия) "ENTEROtest 24".

Изогенные клоны бактерий получали из суточной агаровой культуры методом серийных разведений. У выросших через 20-24 часа при 37°С колоний Е. coli (не менее 20) определяли уровень АГА. Далее, из всей популяции выбирали 2 клона с наиболее низким и высоким значениями АГА и повторяли культивирование с определением АГА трижды. Антигистоновую активность микроорганизмов определяли по методу Бухарина О.В. с соавт. (2001). Животных выводили из эксперимента путем декапитации под эфирным рауш-наркозом. После эвтаназии подопытных животных вскрывали, извлекали внутренние органы в соответствии с Правилами проведения лабораторных исследований в

области ветеринарии (Приказ Минсельхоза РФ N 490 от 5 ноября 2008 г.). Обсеменённость внутренних органов определяли бактериологическим методом.

Материал от экспериментальных и контрольных животных (семенники, гипоталамус (супраоптические ядра - СОЯ, паравентрикулярные ядра - ПВЯ), гипофиз) подвергали однотипной гистологической обработке. Для светоопти-ческого исследования материал (семенники, гипоталамус (СОЯ, ПВЯ) фиксировали в 10% растворе забуференного формалина, рН=7,0, при комнатной температуре в течение 1-2 суток, после чего обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (70°-96°), помещали в хлороформ и запивали в парафин.

Серийные срезы толщиной 5-6 мкм депарафинировали по стандартной методике и окрашивали гематоксилином Майера и эозином, а также паральде-гид фуксином по Гомори-Габу в модификации А.Л. Поленова (Семченко В.В. с соавт., 2006).

Для оценки особенностей структурно-функциональной реорганизации СОЯ и ПВЯ гипоталамуса, гипофиза, а также сперматогенного эпителия и интерстициальных элементов семенников крыс в условиях инфицирования изогенными клонами Е. coli (АГА-) и Е. coli (АГА+), в том числе в условиях стресса, применяли комплекс морфологических, морфометрических, иммуно-гистохимических и статистических методов исследования (Ухов Ю.И., Астра-ханцев А.Ф., 1983; Шевлюк H.H., Стадников A.A., 2010).

В гипоталамусе на светооптическом уровне определяли объем ядер и ядрышек нейросекреторных клеток (НСК) СОЯ и ПВЯ. В половых железах проводили измерения диаметра и площади поперечных срезов извитых семенных канальцев (ИСК), определение процента поперечных срезов канальцев с многоядерными клетками, относительной площади интерстиция (Ухов Ю.И., Астра-ханцев А.Ф., 1983). Морфометрию выполняли на световом микроскопе Биомед-6 ПР 3 (Биомед, Москва) с использованием цифровой камеры Toup Camera, 5.1 mpx, и прилагающегося к ней программного обеспечения.

Для расширения возможностей интерпретации полученных результатов применяли иммуногистохимические реакции с целью определения экспрессии проапоптотического белка caspase-3 (Sigma-Aldrich, США), рабочее разведение 1:100. Срезы толщиной 5-6 мкм монтировали на предметные стекла с Polysine покрытием (Menzel, Германия) и депарафинировали по стандартной методике.

Все манипуляции с антителами осуществляли согласно протоколам фирм-производителей, а также рекомендациям по иммуногистохимии (Киясов А.П., 1998; Петрова И.В., Райхлина Н.Т., 2004). Реакцию связывания первичных антител выявляли непрямым способом при помощи пероксидазной стрептавидин-биотиновой системы детекции. Для каждой группы проводили выборочный контроль специфичности иммунодетекции. Ядра контрастировали водным гематоксилином Майера.

Во всех случаях подсчитывали количество положительно окрашенных клеток с учетом их классовой принадлежности не менее чем в 10 различных полях зрения (увеличение окуляра хЮ; объектива х 40) не менее 100 клеток

каждой популяции (сперматогоний, сперматоцитов, ранних сперматид) (Потапов В. А. и др., 2012; Шаповалова Е.Ю., 2010).

Для электронно-микроскопических исследований материал (гипоталамус, гипофиз) фиксировали в охлаждённом (+4°С) 2,5% растворе глютарового альдегида на S - коллединовом буфере (рН=7,3) с последующей дополнительной фиксацией в 1% растворе четырёхокиси осмия по Millong (1961). Материал обезвоживали в растворах ацетона с возрастающей концентрацией и заливали в смесь смол ЭПОН-812 и арапдита. Ультратонкие срезы (40-60 нм) готовили на ультратоме LKB-5 (Bromma, Sweden) с последующим контрастированием в насыщенном спиртовом растворе уранил - ацетата и цитрате свинца. Исследование приготовленных срезов выполняли при помощи электронного микроскопа ЭМВ 100 АК, при увеличении х 6 000 - 40 000.

Результаты исследования подвергали статистической обработке в соответствии с рекомендациями Г.Ф. Лакина (1990) и С. Гланца (1999). Статистическая обработка результатов проведена при помощи программы BioStat 2009.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Структурно-функциональная реорганизация нонапептидергических нейро-секреторных центров гипоталамуса и аденогипофиза экспериментальных

животных

Согласно современным представлениям о стрессе при формировании ответной реакции со стороны ГГНС в ответ на экстремальные воздействия помимо усиления секреторной активности кортикотропоцитов, происходит повышенное выделение разнообразной группы родственных кортикотропину пептидов (Науменко Е.В., 1994; Стадников A.A., Шевлюк H.H., 1996; Стадни-ков A.A., 1999, 2011). В зависимости от характера стрессорного воздействия можно наблюдать изменения секреции различных аденоцитов гипофиза (мам-мотропоцитов, тиреотропоцитов, гонадотропоцитов), что говорит о зависимости спектра аденогипофизарных гормонов от природы стрессора, а также от индивидуальной стратегии индивидуума.

Оценка состояния НСК СОЯ и ПВЯ гипоталамуса крыс, инфицированных Е. coli 6В1-2 (АГА-), во всех сериях опытов, показала их умеренную функциональную активность (табл. 1 и 2).

Таблица 1

Морфометрические показатели НСК СОЯ и ПВЯ гипоталамуса крыс в условиях нормы и введения Е. coli 6В1-2 (АГЛ-), Mim, мкм3

СОЯ ПВЯ

Сутки контроль 3 7 10 контроль 3 7 10

Объем ядра 276,6 ±4.7 482,6* ±5,7 300,1* ±6,1 290,2* ±5,5 285,6 ±4,7 498,4* ±6,1 378,8* ±5,6 305,6* ±3,4

Объем 28,8 39,1* 30,4* 29,7 40,1 43.1* 42,2 40,1

ядрышка ±0,9 ±1,1 ±1,1 ±1,4 ±1.1 ±1,8 ±3,3 ±1,7

* р<0.05, достоверность различия изменения показателя между опытными и контрольной группами

Таблица 2

Морфометрические показатели НСК СОЯ и ПВЯ гипоталамуса крыс в условиях нормы и введения Е. coli 6В1-8 (АГА+), M±m, икм

СОЯ ПВЯ

Сутки Контроль 3 7 10 Контроль 3 7 10

Объем ядра 276,6 ±4,7 510,1* ±6,8 498,1* ±4,1 480,2* ±8,1 285,6 ±4,7 521,1* ±6,1 501,8* ±8,1 477,8* ±6,7

Объем ядрышка 28,8 ±0,9 48.2* ±5,1 45,6* ±3,1 46,2* ±9,2 40,1 ±1,1 49,1* ±3,4 47,6* ±4,4 43,6 ±6,1

* р<0,05, достоверность различия изменения показателя между опытными и контрольной группами

На 3 сутки эксперимента увеличивались размеры ядер и ядрышек функционально активных НСК. К 3-7 суткам параметры ядер и ядрышек возвращались к таковым, наблюдаемым у интактных животных. НСК и терминапи их аксонов, контактирующие с гемокапиллярами нейрогипофиза содержали большое количество «пустых пузырьков», крупные, темные митохондрии, свободные рибосомы, расширенные канальцы шероховатого эндоплазматического ретикулума. При этом большинство аксонов были полностью лишены секреторных включений.

Состав СОЯ и ПВЯ гипоталамуса у данных животных характеризовался преобладанием функционально активных НСК (рис. 1). Очевидно, что в них синтез нейросекрета был уравновешен с его выведением.

Рис. 1. Нейросекреторные клетки супраоптического ядра гипоталамуса крысы через 7 суток после введения Е. coli АГА-. Светлые, функционально активные нейросекреторные клетки. Фиксация: спирт-формол. Окраска: паральдегид-фуксин по Гомори-Габу, в модификации А.Л. Поленова. У в. х 400.

При введении животным Е. соИ 6В1-8 (АГА+) мы получили результаты, свидетельствующие о повышенной активности НСК крупноклеточных ядер гипоталамуса. Размеры клеток, их ядер и ядрышек резко увеличивались на

3 сутки, сохраняя эту тенденцию вплоть до 7-10 суток (табл. 3). Ядрышки располагались перикариолемно и имели разрыхленный (нуклеолонемный) вид. Число электронноплотных секреторных гранул в цитоплазме НСК и их аксонах резко снижалось (вплоть до 10 суток эксперимента).

Таблица 3

Диаметр I1CK семенников крыс после интраперитонеалыюго введения E.coli АГА+ н АГА-, М±ш, мкм

Контроль АГА- АГА+

3 сутки 193,08 ±2,35 230,1 ±3,53 Р, <0,01 180,3 ±3,1 Pi <0,01; Рз <0,01

7 сутки 252,93 ±5,54 172,27 ±3,62 Pi<0,01 157,16 ±3,62 Pi <0,01; Р2 <0,05

10 сутки 260,2 ±3,5 305,41 ±2,35 Р, <0,01 257,04 ±4,06 Р, <0,01

Р1-достоверность различия изменения показателя по сравнению с контрольной группой; Рг - достоверность различия изменения показателя между опытными группами.

На этом основании мы высказываем суждение о том, что независимо от способа проникновения (интраперитонеально или интратестикулярно) бактерий, обладающих персистентным потенциалом, наблюдается пролонгирование течения адаптивной структурно-функциональной реорганизации НСК крупноклеточных ядер гипоталамуса без существенного нарушения её этапности.

Оценивая реактивные изменения аденоцитов передней доли гипофиза в условиях воздействия Е. coli (АГА+) и (АГА-) был выявлен ряд реактивных изменений в соматотропоцитах, маммотропоцитах, тиреотропоцитах, кортико-тропоцитах и маммотропоцитах, которые демонстрировали существование определенных морфофункциональных параллелей между уровнем секреции гипоталамических нейрогормонов и цитофизиологическими отправлениями аденоцитов передней доли гипофиза относительно моделируемых условий.

Что касается гонадотропоцитов, то у животных, инфицированных E.coli (АГА-), эти клетки содержали большое количество секреторных гранул, которые были равномерно распределены по всей цитоплазме, включая зону, прилегающую к плазмолемме. Некоторые гранулы имели четко выраженную мембрану, либо четко прилежащую к содержимому, либо, отграниченную от содержимого узким светлым ободком. В последнем случае гранулы имели более низкую электронную плотность, их содержимое при этом принимало вид зернистости.

В серии опытов с введением E.coli (АГА+) мы регистрировали клетки с распадом секреторных гранул в цитоплазме. При этом часто встречали крупные аморфные тельца диаметром до 1000 нм с низкой электронной плотностью. Они напоминали расширенные вакуоли эндоплазматического ретикулума, заполненные мелкозернистым содержимым, при этом отграничивающая мембрана никогда не содержала рибосом. Это, на наш взгляд, может свидетельст-

11

вовать о существенных нарушениях секреторного цикла гонадотропоцитов в части структурного оформления секреторных гранул, что ранее было показано на модели длительного эмоционально-болевого стресса (Стадников А.А., 2001).

При изучении ГГНС у животных, подвергнутых воздействию иммобили-зационно-изоляционного стресса (ИИС) и также инфицированных штаммами E.coli (АГА+) и (АГА-), выявлено, что в случае введения стрессированным животным штамма E.coli (АГА-) со стороны ГГНС регистрировали явления выраженной гипёрсекреции НСК СО и ПВ ядер гипоталамуса (табл. 2). В пользу этого свидетельствовали выраженная гипертрофия перикарионов, ядер, ядрышек и органелл. Хроматин в ядрах был деконденсирован, ядрышки рыхлые, а иногда и вакуолизированные. Аппарат Гольджи занимал значительный объем цитоплазмы. Значительно возрастало число лизосом (плотных ламеллярных телец). При этом за счет активного высвобождения нейросекреторных продуктов на уровне аксовазальных контактов снижалось количество секреторных гранул, а также значительно возрастала доля пустых пузырьков в цитоплазме НСК.

При инфицировании стрессированных животных штаммом E.coli (АГА+) состояние длительной секреции НСК находилось на грани истощения. Так, через 3 суток эксперимента в составе СО и ПВ ядер отмечали сильно гипертрофированные «светлые» и набухшие перикарионы, округлые, с многочисленными инвагинациями плазмолеммы ядра. Эндоплазматические канальцы теряли рибосомы и превращались, как уже было описано выше, в вакуолеподобные структуры диаметром 800-1000 нм. В таких клетках наблюдали также дезорганизацию дик-тиосом аппарата Гольджи и митохондриальных структур. Наиболее характерным признаком НСК данной группы животных было наличие большого числа лизосом, в особенности вторичных, а также аутофагосом и мультиламеллярных телец.

Следует особо отметить, что при введении штамма E.coli (АГА+), нами был отмечен феномен блокировки высвобождения гипоталамического нейро-секрета, возникающего вследствие торможения выведения нейрогормонов на уровне терминалей аксонов на фоне продолжающегося усиленного формирования элементарных секреторных гранул. При этом в аксонах НСК регистрировали крупные лизосомы, что указывало на дискомплексацию и разрушение мембранных структур клеток. Подобные изменения были описаны Э.М. Вахитовым (2011) при интратрахеальном введении крысам бактерий Klebsiella pneumoniae, обладающих антилактоферриновой активностью.

Возрастание численности пикноморфных НСК свидетельствовало об интенсификации их «физиологической дегенерации». Эти клетки имели угловатую форму, различную степень сжатости цитоплазмы и ядра (рис. 2) по сравнению с интактными животными (рис. 3).

Вместе с тем, обращало на себя внимание то обстоятельство, что при воздействии ИИС в комплексе с E.coli (АГА+) в ГГНС имела место блокировка высвобождения нейросекрета на уровне нейрогипофиза, что приводило к переполнению аксонов НСК крупными, нередко каплевидными включениями. При этом терминальные расширения аксонов имели преимущественно конусообразную или колбообразную форму. В нейроплазме таких терминалей содержались

агранулярный ретикулум, митохондрии, нейротрубочки, нейрофиламенты и, так называемые, синаптические пузырьки.

Рис. 3. Нейросекреторные клетки супраоптического ядра интактной крысы (контроль). Фиксация: спирт-формол. Окраска: паральдегид-фуксин по Гомори-Габу, в модификации А.Л. Поленова. Ув. х 400.

Рис. 2. Пикноморфные нейросекреторные клетки паравентрикулярного ядра гипоталамуса стрессированной крысы (на уровне срединного возвышения) через 3 суток после введения Е. coli АГА+. Фиксация: спирт-формол. Окраска: паральдегид-фуксин по Гомори-Габу, в модификации А.Л. Поленова. Ув. х 400.

Согласно данным литературы, подобные аксоны НСК наблюдали у животных при угнетении гаметогенеза, и, напротив, исчезновение каплевидных секреторных включений в период высокой репродуктивной активности (Поленов А.Л., 1993).

С другой стороны, полученные факты свидетельствовали о том, что взаимодействие микробных агентов обладающих антигистоновой активностью с тканевыми структурами семенников, особенно на фоне стресса, происходит в условиях разбалансировки гипоталамической регуляции. Данное обстоятельство может иметь решающее значение в лимитировании адаптивных возможностей клеток и тканей семенников экспериментальных животных.

Структурно-функциональная реорганизация сперматогенного эпителия и интерстициальных элементов семенников в условиях инфицирования Е. coli, в том числе и при стрессорных воздействиях

При интраперитонеальном введении бактериальной суспензии как в случае введения изогенного клона Е. coli 6В1-2 (АГА-) и Е. coli 6В1-8 (АГА+) наблюдали активную реакцию со стороны семенников. Несмотря на отсутствие самого возбудителя в тканях семенников по данным бактериологического контроля, наличие ответа со стороны сперматогенного эпителия объясняется, вероятно, общей реакцией организма на присутствие инфекционного агента.

У животных, инфицированных Е. coli (АГА+) к 3 суткам эксперимента в семенниках наблюдали интенсивную десквамацию сперматогенного эпителия, аналогичную реакцию наблюдали у животных, инфицированных Е. coli (АГА-) на 7 сутки. К 10 суткам отмечали тенденцию к восстановлению сперматогенной функции на фоне продолжающейся десквамации новообразованных половых клеток.

Сравнивая показатели диаметра ИСК в группах инфицированных Е. coli (АГА+) и (АГА-), на 3 сутки регистрировали более выраженное уменьшение диаметра ИСК в группе АГА+ по сравнению с группой АГА-, что могли наблюдать и на 7 сутки эксперимента. К 10 суткам, эти различия нивелировались (табл. 3).

Присутствие инфекционного агента в организме экспериментальных животных приводило нарастанию относительной площади интерстициальной ткани на 7 сутки. При этом отмечали значимую разницу между группами АГА- и АГА+, с более интенсивной реакцией в первой. К 10 суткам, в группе АГА+ и группе АГА- относительная площадь интерстиция демонстрировала резкое снижение, в то время как в контрольной группе значения данного параметра, хотя и шли на снижение, но демонстрировал более плавную динамику. Показанные различия, по всей видимости, являются результатом более интенсивной реакции со стороны организма на присутствие инфекционного агента (табл. 4).

Таблица 4

Относительная площадь интерстициальной ткани в семенниках крыс после интраперитонеального введения Е. coli АГА+ и АГА-, М±т в %.

Контроль АГА- АГА+

3 сутки 12,82±0,43 12,05 ±0,49 11,75 ±0,53

7 сутки 11,32±0,64 16,89 ±0,7 Р, < 0,01 15,04 ±0,52 Pi <0,01; Р2 < 0,05

10 сутки 10,23±0,43 8,43 ±0,49 Р, < 0,05 11,42 ±0,73 Р2<0,01

Р, - достоверность различия изменения показателя по сравнению с контрольной группой; Р2 - достоверность различия изменения показателя между опытными группами.

При интраперитонеальном заражении экспериментальных животных на фоне однократного ИИС во всех исследуемых группах животных наблюдали снижение численных значений учитываемых показателей относительно тех, что были получены у животных после интраперитонеального заражения без предварительного стрессирования.

Оценка эффектов в опытных группах позволила выявить следующие особенности. В группе животных, инфицированных Е. coli (АГА-) наблюдали значимое расширение ИСК (табл. 5), их деформацию, выраженную десквамацию сперматогенного эпителия, а также утолщение прослоек интерстициальной ткани.

Таблица 5

Диаметр ИСК семенников крыс группы ИИС после экспериментальной инфекции, М±т мкм.

Контроль АГА- АГА+

3 сутки 217,9 ±3,01 232,7 ±2,39 Р, <0,01 235,61 ±2,14 Р, <0,01

7 сутки 217,9 ±3,16 232,7 ±2,68 Р, <0,01 172,76 ±4,65 Р, <0,01; Р2<0,01

10 сутки 233,04 ±3,78 238,9 ±2,44 *

♦Показатель не обеспечивает валидность параметра

Р1 - достоверность различия изменения показателя по сравнению с контрольной группой; Р2 - достоверность различия изменения показателя между опытными группами.

На более поздних сроках наблюдения какого-либо улучшения в состоянии семенников животных не отмечали. Что касается группы животных, инфицированных Е. coli (АГА+), то на ранних сроках наблюдения (3 сутки) картина в семенниках была сходной с той, что описывали для группы (АГА-) (тТабл. 6).

Таблица 6

Относительная S интерстициальной ткани в семенниках крыс после интраперитонеального введения Е. coli АГА+ и АГА- при однократном ИИС, М±ш в %

Контроль АГА- АГА+

5 сутки 8,99±0,87 11,33±0,51 Р, < 0,05 12,61±1,19 Р, <0,01

7 сутки 11,2±1,29 8,92±0,61 Р, < 0,05 10,03±0,49

10 сутки 7,23±0,62 10,01 ±0,41 Р, < 0,01 18,23±1,23 Р, <0,01; Р2 < 0,05

Р| - достоверность различия изменения показателя по сравнению с контрольной группой; Р2 - достоверность различия изменения показателя между опытными группами.

Однако на 7 сутки происходило выраженное запустевание ИСК, в их просвете выявляли лишь отдельные клетки, принадлежащие ранее к сперматоген-ному эпителию. В интерстиции сохранялись интерстициальные эндокриноци-ты. На 10 сутки наблюдали атрофию клеток сперматогенного эпителия, а также значительное разрастание интерстициальной ткани за счет усиления синтеза волокнистого компонента интерстиция, при этом, сохранившиеся интерстициальные эндокриноциты оказывались «замурованными» в его толще.

В результате показано, что комплексное воздействие инфекционного и стрессорного факторов вызывают ряд структурно-функциональных изменений в семенниках экспериментальных животных.

В результате показано, что комплексное воздействие инфекционного и стрессорного факторов вызывают ряд структурно-функциональных изменений в семенниках экспериментальных животных. Прогрессивно (по срокам наблюдения) в ИСК нарастали деструктивные процессы в сперматогенном эпителии вплоть до полного опустошения сперматогенных структур. Явления выраженного отека интрестициальной ткани, сопровождающегося расширением и полнокровием кровеносных сосудов, расширением сосудов лимфатического русла, диапедезом форменных элементов крови, сменяются затем склеротическими изменениями в интерстициальной ткани семенников.

При интратестикулярном введении в гонадах животных, инфицированных штаммом Е. coli (АГА-) через 3 суток формировался фокус деструкции с накоплением транссудата в интерстиции. При этом наблюдали диссоциацию сперматогенного эпителия с последующей некротизацией половых элементов. В интерстиции был выражен отек. Наблюдали развитую продуктивную фазу воспаления, в лейкоцитарных ассоциациях преобладали полиморфноядерные лейкоциты и макрофаги. Реактивный гипосперматогенез наблюдали как в отдельных участках ИСК, так и с формированием полностью запустевших канальцев. К 7 суткам эксперимента в герминативной паренхиме половых желёз развивался диффузный асперматогенез. Признаки воспалительной реакции в интерстиции заметно ослабевали, однако в просвете ИСК продолжалось активное слущивание элементов сперматогенного эпителия и их некротизация. На 10 сутки эксперимента было заметно начало восстановления сперматогенеза. Деструктивная перестройка не выражена, хотя встречались запустевшие, деструктивно измененные ИСК. Сперматогенный эпителий в канальцах имел высоту не более половины нормальной, но динамика дифференцировки демонстрировала тенденцию к восстановлению.

В гонадах животных, инфицированных штаммом Е. coli (АГА+) на 3 сутки опыта также наблюдали явления распространённого отёка стромы и некроза эпителия в ИСК. Воспалительная реакция - на этапе краевого стояния лейкоцитов, либо лейкодиапедеза. Обширных скоплений лейкоцитов не обнаруживали. На 7 сутки основная доля ИСК на протяжении большей части их длины были заполнены клеточным детритом. Происходила активная некротизация и слущивание сперматогенных клеток. При этом высота сперматогенного эпителия значительно снижалась. К 10 суткам эксперимента в семенниках

группы АГА+ наблюдали как ИСК с признаками возобновления развития половых клеток, так и канальцы с явлениями склероза. Высота сперматогенного эпителия приближена к таковой в семенниках здоровых животных. Данные факты могут указывать, с одной стороны, на исключительную «жесткость» генетической программы, определяющей пролиферацию и дифференцировку гамет (Райцина С.С., 1982), а с другой- на достаточно высокий запас резистентности процессов образования половых клеток к экстремальным воздействиям.

При измерении диаметра ИСК обращало на себя внимание значимое увеличение указанного параметра на 10 сутки в группе животных, инфицированных изогенным клоном Е. соП 6В1-8 (АГА+) (табл. 7).

Таблица 7

Диаметр ИСК семенников крыс после интратестикулярного введения E.coli АГА+ и АГА-, М±ш мкм

Контроль АГА- АГА+

3 сутки 261,19±2,95 235,02±2,29 Р, <0,01 237,57±3,51 Р, <0,01; Р2<0,01

7 сутки 244,8±3,56 208,54±5,3 Р|<0,01 255,82±3,61 Р, <0,01

10 сутки 243,4±5,8 225,47±4,23 250,07±3,44 Р, <0,05; Р2 <0,05

Р]-достоверность различия изменения показателя по сравнению с контрольной группой; Рг - достоверность различия изменения показателя между опытными группами.

Что касается результатов измерения относительной площади интерстиция следует отметить активную реакцию интерстиция как на введение стерильного физраствора, так и на введение бактериальной суспензии. Обращает на себя внимание также более интенсивная реакция интерстиция на ранних сроках эксперимента, хотя позднее, данные различия нивелировались в пользу контрольной группы (7 сутки: контроль - 12,81±1,15 мкм, (АГА-) - 13,66±2,05мкм, (АГА+) - 13,23±2,1 мкм. Отсутствие однозначной тенденции в данном случае, скорее всего, обусловлено наличием одновременно двух действующих факторов - механической травмы и бактериальной инфекции.

Особенностью данной серии экспериментов было появление в просвете извитых семенных канальцев, так называемых, многоядерных клеток-шаров, или гигантских клеток. Наиболее ранний и интенсивный ответ в виде активной десквамации сперматогенного эпителия (21±3,1%) был получен в группе животных, инфицированных Е. coli (АГА+), в то время как пик ответа со стороны эпителия в группе животных, инфицированных Е. coli (АГА-) (24±2,9%) наблюдали только к 7 суткам. Дальнейшее снижение количества данных клеток в группе животных, инфицированных Е. coli (АГА+) (6±0,45% - 7 сутки, 1±0,12% - 10 сутки) является результатом активной реакции эпителия на ранних этапах наблюдения. Следует отметить также и то, что в ИСК контрольной группы животных подобные клетки выявить не удалось.

По результатам иммуногистохимического исследования экспрессии про-апоптотического белка савраэе-З наиболее интенсивную экспрессию наблюдали среди ранних сперматид, реже - среди сперматоцитов первого и второго порядков. Обращала на себя внимание достаточно высокая устойчивость к апоптозу сперматогоний (табл. 8).

Таблица 8

Индекс апоптоза сперматогенных клеток при интратестикулярном введении E.coli АГА+ и АГА-, М±ш в %.

Сроки наблюдения (сутки) Сперматогонии Спераматоциты Ранние сперматилы

АГА+ АГА- АГА+ АГА- АГА+ АГА-

3 20,5±3,9* 5,85±1,7 38,9±4,4 36,5±4,3 45,9±5,2* 31,6±7,1

7 12,9±2,7* 4,04±1,1 26,9±3,2* 10,1 ±2,6 50,7±5,5* 31,2±6,02

10 0 0 8,1±1,3 5,0±0,85 20,1±3,6 18,5±2,2

* р<0,05, достоверность различия изменения показателя между опытными группами.

В результате исследования выявлена группа факторов, обуславливающих повреждение семенника, в результате воздействия Е. coli с антигистоновой активностью. К ним можно отнести интенсификацию развития воспалительного процесса, диффузный асперматогенез с обширной некротизацией сперматогенного эпителия, усиление механизмов элиминации генетически повреждённых половых клеток путем формирования многоядерных герминативных элементов, а также снижение пролиферативной активности клеток сператогенного эпителия, о чем можно судить по данным иммуногистохимического исследования.

Популяционная характеристика штамма Е. coli 6В1 по степени выраженности и изменчивости антигистонового признака

Нами предпринята попытка оценить гетерогенность популяции штамма Е. coli 6В1 по антигистоновому признаку. В популяции нативного штамма кишечных палочек, где присутствовало 55,6% клонов с низким уровнем антигистоновой активности (0-1,7 мкг/мл), 44,4% - со средним уровнем АГА (1,8-5,3 мкг/мл), а также с высоким - 5,6% (5,4-12,8 мкг/мл), было выделено два клона: Е. coli 6В1-2 с низкой (0,32 мкг/мл) и Е. coli 6В1-8 с высокой (6,8 мкг/мл) антигистоновой активностью.

Для оценки стабильности популяции отобранных клонов Е. coli по антигистоновому признаку выполнены 3 серии опытов. После первого клонирования в популяции клона Е. coli 6В1-2 60% клонов обладали низкой АГА, 40% -средней, клонов, обладающих высокой АГА не наблюдали. После второго пассажа количество клонов с низким уровнем АГА уменьшалось в 2 раза, количество клонов со средним уровнем признака увеличивалось в 1,7 раза, появились клоны с высоким уровнем выраженности АГА, составившие 6,7% популяции.

В результате третьего пассажа наблюдали возврат к исходной структуре популяции: клонов с низким уровнем АГА было 64%, клонов со средним уровнем признака - 28%, тогда как клонов с высоким уровнем АГА - 8%.

По результатам первого клонирования Е. coli 6В1-8 установлено, что доля клонов с низким уровнем АГА составила 35,3%, со средним уровнем - 41,2% и с высоким - 23,5%. После второго пассажа доля клонов с низким уровнем АГА возросла до 38,9%, со средним уровнем - до 50%, тогда как с высоким уровнем снизилась до 11,1%. После третьего пассажа в структуре популяции клона Е. coli 6В1-8 проявилась тенденция к стабилизации, выразившаяся в снижении доли клонов с низким уровнем АГА (32%), при сохранении доли клонов со средним уровнем признака (52%), на фоне увеличения доли клонов с высоким уровнем признака до 16%. Исходя из полученных данных установлено, что для популяции изученного штамма Е. coli характерна широкая вариабельность ан-тигистонового признака, составляющих ее клонов. Исходя из полученных данных установлено, что для популяции изученного штамма Е. coli характерна широкая вариабельность антигистонового признака, составляющих ее клонов, что соотносится с данными Плотникова А.О. (2002) и Селивановой Е.А. (2007).

Анализ отобранных изогенных клонов Е. coli 6В1-2 и Е. coli 6В1-8 показал динамику клонапьной перестройки популяции, приводящую к повышению приблизительно в 1,6 - 2,7 раза, соответственно, среднего уровня АГА признака после двух пассажей на питательной среде. После третьего пассажа у исследуемых клонов наблюдали стабилизацию среднего уровня антигистоновой активности. У изогенного клона Е. coli 6В1-2 средний уровень антигистоновой активности составил 1,94 мкг/мл, у Е. coli 6В1-8 - 3,7 мкг/мл.

Итогом данного этапа исследований было выделение изогенных клонов Е. coli 6В1-2 и Е. coli 6В1-8 со стабильной выраженностью антигистонового признака. Учитывая, исходный незначительный уровень признака (0,32 мкг/мл) у изогенного клона Е. coli 6В1-2 условно он был принят за 0. В дальнейших исследованиях этот клон обозначен как АГА-, соответственно, другой клон Е. coli 6В1-8 обозначен как АГА+.

После экспериментального инфицирования животных осуществляли бактериологический контроль обсемененности внутренних органов на 3, 7 и 10 сутки. При интраперитонеапьном введении изогенных клонов Е. coli (АГА-) и Е. coli (АГА+) на 3 сутки отмечали выделение единичных бактериальных клеток из тканей печени. На 7 и 10 сутки результаты были отрицательными, что свидетельствовало об элиминации возбудителя из организма животных. Бактериальной обсемененности семенников при данном способе инфицирования не отмечено. Аналогичные результаты были получены при интраперитонеапьном инфицировании животных, предварительно подвергшихся однократному ИИС.

При интратестикулярном способе заражения во все сроки наблюдения результаты бактериологического исследования семенников были положительными в обеих опытных группах. Так, при введении изогенным клона АГА + обсе-мененность семенников на 3 сутки достигала уровня 1х104 КОЕ/г, на 7 и 10 сутки снижалась, сохраняясь на уровне 1х103 КОЕ/г. При введении клона АГА -

обсемененность семенников на 3 сутки была 1 х 103 КОЕ/г, сохраняясь на том же уровне до 7 суток. На 10 сутки анализы были отрицательные, в отдельных случаях регистрировали рост единичных микроорганизмов.

Кривая антигистоновой активности изогенного клона Е. coli 6В1-2 (АГА -) на 3 сутки после инфицирования животных повышалась до уровня 1,57±0,29 мкг/мл, затем плавно снижаясь до 1,17±0,14 мкг/мл к 7 суткам, достигала первоначальных значений 1,08±0,2 к 10 суткам эксперимента. Показатели АГА изогенного клона Е. coli 6В1-8 (АГА+) к 3 суткам снижались с первоначального уровня 6,8 мкг/мл до 3,22±0,34 мкг/мл, повышаясь к 7 суткам до уровня 6,09±1,45 мкг/мл, достигая первоначального уровня 6,7±1,08 к 10 суткам.

Показано, что популяционный анализ может быть использован в качестве методического ключа для отбора изогенных клонов бактерий, различающихся по уровню антигистонового признака. Полученные данные представляют интерес для дальнейшего изучения признака антигистоновой активности и его распространенности в популяции микроорганизмов, и его роли во взаимодействии про- и эукариот.

Выводы

1. При введении штамма Е. coli (АГА+) происходит дискоординация между активным синтезом нонапептидов крупноклеточных ядер гипоталамуса и их высвобождением на уровне аксовазальных комплексов нейрогипофиза, на фоне ультраструктурных повреждений гонадотропоцитов аденогипофиза, в отличие от реакции на введение Е. coli (АГА-), заключающейся в пролонгировании течения адаптивной структурно-функциональной реорганизации нона-пептидергических нейросекреторных ядер гипоталамуса без существенного нарушения этапности секреторного цикла.

2. Стрессорные факторы в комплексе с антигистоновой активностью бактерий обеспечивают пролонгирование сроков пребывания Е. coli в организме экспериментальных животных, а также приводят к снижению регенераторных возможностей тканей.

3. Штамм Е. coli с антигистоновой активностью способствует отклонению нормального цикла сперматогенеза, в частности, блокирование стадий сперматогоний, сперматоцитов, сперматид, а также задержку спермиации, через активацию процессов апоптоза.

4. Инфицирование экспериментальных животных Е. coli (АГА+) приводит к лимитированию запаса резистентности сперматогенеза, что проявляется явлениями атипии, формированием мегалоформ сперматоцитов, сперматид, с последующей десквамацией половых клеток на фоне дистрофических изменений сустентоцитов и собственной оболочки семенных извитых канальцев.

5. Антигистоновая активность E.coli способствует нарастанию деструктивных процессов в сперматогенном эпителии млекопитающих животных (крыс) вплоть до его атрофии, что свидетельствует о лимитировании возможности дальнейшего восстановления репродуктивной функции.

6. Гетерогенность популяции штамма Е. coli по антигистоновому признаку обеспечивает адаптивную пластичность популяции штамма Е. coli в условиях экспериментальной инфекции, способствуя бактериальной персистенции.

7. Антигистоновая активность штамма Е. coli является бактериальной компетенцией, определяющей ход воспалительного процесса в органах уроге-нитального тракта позвоночных животных и может быть использована в качестве клинико-лабораторного показателя для прогнозирования исхода воспалительного процесса и влиянии его на фертильность мужских особей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1) Немцева А.К. (Логинова А.К.), Немцева Н.В., Валов С.Д. Экспериментальная оценка цитофизиологических эффектов АГА в клетках эукариот // Морфология. 2008. Т. 133. №2. С. 94;

2) Немцева А.К. (Логинова А.К.), Плотников А.О. Оценка клеточных эффектов антигистоновой активности бактерий в эксперименте // Вестник РГМУ, 2008. - №2(61). - С. 318;

3) Немцева А.К. (Логинова А.К.), Валов С.Д., Плотников А.О. Оценка цитологических эффектов антигистоновой активности бактерий в эксперименте // Морфология. 2008. Т. 133. №3. С. 78-79;

4) Немцева А.К. (Логинова А.К.), Плотников А.О., Валов С.Д. Особенности цитологических эффектов антигистоновой активности бактерий Klebsiella ozaenae в условиях эксперимента // Украинский научно-медицинский молодёжный журнал. 2008. №3. С. 142-143;

5) Немцева А.К. (Логинова А.К.), Валов С.Д., Плотников А.О., Стадни-ков A.A., Немцева Н.В. Исследование морфологических исследований, происходящих в клетках млекопитающих под действием бактерий, обладающих антигистоновой активностью // Украинский научно - медицинский молодёжный журнал. 2009. № 3. С. 142-143;

6) Боков Д. А., Николаева Е. А., Немцева А.К. (Логинова А.К.) Адаптивные формы функциональной блокады семенников в аспекте оценки патоморфо-генетических факторов их перестройки при дефертилизации половозрелых самцов рыжей полёвки // Вестник РГМУ. Специальный выпуск. 2010. № 2. С. 461-462;

7) Немцева А.К. Морфологические изменения в эукариотических клетках под действием бактерий, инактивирующих гистоны // Приложение к журналу «Фарматека». Тезисы итоговой научной конференции молодых исследователей с международным участием «Татьянин день». - М.: Издательский дом «Бионика», 2010 [CD-Диск]

8) Логинова А.К., Плотников А.О. Немцева Н.В. Морфологические изменения в клетках млекопитающих под действием бактерий, обладающих антигистоновой активностью. Материалы докладов X конгресса МАМ, г. Ярославль // Морфология. 2010. № 4. С.140;

9) Логинова А.К., Немцева Н.В., Плотников А.О., Боков Д.А. Фактор антигистоновой активности бактерий Е. coli в определении пролиферативной

дискинетики элементов полового синцития и гепатоцитов // Материалы 64 конференции студентов и молодых учёных «Актуальные проблемы современной медицины» // Украинский научно-медицинский молодёжный журнал (спец. выпуск). 2010. №. 4. С.;

10) Логинова А.К., Плотников А.О. Экспериментальное обоснование единого механизма взаимодействия бактерий с антигистоновон активностью с клетками эукариотических организмов // Вестник ОГУ. 2011. № 16. с. 300-302;

11) Loginova А. К., Plotnikov А. О., Nemtseva N. V., Stadnikov А. А., КН-mushkin А. V. Escherichia coli (Е. coli) antihistone activity (AHA) can modify the chromatin organization in rat testicular germ cells / Материалы научной конференции «Experimental biology 2012» (21-25 апреля 2012 г., Сан-Диего, США) // The FASEB Journal. 2012. № 26. 835.18 (www.experimentalbiology.org);

12) Атапина A.A., Логинова A.K., Стадников A.A. // Материалы «II Всероссийской конференции студентов и молодых учёных в рамках «Дней молодежной медицинской науки ОрГМА», посвященной памяти чл.-корр. АМН СССР, профессора Ф.М. Лазаренко». Оренбург: изд-во ОрГМА, 2013. с. 28.

Логинова Анастасия Константиновна

СТРУКТУРНО - ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ГИПОТАЛАМО - ГИПОФИЗАРНО - ГОНАДНОЙ СИСТЕМЫ КРЫС В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ ДЕСТАБИЛИЗИРУЮЩИХ ФАКТОРОВ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Заказ № 2820. Тираж 150 экз. Усл. печ. л. 1,4. Подписано в печать 24.05.2013 г.

ЛР№ 063109 от 04.02.1999 г. Отпечатано в ООО «Агентство «Пресса»

ИННЖПП 5610056518/561001001 460015, г. Оренбург, ул. Пролетарская, 15 тел. 297-699, e-mail: presal 999@mail.m

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Логинова, Анастасия Константиновна, Оренбург

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ОРЕНБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

СТРУКТУРНО - ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ГИПОТАЛАМО - ГИПОФИЗАРНО - ГОНАДНОЙ СИСТЕМЫ КРЫС В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ ДЕСТАБИЛИЗИРУЮЩИХ

ФАКТОРОВ

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология 03.02.03 - Микробиология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

На правах рукописи

(Н2СИ 359638

Логинова Анастасия Константиновна

Научные руководители: З.д.н. РФ, д.б.н. профессор A.A. Стадников, к.м.н., доцент А.О. Плотников

Оренбург-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

11

15

18

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 3

ГЛАВА 1. Гипоталамическая нонапептидергическая нейрогормо-нальная регуляция сперматогенеза в аспекте стрессорных воздей- 10 ствий и взаимоотношений про- и эукариот (обзор литературы)

1.1. Стресс, влияние стрессорных воздействий на сперматогенез и гипоталамо-гипофизарную систему млекопитающих и человека

1.2. Сперматогенез и роль гистонов и их вариантов в процессе созревания герминативных элементов

1.3. Роль гистонов как факторов врожденного иммунитета млекопитающих в построении взаимоотношений про- и эукариот ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 29 ГЛАВА 3. Результаты собственного исследования 42

3.1. Структурно-функциональная реорганизация нонапептидерги-ческих нейросекреторных центров гипоталамуса и аденогипофиза 42 экспериментальных животных

3.2. Структурно-функциональная реорганизация сперматогенного эпителия и интерстициальных элементов семенников в условиях инфицирования Е.соН, в том числе и при стрессорных воздействиях

3.3. Популяционная характеристика штамма Е. coli 6В1 по степени выраженности и изменчивости антигистонового признака

ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 101

ВЫВОДЫ 111

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 113

62

91

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Стресс, как процесс реализации неспецифических механизмов адаптации в ответ на внешнее раздражение (Селье Г., 1960) непосредственно связан с возрастанием активности гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы (ГГНС) (Поленов A.JL, Константинова М.С., Гарлов П.Е., 1994; Акмаев И.Г., 2003; Акмаев И.Г., Гриневич В.В., 2003; Стадников A.A., 1995; Стадников A.A., Бухарин О.В., 2012; Кузнецов С.Л. с соавт., 2009). Действие стрессорных факторов подразумевает не только напряжённость ГГНС, но и наличие ответа в регуляторно - зависимых органах, проявляющегося в соответствующих морфофункциональных изменениях, определяемых в рамках «болезней адаптации» (Филаретов A.A., 1987).

К стрессорным относят и инфекционные факторы, представленные как самими бактериями, так и продуктами их метаболизма (Семёнов A.B., 2000; А1у H.A.A., Lightfoot D.A., El-Shemy H.A., 2010). Успешность адаптивных реакций организма во многом определяется биологическими свойствами микроорганизмов, в частности - наличием у возбудителей персистентных характеристик (Экология микроорганизмов человека, 2006), а также участием в процессе взаимодействия про- и эукариот нонапептидов гипоталамуса (Стадников A.A., 2001; Стадников A.A., Бухарин О.В., 2012).

На сегодняшний день, большой интерес представляет изучение характера влияния стрессорных факторов на процессы реализации адаптивных реакций в интерстициальных клетках семенников и в сперматогенном эпителии, отражающейся на половой функции в целом (Bray Т.М., Taylor C.G., 1993; Steinberger, A., Klinefelter G., 1993; Bindhu M.P., Annamalai P.T., 2004; Шевлюк H.H. с соавт., 2007).

Одним из новых и весьма актуальных направлений в изучении

стрессовых воздействий является установление в клетках эукариотических

организмов специфического комплекса морфофункциональных изменений,

3

развивающихся под действием бактерий, обладающих персистентными свойствами. На данный момент имеются сведения о морфофункциональных изменениях в клетках эукариот при их взаимодействии с бактериями, обладающими антилизоцимной, антикарнозиновой или антилактоферриновой активностью (Бухарин О.В. соавт., 2000; Карташова О. Л. с соавт., 2006; Бухарин О.В. с соавт., 2005; Козлова А.Н. с соавт., 2004).

Что же касается антигистоновой активности, то имеются лишь единичные сведения, касающиеся взаимодействия бактерий (Е.соН) с одноклеточными эукариотами (инфузориями) (Бухарин О.В. с соавт., 2004).

Показанные эффекты взаимодействия бактерий с антигистоновой активностью с одноклеточными эукариотами позволили сделать предположение о возможной роли этого свойства во взаимодействии бактерий с многоклеточными организмами, в том числе с клетками млекопитающих.

Исследование процессов сперматогенеза может рассматриваться как удобная модель для исследования закономерностей клеточной и репродуктивной биологии, генетики, радиобиологии, не только благодаря тому, что гаметогенез динамично отражает развитие мужских половых клеток, находящихся под строгим генетическим и гормональным контролем, и подчиняющихся строгой пространственно-временной организации (Пальцев М.А., Кветной И.М., 2008), но и за счет высокого уровня метаболизма гистоновых белков, являющихся мишеныо антигистоновой активности бактерий (Боже-домов В.А.с соавт., 2012).

Практическая значимость подобных исследований продиктована необходимостью познания патогенетических механизмов бактериальных инфекций урогенитального тракта мужчин. Следует отметить, что изучение влияний патогенной и условно-патогенной микрофлоры на процесс сперматогенеза уделяется недостаточное внимание. В то же время, многообразие существующих неблагоприятных факторов, способных нарушать процессы пролиферации и дифференцировки мужских половых клеток, обосновывают необходимость дальнейшего изучения диапазона адаптивных и компенсатор-

4

ных возможностей семенников, особенно в аспекте гипоталамической нона-пептидергической нейроэндокринной регуляции (Шевлюк H.H., Стадников A.A., 2010).

Сегодня представляется особо важным сформировать парадигму адаптации тканевых элементов эукариот к воздействиям прокариот с учетом генетических особенностей, как бактерий, так и организма-хозяина. Все вышеизложенное послужило обоснованием проведения настоящего исследования.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целыо работы явилось установление закономерностей адаптивных структурно-функциональных изменений тканевых и клеточных элементов гипоталамо - гипофизарно - гонадной системы крыс-самцов в условиях стрессорных воздействий и бактериального инфицирования E.coli с различным персистентным потенциалом.

Для достижения цели были решены следующие задачи:

1. Определить характер цитологических изменений нейросекретор-ных клеток крупноклеточных ядер гипоталамуса крыс - самцов, а также аде-ноцитов гипофиза в условиях стресса и введения животным бактерий с различным персистентным потенциалом (E.coli с антигистоновой активностью (АГА+) и без таковой (АГА-).

2. Оценить диапазон реализации гисто- и органотипических потенций сперматогенным эпителием и клетками интерстиция семенников стрес-сированных, а также инфицированных животных в модельных экспериментах.

3. Установить связь между персистентными характеристиками исследуемых бактерий и особенностями изменений, происходящих в семенниках исследуемых животных.

4. Дать микробиологическую характеристику популяционной изменчивости штамма E.coli по признаку антигистоновой активности in vitro и in vivo.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Впервые проведено комплексное гистологическое исследование гипо-таламо-гипофизарно-гонадной системы стрессированных крыс в условиях бактериального инфицирования изогенными клонами E.coli с антигистоно-вой активностью (АГА+) и без таковой (АГА-). Полученные данные раскрывают закономерности изменений нонапептидергической регуляции со стороны ГГНС в условиях инфицирования животных изогенным клоном E.coli АГА+, что обосновывает механизмы структурно-функциональных нарушений сперматогенных и стромальных структур семенников крыс, связанных с разбалансировкой синтеза и транспорта нейрогормонов супраоптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса.

Установлены закономерности адаптивной структурно-функциональной модификации клеточных элементов гипоталамо - гипофи-зарно - гонадной системы крыс-самцов в условиях инфицирования изогенным клоном E.coli АГА- на фоне стрессорных воздействий, свидетельствующие о достаточно высоком запасе резистентности гаметогенеза к экстремальным воздействиям.

Получены новые факты о негативном влиянии E.coli АГА+ на сперма-тогенный эпителий и интерстиций семенников экспериментальных животных, проявляющемся в нарушении сперматогенеза, явлениях атипии, апопто-за, десквамации половых клеток на фоне дистрофических изменений сустен-тоцитов и собственной оболочки семенных извитых канальцев.

С помощью популяционного анализа дана оценка гетерогенности популяции штамма E.coli по антигистоновой активности, что позволило оценить адаптивную пластичность бактериальной популяции и отобрать изоген-ные клоны, пригодные для экспериментальной модели.

Впервые на экспериментально-гистологической модели показаны эффекты антигистоновой активности эшерихий, которые могут быть использованы в качестве клинико-лабораторного стандарта в прогнозировании исхода воспалительного процесса и влиянии его на фертильность мужских особей.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Результаты проведенного исследования раскрывают дополнительные аспекты механизмов гипоталамической нейроэндокринной регуляции сперматогенеза с новых позиций, свидетельствующих об аффинности спермато-генного эпителия и интерстиция семенников к воздействиям Е.соП АГА+ ,проявляющейся в экспериментальных условиях (при нарушениях адекватной гипоталамической нейросекреции) в повреждениях сперматогенеза, реактивных отклонениях процессов целостности тканей гонад, их клеточного обновления, формировании апоптозной доминанты и локальных механизмов контроля межклеточных взаимодействий.

Полученные данные имеют прикладное значение для верификации и прогнозирования исходов инфицированных поражений семенников (гипос-перматогенез, азооспермия), оценки степени их обратимости, что является важным для профилактики и лечения мужского бесплодия.

Тема данного диссертационного исследования включена в план НИР кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии. Работа «Экспериментальное обоснование эффектов антигистоновой активности бактерий в клетках млекопитающих» удостоена Премии Губернатора Оренбургской области для талантливой молодёжи в 2011 г. Исследования выполнены, в том числе, при поддержке Гранта Правительства Оренбургской области для талантливой молодёжи (2012).

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты исследований и выводы диссертации используются в учебном и научном процессах на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии Оренбургской государственной медицинской академии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Выявлен новый аспект механизма взаимодействия организма-хозяина с микробными агентами, обладающими персистентным свойством, антигистоновой активностью, заключающийся в дискоординации между синтетической и регуляторной функциями нонапептидергической ГГЫС.

2. Комплексное воздействие стресса и инфицирования животных E.coli АГА+ приводит к нарушению резистентности пролиферации и диффе-ренцировки гамет семенников крыс к экстремальным воздействиям, что проявляется существенными дистрофическими изменениями в сперматогенном эпителии и интерстициальных структурах семенников.

3. Гетерогенность популяции эшерихий по антигистоновому признаку, способствующая персистенции бактерий в организме - хозяине с одной стороны, и обуславливающая реакцию гипоталамо-гипофизарно-гонадной системы - с другой, в совокупности позволяет оценить исход воспалительного процесса и его влияние на фертильность мужских особей.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты диссертации доложены и обсуждены на: итоговой научной конференции молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» (г. Москва, 2010); X конгрессе Международной ассоциации морфологов (г. Ярославль, 2010); 64 конференции студентов и молодых учёных «Актуальные проблемы современной медицины» (г. Киев, Украина, 2010); конференции молодых учёных «Актуальные проблемы экологии, гигиены и эпидемиологии» в рамках Дней молодёжной науки в Оренбургской области (г. Оренбург, 2011); I Всероссийской конференции студентов и молодых учёных в рамках «Дней молодежной медицинской науки ОрГМА», посвященной памяти чл.-корр. АМН СССР, профессора Ф.М. Лазаренко (г. Оренбург, 2012); Международном конгрессе FASEB (Fédéral Association of Expérimental Biologists) «Expérimental biology 2012» (r. Сан-Диего, США, 2012); Всероссийской конференции «Персистенция микроорганизмов» (г. Оренбург, 2012); II всероссийской конференции студентов

8

и молодых учёных в рамках «Дней молодежной медицинской науки ОрГ-МА», посвященной памяти чл.-корр. АМН СССР, профессора Ф.М. Лазарен-ко (г. Оренбург, 2013).

ПУБЛИКАЦИИ.

Основные положения работы изложены в 12 печатных работах, из них 6 в изданиях, рекомендованных ВАК при Минобрнауки РФ.

СТРУКТУРА И ОБЪЁМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материал и методы исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 22 таблицы и 34 рисунка. Список литературы содержит 193 источника, включая 109 отечественных и 84 зарубежных работ.

ГЛАВА 1. ГИПОТАЛАМИЧЕСКАЯ НОНАПЕПТИДЕРГИЧЕСКАЯ НЕЙРОГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ СПЕРМАТОГЕНЕЗА В АСПЕКТЕ СТРЕССОРНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ И ВЗАИМООТНОШЕНИЙ ПРО- И ЭУКАРИОТ

(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Интерес к проблеме нарушения сперматогенеза диктуется необходимостью решения постоянно расширяющегося круга актуальных практических задач, имеющих большое медико-биологическое и социальное значение. К таковым относят преодоление мужского бесплодия, изучение последствий действия повреждающих факторов окружающей среды, а также усовершенствование методов искусственного оплодотворения, криоконсервации, эффективного управления размножением сельскохозяйственных животных и насекомых, планирование семьи (Захидов С.Т., 1998).

На сегодняшний день одним из немаловажных факторов, способствующих нарушению процесса сперматогенеза с последующим развитием бесплодия, все чаще становится воздействие инфекционных агентов. Имеющиеся данные о влиянии инфекций урогенитального тракта на фертильность противоречивы. Некоторые авторы отмечают, что при сравнении микрофлоры эякулятов от здоровых и инфертильных мужчин, помимо патогенных микроорганизмов, определённую роль в формировании патоспермии играют и представители условно-патогенной микрофлоры (Бухарин О.В. с соавт. 2006). Кроме того, согласно современным понятиям о развитии инфекционного процесса, очевидно, что роль в нарушении сперматогенеза бактериальные патогены играют как опосредованно, через активацию механизмов иммунной защиты, так и непосредственно, путем транслокации из других биотопов организма (Копылов В.А, 2005).

Однако взгляд на инфекцию как на единственную причину формирования бесплодия не соответствует современным представлениям о механизмах взаимодействия про- и эукариот (Стадников A.A., Бухарин О.В., 2012). Сложные биологические системы, такие как человек или млекопитающие животные,

10

находясь под влиянием факторов окружающей среды одновременно генерируют множество ответных реакций на действующие раздражители. Возможность формирования адекватной реакции и поддержания гомеостаза многоклеточного организма напрямую зависит от пороговости действующего раздражителя, а также от способности организма к адаптации. Именно изучение возможностей макроорганизма к формированию адаптивных реакций в ответ на действие внешних факторов различного генеза является одной из главнейших проблем современной биологии.

1.1. Стресс, влияние стрессорных воздействий на сперматогенез и гииоталамо-гнпофизарную систему млекопитающих и человека

Проблема нарушения фертильности является одной из актуальных проблем современной науки и медицины. Согласно современным эпидемиологическим исследованиям частота встречаемости бесплодных пар среди населения России колеблется от 8 до 15%, а в ряде регионов Российской Федерации имеет тенденцию к увеличению. При этом вклад нарушений мужской репродуктивной функции в общую структуру бесплодного брака составляет 30-40%.

В настоящее время признанной является классификация мужского бесплодия, основанная на изучении причинных факторов, основными из которых считают инфекции гениталий, варикоцеле, идиопатическую патозооспермию и эндокринный фактор. Однако, в стандартизированной п