Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск и изучение транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию гомеобоксного гена Xanf-1 в развитии головного мозга у шпорцевой лягушки

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Поиск и изучение транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию гомеобоксного гена Xanf-1 в развитии головного мозга у шпорцевой лягушки"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М.ШЕМЯКИНА И ЮА.ОВЧИШШКОВА

На правах рукописи

Мартынова Наталья Юрьевна

Поиск и изучение транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию гомеобоксного гена Хап/-1 в развитии головного мозга у шпорцевой лягушки.

Специальность - 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2005

Работа выполнена в группе молекулярных основ эмбриогенеза Института биоорганической химии

им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Зарайский А. Г.

Официальные оппоненты:

чл.-корр РАН, доктор биологических наук Лукьянов С.А. чл.-корр РАН, доктор биологических наук Корочкин Л.И.

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова

Защита состоится

2005 года в

<0

часов на заседании

специализированного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16-10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета, доктор химических наук, профессор В. А. Несмеянов

Актуальность проблемы

Выяснение молекулярно-генетических механизмов раннего развития головного мозга -одна из фундаментальных задач функциональной геномики. Знание этих механизмов также важно для понимания природы многих наследственных заболеваний у человека.

Среди всех отделов головного мозга в наименьшей степени изучены механизмы развития т.н. переднего мозга. Вместе с тем, выяснение именно этих механизмов крайне важно ввиду того, что передний мозг отвечает за высшие формы нервной деятельности, в том числе, за мышление у человека. Кроме того, передний мозг является одним из основных анатомических признаков, отличающих позвоночных животных от всех других организмов. Поэтому изучение механизмов его развития важно для понимания особенностей эволюции типа позвоночных животных в целом.

Эффективным подходом к решению указанной задачи может быть поиск и изучение функций регуляторных белков, определяющих пространственно-временное "расписание" дифференцировки клеток в зачатке переднего мозга.

Ранее, в группе молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН, был идентифицирован новый класс гомеодоменных транскрипционных факторов, Anf, ответственных за наиболее раннюю стадию развития зачатка переднего мозга. На модели эмбрионов шпорцевой лягушки было показано, что представитель данного класса транскрипционных факторов, Xanf-1, играет ключевую роль в развитии зачатка переднего мозга, а искусственно вызванная активация гена вне зоны его нормальной экспрессии - в

передней части нервной пластинки - приводит к серьезным аномалиям переднего мозга.

В связи с этим, первой актуальной задачей является поиск и изучение функций специфических транскрипционных факторов, обеспечивающих строгую пространственную локализацию экспрессии в границах будущего зачатка

переднего мозга.

Поскольку решение данной задачи сопряжено со значительными трудностями, обусловленными, прежде всего, малыми размерами раннего зачатка переднего мозга и, как следствие, весьма низкой копийностью искомых транскрипционных факторов, второй актуальной технической задачей является разработка методики, позволяющей проводить систематический поиск таких факторов с помощью экспрессионных кДНК библиотек эмбриональных клеток.

Решение этих двух задач представляется важным не только для выяснения механизмов, контролирующих экспрессию одного из ключевых регуляторов дифференцировки переднего мозга, гена но и с точки зрения разработки универсальных подходов к

изучению механизмов регуляции экспрессии генов в индивидуальном развитии.

Цель работы

Целью данной работы была идентификация и изучение функций транскрипционных факторов, участвующих в пространственной регуляции экспрессии гомеобоксного гена Xanf-J на ранних стадиях развития головного мозга у шпорцевой лягушки.

Научная новизна и практическая ценность.

Впервые была разработана методика, позволяющая проводить систематический поиск транскрипционных факторов, связывающихся с цис-регуляторными элементами генов-регуляторов эмбрионального развития, с помощью дрожжевой одно-гибридной системы и коммерческих кДНК библиотек, сконструированных на основе LEXA-экспрессионного вектора и используемых для двугибридной дрожжевой системы фирмы Clontech. Благодаря большому разнообразию таких библиотек, выпускаемых этой фирмой, появляется возможность проводить одно-гибридный поиск транскрипционных факторов, продуцирующихся на разных стадиях развития в клетках многих тканей различных организмов.

С помощью разработанной методики впервые были идентифицированы 10 транскрипционных факторов, способных связываться с установленным ранее цис-регуляторным элементом одного из ключевых регуляторов раннего развития переднего мозга, гомеобоксного гена Впервые было показано, что два из этих факторов,

гомеодоменный транскрипционный фактор Vent-2 и fork-head фактор FoxA4a, обеспечивают локализацию экспрессии в клетках передне-головной области

нервной пластинки путем ингибирования экспрессии этого гена в клетках задне-головной области. Таким образом, впервые было установлено, что наиболее ранний этап выделения области будущего зачатка переднего мозга в передней зоне нервной пластинки, помимо активации гена в этой зоне включает его ингибирование в клетках, расположенных

позади от этой зоны. Эти данные впервые вскрывают молекулярный механизм, лежащий в основе известного явления, описанного Ньюкупом: локализации передне-мозговых потенций в переднее-головной области нервной пластинки за счет их подавления в туловищной и задне-головной области.

Публикации

По теме диссертации опубликовано три печатные работы.

Материалы работы докладывались на международной конференции.

Подходы и модели, использованные в работе

Ранее в группе молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН в результате анализа экспрессии делеционных мутантов промоторной области гена Xanf-1 в трансгенных эмбрионах лягушки были идентифицированы два цис-элемента, ответственных за регуляцию экспрессии данного гена в раннем эмбриогенезе. Было установлено, что первый элемент, длиной 8 пар оснований, необходим для ингибирования Xanf-1 в туловищной и задне-головной областях нервной пластинки. При удалении этого элемента экспрессия Xanf-1 распространялась назад, за границу среднего и заднего мозга. Второй элемент, 30 пар оснований, отвечает за активацию Xanf-1. В отсутствие этого элемента экспрессия Xanf-1 происходит на очень низком уровне. Было также показано, что найденные регуляторные элементы являются консервативными у всех позвоночных, включая человека.

Для идентификации транскрипционных факторов, ответственных за регуляцию экспрессии и изучения их влияния на пространственную разметку зоны экспрессии

данного гена, были использованы два подхода:

1. Установленные цис-регуляторные элементы гена Xanf-1 были использованы в качестве мишеней для поиска белков-регуляторов при помощи одно-гибридной дрожжевой системы с последующим анализом способности найденных белков связываться с целевыми цис-регуляторными элементами в системе in vitro при помощи метода торможения в геле комплексов ДНК-белок.

2. Было изучено влияние найденных транскрипционных факторов на экспрессию гена

in vivo при помощи модели эмбрионов шпорцевой лягушки. Данная модель позволяет использовать ряд современных эффективных методик для изучения функционирования транскрипционных регуляторов в наиболее естественных условиях: микроинъекции в ранние эмбрионы синтетических мРНК, антисмысловых олигонуклеотидов, изучение экспрессионных доменов с помощью гибридизации меченых зондов с мРНК на целых зародышах, гистологические исследования с применением прижизненных флуоресцентных меток.

Содержание работы

1. Поиск транскрипционных регуляторов гомеобоксного гена Xanf-1.

Скрининг экспрессионной к ДНК библиотеки поздней гаструлы шпорцевой лягушки с помощью дрожжевой одно-гибридной системы.

Поиск специфических транскрипционных факторов, связывающихся с известным цис-регуляторным участком промотора, является важным этапом в изучении системы

регуляции транскрипции. К сожалению, прямое тестирование всех известных транскрипционных факторов, теоретически способных взаимодействовать с консенсусными последовательностями изучаемого цис-регуляторного элемента, не представляется возможным из-за громадного разнообразия таких факторов. Кроме этого, возможно наличие не известных ранее факторов. Наконец, не все консенсусные последовательности для известных транскрипционных регуляторов описаны в литературе и содержатся в базах данных.

Одним из эффективных методов, позволяющим обойти указанные трудности, является одно-гибридная дрожжевая система. В отличие от широко известной двугибридной системы, целевым элементом в ней является не белок, а исследуемый регуляторный участок промотора, контролирующий экспрессию того или иного репортера в составе специального вектора, встроенного в дрожжевой геном. А мишенями - пул гибридных белков, каждый из которых содержит активационный домен (АД) известного активатора транскрипции - дрожжевого белка ОАЫ, а также белок, кодируемый одной из кДНК из определенной тканевой библиотеки. Такая библиотека конструируется путем клонирования тотальной кДНК из той или иной ткани, в специальный экспрессионный дрожжевой вектор, содержащий кодирующую последовательность АД ОАЪ4.

Дрожжевой штамм, в геном которого заранее был встроен вектор, содержащий репортерный ген под контролем изучаемого цис-регуляторного элемента, трансформируется этой библиотекой. В результате, репортерный вектор получает возможность экспрессироваться только в тех дрожжевых колониях, в которых присутствует гибридный белок, имеющий в своем составе тот или иной транскрипционный фактор, способный связываться с изучаемым цис-элементом.

Для большей достоверности обычно используют сразу два независимых репортера-колориметрический (обычно галактозидазный) и ауксотрофный (позволяющий штамму дрожжей, мутантному по какому-либо из генов метаболической цепи синтеза одной из аминокислот, расти на среде, лишенной этой аминокислоты).

Соответственно, в геном штамма дрожжей последовательно встраивают две репортерные конструкции: одну - содержащую ген Р-галактозидазы и другую - ген, необходимый для синтеза нужной аминокислоты. В итоге, отбирают дрожжевые клоны способные одновременно расти на среде, лишенной аминокислоты, и продуцировать галактозидазу. Такой двойной контроль позволяет существенно снизить вероятность отбора т.н. ложно-позитивных клонов.

В настоящее время кДНК библиотеки на основе векторов, экспрессирующих гибридные белки с активационнам доменом ОАЬ4, выпускаются фирмой С1ойесИ.

Эта же фирма производит большое разнообразие аналогичных библиотек из тканей разных организмов на основе другого вектора, с использованием активационного домена бактериального белка LEXA.

Создание таких библиотек основано на использовании векторов с различными

дрожжевыми промоторами - как индуцибельными (для экспрессирующих векторов LEXA-системы), так и неиндуцибельными (для экспрессирующих вектров GAL4-системы).

Использование вектора с индуцибельным GAL1 промотором для создания экспрессирующей гибридной кДНК библиотеки в LEXA-двугибридной системе позволяет индуцировать экспрессию гибридных белков в дрожжевом штамме EGY 48, имеющем дикий тип gal4 И gal80 генов, кодирующих регуляторные белки GAL4 и GAL80. При наличии галактозы GАL4-регуляторный белок способен взаимодействовать с GAL4 регуляторным элементом в составе GAL1 UAS (upstream activation sequences) и активировать транскрипцию генов, вовлеченных в метаболизм галактозы. В отсутствии галактозы белок GAL80 связывается с белком GAL4, и активация транскрипции блокируется. Более того, в присутстствии глюкозы транскрипция галактозных генов немедленно подавляется.

Индуцибельная экспрессия применяется как способ уменьшения токсического воздействия чужеродного белка на дрожжевые клетки штамма-хозяина, что приводит к сокращению количества потенциально активных белков, участвующих во взаимодействии.

К сожалению, непосредственное использование LEXA-библиотек для одно-гибридного скрининга не представляется возможным, поскольку дрожжевой штамм YM4271, использующийся для введения репортерных конструкций в геном, имеет делеции в генах gal4A И gal80A и не может обеспечить индукцию экспрессии гибридных белков.

В то же время, в ряде случаев именно LEXA-библиотеки представляют интерес для такого скрининга. В частности, для эмбрионов шпорцевой лягушки фирмой Clontech производятся только LEXA-библиотеки.

Чтобы преодолеть указанную трудность, мы провели скрещивание использующегося в одно-гибридной системе штамма YM4271(Matchmaker one-hybrid system), имеющего

генотип: МЛТа, ura3-52, his3-200, fys2-801, ade2-101, adeí, trpl-901, leu2-3, 112, tyrl-501,

с введенными в геном репотерными конструкциями под конролем цис-регуляторного элемента гена и штамма для двугибридной LEXA-

системы EGY48 (LexA yest two-hybrid system) генотип: MATa, игаЗ, his3, trpl, LexAop(x6) -LEU2, имеющего дикий тип ga¡4Kga!80 генов.

Принцип одно-гибридной системы с использованием скрещивания показан на схеме 1:

Репортериые конструкции, введенные в геном

ва14Л.да!80Л

ДИКИЙ ТИП Са14.да180

YM4271 (Matchmaker one-hybrid system1 MATa, ural-S2,hls3-200,lys2-801,ade2-101, ade5,trp1-901,leu2-3,112,tyr1-S01, gal4A gal80ü,ade5:: hlsG)

Селективная среза для отбора диплоидных дрожжевых колоний.

Проверка уровня фоновой экспрессии генов-репортеров

Белок us хДЩС библиотеки

СПОСОбнШ yjHaBdTb ЦйЛввОК

элемент провотора г.™ вв»

Целевой элемент upouoiupa тема Xunf-I

Отбор зрккжсвьи клонов по рост) на селективной среде.

Схема плазмиды pB42AD, использующейся для создания экспресснрующеи кДНК бнблио! еки в двм ибриднои дрожжевой LexA системе

Трансформация кДНК библиотекой зародышей шпорцевой лягушки 12 стадии

Отбор дрожжевых клонов по активности ß -галактозидазы.

ста

Таким образом, нами был разработан метод, позволяющий использовать готовые экспрессирующие библиотеки, созданные для двугибридной LEX А- системы для поиска ДНК-связывающих белков в одно-гибридной дрожжевой системе путем скрещивания двух дрожжевых штаммов.

В качестве целевых элементов для создания репортерных штаммов мы использовали два цис-регуляторных элемента, ответственных за регуляцию экспрессии гена Xanf-1. Првый элемент, длиной 14 пар оснований, необходим для ингибирования Xanf-1 в туловищной и задне-головной областях нервной пластинки, при удалении этого элемента

экспрессия Xanf-1 распространялась назад, за границу среднего и заднего мозга. Второй элемент, 22 пар оснований, отвечает за активацию Xanf-1. В отсутствие этого элемента экспрессия Xanf-1 происходит на очень низком уровне.

Нами были использованы эти два участка промотора: первый проксимальный элемент из 14 пар оснований (TGCTAATTACACAC); второй элемент из 22 пар оснований (САААСАААТАААСААТТААСГС) а также последовательность, содержащая оба регуляторных элемента (TGCTAATTACACACCAAACAAATAAACAATTAAC).

Поиск транскрипционных регуляторов проводили при помощи репортерного штамма, содержащего наиболее длинный (содержащий оба регуляторных элемента) участок промотора гена Xanf-1. Штаммы, содержащие короткие элементы использовали для подтверждения взаимодействий найденных факторов с промотором Xanf-1.

Для создания репортерного штамма, содержащего целевые элементы, данные олигомерные последовательности были введены в виде тройных копии в регуляторные области репортерных векторов Созданные

конструкции были линеаризованы и последовательно введены в геном штамма YM4271 (Matchmaker one-hybrid system) в локусы HIS3 для ауксотрофного pHisi и URA3 для колометрического pLacZi. Полученный штамм YM-4271 содержал два встроенных в геном репортерных гена под контролем указанных цис-регуляторных элементов.

После проведения скрещивания репортерного штамма YM-4271 и штамма EGY48 для двугибридной LEXA-системы диплоидный дрожжевой штамм был отобран на селективной среде Для установления уровня фоновой экспрессии

репортерных конструкций полученного штамма проводили подбор селективной среды с различным содержанием 3-АТ (азотриазола, ингибитора синтеза триптофана) для ауксотрофного HIS3 репортерного гена до полного подавления роста и определяли активность колометрического репортера по времени появления окраски дрожжевых клонов.

После трансформации экспрессирующей библиотекой из зародышей Xenopus laevis 12 стадии развития (стадия поздней гаструлы) в векторе pB42AD (Matchmaker LexA two-hybrid system, Clontech laboratories), отбор дрожжевых трансформантов проводили на селективной среде -Ade/-Tip/-His/-Tyr/-Ura. Пересев на среду для экспрессии -Ade/-Trp/-

содержащей галактозу для инициации работы галактозного промотора в плазмиде рВ42АД, а также 80 мМ 3-АТ для подавления фоновой экспрессии ауксотрофного HIS3 репортерного гена, позволил выявить только те дрожжевые колонии, в которых произошло связывание транскрипционного фактора с целевым регуляторным элементом и активирован этот репортерный ген. Для выявления и удаления ложно-

положительных клонов был использован второй, колометрический репортерный геи Lac Z, его активность оценивалась с использованием метода измерения галактозидазной активности на фильтрах (YPH, Clontech).

Плазмиды, содержащие кДНК- вставки выделяли из отобранных дрожжевых колоний, ретрансформировали в Е. Coli и выделяли для повторной трансформации в дрожжевой репортерный штамм.

После отбора на селективной среде, с последующей проверкой ß- галактозидазной активности, было получено 98 дрожжевых клона. Для удаления повторяющихся последовательностей был проведен рестриктный анализ найденных кДНК- вставок, полученных при помощи ПЦР с фланкирующих данные последовательности праймеров.

После подтверждения способности отобранных последовательностей связываться с целевым элементом и активировать оба дрожжевых репортерных гена, их секвенировали и идентифицировали с использованием базы данных BLAST.

В результате этого поиска было найдено десять уникальных последовательностей, кодирующих транскрипционные регуляторы: Dlx2, Dlx5, FoxA4a/Pintallavis, Hoxb9, Msxl, Xanf-1, Xanf'2, XnkxS.l, Xventl, Xvent2.

Краткая характеристика идентифицированных транскрипционных факторов и анализ расположения их зон экспрессии по отношению к зоне экспрессии Xanf-1.

Девять из десяти идентифицированных нами генов-

кодируют гомеодомен-содержащие транскрипционные факторы, которые относятся к т.н. суперклассу 3 (факторы с доменами типа «спираль-поворот-спираль). Один из найденных регуляторов, FoxA4a/Pintallavis, относится к другому классу факторов, содержащих домены типа "Fork head/winged helix" того же суперкласса 3.

Гомеобоксные гены Dix 2 и Dtx5, впервые описанные как Dil (distal-less) у плодовой мушки дрозофилы, принадлежат к большой группе генов, которые принимают участие во многих процессах развития от формирования конечностей у насекомых до дифференцировки глазных плакод у позвоночных. В эмбрионах щпорцевой лягушки на стадии ранней нейрулы эти гены экспрессируются вне зоны нервной пластинки, ограничивая ее латеральные и антериорный края. По литературным данным, эти гены, как и ген Msxl, принимают участие в дифференцировке нервной ткани в качестве ингибитора нейруляции эктодермы. В отдельной работе было показано, что фактор Dlx5 оказывает как прямое, так и опосредованное ингибиторное влияние на экспрессию гена а

фактор Dlx2- только опосредованное ингибиторное влияние на его экспрессию в зачатке головного мозга.

Гомеобоксный ген НохЬ9 входит в состав В-кластера т.н. НОХ-комплекса гомеобоксных генов, продукты которых, так же как продукты их гомологов у всех других многоклеточных животных, определяют разметку дифференцировки клеток вдоль главной оси тела. В зачатке центральной нервной системы позвоночных ген НохЬ9 экспрессируется в туловищной области.

Гомеобоксный ген Msxl является мишенью т.н. BMP-каскада (Bone Morphogenetic Protein), регулирующего в раннем эмбриогенезе развитие вентральных тканей зародыша, а также клеток нервных валиков. Продукт гена Msx - транскрипционный репрессор - играет важную роль в дифференцировке нервной ткани в качестве ингибитора нейруляции эктодермы. Зона его экспрессии лежит вне нервной пластинки, в окружающей ее эктодерме.

Гомеобоксный ген Х-пкх5.1 был впервые найден нами у шпорцевой лягушки, клонирована его полноразмерная форма кДНК. Анализ с помощью пакета программ BLAST последовательности аминокислот, предсказанной на основе трансляции выявленной кДНК показал ее существенное сходство с генами Nkx 5.1 цыпленка, мыши и рыбы данио. Более детальному, изучению этого гена посвящена отдельная работа. В частности, было показано, что транскрипционный фактор X-nkx5.1 играет роль непосредственного ингибитора экспрессии гена участвуя в процессе его стадио-

специфичной регуляции в развитии зачатка головного мозга у шпорцевой лягушки.

Наличие кДНК гена Xanf-1 и его псевдоаллеля Xanf-2 среди идентифицированных нами последовательностей хорошо согласуется с установленным ранее фактом ингибиторного влияния белка Xanf-1 на экспрессию его собственного гена. Этот факт указывает на возможность связывания Xanf-1 с промотором собственного гена. В дальнейшем последняя способность была подтверждена методом торможения ДНК-белковых комплексов в полиакриламидном геле.

Гомеодоменные транскрипционные репрессоры Xventl и Xvent2 являются регуляторными белками ВМР-4 каскада, экспрессируются преимущественно на вентральной стороне зародышей, подавляют развитие нейроэктодермы и дорсальной мезодермы, но способны индуцировать дифференцировку эпидермиса и вентральной мезодермы. Кроме того, гомеобоксный ген Xvent2 экспрессируется вдоль всей нервной пластинки, кроме зоны ее медиальной части (notoplate-нервного желобка) и наиболее ростральной области. И, наконец, fork-head фактор, FoxA4a/Pintallavis экспрессируется в области нервного желобка, и так же как Xvent2, не экспрессируется в клетках ростральной

области нервной пластинки (Рис.1). Интересно отметить, что FoxA4a/Pintallavis и его гомологи у млекопитающих, «Fork head» домен содержащие транскрипционные факторы FoxA семейства считаются транскрипционными активаторами, хотя известно, что гомолог FoxA4a/Pintallavis у млекопитающих, FoxA2 может связывать TLE и SMAD3-корепрессоры.

Для оценки потенциальной способности найденных факторов участвовать в непосредственной регуляции гена нами был проведен анализ взаимного

расположения зон экспрессии этих факторов и Xanf-1 в эмбрионах шпорцевой лягушки с помощью метода гибридизации in situ (Схема 2).

В результате было установлено, что гены трех из обнаруженных факторов (Dlx2, Hoxb9, Xventl; рисунки 4,5,3 на схеме 2) экспрессируются в областях зародыша не граничащих непосредственно с областью экспрессии гена Следовательно, эти

факторы не могут принимать участие в регулировании экспрессии В то же время,

другие 7 факторов, зоны экспрессии которых перекрываются {Xanf-1, Xanf-2, Xnhx-S.l; рисунки 1,6,2 на схеме 2) или граничат с зоной экспрессии Xanf-1 {Dlx5, Msxl, FoxA4a/Pintallavis и Xvent2; рисунки 9,10,8,7 на схеме 2), потенциально могут быть вовлечены в регуляцию экспрессии.

П. Изучение роли транскрипционных факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 в локализации экспрессии Xanf-1 в головной нейроэктодерме.

Выделение в составе нервной пластинки области, экспрессирующей - наиболее

раннее событие в детерминации будущего зачатка переднего мозга. Как показал делеционный анализ промотора механизм локализации экспрессии данного гена в

передней части нервной пластинки основан на подавлении его экспрессии в задней части пластинки. В связи с этим, большой интерес представляет поиск транскрипционных факторов, обеспечивающих такое подавление.

Среди найденных десяти транскрипционных факторов, способных связываться с элементом промотора необходимым для локализации его экспрессии, только два

фактора, FoxA4a/Pintallavis и Xvent2, могут претендовать на роль искомых ингибиторов, поскольку зоны их экспрессии в нервной пластинки расположены позади области экспрессии Xanf-1 и полностью комплементарны этой области. (Рис.1). На основании этого, данные два фактора были выбраны для дальнейшего изучения их влияния на экспрессию в нервной пластинке.

Рис.1 Экспрессионные домены гена Xanf-1 и генов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 занимают комплементарные области нервной пластинки. Гибридизация in situ с пробами: Xanf-Ц А), Xvent2 (В), FoxA4a/Pmtallavis{C).

(A) Экспрессия гена Xanf-1 в передней нейроэктодерме.

(B) Экспрессия гена Xvent2 локализована по бокам нервной пластинки, сзади от экспрессионного домена гена Xanf-/(маркированного прерывистой красной линией).

(C) Ген FoxA4a/Pintallavis экспрессируется по центральной линии нервной пластинки, за зоной экспрессии гена Xanf-1. Передняя часть экспрессионного домена FoxA4a/Pintallavis ограничивает центральную постериорную зону экспрессии гена Xanf-1 (маркированного прерывистой красной линией).

(D,E) Двойная in situ гибридизация с пробами Xanf-1 и Xvent2 (D) или Xanf-1 и FoxA4a/Pintallavis

(E) демонстрирует отсутствие несовпадающих зон в экспрессионных доменах этих генов

(F) Диаграмма полной комплементарности зон экспрессии генов FoxA4a/Pintalla\is и X\ent2, ограничивающих экспрессию Xanf-1 в постериорной части нервной пластинки.

1 2 3 4 5

т&бб

ХаЫ-2 ХуепЙ Рох4А/Р1гИа11ат 01x5 Мэх1

Схема 2: Зоны экспрессии транскрипционных факторов, идентифицированных в результате поиска с использованием одно-гибридной дрожжевой системы

Рис.2 Использование метода торможения в геле ДНК- белковых комплексов (ЕМ8А) для подтверждения способности факторов РохА4а/Рт1а11ау1з и Хуей2 связываться с 14 и 22 нп элементами промотора гена Xanf-1 (А, В) В реакционной смеси использовались следующие компоненты 1 дорожка - экстракт ооцитов, микроинъецированных мРНК, кодирующей зеленый флуоресцентный белок ЕОБР (контроль), 2 дорожка - экстракт ооцитов, микроинъецированных мРНК, кодирующей FoxA4a/Pinta11avis (А) и Хуей2(В) разбавленный в 10 раз экстрактом ооцитов, микроинъецированных мРНК EGFP, 3 дорожка - неразбавленный экстракт ооцитов, микроинъецированных мРНК FoxA4a/Pintallavis (А) и Xvent2(B)

(С) Проверка специфичности взаимодействия FoxA4a/Pinta11avis с 14-н п элементом 1 дорожка экстракт ооцитов, микроинъецированных мРНК, кодирующей ЕGFP (контроль), дорожки 2-4-экстракт ооцитов, микроинъецированных мРНК FoxA4a/Pintallavis смешанный с нормальным (А) или мутантными (В,С) вариантами элемента промотора из 14н п Последовательности этих вариантов приведены в нижней части рисунка С, мутированные нуклеотидные основания выделены подчеркиванием

(Э) Сравнение последовательностей проксимального (желтый цвет) и дистального (синий цвет) элементов промотора гена Xanf 1 шпорцевой лягушки (Xlaevis) с его гомологами у курицы ^ gallus) и человека (Н sapiense) указывает на высокую эволюционную консервативность данного элемента Последовательности, необходимые для связывания FoxA4a/Pinta11avis помечены черными линиями, для связывания Xvent2 - красными, последовательности, локализованные на противоположной цепи ДНК, подчеркнуты, последовательность связывания FoxA4a/Pint11avis, имеющая точечную мутацию по сравнению с канонической последовательностью, обозначена черным пунктиром

Рис. 3 Эффекты, вызванные эктопической экспрессией FoxA4a/Pintallavis и Xvent2, а также их репрессорными и активаторньши версиями на экспрессию эндогенного Xanf-1. Все эмбрионы были микроинъецированы смесью синтетической мРНК вместе с внутриклеточной меткой (FLD)

Гибридизация in situ с зондами к Xanf-1 и Engrailed2 (En) зародышей, микроинъецированных мРНК:

FoxA4a/Pintattavis(А) мРНКХуелt2(В); EnR-FoxA4a/Pintallavis(С); EnR-Xvent2(D,).

распределение микроинъецированного материала в зародыше, идентифицированное по наличию метки FLD.

(C,D) Эктопическая экспрессия доминантно-репрессорных конструкций EnR-FoxA4a/Pintallavis и EnR-Xvent2 обеспечивает подавление экспрессии Xanf-1.

Гистологические срезы на двух саггитальных уровнях (срезы 1 и2 на рис тех же эмбрионов являются подтверждением того, что клетки-потомки микроинъецированных бластомеров, меченые внутриклеточным красителем FLD, локализованы преимущественно в верхнем, нейроэктодермальном слое клеток, и только единичные флуоресцирующие клетки видны в подлежащих эндомезодермальных клеточных слоях.

(В1,В2) Экспрессия эндогенного Xanf-1 на данных гистологических срезах.

(E-G) Эктопическая экспрессия доминантно-активаторных конструкций VP16-FoxA4a/Pintallavis и VP-16Xvent2, а также мутантной версией Xvent-P40 (L/P в гомеодоменной области белка в позиции 40) вызывает распространение экспрессии эндогенного Xanf-1 в постериорную область нейроэктодермы (идентификация по гибридизации in situ с зондами к Xanf-1 и Engrailed2). Красными стрелками отмечена постериорная граница экспрессионного домена Xanf-1 в микроинъецированных зонах, а черными - в "нормальных" зонах зародыша. МикроинъекциимРНК: VP16-FoxA4a/Pintallavis (Е,Е'), VP16-Xvent2(Ff'), Xvent-P40(G,G').

(El,El') Гистологический срез на уровне 1 эмбриона, изображенного на рис Е и Е\ иллюстрирует присутствие клеток-потомков инъецированных бластомеров в нейроэктодермальном слое и распространение экспрессии эндогенного Xanf-1 на срезе.

«ийй!*'

Подавление экспрессии Подавление эксдрессии с эндогенного^1 12 эндогенного РохМа £

Рис.4 Подавление трансляции эндогенной мРНК FoxA4a/Pintallavis и Xvent2, при помощи микроинъекций антисмысловых МО, приводит к увеличению зоны экспрессии гена Xanf-1 со сдвигом её задней границы в районе экспрессионных доменов генов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2.

1-Схематическое изображение нормального паттерна экспрессии у контрольных зародышей для геновХая/-1 ,Xvent2, FoxA4a/Pintallavis.

А^'Д^гибридизация in situ контрольных зародышей с зондами: К-Xanf-1, A'-Xvent2, A"- FoxA4a/Pintallavis. Желтой линией обозначена область нервной пластинки. Красным пунктиром выделена нормальная зона экспрессии гена Xanf-1, красными стрелками обозначена задняя граница зоны его нормальной экспрессии.

2-Схематическое изображение сдвига экспрессионного домена Xanf-1, в случае подавления трансляции эндогенной мРНКXvent2, при помощи МО в правой половине зародыша.

В- гибридизация in situ зародыша, микроинъецированного анти - Xvent2 МО, с зондом Xanf-1 (красными стрелками обозначена задняя граница экспрессии Xanf-1, хорошо виден её сдвиг в правой половине зародыша).

В'-идентификация клеток, содержащих микроинъецированный материал, по наличию в них флуоресцентной метки FLD.

3- Схематическое изображение сдвига экспрессионного домена Xanf-1 в случае подавления трансляции эндогенной мРНК FoxA4a/Pintallavis.

С- гибридизация in situ зародыша, микроинъецированного анти - FoxA4a/Pintallavis МО, с зоцдом Xanf-1 (красной стрелкой обозначена задняя граница экспрессии Xanf-1).

распределение микроинъецированного материала в зародыше, наблюдаемое по наличию флуоресцентной метки FLD.

Рис 5 Эксперименты с гормон-индуцибельными версиями FoxA4a/Pintallavis uв условиях подавления синтеза белка СНХ доказывают непосредственное воздействие этих факторов на экспрессию гена Xanf-1.

При добавлении дексаметазона (БЕХ) в среду для инкубации зародышей, в цитоплазме клеток происходит освобождение факторов ЛИб-РохМа/РтЫкук-ВБОК (А^') и ЛИб-ХуепЙ-В1ХЖ(В,В') из комплексов с белком теплового шока Изр90, которые, в условиях подавления синтеза белка циклогексимидом, могут активировать транскрипцию только их непосредственных генетических мишеней, в частности, транскрипцию гена Xanf-1.

Следует отметить, что в случае VP16-FoxA4a/Pintallavis-BDGR наблюдается незначительное увеличение зоны экспрессии Xanf-1 в постериорном направлении (А, краснами стрелками отмечены границы расширения экспрессии Xanf-1), тогда как в случае VP16-Xvent2-BDGR (В, краснами стрелками отмечены границы расширения экспрессии Xanf-1) зона расширения его экспрессии значительно больше.

Проверка способности белковых факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 связываться с регуляторным элементом промотора гена Xanf-1 in vitro.

Для подтверждения способности транскрипционных факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 связываться с идентифицированными регуляторными элементах промотора гена Xanf-1 нами был использован метод торможения ДНК-белковых комплексов в полиакриламидном геле (Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA).

Для экспрессии регуляторных белков использовали микроинъекции мРНК, кодирующие факторы FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 в ооциты шпорцевой лягушки и полученный грубый экстракт из ооцитов использовали при анализе изменения

подвижности радиоактивно-меченых олигонуклеотидных последовательностей. Специфичность связывания проверялась по уменьшению EMS-сигнала при разбавлении в 10 раз экстракта из ооцитов, микроинъецированных мРНК,кодирующих FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 контрольным экстрактом из ооцитов, инъецированных мРНК, кодирующей флуоресцентный белок EGFP, а также полное отсутствие EMS- сигнала при использовании только контрольных экстрактов ооцитов (Рис. 2).

Для проведения EMSA-анализа использовались двухцепочечные олигомерные последовательности, содержащие дистальный (14 н.п.) и проксимальный (22 н.п.) цис-регуляторные элементы промотора гена Xanf-1: 5'tctgtcccaTGCTAATTACACAC (14н.п. элемент), 5'tctgcatgtcgaCAAACAAATAAACAATTAACTCga (22 н.п. элемент). Следует отметить, что описанные в литературе 2 консенсусные последовательности, необходимые для связывания фактора Xvent2, CT AATTA и СААТТАА, содержатся соответственно в 14 н.п. и 22 н.п. элементах.

Консенсусная последовательность, необходимая, по литературным данным, для связывания FoxA4a/Pintallavis (G/A)TAAA(T/C)A, содержится только в 22 н.п. элементе САААСАААТАААСААТТААСТС (Рис. 2D).

Комплементарная цепь 14-н.п. элемента TGCTAATTACACAC содержит последовательность GTAATTA, которая имеет всего одну замену в консенсусной последовательности (G/A)TAAA(T/C)A. Этим можно объяснить сильное (приблизительно 10- кратное) уменьшение EMS- сигнала от 14-н.п. элемента по сравнению с 22-н.п. элементом. Для изучения специфичности связывания FoxA4a/Pintailavis с 14-н.п. элементом мы сделали такие точечные мутации в исследуемой последовательности, которые, в случае специфичного взаимодействия, должны приводить к полному нарушению связывания. В результате замены последовательности СТАААТТА на CTACGTC EMS-сигнал полностью исчезает (Рис. 2С). Изменение потенциального сайта связывания в последовательности дистального элемента СТАААТТА на консенсусную для FoxA4a/Pintallavis последовательность GTATTTA приводит к сильному возрастанию EMS-сигнала по сравнению с исходным 14-н.п. цис-регуляторным элементом (Рис. 2С). Таким образом, нами была показана возможность связывания транскрипционного фактора FoxA4a/Pintallavis с последовательностью, имеющую одну нуклеотидную замену по сравнению с консенсусной в регуляции транскрипции гена Xanf-1.

Анализ влияния экзогенных факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 на экспрессию гена Xanf-1 в эмбрионах шпорцевой лягушки.

Для изучения роли найденных факторов в регуляции экспрессии гена Xanf-1 in vivo были проведены микроинъекции синтетической мРНК, кодирующей эти факторы, вместе с внутриклеточной меткой, флуоресцеин-лизин-декстраном (FLD) в один или два бластомера на анимальном полюсе зародыша.

Известно, что микроинъекции в дорсальные-анимальные бластомеры на стадии 32-клеточного зародыша приводят к распределению введенной метки только в эктодермальном клеточном слое, но не в подлежащей дорсальной мезодерме. Такая локализация инъецированной мРНК дает возможность исключить косвенное влияние изучаемых факторов на нейроэктодерму через изменение индукционных влияний от подлежащего мезодермального слоя клеток.

На стадии ранней нейрулы мы отбирали только те эмбрионы, которые содержали FLD-метку в области нервной пластинки для дальнейшего анализа изменений экспрессии гена Xanf-1 методом in situ гибридизации на целых зародышах.

Для детальной оценки изменений в зоне экспрессии гена Xanf-1 был применен метод in situ гибридизации на целых зародышах с использованием смеси двух dig-меченых мРНК зондов: первый зонд, к мРНК гена Xanf-1, и второй, к мРНК экспрессионного маркера границы среднего/заднего мозга - гена Engrailed2.

Во всех отобранных эмбрионах (37 эмбрионов для FoxA4a/Pintallavis и 39 для Xvent2 в 4 независимых экспериментах), мы наблюдали подавление экспрессии гена Xanf-1 в тех клетках нервной пластинки, которые содержали эктопическую FoxA4a/Pintallavis u Xvent2 мРНК, что подтверждало способность этих белков ингибировать экспрессию Xanf-1 (Рис.3

А,А',В,В')-

Для анализа распределения микроинъецированных клеток по клеточным слоям были приготовлены гистологические срезы (четыре зародыша для каждой пробе мРНК). Как и предполагалось, FLD-меченные клетки видны преимущественно в эктодермальном слое клеток в области, где детектируется подавление экспрессии гена Xanf-1. Только несколько одиночных меченых клеток можно увидеть в подлежащих эндомезодермальных слоях (Рис.ЗВ1). В то же время, в областях с нормальной экспрессией гена Xanf-1 у тех же самых зародышей не наблюдается FLD-меченых клеток, следовательно, эти области не содержат эктопической FoxA4a/Pintallavis u Xvent2мРНК (Рис.ЗВ2,ЗВ2').

Эти данные свидетельствуют о том, что подавление экпрессии гена Xanf-1 экзогенными FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 является результатом прямого влияния этих факторов в клетках нейроэктодермы.

Для подтверждения репрессорной роли транскрипционных регуляторов FoxA4a/PintaUavis и Xvent2 мы синтезировали мРНК, кодирующие гибридные версии ДНК-связывающих доменов этих факторов с репрессорным доменом транскрипционного фактора Engгeald (EnR) дрозофилы. Полученные мРНК, кодирующие ультимативные репрессорные версии гибридных белков FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 (EnR-FoxA4a/Pintallavis и EnR-Xvent2), были микроинъецированны в дорсальные-анимальные бластомеры 32-клеточных эмбрионов. В результате, мы наблюдали подавление экспрессии гена Xanf-1 во всех клетках, содержащих FLD-метку (34 эмбриона было отобрано для EnR-FoxA4a/Pintallavis и 37 для EnR-Xvent2 в трех независимых экспериментах)

Гистологические срезы этих эмбрионов (по 4 эмбриона для каждого типа инъецированной мРНК) подтвердили автономность действия использованных гибридных конструкций в клетках нейроэктодермы.

Поскольку добавление сильного репрессивного EnR-домена к мРНК последовательностям факторов FoxA4a/PintaUavis и Xvent2 не изменило их характер влияния на экспрессию гена Xanf-1, по сравнению с интактными факторами, можно сделать вывод о репрессивной роли этих факторов в нормальном развитии.

Для проверки этого вывода независимым методом были проведены микроинъекции мРНК, кодирующие доминантно-негативные версии факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2. В своей работе мы использовали два типа доминантно-негативных конструкций.

В первом случае, оба исследуемых транскрипционных фактора были экспрессированы в виде гибридных белков с сильным активационным доменом белка VP16 из вируса герпеса. Как известно из литературы, последний домен способен изменять репрессорную функцию транскрипционных факторов на активаторную.

Второй способ доминантно-негативного изменения функции был использован в случае фактора Xvent2 и заключался в получении мРНК, кодирующей данный фактор, содержащий точечную мутацию Ь/Р в гомеодоменной области белка в позиции 40 (Xvent-Р40).

По литературным данным, такая мутация способна блокировать активность нормального фактора Xvent2, за счет образования нефункционального гетеродимера нормального и мутантного факторов, что приводит к потере способности связываться с ДНК.

В результате микроинъекций мРНК, кодирующих эти три доминантно-негативные конструкции, в анимально-дорсальные бластомеры на стадии 32-бластомеров, мы во всех случаях наблюдали расширение зоны экспрессии Хап/-1 (Рис. ЗЕ,Е';Р,Р';0,0').

Примечательно, что во всех трех случаях зона эктопической экспрессии Хап/-1 внутри нервной пластинки распространялась до границы заднего мозга, маркированной зоной экспрессии гена е^гаИеё2 (Рис.ЗЕ^; отмечены задние границы нормальной (черная стрелка) и расширенной (красная стрелка) зоны экспрессии Хап/-1). Этот результат свидетельствует о том, что позади данной границы, возможно, действуют какие-то другие эндогенные ингибиторы экспрессии Хап/-1, способные эффективно конкурировать с использованными нами доминантно-негативными вариантами РохЛ4а/РМа11ау1$ и Xvent2.

Представленные данные были получены в 3 независимых экспериментах, в результате которых было отобрано: 31 зародыш микроинъецированный мРНК УР16-РохЛ4а/Р1Ша11ау1я, 34 зародыша микроинъецированных мРНК ХуеШ-Р40 , 26 зародышей микроинъецированных мРНК УР16-ХуеШ2.

В результате анализа гистологических срезов отобранных зародышей (по 4 зародыша для каждого типа мРНК) было показано, что клетки, содержащие инъецированные мРНК, действительно располагались исключительно в нейроэктодерме и, следовательно, наблюдаемые эффекты являлись результатом автономного действия доминантно-негативных вариантов FoxЛ4a/Pintallavis и Xvent2 непосредственно в клетках нейроэктодермы

Проверка ингибирующего действия эндогенных факторов FoxЛ4a/Pintallavis и Хуе^2 на ген Хап/-1.

В последнее время стал широко использоваться новый эффективный метод «выключения функции» различных генов, основанный на направленном подавлении трансляции мРНК за счет её комплементарного связывания с синтетическими антисмысловыми морфолиновыми олигонуклеотидами (МО).

Для подтверждения репрессорной функции эндогенных факторов FoxA4a/PintaUavis и Xvent2 были проведены микроинъекции в зародыши Хепорш на стадии 4-8 бластомеров антисмысловых МО-олигонуклеотидов, комплементарных некодирующсй области их эндогенных мРНК.

В результате, при использовании анти- FoxЛ4a/Pintallavis МО, мы наблюд&чи увеличение зоны экспрессии Хап/-1 в постериорном направлении именно в той области нервной пластинки (вдоль нервного желобка), где в норме экспрессируется эндогенный FoxЛ4a/Pintallavis (Рис.4С, С).

Важно отметить, что, как и в эксперименте с использованием доминантно-активаторной версии FoxЛ4a/Pintallavis, в эксперименте с МО эктопическая экспрессия гена Хап/-1 распространяется в постериорном направлении только до будущей передней

границы заднего мозга, маркированной зоной экспрессии гена Engraild-2 (Рис.ЗЕ и Рис.4С). Этот результат подтверждает наличие других транскрипционных регуляторов, подавляющих экспрессию Xanf-1 в более отдаленной от его экспрессионного домена постериорной области нервной пластинки.

К сожалению, добиться таких же четких результатов с использованием анти-Хуеп£2 МО нам не удалось, так как у подавляющего (80- 95%) числа зародышей наблюдалась дезинтеграция эктодермального слоя на отдельные клетки в конце гаструляции, при этом мы использовали для микроинъекций широкий диапазон концентраций МО: от 1 до 0,01 mМ. Тем не менее, у 5 зародышей из 72 выживших в 2 независимых экспериментах нам все же удалось наблюдать небольшое расширение зоны экспрессии Xanf-1 при концентрации инъецированных анти-

Для подтверждения специфичности действия анти-ГохЛ4а/И^аПау^ и анти- Xvent2 МО была применена методика «спасение» (rescue) - восстановление функции генов при добавлении мРНК FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 в пробу для микроинъекций, содержащую МО и FLD-метку. Учитывая, что МО-олигонуклеотиды синтезированы как комплементарные к 5'-некодирующей области эндогенных мРНК FoxA4a/Pintallavis и Xvent2, мы смешивали МО с синтетическими мРНК, которые содержали только кодирующую последовательность этих факторов, и поэтому их трансляция не могла быть заблокирована, несмотря на наличие МО. Для микроинъекций использовались смеси мРНК и МО в следующих соотношениях: lmM MO+20ng/ml для мРНК FoxA4a/Pintallavis и 0,03mM MO+50ng/ml для мРНК Xvent2. В результате микроинъекций зародышей такой смесью наблюдалось не увеличение, а уменьшение зоны экспрессии Xanf-1, похожее на то, которое мы уже видели в случае микроинъекций мРНК, кодирующих FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 (см. Рис.3 А,В). Важно отметить, что при смешивании lmM МО с 50ng/ml Xvent2 мРНК, также происходило восстановление целостности эктодермы у 50% инъецированных зародышей. На основании полученных данных можно сделать вывод о специфичном действии МО на изучаемые гены.

Проверка гипотезы о_непосредственном воздействии транскрипционных

репрессоров FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 на экспрессию гена Xanf-1.

Для проверки гипотезы о том, что ген Xanf-1 является прямой мишенью для репрессоров FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 в эмбриональных клетках, были проведены эксперименты с использованием мРНК, кодирующими их дексаметазон-индуцируемые доминантно-активаторные гибридные версии.

Зародыши на стадии 4-8 бластомеров были микроинъецированы мРНК, кодирующими доминантно-активаторные версии обоих факторов со связывающим доменом глюкокортикоидного рецептора (Binding Domain of Glucocrticoid Receptor, BDGR). Особенностью таких конструкций является инактивация гибридного белка в клетке за счет связывания BDGR-домена с комплексом белков теплового шока в цитоплазме. Добавление в инкубационную среду синтетического глюкокортикоида, дексаметазона (DEX), приводит к разрушению этого комплекса, в результате чего гибридные доминантно-активаторные версии факторов получают возможность связываться с регуляторными элементами промоторов генов-мишеней.

На стадии поздней гаструлы зародыши, микроинъецированные мРНК VP16-FoxA4a/Pintallavis-BDGR и VP16-Xvent2-BDGR, были помещены на 1 час в среду, содержащую Юмг/мл циклогексимида (СНХ) для полного подавления синтеза белка. После этого, транслированные ранее в клетках микроинъецированных эмбрионов гибридные белки VP16-FoxA4a/Pintallavis-BDGR и VP16-Xvent2-BDGR, были активированы добавлением в среду дексаметазона (DEX) в концентрации 2мкМ. В этих условиях (подавление общего белкового синтеза) могла происходить активация транскрипции только непосредственных генетических мишеней факторов VP16-FoxA4a/Pintallavis-BDGR и VP16-Xvent2-BDGR, но не тех генов, которые при разрешенном синтезе белка могли бы быть активированы промежуточными факторами-посредниками.

В результате этих экспериментов, в случае применения как первой, так и второй конструкции, мы наблюдали увеличение зоны экспрессии Xanf-1:42 и 21 зародыша имели расширенную область экспрессии гена Xanf-1 в двух независимых экспериментах для VP16-FoxA4a/Pintallavis-BDGR и VP16-Xvent2-BDGR, соответственно (Рис. 5 АД'33'). Эти данные подтверждают гипотезу о . прямом взаимодействии факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 с промотором Xanf-1.

Подавление экспрессии гена Xanf-1 в туловищной зоне нервной пластинки хорошо согласуется с активаиионно-трансформаиионноймоделью Ньюкупа.

Известная модель нейральной индукции, предложенная Ньюкопом, предполагает, что на первом этапе вся нейроэктодерма, под индукционным влиянием «раннего» организатора Шпемана, приобретает потенции к развитию в переднеголовные структуры, а на втором этапе, под воздействием «позднего» организатора, эти потенции трансформируются в туловищные. Важным постулатом этой модели является то, что переднеголовные потенции сохраняются в туловищной зоне нервной пластинки и на

втором этапе индукции, просто они оказываются маскированными трансформирующим сигналом.

Таким образом, переднеголовные потенции, индуцированные на первом этапе в нейроэктодерме, могут быть реализованы только в передней части нервной пластинки.

В полном соответствии с этой моделью, экспрессия гена Xanf-1, которая была активирована факторами 8охЭ, 01x2 и, возможно, другими активаторами в процессе нормального развития, впоследствии оказывается подавленной в постериорной области нервной пластинки в результате связывания репрессоров FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 с цис-регуляторным элементом промотора гена Xanf-1 (Схема 3). Блокирование действия этих репрессоров приводит к восстановлению экспрессии Xanf-1 в задне-головной области, что соответствует предсказанию модели Ньюкупа о возможности реактивации переднеголовных потенций в подходящих условиях.

А В

Схема 3 Модель разметки нервной пластинки на антериорную область, характеризующуюся экспрессией гена Xanf-1, и постериорную, характеризующуюся экспрессией репрессоров FoxA4a/Pintallavis и Хуей2, является хорошим подтверждением модели двух стадий разметки нервной пластинки, предложенной Ньюкупом.

А Согласно модели, предложенной Ньюкупом, антериорные потенции, активированные на первой стадии нейральной индукции по всей поверхности нейроэктодермы, могут быть реализованы только в антериорной области нервной пластинки (зона, выдел еннная тёмным цветом на рисунке), вследствие их подавления трансформирующим сигналом, появляющимся в постериорной области пластинки (зона, обозначена серым цветом)

В Экспрессия гена Xanf-1, инициированная транскрипционными активаторами 8охЭ, 01x2, действующими по всей поверхности нервной пластинки, в нормальном развитии ограничена в ее антериорной части за счет ингибирующего влияния репрессоров FoxA4a/Pintallavis и Хуей2, которые экспрессируются в постериорной области пластинки и определяют четкую задне-головную границу экспрессии Xanf-1.

Следует отметить, что найденные цис-регуляторные элементы промотора гена Xanf-1 оказываются высоко консервативными у всех известных генов семейства Л^ в том числе,

у Anf генов таких далеко дивергировавших организмов, как шпорцевая лягушка, курица и человек (Рис. 2D). Из этого можно сделать вывод о высокой консервативности механизма подавления экспрессии данных генов гомологами транскрипционных факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 у всех позвоночных.

Интересно, что все другие типы животных, включая ближайших родственников позвоночных - низших хордовых, не имеют анатомических структур, гомологичных переднему мозгу позвоночных. Более того, данные по изучению геномов показывают, что гены семейства Anf также могут быть специфической эволюционной "находкой" позвоночных животных.

Эти данные, а также тот факт, что экспрессия Anf генов является необходимым условием развития переднего мозга, позволяют сделать предположение о том, что возникновение Anf-тина гомеобоксного гена и механизма, обеспечивающего передне-головную локализацию его экспрессии путем подавления при помощи факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 (или их гомологов) в задних областях, может быть решающей стадией в эволюции переднего мозга у позвоночных.

Выводы

1. Впервые была разработана методика, позволяющая проводить систематический поиск транскрипционных факторов, связывающихся с цис-регуляторными элементами генов-регуляторов эмбрионального развития, с помощью дрожжевой одно-гибридной системы и коммерческих кДНК библиотек, сконструированных на основе LEXA-экспрессионного вектора и используемых для двугибридной дрожжевой системы.

2. С использованием одно-гибридной дрожжевой системы идентифицированы 10 транскрипционных факторов Dlx2, Dlx5, Hoxb9, Msxl, Nkx5.1, FoxA4a/Pintallavis, Xventl, Xvent2, Xanf-1, Xanf 2, способных связываться с цис-регуляторным элементом промотора гена Xanf-1, расположенным между позициями «-203» и «167» от сайта начала транскрипции.

3. Доказано прямое ингибиторное влияние факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 на экспрессию гена Xanf-1 в зачатке головного мозга у шпорцевой лягушки.

4. Показано, что гомеодоменный транскрипционный фактор Xvent-2 и fork-head фактор FoxA4a/Pintallavis обеспечивают ингибирование экспрессии гена Xanf-1 и определяют постериорную границу его экспрессионного домена в туловищной зоне нервной пластинки.

5. Полученные данные об ингибировании Xanf-1 в туловищной зоне нервной пластинки, за пределами его нормального экспрессионного домена, полностью соответствуют активационно-трансформационной модели нейральной индукции, предложенной Ньюкупом.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Martynova N, Eroshkin F, Ermakova G, Bayramov A, Gray J, Grainger R, Zaraisky A., 2001,The expression of the homeobox gene Anf is restricted into the anterior neuroectoderm due to its suppression into the posterior neuroectoderm. Joint EMBO-IMA workshop.

2. Eroshkin F, Kazanskaya O, Martynova N, Zaraisky A., 2002. Characterization of cis-regulatory elements ofthe homeobox gene Xanf-1. Gene 285,279-286.

3. Martynova N, Eroshkin F, Ennakova G, Bayramov A, Gray J, Grainger R, Zaraisky A., 2004, Patterning the forebrain: FoxA4a/Pintallavis and Xvent2 determine the posterior limit of Xanf-1 expression in the neural plate. Development. May,131(10):2329-38.

4. Bayramov AV, Martynova NY, Eroshkin FM, Ennakova GV, Zaraisky AG., 2004, The homeodomain-containing transcription factor X-nkx-5.1 inhibits expression of the homeobox gene Xanf-1 during the Xenopus laevis forebrain development Mech Dev.Dec;121(12):1425-41.

Принято к исполнению 15/03/2005 Заказ № 703

Исполнено 16/03/2005 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www autoreferat ru

Е> А .

*

Vf;:¿/ • 7СГ0 2 г НАР 2005" "■

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мартынова, Наталья Юрьевна

Страница

Введение.

1. Литературный обзор

1.1 Нейральные индукторы и антинейрогенные факторы.

1.2 Регионализация нервной трубки.

1.3 Транскрипционные факторы, принимающие участие в ранней дорсо-вентральной регионализации нервной пластинки.

1.4 Антериорно-постериорная регионализация нервной пластинки.

1.5 Факторы, которые могут играть роль постеризующего сигнала в формировании ранней АП разметке нервной пластинки.

1.6 Роль вертикальной и планарной индукции в разметке нервной пластинки.

1.7 Пространственная модель АП разметки нервной пластинки.

1.8 Роль гомеобоксного гена Хаг^ 1 в раннем развитии переднего мозга у позвоночных.

1.9 Прицельный поиск транскрипционных регуляторов эмбриогенеза при помощи дрожжевой-одногибридной системы.

2. Результаты и их обсуждения

Подходы и модели, использованные в работе.

2.1 Поиск транскрипционных регуляторов гомеобоксного гена Xanfl.

2.1.1 Скрининг экспрессионной к ДНК библиотеки поздней гаструлы шпорцевой лягушки с помощью дрожжевой одно-гибридной системы.

2.1.2 Краткая характеристика идентифицированных транскрипционных факторов и анализ расположения их зон экспрессии по отношению к зоне экспрессии Xanf-1.

2.2 Изучение роли транскрипционных факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 в локализации экспрессии Xanf-1 в головной нейроэктодерме.

2. 2.1 Проверка способности белковых факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 связываться с регуляторным элементом промотора гена Xanf-1 in vitro.

2.2.2 Анализ влияния экзогенных факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 на экспрессию гена Xanf-1 в эмбрионах шпорцевой лягушки.

2.2.3 Проверка ингибирующего действия эндогенных факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 на ген Xanf-1.

2.2.4 Проверка гипотезы о непосредственном воздействии транскрипционных репрессоров FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 на экспрессию гена Xanf-1.

2.2.5 Подавление экспрессии гена Xanf-1 в туловищной зоне нервной пластинки хорошо согласуется с активационно-трансформационной моделью нейральной индукции.

Выводы.

3. Экспериментальная часть

3.1.1. Реактивы.

3.1.2. Ферменты.

3.1.3. Лабораторное оборудование.

3.1.4. Лабораторные животные.

3.1.5. Буферы и растворы.

3.1.6. Микробиологические среды.

3.1.7. Предоставленные плазмиды.

3.1.8. Предоставленные dig-зонды.

3.2. Методы исследования.

3.2.1 Дрожжевая одно-гибридная система.

3.2.2 Метод торможения в геле ДНК-белковых комплексов(ЕМЗА).

3.2.3 Методы, использованные для приготовления ДНК-конструкций.

3.2.4. Приготовление конструкций для синтеза мРНК для микроинъекций . .88 3.2.5 Транскрипция in vitro.

3.2.6. Получение зародышей шпорцевой лягушки.

Микроинъекции синтетических мРНК в зародыши шпорцевой лягушки.

3.2.7. Блокирование экспрессии генов на уровне подавления трансляции эндогенной мРНК при помощи микроинъекций антисмысловых Морфолино Олигонуклеотидов (МО).

3.2.8. Синтез dig-меченых гибридизационных зондов.

3.2.9. Фиксация зародышей.

3.2.10. Гибридизация In situ.

Список сокращений.

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск и изучение транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию гомеобоксного гена Xanf-1 в развитии головного мозга у шпорцевой лягушки"

Выяснение молекулярно-генетических механизмов раннего развития головного мозга - одна из фундаментальных задач функциональной геномики. Знание этих механизмов так же важно для понимания природы многих наследственных заболеваний у человека.

Среди всех отделов головного мозга в наименьшей степени изучены механизмы развития т.н. переднего мозга. Вместе с тем, выяснение именно этих механизмов крайне важно ввиду того, что передний мозг отвечает за высшие формы нервной деятельности, в том числе, за мышление у человека. Кроме того, передний мозг является одним из основных анатомических признаков, отличающих позвоночных животных от всех других организмов. Поэтому изучение механизмов его развития важно для понимания особенностей эволюции типа позвоночных животных в целом.

Эффективным подходом к решению указанной задачи может быть поиск и изучение функций регуляторных белков, определяющих пространственно-временное "расписание" дифференцировки клеток в зачатке переднего мозга.

Ранее, в группе молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН, был идентифицирован новый класс гомеодоменных транскрипционных факторов, Ап^ ответственных за наиболее раннюю стадию развития зачатка переднего мозга (2ага1зку е1 а1., 1992; 2ага1зку а1., 1995; Кагашкауа е1 а1., 1997). На модели эмбрионов шпорцевой лягушки было показано, что представитель данного класса транскрипционных факторов, ХапМ, играет ключевую роль в развитии зачатка переднего мозга, а искусственно вызванная активация Хап/-1 вне зоны его нормальной экспрессии - в передней части нервной пластинки -приводит к серьезным аномалиям переднего мозга (БаИаш & а1., 1998; Егшакоуа е1 а1., 1999).

В связи с этим, актуальной задачей является поиск и изучение функций специфических транскрипционных факторов, обеспечивающих строгую пространственную локализацию экспрессии Хап/-1 в границах будущего зачатка переднего мозга.

Поскольку решение данной задачи сопряжено со значительными трудностями, обусловленными, прежде всего, малыми размерами раннего зачатка переднего мозга и, как следствие, весьма низкой копийностью искомых транскрипционных факторов, актуальной технической задачей является разработка методики, позволяющей проводить систематический поиск таких факторов с помощью экспрессионных кДНК библиотек эмбриональных клеток.

Решение этих двух задач представляется важным не только для выяснения механизмов, контролирующих экспрессию одного из ключевых регуляторов дифференцировки переднего мозга, гена Хап/-1, но и с точки зрения разработки универсальных подходов к изучению механизмов регуляции экспрессии генов в индивидуальном развитии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мартынова, Наталья Юрьевна, Москва

1. Зарайский А. Г. 2004. Изучение молекулярно-генетических механизмовразвития мозга на модели эмбрионов шпорцевой лягушки. Молекулярная биология, Т.38, № 1, с. 40-47

2. Казанская О.В., Ермакова Г.В., Паннезе М., Бончиннелли Е,

3. Зарайский, А.Г. (1998), Клонирование кДНК трех новыхгомеобокс-содержащих генов класса Anf из человека, курицы и испанского тритона. Ь'моорганмчес/сйл химия 24,186-193.

4. Amaya, E.,Musci,T.J., and Kirscher,M.W.(1991) Expression of adominant-negative mutant of the FGF receptor disrupts mesoderm formation in

6. Ang, S.-L., and Rossant, J. (1994). HNF-Зр is essential for node andnotochord formation in mouse development. Cell 78, 561-574.

7. Arend, D., and Niibler-Jang, K. (1994). Imversion of dorsoventral axis?1. Nature 311, 26.

8. Asano M, Emori Y, Saigo K, Shiokawa K., 1992, Isolation andcharacterization of a Xenopus cDNA which encodes a homeodomain highly homologous to Drosophila Distal-less. J Biol Chem. Mar 15;267(8):5044-7.

9. Barth, K. A., Wilson, S. W. (1995). Expression of zebrafish nkx2.2 isinfluenced by sonic hedgehog/vertebrate hedgehog-1 and demarcates a zone of neuronal differentiation in the embryonic forebrain. Development 111, 1755-1768.

10. Basler, k., Edlund, Т., Jessel, T.M., and Yamada, T. (1993). Control of cellpattem in the neural tube: Regulation of cell differentiation by dorsalin-1, a novel

11. TGPp family member. Cell 1Ъ, 687-702.

12. Bauer, D.V., Huang, S., Moody, S.A. (1994). The cleavage stage origin of

13. Spemann's Organizer: analysis of the movements of blastomere clones beforeand during gastrulation in Xenopus. jDeve/opmew/120, 1179-89

14. Bayramov AV, Martynova NY, Eroshkin FM, Ermakova GV, Zaraisky

15. AG., 2004, The homeodomain-containing transcription factor X-nkx-5.1 inhibitsexpression of the homeobox gene Xanf-1 during the Xenopus laevis forebrain development.MecA Dev. Dec;121(12):1425-41.

16. Bellefroid, E. D., Kobbe, A., Gruss, P., Pieler, Т., Gurdon, J.B.,

17. Papalopulu, N. (1998).Xiro3 encodes a Xenopus homolog of the Drozophila1.oquois genes and functions in neural specification. EMBOJ. 17.191-203.

18. Bosse, A., Zulch, A., Becker, M. В., Torres, M., Gomes-Srarmeta, J.L.,

19. Modolell, J., Gruss, P. (1997). Identification of the vertebrate Iroquos homeoboxgene family with overlapping expression during early development of the nervous system. MecA. Dev. 67. 169-181.

20. Brewster, R., Lee, J., Ruiz I Altaba, A.(1998).Gli/Zic factors pattern theneural plate by defining domains of cell differentiation. Nature 393, 579-583.

21. Byrd, C.A., and Burd, G.D. (1993) The quantitative relationship betweenolfactory axons and mitral/tufted cells in developing Xenopus With partially deafferented olfactory bulbs. J. Neurobiol.24, 1229-1242.

22. Chen, Y.-P., Huang, Y., and Solursh, M. (1994). A concentration gradientof retinoids in the early Xenopus laevis embrio. Dev. Biol. 161, 70-76.

23. Chiang, C , Litingtung, Y., Lee, E., Young, K. E., Corden, J. L., Westhal,

24. H. and Beachy, P.A. (1996). Cuclopia and defective axial pattering in micelacking Sonic hedgehog gene function. Nature 383, 407-413.

25. Chitnis, A., Mntner C. (1996). Sensitivity of proneural genes to lateralinhibition affects the pattern of primary neurons mXenopus embryos. Development 122,2295-2301.

26. Chitnis, A. (1999). Control of neurogenesis-lessons from frog, fish and flies.

27. Current Opinion in Neurobiology 9, 18-25.

28. Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., and Kintler, C.(1995). Primary neurogenesis mXenopus embrios regulated by a homologue of

29. Drosophila neurogenesis gene Delta. Nature Ъ1?>, 761-766.

30. Chow, R.L., Altmann, C. R., Lang, R. A., and Haemmati-Brivanlou, A.(1999), Pax6 induces ectopic eyes in a vertebrate. Development 126,4213-4222.

31. Cho KW, Blumberg B, Steinbeisser H, De Robertis EM.

32. Molecular nature of Spemann's organizer: the role of the Xenopus homeobox genegoosecoid.Ce//67:1111-20.

33. Cox, W. G., and Hemmati-Brivanlou, A. (1995). Caudalization of neuralfate by tissue recombination and bFGF. Development 121, 4349-4358.

34. Couly, G. and Le Dourin, N.M. (1988). The fate map of the cephalic neuralprimordium at the presomitic to the 3-somite stage in the avian embryo.

35. Development 103, Supplement, 101-113.

36. Crossley, P. H., Martinez, S. and Martin, G. R. (1996). Midbraindevelopment induced by FGF8 in the chick embryo. Nature 380, 66-68.

37. Cohen SM, Jurgens G., 1989, Proximal-distal pattern formation in

38. Drosophila: cell autonomous requirement for Distall-less gene activity in limbdevelopment. EMBO J, 8, 2045-2055

39. Cunliffe, v., and Smith, J. C. (1994). Specification of mesodermal pattern in

40. Xenopus laevis by interaction between Brachiyry, noggin, and Xwnt-8. EMBO J.13, 349-359.

41. Diakoku, S., Chikamori, M., Adachi, Т., Okamura, Y., Nishiyama, T. and

42. Tsurio, Y. (1983). Ontogenesis of hзфothalamic immunoreactive ACTH cells invivo and in vitro: role of Rathke's pouch. Dev. Biol. 97, 81-88.

43. Dale, L., Howes, G., Price, B.M. J., and Smith J. С (1992). Bonemorfogenetic protein 4: A ventralizing factor in early Xenopus development. 1. Development 115, 573-585.

44. Davidson, D. R., and Hill, R. E. (1991). Msh-like genes: A family ofhomeobox genes with wide- ranging expression during vertebrate development.

46. Dattani M. Т., Martinez-Barbera J. P., Thomas P. Q., Brickman J. M.,

47. Gupta R., Mortensson I. L., Toresson H., Fox M., Wales J. K., Hindmarsh P.

48. C, Krauss S., Beddington R. S. and Robinson I. C , 1998. Mutations in thehomeobox gene HESXl/Hesxl associated with septo-optic dysplasia in human and mouse. Nat. Genet. 19, 125-133.

49. Dirksen ML, Mathers P, Jamrich M., 1993, Expression of a Xenopus

50. Distal-less homeobox gene involved in forebrain and cranio-facial development.

52. De Robertis, E. M., and Sasai, Y. (1996). A common plan for dorso-ventralpatterning in Bilateria. Nature 380, 37-40,

53. De Robertis E.M. and Kuroda H. (2004). Dorsal-Ventral patterning andneural induction in Xenopus embrios. Ann.Rev.Cell Dev.Biol.2004.20:258-308

54. Deschet, K., Bourrat, F., Chourrout, D., Joly, J.S. (1998). Expressiondomain of the medaca ( Oryzias latipes) 01-Gsh 1 gene are reminiscent of those of clustered and orphan homeoboxes genes. Dev. Genes Evol. 208. 235-244.

55. Dirksen, M. L., and Jamrich, M. (1992). A novel,activin-inducible,blastopore lip- specific gene of Xenopus laevis contains a fork-head DNA binding domain. Genes Dev. 6, 599-608.

56. Doniach, T. (1993), Planar and vertical induction of anterioposterior patternduring the development of the amphibian central nervous system. J. Neurobiol. 24, 1256-1275.

57. Doniach, T. (1995). Basic FGF as induscer of anteroposterior neural pattern.1. Ce//83, 1067-1070.

58. Eagleson, G., Ferreiro, B. and Harris, W. A. (1995). Fate of anterior neuralridge and morphogenesis oiibQ Xenopus forebrain. J. Neurobiol. 28, 14158.

59. Echelard, Y., Epstein, D.J., St-Jacques, В., Shen, L., Mohleer, J.,

60. McMahon, J. A., and McMahon, A. P. (1993). Sonic hedgehog, a member of afamily of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity. Ce//75, 1417-1430.

61. Ekker, M., Akimenko M.A., AUende, M.L., Smith, R., Droin, G.,1.ngille, R. M., Weinberg, E.S., Westerfield, M. (1997). Relationship among msx gme structure and function in zebrafish and other vertebrates. Mol. Biol. Evol. 14,1008-1022.

62. Ekker, S.C., Mc Grew, L. L., Lai, C.-J., Lee, J. J., von Kessler, D. P.,

63. Moon, R. Т., and Beachy, P. A. (1995), Disting expression and shared activitiesof members of the hedgehog gene family of Xenopus laevis. Development 121, 2337-2347.

64. Ermakova, G. V., Alexandrova, E.M., Kazanskaya, O. V., Vasiliev, O. L.,

65. Smith, M. W., and Zaraisky, A.G. (1999). The homeobox gene, Xanf-l cancontrol both neural differentiation and pattering in the presumptive anterior neuroectoderm of iheXenopus laevis embryo. Development 126,4513-4523.

66. Eroshkin F, Kazanskaya O, Martynova N, Zaraisky A., 2002.

67. Characterization of cis-regulatory elements of the homeobox gene Xanf-l. Gene285, 279-286.

68. Fainsod, A., Steibeisser, H., and De Robertis, E. M. (1994). On thefunction of BMP-4 in patterning the marginal zone of the Xenopus embrio. EMBO 1. J. 13,5015-5025.

69. Fan, C.-M., Porter, J. A., Chiang, C, Chang, D. Т., Beachy, P. A., and

70. Tessier- Lavigne, M. (1995). Long-range sclerotome induction by sonichedgehog: Direct role of the amino- terminal cleavage product and modulation by the cyclic AMP signaling pathway. Cell 81, 457-465.

71. Fekany, K., Yamanaka, Y., Leung, Т., Sirotkin, H. I., Topczewski, J.,

72. Gates, M. A., Hibi, M., Renucci, A., Stemple, D., Radbill, A., et al. (1999). Thezebrafish bozozok locus encodes Drarma, a homeoprotein essential for induction of gastrula organizer and dorsoanterior embryonic structures. Development 126, 1427-1438.

73. Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., and Fishell, G. A. (1999). Amethod for rapid gain-of-fimction studies in the mouse embryonic neuros system.

75. Gammill LS, Sive H. (1997). Identification of otx2 target genes andrestrictions in ectodermal competence during Xenopus cement gland formation.

77. Geoffroy St. Hilaire, E. (1822). Considerations generales sur la vertebre.

79. Glinca,A., Wu, W., Onichtchouk, D., Blumenstock, C, and Niers, C.(1998). Dickkopf-1 is a member of a new family of secreted proteins and function in head induction. Nature 3, 357-362.

80. Gomes-Skarmeta, J. L., del Corral, R. D., de la Calle-Mustlnes, E., Ferre

81. Marco, D., Modolell, J. (1996). Araucan and caupolican, two members of thenovel Iroquois complex, encode homeoproteins that control proneural and veinforming genes. Cell 85, 95-105.

82. Gomes- Skarlmeta, J. L., Glavic, A., da la Calle-Mustienes,E., Modolell,

83. J.,Mayor, R. (1998). Xiro, a Xenopus homolog of the Drosophila Iroquoiscomplex genes, control development at the neural plate. EMBOJ. 17, 181-190.

84. Graff, J. M., Thries, R. S., Song, J. J., Celeste, A. J., and Melton, D. A.(1994). Studies sNiih^i Xenopus BMP receptor suggest that ventral mesodermindusing signals override dorsal signals in vivo. Cell 79, 169-179.

85. Graziadei, P. P. С and Monti- Graziadei, A. G. (1992). The influence ofthe olfactory placode on the development of the telencephalon ш Xenopus laevis. 1. Neurosci. 46, 617-629.

86. Grinblat, Y., Gamse, J., Patel, M., Sive, H. (1998). Determination of thezebrafish forebrain: induction and pattering. Development 125, 4403-4416.

87. Gristman, K., Zhang, J., Cheng, S., Heckscher, E., Talbot, W., and

88. Schier, A. (1999). The EGF-CFC protein one-eyed pinhead is essential for nodalsignaling. Ce//97,121-132.

89. Gristman, K., Talbot, W., and Schier, A.S.(2000). Nodal signaling patternsthe organizer. Development 127, 921-932.

90. Grosschendl, г., Gierse, K., and Pagel, J. (1994). HMG domain proteins:

91. Architectaral elements in the assembly of nucleoprotein structures. Trends Genet.10, 94-99.

92. Gruss, P., and Walter, C. (1992). Pax in development. Cell 69, 719-722.

93. Hamburger, V.(1988)" The Heritage of Experimental Embryology: Hans

94. Spemann and the Organizer" Oxford Univ. Press, Oxford.

95. Gstaiger M, Knoepfel L, Georgiev O, Schaffner W, Hovens CM.(1995)

96. А B-cell coactivator of octamer-binding transcription factors.

98. Haremaki T, Tanaka Y, Hongo I, Yuge M, Okamoto H. (2003) Integrationof multiple signal transducing pathways on Fgf response elements of the Xenopus caudal homologue Xcad3. Development. Oct;130(20):4907-17. Epub 2003 Aug 20.

99. Hashimoto, H., Itoh, M., Yamanaka, Y., Yamashita, S., Shimizu, Т.,

100. Solica-Krezel, L., Hibi, M., and Hirano, T. (2000). Zebrafish Dkkl function inforebrain specification and axial mesendroderm formation. Dev. Biol. 217,138-152.

101. Harland R. M., 1991. In situ hybridization: an improved whole-mountmethod for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695.

102. Hawley, S. H. В., Wunneberg-Stapleton, K., Hashimoto, C, Laurent, M.

103. N., Watanabe, Т., Blumberg, B. W., and Cho, K. W. Y. (1995). Disruption of

104. BMP signals in embryonic Xenopus ectoderm leads to direct neural induction.1. Genes Dev. 9,2923-2935.

105. Heisenberg, C.-P., Brand, M., Jiang, Y.-J., Warga, R., Beuchle, D., van

106. Eeden, F.J.M., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt,

107. M., et al. (1996). Genes involved in forebrain development in the zebrafish, Danioverio. Development 123, 191-203.

108. Hemmati-Brivanlou, A., Stewart, R. M., and Harland, R. M. (1990).

109. Region-specific neural induction of an engrailed protein by anterior notochord in

111. Hemmati-Brivanlou, A., and Melton, D. (1994). Inhibition of activinreceptor signaling promotes neutralization in Xenopus. Cell 77, 273-281.

112. Hemmati-Brivanlou, A., and Melton, D.(1997). Vertebrate neural induction.

114. Hermesz E., Mackem S., Mahon K. A., 1996. Rpx: a novel anteriorrestricted homeobox gene progressively activated in the prechordal plate, anterior neural plate and Rathke's pouch of the mouse embryo. Development 122, 41-52.

115. HoUey, S. A., Jackson, P. D., Sasai, Y., Lu, В., De Robertis, E. M.,

116. Hoffmann, F. M., and Ferguson, E. L. (1995), A conserved system for dorsoventral pattering in insects and verterbrates involving sog and chd. Nature 376, 249-253.

117. Jacobson M. (1990). Methods for clonal analysis and tracing cell lineages inthe verterbrate CNS. In Methods in Neuroscience, ed PM Conn. Orlando, FL: 1. Academic.

118. Jacobson, A.G. (1963). The determination and positioning of the nose, lensand ear. Interactions within the ectoderm, and between the ectoderm and underlying tissues. J. Exp. Zool. 154, 273-284.

119. Jaynes, J.B. and O'Farrell, P.H. (1991). Active repression of transcriptionby the engrailed homeodomain protein. ^ MBO J. 10, 1427-1433.

120. Jones, C. M., Lyons, K. M., Lapan, P. M., Wright, С V. E., and Hogan,

121. B. L. M. (1992). DVR-4 (bone morphogenetic protein-4) as a posteriorventralizing factor mXenopus mesoderm induction. Development 115, 639-647.

122. Kazanskaya, O., Glinka, A., and Niehrs, C. (2000). The role of Xenopusdickkopfl in prechordal plate specification and neural pattering. Development 127, 4981-4992.

123. Kaestner, K.H. (2000). The hepatocyte nuclear factor 3 (HNF3 or FOXA)family in metabolism. Trends Endocrinol. Metab. 11,281-285.

124. Kaufmann, E., Muller, D., Knochel, W. (1995). DNA recognition siteanalysis of Xenopus winged helix proteins. J. Mol. Biol. 248, 239-254.

125. Kessler, D. S. and Melton, D. A. (1994). Verterbrate Embryonic Induction:

126. Mesodermal and Neural Pattering. Science 266, 596-604.

127. Kim, C.-H., Oda, Т., Itoh, M., Jiag, D., Artinger, K. В.,

128. Chandrasekharappa, S. C, Driever, W., and Chinis, A.B. (2000). Repressoractivity of haedless/ TcF3 is essential for vertebraite head formation. Nature 407, 913-916. »

129. Knoetgen, Н., Teichmann, U., and Kessel, M. (1999). Head-organizingactivities of endodermal tissues in vertebrates. Cell. Mol Biol. 45, 481-492.

130. Kobayashi, M., Toyama, R., Takeda, H., Dawid, I. В., and Kawakami, K.(1998). Overexpression of forebrain-specific homeobox gene six3 induces rostral forebrain enlagement in zebrafish. Development 125, 2973-2982.

131. Korzh, v., Sleptsova, I., Liao, J., HE, J., Gong, Z. (1998). Expression ofzebrafish bHLH genes ngnland nrd defines disting stages of neural differentiation. 1. Dev.Z)y«. 213, 92-104.

132. Krauss, S., Concordet, J.-P., and Ingham, P. W, (1993). A functionalconserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell IS, 1431-1444.

133. Kudo N, Kimura Y. (2002) Nuclear DNA endoreduplication during petaldevelopment in cabbage: relationship between ploidy levels and cell size. J Exp ^ot.May;53(371):1017-23

134. Kuo, J. C, Patel, M., Gamse, J., Merzdorf, C, Liu, X., Apekin, V., Sive,

135. TGF-beta inhibits pulmonary surfactant protein-B gene transcription through

136. SMAD3 interactions with NKX2.1 and HNF-3 transcription factors. J. Biol.1. С/гет. 277,38399-38408.

137. Mangold, O. (1933). Uber die Induktionsfahigkeit der vershiedenen Bezirkeder Neurula von Urodelen. Naturwissenshaften 12, 761-76

138. Martynova N, Eroshkin F, Ermakova G, Bayramov A, Gray J, Grainger

139. R, Zaraisky A., 2004, Patterning the forebrain: FoxA4a/Pintallavis and Xvent2determine the posterior limit of Xanfl expression in the neural plate. Development. 1. May;131(10):2329-38.

140. Masai, I. M., Heisenberg, C.-P.H., Barth, K.A., Macdonald, R., Adamek,

141. S., and Wilson, S. W. (1997). Floating head and masterhlind regulate neuronalpattering in the roof of the forebrain. Neuron 18,43-57.

142. McChinnis, W., and Krumlaf, R.(1992). Homeobox genes and axialpattering. Cell 68, 283-302.

143. Mizuseki, K., Kishi, M., Metsui, M., Nacanishi, S., Sasai, Y. (1998).

144. Xenopus and Zic- related-1 Sox-2, two factors induced by chordin, have distingactivities in the initiation of neural induction. Development 125, 579-587.

145. Mizuseki, K., Kishi, M., Shiota, K, Nacanishi, S., Sasai, Y. (1998).Sox D:an essential mediator of induction of anterior neural tissues in Xenopus embryos. 1. Neuron, 21, 77-85.

146. Morgan, R., Sargent, M.G. (1997). The role in neural pattering of translationinitiation factor elF4AII; induction of neural fold genes. Development 124, 27512760. по

147. Nakata, К., Nagai, Т., Aruga, J., Mikoshiba, K.(1997) JCenopus Zic3, aprimary regulator both in neural and neural crest development. Proc. Natl. Acad. 1. Sci. ШЛ. 94, 11980-11985.

148. Nakata, K., Nagai, Т., Aruga, J., Mikoshiba, K. (1998).Xenopus Zic familyand its role in neural and naural crest development. Mech. Dev. 75, 43-51.

149. Niehrs, C. (1999). Head in WNT. Trends Genet. 15, 314-319.

150. Nieuwkoop, P. D.(1952). Activation and organization of the central nervoussystem in amphibians.Part 1,2,/. Exp. Zool. 120, 1-81.

151. Nieuwkoop, P. D., and Koster, K. (1995). Vertical versus planar inductionin amphibian early development. Dev. Growth Differ. 37, 653-688.

152. Nieuwkoop, P.D., and Nigtevecht, G.V. (1954). Neural activation andtransformation in explants of competent ectoderm under the influence of fragments of anterior notochord mmodolQS. J.Embryol. Exp.Morph. 2, 175-193.

153. Ntisslein-Volhard, C, and Wieschaus, E. (1980). Mutations affectingsegment number and polarity in Drosophila. Nature 287, 795-801.

154. Onichtch ouk, D., Gawantka, V., Dosch, R., Delius, H., Hirschfeld, K.,

155. Blumenstock, C , Niehrs, C. (1997). The Xvent-2 homeobox gene is part of the

156. BMP-4 signalling pathway controlling dorsoventral patterning of Xenopusmesoderm. Development 122, 3045-3053.

157. Wilson SI, Edlund T.(2001) Neural induction: toward a unifying mechanism.

158. NatNeurosci. 2001 Nov;4 Supphl 161-8

159. Padgett, R. W., ST. Johnson, R.D., and Gelbart, W. M.(1993). Human

160. BMP-4 can confer normal dorsal-ventral pattering in the Drosophila embryo. Proc.

161. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2905-2909.

162. Penton, A., Chen, Y., Staehling-Hampton, K., Wrana, j.l., Attisano, L.,

163. Szidonua, J., Cassill, J. A., Massaque, J., and Hoffman, F. M. (1994).1.entification of two bone morphogenetic protein type 1 reseptors in Drosophila and evidence that Brk 25D is a decapentaplegic receptor. Cell 78, 239-250. 1.l l

164. Papalopulu N, Kintner C, 1993, Xenopus Distal-less related homeoboxgenes are expressed in the developing forebrain and are induced by planar signals.

166. Perea-Gomes, A., Rhinn, M., and Ang, S.-L. (2000). Role of anteriorvisceral endoderm in restricting posterior signals in the mouse embryo. Int. J. Biol. 45.

167. Piccolo, S., Aguis, E., Leyns, L., Bhattacharyya, S., Grunz, H.,

168. Bowmeester, Т., and De Robertis, E. M. (1999). The head inducer Cerberus is amultifunctional antagonist of nodal, BMP and Wnt signals. Nature 397, 707-710.

169. Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, В., and De Robertis, E. M. (1996), Dorso-ventralpattering m Xenopus: Inhibition of ventral signals by direct binding of Chordin to 1. BMP-4. Cell 86, 589-598.

170. Price, M. (1993). Members of the Dlx- and Nkx-2-genes families areregionally expressed in the developing forebrain. J. Neurobiol. 24, 1385-1399.

171. Rao, Y. (1994). Conversion of mesodermalizing molecule, ihQ Xenopus

172. Brachiury gene, into a neuralizing factor. Genes Dev. 8, 939-947,

173. Richter, K., Grunz, H., and Dawid, I. B, (1988), Gene expression in theembryonic nervous system of Xenopus laevis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8086-8090.

174. Riddle, R. D., Johnson, R.L., Laufer, E., and Tabin, C. (1993). Sonichedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell 75, 1401-1416.

175. Rlssi, M., Wittbrodt, J., Delot, E., Naegeli, M., and Rosa, F. M. (1995),

176. Zebrafish Radar: A new member of the TGF-P superfamily defines dorsal regionsof the neural plate and the embryonic retina. Mech. Dev. 49, 223-224.

177. Roelink, H., Augsburger, A., Heemskerk, J., Korz, V., Norlin, S., Ruiz i

178. Ataba, A., Tanabe, Y., Placzek, M., Edlund, Т., Jessel, T. M., and Dodd, J.(1994). Floor plate and motor neuron induction by vhh-1, a verterbrate homolog of hedgehog expressed by the notochord. Cell 16, 761-775,

179. Rubenstein, J.L. R., Shimamura, K. (1998), Regionalization of theprozencephalic neural plate, Annu. Rev.Neurosci. 21,445-477,

180. Ruiz I Altaba, A. (1992). Planar and vertical signals in the induction andpattering of the Xenopus nervous system. Development 115, 67-80.

181. Ruiz I Altaba, A., and Jessell, T. M. (1991). Retinoid acid modifies thepattern of cell differentiation in the central nervous system of neurula stage

182. Xenopus embryos. Development 112, 945-958.

183. Ruiz I Altaba, A., and Jessell, T. M. (1992). Pintallavis, a gene expressed inthe organizer and midline cells of firog embryos: Involvement in the development of the neural axis. Development 116, 81-93.

184. Ruiz i Altaba, A., Cox, C, Jessell, T.M., Klar, A. (1993). Ectopic neuralexpressionof a floor plate marker in frog embryos injected with the midline transcription factor Pintallavis. Proc. Natl. Acad. Set 90, 8268-8272.

185. Saha, M. S., Servetnic, M. and Granger, R.M. (1992). Vertebrate eyedevelopment. Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 582-588.

186. Sasai, Y., Lu, В., Steinbeisser, H., Geissert, D., Gont, L. K., and De

187. Robertis, E. M. (1994). Xenopus chordin: a novel dorsalizing factor activated byorganizer-specific homeoboxes genes. Cell 79, 779-790.

188. Sasai, Y., Lu, В., Steinbeisser, H., and De Robertis, E. M. (1995).

189. Regulation of neural indaction by the chd and BMP-4 antagonistic pattering signalsin Xenopus. Nature 376, 333-336.

190. Sasai, Y. (1998). Identifying the missing links: genes that connect neuralinduction and primary neurogenesis in vertebrait embryos. Neuron 21, 455-458.

191. Saxen, L. (1989). Neural induction. Int. J. Dev. Biol. 33, 21-48.

192. Saxen, L., and Toivonen, S. (1961). The two-gradient hypothesis in primaryinduction: The combined effect of two types of indusers mixed in different ratios.

194. Schier, A.F., and Shen, M. M. (2000). Nodal signaling in vertebratedevelopment. Nature 403, 385-389.

195. Schmidt, J.E., Suzuki, A., Ueno, N., and Kimelman, D. (1995). Localized

196. BMP-4 mediates dorso/ventral pattering in the Qarly Xenopus embryo. Dev. Biol.169,37-50. 1. ИЗ

197. Schuler-Metz А, Knochel S, Kaufmann E, Knochel W. (2000). Thehomeodomain transcription factor Xvent-2 mediates autocatalytic regulation of

198. BMP-4 expression in Xenopus embryos. J. Biol. Chem. 275, 34365-34374.

199. Sive H.L., Grainger R. M., Harland R. M., 2000, Early development of

200. Xenopus laevis., Cold spring harbor.

201. Shanmugalingam, S., Houart, C, Picker, A., Reifers, F., Macdonald, R.,

202. Barth, K. A., Griff, K., Brand, M., and Wilson, S.W. (2000). Ace/fgf8 isrequired for forebrain commissure formation and pattering of the telencephalon.

204. Sharpe, C. R. (1991). Retinoic acid can mimic endogenous signals involvedin transformation oiihQ Xenopus nervous system. Neuron 1, 239-247.

205. Shimamura, K., Martinez, S., Puelles, L. and Rubenstein, J. L. R,(1997).

206. Pattems of gene expression in the neural plate and neural tube subdivide theembryonic forebrain into transverse and longitudinal domains. Dev. Neurosci. 19, 88-96.

207. Shimamura, K., Martinez, S., Puelles, L. and Rubenstein, J. L. R. (1997).1.ductive interactions direct early regionalization of the mouse forebrain.

209. Shimeld, S.M., Holland, P.W. (2000). Vertebrate innovations. Proc. Natl.1. Acad. Sci.,91, 4449-4452.

210. Smith, W. C, and Harland, R. M. (1992). Expression cloning of noggin, anew dorsalizing factor localized to the Spermann organizer in Xenopus embryos. 1. Cell 70, 829-840.

211. Schnapp E, Tamaka EM.(2005). Quantitative evaluation of morpholinomediated protein knockdown of GFP, MSXl, and PAX7 during tail regeneration in

212. Ambystoma mexicanum. Dev Dyn. 2005 Jan;232(l): 162-70.

213. Spermann, H., and Mangold, H. (1924). Uber induction von Embryo

214. Thisse, В., Wright, C.V.E., and Thisse, С (2000). Activin and Nodalrelated factors control anterior-posterior pattering of the zebrafish embryo. Nature 403, 425-428.

215. Streit A, Berliner AJ, Papanayotou C, Sirulnik A, Stern CD.(2000)1.itiation of neural induction by FGF signalling before gastrulation. Nature. Jul 6;406(6791):74-8 425-428.

216. Thomas, P.Q., Johnson, B.V., Rathjen, J. and Rathjen, P.D. (1995).

217. Sequense, genomic organization, and expression of the novel homeobox gene

218. Hesxl. J.Biol.Chem. 270, 3869-3875.

219. Torresson, H., Potter, S.S., and Campbell, K. (2000). Genetic control ofdorsal-ventral identity in the telencephalon: opposing roles for Pax 6 and Gsh2.

221. Tribulo C, Aybar MJ, Nguyen VH, Mullins MC, Mayor R.

222. Regulation of Msx genes by a Bmp gradient is essential for neural crestspecification. Development. 2003 Dec; 130(26):6441-52. Epub 2003 Nov 19.

223. Trindade, M., Tada, M. and Smith, J. C. (1999). DNA-binding specificityand embryological function of Xom (Xvent-2), Dev. Biol 216, 442-456.

224. Valerius, M. Т., Li, H., Stok, J.L., Weistein, M., Kaur, S., Singh,

225. G.,Potter, S.S. (1995).Gsh-l: a nowel murine homeobox gene expressed in thecentral nervous system. Dev. Dyn. 203, 337-351.

226. Wang, J.C., Waltner-Law, M., Yamada, K., Osawa, H., Stifani, S.,

227. Granner, D.K. (2000). Transducin-like enhancer of split proteins, the humanhomologs of Drosophila groucho, interact with hepatic nuclear factor 3beta. J.

229. Webb, J. F., and Noden, D. M. (1993). Ectodermal placodes: contributionsto the development of the vertebrate head. Amer. Zool. 33, АЪ^АА!.

230. Weiss, J.B., Von Ohlen, Т., Mellerick, D. M., Dressier, G., Doe, C.Q.,

231. Scot, M.P.(1998). Dorsoventral pattering in the Drosophila central nervoussystem: the intermediate neuroblast defective homeobox gene specifies intermediate column identity. Genes Dev. 12. 3591-3602.

232. Wilson SI, Edlund T.(2001) Neural induction: toward a unifyingmechanism.A^a^ Neurosci^ov,^ Supphl 161-8

233. Wilson S.W and Houart C.(2004) Early Steps in the Development of theorebrain. Developmental Cell, vol.6,167-181.

234. Wang MM, Reed RR.(1993) Molecular cloning of the olfactory neuronaltranscription factor Olf-l by genetic selection in yeast. .• Nature. 1993 Jul 8;364(6433):121-6

235. Zaraisky A. G., Ecochard V., Kazanskaya O. V., Lukyanov S. A.,

236. Fesenko I. V. and Duprat A.-M., (1995). The homeobox-containing gene

237. XANF-1 may control development of the Spemann organizer. Development 121,3839-3847.

238. Zaraisky A. G., Lukyanov S. A., Vasiliev O. L., Smirnov Y. V.,

239. Belyavsky, A. V., and Kazanskaya, O. V., 1992. A novel homeobox geneexpressed in the anterior neural plate of the Xenopus embryo. Dev. Biol. 152, 373382.

240. Zhang, J., Talbot, W.S., and Sehier, A.F. (1998). Positional cloningidentifies zebrafish one-eyed-pinhead as a permissive EGF-related ligand required during gastmlation. Cell 92, 241-251.