Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм локализации мРНК нового гена Germes в оогенезе шпорцевой лягушки Xenopus laevis

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Механизм локализации мРНК нового гена Germes в оогенезе шпорцевой лягушки Xenopus laevis"

На травах рукописи

ПОНОМАРЕВ МАКСИМ БОРИСОВИЧ

МЕХАНИЗМ ЛОКАЛИЗАЦИИ мРНК НОВОГО ГЕНА СЕЖИЕ? В ООГЕНЕЗЕ ШПОРЦЕВОЙ ЛЯГУШКИ 1ЛЕУ1$

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г:

г • г~. "1

•«_ и Ц!

' 1 Г

МОСКВА 2006

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии развития Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Научные руководители:

доктор биологических наук

Белявский Александр Вадимович

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук доктор биологических наук

Преображенская Ольга Владимировна Васецкий Сергей Григорьевич

Ведущая организация:

Институт биологии гена РАН.

Защита диссертации состоится _2006 г. в_ч. на заседании Диссертационного

Совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан "_"_2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук

Крицын А.М.

zoo GA

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Асимметричное распределение цитоплазматических молекул РНК в клетке является одним из механизмов, обеспечивающих дифференциальную экспрессию генов. Это явление встречается во многих типах клеток от бактерий и дрожжей до растений и животных. Особое значение ему придается в биологии развития. Неравномерно распределенные РНК в ооцитах и ранних эмбрионах принимают участие в таких биологических процессах, как локальная регуляция трансляции и сборка новых функциональных белковых комплексов, формирование полярности и осей развития эмбриона, детерминация и дифференцировка различных типов клеток и тканей. Одним из классических объектов биологии развития, на котором активно изучают это явление - ооциты шпорцевой лягушки Xenopus laevis.

В процессе созревания ооцитов Xenopus некоторые РНК, до того равномерно распределенные по всей цитоплазме ооцита, перераспределяются вдоль анимально-вегетативной оси и концентрируются в разных полушариях яйца. РНК, которые сосредоточиваются в анимальном полушарии, принимают участие в формировании тканей эмбриона эктодермального происхождения (покровы и их производные, нервная система). К ним относятся Anl-4, Xlan4, х121,0ct-60, РАВР. В вегетативном полушарии яйца локализуются РНК, участвующие в индукции мезодермы и последующем формировании тканей энтодермального (гастроцель и ее производные) и мезодермального (мышцы, кровь, скелетные элементы и др.) происхождения, а также в закладке и дифференцировки первичных половых клеток (ЛПК), ответственных за передачу генетической информации следующему поколению. В эту, более многочисленную, группу входят такие РНК, как Vgl, VegT, Xpat, Xcat2, Xcat3, Xdazl, Xlsirt, Xwntl 1, DeadSoulh, Xotxl, fatvg, pTiCP.

РНК, концентрирующиеся в вегетативном полушарии ооцита, к концу оогенеза

локализуются в тонком кортикальном слое вегетативного полюса ооцита. Для достижения

вегетативного полюса РНК могут использовать один из двух описанных механизмов

локализации*. Первый из них функционирует на ранних стадиях I/II оогенеза. Локализация

РНК, использующих этот механизм, осуществляется с помощью митохондриальпого облака

(МО) - макроскопической структуры, в состав которой входят гранулярно-фибриллярный

материал, митохондрии, эндоплазматический ретикулум (ЭР), материнские РНК и белки. Этот

механизм получил название METRO (MEssage TRansport Organizer), или ранний механизм

локализации. МО является источником материала для зародышевой плазмы - детерминанты

•Далее, в автореферате и диссертации, под термином локализация РНК понимается активный процесс доставки молекул РНК в специфическую область клетюц^езхдьтате действия определенных клеточных механизмов- локальной деградации, направ; фиксации в области

локализации.

предшественников половых клеток (ППК), поэтому практически все РНК, которые используют этот механизм локализации, в последствии включаются в состав зародышевой плазмы. Второй механизм функционирует на более поздних стадиях ШЛУ оогенеза, и поэтому получил название позднего механизма локализации РЖ. Локализация РНК, использующих этот механизм, зависит от компонентов цитоскелетной сети, в частности от микротрубочек и микрофиламентов. РНК, которые используют поздний механизм локализации, играют важную роль в формировании эндодермы и индукции мезодермы.

В основе действия механизмов локализации РНК лежит взаимодействие между цис-действующими последовательностями РНК и транс-действующими белковыми факторами транспортной машины. Однако то, какие принципы заложены в основе организации цис-действующих элементов РНК, какие транс-действующие факторы их узнают, и каким образом обеспечивается специфичность этого взаимодействия, остается во многом неизвестным. Изучение вопроса, при участии каких дополнительных факторов/моторов происходит транспорт РНК и что его регулирует, является необходимым для полного понимания функционирования механизмов локализации РНК. Несмотря на продолжающиеся исследования этих механизмов, идентификация новых локализованных РНК и транс-действующих белковых факторов остается актуальной задачей.

В настоящей работе исследуется механизм локализации мРНК нового гена шпорцевой лягушки Хепорих 1аеугз на вегетативный полюс ооцита, и цис- и транс- действующие факторы, принимающие участие в регуляции транспорта транскрипта.

Цели и задачи работы.

С целью изучения механизмов локализации РНК на вегетативный полюс яйца Хепориз \aevis были поставлены следующие задачи:

1) Идентификация и клонирование кДНК нового гена, мРНК которого локализована на вегетативном полюсе ооцитов и ранних эмбрионов Хепорш 1ае\1й.

2) Исследование механизма локализации мРНК на вегетативный полюс яйца.

3) Поиск цис-действующих последовательностей, ответственных за локализацию мРНК

4) Изучение транс-действующих белковых факторов, специфично взаимодействующих с цис-последовательностями мРНК.

Научная новизна и практическая ценность.

Асимметричное распределение РНК играет значительную роль в таких важных биологических процессах, как детерминация, дифференцировка и поляризация клеток. Ооциты

Xenopus являются одной из наиболее удобных моделей для изучения подобных процессов. Во время оогенеза на вегетативном полюсе ооцита локализуются различные мРНК, которые принимают участие в формировании как соматических клеток будущего зародыша, так и клеток зародышевой линии.

В настоящей работе была получена кДНК нового гена, Germes, мРНК которого локализуется на вегетативном полюсе ооцита и связана с зародышевой плазмой на ранних стадиях эмбриогенеза. Исследован мехапизм локализации мРНК Germes на вегетативный полюс. Выявлены цис-действующие последовательности мРНК, ответственные за ее локализацию, изучены транс-действующие белковые факторы, специфически с ними взаимодействующие. При изучении локализации мРНК Germes был впервые опробован метод одновременной инъекции двух РНК, меченных различными флуоресцентными метками, который позволяет более детально изучать механизм локализации РНК, в частности, исследовать характер поведения мутантных РНК В ходе выявления компонентов белковой транспортной машины, которая задействована в локализации мРНК Germes, были выявлены предположительно новые транс-факторы, принимающие участие в раннем механизме локализации РНК.

Данные, полученные в работе, являются новыми и вносят вклад в изучение молекулярных механизмов локализации РНК на вегетативный полюс ооцита Xenopus laevis. Результаты могут быть использованы в построении общей картины формирования зародышевой плазмы, являющейся основным детерминирующим компонентом первичных половых клеток.

Апробация работы.

Результаты диссертации были представлены на 7-ой школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003 г.) и 7-ой международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии (Суздаль, 2004 г.).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 4 работы, в том числе 2 статьи в рецензируемых изданиях и 2 тезиса конференций.

Объем и структура работы.

Диссертационная работа изложена на_страницах машинописного текста (двойной

интервал) и состоит из следующих разделов- введение, обзор литературы, материалы и методы,

результаты и обсуждение, выводы, список цитируемой литературы. Диссертация содержит_

таблиц и_рисунков.

Основное содержание работы

Идентификация я клонирование кДНК нового гена, транскрипт которого локализован на вегетативном полюсе ооцитов и ранннх эмбрионов Xenopus laevis.

Для поиска новых генов, дифференциально экспрессирующихся в раннем развитии эмбрионов Xenopus laevis, в нашей лаборатории был разработан метод фингерпринтирования генной экспрессии (GEF) [Ivanova and Belyavsky, 1995] В результате применения этого метода к эмбрионам, находящимся на стадии развития 10,25 (ранняя гаструла), было идентифицировано несколько коротких кДНК-фрагментов, соответствующих неизвестным генам-кандидатам, обладающих предположительно региональной экспрессией в эмбрионе [Иванова и др., 1998]. Последующие проверки прошли несколько из этих фрагментов под номерами N4, N6, N12, N22, N37, N76. Ген, соответствующий кДНК-фрагменту N4, был ранее клонирован и исследован в нашей лаборатории [Popsueva et al., 2001].

С целью дальнейшего подтверждения специфичности локализации последовательности, соответствующие оставшимся к ДНК-фрагментам, были дополнительно проверены с помощью метода обратной транскрипции РНК - ПЦР амплификации (RT-PCR). Для этого из эксплантатов, соответствующих анимальной, дорсальной, вегетативной и вентральной областям эмбрионов, находящихся на 6-ой стадии развития, была выделена тотальная РНК, которая была использована для синтеза кДНК. Получившиеся фракции кДНК анализировали с помощью ПЦР амплификации на предмет представленности исследуемых кДНК-фрагментов в этих областях. В результате из всех анализируемых кДНК-фрагментов только N22 показал ярко выраженную локализацию РНК в вегетативной области (рис.1 А). Таким образом, по сравнению с остальными областями, вегетативная область эмбриона в значительной степени обогащена транскриптом, соответствующим этому кДНК-фрагменту.

Аналогичный анализ (RT-PCR) был проведен с фракциями к ДНК, синтезированными с тотальной РНК выделенной из целых эмбрионов стадий 2,12 и 19. Количество транскрипта, соответствующего кДНК-фрагменту N22, было максимально на ранних стадиях (стадия 2-х клеток), уменьшалось на последующих (стадия 12), и к 19-ой стадии развития практически исчезало (рис. 1Б). Полученный результат говорит о материнском происхождении транскрипта.

Результаты были получены в двух независимых сериях экспериментов и согласуются между собой. Таким образом, транскрипт, соответствующий кДНК-фрагменту N22, обладает ярко выраженной локализацией в вегетативной области яйца и имеет материнское происхождение. Этот кДНК-фрагмент был выбран для дальнейшей работы.

Рис. 1. Анализ пространственного (А) и временного (Б) распределения транскрипта, соответствующего кДНК-фрагменту N22, с помощью метода обратной транскрипции - ПЦР амплификации.

А. Анализ распределения транскрипта N22 в анимальной (Ал), дорсальной (Dr), вегетативной (Vg) и вентральной (Vn) областях зародыша. 22с, 26с и 30с - циклы ПЦР амплификации. Транскрипт преимущественно локализован в вегетативной области ранних зародышей. Б. Анализ содержания транскрипта N22 в эмбрионах по стадиям развития: 2 (2st - стадия 2-х бластомсров, до включения зиготического генома), 12 (12st - поздняя гаструла, после включения зиготического генома), 19 (19st - хвостовая почка) 28с, 32с и 36с - циклы ПЦР амплификации Присутп вие транскрипта ограничено ранними стадиями эмбриогенеза

Исходная длина кДНК-фрагмента N22 составляла ~ 450 п.о Для получения недостающих 5'- и 3' - областей кДНК-фрагмента был использован метод быстрой амплификации концов (Rapid Amplification of cDNA Ends - RACE) Полученные в результате RACE-фрагменты кДПК были частично секвенированы, на основании чего были синтезированы олигонуклеотиды для амплификации полноразмерной копии кДНК с помощью RT-PCR. В результате были клонированы и секвенированы три независимых полноразмерных клона кДНК.

Анализ нуклеотидной последовательности полноразмерной копии кДНК показал, что кодирующая область составляет 1761 п.о., а 5'- и 3'- НТО - соответственно 279 и 799 п.о. Общая длина полноразмерной копии кДНК - 2839 п.о. Предсказанная аминокислотная последовательность составляет 587 аминокислот, содержит два мотива лейциновых застежек-молпий и один EF-hand капьций-связывающий домен, имеет расчетный молекулярный вес -68,3 кДа (рис. 2).

Поиск в базе данных известных нуклеотидных и белковых последовательностей GenBank с помощью алгоритма BLAST не обнаружил каких-либо значительных гомологий с идентифицированным нами геном.

1 остаттвсттастас ттсаеасгдасатас аттттаттйаасстт сааат<3<зат<и;ат150 саесттотаааттса 76 етстттаттттсттй ттттатсаататстс сататтсасаасеат естеотттаесабтт сстссеессабасат 151 астасттасстагвс таатаататааттаа сттааттастоттсс ст(ксаааоттттат сствтвастсстата

ми о м i, к у

226 татот«жк;аасат ттсттсстссватсс аттасттаатттею атитаттадатетво сааат<кт<зааатат

v v К о v в I м к о и Ь К n т С Я I, Р к Т I Ь Г V 301 стясттааасааота ассаттатваавсаа тсостаааоаатаса твссвтстоттсаас асеаттсттттсаат

А V Р Е Р 3 т У в Н О Э 8 Э А Т Р V 3 3 I, О р В Н 37 6 есаетттттеаосст тссасттатаетсат саааеттсатстест асатттеттабттст стасаасатеаасат

о е я м т р v к е м ь е р р р о с и ь ь р р к i. 3 4 51 саеелеавсатеасс ттттссаласааатс сттсаатттсатттс саст^ссосстсгтс тттеасаааттстсс

Б Г В V !■ N v N Е О ГААИТ N Р М Ь 3 V К Ь 8 У 526 аестттсдтеттстс аатетааатеаасаа тттестесесатаса аатттсатеттатгт стаааестеаестат А i с с N i; М к с е е ь ь о к ь о к ь к а г с у о

601 ессаттеатвесаат сплтв/лстст(хя саастсттесааааа ттесаеааеттеааа есстттееттатсаа

а v р б т р i р я n v р i, р э ь с у я о е ь м n а

676 естетесстсхааса ссаататтсайсаат стстттттаватаот стттеттасаеасас еааттаатеаатеса

аоеме р ь и к е муеое к v ь ъ е маест

751 сстсаееааатееае ТТТСТС7ВВАААСАА атстатваасаасаа ааосттттсгтасаа атсссасаатстаса

(2 е б у о р р i, р е n с к м с б я ь о р пылок

826 сае(5ааееататсаб батттсстстттбаа аастбсаааатбтбт ббааатстссаессс тееаатсбасааааб

у я к 3 i, 3 с р р р n р ь н к оъкта е н э о к

901 тасаоааааабттта тсатбтссстттссс ааттттстасасаао саастааааасаест ба5саттсссас.ааа

тнзан я v v м н а т р к т v ь 3 е 5 ъ 8 i. и р

976 асасаттствстслт сбтбтабттатсаат бсаасабатааааст бтестсаетбаатса ттаабсттаагаттс р Н р О с ъерьк а е 3 3 к М н О Ь N нк1ир

1051 ттссатбатсалтбт ттабаасстстсааа ссабаатсттссааа атесатеатттааат сасалбатлаатсст

и ь и ь р 3 а р р т т 8 3 я б к я v г ь (2 р ъ а к

1126 тббттааббстбсса тсббстеастттаса асатсааетаеабба аабсбабтвтсасте саассбттббссааа

V N к р ь к р т в I а т о Р к Е Е е к х р ь 3 т г

1201 втсаасаавттсств ааа<затасстсбатт сааасссаабатааа саасаг,йг,саааатт басстатссассает

э н в n в к е м о р к у с б ь о е с б v (¡те _ь_э

1276 асгсаттсааастсс ааобааатссаасас аабтаттетебастс саабаатбтебтбтт сааастбабстстст

е я р i б ь р э т т 3 ь ь е э n р 8 г ь 3 э у ё е 1351 тттабасссаттббт ттбттттссасааса тстстаттабаатса аатбастстттсстт аесабттасабтбаа р к р р р акзэт р и о г у о ь н ь 8 я я м ь р 1426 ссааатбатсстеас естаастсаабтатт ттттбббатаеттат бассттсатстттсс аеаабаатосттсат

n в у н и о 0 р « р v к е о я е Ь о б i е р я i, к 1501 ааттстбтбсаттбб сассаасастссоат СТСААС^ААСААААТ баастссааббтатт баббатсббттбааа

УТЕА1 Ь К В Е Е Т А_Я Е ЕОАЬЕ V Ь Ъ Я Е

1576 татастеааессата сттааебаббаббаа асёесастсабаеаа баасаббсастббаа бттсттстбсбаеаб

е00рм р с i р n б румк еыуьо ыорт о 1651 сабсасзсаасстатс бастссататттаат остеасстсаатааа йсааастатстйсас аассабсасатасас ктмоы нэутя тыоьз зтряу n i а н я 1726 аасастатегаваат ааттссвгаастаба асааатсасстотст тстастссадатвта аасаттссссатайс

стзьр эззор вяурр урвум кьебс 1801 т<зсасаавтттеват тсатста6тсаасса аетаастастттсст сттсаттстетаатс ааостаоаааестет

еьймз р я i i к е с р е ь бунра уяырс 1876 ваасттвссатстст (затасааттатаааб ваатоттттеасста есатассатвасот сттасааатоаттет ррмтэ ыкяъэ е ь г ь ъ яяяет ябяао

1951 ссстттаасатаасс аатаааа<мстстса ТТТСГСПОТСТОСТа СССКСАССАСАкАСС АОУГСаА&ХСССАА к Ъ э н т *

2026 аааттаасзссатаст тааасатб(этаааса стйааааасетсатт аааатбаттассаеа статассттстасат 2101 сссааасттстаатт тсттстстастааса ааатаатттсассст ттстаттсатттсса аатттасатттттаа 2176 тбаитобаатбаасс ттестстаастоаот ттасттсттсасате таттеттосястеся сттттттвтвтасса 2251 татоаааатстввет атасатастстааае атсасаятастйттт аоатвтвтсттатат ттаетсттсттттст 2326 статттттттттттт стсаттюаталслт ТОС/^ТТАТСАСТТТС тссасттттттаатс ссслатататстатс 2401 ттасстаааасттат ттатссттатссаст тттаесттаатттат аатттттятсааатт ааатааттсассааа 2476 аааатстатттсатт тстастстг.татаас ттттсаассасастс сттг,г.астоастср-а агтгатататататт 2551 тттттатбтттсста атаатсастсаатес тсгстатсаатсаст ааатстатасстттт аабтатаассасасс 2626 татттааатстасст ттасаасесттсато сатосааааттетса сттеатаатттсата яттатаяттотстат 2701 тоттвтотлаттета атттсасттттстат соататсаттстста аеатттттаааатес ттстсаааттатава 2776 (5састттасасааст тстааттаатасаса тсстссасатсстс* аиилттсааататт ттат

Рис. 2. Нуклеотидиая и аминокислотная последовательности полученной кДНК.

В предсказанной аминокислотной последовательности два мотива лейциновых застежек-молний подчеркнуты одной линией, ЕР-11ап<1 домен подчеркнут двойной линией. Стоп-кодон обозначен звездочкой, сайт полиаденилирования выделен жирным шрифтом.

Полученные данные были дополнены результатами проверки длины полноразмерной копии кДНК, а так же анализом пространственной и временной экспрессии гена в раннем развитии Хепори.ч laevis и опубликованы в статье [Berekelya et al., 2003] В ходе этой работы было установлено, что на самых ранних стадиях оогенеза мРНК гена равномерно распределена по всей цитоплазме ооцита, на средних стадиях 11/1П локализована в митохондриальном облаке (МО), а к моменту полного созревания ооцита обнаруживается в тонком кортикальном слое на вегетативном полюсе. На ранних стадиях эмбриогенеза транскрипт гена связан с зародышевой плазмой, сосредоточенной на вегетативном полюсе яйца, и поэтому был назван нами Germes (от ан1 лийского термина germ plasm, то есть зародышевая плазма).

На сегодняшний день известно более 15 различных РНК, которые локализуются на вегетативном полюсе яйца Хепорич laevis Среди них такие мРНК, как Vgl, VegT, Xcat2, Xdazl, Xpat, fatvg и др. Как уже обсуждалось выше, локализация этих транскриптов осуществляется благодаря действию двух механизмов транспорта РНК на вегетативный полюс ооцита -раннего (METRO) и позднего.

Исследование механизма локализации мРНК Germes на вегетативный полюс ооцита.

Для изучения механизма локализации мРНК Germes был использован метод инъекций флуоресцентной РНК в живые ооциты с последующим их анализом на конфокальном микроскопе Анализ ооцитов, инъецированных флуоресцентно меченой полноразмерной РНК Germes, показал, что РНК, сразу после инъекции диффузно распределяющаяся по всему объему ооцита, способна концентрироваться в МО ооцитов стадии I уже на следующие сутки после их инкубации в питательной среде (рис ЗА). Флуоресцентная РНК Germes, инъецированная в ооциты стадии НЛП, способна концен грироваться на вегетативном полюсе в составе МО, когда оно распадается и его компоненты входят в состав вегетативного кортекса (рис ЗБ). Полученные результаты согласуются с результатами, полученными с помощью метода in situ гибридизации, и говорят о том, что мРНК Germes относится к классу РНК, использующих ранний механизм (METRO) транспорта РНК на вегетативный полюс.

Исследования локализующихся РНК показывают, что цис-действующие последовательности ответственные за локализацию РНК, как правило, находятся в З'НТО РНК [Johnston, 1995].

А Б В Г

Рис. 3. Конфокальное изображение ооцитов, инъецированных флуоресцентной РНК.

(А, Б) Ооцнты стадии I (А) и П/1П (Б) были инъецированы флуоресцентно меченой полноразмерной РНК Germes. РНК локализуется в МО, находящемся возле ядра (А), или распадающемся возле вегетативного полюса (Б).

(В, Г) Ооцит стадии I/П был инъецирован эквимолярной смесью РНК З'НТО Germes (В) и З'НТО Xcat2 (Г), меченых флуоресцентными метками Rho и А1еха488, соответственно. Наблюдается локализация РНК в МО, находящееся между ядром и вегетативным полюсом. Я -ядро, Вг - вегетативный полюс, МО - митохондриальное облако

С целью ответа на вопрос, в какой области мРНК Germes находятся последовательности, регулирующие ее транспорт в МО и на вегетативный полюс, были синтезированы меченные флуоресцентной меткой Rho (tetramethylrhodamine) РНК, соответствующие кодирующей части мРНК Germes или ее З'НТО. Каждую из этих РНК смешивали в эквимолярном соотношении с З'НТО РНК Xcat2, меченной другой флуоресцентной меткой - А1еха488. Полученные смеси инъецировали в ооциты стадии I/I1. З'НТО РНК Xcat2, которая относится к классу РНК, использующих ранний механизм транспорта, содержит необходимые и достаточные последовательности, направляющие ее транспорт в МО, и поэтому способна самостоятельно локализоваться в МО инъецированного ооцита [Forristall et al., 1995] Анализ инъецированных ооцитов с помощью конфокальной микроскопии показал, что З'НТО РНК Germes, так же как и З'НТО Xcat2, концентрируется в МО (рис. 3, В, Г)- В то же время кодирующая часть РНК Germes остается равномерно распределенной по всей цитоплазме ооцита и не концентрируется в МО (данные не показаны). Интересно, что характер распределения З'НТО РНК Germes в МО отличается от распределения РНК З'НТО Xcat2. По-видимому, эти РНК локализуются в разных компартментах внутри МО. В то время как З'НТО РНК Xcat2 главным образом образует кольцо с внутренней стороны МО, З'НТО РНК Germes равномерно распределена по всему объему МО. Ранее было показано, что мРНК Xcat2 связывается с зародышевыми гранулами внутри МО [Zhou and King, 1996; Kloc et al., 2000], a мРНК Xdazl - с плотной сеть ЭР в МО [Chang et al., 2004]. Флуоресцентная З'НТО РНК Germes, инъецированная в ооциты стадии Will, также способна локализоваться в МО, находящееся возле вегетативного полюса (данные не показаны).

Таким образом, вся информация, необходимая для транспорта мРНК Germes на вегетативный полюс ооцита, находится в ее З'НТО.

Исследования механизмов локализации РНК свидетельствуют о том, что в их основе лежит взаимодействие между цис-действующими последовательностями РНК, являющимися сигналами локализации, и транс-действующими белковыми факторами, составляющими молекулярную основу локализационной машины [Johnston, 1995]. Таким образом, поиск цис-последовательностей в З'НТО мРНК Germes и исследование транс-факторов, специфично с ними взаимодействующих, являются важными этапами исследования механизмов функционирования локализационного аппарата.

Поиск цис-действующих последовательностей мРНК Germes.

Детальные исследования цис-действующих последовательностей приводят к накоплению все больше данных, подтверждающих, что протяженные цис-действующие последовательности состоят из более коротких, повторяющихся, нетандемных нуклеотидных элементов, образующих кластеры. Эти элементы часто представлены в избытке, так что отдельная их группа или их часть является достаточной для локализации РНК, однако полный набор этих элементов вместе с остальными цис-последовательностями РНК обеспечивает наиболее эффективную локализацию.

Для поиска цис-действующих последовательностей внутри З'НТО РНК Germes, ответственных за ее локализацию в МО и на вегетативный полюс, была использована недавно разработанная программа REPFIND [Betley et al., 2002], которая позволяет идентифицировать короткие нуклеотидные повторы ДНК. Авторы показали, что у многих организмов кластеры из этих повторов являются, по-видимому, сигналами локализации РНК. Обнаружена высокая корреляция между наличием САС-содержащих кластеров в РНК и ее способностью локализоваться в клетке.

Анализ полноразмерной последовательноста РНК Germes с помощью программы REPFIND показал, что в ее З'НТО находится кластер, состоящий из 13-ти САС-повторов, который потенциально может бьггь ответственен за локализацию РНК (рис. 4) Для проверки этого предположения было решено исследовать поведение инъецированных в ооциты мутантных форм З'НТО РНК Germes с делециями отдельных групп САС-повторов в ооцитах. Детальный анализ З'НТО РНК Germes показал, что кластер из 13 САС-повторов преимущественно находится в 3' конце З'НТО и может быть условно разбит на три подгруппы, обозначенные нами как 'а', 'Ь' и 'с' (рис. 5). Мутантные формы З'НТО РНК Germes с делециями соответствующих областей были названы как З'НТОДа, З'НТОДЬ и З'НТОДс.

и»;

ТУТ. I г - if m

'ïtà&L-i iwmS w

..даггй "пт

гост Клмйбге "

-^-■ ■ jàK». -

•ws г«ад«<ии«ц'т -» ■ i

Ряс. 4. Результат анализа полноразмерной последовательности РНК Germes с помощью программы REPFIND.

Представлен результат для САС-содержащих повторов с наименьшими значениями параметра Р. Расположение САС-содержащих повторов внутри последовательности РНК Germes схематически изображено вертикальными полосками, в соответствии с масштабом (в нуклеотидах) - верхняя линия. Повторы, образующие кластер, выделены цветными полосками. Область соответствующая З'НТО (3'UTR) выделена желтым цветом. Кластеры находятся в З'НТО. Величина параметра Р означает вероятность обнаружения кластера, для которого вычислено это значение, случайно, среди всех возможных кластеров, образованных из заданного повтора в исследуемой последовательности.

. ^Mt г. ; <

■ -....—

' " . ■ ■ • .¿t., : -КЯ*«»з

Рис. 5. Результат анализа последовательности З'НТО РНК Germes с помощью программы REPFIND.

Представлен результат для САС-содержащих повторов с наименьшими значениями параметра Р. Кластеры преимущественно находятся в 3' конце З'НТО и условно могут быть разбиты на три подгруппы, обозначенные нами как 'а','Ь' и 'с' (выделены желтым цветом).

РНК, соответствующие мутантным формам З'НТОДа, З'НТОДЬ и З'НТОДс были синтезированы в присутствии флуоресцентной метки Rho и смешаны в эквимолярном соотношении с РНК З'НТО дикого типа, синтезированной в присутствии другой флуоресцентной метки А1еха488 Полученные смеси были инъецированы в ооциты стадии I/II Оказалось, что в то время как РНК З'НТО дикого типа локализуется в МО ооцита, мутантные формы РНК, соответствующие З'НТОДа, З'НТОДЬ или З'НТОДс, теряют эту способность. На рисунке б представлены результаты для З'НТО РНК Germes с удаленными 'Ь' и 'с' областями.

А А' Б Б'

Рис. 6. Удаление 'Ь' и 'с' областей из З'НТО РНК Germes нарушает ее локализацию в МО. (А, А') Конфокальное изображение ооцита (стадия I/II), инъецированного эквимолярной смесью РНК З'НТО Germes дикого типа (А) и с делецией 'Ь' области (А'), меченных флуоресцентными метками А1еха488 и Rho, соответственно. Деления 'Ь' области исключает локализацию РНК в МО.

(Б, Б') Конфокальное изображение ооцита (стадия I/II), инъецированного эквимолярной смесью РНК З'НТО Germes дикого типа (Б) и с делецией 'с' области (Б'), меченных флуоресцентными метками А1еха488 и Rho, соответственно. Делеция 'с' области нарушает, но не исключает локализацию РНК в МО. Я - ядро, МО - митохондриальное облако.

Таким образом, удаление любой из трех САС-содержащих областей предотвращает локализацию З'НТО РНК Germes в МО. Следовательно, последовательности 'а', 'Ь' и 'с' являются необходимыми для локализации З'НТО РНК Germes в МО и на вегетативный полюс, и могут претендовать на роль цис-действующих последовательностей, регулирующих ее транспорт.

Известно, что цис-действующие последовательности или их отдельные элементы могут образовывать вторичные и третичные структуры, которые, в свою очередь, могут являться сигналами локализации РНК [Wyatt and Tinoco, 1993]. С целью предсказания таких сигналов локализации в мРНК Germes, ее З'НТО была проанализирована с помощью программы MFOLD [Zuker, 2003]. Программа предсказывает образование потенциальных вторичных структур РНК. Наибольший интерес в этом анализе представляет образование вероятных вторичных структур в областях РНК, необходимых для ее локализации в МО, т.е. в САС-содержащих областях 'а', 'Ь' и 'с'. Проведенный анализ показал, что последовательность 'с' области принимает участие в образовании протяженной вторичной структуры, которую мы назвали как с' структура -

двухцепочечная РНК с перемежающимися петлями (рис. 7). Последовательность 'Ь' области образует протяженный двухцепочечный участок РНК с другой частью РНК Germes -последовательностью, частично принадлежащей 'а' области. На 5' конце 'Ь' области находится вторичная структура, названная нами как L, состоящая из даухцепочечного участка с петлей на конце. Удаление 'Ь' области из З'НТО РНК Germes исключает образование структуры L Последовательность, из которой состоит структура L и область 'Ь' была названа нами как 'Lb' (рис. 7). В 'а' области можно также наблюдать образование сложной вторичной структуры целиком состоящей только из этой последовательности, которую мы назвали как а' структура

Рис. 7. Анализ вторичной структуры З'НТО РНК Germes с помощью программы MFOLD. Представлена наиболее вероятностная вторичная структура З'НТО РНК Germes. Указаны структуры с' и L. Последовательность, из которой состоит структура L и область 'Ь' обозначена как Lb.

Таким образом, учитывая, что САС-богатые последовательности 'а', 'Ь' и 'с' являются необходимыми для локализации З'НТО РНК Germes в МО и на вегетативный полюс, можно предположить, что предсказанные в этих областях целостные вторичные структуры a', L и с1 играют критическую роль и являются потенциальными сигналами локализации.

Для выявления последовательностей, которые могли бы направлять локализацию З'НТО РНК Germes в МО, т.е. быть способными самостоятельно локализоваться в МО, и, таким образом, являться сигналами локализации, мы инъецировали в ооциты стадии I/II следующие флуоресцентные последовательности З'НТО РНК Germes: 1) Lb; 2) с'; 3) Lbc'; 4) abc'.

Ч

V

Оказалось, что ни Lb, ни с', ни их комбинация Lbc* или abc', не обладают способностью самостоятельно локализоваться в МО ооцита. Все эти РНК равномерно распределялись по всей цитоплазме ооцита и были в разной степени исключены из МО - концентрация флуоресцентного сигнала в МО была всегда ниже или сравнима с концентрацией сигнала в цитоплазме (данные не показаны). В случае инъекции РНК Lbc' было, однако, обнаружено формирование крупных гранул в цитоплазме и в кортикальном слое ооцита (рис.8, А, Б). Хотя в большинстве инъецированных ооцитов гранулы были равномерно распределены по всему объему цитоплазмы, встречались также ооциты, у которых концентрация гранул наблюдалась возле ядра (рис.8, В) или вокруг МО (рис.8, Г)-

А Б В Г

Рис.8. Конфокальное изображение ооцитов стадии П, инъецированных флуоресцентной РНК Lbc'.

(А) Гранулы равномерно распределены по всему объему цитоплазмы и в кортикальном слое. (Б) Локализация гранул в кортикальном слое ооцита. (В) Концентрация гранул наблюдается возле ядра ооцита. (Г) Гранулы сосредоточены вокруг МО. Я - ядро, МО - митохондриальное облако.

Столь необычное поведение РНК Lbc' в ооцитах, которое не наблюдалось ранее при инъекции ни одной из исследуемых РНК Germes, очевидно обусловлено объединением двух последовательностей - Lb и с'. При инъекции Lb или с', РНК равномерно распределялась по всему объему ооцита, исключая МО, формирование гранул в цитоплазме не наблюдалось. Объединение Lb и с' привело к функциональной последовательности, Lbc', инъекция которой в ооциты стадии I/II инициирует образование гранул в цитоплазме и их локализацию в кортикальном слое (рис.8, А, Б). Более того, в некоторых из инъецированных ооцитах гранулы локализуются возле МО или в околоядерной области, образуя при этом более крупные агрегаты (рис.8, В, Г). Возможно, что РНК Lbc' является минимальной цис-действующей последовательностью, которая взаимодействует с локализационной машиной или отдельными ее компонентами, и участвует в процессе локализации или одном из его этапов. В пользу этого предположения свидетельствуют следующие факты. Известно несколько мРНК, которые в процессе достижения вегетативного полюса ооцита локализуются возле ядра. Так процесс локализации эндогенной мРНК Vgl, использующей поздний механизм, начинается с

концентрации мРНК возле ядра на стадии П/П1 оогенеза и позже возле ядра со стороны вегетативного полюса ооцита [Zhou and King, 1996] Эндогенная мРНК fatvg, которая использует как ранний, так и поздний механизмы локализации, обнаружена в околоядерной области ооцита стадии III, совпадающей с областью, где локализуется мРНК Vgl [Chan et al., 1999]. Флуоресцентные РНК fatvg и Xcat2 инъецированные в ооциты стадии Ш/IV также предварительно локализуются возле ядра, а затем с помощью позднего механизма в кортикальном слое вегетативного полюса ооцита [Zhou and King, 1996; Chan et al., 1999]. При инъекции флуоресцентной РНК Xcat2 в цитоплазме ооцита отмечается формирование гранул. Локализация мРНК Vgl и fatvg на вегетативный полюс также происходит в виде комплексов [Chan et al, 1999] Таким образом, проводя аналогии с выше описанными фактами, можно предположить, что инъецированная в оониты стадии I/II РНК I,bc' принимает участие в начальных этапах позднего механизма локализации РНК Следовательно, Lbc' возможно является цис-действующей последовательностью мРНК Germes, ответственной за локализацию по позднему пути Вообще, многие РНК раннего пути могут использовать поздний механизм локализации, если их инъецировать в ооциты на стадии ГО/TV, когда функционирует этот механизм. В некоторых из этих РНК обнаружены цис-действующие последовательности, отвечающие за локализацию по обоим путям, что не удивительно, поскольку в основе организации цис-последовательностей РНК раннего и позднего пути локализации лежат схожие принципы - и те, и другие образуют кластеры из САС-повторов. Способность некоторых РНК пути METRO использовать поздний механизм локализации, возможно, обеспечивает их эффективную и полную доставку на вегетативный полюс ооцита. Многие из РНК пути METRO являются детерминантами ППК, поэтому их трансляция в соматических клетках будущего эмбриона нежелательна.

Тот факт, что во многих инъецированных РНК Lbc' ооцитах гранулы локализуются в кортикальном слое ооцита или возле ядра, подразумевает активный транспорт этих частиц. Было показано, что локализация РНК по позднему пути локализации зависит от микротрубочек [Yisraeli et al., 1990] Сеть микротрубочек распределена по всему объему ооцита, включая плотную сеть в кортикальном слое и вокруг ядра [Gard, 1991 ; Gard 1994]. Поэтому участие микротрубочек в активном транспорте этих частиц является наиболее вероятным. Наши предварительные данные говорят о колокализации гранул с микротрубочками в цитоплазме, однако для окончательного подтверждения необходимы дополнительные эксперименты.

Похожие результаты были получены при инъекции в ооциты стадии I флуоресцентной последовательности РНК MCLE, ответственной за локализацию мРНК Xcat2 в МО, а именно -формирование крупных гранул (агрегатов) в цитоплазме, их локализация возле МО и ядра, а также колокализация с микротрубочками [Choo et al., 2005]. Тот факт, что РНК MCLE

локализуется в МО и может использовать оба механизма локализации, говорит о том, что эта последовательность, в отличие от РНК Lbc', вероятно содержит сигналы локализации для обоих путей.

Явление концентрации РНК вокруг ядра и около ядра со стороны вегетативного полюса ооцита остается до сих пор не изученным. Возможпо, в основе этого явления лежит то, что в ядре могут содержаться белковые факторы, необходимые РНК для ее транспорта на вегетативный полюс ооцита. Поэтому для связывания с этими факторами РНК должна быть доставлена к ядру или непосредственно в само ядро. Так, например, белковые комплексы мРНК Vgl и VegT с белками VglRBP/Vera и VgRBP60/hnRNP I, принимающие участие в позднем механизме локализации этих мРНК, были обнаружены в ядре уже на самых ранних стадиях оогенеза [Kress et al., 2004]. Известно, что некоторые из этих факторов могут диффундировать из ядра в цитоплазму и обратно. Некоторые РНК раннего пути так же могут связывать эти белковые факторы [Chang et al., 2004; Clau(3en et al., 2004]. Нами было показано, что З'НТО РНК Germes и ее цис-последовательности, в частности Lbc', способны связывать белки VglRBP/Vera и VgRBP60/hnRNP I (см. далее). Поэтому не исключено, что РНК Lbc' может использовать те же механизмы для локализации на вегетативный полюс ооцита, что и PIIK позднего пути. Структурная организация области возле ядра со стороны вегетативного полюса также слабо изучена. Были сделаны некоторые предположения [Zhou and King, 1996; Chan et al., 1999], но для полной ясности необходимы детальные исследования.

Исследование белковых факторов, взаимодействующих с З'НТО мРНК Germes.

мРНК Germes относится к классу РНК, использующих ранний путь локализации для достижения вегетативного полюса ооцита. На сегодняшний день известно крайне мало о молекулярных механизмах функционирования этого пути, в частности о белковых факторах, регулирующих процесс локализации и составляющих белковую транспортную машину Исследование белковых факторов, специфично взаимодействующих с РНК раннего пути локализации, в том числе и с мРНК Germes, является необходимым для понимания молекулярных основ функционирования этого процесса.

Таким образом, в рамках настоящего исследования были поставлены следующие задачи'

1) Исследовать белковые факторы ооцитов, специфично взаимодействующих с З'НТО мРНК Germes и ее цис-последовательностями.

2) Провести сравнительный анализ белков, связывающихся с З'НТО мРНК Germes и другими РНК раннего и позднего пути локализации с целью идентификации уникальных и универсальных белковых факторов, взаимодействующих с З'НТО мРНК Germes

Для решения поставленных задач был использован метод сшивки с помощью ультрафиолета. В этом методе вначале проводят инкубацию белков экстракта из ооцитов вместе с радиоактивно меченой исследуемой РНК. Образованные комплексы облучают ультрафиолетом для образования ковалентной связи между РНК и белками, и затем обрабатывают РНК азами для устранения несшитой РНК. В результате взаимодействующие с РНК белки приобретают радиоактивную метку, т.е. происходит "перенос" метки от РНК к белкам. Разделение продуктов реакции в полиакриламидном геле с последующей радиоавтографией позволяет получить дисплей белков, связавшихся с исследуемой РНК. Для подавления неспецифичного связывания бежов с радиоактивной РНК в реакцию добавляют тРНК, дрожжевую тотальную РНК и РНК, соответствующую кодирующей части ß-глобина Xenopus.

В ходе исследования белковых факторов, специфично взаимодействующих с цис-последовательностями в З'НТО мРНК Germes, предполагалось также исследовать роль вторичных структур в организации сигналов локализации. Известно, что цис-последовательности РНК могут образовывать вторичные структуры, такие как шпильки или двухцепочечные участки, которые могут узнаваться транс-факторами, и соответственно, являться сигналами локализации. Поэтому, основываясь на результатах предсказания вторичной структуры с помощью программы MFOLD, для анализа с помощью метода сшивки были выбраны последовательности З'НТО мРНК Germes, предположительно образующие целостные вторичные структуры - Lb и с'.

С целью идентификации уникальных и универсальных белковых факторов, взаимодействующих с З'НТО мРНК Germes, в исследованиях также были использованы мРНК Xcat2 и Vgl, являющиеся наиболее изученными представителями раннего и позднего механизма локализации, соответственно [Kloc and Etkin, 1995]. Локализация этих мРНК в обоих случаях направляется цис-действующими последовательностями, находящимися в их З'НТО. В случае с Xcat2 - это последовательность, MCLE (Mitochondrial Cloud Localization Element), необходимая и достаточная для локализации в МО. В случае с Vgl - это VgLE, необходимый и достаточный элемент для локализации на вегетативный полюс. Также в З'НТО мРНК Xcat2 находится последовательность GGLE (Germinal Granule Localization Element) необходимая для иммобилизации мРНК Xcat2 в зародышевые гранулы внутри МО. Набор белков, который связывается с З'НТО Xcat2 и VgLE с помощью метода сшивки, был ранее

охарактеризован [Chang et al., 2004; Mowry et al., 1996], поэтому эти последовательности были использованы в качестве положительного контроля

Известно, что для локализации или связывания с белковыми факторами некоторых пис-действующих последовательностей они должны быть мультимеризованы [Gautreau et al, 1997, Lewis et al , 2004] Поэтому в нашем исследовании все последовательности, которые были использованы в экспериментах по связыванию с белковыми экстрактами из ооцитов, представляли собой димеры или тримеры. Так как ранний и поздний механизмы локализации функционируют на разных стадиях оогенеза, белковые экстракты были получены из ооцитов стадий: I/II (ранние стадии), HI/TV (средние стадии) и VI (поздняя стадия, зрелый ооцит).

В ходе исследования, прежде всего было обнаружено, что набор белковых факторов, связывающихся с исследуемыми РНК, идентичен в ооцитах ранних и средних стадий, когда функционируют разные механизмы локализации РНК, но зависит от последовательности этих РНК. Полученный результат, возможно, свидетельствует о том, что многие бежовые факторы, участвующие в разных механизмах локализации, присутствуют в ооцитах самых ранних стадий оогенеза. Отсюда можно предположить, что выбор механизма локализации той или иной РНК зависит от самой последовательности этой РНК, в частности от ее цис-действующих элементов.

В ходе детального анализа дисплея связывания цис-последовательностей РНК Xcat2 и Vgl было обнаружено, что на ранних и средних стадиях оогенеза MCLE и VgLE связывают сходные белки, в том числе VglRBP/Vera (69/75 кДа) и VgRBP60/hnRNP I (60 кДа), принимающие участие в позднем механизме локализации РНК Vgl и VegT (рис. 9) Профиль связывания GGLE, однако, резко отличается от MCLE и VgLE тем, что эта последовательность не связывает VglRBP/Vera и VgRBP60/hnRNP I, но связывает два других белка - рЗО и р45. Среди белков, которые связываются с З'НТО РНК Germes, были так же обнаружены белки VglRBP/Vera и VgRBP60/hnRNP I, рЗО и р45 (рис. 9) Интересен тот факт, что рЗО и р45 не связываются с VgLE, что предполагает их участие в раннем механизме локализации РНК. Кроме того, за связывание с этими белками в З'НТО РНК Germes отвечают разные последовательности, необходимые для локализации в МО. Последовательность Lb связывает белок р45, а с' - рЗО. Полученные результаты говорят о высокой специфичности взаимодействия белков с РНК. Тот факт, что РНК, использующие ранний путь локализации, способны связывать белковые факторы позднего пути локализации обусловлен, по-видимому, тем, что ранние РНК могут использовать поздний механизм. Не исключено, впрочем, что белки позднего пути могут принимать участие в раннем механизме локализации. Одним из резких отличий профиля связывания РНК З'НТО Germes от MCLE, GGLE и VgLE является связывание белка р57. Вероятно, этот белок является специфичным только для мРНК Germes. Другой белок, р65, который взаимодействует с З'НТО РНК Germes, не был описан ранее в литературе

среди белков, связывающихся с цис-последовательностями Xcat2 и Vgl мРНК. В наших экспериментах мы обнаружили, что рб5 не связывается с MCLE и VgLE последовательностями, но связывается с GGLE (рис. 9). Возможно, что белок р65 задействован в процессе локализации мРНК Germes и Xcat2 в зародышевые гранулы МО в раннем механизме локализации РНК.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Рис. 9. Дисплей связывания белковых факторов из экстракта ооцитов с радиоактивно мечеными последовательностями РНК.

Представлен результат связывания белковых факторов из экстракта ооцитов средних (дорожки 1-6) и поздних (7-12) стадий оогенеза с радиоактивно мечеными последовательностями РНК: З'НТО Germes (дорожки 1, 7); Lb (2, 8); с' (3,9); GGLE (4,10); MCLE (5,11); VgLE (6,12). Обозначения белков, сшивающихся с РНК, указаны слева, молекулярные веса белков (в кДа) -справа.

В качестве дополнительного контроля к этому эксперименту проводилось связывание исследуемых РНК с белковым экстрактом из зрелых ооцитов, когда локализация РНК уже закончена. В результате было обнаружено, что на этой стадии оогенеза профиль связывания З'НТО РНК Germes отличается от профиля связывания на ранних и средних стадиях

отсутствием связывания с белками рЗО, р45 и р65 (рис. 9), что предполагает их участие в процессе локализации. С белком р57 на этой стадии связываются только последовательности РНК Germes. Хотя на поздних стадиях оогенеза локализация РНК уже закончена, способность некоторых белков с этих стадий связываться с РНК не исключает их участия в процессе локализации, а лишь отражает их присутствие в цитоплазме ооцита на этой стадии. Таким образом, белки рЗО, р45, р57 и р65 являются, предположительно новыми транс-факторами, принимающие участие в раннем механизме локализации мРНК Germes и Xcat2.

Специфичность связывания белковых факторов из экстракта ооцитов с З'НТО РНК Germes была подтверждена с помощью метода конкурентного связывания. Для этого вначале проводили инкубацию белкового экстракта с выбранной немеченой специфической конкурентной РНК, после чего в смесь добавляли радиоактивно меченую З'НТО РНК Germes. Превышение концентрации конкурентной немеченой РНК над меченой, как правило, составляло два порядка. Реакцию далее облучали ультрафиолетом и обрабатывали РНКазами. Продукты реакции разделяли в полиакриламидном геле. В результате, сравнивая дисплеи связывания З'НТО РНК Germes в присутствии конкурентной холодной РЖ и без таковой, можно идентифицировать специфично связывающиеся с РНК белки.

В качестве конкурентных РНК были использованы следующие последовательности: кодирующая часть РНК ß-глобинаXenopus, З'НТО Germes, L, Lb, с1, GGLE, MCLE, VgLE.

Результаты эксперимента представлены на рисунке 10. В результате, как и ожидалось, на средних стадиях оогенеза немеченые последовательности MCLE и VgLE способны конкурировать за связывание с белками VglRBP/Vera и VgRBP60/hriRNP I, а последовательность GGLE - за связывание с р45 и рЗО, что подтверждает специфичность связывания с этими белками и согласуется с полученными ранее результатами. Аналогично, отдельные участки З'НТО РНК Germes, Lb и с', способны конкурировать за связывание с этими белками. При этом, как и ожидалось, Lb конкурирует за связывание с р45, а с' за рЗО, Одним из неожиданных результатов этого эксперимента явилось то, что последовательность MCLE, но не VgLE, способна конкурировать за связывание с белком р57. Другой неожиданный результат заключается я том, что последовательность VgLE способна конкурировать за связывание с белками р45 и рЗО, хотя и не очень эффективно, предполагая их участие в локализации мРНК Vgl. Полученные данные противоречат результатам предыдущего эксперимента, из которого очевидно, что MCLE не связывает р57, a VgLE не связывает р45 и рЗО. Разногласия могут быть обусловлены тем, что степень сродства последовательностей MCLE и VgLE к этим белкам значительно меньше, чем у З'НТО РНК Germes, и поэтому для связывания с ними необходимо гораздо большее количество РНК MCLE и VgLE. Как раз это и происходит, когда количество конкурентной холодной РНК MCLE и VgLE превышает количество радиоактивной З'НТО РНК

Germes в реакции связывания на два порядка. Окончательный вывод можно будет сделать только при более детальном исследовании. Последовательность GGLE не способна

конкурировать за связывание с р57, в то время как с' напротив, показала высокое сродство к этому белку Обе последовательное!и, GGLE и с', не способны конкурировать за связывание с белками VglRBP/Vera и VgRBP60/hnRNP I. Эти данные согласуются с полученными ранее результатами За связывание с белком р65 способны конкурировать все исследуемые последовательности З'НТО РЖ Germes, а 1акже GGLE, в меньшей степени РЖ MCLE и VgLE.

Рис. 10. Дисплей связывания белковых факторов из экстракта ооцитов с радиоактивно меченой З'НТО РНК Germes в присутствии различных конкурентных немеченых последовательностей РНК.

Представлен результат связывания белковых факторов из экстракта ооцитов средних (дорожки 1-9) и поздних (10-18) стадий оогенеза с радиоактивно меченой З'НТО Germes в отсутствии специфической конкурентной РЖ (дорожки 3,12) и в присутствии следующих конкурентных специфических последовательностей РЖ: кодирующая часть р-глобина Xenopus (дорожки 1, 10); З'НТО Germes (2,11); L (4,13); Lb (5,14); с' (6,15); GGLE (7,16); MCLE (8,17); VgLE (9, 18). Обозначения белков сшивающихся с РЖ, указаны слева, молекулярные веса белков (в кДа) - справа.

В случае, когда конкурентная реакция проводилась с белковым экстрактом из зрелых ооцитов, были получены аналогичные результаты, с тем лишь отличием, что на этой стадии оогенеза З'НТО РЖ Germes не связывает белки р45 и рЗО Необходимо отметить, что в случае,

когда в качестве холодной конкурентной РНК использовали последовательность кодирующей части Р-глобина Xenopus, взаимодействие белков с З'НТО РНК Germes не нарушалось. В качестве положительного контроля процедуры использовали конкурентную З'НТО РНК Germes.

Таким образом, с помощью метода сшивки ультрафиолетом был проведен сравнительный анализ связывания З'НТО РНК Germes и ее цис-последовательностей с белковыми экстрактами из разных стадий ооцитов в присутствии различных специфических и неспецифических последовательностей РНК. Среди белков, специфично взаимодействующих с З'НТО РНК Germes, наибольший интерес представляют не описанные ранее белки рЗО, р45, р57 и р65, которые предположительно задействованы в раннем механизме локализации мРНК Germes и Xcat2. Высокая специфичность связывания (избирательное связывание) белков рЗО и р45 с цис-последовательностями мРНК Germes, образующими, по предсказаниям, выраженные вторичные структуры, может указывать на участие этих структур в процессах локализации. Обнаруженные белки являются потенциальными претендентами на роль транс-факторов, принимающих участие в раннем механизме локализации РЖ.

Выводы

1 ) Клонирована полноразмерная кД1 ПС нового гена, Germes, транскрипт которого локализован на вегетативном полюсе зрелых ооцитов и ранних эмбрионов шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Определена нуклеотидная последовательность кДНК гена. Предсказана структура кодируемого белка.

2) мРНК Germes локализуется на вегетативный полюс яйца во время оогенеза за счет раннего механизма транспорта РНК. Предсказаны пис-действуюпще последовательности, ответственные за локализацию транскрипта, находящиеся в его З'НТО, и представляющие собой три кластера из САС-повторов Все три кластера являются необходимыми, но недостаточными для локализации мРНК Germes в МО и на вегетативный полюс ооцита.

3) Предсказаны вторичные структуры, образующиеся в З'НТО мРНК Germes и ее цис-действующих последовательностях. Изучен характер поведения РНК, содержащих кластеры из САС-повторов, и потенциальные вторичные структуры, являющиеся претендентами на роль сигналов локализации в ооцитах Xenopus laevis. РНК, соответствующая последовательности, обозначенной нами как Lbc', показала нетипичное поведение при инъекциях в ооциты -образование крупных агрегатов в цитоплазме, их локализацию в кортикальном слое и околоядерной области ооцитов ранних стадий. Предположительно, Lbc' является цис-действующей последовательностью мРНК Germes, ответственной за локализацию по позднему пути.

4) Исследованы белковые факторы, специфично взаимодействующие с З'НТО мРНК Germes и ее цис-действующими последовательностями. Установлено, что Lbc' является минимальной цис-действующей последовательностью, с которой связывается набор бежов, идентичный набору белков связываемых с З'НТО мРНК Germes. Разные части последовательности Lbc' - Lb и с', образующие предсказанные вторичные структуры, связывают разные наборы белков, предполагая участие этих структур в роли сигналов локализации. Среди бежов, связывающихся с З'НТО мРНК Germes, обнаружены ранее не описанные белки с молекулярными весами 30, 45, 57 и 65 кДа, обозначенные нами как рЗО, р45, р57 и р65, соответственно. За связывание с бежом р45 отвечает Lb, а с рЗО -последовательность с'. Белки р57 и р65 связываются с обеими частями Lbc'.

5) Сравнительный анализ белковых факторов, связывающихся с З'НТО мРНК Germes и с цис-последовательностями Xcat2 и Vgl мРНК показал, что белки рЗО, р45, р57 и р65 являются, предположительно новыми транс-факторами, принимающие участие в раннем механизме локализации мРНК Germes и Xcat2.

Список публикаций по теме диссертации

1) Berekelya LA, Ponomarev MB, Luchinskaya NN, Belyavsky AV (2003) Xenopus Germes encodes a novel germ plasm-associated transcript. Gene Expr Patterns 3(4):521-524.

2) Берекеля Л.А., Пономарев M Б., Микрюков А.А., Лучинская Н.Н., Белявский А.В. (2005) Молекулярные механизмы детерминации клеток зародышевого пути у животных. Молекулярная биология 39(4):664-677.

Тезисы

1) Пономарев М.Б., Берекеля Л.А., Лучинская Н.Н., Белявский А.В. Исследование механизма локализации мРНК и картины экспрессии белкового продукта нового гена Germes в ооцитах и эмбрионах X. laevis 1-ая школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». 14-18 апреля 2003 г, Пущино. Сборник тезисов, с. 366.

2) Ponomarev MB, Berekelya LA, Luchinskaya NN, Belyavsky AV. Germes, a novel germ plasm-associated transcript of Xenopus laevis. Poster section. 7th International Engelhardt Conference on Molecular Biology, November 28 - December 02,2004, Moscow-Suzdal, Russia.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИДЫ 00510 от01.12.99 г. Подписано к печати 25.01.2006 г. Формат 60x90 1/16 Усл.печл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 043 Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

2.00CPI

p-5 A 4 6

t-

I

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пономарев, Максим Борисович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Биологическая роль локализованных РНК

Локализующиеся РНК как детерминанты развития

Drosophila

Xenopus

Асцидии

Daniorerio 10 Роль локализующихся РНК в специализации клеток половой линии

Формирование зародышевой плазмы у Drosophila

Формирование зародышевой плазмы у Xenopus

Зародышевая плазма у других организмов

Механизмы локализации РНК в клетке

Свободная диффузия и локальное заякоривание

Локализация РНК с помощью деградации

Активный транспорт

Drosophila

Xenopus

Активный транспорт в соматических клетках

Регуляция транспорта и локализации РНК

Цис-действующие последовательности

Транс-действующие факторы

Staufen hnRNP

Регуляция трансляции локализующихся мРНК

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение зародышевого материала лягушки 35 Анализ пространственной и временной экспрессии транскриптов, соответствующих кДНК фрагментам, с помощью метода обратной транскрипции РНК и

ПЦР амплификации (RT-PCR)

Клонирование полноразмерной кДНК Germes

Получение 3 '- области кДНК Germes с помощью 3 '-RACE

Получение 5 '- области кДНК Germes с помощью 5 '-RACE 38 Клонирование полноразмерной кДНК Germes с помощью RT-PCR

Приготовление ДНК конструктов для синтеза РНК

Микроинъекции

Получение ооцитов для микроинъекций

Синтез флуоресцентной РНК 42 Получение конфокального изображения живых ооцитов инъецированных флуоресцентной РНК

Метод сшивки с помощью ультрафиолета

Получение белкового экстракта из ооцитов

Синтез радиоактивно меченой РНК

Связывание белковых факторов с РНК

Манипуляции с ДНК, клонирование ДНК

Электрофорез в агарозном геле

Рестрикция

Зачистка концов фрагментом Кленова

Дефосфорилирование

Лигирование

Трансформация компетентных клеток

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 49 Идентификация и клонирование кДНК нового гена, транскрипт которого локализован на вегетативном полюсе ооцитов и ранних эмбрионов Xenopus laevis 49 Исследование механизма локализации мРНК Germes на вегетативный полюс ооцита

Поиск цис-действующих последовательностей мРНК Germes 54 Исследование белковых факторов, взаимодействующих с З'НТО мРНК Germes

ВЫВОДЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Пономарев, Максим Борисович

1) Клонирована нолноразмерная кДНК нового гена, Germes, транскринт которого

локализован на вегетативном нолюсе зрелых ооцитов и ранних эмбрионов шпорцевой

лягушки Xenopus laevis. Определена нуклеотидная последовательность кДНК гена. Предсказана структура кодируемого белка. 2) мРНК Germes локализуется на вегетативный полюс яйца во время оогенеза за

счет раннего механизма транспорта РНК. Предсказаны цис-действующие

последовательности, ответственные за локализацию транскрипта, находящиеся в его

З'НТО, и представляющие собой три кластера из САС-повторов. Все три кластера

являются необходимыми, но недостаточными для локализации мРНК Germes в МО и на

вегетативный нолюс ооцита. 3) Предсказаны вторичные структуры, образующиеся в З'НТО мРНК Germes и ее

цис-действующих последовательностях. Изучен характер поведения РНК, содержащих

кластеры из САС-повторов, и потенциальные вторичные структуры, являющиеся

претендентами на роль сигналов локализации в ооцитах Xenopus laevis. РНК,

соответствующая последовательности, обозначенной нами как Lbc', показала нетипичное

новедение при инъекциях в ооциты - образование крупных агрегатов в цитоплазме, их

локализацию в кортикальном слое и околоядерной области ооцитов ранних стадий. Предноложительно, Lbc' является цис-действующей последовательностью мРНК Germes,

ответственной за локализацию по позднему пути. 4) Исследованы белковые факторы, специфично взаимодействующие с З'НТО

мРНК Germes и ее цис-действующими последовательностями. Установлено, что Lbc'

является минимальной цис-действующей последовательностью, с которой связывается

набор белков, идентичный набору белков связываемых с З'НТО мРНК Germes. Разные

части последовательности Lbc' — Lb и с', образующие предсказанные вторичные

структуры, связывают разные наборы белков, предполагая участие этих структур в роли

сигналов локализации. Среди белков, связывающихся с З'НТО мРНК Germes, обнаружены

ранее не онисанные белки с молекулярными весами 30,45, 57 и 65 кДа, обозначенные

нами как рЗО, р45, р57 и р65, соответственно. За связывание с белком р45 отвечает Lb, а с

рЗО - носледовательность с'. Белки р57 и р65 связываются с обеими частями Lbc'. 5) Сравнительный анализ белковых факторов, связывающихся с З'НТО мРНК

Germes и с цис-носледовательностями Xcat2 и Vgl мРНК показал, что белки рЗО, р45, р57

и р65 являются, предположительно новыми транс-факторами, припимающие участие в

раннем механизме локализации мРНК Germes и Xcat2.