Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нарушения в тиреоидной и репродуктивной системах крыс с экспериментальным сахарным диабетом и их коррекция интраназально вводимым инсулином

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Нарушения в тиреоидной и репродуктивной системах крыс с экспериментальным сахарным диабетом и их коррекция интраназально вводимым инсулином"

На правах рукописи

Богуш Ирина Викторовна

НАРУШЕНИЯ В ТИРЕОИДНОЙ И РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМАХ КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ И ИХ КОРРЕКЦИЯ ИНТРАНАЗАЛЬНО ВВОДИМЫМ ИНСУЛИНОМ

03.01.04 - биохимия

15 ЯНЗ 2015

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005557477

Санкт-Петербург - 2014

005557477

Работа выполнена в лаборатории молекулярной эндокринологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Шпаков Александр Олегович

Официальные оппоненты:

Кокряков Владимир Николаевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией общей патологии Отдела общей патологии и патофизиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук

Бабенко Алина Юрьевна, доктор медицинских наук, заведующая научно-исследовательской лабораторией диабетологии Института эндокринологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный медицинский исследовательский центр им. В. А. Алмазова»

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Защита состоится «!Р» Ф^/сСиЛ^ 2015 г. в /V часов на заседании диссертационного совета ' Д/002.127.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук (194223, Санкт-Петербург, пр. Тореза, д. 44).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук по адресу: 194223, Санкт-Петербург, пр. Тореза, д. 44 и на сайте http://www.iephb.ru/sovet.htm.

Автореферат разослан «1'9 » 201У г.

Ученый секретарь диссертационного совета:

доктор биологических наук ^г— • Парнова Римма Германовна

г*;, "7 _______

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Одной из актуальных проблем современной медицины является разработка новых подходов для диагностики, лечения и мониторинга сахарного диабета (СД) и его осложнений. В мире СД болеют более 360 миллионов человек (в Российской Федерации - более 12 миллионов), из них около 10 % страдают инсулинозависимым СД 1-го типа (СД1), остальные 90 % - инсулиннезависимым СД 2-го типа (СД2). Более чем у 40 % больных СД выявлены тяжелые осложнения со стороны сердечно-сосудистой, нервной, выделительной и других систем организма, что приводит к временной или полной их нетрудоспособности, инвалидизации и, при неблагоприятном течении заболевания, к преждевременной смерти. В настоящее время все больше внимания уделяется нарушениям, которые возникают в тиреоидной и репродуктивной системах у больных СД, что ведет к развитию гипотиреоидных состояний, андрогенной недостаточности, синдрома поликистоза яичников, усугубляет дисфункции со стороны сердечно-сосудистой системы. Несмотря на значительные успехи, достигнутые в изучении осложнений со стороны эндокринной системы при СД, этиология, патогенез и молекулярные механизмы развития заболеваний репродуктивной системы и щитовидной железы (ЩЖ) в условиях СД до сих пор изучены недостаточно. В частности не выяснено, какие из звеньев гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной (ГГТ) и гипоталамо-гипофизарно-гонадной (ГГГ) осей подвергаются наибольшим функциональным изменениям при СД и каковы молекулярные механизмы, лежащие в основе этих изменений. Ключевую роль в реализации эффектов гипофизарных гликопротеиновых гормонов играет аденилатциклазная сигнальная система (АЦСС), однако данные о взаимосвязи между функциональным состоянием АЦСС в ЩЖ и органах репродуктивной системы при СД, с одной стороны, и уровнем гипофизарных гликопротеиновых гормонов, тиреоидных и половых стероидных гормонов в условиях СД1 и СД2 отсутствуют.

Важнейшим подходом для поиска эффективных путей лечения, прогнозирования и профилактики осложнений СД является разработка адекватных моделей СД1 и СД2 с применением экспериментальных животных. В экспериментальной эндокринологии для моделирования СД1 широко используются краткосрочная стрептозотоциновая модель заболевания, вызываемая одноразовой обработкой высокой дозой стрептозотоцина (СТЗ), для которой характерна абсолютная инсулиновая недостаточность и выраженная гипергликемия, а также модели СД2 на мутантных линиях грызунов, которые характеризуются ожирением и резистентностью тканей к инсулину. Однако эти модели имеют лишь отдаленное сходство с соответствующими заболеваниями человека. Так у животных с острой моделью СД1 в полной мере не успевают развиться осложнения этого заболевания, а спектр и степень выраженности функциональных изменений в эндокринной системе заметно отличаются от таковых при СД1 человека. Для увеличения продолжительности заболевания необходимо лечение инъекционным инсулином, что приводит к гипогликемическим эпизодам, которые сами вызывают нарушения со стороны ЦНС и функционально связанных с ней ГГТ и ГГГ осей. Исходя из этого, необходимы длительные модели СД1, лишенные указанных недостатков. Среди моделей СД2 наибольший интерес представляет неонатальная модель, которую вызывают инъекцией СТЗ новорожденным крысятам (БЬракоу е1 а., 2012а). Она характеризуется сильно выраженной инсулиновой резистентностью и дислипидемией, характерными признаками СД2 человека, и большой длительностью, что позволяет проследить развитие осложнений со стороны эндокринной и других систем организма.

Для лечения СД традиционно используют инъекционный инсулин, применение которого приводит к снижению гипергликемии, но не в полной мере устраняет дефицит инсулина в мозге, одну из первопричин развития нейродегенеративных заболеваний. В последние годы получены экспериментальные доказательства того, что повышение концентрации инсулина в мозге путем его интраназального введения положительно влияет на функционирование ЦНС, устраняет развивающийся в условиях СД когнитивный дефицит, повышает чувствительность периферических тканей к инсулину. Это позволяет рекомендовать интраназальный инсулин (ИИ) для лечения СД и его осложнений, в том числе со стороны эндокринной системы, поскольку повышение уровня инсулина в мозге может восстановить функции ГГТ и ГГГ осей, нарушенные вследствие инсулиновой недостаточности (СД1) или инсулиновой резистентности (СД2). Однако исследования влияния длительного воздействия ИИ на функции тиреоидной и репродуктивной систем в условиях СД не проводились. Следует подчеркнуть, что актуальность и необходимость таких исследований связана еще и с тем, что в последние годы ИИ стали широко применять в клинике для лечения пациентов с болезнью Альцгеймера и неврологическими расстройствами недиабетической этиологии. Все это требует комплексного изучения влияния длительной терапии ИИ на эндокринную и другие системы организма как в условиях СД, так и в отсутствие диабетической патологии.

Цель работы состояла в изучении нарушений гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной и гипоталамо-гипофизарно-гонадной осей у самцов крыс с пролонгированными моделями сахарного диабета 1-го и 2-го типов и в исследовании влияния на них длительной обработки с помощью интраназально вводимого инсулина.

Задачи исследования:

1. Получить пролонгированную модель мягкого СД 1-го типа и неонатальную модель СД 2-го типа на самцах крыс, охарактеризовать их по метаболическим показателям, сравнить модель мягкого СД 1-го типа с наиболее часто используемой краткосрочной моделью острого СД 1-го типа.

2. Изучить функциональное состояние гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной оси у крыс с пролонгированным мягким СД 1-го типа по содержанию у них тиреоидных гормонов и тиреотропного гормона (ТТГ), теста с нагрузкой тиролиберином, и сравнить полученные результаты с аналогичными показателями у крыс с краткосрочным острым СД 1-го типа.

3. Провести сравнительное исследование функциональной активности гормоночувствительной аденилатциклазной сигнальной системы (АЦСС), ответственной за продукцию тиреоидных гормонов, в щитовидной железе крыс с моделями мягкого и острого СД 1-го типа.

4. Исследовать влияние длительной обработки крыс с моделями острого и мягкого СД 1-го типа различными дозами интраназально вводимого инсулина (ИИ) на содержание у них тиреоидных гормонов и ТТГ, чувствительность ГГТ оси к тиролиберину, а также на функциональную активность гормоночувствительной АЦСС в щитовидной железе.

5. Изучить функциональное состояние гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси у самцов крыс с моделями СД 1-го и 2-го типов с помощью мониторинга содержания уровня тестостерона и теста с нагрузкой люлиберином.

6. Исследовать функциональную активность гормоночувствительной АЦСС в семенниках диабетических крыс, и изучить влияние на нее длительной обработки животных с помощью ИИ.

Научная новизна работы

Разработана модель мягкого СД1 продолжительностью семь месяцев, которая характеризуется относительной инсулиновой недостаточностью и умеренной гипергликемией, более близкая по ряду характеристик СД1 человека в сравнении с острой СТЗ моделью заболевания. Впервые показано, что у крыс с пролонгированной моделью СД1 снижается уровень тиреоидных гормонов при повышении содержания ТТГ, что указывает на развитие у них гипотиреоидного состояния. Эти изменения существенно отличаются от таковых при остром СД1, и сходны с изменениями тиреоидного статуса у пациентов с СД1, что свидетельствует об адекватности использования пролонгированной модели для изучения функций ГГТ оси при СД1 человека. Впервые показано, что чувствительность АЦСС к ТТГ в ЩЖ крыс с пролонгированными моделями СД1 и СД2 снижена, что свидетельствует о развитии резистентности ЩЖ к регуляторному действию ТТГ и является одной из ключевых причин снижения уровня тиреоидных гормонов при СД. Впервые изучено влияние длительной обработки ИИ на тиреоидный статус и показано, что ИИ в дозах 0.5-0.6 МЕ/крысу в значительной степени восстанавливает уровень тиреоидных гормонов у крыс с СД1, но при этом повышает уровень ТТГ, причем это повышение обнаружено и при обработке ИИ здоровых животных. Впервые показано, что у крыс с СД1 и СД2 снижается уровень тестостерона и ослабляется ответ семенников на обработку люлиберином, что свидетельствует о нарушениях в ГГГ оси и развитии андрогенной недостаточности у диабетических животных. Впервые установлено, что одной из причин снижения продукции андрогенов при СД является ослабление функциональной активности АЦСС в семенниках диабетических крыс и снижение ее чувствительности к регуляторному действию гонадотропина, причем эти нарушения в значительной степени восстанавливались при длительной обработке ИИ.

Теоретическое и практическое значение работы

Разработанная и охарактеризованная в работе пролонгированная модель мягкого СД1 может быть использована для изучения нарушений ГТТ оси в условиях СД1, поскольку по изменению гормональных показателей тиреоидной системы она сходна с СД1 человека. Установлен один из ключевых молекулярных механизмов, лежащих в основе развития резистентности ЩЖ и семенников к гипофизарным гликопротеиновым гормонам в условиях СД, в основе которого лежит снижение чувствительности АЦСС в этих тканях к регуляторному действию ТТГ и гонадотропинов. Восстановление функционирования тиреоидной системы при длительной обработке диабетических крыс с помощью ИИ указывает на его терапевтический потенциал для коррекции нарушений со стороны ГГТ оси при СД. При этом выявлено повышение уровня ТТГ, которое наблюдается при длительной обработке ИИ как диабетических, так и здоровых крыс, что необходимо учитывать при использовании ИИ для лечения СД, болезни Альцгеймера и нейрологических расстройствах. Идентификация гормональных нарушений в ГГТ и ГГГ осях при СД и их коррекция с помощью ИИ открывают новые перспективы для диагностики, лечения и профилактики дисфункций ЩЖ и репродуктивной системы в условиях СД1 и СД2. Результаты работы могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологического и медицинского факультетов Санкт-Петербургского государственного университета, Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии, Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова и других биологических и медицинских вузов.

Положения, выносимые на защиту

1. У крыс с пролонгированной моделью мягкого СД 1-го типа снижены уровни тиреоидных гормонов на фоне повышенного уровня ТТГ, что характерно для СД 1-го типа человека.

2. Одной из причин снижения уровня тиреоидных гормонов у крыс при СД 1-го типа является ослабление чувствительности АЦСС к регуляторному действию ТТГ в щитовидной железе.

3. Длительная обработка крыс с СД 1-го типа с помощью ИИ частично восстанавливает уровень тиреоидных гормонов и активность АЦСС в щитовидной железе, но при этом значительно повышает у них уровень ТТГ. Повышение ТТГ отмечено также при обработке ИИ здоровых животных.

4. При СД 1-го и 2-го типа у крыс снижен уровень тестостерона, ослаблен ответ гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси на люлиберин и снижена чувствительность АЦСС семенников к гонадотропину и пептидным гормонам. Длительная обработка ИИ частично восстанавливает чувствительность АЦСС семенников к гонадотропину.

Личный вклад автора. Все экспериментальные данные, приведенные в диссертационной работе, получены лично автором или при его непосредственном участии. Автор проводил статистическую обработку полученных данных, осуществлял их анализ и обобщение, принимал участие в подготовке публикаций по материалам работы.

Апробация работы. Результаты исследования представлены на Международной молодежной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновационные технологии в гематологии и диабетологии» (Санкт-Петербург, 2012), III Конференции Молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2012), Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2013), XXII съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновационные технологии в нейроэндокринологии, нейронауках и гематологии» (Санкт-Петербург, 2013), III Российском конгрессе «Метаболический синдром: междисциплинарные проблемы» (Санкт-Петербург, 2013), Всероссийской конференции с международным участием «Трансляционные исследования в инновационном развитии здравоохранения» (Санкт-Петербург, 2014), IV Съезде физиологов стран СНГ (Сочи-Дагомыс, 2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 6 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, их обсуяедения и выводов. Работа изложена на 154 страницах, включая 29 рисунков, 19 таблиц и приложение. Список цитируемой литературы содержит 189 ссылок.

Благодарности. Работа выполнялась при финансовой поддержке Программы Российского Научного Фонда № 14-15-00413, Молодежного гранта РФФИ № 12-0432034 (руководитель Мойсеюк (Богуш) И.В.), Федеральной целевой программы министерства образования и науки РФ (соглашение № 8486), гранта Правительства Санкт-Петербурга для студентов, аспирантов, молодых ученых, молодых кандидатов наук 2012 года.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы представлены сведения о функционировании ГГТ и ГГГ осей, об основных регуляторах тиреоидной и репродуктивной систем, а также о нарушениях в этих системах у пациентов с СД и у экспериментальных животных с моделями этого заболевания. Рассмотрена структурно-функциональная организация АЦСС, чувствительной к действию ТТГ и гонадотропинов, а также ее роль в продукции гормонов и функционировании ЩЖ и семенников. Изложены сведения о механизмах действия ИИ, его применении для коррекции когнитивных дисфункций.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали самцов крыс породы Wistar различного возраста (в зависимости от модели СД). Животных содержали на стандартном рационе и в стандартных условиях при условии свободного доступа к воде и пище.

Пролонгированную модель мягкого СД1 инициировали тремя последовательными в/б инъекциями пятимесячным самцам крыс СТЗ, растворенного в 0.1 М цитратном буфере (рН 4.5), в дозах - 40 (первый день), 35 (10-й день) и 30 (80-й день) мг/кг. Животных разделили на 6 групп: 3 диабетические с продолжительностью мягкого СД1 30, 150 и 210 суток, которых обрабатывали СТЗ (мДЗО, п=6; мД150, и=8; мД210, п=8) и 3 соответствующих им контрольные группы, которые вместо СТЗ получали цитратный буфер (мКЗО, п=6 мК150, п=8; мК210, л=8). Для изучения действия ИИ (человеческий рекомбинантный, «Lilly», США) сформировали 8 групп: крысам из первых четырех (мКИ150, /1=6; мКИ210, п=6; мДИ150, п=6 и мДИ210, п=6) вводили ИИ в суточной дозе 0.5 ЕД/крысу в течение 75 и 135 суток соответственно, животным из других четырех групп (мК150, л=8; мК210, и=8; мД150, п= 8 и мД210, п=8) вместо ИИ интраназально вводили цитратный буфер (рН 4.5). Уровень глюкозы и инсулина оценивали через 9 суток после первой и через 9 суток после второй инъекций СТЗ, на 74-е сутки - за сутки до начала лечения ИИ, а также перед декапитацией. В образцах крови, полученных до начала эксперимента, на 74-е сутки и в конце эксперимента (на 210-е сутки) измеряли уровни тиреоидных гормонов (свободного (fT4) и общего (tT4) тироксина и общего трийодтиронина (tT3)) и ТТГ. В группах мК210, мКИ210, мД210 и мДИ210 тест с нагрузкой тиролиберином проводили на 190-е сутки эксперимента, на 210-е сутки животных декапитировали под наркозом и забирали ткани для последующего выделения фракций плазматических мембран из ЩЖ и семенников. Крыс из групп мКЗО и мДЗО и из групп мК210, мД210, мКИ210 и мДИ210 декапитировали на 30-е и 210-е сутки эксперимента, соответственно, забирали у них ткани ЩЖ и семенников для выделения фракций плазматических мембран. Перед забоем у всех животных забирали кровь для определения уровня гормонов.

Краткосрочную модель острого СД1 вызывали в/б введением шестимесячным самцам крыс СТЗ в дозе 65 мг/кг (группа оД, п=8), животным контрольной группы (оКЗО, п=8) вместо СТЗ вводили 0.1 М цитратный буфер (рН 4.5). Масса тела, уровень глюкозы и инсулина были измерены перед началом эксперимента, через 10 суток после обработки СТЗ и перед декапитацией (30-е сутки). Содержание тиреоидных гормонов и тестостерона в сыворотке крови определяли перед началом эксперимента и перед декапитацией. Животных декапитировали на 30-е сутки и забирали ткани для выделения фракций плазматических мембран из ЩЖ и семенников. Для изучения влияния ИИ сформировали 8 групп: одна контрольная группа получала интраназально цитратный буфер (оК, п=8), три недиабетические группы получали ИИ в суточной дозе 0.3 (оКИо.з,

п=6), 0.6 (оКИ15, п=б) и 1.5 (оКИо.б, п=6) ME/крысу, пятая, диабетическая, группа ползала интраназально буфер (оД, п=8), три других диабетических группы ИИ в суточной дозе 0.3 (оДИо.з, п=6), 0.6 (оДИ06, л=6) и 1.5 (0КД1.5, л=6) МЕ/крысу. Обработку ИИ проводили в течение 28 суток (с 3-их по 30-е сутки эксперимента). Содержание тиреоидных гормонов, ТТГ и тест с нагрузкой тиролиберином проводили через 28 суток после введения СТЗ.

Неонатальную модель СД2 вызывали в/б введением пятидневным крысятам СТЗ в дозе 80 мг/кг, контрольной группе того же возраста вводили цитратный буфер (pH 4.5). Через 2-3 месяца у 70 % крыс развивались признаки СД2. Для дальнейших экспериментов отбирали животных с нарушенной толерантностью к глюкозе. Изучали 6 групп самцов крыс - три контрольные группы, которых забивали в возрасте 3-х (нКЗ, п=8), 8-ми (нК8, п=10) и 18-ти (нК18, п=7) месяцев, и три диабетические группы, которых забивали в возрасте 3-х (нДЗ, п=8), 8-ми (нД8, п=10) и 18-ти (нД18, п=7) месяцев. Перед декапитацией у животных проводили тест на толерантность к глюкозе, тест с нагрузкой люлиберином для оценки нарушений в ГГГ оси, забирали кровь для определения гормонов, а после декапитации забирали ткани ЩЖ и семенников для выделения из них фракций плазматических мембран.

Определение уровня гормонов и глюкозы в крови крыс. Уровни ГГ4 , tT4 и tT3 определяли в крови крыс, которую получали из хвостовой вены, с помощью иммуноферментных наборов «ИФА-СвТ4-1», «ИФА-ТТ4-1» и «ИФА-ТТ3-1» (ЗАО «НЕЮ Иммунотех», Россия), уровень тестостерона (Т) в плазме крови определяли с помощью наборов «Тестостерон-ИФА» (ООО «Алкор-Био», Россия). Концентрацию инсулина измеряли с помощью набора Rat Insulin ELISA («Mercodia AB», Швеция). Измерение уровня глюкозы проводили с помощью тест-полосок «One Touch Ultra» (США) и глюкометра фирмы «Life Scan Johnson & Johnson» (Дания).

Оценка толерантности к глюкозе. Для изучения толерантности к глюкозе у крыс с СД2 животным в/б вводили раствор глюкозы (2 г/кг веса) с последующим измерением концентрации глюкозы и инсулина в крови на протяжении 2 ч. Крыс, уровень глюкозы у которых через 2 ч после нагрузки, превышал значение 8 мМ, рассматривали как диабетических.

Тест с нагрузкой тиролиберином. Тиролиберин разводили в физиологическом растворе и вводили интраназально в дозе 100 мкг/крысу. Контрольным животным интраназально вводили физиологический раствор в том же объеме. Кровь для исследования уровня ТТГ, fT4, tT4 и tT3 забирали до введения и через 2 ч после введения рилизинг-фактора.

Тест с нагрузкой люлиберином. Люлиберин разводили в 0.2 М ацетатном буфере (pH 5.2) и в дозе 0.25 пг/крысу вводили инраназально четыре раза в день (в 10.30, 12.00, 13.30 и 15.00), суммарная суточная доза люлиберина составила 1 пг/крысу. Контрольные животные получали интраназально ацетатный буфер в том же объеме и в те же сроки. Кровь для исследования уровня тестостерона забирали через 30 мин, 2, 3.5 и 5.5 ч (11.00, 12.30, 14.00 и 16.00) после введения первой дозы люлиберина.

Реактивы и радиоизотопы для биохимических экспериментов. Использовали хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), ТТГ из гипофиза быка, РАСАР-38 (гипофизарный аденилатциклазу активирующий полипептид-38, pituitary adenylyl cyclase-activating polypeptide-38), изопротеренол, креатинфосфат, креатинфосфокиназу из мышц кролика, АТФ, ГТФ, р,у-имидогуанозин-5'-трифосфат (GppNHp), форсколин, соматостатин, креатинфосфат, креатинфосфокиназу из мышц кролика, («Sigrm»,CLIlA). Для определения активности аденилатциклазы (АЦ) использовали радиоактивно

меченый [а-32Р]АТФ (150 ГБк/ммоль) (Всерегиональное объединение «Изотоп», Россия), для определения ГТФ-связывающей способности гетеротримерных G-белков использовали [8-3H]GppNHp (5 Ки/мМ) («Amersham», Англия).

Выделение мембранных фракций из семенников и ЩЖ крыс. Фракцию плазматических мембран из щитовидной железы выделяли, как описано (Sato et al., 1990; Shpakov et al., 2012b). Ткань ЩЖ промывали охлажденным физиологическим раствором, измельчали, гомогенизированы в 20 объемах охлажденного до 4°С 40 мМ Tris-HCl буфера (рН 7.4), содержащего 5 мМ MgCl2, 320 мМ сахарозы и коктейль ингибиторов протеаз (буфер А). Гомогенат центрифугировали (480 g, 10 мин), осадок отбрасывали, супернатант снова центрифугировали (27 500 g, 20 мин), полученный осадок ресуспендировали в буфере А без сахарозы и повторно центрифугировали (27 500 g, 20 мин). Для выделения тестикулярных мембран измельченную ткань семенников гомогенизировали на холоде в 40 мМ Tris-HCl-буфере, рН 7.4, содержащем 5 мМ MgCl2, 10 % (w/v) сахарозу и ингибиторы протеаз. Гомогенат центрифугировали при 1500 х g в течение 10 мин, после чего супернатант центрифугировали при 20000 х g в течение 30 мин. Полученный осадок ресуспендировали в буфере без сахарозы и центрифугировали в том же режиме. Полученные из ЩЖ и семенников фракции плазматических мембран ресуспендировали в 50 мМ Tris-HCl буфере (рН 7.4), так чтобы содержание белка в них составило 1-3 мг/мл, и хранили при -70°С.

Определение активности АЦ. Активность аденилатциклазы (ЕС 4.6.1.1) определяли, как описано в работе (Shpakov et al., 2010). Реакционная смесь (общий объем 50 мкл) содержала 50 мМ Tris-HCl (рН 7.4), 5 мМ MgCl2, 0.1 мМ цАМФ, 1 мМ АТФ, 1 мкКи [а-32Р]-АТФ, 20 мМ креатинфосфата, 0.2 мг/мл креатинфосфокиназы и 25100 мкг мембранного белка. Реакцию проводили в течение 12 минут при 37°С, начинали добавлением фракции плазматических мембран и останавливали добавлением 100 мкл 0.5 М НС1. Пробы кипятили в течение 6 мин для разрушения комплексов между меченым цАМФ и белками, нейтрализовали кислоту с помощью 100 мкл 1.5 М имидазола. Образовавшийся [32Р]-цАМФ отделяли на колонках с оксидом алюминия, элюат собирали в сцинтилляционные флаконы и считали радиоактивность на счетчике 1209/1215 RackBeta («LKB», Швеция). Каждое измерение проводили в трех независимых экспериментах в трех или четырех параллельных пробах. Активность АЦ выражали в пМ цАМФ/мин на мг мембранного белка. Базальную активность АЦ измеряли в отсутствие гормональных и негормональных агентов, ингибирующий эффект гормонов оценивали по их влиянию на активность АЦ, предварительно стимулированную форсколином (10"5 М).

Определение ГТФ-связывающей способности G-белков. ГТФ-связывающую способность определяли по методу (Mclntire et al., 2001) с модификациями (Shpakov et al., 2010) в реакционной смеси, которая содержала 50 мМ Трис-HCl буфер (рН 8.0), 1 мМ ЭДТА, 50 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитола, 1 мкМ GppNHp, 0.5-1 мкКи [8-3H]GppNHp. Реакцию начинали внесением в пробу мембранной фракции (50-80 ми-белка). Общий объем пробы составлял 50 мкл. После инкубации (45 мин, 37 °С) реакцию останавливали добавлением 100 мкл 0.1 %-ного раствора Lubrol-PX в 20 мМ фосфатном буфере (рН 8.0). Пробы фильтровали через нитроцеллюлозные фильтры (тип НА, 0.45 мкм, «Millipore», США), фильтры дважды промывали 4 мл 20 мМ фосфатного буфера (рН 8.0), помещали в виалы со сцинтилляционной смесью, содержащей 0.4 % 2,5-дифенилоксазола и 0.02 % 1-4бис2-5-фенилоксазолил бензол а. Радиоактивность измеряли на счетчике 1209/1215 Rackbeta («LKB», Швеция). Специфическое ГТФ-

связывание определяли как разность между связыванием [8-3H]GppNHp в пробе в отсутствие ГТФ и таковым в присутствии 10 мМ ГТФ.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили в программе «Microsoft Office Excel 2007» с помощью надстроек «Attestat 12.5» и «Daniel's XL Toolbox 6.52». Все данные представлены в виде M±SD (как среднее + стандартное отклонение). Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для сравнения двух зависимых/независимых выборок с нормальным распределением использовали парный/двухвыборочный t-критерий Стьюдента, для сравнения трех и более групп -дисперсионный анализ: вводили поправку Бонферрони. Данные, не удовлетворяющие критериям нормального распределения и не прошедшие тест на равенство дисперсий, обрабатывали с применением непараметрических методов: для сравнения двух независимых групп использовали U-критерий Манна-Уитни, для сравнения зависимых выборок - критерий Уилкоксона, для сравнения трех и более групп тест - Крускалла-Уоллиса с последующим попарным сравнением с применением критерия Данна. Статистически значимыми считались отличия при уровне значимости р <0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Характеристика моделей сахарного диабета 1-го и 2-го типов

У крыс с краткосрочной моделью острого СД1, вызванной однократной обработкой высокой дозой СТЗ, уже через 10 суток наблюдали достоверное снижение массы тела, отчетливо выраженную гипергликемию и инсулиновый дефицит. Через 30 суток после инъекции СТЗ в группе оДзо масса тела составила 257 ± 17 г, концентрация глюкозы и инсулина 27.5± 4.1 мМ и 0.1 ± 0.1 нг/мл, и эти значения достоверно отличались от таковых в контроле (334 ± 20 г, 4.7 ± 0.7 мМ и 2.0 ± 0.2 нг/мл, соответственно, /><0.05). Следует отметить, что вследствие сильно выраженной гипергликемии часть животных из диабетической группы погибли уже в первые дни эксперимента. Таким образом, острый СД1 характеризуется абсолютным дефицитом инсулина, сильно выраженной гипергликемией, что приводит к сильной интоксикации и окислительному стрессу и сопровождается высокой смертностью животных.

Мягкий СД1 вызывали последовательными инъекциями средних доз СТЗ (30-40 мг/кг). У крыс с мягким СД1 продолжительностью 30 суток изменения были выражены намного слабее, чем при 30-ти суточном остром СД1 (табл. 1). При увеличении продолжительности мягкого СД1 до 150 и 210 суток снижение массы тела становилось более выраженным, чем через 30 суток развития заболевания, но концентрация глюкозы в среднем не превышала 17 мМ. Концентрация инсулина в крови крыс с мягким СД1 снижалась до 0.3 нг/мл, но этой концентрации гормона, согласно нашим данным, достаточно для частичного поддержания глюкозного гомеостаза.

и

Таблица 1. Масса тела, уровень глюкозы и инсулина в крови крыс с мягким СД1 в сравнении с соответствующим контролем (Л/ ± Ж)

Группа крыс Масса тела, г Глюкоза, мМ Инсулин, нг/мл

Мягкий СД1, через 30 суток после первой обработки СТЗ

мКЗО (п=6) 351 ±15 4.3 ±0.1 1.82 ±0.27

мДЗО (п=6) 316 ± 19 17.1+2.4* 0.30 + 0.16*

Мягкий СД1, через 150 суток после первой обработки СТЗ

мК150 (п=8) 379 ± 16 5.1 +0.2 N0

мД150 (п=8) 315±19* 15.2 + 3.7* N0

Мягкий СД1, через 210 суток после первой обработки СТЗ

мК210 (п=8) 412±27 4.9±0.5 2.19 + 0.19

мД210 (п=8) 354±32* 16.7±5.0* 0.33+0.14*

* — различия между мягким СД1 и контролем одного возраста статистически

достоверны при р<0.05. N0 - концентрацию инсулина не определяли.

Неонатальную модель СД2 вызывали инъекцией СТЗ (80 мг/кг) пятидневным крысятам, исследуя в дальнейшем животных с продолжительностью заболевания 3, 8 и 18 месяцев. У крыс с СД2 наблюдали повышение массы тела, умеренную гипергликемию и нормоинсулинемию (табл. 2). На всех сроках развития СД2, начиная с трех месяцев, отмечали нарушенную толерантность к глюкозе, которую выявляли с помощью теста с глюкозной нагрузкой (в качестве примера даны результаты теста у 8-ми месячных крыс) (рис. 1). Так через 2 ч после в/б введения глюкозы (2 г/кг) ее уровень в группах нДЗ, нД8 и нД18 составил 10.7+1.5 мМ, 11.6+1.9 мМ и 10.5+1.9 мМ, что достоверно выше, чем у соответствующего контроля. Животные, у которых не было нарушений толерантности к глюкозе, исключались из эксперимента. Совокупность полученных данных указывает на то, что, начиная с трехмесячного возраста у крыс, обработанных в раннем возрасте СТЗ, развиваются признаки, характерные для СД2.

Таблица 2. Масса тела, уровень глюкозы и инсулина в крови крыс разного возраста с неонатальной моделью СД2 в сравнении с соответствующими контролями (М +50)

Показатели 3 месяца (п=8) месяцев (п=10) 18 месяцев(п=7)

Контрольные крысы

Вес тела, г 206+17 266±15 326±17

Глюкоза, мМ 4.4±0.4 4.7±0.5 4.4+0.4

Инсулин, нг/мл N0 N0 1.8+0.3

Крысы с СД2

Вес тела, г 214+17* 338+25* 398+22*

Глюкоза, мМ 5.2±0.5 6.9+0.7* 6.5+0.6*

Инсулин, нг/мл N0 N0 2.1+0.4

* - различия между диабетическими и контро статистически достоверны при р<0.05. N0 - чьными крысами сходного возраста концентрацию не определяли

Рис. 1. Изменение

--- нК8 концентрации глюкозы в

20- ---- нД8 группе нД8 и в

2 5 сс со * ★ соответствующей группе

15- / Т * * контрольных крыс в течение 120 мин после глюкозной

10- ¡Ai^ нагрузки.

2 * *// ** - различия между группами

с; [_ 5- 4 нК8 и нД8 достоверны при р<0.01.

0 30 60 90 120

Время, МИН

2. Нарушения в гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной оси у крыс с сахарным диабетом 1-го типа

Показано, что у крыс с острым СД1 были значительно снижены уровни тиреоидных гормонов (табл. 3). Уровень ТТГ также снижался, хотя и статистически незначимо. Полученные данные указывают на то, что нарушения в ГГТ оси наблюдаются как на уровне секреции ТТГ, так и на уровне ЩЖ. У больных СД1 уровень ТТГ, как правило, близок к норме или повышен, а снижение уровня тироксина менее выраженное, что по показателям тиреоидной системы отличает острый СД1 от соответствующего заболевания человека.

У крыс с 30-ти суточным мягким СД1 снижался уровень fT4 (на 32 %), но концентрации tT4, tT3 и ТТГ существенно не менялись (табл. 3). При продолжительности мягкого СД1 150 и 210 суток концентрации тиреоидных гормонов достоверно снижались, а уровень ТТГ был повышен - у крыс с 210-ти суточным мягким СД1 на 119 % в сравнении с контролем (табл. 3). Снижение уровня тиреоидных гормонов при повышении уровня ТТГ указывает на развитие у крыс с мягким СД1 гипотиреоидного состояния, сходного с таковым у человека.

Мы предположили, что одной из причин снижения уровня тиреоидных гормонов и повышения уровня ТТГ при СД1 является ослабление чувствительности ЩЖ к ТТГ. Для проверки этого предположения изучали ответ ЩЖ диабетических крыс на обработку тиролиберином, а также функциональную активность АЦСС, чувствительной к ТТГ и другим гормонам, в тканях ЩЖ диабетических животных.

Таблица 3. Содержание тиреоидных гормонов и ТТГ в крови крыс с острым СД1 (30 суток) и мягким СД1 различной продолжительности в сравнении с соответствующими контрольными животными (Л/±">О)

Группа крыс fT4, пМ tT4, нМ tT3, нМ ТТГ, мкЕд/мл

Острый СД1 (30 суток)

оКЗО (п=8) 21.4 + 1.8 76.1 +3.5 2.43 ±0.25 . 0.42 ± 0.22

оДЗО (п=8) 11.9+2.5** 58.7 ± 4.9* 1.52 ±0.24* 0.29 ± 0.20

Мягкий СД1, 30 суток

мКЗО (п=6) 24.2 + 1.2 79.3 + 1.6 2.16 + 0.25 0.38 ±0.19

мДЗО (п=6) 16.4 ±2.8* 75.6 + 4.2 1.94 + 0.18 0.43 ± 0.23

Мягкий» СД1,150 суток

мК150 (п=8) 20.7 ± 1.3 71.9 + 2.4 2.08 ±0.11 ND

мД150 (п=8) 13.8 ± 1.4** 60.8 ± 4.5* 1.69 ±0.16* ND

Мягкий СД1, 210 суток

мК210 (п=8) 23.0 ±1.6 74.9 ±3.1 2.24 ±0.15 0.31 ±0.16

мД210 (п=8) 16.0 ± 1.7** 58.8 ±4.4** 1.57 ±0.13** 0.68 ± 0.24*

* ** _ различия между диабетическими и соответствующими им контрольными

крысами достоверны при р<0.05 и 0.005, соответственно.

3. Ответ щитовидной железы на обработку тиролиберином у крыс с острым и мягким СД1

Введение тиролиберина (интраназально, в дозе 100 мкг/крысу), рилизинг-фактора ТТГ, приводило к повышению уровня тиреоидных гормонов и ТТГ как у диабетических, так и у контрольных крыс, но различия в эффектах были значительными (табл. 4). У животных с острым СД1 наблюдали прирост концентрации tT4, fT4 и tT3 на 21.1 нМ, 6.5 пМ и 0.70 нМ, в то время как в контроле прирост составил 27.6 нМ, 10.7 пМ и 1.27 нМ, что на 24, 39 и 45 % выше, чем в группе оДЗО. Уровень ТТГ у диабетических крыс повысился на 1.72 мкЕд/мл, что на 36 % ниже, чем в контроле (табл. 4). Эти данные указывают на снижение ответа гипофиза на тиролиберин у крыс с острым СД1 и на снижение уровня тиреоидных гормонов, которое может быть вызвано ослаблением секреции тиротрофами гипофиза ТТГ и нарушением синтеза тиреоидных гормонов в ЩЖ.

При изучении крыс с мягким СД1 (210 суток) ответ ГГТ оси на обработку тиролиберином также был снижен (табл. 4). Прирост концентрации tT4 и fT4 при мягком СД1 составил 56 и 44% от такового в контроле, в то время как прирост концентрации tT3 менялся в незначительной степени, что может указывать на компенсаторное повышение синтеза и секреции Т3 в ЩЖ и экстратиреоидных тканях. Не было выявлено заметных различий в приросте концентрации ТТГ, что свидетельствует о сохранении реактивности гипофиза к тиролиберину и способности тиротрофов секретировать ТТГ. Таким образом, в условиях пролонгированного мягкого СД1 ослабляются функции ЩЖ, ответственной за синтез и секрецию тироксина, в то время как чувствительность гипофиза к тиролиберину и конверсия тироксина в Т3 сохраняются.

Таблица 4. Влияние обработки крыс с острым и мягким СД1 тиролиберином на содержание у них тиреоидных гормонов и ТТГ в сравнении с соответствующими группами контрольных животных (М±БО)

Группа крыс ГГ4, пМ Я4, нМ ЯЗ. нМ ТТГ, мкЕд/мл

Модель острого СД1, до обработки тиролиберином

оКЗО (п=6) 21.4 ± 1.9 74.9 ± 3.2 2.40 ± 0.07 0.42 + 0.18

оДЗО (п=6) 11.9 + 3.0 60.6 + 5.4 1.79 + 0.17 0.31 ±0.15

Модель острого СД1, через 2 ч после обработки тиролиберином

оКЗО (п=6) 32.1+3.3* 102.5 + 9.4* 3.67 + 0.28* 3.10 + 0.70*

оДЗО (п=6) 18.4 + 2.8* 81.7 ± 1.8* 2.49 + 0.25* 2.03 + 0.69*

Модель мягкого СД1, до обработки тиролиберином

мК210 (п=5) 23.4±1.3 75.5±2.9 2.23Ю.14 0.33±0.07

мД210 (п=5) 15.8±0.8 58.1±4.9 1.58М.15 0.80+0.12

Модель мягкого СД1, через 2 ч после обработки тиролиберином

мК210 (п=5) 35.8±3.1* 103.1±6.2* 3.52Ю.28* 1.14±0.12*

мД210 (п=5) 21.2+2.0* 73.5±3.5* 2.98±0.25* 1.53±0.23*

* - различия между уровнем гормонов у крыс одной группы до и после обработки

тиролиберином статистически достоверны при р<0.05.

4. Функциональное состояние аденилатциклазной сигнальной системы в щитовидной железе крыс с острым и мягким СД1

Для характеристики функционального состояния АЦСС во фракциях плазматических мембран, выделенных из ЩЖ крыс с острым и мягким СД1, изучали базальную активность АЦ и ее стимуляцию вррМНр, негидролизуемым аналогом ГТФ, активатором гетеротримерных О-белков, а также форсколином, действующим на каталитический сайт АЦ. Назальная и стимулированная форсколином активность АЦ заметно не менялись, исключая повышение (на 21 %) базальной активности фермента у крыс с 210-ти суточным мягким СД1, что указывает на сохранение каталитических потенций АЦ при СД1. В то же время стимулирующий эффект ОррИНр на АЦ снижался почти в два раза, что свидетельствует об ослаблении функций С5-белков в ЩЖ в условиях инсулиновой недостаточности и гипергликемии, характерных для СД1.

Для исследования гормональной чувствительности АЦ изучали ТТГ, основной регулятор гормонпродуцирующей функции ЩЖ, РАСАР-38, контролирующий рост и дифференцировку клеток ЩЖ, и р-агонист изопротеренол, ответственный за микроциркуляцию крови в ЩЖ. В тканях ЩЖ контрольных крыс различного возраста ТТГ повышал активность АЦ на 239-311 %. В ЩЖ диабетических крыс этот эффект был снижен, в наибольшей степени при остром СД1. Так у крыс с острым СД1 прирост активности АЦ, вызванный ТТГ, снижался на 46 %, у крыс с 30-ти и 210-ти суточным мягким СД1 - на 18 и 34 % (рис. 2). Впервые выявленное нами снижение АЦ эффекта ТТГ в ЩЖ крыс с СД1 положительно коррелирует со снижением у них уровня тиреоидных гормонов. Стимулирующий АЦ эффект РАСАР-38 снижался в ЩЖ крыс с 210-ти суточным мягким СД1 (на 42 %), но слабо менялся при 30-ти суточном СД1 (рис. 2). Это указывает на то, что только длительная гипергликемия и инсулиновый дефицит существенно влияют на чувствительность АЦСС к РАСАР-38. АЦ эффект

изопротеренола снижался только в ЩЖ крыс с острым СД1 (рис. 2), что связано с высокой чувствительностью адренергической сигнальной системы к сильно выраженной гипергликемии (уровень глюкозы выше 25 мМ.

Таким образом, в ЩЖ крыс с острым и мягким СД1 изменена чувствительность АЦ к ТТГ и другим гормонам, причем у крыс с острым СД1 в значительной степени ослаблялись стимулирующие АЦ эффекты ТТГ и изопротеренола, у крыс с пролонгированным мягким СД1 - эффекты ТТГ и РАСАР-38, в то время как у крыс с 30-ти суточным мягким СД) изменения гормональной чувствительности АЦ были выражены слабо. Сделан вывод о том, что одной из ключевых причин резистентности ЩЖ к регуляторному влиянию ТТГ при СД] является ослабление вызываемой ТТГ стимуляции АЦ.

— оКЗО

С13 одзо ШЗмКзо ШЗмДЗО Г"~1 МК210 МД210

Рис. 2. Стимулирующие эффекты гормонов на активность АЦ в мембранах, выделенных из ЩЖ диабетических и контрольных крыс.

(А) - ТТГ, 108 М, (Б) -РАСАР-38, 10"6 М, (В) -изопротеренол, 10"5 М. Данные представлены как М±£0. * - различия между диабетическими и

соответствующими им

контрольными группами статистически достоверны при р<0.05.

5. Функциональное состояние аденилатциклазной сигнальной системы в щитовидной железе крыс с неонатальной моделью СД2

Далее изучали функциональное состояние АЦСС в ЩЖ у крыс с неонатальной моделью СД2, имеющих различную продолжительность заболевания (от 3 до 18 месяцев), в сравнении с контрольными животными того же возраста. У крыс с СД2 с увеличением возраста базальная активность АЦ в ЩЖ повышалась, и у 8-ми и 18-ти месячных животных превосходила таковую у контрольных крыс того же возраста Стимулирующий АЦ эффект ОррМНр (105 М) в ЩЖ крыс с СД2 снижался уже на ранних сроках заболевания, в то время как у контрольных животных он снижался только в возрасте 18 месяцев. Полученные данные указывают на влияние СД2 и возраста крыс на активность 0.,-белков в ЩЖ крыс и на их сопряжение с ферментом АЦ. Стимулирующие АЦ эффекты форсколина (105 М), в отличие от таковых СррГЧНр, во всех группах менялись слабо, что свидетельствует о сохранении активности каталитического компонента АЦСС в условиях СД и при повышении возраста животных. При изучении гормональной чувствительности АЦ показано, что стимулирующий АЦ эффект ТТГ был снижен во всех группах животных с СД2, а в контрольной группе ослаблялся только у 18-ти месячных крыс.

6. Влияние обработки интраназально вводимым инсулином на массу тела и уровень глюкозы у крыс с острой и пролонгированной моделями СД1

Для изучения влияния ИИ на метаболические показатели и статус ЩЖ у крыс с острым СД1 использовали три дозы гормона (0.3, 0.6 и 1.5 МЕ/крысу), который вводили ежедневно в течение 28 суток, начиная с 3-го дня после обработки СТЗ. Перед началом обработки ИИ у крыс измеряли уровень глюкозы и для дальнейших экспериментов отбирали животных с уровнем глюкозы выше 25 мМ. Были сформированы 3 диабетические (оДИо.з, оДИо.в и 0ДИ1.5) и соответствующие им 3 контрольные группы (оКИо.э, оКИо.б и оКИ[ 5). Обработка ИИ диабетических крыс существенно не влияла на массу тела и уровень глюкозы, за исключением дозы 0.6 МЕ/крысу, при которой наблюдали достоверное снижение уровня глюкозы на 32% в сравнении с группой оД (р< 0.05).

Крыс с мягким СД1 обрабатывали ИИ в дозе 0.5 МЕ/крысу, который вводили ежедневно в течение 75 или 135 суток (в зависимости от продолжительности эксперимента), начиная с 75-го дня после первой обработки СТЗ. Были сформированы 2 диабетические (мДИ150 и мДИ210) и 2 контрольные группы (мКИ150 и мКИ210). Обработка ИИ приводила к небольшому повышению массы тела и достоверному снижению уровня глюкозы - на 43 % в группе мДИ150 и на 62 % в группе мДИ210 (табл. 5).

Таблица 5. Влияние длительной обработки ИИ на массу тела и уровень глюкозы у крыс с пролонгированным мягким СД1 продолжительностью 150 и 210 суток в сравнении с контрольными животными (M+SD)

Группа крыс Масса тела, г Уровень глюкозы в крови, мМ

75 суток обработки ИИ (150 суток после первой СТЗ обработки)

мК150 (п=8) 379 ± 16 5.1 + 0.2

мКИ150 (п=6) 398 ±11 5.0 + 0.2

мД150 (п=8) 315±19* 15.2 + 3.7*

МДИ150 (п=6) 339 ± 23 11.0+1.8*

135 суток обработки ИИ (210 суток после первой СТЗ обработки)

мК210 (п=8) 412±27 4.9+0.5

мКИ210 (п=6) 441 + 18 5.1+0.2

мД210 (п=8) 354+32* 16.7±5.0*

мДИ210 (п=6) 374±15* 10.112.3*

* - различия между соответствующими по возрасту и длительности обработки ИИ

диабетическими и контрольными группами являются статистически значимыми при

р<0.05.

7. Влияние обработки ИИ на функциональное состояние щитовидной железы у крыс с острым и мягким СД1

Обработка крыс с острым СД1 с помощью ИИ в дозе 0.6 МЕ/крысу частично восстанавливала уровни тиреоидных гормонов, сниженные при СД1. На 30-ый день уровни и Яз в группе оДИо.6 повышались на 38, 17 и 26 % в сравнении с группой

оД (табл. 6). Обработка ИИ в дозе 1.5 МЕ/крысу в течение 2 недель предотвращала снижение 1Т4 и вызывала повышение уровней ГГ4 и Я3 на 15 и 28 % в сравнении с группой оД. Однако на 30-ый день восстанавливающее действие ИИ в этой дозе было ослаблено. ИИ в дозе 0.3 МЕ/крысу заметно не влиял на уровень тиреоидных гормонов у

крыс с острым СД1. На 15-ый день ИИ в дозах 0.6 и 1.5 МЕ/крысу повышал концентрацию ТТГ на 58 и 67 %, на 30-ый день - на 48 и 74 % в сравнении с диабетической группой, не получавшей ИИ. В группе оДИ03 уровень ТТГ в плазме крови животных практически не менялся и был сходным с таковым в группе оД (табл .7).

Таблица 6. Влияние обработки крыс с острым 30-тисуточным СД1 с помощью ИИ (28 суток) в различных суточных дозах (0.3, 0.6 и 1.5 МЕ/крысу) на уровень тиреоидных гормонов (М±5О)

Группа т, нМ ГГ4, нМ ГГЗ, нМ

До После До После До После

оК (п=8) 20.2+1.4 21.4+1.8 70.9+3.4 74.9+4.3 2.23+0.23 2.43+0.25

оКИо з (п=6) 20.9+1.9 25.8+3.1& 69.6+3.9 84.3+3.9& 2.27+0.31 2.73+0.23

оКИо.б (п=6) 21.5+1.4 24.3+1.8& 69.1+3.7 86.3+3.5& 2.13+0.27 2.43+0.34

оКИ, 5 (п=6) 19.8+1.5 19.2+1.5 68.0+3.6 72.1+3.6 2.20+0.25 2.23+0.23

оД (п=8) 21.2+1.6 11.9+2.5* 72.3+4.2 58.2+4.6* 2.26+0.26 1.52±0.24*

оДИо з (п=6) 19.5+1.7 12.5±1.0 68.4+4.2 63.6+3,0& 2.17+0.21 1.77+0.20

оДИо.б (п=б) 19.7+2.0 16.4+3.0& 68.7+5.1 71.1±5.6& 2.22±0.19 2.05+0.30&

оДИ,.5 (п=6) 20.7+0.9 14.0+1.5 69.6+2.1 62.7+3.1 2.27+0.31 2.08+0.19&

* - статистически значимые различия между группами оК и оД, и соответствующими группами оКИ и оДИ при р<0.05; & - между группой оК и группами оКИ0}, оКИоб, оКИ] ¡; между группой оД и группами оДИ03, оДИ06, оДИ15 при р<0.05.

Таблица 7. Влияние длительной обработки крыс с острым СД1 с помощью ИИ в дозах 0.3, 0.6 и 1.5 МЕ/крысу на уровень ТТГ (М+БР)_

Группа животных Концентрация ТТГ, мкМЕ/мл

До начала эксперимента, 1-й день 15-ый день 30-ый день

оК (п=8) 0.39 + 0.15 0.40 + 0.12 0.42 + 0.22

оКИ0 з (и=6) 0.43 + 0.18 0.78 + 0.32& 0.67 + 0.29

оКИ0 6 (п=6) 0.37 + 0.19 0.72 + 0.33 0.58 + 0.36

оКИ, 5 01=6) 0.47 ± 0.25 0.49 ± 0.33 0.34 + 0.17

оД (и=8) 0.44 + 0.22 0.35 + 0.15 0.29 + 0.20

оДИо.з (п=6) 0.37 + 0.12 0.47 + 0.16 0.35+0.17

оДИов (п=6) 0.45 + 0.21 0.57 ±0.18& 0.51+0.28

оДИ15 (и=6) 0.41 ± 0.09 0.60 + 0.26& 0.52 + 0.24

А - статистически значимые различия между группой оК и группами оКИ0.з, оКИ0 6, 0КИ15; между группой оД и группами оДИ0.з, оДИ0 6, оДИ,.5 при р<0.05.

Обработка ИИ в суточной дозе 0.5 ЕД/крысу в течение 75 или 135 суток крыс с мягким СД1 приводила к частичному восстановлению уровня тиреоидных гормонов, хотя различия между группами мДИ150 и мД150, мДИ210 и мД210 были достоверными только в случае ГГ4, уровень которого повышался на 17-20 % (табл. 8). Уровень ТТГ при обработке ИИ менялся в значительной степени. Так в сравнении с необработанными ИИ диабетическими крысами, в группах мДИ150 и мДИ210 уровень ТТГ повышался в 1.5 раза, а в сравнении с необработанными контрольными крысами - в 2-3 раза (табл. 8).

Показано также, что 135-ти дневная обработка контрольных крыс с помощью ИИ повышала уровень ТТГ на 123 %.

Таблица 8. Влияние длительной обработки крыс с мягким СД1 с помощью ИИ в дозе 0.5 МЕ/крысу на уровень тиреоидных гормонов и ТТГ (М+5£>)

Группа крыс fT4, пМ tT4, нМ tT3, нМ ТТГ, мкЕД/мл

75 суток обработки ИИ (150 суток после первой СТЗ обработки)

мК150 (и=8) 20.7+1.3 71.9 ±2.4 2.08 ±0.11 0.36 ±0.15

МКИ150 (п=б) 18.7 ±2.5 68.8 ± 2.7 2.13 ±0.15 0.50 ± 0.24

мД150 (п=8) 13.8 ± 1.4** 60.8 ±4.5** 1.69 ±0.16* 0.52 ± 0.30

мДИ150 (/1=6) 16.1 ±2.1**,& 62.7 ± 3.8 1.87 ±0.12 0.80 ±0.35

135 суток обработки ИИ (210 суток после первой СТЗ обработки)

мК210(л=8) 23.0 ± 1.6 74.9 ±3.1 2.24 ±0.15 0.35 ±0.13

мКИ210 (л=6) 20.8 ± 1.5 69.5 ± 2.7 1.75 ± 0.25& 0.69 ± 0.28&

мД210 (п=8) 16.8 ± 1.7** 58.8 ±4.4** 1.57 ±0.13** 0.71 ±0.23*

мДИ210 (л=6) 20.1 ±3.2& 68.0 ± 4.8 1.74 ±0.14 1.04 ±0.29

*, ** - статистически значимые различия между соответствующими группами мК и мД, мКИ и мДИ, при р<0.05 и р<0.01, соответственно, &- статистически значимые

различия между группами мК и мКИ или мД и мДИ при р<0.05.

8. Снижение уровня тестостерона и ослабление чувствительности к люлиберину гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси у крыс с сахарным диабетом 1-го и 2-го типов

Для идентификации нарушений в ГГГ оси у самцов крыс с различными моделями СД1 определяли содержание уровня тестостерона (Т) в крови диабетических животных, а также исследовали ответ ГГГ оси на люлиберин, рилизинг-фактор ЛГ.

У контрольных крыс наблюдали суточную динамику изменений концентрации Т, с максимумом уровня гормона в утренние часы и его снижением к 18.00. При остром СД1 наблюдали нарушение суточной динамики изменений уровня Т и значительное снижение концентрации гормона, причем по результатам исследования диабетические крысы были условно разделены на две группы. В первой (оДЗО/1, л=3) наблюдали снижение продукции Т при сохранении утреннего пика, во второй (оДЗО/2, п=5) -полное подавление продукции гормона и отсутствие утреннего пика (рис. 3). Значение АиС( 11.00-16.00) для концентрации Т у первой и второй групп составило 44+10 и 20+1, что достоверно меньше, чем в контроле (84+13). У крыс с мягким СД1 (п=8) суточная динамика сохранялась только у одного животного из 8. В группе мД210 отмечали сильно выраженное снижение уровня Т: 6.1+4.4 нМ в сравнении с 28.7+10.9 нМ в группе мК210 (р<0.01). Эти данные указывают на то, что длительное течение СД1, даже в условиях умеренной гипергликемии и относительной инсулиновой недостаточности, характерных для мягкого СД1, приводит к более выраженным нарушениям в функционировании ГГГ оси, чем при краткосрочном остром СД1.

Обработка контрольных крыс люлиберином в дозе 1 пг/крысу (4 введения по 0.25 пг в 10.30, 12.00, 13.30 и 15.00) приводила к значительному повышению уровня Т, в то время как у крыс с острым СД1 стимулирующее влияние люлиберина было ослаблено. При этом в группе оД30/1 наблюдали ослабление ответа на люлиберин с постепенным

снижением его эффекта в течение 5 ч, в то время как в группе оДЗО/2 первоначальный пик отсутствовал и только к 16.00 наблюдали небольшое повышение уровня Т (рис. 3).

У крыс с 8-ми месячной неонатальной моделью СД2 (нД8, /1=10) динамика изменений уровня Т была сходной с таковой в контроле, но утренний пик (12.00) был выражен слабо, а концентрация гормона с 14.00 до 18.00 практически не менялась. Значение АиС( 10.00-18.00) для концентрации Т у крыс с СД2 составило 106+27, что на 53 % меньше, чем в контроле - 224±33. У диабетических животных прирост концентрации Т через 30 мин после первого введения люлиберина составил 8.5 нМ, что существенно ниже такового в контроле (27.6 нМ). В то же время, в отличие от контрольных крыс, через 2 и 3.5 ч после начала обработки люлиберином прирост концентрации Т у крыс с СД2 сохранялся на том же уровне, что и через 30 мин (рис. 4). Таким образом, при неонатальном СД2, несмотря на снижение максимального ответа ГГГ оси к люлиберину, ее чувствительность к этому рилизинг-фактору сохраняется, что должно учитываться при лечении андрогенной недостаточности в условиях СД2 люлиберином и его аналогами.

[Г13оК30 1оКЗО+Л I I оДЗО/1 I I оДЗО/1 +Л оДЗО/2 ОД30/2+Л

Рис. 3. Стимулирующее влияние обработки интраназально

вводимым люлиберином на уровень тестостерона у крыс с острым СД1 в сравнении с контрольной группой животных. * - различия в уровне Т между группой оКЗО и группой оДЗО/1 или оДЗО/2 достоверны при р<0.05, ** - между оД30/1 и оДЗО/2; оДЗО/1 +Л и оДЗО/2+Л; & - между группой оКЗО+Л и группой оДЗО/1 +// или оДЗО/2+Л, при р<0.05, # - между крысами одной группы до и после обработки люлиберином, при р<0.05.

11.00

12.30

14.00 16.00

Рис. 4. Влияние интраназально вводмимого люлиберина на уровень тестостерона у крыс с 8-ми месячной неонатальной моделью СД2 в сравнении с контрольными животными.

* ** - различия в уровне Т между группами нК8 и нД8 достоверны при р<0.05 и р<0.01, # - между группами нК8 и нК8+Л и между группами нД8 и нД8+Л, р<0.05, & - между группами нК8+Л и нД8+Л, р<0.05.

9. Функциональная активность аденилатциклазной сигнальной системы в семенниках крыс с СД1 и влияние обработки интраназальным инсулином

В семенниках крыс с 30-ти суточным острым СД1 снижались базальная активность АЦ (на 44 %) и ее стимуляция форсколином и ОррМНр. Стимулирующие АЦ эффекты ХГЧ (10~8 М), структурного и функционального гомолога ЛГ, и пептидного гормона РАСАР-38 (10~7 М), регулирующего дифференцировку и регенерацию тестикулярных клеток, снижались на 62 и 33 %, в то время как ингибирующий АЦ эффект соматостатина (10"6 М), регулирующего ростовые процессы, снижался на 57 %. Ослаблялась стимуляция гормонами ГТФ-связывающей способности Б-белков, в случае соматостатина - на 68 %. Эти данные свидетельств уют об ослаблении активности сопрягающего и каталитического компонентов АЦСС, а также об ослаблении чувствительности АЦ к гормонам в семенниках крыс с острым СД1.

В семенниках крыс с 210-ти суточным мягким СД1 базальная, стимулированная Орр1ЧНр, форсколином и гормональными агентами (ХГЧ, РАСАР-38) активности АЦ были снижены в той же степени, что и у крыс с острым СД1. Ингибирующий АЦ эффект соматостатина при этом был почти полностью подавлен.

135-ти суточная обработка ИИ (0.5 МЕ/крысу) крыс с 210-ти суточным мягким СД1 частично восстанавливала АЦ эффект ХГЧ, но слабо влияла на базальную и стимулированную другими изученными гормонами активность АЦ. Так в тестикулярных мембранах крыс группы мДИ210 прирост активности АЦ, вызванный ХГЧ, составил 67±2 пмоль цАМФ/мин на мг белка, в то время как в группе мД210 он составил 40±3 пмоль цАМФ/мин на мг белка (р<0.001). Эти данные свидетельствует о повышении чувствительности семенников крыс с мягким СД1 к регуляторному влиянию гонадотропинов при их обработке ИИ.

10. Функциональная активность аденилатциклазной сигнальной системы в семенниках крыс с СД2

В группах нД8 и нД18 базальная активность АЦ в семенниках составила 70 и 45% от таковой в группе нДЗ. У 18-ти месячных самцов контрольной группы базальная активность АЦ была снижена в сравнении с группами нКЗ и нК8. При сравнении базальной активности АЦ в семенниках контрольных и диабетических крыс одного и того же возраста значительные различия наблюдали только у 8-ми и 18-ти месячных животных, что, как мы полагаем, связано с отсутствием выраженных признаков заболевания у трехмесячных крыс с СД2. Стимулирующий АЦ эффект форсколина (10~5 М) был снижен в семенниках 18-ти месячных диабетических крыс в сравнении с 3-х и 8-ми месячными животными, что указывает на ослабление каталитической активности АЦ в семенниках с увеличением возраста и срока развития неонатального СД2. Сходную тенденцию отмечали и для стимулирующего АЦ эффекта вррМНр (105 М). В возрасте 8 и 18 месяцев АЦ эффекты форсколина и вррИНр у крыс с СД2 были достоверно снижены в сравнении с контрольными животными (р<0.001).

В семенниках 18-ти месячных диабетических крыс стимулирующие АЦ эффекты ХГЧ и РАСАР-38 были достоверно снижены в сравнении с таковыми в группах нДЗ и нД8. Сходные тенденции наблюдали и у контрольных животных, но различия здесь были выражено намного слабее (рис. 5). В группах нД8 и нД18 был ослаблен также ингибирующий АЦ эффект соматостатина (10 6 М), который в группе нД18 составил всего 36 % от такового в группе нК18. Совокупность полученных данных позволяет сделать вывод о том, что в семенниках крыс с длительным неонатальным СД2 нарушены как стимулирующие, так и ингибирующие АЦ сигнальные пути, что ведет к ослаблению

тестостеронпродуцирующей функции семенников, нарушению процессов роста, дифференцировки и регенерации репродуктивных клеток.

Рис. 5. Стимулирующие АЦ эффекты гормонов в семенниках крыс с СД2 в сравнении с контрольными животными

различного возраста (М± 50) Концентрация ХГЧ - 10"8 М, РАСАР-38 - 10"6 М. * - различия между группами диабетических и контрольных крыс одного возраста достоверны при р<0.05; # - между группами нКЗ и нК8 и между группами нКЗ и нК18, р<0.05; ## -между группами нК8 и нК!8, р<0.05; & - между группами нДЗ и нД8 и между группами нДЗ и нД18, р<0.05; и && - между группами нД8 и нД18, р<0.05.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что у крыс с разработанной нами пролонгированной, 7-ми месячной, моделью мягкого сахарного диабета 1-го типа (СД1), для которой характерны относительный инсулиновый дефицит и умеренная гипергликемия, снижен уровень тиреоидных гормонов, повышен уровень тиреотропного гормона (ТТГ), ослаблен функциональный ответ тиреоидной системы на обработку тиролиберином, что свидетельствует о развитии у них гипотиреоидного состояния, сходного с таковым у человека. Это отличает пролонгированную модель мягкого СД1 от изученной нами, широко используемой, краткосрочной модели острого СД1, при которой в значительной степени снижаются уровни как тиреоидных гормонов, так и ТТГ.

2. Обнаружено, что в тканях щитовидной железы крыс с острым и мягким СД1 меняется функциональная активность аденилатциклазной сигнальной системы (АЦСС) и снижается ее чувствительность к ТТГ, основному регулятору синтеза и секреции тиреоидных гормонов, что является одной из ключевых причин развития гипотиреоидного состояния в условиях диабетической патологии.

3. Показано, что длительная обработка крыс с экспериментальным СД1 с помощью интраназально вводимого инсулина (ИИ) в дозах 0.5-0.6 МЕ/крысу приводит к восстановлению у них уровня тиреоидных гормонов, функционального ответа гиполатамо-гипофизарно-тиреоидной оси на тиролиберин, а также активности гормоночувствительной АЦСС в тканях щитовидной железы. Длительная обработка ИИ (135 суток) крыс с мягким СД1, а также здоровых животных приводила к значительному повышению у них уровня ТТГ, что свидетельствует о выраженном стимулирующем влиянии инсулина мозга на продукцию ТТГ и должно учитываться при практическом применении ИИ.

4. Установлено, что у самцов крыс с экспериментальными моделями СД1 и СД2 снижается уровень тестостерона, нарушается его суточный ритм, ослабляется

функциональный ответ гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси на обработку люлиберином.

5. Показано, что в семенниках диабетических животных снижена функциональная активность АЦСС и ее чувствительность к действию гормональных и негормональных регуляторов, в том числе гонадотропина, основного регулятора продукции тестостерона, что является одной из основных причин развития андрогенной недостаточности при СД. При этом длительная, 135-ти суточная, обработка крыс с мягким СД1 с помощью ИИ (0.5 ME инсулина/крысу) приводила к частичному восстановлению у них чувствительности АЦСС семенников к стимулирующему влиянию гонадотропина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Intranasal insulin affects adenylyl cyclase system in rat tissues in neonatal diabetes / A. O. Shpakov, О. V. Chistyakova, К. V. Derkach, I. V. Moyseyuk (Bogush), V. M. Bondareva // Central European Journal of Biology. - 2012. - Vol. 7, Issue 1. - P. 3347.

2. Андрогенная недостаточность у самцов крыс с долгосрочным неонатальным стрептозотоциновым диабетом / К. В Деркач., И. В. Мойсеюк (Богуш), О. В. Чистякова, А. О. Шпаков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2013.-Т. 155, №3,-С. 315-318.

3. Функциональная активность аденилатциклазной сигнальной системы в мозге, миокарде и семенниках крыс с восьми- и 18-ти-месячным неонатальным диабетом / К. В Деркач, А. О. Шпаков, И. В. Мойсеюк (Богуш), О. В.Чистякова // Доклады Академии наук. - 2013. - Т. 448, № 5. - С. 598-601.

4. Деркач, К. В. Влияние пролонгированного стрептозотоцинового диабета на функционирование щитовидной железы у крыс / К. В. Деркач, И. В. Мойсеюк (Богуш), Шпаков А.О.// Доклады Академии наук. - 2013. - Т. 451, № 6. - С. 691.

5. Активность аденилатциклазной системы в миокарде и семенниках крыс с острой и пролонгированной стрептозотоциновыми моделями сахарного диабета / К. В. Деркач., И. В. Мойсеюк (Богуш), О. В. Чистякова, В. М. Бондарева, А. О. Шпаков // Технологии живых систем. - 2013. - Т. 10, № 9. - С. 3-13.

6. Мойсеюк (Богуш), И. В. Функциональная активность щитовидной железы у самцов крыс с острым и мягким стрептозотоциновым диабетом / И. В. Мойсеюк (Богуш), К .В.Деркач, А. О. Шпаков //Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 2014. - Т. 50, № 4. - С. 275-283.

Тезисы докладов:

1. Влияние интраназального введения инсулина на аденилитциклазную сигнальную систему в тканях крыс с неонатальной моделью сахарного диабета / И. В. Мойсеюк (Богуш), О. В. Чистякова, К. В. Деркач, В. М. Бондарева, А. О. Шпаков // Тезисы докладов и сообщений, представленных на III конференцию молодых ученых Института цитологии РАН / Цитология. - Т. 54, № 4. - С. 349.

2. Андрогенная недостаточность у самцов крыс с долгосрочным неонатальным стрептозотоциновым диабетом / А. О. Шпаков, К. В. Деркач, И. В. Мойсеюк (Богуш), О. В. Чистякова, В. М. Бондарева // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновационные

технологии в диабетологии и гематологии» / Бюллетень ФЦСКЭ им. В.А. Алмазова. - 2012. - Приложение 1, май. - С. 26.

3. Дефицит андрогенов у самцов крыс с неонаталыюй моделью сахарного диабета 2-го типа / И. В. Мойсеюк (Богуш), К. В. Деркач, О. В. Чистякова, А. О. Шпаков // Биология - наука XXI века: Материалы Международной конференции / под ред. Р.Г. Василова. - М„ 2012. -С. 591.

4. Функциональная активность щитовидной железы в условиях пролонгированного стрептозотоцинового диабета / И. В. Мойсеюк (Богуш), К. В. Деркач, О. В. Чистякова, А. О. Шпаков // Сборник статей Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» / под ред. В. П. Зинченко, А. В. Бережнова - М„ 2013. - Т. 2. - С. 467-469.

5. Функциональное состояние гипоталамо-гипофизарно-гонадной и -тиреоидной осей при экспериментальном сахарном диабете / К. В. Деркач, И. В. Мойсеюк (Богуш), О. В. Чистякова, В. М. Бондарева, А. О. Шпаков // XXII съезд Физиологического общества имени И. П. Павлова: Тезисы докладов. - Волгоград, 2013.-С. 146-147.

6. Деркач, К. В. Функциональный статус щитовидной железы у крыс с пролонгированной моделью стрептозотоцинового диабета / К. В. Деркач, И. В. Мойсеюк (Богуш), А. О. Шпаков // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновационные технологии в нейроэндокринологии, нейронауках и гематологии» / Бюллетень ФЦСКЭ им. В.А. Алмазова. - 2013. - Приложение 1, май. - С. 11.

7. Ослабление регуляторных эффектов гормональных и негормональных агентов на аденилатциклазу у самцов крыс с одномесячным стрептозотоциновым диабетом / К. В. Деркач, О. В. Чистякова, И. В. Мойсеюк (Богуш), В. М. Бондарева, А. О. Шпаков // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновационные технологии в нейроэндокринологии, нейронауках и гематологии» / Бюллетень ФЦСКЭ им. В.А. Алмазова. - 2013. -Приложение 1, май. - С. 11-12.

8. Снижение функциональной активности гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси при длительном неонатальном сахарном диабете 2-го типа / К. В. Деркач, И. В. Мойсеюк (Богуш), О. В. Чистякова, А. О. Шпаков // Материалы III Российского конгресса «Метаболический синдром: междисциплинарные проблемы» / Медицинский академический журнал. - 2013. - Специальный выпуск. - С. 64-65.

9. Деркач, К. В. Сравнительное изучение тиреоидной системы у крыс с острым и мягким стрептозотоциновым диабетом / К. В. Деркач, И. В. Мойсеюк (Богуш), А. О. Шпаков // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Трансляционные исследования в инновационном развитии здравоохранения» / Бюллетень ФЦСКЭ им. В.А. Алмазова. - 2014. -Приложение 1, май. - С. 13.

10. Функциональная активность щитовидной железы при остром и мягком сахарном диабете у самцов крыс. И. В. Мойсеюк (Богуш), К. В. Деркач, О. В. Чистякова, А. О. Шпаков // Научные труды IV съезда физиологов СНГ / под ред. А. И. Григорьева, Ю. В. Наточина, Р. И. Сепиашвили - М., 2014. - С. 135.

Подписано в печать 15.12.2014 Формат 60x841 '/i6 Цифровая Печ. л. 1.0 Тираж 100 Заказ № 08/12 печагь

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)