Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфо-функциональный анализ нового гена в раннем развитии шпорцевой лягушки Xenopus laevis

ВАК РФ 03.00.30, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Морфо-функциональный анализ нового гена в раннем развитии шпорцевой лягушки Xenopus laevis"

Направахрукописи

БЕРЕКЕЛЯ ЛЮБОВЬ АЛЕКСАНДРОВНА

МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ НОВОГО ГЕНА В РАННЕМ РАЗВИТИИ ШПОРЦЕВОЙ ЛЯГУШКИ ХЕЫОРив LЛЕМБ

03.00.30 - Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена на кафедре эмбриологии Биологического факультета Московского Государственного Университета им. МВ. Ломоносова и в лаборатории молекулярной биологии развития Института Молекулярной Биологии им. ВА. Энгельгардга РАН.

Научные руководители:

доктор биологических наук, кандидат биологических наук,

Белявский Александр Вадимович Новоселов Владимир Валерьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, член-корр. РАН кандидат биологических наук

Корочкин Леонид Иванович Минин Андрей Александрович

Ведущая организация:

Институт Биоорганической Химии РАН

Защита диссертации состоится 16 декабря 2004 г. в.

ч

мин на заседании

Диссертационного Совета Д.501.001.52 при Московском Государственном Университете по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, д.1, корп. 12, Биологический факультет МГУ, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М В. Ломоносова.

Автореферат разослан_2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время ведется большое количество работ по изучению ранних этапов онтогенеза позвоночных. Это связано как с интересом к собственно раннему развитию, так и с большим сходством в поведении эмбриональных и опухолевых тканей. В свете современных достижений в этих областях на первый план выходит выяснение молекулярных основ развития.

Первые события в онтогенезе так или иначе связаны со сложными преобразованиями, которые ведут от единственой клетки зиготы к трехмерно организованному эмбриону. Полярность будущего зародыша заложена в полярности яйца, которая устанавливается еще в оогенезе в материнском организме. Неравномерное распределение молекул в яйцеклетках является результатом процессов ооплазматической сегрегации, которые продолжаются и после оплодотворения. Ооплазматическая сегрегация приводит к неравномерному запасанию факторов в различных компартментах яйца - тех самых факторов, которые, будучи наследуемыми отдельными популяциями бластомеров, вносят ассимметрию в зародыш и запускают ранние события в эмбриогенезе: разметку осей тела, закладку зародышевых листков, выделение линии половых клеток. Таким образом, один из основных инструментов для изучения молекулярных событий, управляющих ранним развитием, - это изучение дифференциально локализованных в оогенезе материнских молекул.

Одной из самых популярных моделей биологов развития в последние десятилетия является шпорцевая лягушка Xenopus laevis. Основные преимущества, которые дает использование этого объекта, - это возможность получения огромного количества ооцитов или синхронно развивающихся зародышей, малые сроки развития до личинки, крупные размеры яиц и их ярко выраженная полярность. Дополнительным преимуществом при изучении молекулярных основ раннего онтогенеза является известный факт, что материнские молекулы-регуляторы находятся в вегетативном кортексе ооцитов шпорцевой лягушки.

Для идентификации новых генов-регуляторов эмбриогенеза в лаборатории Молекулярной биологии развития ИМБ РАН ранее был применен метод фингерпринтирования генной экспрессии [Ivanova, Belyavsky, 1995], позволяющий сравнивать наборы мРНК в исследуемых образцах. В данном случае между собой сравнивались четыре области ранней гаструлы (ст. 10.5) шпорцевой лягушки: анимальные шапочки, вегетативные массы, дорсальная и вентральная маргинальные зоны. В результате был обнаружен фрагмент кДНК неизвестного гена, показавшего экспрессию в вегетативной части зародыша [Иванова с соавт., 1998]. Позднее были получены кодирующая область и З'-НТО (нетранслируемая область), соответствующие этому фрагменту.

Настоящая работа, посвященная изучению этого потенциального гена-регулятора,

оказавшегося впоследствии одним

шагом к

пониманию молекулярных процессов, лежащих в основе раннего развития, в частности, выделения линии половых клеток.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Цель настоящей работы состояла в анализе экспрессии и функции нового гена Xenopus laevis, показавшего экспрессию на вегетативном полушарии зародышей. Для этого были поставлены основные задачи:

1. Клонирование полноразмерной кДНК нового гена шпорцевой лягушки, экспрессирующегося в вегетативных массах зародышей.

2. Анализ пространственно-временной картины экспрессии нового гена в раннем развитии и тканях взрослого организма.

3. Функциональный анализ гена с помощью мутантных форм, созданных на основе информации о первичной последовательности его белка.

4. Поиск белковых партнеров гена для уточнения процессов, в которых он может принимать участие.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. На сегодняшний день информация о формировании и функционировании половой плазмы - организатора половой линии -крайне скудна. Связано это в первую очередь с ограниченностью набора идентифицированных в ней факторов. Одним из результатов данной работы явилось клонирование нового компонента половой плазмы шпорцевой лягушки - Germes.

Мутационный анализ Germes показал, что этот белок необходим для нормального развития первичных половых клеток. Была сделана попытка определить ближайшее функциональное окружение Germes, то есть найти его белковые партнеры, что позволило бы лучше понять место этого белка в процессах, лежащих в основе выделения линии половых клеток. В результате была показана связь между компонентом половой плазмы, коим является Germes, и цитоскелетом через легкие цепи динеина.

Все данные, полученные в ходе экспрессионного и функционального анализа Germes, являются новыми и вносят вклад в современные представления о функционировании половой плазмы.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены на XIII зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2001 г.), 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003 г.), 10-й международной конференции по Xenopus (Вудс Хол, 2004 г.).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 4 работы, в том числе 1 статья в рецензируемом издании и 3 тезиса конференций.

СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация изложена на_страницах машинописного текста (12

шрифт, полуторный интервал), содержит_рисунков,_таблиц. Включает следующие разделы:

«Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и

«Список литературы». Список литературы содержит_наименования, в том числе_

иностранных источника.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Клонирование нового гена Xenopus laevis.

Фрагменты кДНК, соответствовавшие обнаруженному ранее транскрипту с вегетативной локализацией, были частично просеквенированы. Поиск открытой рамки считывания в этих последовательностях показал, что, возможно, имеющиеся фрагменты не составляют в сумме иолноразмерную кДНК. Чтобы определить длину полиоразмерного транскрипта исследуемого гена была проведена нозерн-блот гибридизация на образце РНК, выделенной из эмбрионов шпорцевой лягушки на стадиях раннего дробления (ст. 2-6). Оказалось, что мРНК гена в период дробления представлена единственной полосой и составляет примерно 2800 о. (рис. 1А) Имевшиеся у нас фрагменты кДНК составляли около 2600 п.о., на 3'-конце кДНК обнаруживался поли(А)-хвост и сайт полиаденилирования, следовательно, для получения полной первичной последовательности кДНК недоставало ее 5'-конца. Для получения недостающего фрагмента использовался метод быстрой амплификации концов кДНК (RACE). В ходе амплификации 5'-конца был получен фрагмент около 300 п.о. Первичные последовательности полученного 5'-КАСЕ-фрагмента и имевшегося З'-RACE-фрагмента были использованы для дизайна олигонуклеотидов для доследующей амплификации полноразмерной кДНК. Полная копия кДНК гена была получена с помощью ПЦР после обратной транскрипции мРНК со стадии 2-х бластомеров, вставлена в вектор pGEM-T и просеквенирована.

Анализ первичной последовательности показал, что кДНК нового гена состоит из 2839 нуклеотидов, 1761 из которых входят в состав кодирующей области, 288 составляют 5'-нетранслируемую область, 799 - З'-нетранслируемую. Предсказанный белок состоит из 587 аминокислот и имеет молекулярный вес 68 кДа.

Сравнение полученных нуклеотидной и аминокислотной последовательностей с имеющимися в базах данных позволил обнаружить консенсус для калышйевязывающего EF-hand домена и два мотива лейциновых застежек-молний, обеспечивающих белок-белковое взаимодействие. Кроме этого, значительной гомологии с другими белками найдено не было.

-2800 о,-

123456789 10 1 23456 78

^P^pi SP" ^

В

Рисупок 1. Нозерп-блот анализ экспрссии Germes. А - на радиоавтографе РНК Germes обнаруживается в виде единственной полосы, по размеру соответствующей примерно 2800 оснований. Б - постадийный анализ экспрессии, 1 - ст. 2,2 - ст. 7,3 - ст. 10.5,4 - ст. 13,5 - ст. 18,6 - ст. 22,7 - ст. 28,8 - ст. 35,9 - ст. 40,10 - ст. 44; максмимальное количество транскрипта наблюдается до включения зиготической экспрессии генов (ст. 2, 7), далее концентрация мРНК Germes постепенно падает. В - анализ экспрессии в различных тканях взрослого организма, 1 - печень, 2 - сердце, 3 - яичник, 4 - кожа, 5 - легкие, 6 - семенник, 7 - почка, 8 - селезенка; мРНК Germes присутствует только в яичнике.

Временной характер транскрипции нового гена в раннем развитии, а также распространение его в тканях взрослого ор1анизма были проанализированы с помощью нозерн-блог гибридизации. Тотальную РНК из эмбрионов, находившихся на разных стадиях развития от ст.2 до ст.44, а также из тканей разных закладок электрофоретически фракционировали в денатурируюхцих условиях и гибридизовали с радиоактивным зондом к гену. В качестве контроля нанесения РНК те же фильтры гибридизовали с радиоактивным зондом к повсеместно экспрессирующемуся фактору трансляции EFl-a. Было показано, что новый ген экспрессируется только в яичниках взрослой лягушки (рис. 1В), а в эмбриональном развитии его мРНК присутствует еще до включения собственного генома (ст. 8), т.е. является материнской (рис. 1Б). Со стадии гаструлы (ст. 10,5) количество ее резко снижается, и уже на стадии поздней хвостовой почки (ст.28) детектировать ее невозможно.

Более детально картина экспрессии нового гена была исследована с помощью гибридизации т situ (рис. 2, 3). В ранних ооцитах (до ст.П) транскрипт распределен по всей цитоплазме, но особенно сконцентрирован в митохондриальном облаке (рис. 2А, Г). На стадии II оогенеза он мигрирует к вегетативному кортексу (рис. 2Г), так же как и другие локализованные в митохондриальном облаке мРНК [Kloc, Etkin, 1995]. На последующих стадиях (рис. 2В, Д) продолжается миграция и диссоциация материала облака и прикрепление отдельных гранул, содержащих мРНК гена, к вегетативному кортексу. На стадии III транскрипт образует сплошной слой на границе между кортексом и обогащенной желтком цитоплазмой (рис. 2В). К завершению оогенеза (стадия VI) он весь локализован в виде отдельных гранул в вегетативном кортексе зрелого ооцита (рис. 2Д).

В зрелых ооцитах и зиготах транскрипт гена обнаружен в виде широкого поля гранул на вегетативном полюсе (рис. 2Б). После оплодотворения гранулы, содержащие мРНК, компактизуются и

Анализ временной и пространственной экспрессии гена.

до 16-клеточной стадии образуют более крупные и сложно устроенные комплексы (рис. ЗА, В). Уже на стадии ранней бластулы (32-64 бластомера) эти гранулы формируют несколько плотных образований, связанных с вегетагивным кортексом или находящихся в непосредственной близости от него (рис 2С, Е) Такое поведение характерно для большинства мРНК, локализованных в островках половой плазмы дробящихся зародышей [Kloc et al, 2002] Эти крупные гранулы обычно находятся в наиболее центральных вегетативных бластомерах - предшественниках ПИК Во время гаструляции последние погружаются внутрь зародыша в составе массы энтодермальных клеток В это же время материал гранул половой плазмы разрыхляется и перераспределяется в околоядерное пространство [Bladder, 1958, Houston et al., 1998] Гибридизационный анализ зародышей на стадии гаструлы позволил обнаружить исследуемый транскрипт в безжелтковом околоядерном слое цитоплазмы ПГ1К

Рисунок 2. Анализ локализации мРНК Germes во время оогенеза с помощью гибридизации in situ. A -

ооцит на стадии 4 со связкой мелких ооцитов (ст II) У ранних ооцитов просвечивает интенсивно окрашенное митохондриальное облако, слегка окрашена цитоплазма Более зрелый ооцит демонстрирует транскрипт Germes на вегетативном полюсе Б - группа ооцитов разных стадий с вегетативным полем Germes-положительных гранул В - гибридизация in situ на парафиновых срезах ооцита ст III Окрашенный материал распавшегося митохондриального облака распределяется вдоль кортекса, но еще че входит в его состав Г - эпоновый срез ооцитов ст II после гибридизации in situ на целых ооцитах Видно, как митохондриальное облако, содержащее транскрипт Germes, переместилось на вегетативный полюс Д - гибридизация in situ на парафиновых срезах зрелого ооцита (ст VI) мРНК Germes в виде гранулярного материала (половая плазма) входит в состав вегетативного кортекса тс - митохондриальное облако, п - ядро, vc - вегетативный кортекс

Рисунок 3. Анализ экспрессии Germes в ранних зародышах шпорцевой лягушки с помощью гибридизации in situ на целых эмбрионах. А - двуклеточный зародыш. Виц с вегетативного полюса. В -восьмиклеточный зародыш. Вид с вегетативного полюса. С — прозрачный эпоновый блок, содержащий половину зародыша на ст. ранней бластулы. Видна компактизация вегетативных гранул. D - эпоновый срез восьмиклеточного эмбриона; вегетативные бластомеры. Е — эпоновый срез ранней бластулы (тот же зародыш, что и на (С)). Компактный окрашенный материал остается вблизи вегетативного кортекса.

Таким образом, па всех стадиях оогенеза и в раннем развитии распределение мРНК исследуемого гена повторяет картину, характерную для поведения маркеров половой плазмв1 Xenopus, следовательно, транскрипт является специфическим для зародышевой плазмы и ранним маркером ППК. В связи с этим исследуемый ген Xenopus laevis и его продукт получили имя Germes.

Анализ влияния оверэкспрессии Germes дикого типа и его мутантных форм на формирование и миграцию ППК. Получениемутантных форм Germes.

Для функционального анализа исследуемого гена был использован один из стандартных подходов, заключающихся в скрининге эффектов при увеличении дозы гена и при конкурентном влиянии мутантных форм гена. Для анализа оверэкспрессии мРНК Germes дикого типа был изготовлен экспрессионный конструкт на основе вектора pCS2+, содержащий кодирующую область кДНК, pCS2+Germes. Мутационный анализ гена было решено начать с построения форм Germes с делециями функциональных доменов, обнаруженных в его белковой последовательности - мотивов лейциновых застежек-молний и кальцийсвязывающего EF-hand домена. Кроме того, необходимо было получить конструкт дг1я контроля неспецифического влияния оверэкспрессии РНК. Таким контролем обычно служат формы кДНК исследуемых генов, содержащие нонсенс-мутации, которые приводят к появлению ранних стон-кодонов и/или сдвигу рамки считывания.

Полученная ранее плазмида pCS2+Germes была использована в качестве основы для изготовления мутантных форм гена. Они были получены с помощью инверсной ПЦР и систем праймеров, позволявших амплифицировать Germes без каждого из мотивов лейциновых застежек-молний (pCS2+Germes-LZl, pCS2+Germes-LZ2) и без обоих (pCS2+Germes-LZs), без EF-hand домена (pCS2+Germes-EFh) и со стоп-кодоном, введенным в начало белковой последовательности (pCS2+GermesStop). Белковым продуктом pCS2+GermesStop должен быть полипептид, состоящий из первых 50 а о Germes (рис. 4)

Рисунок 4. Нормальная и мутантная формы Germes. Схематическое изображение.

Анализ влияния оверэкспрессии различных форм Germes на развитие ППК. Для анализа фенотипических эффектов оверэкспрессии нормальной и мутантных форм Germes

были проведены микроинъекции соответствующих мРНК, полученных в ходе in vitro транскрипции. Для максимально близкой доставки соответствующих продуктов к потенциальным мишеням -половой плазме и будущим ППК - инъекции проводили вегетативно под кортикальный слой зародыша. В качестве дополнительного контроля на механические повреждения вегетативного полюса в зиготы инъецировали воду. Таким образом, в эксперименте было 5 групп зародышей: инъецированные водой и четырьмя мРНК (по 500 пг каждая) - Germes, Germes-LZs, Germes-EFh, GermesStop.

Зародыши из экспериментальных групп и интактный контроль к ним инкубировались до достижения ст. 33, после чего их фиксировали и с помощью гибридизации in situ с зондом к маркеру половой плазмы Xpat, РНК которого сохраняется до этой стадии, выявляли ППК в процессе их миграции в половую железу. Это позволяло оценить как количество половых клеток, так и их способность к миграции.

Рисунок 5. Мигрирующие ППК в интактных зародышах. А, Б - ППК, выявленные с помощью гибридизации in situ на целых эмбрионах (ст. 33) с зондом к маркеру половой плазмы Xpat. Группы мигрирующих Xpat-позитивных клеток указаны стрелками. В - распределение зародышей по содержанию ППК. Основная масса эмбрионов имеет по 9-20 мигрирующих половых клеток на этой стадии.

Для эмбрионов каждой группы оценивали число ППК и характер их распределения на пути миграции в гонаду (табл. 1). Так как вариабельность по количеству ППК на зародыш оказалась очень большой, и стандартные отклонения в группах пересекались, мы также определяли характер распределения зародышей по группам в зависимости от содержания в них половых клеток (рис. 6).

Поскольку Xpat является специфическим маркером клеток половой линии на этой стадии развития, количественная оценка его экспрессии может в той или иной степени отражать число ППК. Поэтому для дополнительного подтверждения наших результатов в одном из экспериментов зародыши, достигшие ст. 33, были использованы для выделения тотальной РНК и последующей нозерн-гибридизации с зондом к Xpat. Для этой цели было использовано по 60 зародышей из каждой экспериментальной группы. Экспрессию Xpat и, в качестве контроля, EF-la оценивали с помощью нозерн-блот гибридизации. Экспрессия EF-la должна быть одинаковой у всех зародышей, находящихся на одной стадии развития, соответственно, интенсивность сигнала этого транскрипта отражает количество РНК каждого образца на гибридизационном фильтре. В связи с этим реальной оценкой уровня экспрессии Xpat мы считали отношение численных выражений уровней экспрессии Xpat: EF-la (табл. 1).

Таблица 1. Среднее количество ППК на эмбрион в экспериментальных группах;

уровень экспрессии Хра1.

интактный контроль инъециров. вода инъециров. мРНК БТОР инъециров. мРНК бегтеэ инъециров. мРНК ДЕРН инъециров. мРНК дьг

Количествово зародышей 105 67 68 81 80 29

Среднее количество клеток на зародыш 12,67 13,56 12,26 9,98 13,43 7,48

а (стандартное отклонение) 6,71 5,90 5,67 5,31 6,82 5,21

Относительное значение экспрессии маркера ППК Хра! в усл. ед. 15218 11213 10152 8785 10993 6981

Относительная экспрессия Хра1 е% относительно воды 135,7 100 90,5 78,3 98,0 62,3

Подсчет ППК в интактных зародышах обнаружил большую вариабельность по этому параметру в норме: разброс значений составил от 1 до 29 клеток. При этом большая часть зародышей

9

(60%) имеет ППК в количестве от 9 до 20 штук (среднее число ППК на зародыш - 12.67) (рис. 5В). Клетки мигрируют с вентральной стороны зародыша в дорсальном направлении справа и слева в наружном слое энтодермы и выглядят на зародышах стадии 33, как довольно компактная группа в области 15-20 сомита (рис. 5А, Б). Вариабельность также обнаружилась и в количестве мРНК Xpat на клетку - окрашенные пятпа сильно разнились по размеру (нередко в 2-4 раза) (см. рис. 5А, Б), причем зависимости между глубиной залегания ППК и интенсивностью сигнала Xpat в ней не было. Это исключает простое объяснение данного факта, как меньшая доступность мишеней для зонда, антител и субстрата в более глубоких слоях зародыша. Дабы убедиться в том, что каждое пятно, вне зависимости от размера, соответствует единственной клетке, был проведен анализ серийных гистологических срезов с нескольких контрольных зародышей (не показано). И действительно, в каждом окрашенном очаге обнаруживалось только одно ядро.

Инъекции воды и мРНК STOP не оказали существенного влияния на количество ППК на зародыш (13.56 и 12.26 соответственно), их расположение в ходе миграции и экспрессию Xpat (см. табл. 1 и рис. 6).

При оверэкспрессии мРНК Germes среднее количество ППК на зародыш снизилось до 10 (табл. 1). Косвенно подтвердила этот результат и пониженная экспрессия Xpat, выявленная с помощью нозерн-гибридизации (габл. 1).

Оверэкспрессия мутантной формы Germes, не содержащей EF-hand домена, не сказалась ни на количестве ППК, ни на уровне экспрессии Xpat (табл. 1). Как видно, феногип зародышей с оверэкспрессией GermesAEFH не повторяет фенотип зародышей с оверэкспрессией Germes дикого типа, напротив, данная делеция приводит к «улучшению» показателей — количество ППК и экспрессия Xpat возвращаются в норму. Видимо, данная форма Germes не способна реагировать на кальциевый сигнал и, соогветственно, проводить на него ответ.

Оверэкспрессия Germes с делецией лейциновых молний (ALZ) приводила к заметным фенотипическим эффектам. Понизилось среднее количество ППК (табл. 1), изменилась их способность к миграции. Отчетливо изменилось распределение эмбрионов но содержанию в них ППК (рис. 6). Примерно у трети зародышей in situ гибридизация с зондом против Xpat выявляла аномально крупные единичные окрашенные очаги (рис. 7). Размер их зачастую был на порядок больше, чем у ППК в любой другой экспериментальной и интактной группах зародышей. Их положение тоже было аномальным: вентральная сторона вблизи гастропора, в то время как они должны находиться ближе к спине и головному отделу; толща энтодермы вместо границы с боковой мезодермой. Подсчет ППК у этих зародышей показал, что их количество снижено почти вдвое (табл. 1). Как и при оверэкспрессии Germes, снижение количества ППК сопровождалось существенным падением уровня экспрессии Xpat (табл. 1).

А

вода и STOP

1-4. 5-8. 9-12. 13-16. 17-20. 21-24. 25-28. 29-32. 33-36. 37-40. кол-во ЛПК на зародыш

вода и Germes

кол-во ЛПК на зародыш

в

вода и AEFH

14 5-8 9 12 13-16 17 20 21 24 25-28 29-32 33 36 37 40 кол во ППК на зародыш

вода и ALZ

1 4 5-8 9-12 13-16 17 20 21 24 25-28 29-32 33-36 37-40 кол во ППК на зародыш

Рисунок 6. Распределение экспериментальных зародышей по содержанию ППК относительно контрольных. Приведенные данные демонстрируют распределение по содержанию ППК в зародышах, инъецированных мРНК STOP (A), Germes (Б), AEFH (В), AL7 (Г) Для сравнения показано распределение в одной из контрольных групп (зародыши, инъецированные водой)

Чтобы подтвердить фенотипические эффекты, оказанные на развитие ППК оверэкспрессией Germes и GermesALZ, мы провели еще один эксперимент, включивший 4 группы: интактный контроль и инъекции воды, мРНК Germes и мРНК GermesALZ. Его результаты повторяли все тенденции, обнаруженные ранее. В том числе очень сходным оказалось и распределение экспериментальных зародышей по содержанию в них ППК. Самое главное, как и прежде, в большой части зародышей из группы, инъецированной мРНК GermesALZ, (около трети) были обнаружены дефекты в миграции ППК (крупные единичные очаги экспрессии Xpat в толще энтодермы).

Рисунок 7. ППК в зародышах с оверэкспрессиеи GermesALZ. В эмбрионах, инъецированных мРНК ALZ, очень часто обнаруживается небольшое количество ППК в вентрально-каудальном отделе. Крупные очаги экспрессии Xpat указаны стрелками.

Гистологический анализ зародышей, инъецированныхмРНКGermesALZ.

Чтобы выяснить, что собой представляют Xpat-положителыше пятна в эмбрионах, экспрессирующих GermesALZ, был проведен гистологический анализ этих и контрольных эмбрионов после гибридизации in situ (рис. 8). В каждой группе было проанализировано по 6-7 зародышей. В результате обнаружились существенные различия в морфологии ППК между этими группами. Прежде всего бросается в глаза аномальное положение Xpat-позитивных клеток в эмбрионах, экспрессирующих GermesALZ: они находятся в толще энтодермы (рис. 8Г, Д), в то время как на этой стадии (ст. 33) ППК путем активной миграции должны были достигнуть боковых или верхних границ энтодермы с мезодермой [Bladder, 1958], что демонстрирует анализ интактных эмбрионов (рис. 8А,

Б).

Кроме положения клеток разительный контраст с контролем демонстрирует собственно морфология половой плазмы в экспериментальных зародышах: если в интактных эмбрионах

окрашенная по транскрипту Xpat половая плазма оказывается диспергированной между желточными гранулами, то у экспериментальных зародышей она сохраняет компактность и выглядит как гомогенное по структуре, свободное от желтка крупное образование. Учитывая еще и тот факт, что половая плазма у последних представлена всего одним-двумя очагами на весь эмбрион, получается, что она организована во что-то вроде неделимого блока. Следует еще раз подчеркнуть, что данный фенотип наблюдался только примерно у трети зародышей. Самым вероятным объяснением вариабельности этого фенотипа является слабая адресность инъецируемых транскриптов. Инъецируя мРНК флуоресцентных белков в вегетативное полушарие, мы не раз наблюдали, что данный белок экспрессируется в анимальном полушарии. Вероятно, водный раствор, в котором растворен транскрипт, «всплывает» на поверхность тяжелого желтка в почти свободную от нею анимальную цитоплазму. Соответственно, и при инъекции мРНК GermesALZ может происходить то же самое, а это значит, что доставка мРНК к половой плазме, заякоренной в эго время на вегетативном кортексе, малоэффективна.

Возвращаясь к организации половой плазмы у экспериментальных зародышей на стадии миграции ППК, хочется отметить, что только по большому объему плазмы судить об аномальности ее устройства нельзя. Работы восьмидесятых годов по нормальной морфологии ППК говорят о большом разнообразии по этому параметру: любая клетка зародышевого пути может как иметь морфологически четко выраженную половую плазму (организованную в безжелтковой околоядерной цитоплазме), так и не обладать таковой, со всеми промежуточными вариантами [Kamimura et al., 1980]. И тем не менее, в нашем случае налицо очевидная разница между контролем и опытом: окрашенная плазма отличается в них даже по цвету, что, возможно, говорит о разнице в концентрации мишени (транскрипт Xpat), что, в свою очередь, может говорить о разнице в плотности половой плазмы. Главным же фактом, свидетельствующим об аномальности наблюдаемой картины, несомненно, служит многоядерность окрашенных монолитов. Так, например, на рис. 8Е видно 2 ядра в одном очаге экспрессии Xpat (указаны галочками). К сожалению, на основании этих данных сделать окончательный вывод о том, являются ли эти образования многоядерными клетками или агрегатами нескольких клеток, нельзя, так как в ходе гибридизации in situ клеточные мембраны не сохраняются. Тем не мепее, окрашенные области структурно представляют из себя единое целое, и, соответственно, наиболее вероятное объяснение наблюдаемым фактам — это нарушение цитотомии, хотя нельзя полностью исключить и дефекты в расхождении клеток после митоза.

Известно, чго материал половой плазмы Xenopus во время дробления (начиная со ст. 8-16 бластомеров) наследуется дочерними клетками неравномерно, как правило целиком уходя к одному из полюсов веретена. К началу гаструляции он распределяется между 8-10 клетками, которые и основывают половую линию в данном эмбрионе. После этого механизм наследования половой плазмы

меняется - теперь дочерние клетки (это уже ПШС) делят ее пополам Митотическая активность этих клеток низка - они делятся еще только 2-3 раза до начала активной миграции [Айзенштадт, 1975] Таким образом не исключено, что мутантный Germes блокирует смену механизма наследования половой плазмы и нарушает процесс цитотомии, не препятствуя при этом делению ядер, что объясняло бы наличие двуядерных Xpat-позитивных клеток в зародышах, экспрессирующих GermesALZ

Рисунок 8. Гистологический анализ эмбрионов из контрольной и инъецированной ALZ мРНК групп. А-В - интактные зародыши, Г-Е - инъецированные ALZ мРНК Очаги экспрессии Xpat указаны стрелками, на большом увеличении (В, Е) ядра указаны галочками

Germes - часть белкового комплекса, образование которого необходимо для нормального развития ППК. Поскольку лейциновые застежки-молнии (LZ) являются доменами белок-белкового

взаимодействия, наличие в Germes этих мотивов позволяет предположить, что у него есть некий LZ-содержащий партнер. Удалив оба мотива лейциновых молний из Germes, мы нарушили его способность взаимодействовать с этим парнером. И именно эта мутантная форма обладала ярким доминантно-негативным эффектом, поскольку несмотря на наличие эндогенного белка дикого типа вызывала серьезные нарушения развития ППК. Похоже, что мутантный белок конкурировал с эндогенным за какой-то ресурс, изымая его из оборота, так как был при этом не в состоянии связаться со своим LZ-партнером. Трудно себе представить, что этим ресурсом могли бы быть ионы кальция -нужно огромное количество белка, чтобы связать их полностью. Тогда логичным кажется предположение, что Germes должен взаимодействовать еще с чем-то, этим ресурсом с большой вероятностью является другой белок. Таким образом получается, что Germes является частью многокомпонентного белкового комнлекса.

Поиск белковых партнеров Germes.

Поиск партнеров с помощью дрожжевой двугибридной системы.

Исследования последних лет свидетельствуют о том, что идентификация партнеров, взаимодействующих с изучаемым белком, часто позволяет сделать определенные выводы о его функциональной роли. Поэтому различные методы, позволяющие находить молекулы-партнеры, стали в последнее время очень популярным инструментом для функционального анализа генов. Одним из самых продуктивных методов является дрожжевая двугибридная система (ДДС). Это генетическая тест-система, позволяющая обнаруживать белковых партнеров за счет активации репортерных генов, опосредованной взаимодействием белковых химер, в состав каждой из которых кроме потенциального партнера входит по «половине» функционального транскрипционного фактора - ДНК-связьгвающий (ДС) и транскрипцию активирующий (ТА) домен.

Для нас поиск белковых партнеров Germes был особенно интересен, так как, основываясь на данных мутационного анализа, мы сделали предположение, что он участвует в образовании мультимолекулярного комплекса. Для поиска белковых партнеров Germes с помощью ДДС был изготовлен конструкт, кодирующий исследуемый белок, слитый с ДС доменом бактериального происхождения (LexA). Он был использован для скрининга библиотеки последовательностей из зрелого ооцита, слитых с вирусным ТА доменом (VP16). Результатом нескольких этапов этого скрининга стали 3 плазмиды, кодирующие белки, показавшие взаимодействие с Germes. Эти плазмиды были просеквенированы. Анализ полученных последовательностей в базах данных позволил идентифицировать белки, закодированные в них. Они оказались высокогомологичны легким цепям динеина dlc8a и dlc8b, а также гистону НЗ.З млекопитающих. Последний является неканоническим гистоном и участвует в огранизации транскрипционно активного хромагина [Henikoffet al., 2004].

Легкие цепи динеина (die) являются составными частями сложных моторных комплексов -динеина и миозина V [King, 2000]. Динеин обеспечивает транспорт вдоль микротрубочек, двигаясь к их минус-концу; миозин V является немышечным мотором микрофиламентов. Таким образом, данное взаимодействие связывает Germes с двумя основными системами цитоскелета в клетке. Существует несколько разновидностей легких цепей цитоплазматического динеина, но только dlc8 входят в состав как динеина, так и миозина V, обеспечивая вместе с другими компонентами грузоспецифичность данных моторных комплексов [King, 2000; Reek-Peterson et al, 2000]. У позвоночных животных есть 2 разновидности dlc8 - dlc8a и dlc8b. Это небольшие высококонсервативные молекулы, экспрессия которых может совпадать или не совпадать во времени и пространстве, в том числе и в развитии. У человека геномный анализ выявил наличие третьего гена в группе - dlc8c, однако его экспрессия пока не показана [Wilson et al, 2001].

Последний тест, с помощью которого необходимо подтвердить взаимодействие в рамках ДДС, - это реципрокное клонирование партнеров и тестирование на позитивный фенотип после трансформации их в дрожжи. Для этого на основе другой разновидности ДДС, в которой ДС- и ТА-домены представлены соответствующими частями дрожжевого транскрипционного фактора Gal4, были приготовлены следующие реципрокные конструкты:

ДС-Шс8а (PGBKT7-dlc8a), ДС-dlcSb (pGBKT7-dlc8b), ДС-НЗ.З (pGBKT7-H3.3) и TA-Germes (pGADT7-Germes).

После попарной трансформации в дрожжи этих конструктов взаимодействие с Germes подтвердили все 3 претендента, однако взаимодействие ДС-НЗ.З л TA-Germes, судя по позднему появлению колоний, было очень слабым.

Подтверждение взаимодействий. Данные, полученные в ДДС нельзя считать окончательными, так как это генетическая система, и действие иеспецифических факторов в ней выявить очень трудно. Поэтому общепринятой считается практика подтверждения обнаруженных взаимодействий вне ДДС [Toby, Golemis, 2001]. Чтобы показать это в нашей ситуации, мы решили использовать два подхода - колокализацию белков в клетках и коиммунопреципитацию.

Для микроскопического анализа совместного расположения белков необходимо сделать их» видимыми. Для этого можно сконструировать химеры этих белков с цветными флуоресцентными \ белками или с пептидными эшпопами, являющимися мишенями для коммерчески доступных антител. Мы решили использовать зеленый флуоресцентный белок (GFP) для визуализации Germes и НА-эпитоп - для его партнеров. В результате были сделаны следующие конструкты: pCS2+GFP-Germes, pCS2+HA-dIc8a, pCS2-fHA-dlc8b, pCS2->-HA-H3.3.

Через сутки после попарной котрансформации плазмид с партнерами в клетки млекопитающих их фиксировали и проводили иммуноокрашивание на НА-эпитоп. Вторичные антитела были коньюгированы с TRITC, так что после процедуры химерный Germes должен был флуоресцировать в зеленой, а его партнеры - в красной части спектра. Анализ взаимного расположения белков проводили с помощью конфокального микроскопа, В результате было показано, что Germes колокализуется с легкими цепями линейна, но не с гистоном НЗ.З. Таким образом, эти результаты подтверждают факт взаимодействия Germes с обеими dlc8, но ставят под сомнение взаимодействие Germes + гистон НЗ.З. Для того, чтобы сделать окончательные выводы, была проведена коиммунопреципитация Germes и его потенциальных партнеров.

Принцип коиммунопрецшштации заключается в том, что если 2 белка взаимодействуют in vivo и формируют некий стабильный физический комплекс, то при иммунопреципитации одного из них будет происходить осаждение и второго. Для проведения такого эксперимента необходимо наличие антител против одного из партнеров и системы детекции для другого. Последняя обычно проводится с помощью иммуноблоттинга и детекции второго партнера специфическими антителами. Поскольку мы не обладали антителами против Germes, dlc8a, dlc8b и НЗ.З, было решено использовать конструкты, кодирующие данные белки, меченные различными эпитопами. Для этого на основе вектора pCS2+MT была получена плазмида pCS2+MT-Germes, кодирующая Germes, слитый с myc-эпитопом. Кроме того, использовались полученные ранее pCS2+HA-dlc8a, pCS2+HA-dlc8b, pCS2+HA-H3.3. После in vitro транскрипции мРНК каждого из меченых партнеров и попарно мРНК партнеров и самого Germes инъецировали в ооциты или эмбрионы. Лизаты каждой из 6 полученных экспериментальных групп инкубировали с анти-МТ антителами и иммуноглобулин-связывающим белком G, коньюгированным с твердофазным носителем (сефароза). После этого связавшийся с сефарозой материал несколько раз промывали, денатурировали, разделяли в полиакриламидном геле и переносили на мембрану. Последнюю в дальнейшем обрабатывали анти-НА антителами и таким образом выявляли наличие НА-dlc8a, HA-dlc8b, НА-НЗ.З в образцах, преципитированных с анти-МТ антителами.

Результаты этих экспериментов представлены на рис. 9. Оказалось, что ни в ооцитах (рис. 9А-4), ни в эмбрионах (данные не приведены) взаимодействие Germes и гистона НЗ.З показать не удается, при этом показано, что все белки в системе экспрессируются (рис. 9А-6; в эмбрионах и для Germes данные не представлены). Таким образом, учитывая результаты предыдущего эксперимента, можно заключить, что детектировать взаимодействие Germes + гистон НЗ.З другими методами кроме ДЦС не удается. Вероятно, этого взаимодействия in vivo не существует.

Однако нам удалось доказать взаимодействие Germes с легкими цепями динеина. Удивительным оказалось различие в способности Germes связывать индивидуальные dlc8 в зависимости от использовавшегося материала. Так, из лизатов ооцитов удается преципитировать

Germes с dlc8b (рис. 9A-2), но не с dlc8a (рис. 9А-3). При этом в контроле, экспрессирующем только dlc8b преципитации этого белка не происходит (рис. 9А-1), что исключает вероятность осаждения dlc8b в результате неспецифических взаимодействий с МТ-антителами или сефарозой. В то же время в эмбрионах Germes связывается как с dlc8b, так и с dlc8a (рис. 9Б-3, 5); специфичность преципитации также показана с помощью соответствующих контролен (рис. 9Б-4, 6).

Анализ взаимодействия Germes с легкими цепями динеина с помощью ДДС.

Точная информация об участке белковой последовательности Germes, взаимодействующей с

dlc8a/b, представляет значительный интерес. Она позволит в будущем провести дополнительный

мутационный анализ, чтобы выяснить, как меняется развитие ППК при нарушении способности

Germes взаимодействовагь с цитоскелетом.

Для поиска такого специфического участка мы использовали ДЦС и набор конструктов с

различными делениями в Germes. Прежде всего было показано, что использовавшиеся в настоящей

19

работе мутантные формы гена сохраняли способность взаимодействовать с легкими цепями динсина, и, соответственно, нарушение этих взаимодействий не было причиной наблюдаемых нами эффектов. Для этого были получены следующие конструкты:

pGBKT7-Germes, pGBKT7-GermesStop, pGBKT7-Germes-LZs, pGBKT7-Germes-EFh. Вместе с имевшимися плазмидами pVP16-dlc8a и pVP16-dlc8b они были использованы для попарной трансформации в дрожжи с последующей оценкой активации репортеров. Как и ожидалось, отсутствие лейциновых молний или EF-hand домена не сказалось на способности Germes взаимодействовать с d!c8a/b. Однако pGBKT7-GermesStop, кодирующая ДС-домен, слитый с первыми 50 а.о. Germes, при котрансформации с pVP16-dlc8a/b не активировала репортерные гены. Следовательно, ни первые 50 а.о. Germes, ни последовательности лейциновых молний и EF-hand домена не содержаг участка, обеспечивающего его взаимодействие с легкими цепями динеина. Для поиска этого участка было изготовлено несколько плазмид, в которых ДС-домен был слит с различными участками Germes:

pGBKT7-N-Germes (содержит N-концевую половину Germes, a.o. 1 -275), pGBKT7-C-Germes (содержит С-кояцевую половину Germes, a.o. 27б-587), pGBKT7-Cs-Germes (содержит внутреннюю часть C-Germes, включая мотивы лейциновых застежек-молний и часть EF-hand домена, а.о. 27б-477).

Полученные конструкты использовались для трансформации в дрожжи попарно с pVP16-dlc8a/b и последующей оценки взаимодействия. В результате, оказалось, что N-концевая часть Germes не взаимодействует с легкими цепями динеина, а С-концевая взаимодействует. Более того, пары Cs-Germes + dlc8a/b также активировали репортерные гены. Значит, последовательность аминокислот в Germes, с которой взаимодействуют dlc8 закодирована в промежутке от 1106 до 1709 п.о. и находится между 275 и 477 а.о., исключая мотивы лейциновых молний.

В литературе описано 2 консенсусные последовательности, с которыми могут взаимодействовать dlc8 [Wu, King, 2003]. Это K/R_X_T_Q_T для динеина, проапоптотического белка Bim и swallow и G_I_Q_V_D_R для nNOS. Анализ аминокислотной последовательности Germes, представленной в Cs-Germes, показал, что описанные мотивы для взаимодействия с dlc8 там отсутствуют. Следовательно, взаимодействие Germes с легкими цепями динеина обеспечивается за счет нового, ранее неописанного аминокислотного консенсуса.

Возможнаяроль Germes вразвит и и ППК. Итак, взаимодействие Germes + dlc8 было показано тремя различными способами, что мы считаем достаточным доказательством существования такого партнерства in vivo. Эти данные хорошо согласуются с ранее сделанным предположением о том, что Germes организует на себе сложный

молекулярный комплекс. Это событие необходимо для нормального развития половых клеток. Можно сделать предположение, что легкие цепи динеина связывают этот комплекс с цитоскелетом. Мутационный анализ, выявивший важную роль Germes в морфологии половой плазмы в ППК (рис. 8), и новые данные по белковым партнерам Germes позволяют предположить, что он является адаптером между половой плазмой и цитоскелетом. Действительно, экспрессия мутантной формы белка вызывала формирование крупных неделимых агрегатов половой плазмы, зачастую связанных с несколькими ядрами. Такие нарушения так или иначе должны быть связаны с цитоскелетом.

Еще более интересной ситуацию делает тот факт, что Germes может быть связан как с микротрубочками через динеин, так и с микрофиламентами через миозин V. Совсем недавно было показано, что в клетках млекопитающих легкие цепи динеина dlc8a и dlc8b имеют разное сродство к динеину и миозину V - in vivo dlc8b (известная также как dlc2) обнаруживается в комплексе только с миозином V, a dlc8a (по другой классификации - dlcl) - преимущественно с линейном [Day et al, 2004]. Такая селективность открывает возможности для регуляции связи клеточных грузов с разными компонентами цитоскелета и в конечном счете - доставки в различные компартменты клетки. В случае с Germes наличие подобного механизма могло бы лежать в основе структурных перестроек половой плазмы, необходимых для нормального развития ППК.

Формирование и функционирование половой плазмы в раннем развитии тесно связано с цитоскелетом: несколько важных событий осуществляется за счет перестроек цитоскелета и/или изменения в связях последнего с зародышевой плазмой. Прежде всего это перестройки, связанные с агрегацией половой плазмы. Это многоступенчатый процесс, который начинается еще во время созревания ооцита, когда небольшие агрегаты митохондрий и половой плазмы, присутствующие на вегетативной поверхности ооцита, сливаются и образуют отдельные островки зародышевой плазмы [Czolowska, 1969J; эти процессы идут в вегетативном кортексе. После оплодотворения островки половой плазмы высвобождаются из кортекса и двигаются в сторону вегетативного полюса, сливаясь по ходу и образуя в конечном счете 2-8 (обычно 4) крупных комплексов. Было показано, что эта процессы связаны с волнами поверхностного сокращения, прохождение которых связано с деполимеризацией субкортикальных микротрубочек [Quaas, Wylie, 2002].

Другое событие, связанное с глобальными перестройками в морфологии половой плазмы, происходит в начале гаструляции, когда она декомпактизустся и переходит из примембранного в перинуклеарное (околоядерное) пространство будущей половой клетки [Bladder, 1958]. Очевидно, что во всех этих процессах самое активное участие должен принимать цитоскелет, причем на разных этапах свой вклад могут вносить все 3 системы филаментов в клетке. Соответственно, должен существовать механизм, который бы контролировал взаимотношения половой плазмы и цитоскелета.

Как уже отмечалось, на роль регулятора этих взаимоотношений мог бы претендовать Germes, обладающий способностью связываться с легкими цепями динеина, причем, его сродство к индивидуальным dlc8 изменяется в развитии (рис. 9). Однако непонятно, есть ли различия в способности легких цепей динеина связывать моторы у амфибий, как у млекопитающих. Известно, что у последних селективность dlc8 к мотору определяется единственной аминокислотой в положении 41 [Day et al., 2004]. У dlc8a это гистидин, а у dlc8b - тирозин. Для того чтобы прояснить этот вопрос, мы провели анализ последовательностей dlc8a и dlc8b у мыши и шпорцевой лягушки. Оказалось, что в последовательности dlc8b нет ни одной аминокислотной замены, в том числе и в положении 41 - и у Xenopus и у мыши там находится тирозин. Однако 41 аминокислота в Xdlc8a отличается от таковой в Mdlc8a - в первом случае там находится фенилаланин. Это различие оставляет вопрос о регуляции связи легких цепей динеина с моторами у лягушки открытым. Однако это не исключает возможность для Germes выступать регуляторным адаптором между половой плазмой и цитоскелетом. Детальный анализ взаимодействия Germes с моторными комплексами - предмет будущих исследований.

выводы

1. Определена длина вегетативно локализованной мРНК нового гена шпорцевой лягушки. Детальный анализ экспрессии гена, названного нами Germes, показал, что его трапскрипт является компонентом половой плазмы шпорцевой лягушки с начальных этапов оогенеза (ст.И) до стадии нейрулы.

2. Получены мутантные формы Germes. С помощью мутационного анализа показано, что инъекция мРНК Germes с делецией лейциновых застежек-молний вызывает нарушения в количестве ППК, их способности к миграции, а также в морфологии половой плазмы на стадиях мшрации.

3. С помощью дрожжевой двугибридной системы обнаружено 3 вероятных белковых партнера Germes. Анализ первичных последовательностей их кДНК показал, что они являются ранее неописанными для Xenopus laevis гомологами легких цепей динеина (DIc8a, Dlc8b) и гистона НЗ.З млекопитающих.

4. Дополнительный анализ с помощью коиммунопрещшитации и колокализации белков показал, что с Germes действительно взаимодействуют только 2 из 3 обнаруженных претендентов -легкие цепи динеина dlc8a и dlc8b, являющиеся составными частями крупных моторных комплексов в клетке - динеина и миозина V.

5. С помощью делсционного анализа показано, что dlc8 взаимодействуют с участком в С-концевой половине Germes, не входящим в состав лейциновых застежек-молний и EF-hand домена.

Список публикаций по теме диссертации

1. LA Berekelya, M.B. Ponomarev, N.N. Luchinskaya, A.V. Belyavsky. Xenopus Germes encodes a novel germ plasm-associated transcript. Gene Expression Patterns, 2003, v. 3, p. 521-524.

2. ЛА Берекеля, М.Б. Пономарев, Н.Н. Лучинская, А.В. Белявский. Получение кДНК и анализ пространственной экспрессии нового материнского гена шпорцевой лягушки Xenopus laevis, активного на ранних стадиях развития в вегетативной области зародышей. XIII зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 7-9 февраля 2001 г. Тезисы докладов и стендовых сообщений, с. 14.

3. АА Микрюков, Л.А. Берекеля, М.Б. Пономарев, Н.Н. Лучинская. Исследование влияния оверэкспрессии гена Germes на поведение зародышевой плазмы и образование первичных половых клеток. 7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 14-18 апреля 2003 г. Сборник тезисов, с. 353.

4. H.R. Woodland, W.M. Moore, R. Hames, R.J. Machado, LA Berekelya, AA Mikryukov, M.B. Ponomarev, N.N. Luchinskaya, A.V. Belyavsky. The formation of the germ plasm and PGCs in Xenopus. 10th International Xenopus Meeting. Woods Hole, USA, September 14th-18th 2004. Abstract book, p. 17.

Подписано в печать 12.11.2004 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 ус л. пл.

Тираж 100 экз. Заказ № 184 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д. 1 Главное здание МГУ, к. 102

12408®

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Берекеля, Любовь Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6 Детерминанты вегетативного полушария Xenopus laevis: локализация и функции

Перемещение детерминант на вегетативный кортекс ооцита

Половая плазма и митохондриальное облако

Детерминанты осевого комплекса

Вегетативно локализованные мРНК

Связь детерминант с кортексом ооцита после созревания

Кортикальный поворот

Волны поверхностного сокращения

Формирование первичных половых клеток

Индукция de novo

Половая плазма и закладка ППК

Насекомые

Бесхвостые амфибии

Рыбы и птицы

Гены, задействованные в формировании половых клеток

Drosophila

С. elegans

Xenopus laevis

Птицы и млекопитающие

Миграция первичных половых клеток

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение зародышевого материала

Клонирование гена Germes

Быстрая амплификация 5 '-конца кДНК (5 '-RACE)

Получение полноразмерной кДНК

Секвенирование, анализ последовательностей кДНК и белков

Нозерн-блот анализ

Гибридизация in situ

Подготовка матрицы

Синтез зонда

Гибридизация

Микроинъекции мРНК Germes, его мутантных форм или его партнеров в эмбрионы и ооциты шпорцевой лягушки

Гистологический анализ

Манипуляции с ДНК, клонирование ДНК

Электрофорез в агарозном геле

Рестрикция

Зачистка концов фрагментом Кленова

Дефосфорилирование

Лигирование

Трансформация компетентных клеток

Получение мутантных форм Germes

Создание генетических конструктов в экспрессионных плазмидных векторах

Дрожжевая двугибридная система

Описание системы

Среды и растворы

Трансформация дрожжей

Трансформация библиотеки

Выделение плазмид из дрожжей

Колокализация белков в клетках млекопитающих

Культивирование клеток млекопитающих

Иммуноокрашивание клеток на покровных стеклах

Коиммунопреципитация

Иммуноблоттинг

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Клонирование нового гена Xenopus laevis

Анализ временной и пространственной экспрессии гена

Анализ влияния оверэкспрессии Germes дикого типа и его мутантных форм на формирование и миграцию ППК

Получение мутантных форм Germes

Анализ влияния оверэкспрессии различных форм Germes на развитие ППК

Гистологический анализ зародышей, инъецированных мРНК GermesЛ LZ

Germes - часть белкового комплекса, образование которого необходимо для нормального развития ППК

Поиск белковых партнеров Germes

Поиск партнеров с помощью дрожжевой двугибридной системы

Подтверждение взаимодействий 81 Анализ взаимодействия Germes с легкими цепями динеина с помощью ДДС

Возможная роль Germes в развитии ППК

ВЫВОДЫ

Заключение Диссертация по теме "Биология развития, эмбриология", Берекеля, Любовь Александровна

выводы

1. Определена длина вегетативно локализованной мРНК нового гена шпорцевой лягушки. Детальный анализ экспрессии гена, названного нами Germes, показал, что его транскрипт является компонентом половой плазмы шпорцевой лягушки с начальных этапов оогенеза (ст.Н) до стадии нейрулы.

2. Получены мутантные формы Germes. С помощью мутационного анализа показано, что инъекция мРНК Germes с делецией лейциновых застежек-молний вызывает нарушения в количестве ППК, их способности к миграции, а также в морфологии половой плазмы на стадиях миграции.

3. С помощью дрожжевой двугибридной системы обнаружено 3 вероятных белковых партнера Germes. Анализ первичных последовательностей их кДНК показал, что они являются ранее неописанными для Xenopus laevis гомологами легких цепей динеина (Dlc8a, Dlc8b) и гистона НЗ.З млекопитающих.

4. Дополнительный анализ с помощью коиммунопреципитации и колокализации белков показал, что с Germes действительно взаимодействуют только 2 из 3 обнаруженных претендентов - легкие цепи динеина dlc8a и dlc8b, являющиеся составными частями крупных моторных комплексов в клетке - динеина и миозина V.

5. С помощью делеционного анализа показано, что dlc8 взаимодействуют с участком в С-концевой половине Germes, не входящим в состав лейциновых застежек-молний и EF-hand домена.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Берекеля, Любовь Александровна, Москва

1. Айзенштадт Т.Б. Современные представления о детерминантах клеток зародышевого пути // Онтогенез 1975. Т. 6. №5. С. 427-441.

2. Белоусов JI.B. Основы общей эмбриологии // М.: Изд-во МГУ. 1993. Гилберт С. Биология развития // М.: Мир. 1993.

3. Иванова Н.Б., Лучинская Н.Н., Попсуева А.Э., Пономарев Е.Д., Белявский А.В.

4. Blackler A.W. Contribution to the study of germ-cells in the Anura II J. Embryol. Exp. Morphol. 1958. V. 6. P. 491-503.

5. Braat A.K., Zandbergen Т., van de Water S., Goos H.J., Zivkovic D. Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA // Dev. Dyn. 1999. V. 216. P. 153-167.

6. Brent R., Ptashne M. A eukaryotic transcriptional activator bearing the DNA specificity of a prokaryotic repressor // Cell 1985. V. 43. P. 729-736.

7. Bounoure L. Recherches sur la lignee germinale chez la grenouille fousse aux premiers stades du developpement//Ann. sci. natur. 1934. V. 17. P. 67-248.

8. Bounoure L., Aubry R., Huck M.L. Nouvelles recherches experimentales sur les origins de la lignee reproductice chez la grenouille rousse // J. Embryol. and Exp. Morphol., 1954. V. 2. P. 245263.

9. Bovery T. On multipolar mitosis as a means of analysis of the cell nucleus // Quoted in Foundations of Experimental Embryology. 1902.

10. Chan A.P., Kloc M., Bilinski S., Etkin L.D. The vegetally localized mRNA fatvg is associated with the germ plasm in the early embryo and is later expressed in the fat body // Mech. Dev. 2001. V. 100. P. 137-140.

11. Chan A.P., Kloc M., Etkin L.D. Fatvg encodes a new localized RNA that uses a 25-nucleotide element (FVLE1) to localize to the vegetal cortex of Xenopus oocytes // Development 1999. V. 126. P. 4943-4953.

12. Chang P., LeGuellec K., Houliston E. Immunodetection of cytoskeletal structures and the Eg5 motor protein on deep-etch replicas of Xenopus egg cortices isolated during the cortical rotation // Biol. Cell 1996. V. 88. P. 89-98.

13. Chang H., Matzuk M.M. Smad5 is required for mouse primordial germ cell development // Mech. Dev. 2001. V. 104. P. 61-67.

14. Chang P., Perez-Mongiovi D., Houliston E. Organisation of Xenopus oocyte and egg cortices // Micr. Res. Tech. 1999. V. 44. P. 415-429.

15. Cleine J. Replacement of posterior by anterior endoderm reduces sterility in embryos from inverted eggs of Xenopus laevis II J. Embryol. Exp. Morphol. 1986. V. 94. P. 83-93.

16. Cleine J.H., Dixon K.E. The effect of egg rotation on the differentiation of primordial germ cells in Xenopus laevis II J. Embryol. Exp. Morphol. 1985. V. 90. P. 79-99.

17. Czolowska R. Observations on the origin of the "germinal cytoplasm" in Xenopus laevis II J. Embryol. Exp. Morphol. 1969. V. 22. P. 229-251.

18. Dale L., Matthews G., Colman A. Secretion and mesoderm-inducing activity of theTGFP-related domain of Xenopus Vgl // EMBO J. 1993. V. 12. P. 4471-4480.

19. Darras S., Marikawa Y., Elinson R.P., Lemaire P. Animal and vegetal pole cells of early Xenopus embryos respond differently to maternal dorsal determinants: implications for the patterning of the organizer // Development 1997. V. 124. P. 4275-4286.

20. Day C.L., Puthalakath H., Skea G., Strasser A., Barsukov I., Lian L.Y., Huang D.C.S., Hinds M.G. Localization of dynein light chains 1 and 2 and their pro-apoptotic ligands // Biochem. J. 2004. V. 377. P. 597-605.

21. Denis H. Cytosquelette et polarite ovulaire // Med. Sci. 1996. V.12. P. 1145-1158.

22. Deshler J., Highett M., Schnapp B. Localization of Xenopus Vgl mRNA by Vera protein and theendoplasmic reticulum // Science 1997. V. 276. P. 1128-1131.

23. Elinson R.P., Rowning B. A transient array of parallel microtubules in frog eggs: potential tracks for a cytoplasmic rotation that specifies the dorso-ventral axis // Dev. Biol. 1988. V. 128. P. 185197.

24. Ephrussy A., Lehmann R. Induction of germ cell formation by oskar // Nature 1992. V. 358. P. 387-392.

25. Fujisue M., Kobayakawa Y., Yamana K. Occurrence of dorsal axis-inducing activity around the vegetal pole of an uncleaved Xenopus egg and displacement to the equatorial region by cortical rotation II Development 1993. V. 118. P. 163-170.

26. Gerhart J., Danilchik M., Doniach T., Roberts S., Rowning B., Stewart R. Cortical rotation of the Xenopus egg: consequences for the anteroposterior pattern of embryonic dorsal development // Development 1989. V. 107. P. 37-51.

27. Havin L., Git A., Elisha Z., Oberman F., Yaniv K., Pressmen Schwartz S., Standart N., Yisraeli J.K. RNA-binding protein conserved in both microtubule- and microfilament-based RNA localization // Genes Dev. 1998. V. 12. P. 1593-1598.

28. Hay B., Jan L.Y., Jan Y.N. A protein component of Drosophila polar granules is encoded by vasa and has extensive sequence similarity to ATP-dependent helicases // Cell 1988. V. 55(4). P. 577587.

29. Hegner R.W. Experiments with chrysomelid beetles. 3. The effects of killing parts of the eggs of Leptinotarsa decemlineata II Biol. Bull. 1911. V. 20. P. 237-251.

30. Heldin C.H., Miyazono K., ten Dijke P. TGF-p signaling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins // Nature 1997. V. 390. P. 465-471.

31. Henikoff S., Furuyama T., Ahmad K. Histone variants, nucleosome assembly and epigenetic inheritance // Trends Genet. 2004. V. 20. P. 320-326.

32. Hogan B.L. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development // Genes Dev. 1996. V. 10. P. 1580-1594.

33. Horb M.E., Thomsen G.H. A vegetally localized T-box transcription factor in Xenopus eggs specifies mesoderm and endoderm and is essential for embryonic mesoderm formation // Development 1997. V. 124. P. 1689-1698.

34. Houliston E., Elinson R.P. Patterns of microtubule polymerization relating to cortical rotation in Xenopus laevis eggs // Development 1991. V. 112. P. 107-117.

35. Houston D.W., Zhang J., Maines J.S., Wasserman S.A., King M.L. A Xenopus DAZ-like gene encodes an RNA component of germ plasm and is a functional homologue of Drosophila boule // Development 1998. V. 125. P. 171-180.

36. Joseph E.M., Melton D.A. Mutant Vgl ligands disrupt endoderm and mesoderm formation in Xenopus embryos // Development 1998. V. 125. P. 2677-2685.

37. Kageura H. Activation of dorsal development by contact between the cortical dorsal determinant and the equatorial core cytoplasm in eggs of Xenopus laevis II Development 1998. V. 124. P. 15431551.

38. Kamimura M., Kotani M., Yamagata K. The migration of presumptive primordial germ cells throygh the endodermal cell mass in Xenopus laevis: a light and electron microscopic study // J. Embryol. Exp. Morph. 1980. V. 59. P. 1-17.

39. Karashima T., Sugimoto A., Yamamoto M. Caenorhabditis elegans homologue of the human azoospermia factor DAZ is required for oogenesis but not for spermatogenesis // Development 2000. V. 127. P. 1069-1079.

40. Kashikawa M., Amikura R. Kobayashi S. Mitochondrial small ribosomal RNA is a component ofgerminal granules in Xenopus embryos // Mech. Dev. 2001. V. 101. P. 71-77.

41. Keshet E., Lyman S.D., Williams D.E., Anderson D.M., Jenkins N.A., Copeland N.G., Parada

42. F. Embryonic RNA expression patterns of the c-kit receptor and its cognate ligand suggestmultiple functional roles in mouse development//EMBO J. 1991. V. 10. P. 2425-2435.

43. Kikkawa M., Takano K., Shinagawa A. Location and behavior of dorsal determinants during firstcell cycle in Xenopus eggs // Development 1996. V. 122. P. 3687-3696.

44. King S.M. The dynein microtubule motor // Biochim. Biophys. Acta 2000. V. 1496. P. 60-75.

45. Kloc M., Dougherty M.T., Bilinsky S., Chan A.P., Brey E., King M.L., Patrick C.W. Jr., Etkin

46. D. Three-dimensional ultrastructural analysis of RNA distribution within gernimal granules of

47. Xenopus II Dev. Biol. 2002. V. 241. P. 79-93.

48. Kloc M., Etkin L.D. Derealization of Vgl mRNA from the vegetal cortex in Xenopus oocytes after destruction of Xlsirt RNA // Science 1994. V. 265. P. 1101-1103.

49. Kloc M., Etkin L.D. Two distinct pathways for the localization of RNAs at the vegetal cortex in Xenopus oocytes // Development 1995. V. 121(2). P. 287-297.

50. Kloc M., Etkin L.D. Apparent continuity between the messenger transport organizer and late RNA localization pathways during oogenesis in Xenopus //Mech. Dev. 1998. V. 73. P. 95-106.

51. KIoc M., Larabell C., Etkin L.D. Elaboration of the messenger transport organizer pathway for localization of RNA to the vegetal cortex of Xenopus oocytes // Dev. Biol. 1996. V. 180. P. 119130.

52. Mahowald A.P. Polar granules of Drosophila: 3. The continuity of polar granules during the life cycle of Drosophila II J. Exp. Zool. 1971. V. 176(3). P. 329-343.

53. Mahowald A.P., Hennen S. Ultrastructure of the "germ plasm" in eggs and embryos of Rana pipiens II Dev. Biol. 1971. V. 24(1). P. 37-53.

54. Marikawa Y., Li Y., Elinson R.P. Dorsal determinants in the Xenopus egg are firmly associated with the vegetal cortex and behave like activators of the Wnt pathway // Dev. Biol. 1997. V. 191. P. 69-79.

55. Massague J., Chen Y.G. Controlling TGF-p signaling II Genes Dev. 2000. V. 14. P. 627-644. Matova N., Cooley L. Comparative aspects of animal oogenesis // Developmental Biology 2001. V. 231(2). P. 291-320.

56. Molyneaux K.A., Zinszner H., Kunwar P.S., Schaible K., Stebler J., Sunshine M.J., O'Brien

57. W., Raz E., Littman D., Wylie C., Lehman 11 R. The chemokine SDF1/CXCL12 and its receptor CXCR4 regulate mouse germ cell migration and survival // Development 2003. V. 130. P. 42794286.

58. Mosquera L., Forristall C., Zhou Y., King M.L. A mRNA localized to the vegetal cortex of Xenopus oocytes encodes a protein with a nanos-like zinc finger domain // Development 1993. V. 117. P. 377-386.

59. Okada M., Kleinman I.A., Schneiderman H.A. Chimeric Drosophila adults produced by transplantation of nuclei into specific regions of fertilized eggs // Dev. Biol. 1974. V. 39(2). P. 286294.

60. Reek-Peterson S. L., Provance D.W. Jr., Mooseker M.S., Mercer J.A. Class V myosins // Biochim. Biophys. Acta 2000. V. 1496. P. 36-51.

61. Ressom R.E., Dixon K.E. Relocation and reorganization of germ plasm in Xenopus embryos after fertilization // Development 1988. V. 103. P. 507-518.

62. Robb D.L., Heasman J., Raats J., Wylie C. A kinesin-like protein is required for germ plasm aggregation in Xenopus II Cell 1996. V. 87. P. 823-831.

63. Robin C. Memoire sur la production des cellules du blastoderme sans segmentation du vitellus chez quelques articules // C. r. Acad. Sci. 1862. V. 54. P. 150-153.

64. Rowning B.A., Wells J., Wu M., Gerhart J.C., Moon R.T., Larabell C.A. Microtubule-mediated transport of organelles and location of beta-catenin to the future dorsal side of Xenopus eggs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997. V. 94. P. 1224-1229.

65. Ruggiu M., Speed R., Taggart M., McKay S.J., Kilanowski F., Saunders P., Dorin J., Cooke

66. H. J. The mouse Dazla gene encodes a cytoplasmic protein essential for gametogenesis // Nature 1997. V. 389. P. 73-77.

67. Saitou M., Barton S.C., Surani M.A. A molecular programme for the specification of germ cell fate in mice // Nature 2002. V. 418. P. 282-283.

68. Sakai M. The vegetal determinants required for the Spemann organiser move equatorially during the first cell cycle //Development 1996. V.122. P. 2207-2214.

69. Sam brook J., Russell D. Molecular cloning: a laboratory manual // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 2001.

70. Schroeder M.M., Gard D.L. Organization and regulation of cortical microtubules during the first cell cycle of Xenopus eggs II Development 1992. V. 114. P. 699-709.

71. Seydoux G., Dunn M. Transcriptionally repressed germ cells lack a subpopulation of phosphorilated RNA polymerase II in early embryos of C.elegans and Drosophila // Development 1997. V. 124. P. 2191-2201.

72. Smith L.D. The role of a "germinal plasm" in the formation of primordial germ cells in Rana pipiens II Dev. Biol. 1966. V. 14(2). P. 330-347.

73. Stennard F., Carnac G., Gurdon J.B. A Xenopus T-box gene, antipodean, encodes a vegetal ly localized maternal mRNA that can trigger mesoderm formation // Development 1996. V. 122. P. 2359-2366.

74. Tam P.P., Zhou S.X. The allocation of epiblast cells to ectodermal and germ-line lineages is influenced by the position of the cells in the gastrulating mouse embryo // Dev. Biol. 1996. V. 178. P. 124-134.

75. Thomsen G.H., Melton D.A. Processed Vgl protein is an axial mesoderm inducer in Xenopus II Cell 1993. V. 74. P. 433-441.

76. Van Doren M., Broiher H., Moore L., Lehmann R. HMG-CoA reductase guides migrating primordial germ cells // Nature 1997. V. 396. P. 466-469.

77. Wilson M.J., Salata M.W., Susalka S.J., Pfister K.K. Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains // Cell Motil. Cytoskeleton 2001. V. 49. P. 229-240.

78. Wu H., King S.M. Backbone dynamics of dynein light chains // Cell Motil. Cytoskeleton 2003. V. 54. P. 267-273.

79. Wylie C.C., Heasman J., Snape A., O'Driscoll M., Holwill S. Primordial germ cells of Xenopus laevis are not ineversibly determined early in development // Developmental Biology 1985. V. 112. P. 66-72.

80. Ying Y., Zhao G.Q. Cooperation of endoderm-derived Bmp2 and extraembryonic ectoderm-derived Bmp4 in primordial germ cell generation in the mouse // Dev. Biol. 2001. V. 232. P. 484492.

81. Yisraeli J.K., Sokol S., Melton D.A. The process of localizing of maternal messenger RNA in Xenopus oocytes // Development 1989. V. 107. P. 31-36.

82. Yisraeli J.K., Sokol S., Melton D.A. A two-step model for the localization of maternal mRNA in Xenopus oocytes: involvement of microtubules and microfilaments in the translocation and anchoring of Vgl mRNA // Development 1990. V. 108. P. 289-298.

83. Yoneda M., Kobayakawa Y., Kubota H., Sakai M. Surface contraction waves in amphibian eggs // J. Cell Sci. 1982. V. 54. P. 35-46.

84. Zalokar M. Transplantation of nuclei into the polar plasm of Drosophila eggs // Dev. Biol. 1973. V. 32(1). P. 189-193.

85. Zernicka-Goetz M. Fertile offspring derived from mammalian eggs lacking either animal or vegetal poles // Development 1998. V. 125. P. 4803-4808.

86. Zhang J., King M.L. Xenopus VegT RNA is localized to the vegetal cortex during oogenesis and encodes a novel T-box transcription factor involved in mesodermal patterning // Development 1996. V. 122. P. 4119-4129.

87. Zhao G.Q., Garbers D.L. Male germ cell specification and differentiation // Developmental Cell 2002. V. 2. P. 537-547.

88. Zhou Y., King M.L. RNA transport to the vegetal cortex of Xenopus oocytes // Dev. Biol. 1996. V. 179. P. 173-183.