Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Белки, взаимодействующие с LIM-доменным цитоскелетным белком зиксином в раннем развитии центральной нервной системы шпорцевой лягушки Xenopus laevis

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Белки, взаимодействующие с LIM-доменным цитоскелетным белком зиксином в раннем развитии центральной нервной системы шпорцевой лягушки Xenopus laevis"

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова

На правах рукописи Людмила Викторовна Ермолина

Белки, взаимодействующие с ЫМ-доменным цитоскелетным белком зиксином в раннем развитии центральной нервной системы шпорцевой лягушки Хепория Ыеу'ю

Специальность - 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

о з ОЕВ 2011

Москва, 20 И

4843633

Работа выполнена

в лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (ИБХ РАН)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, руководитель лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН Зарайский Андрей Георгиевич

Официальные оппоненты:

чл.-корр. РАН, доктор биологических наук, руководитель лаборатории молекулярных технологий и инновационного центра «технопарк ИБХ» ИБХ РАН Лукьянов Сергей Анатольевич

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник группы клеточной биологии Института белка РАН Минин Александр Александрович

Ведущая организация:

Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Биологический факультет

Защита состоится «16» февраля 2011 года в 10 часов на заседании специализированного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан « -/У » января 2011 г.

Учёный секретарь Специализированного совета, Доктор физико-математических наук

Олейников В. А.

Актуальность проблемы

Дифференцировка клеток и морфогенетические движения являются основными процессами, обеспечивающими эмбриональное развитие. В. результате дифференциальной экспрессии генов возникают многочисленные типы клеток, правильное размещение которых в эмбрионе достигается благодаря перемещению отдельных клеток и клеточных пластов. Чтобы избежать аномалий развития, эти процессы должны быть четко скоординированы друг с другом. Поэтому выяснение механизмов, обеспечивающих; такую координацию, является одной из актуальных проблем молекулярной биологии развития. Одним из возможных подходов к решению данной задачи представляется поиск белков, способных, с одной стороны, регулировать морфогенетические движения клеток, а с другой - физически взаимодействовать с белками, регулирующими дифференцировку эмбриональных клеток.

Как известно, важную роль в регионализации эмбриона, а также в эмбриональной клеточной дифференцировке играют гомеодоменные транскрипционные факторы, кодируемые гомеобоксными генами (McGinnis and Krumlauf, 1992). Ранее в нашей лаборатории был идентифицирован новый класс гомеодоменных транскрипционных факторов Anf (от Anterior Neural Fold - передний нервный валик) (Zaraisky et al., 1992; Kazanskaya et al., 1997). Было показано, что представитель данного класса белков у шпорцевой лягушки Xenopus laevis (белок Xanfl) контролирует ранние стадии развития зачатка переднего мозга, из которого в ходе развития формируются большие полушария, а также промежуточный отдел головного мозга и глаза (Ermakova et al., 1999; Ermakova et al., 2007)

В настоящей работе в результате поиска белковых партнеров гомеодоменного белка Xanfl с помощью дрожжевой двугибридной системы на модели эмбрионов шпорцевой лягушки Xenopus laevis был идентифицирован неизвестный ранее у лягушки гомолог цитоскелетного LIM-доменного белка зиксина. Было показано, что связывание зиксина с белком Xanfl приводит к подавлению репрессорной активности Xanfl в клетках зачатка переднего мозга зародышей. Полученные данные представляют значительный интерес в связи с тем, что зиксин известен как белок-регулятор сборки актиновых микрофиламентов и формирования клеточных контактов, что, в свою очередь, является необходимой базой для морфогенетических движений клеток в эмбриогенезе. Таким образом, выявленная в настоящей работе способность зиксина модулировать активность гомеодоменного белка Xanfl указывает на возможный механизм связи морфогенетических движений клеток зачатка мозга посредством зиксина с их транскрипционным аппаратом, контролируемым белком Xanfl. В частности, подобному влиянию зиксина может способствовать выявленная у него недавно способность перемещаться из клеточных контактов в ядро в ответ на приложенные к клетке механические напряжения (Cattaruzza et al., 2004; Yoshigi et al., 2005).

Полученные данные о взаимодействии зиксина с Xanfl, а также известная из литературы способность зиксина взаимодействовать со многими белками в культуре клеток, позволяют предположить, что в эмбриональном развитии зиксин может влиять на активность ряда других транскрипционных факторов и белков, вовлеченных во внутриклеточную передачу сигналов. В связи с этим, представляется актуальным целенаправленный поиск таких белков-партнеров зиксина. Идентификация подобных белков - перспективный подход к проблеме выяснения механизмов связи между морфогенезом и клеточной дифференцировкой в эмбриональном развитии. В рамках настоящей работы поиск белков, способных взаимодействовать с зиксином, был проведен с помощью дрожжевой двугибридной системы. В результате было обнаружено взаимодействие зиксина с несколькими белками, входящими в состав сигнального каскада, запускаемого секретируемыми белками семейства Hedgehog. Данный каскад играет ключевую роль в регуляции множества процессов в нормальном эмбриогенезе, а также при паталогии, например, при некоторых онкологических заболеваниях. Очевидно, что дальнейшее изучение роли зиксина в регуляции сигнального каскада Hedgehog будет представлять большой интерес, как для понимания фундаментальных механизмов координации морфогенеза и дифференцировки, так и с точки зрения возможного использования результатов таких исследований в различных биомедицинских приложениях.

Цель и задачи работы

Целью данной работы была идентификация белков, способных физически взаимодействовать с гомеодоменным фактором транскрипции Xanfl и изучение функций этих взаимодействий в раннем эмбриональном развитии головного мозга шпорцевой лягушки

Xenopus laevis.

В рамках поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Найти новые белки-партнеры транскрипционного фактора Xanfl. Клонировать полную нуклеотидную последовательность кДНК гомолога LIM-доменного белка зиксина шпорцевой лягушки, идентифицированного в результате проведенного поиска. Провести сравнительный анализ аминокислотной последовательности зиксина Xenopus laevis с последовательностями известных гомологов зиксина у других позвоночных.

2. Изучить пространственно-временную динамику экспрессии гена зиксина в процессе раннего развития зародышей шпорцевой лягушки.

3. Подтвердить независимыми методами способность Xanfl связываться с зиксином и локализовать белковые домены, отвечающие за это связывание.

4. Изучить на модели эмбрионов шпорцевой лягушки влияние зиксина на транскрипционную активность Xanfl.

5. Идентифицировать другие белки, взаимодействующие с зиксином в процессе эмбриогенеза.

Научная новизна

В ходе работы впервые был идентифицирован гомолог цитоскелетного LIM-доменного белка зиксина у шпорцевой лягушки. Клонирована полная последовательность кДНК этого белка и проведен структурный и сравнительный анализ его аминокислотной последовательности.

Впервые изучен пространственно-временной паттерн экспрессии гена зиксина в эмбриогенезе шпорцевой лягушки.

Впервые показана способность зиксина физически взаимодействовать с гомеодоменным транскрипционным фактором Xanfl и локализованы области взаимодействия этих белков.

Продемонстрировано ингибирующее влияние зиксина на репрессорную активность Xanfl в клетках зачатка головного мозга эмбрионов шпорцевой лягушки.

Впервые установлена способность зиксина связываться с тремя участниками сигнального каскада, запускаемого Hedgehog-белками: рецептором Ptc2.ii транскрипционными факторами Glil и Ziel.

Апробация диссертации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на III и IV Российских симпозиумах «Белки и пептиды» (Пущино, 16-21 сентября 2007 г. и Казань, 23-27 июня 2009 г., соответственно); XX зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико- химической биологии и биотехнологии» (Москва, 11-15 февраля 2008 г.); международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва-Пущино, 28 сентября - 2 октября 2009 г.); XVIII международной конференции и дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Гурзуф, 31 мая-10 июня 2010 г.).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 5 тезисов.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения и выводов, изложена на страницах машинописного текста, содержит рисунков. Список литературы включает работы.

Основное содержание работы

Поиск белков, взаимодействующих с транскрипционным фактором Xanfl, при помощи дрожжевой двугибридной ЬехА-снстемы

Для поиска потенциальных партнеров транскрипционного фактора Xanfl мы использовали дрожжевую двугибридную ЬехА-систему (CLONTECH), основанную на детекции взаимодействия двух белков по активации транскрипции репортерных генов в

дрожжевых клетках. В качестве целевой последовательности в bait-векторе pGilda была использована кДНК, кодирующая полноразмерный белок Xanfl. Данная конструкция была трансформирована в дрожжевые клетки штамма EGY48 совместно с кДНК-библиотекой из зародышей шпорцевой лягушки Xenopus ¡aevis на стадии поздней гаструлы - ранней нейрулы (ст. 12,5) в ргеу-векторе pB42AD (Matchmaker LexA two-hybrid system, CLONTECH). После выращивания трансформированных дрожжей на селективной среде без Leu, было отобрано 67 клонов с активированным колометрическнм репортерным геном LacZ с помощью метода Colony-lift filter assay.

Плазмиды pB42AD, содержащие вставки кДНК, были выделены из отобранных дрожжевых колоний, ре-трансформированы в клетки Е. coli для последующего выделения и повторной трансформации в дрожжевой штамм EGY48 вместе с контрольной плазмидой pLexA-laminC, кодирующей гибридный белок LexA-ламин С человека (66-230 а.о.). После проверки белок-белковых взаимодействий по вышеописанной методике, только 19 клонов оказались истинно положительными.

В результате секвенирования фрагментов кДНК, содержащихся в выделенных из найденных клонов плазмидах, и последующего анализа полученных последовательностей при помощи пакета программ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi') было показало, что они кодируют С-концевые фрагменты 4 различных белков, в том числе фрагмент не описанного ранее у шпорцевой лягушки белка, гомологичного цитоскелетному белку зиксину человека, мыши и курицы.

Как известно, зиксин участвует в регуляции динамики цитоскелета, включая формирование клеточных контактов и сборку актиновых стресс-фибрилл, крепящихся к контактам. В тоже время, зиксин способен перемещаться в ядро и влиять на экспрессию генов. Важно отметить, что одним из сигналов, вызывающих изменение внутриклеточной локализации зиксина в культуре клеток, являются приложенные к клетке механические напряжения (Cattaruzza et al., 2004; Yoshigi et al., 2005). Как известно, в индивидуальном развитии такие напряжения закономерно создаются в тканях эмбриона в результате морфогенетических движений самих клеток. Таким образом, в эмбриогенезе зиксин может участвовать в регуляции транскрипционной активности Xanfl в ответ на изменение морфогенетического статуса клетки, что в свою очередь является возможным звеном механизма, координирующего морфогенез с экспрессией генов. В связи с этим, дальнейшее изучение роли возможного взаимодействия зиксина с гомеодоменным транскрипционным фактором Xanfl в регуляции раннего развития зачатка головного мозга представляет значительный интерес.

Клонирование полноразмерной последовательности кДНК зиксина Xenopus laevis.

В результате скрининга кДНК библиотеки был идентифицирован фрагмент кДНК из 889 п.о., включающий последовательность, кодирующую 293 а.о. полипептид, гомологичный С-концевому региону белка зиксина у человека и курицы, а также З'-некодирующую последовательность. Фрагмент кДНК, включающий 5'-некодирующую последовательность и последовательность, кодирующую недостающий /^-концевой регион зиксина, был получен методом ПЦР с использованием праймеров, созданных на основе анализа перекрывающихся последовательностей из EST-базы данных (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cei). В качестве матрицы использовали исходную кДНК библиотеку из зародышей Xenopus laevis на стадии ранней нейрулы. Имеющиеся 5'- и 3'- концевые фрагменты кДНК зиксина были клонированы в открытой рамке считывания в экспрессионный вектор pSp64-poly(A) (Promega). Таким образом, была получена кДНК, кодирующая полноразмерный зиксин шпорцевой лягушки длиной 663 а.о. (GenBank EF051627). С помощью программ ExPASy Proteomics Server (http://www.expasv.org/tools) была определена расчетная молекулярная масса зиксина 70725,46Да.

Рис.1: Детекция белка зиксина в лизатах ооцитов X. laevis, инъецированных синтетической мРНК, кодирующей зиксин (дорожка 1), методом иммуноблота с использованием поликлональных кроличьих антител, специфичных к ("-концевому фрагменту зиксина шпорцевой лягушки. Для детекции эндогенного зиксина использовали лизаты неиъецированных (контрольных) ооцитов (дорожка 2).

На основе созданной конструкции была синтезирована мРНК, кодирующая зиксин. В результате трансляции полученной мРНК в ооцитах Xenopus laevis было показано, что синтезирующийся на данной матрице белок идентичен по молекулярной массе эндогенному нативному зиксину (105кДа; Рис.1, дорожка 1). Эндогенный и экзогенный белок детектировали методом иммуноблота с использованием полученных в нашей лаборатории поликлональных кроличьих антител, специфичных к С-концевой области зиксина из шпорцевой лягушки (373-664 а.о.). Разницу между расчетной и фактической молекулярной массой можно объяснить тем, что в клетках белок зиксин подвергается посттрансляционным модификациям, в частности, фосфорилированию, как и его гомологи у других позвоночных (Crawford and Beckerle, 1991; Macalma et al., 1996). С помощью программы NetPhos2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/) мы определили в молекуле зиксина из Xenopus laevis 38 потенциальных сайтов фосфорилирования (Ser: 31, Thr: 5, Туг: 2), в то время как его гомологи у человека и курицы содержат 30 таких остатков.

Экспрессия в ооци тах

Инъекция мРНК зиксина + —

ЗИКСИН —► ----

— 105.

к

ta

Дорожка 1 2

Иммуноблот с анти-зиксиновыми антителами

X huvLt £7. ¡¡allia H .xnpietis

A ¡nevis

G. xtrl/iix

¡pARví

нролмн - богатые участки

i^htfrnP^^pJtïPSKTÎÎi^AE^sS^VTpPûHEgJ-----§р0"~v : -;"f!

[PAO^ÇTÇPHVQSQPQI-----ij^Q^-Hvgsgjígvs^i^-Q^OP^^-igAgkFsgvypKFT

X luuvis п "■"""'.

rî— ^^^Гт'^Г' ^^^3 rSïJgM^gihrtggqhsghWtgqqdeT^QS : 43S

-----------------------------: 350

Рис.2: Сравнение аминокислотных последовательностей гомологов белка зиксина у шпорцевой лягушки (Xenopus laevis), курицы (Gallus gaüus) и человека (Homo sapiens). Черным цветом отмечены полностью гомологичные участки последовательностей, серым цветом - частично гомологичные. Доменная структура у приведенных белков высоко консервативна, но зиксин у шпорцевой лягушки длиннее по сравнению с его гомологами (строчными буквами обозначены последовательности, имеющиеся только у зиксина из Xenopus laevis, в последовательностях зиксина курицы и человека в этих участках поставлены прочерки).

С помощью пакета программ GeneBee (http://www.genebee.msii.su/emb.htrol) нами был проведен сравнительный анализ полученной полноразмерной последовательности белка зиксина у Xenopus laevis с последовательностями его гомологов у курицы (GenBank САА48936) и человека (GenBank NP_003452) (Рис.2). В молекуле зиксина лягушки содержится три структурных элемента, характерных для всех изученных зиксинов: /V-концевая часть с высоким содержанием остатков пролина, сигнальная последовательность экспорта из ядра (NES, nuclear export signal) и три LIM-домена, тандемно расположенные в С-концевой области. Наиболее консервативной частью найденного белка (80% гомологии) является его С-концевая часть (остатки 373-664), включающая NES и три LIM-домена, тогда как общая степень гомологии приведенных последовательностей составляет 53.2%.

Экспрессия гена зиксина в эмбриональном развитии Xenopus laevis

Поскольку ген зиксина у Xenopus laevis был описан нами впервые, мы провели подробное исследование пространственно-временной динамики его экспрессии в ходе раннего развития эмбрионов шпорцевой лягушки, начиная со стадии средней бластулы (ст.8), заканчивая

стадией хвостовой почки (ст.26), на которой зародыш начинает совершать спонтанные движения.

Временную динамику экспрессии гена зиксина изучали с помощью метода ПЦР, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) (Рис.ЗА). Для этого из зародышей на последовательных стадиях развития выделяли тотальную РНК, синтезировали на ее основе первую цепь кДНК, которую использовали в качестве матрицы в реакции ПЦР. В качестве контроля общего количества мРНК в используемых образцах анализировали уровень экспрессии гена фактора трансляции EF-1 a (elongation factor 1 alpha), который в норме должен быть приблизительно одинаковым в рассмотренном ряду стадий. В результате было установлено, что на стадии средней бластулы (ст. 8) мРНК зиксина синтезируется сравнительно слабо. В процессе развития к стадии поздней гаструлы-ранней нейрулы (ст. 12,5) уровень синтеза постепенно усиливается и сохраняется в дальнейшем на постоянном уровне.

развития зародышей Хепориэ 1аеу1$. А. Результаты ОТ-ПЦР с использованием праймеров к кДНК зиксина и в качестве матрицы образцов тотальной РНК, выделенной из зародышей на указанных стадиях развития, «-к»- контрольная реакция, проведенная без добавления фермента обратной транскриптазы. В качестве контроля приведен уровень экспрессии гена ЕР-1а на соответствующих стадиях развития. Б. Детекция белка зиксина в лизатах зародышей Хепорш \aevis на указанных стадиях развития методом иммуноблотинга с использованием поликлональных кроличьих антител, специфичных к зиксину. В качестве контроля приведен уровень синтеза белка альфа-тубулина. В.

9

Анализ паттерна экспрессии гена зиксина в зародышах шпорцевой лягушки методом гибридизации in situ. Темно-синее окрашивание, проявляющееся в результате реакции, маркирует клетки зародыша, содержащие мРНК исследуемого гена. В1. Стадия ранней гаструлы, вид зародыша анимальным полюсом вверх. В2. Стадия маленькой желточной пробки. Пунктирная линия обозначает границы будущей нервной пластинки. ВЗ. Ранняя стадия нервных валиков, вид со спины и с правого боку. В4. Стадия нервного желобка. BS. Стадия хвостовой почки. Доре - вид зародыша со спины (дорсальная сторона); латер - вид сбоку (латеральная сторона). Ст. 10 - стадия развития 10 (Nieuwkoop P.D., 1956) и т.д.

Для проверки полученных данных, определяли уровень синтеза белка зиксина в лизатах зародышей на нескольких последовательных стадиях развития методом иммуноблота с использованием поликлональных кроличьих антител, специфичных к зиксину (Рис.ЗБ). В качестве контроля общего уровня синтеза белков оценивали количество белка альфа-тубулина в исследуемых образцах лизатов методом иммуноблота с помощью мышиных моноклональных антител к а-тубулину (клон DM1A, Sigma). Полученные данные свидетельствуют о том, что на стадии поздней бластулы синтез белка зиксина находится на низком уровне, но плавно усиливается к началу нейруляции (ст. 13) и в дальнейшем развитии поддерживается на относительно постоянном уровне, что полностью согласуется с результатами ОТ-ПЦР. Тот факт, что уровень синтеза зиксина увеличивается в ходе гаструляции и нейруляции, когда происходят наиболее интенсивные морфогенетические движения клеток и клеточных пластов, указывает на важную роль зиксина в регуляции клеточной подвижности в раннем развитии.

In situ: Xanfl

In situ: Xanfl

In situ: зиксин

posteriori-► anterior-*-►posterior

In situ: зиксин

Рис.4. Сравнение паттернов экспрессии генов Xanfl (А) и зиксина (Б) в зародышах Xenopus laevis на стадии средней нейрулы (ст.15). Границы нервной пластинки отмечены пунктиром. Зародыши показаны с дорсально-антериорной стороны. А-Б'. Схематическое изображение окрашенных зародышей. Желтой пунктирной линией обозначена зона экспрессии Xanfl, красной пунктирной линией - антериорная граница нервной пластинки. В. Половинки одного зародыша шпорцевой лягушки на

стадии средней нейрулы, окрашенные по отдельности методом гибридизации ш situ с антисмысловым зондом, комплементарным мРНК Xanfl (слева) или зиксина (справа). В'. Схема продольных срезов зародыша. 1- передняя (антериорная) часть нервной пластинки.

Распределение мРНК зиксина в тканях развивающихся зародышей исследовали методом гибридизации in situ на целых зародышах с использованием антисмысловых РНК-зондов, комплементарных мРНК зиксина (Рнс.ЗВ). В результате было показано, что на стадии ранней гаструлы (ст.10) слабая экспрессия наблюдается в анимальной части зародыша (Рнс.ЗВ1). К концу гаструляции - началу нейруляции (ст. 12,5) экспрессия возрастает в клетках головной эктодермы эмбриона, особенно в области формирующейся нервной пластинки (Рис.ЗВ2). В течение нейруляции экспрессия продолжает усиливаться в передней части нервной пластинки и в граничащей с ней области не-нейральной эктодермы, в т.ч. в области будущей присоски, тогда как в задней части нервной пластинки (будущий спинной мозг) экспрессия ослабляется (Рис. ЗВЗ-4). На стадии хвостовой почки (ст.26) экспрессия наблюдается в наибольшей степени в области зачатка головного мозга, несколько слабее - в глазных и слуховых пузырях, сомитах и вокруг присоски, хотя в области самой присоски экспрессии нет (Рис.ЗВ5).

Зоны экспрессии гена зиксина не имеют четких границ. Очевидно, это связано с тем, что белок зиксин участвует в формировании клеточных контактов и регуляции сборки актиновых филаментов и поэтому должен синтезироваться в каждой клетке организма. Наиболее высокий уровень экспрессии наблюдается в клетках зачатка центральной нервной системы, особенно в его передней части, из которой формируется головной мозг. Исходя из этого, можно предположить, что зиксин играет специфическую роль в развитии ЦНС.

Подробное исследование паттерна экспрессии гена зиксина в ходе раннего развития позвоночных животных на примере шпорцевой лягушки, проведенное в данной работе, было сделано впервые. В работах, посвященных изучению гомологов зиксина у курицы, мыши и человека, содержатся данные только о распределении белка в тканях взрослого организма и в культивируемых клетках.

Сравнение зон экспрессии генов зиксина и Xanfl в зародышах на стадии средней нейрулы (ст. 15) показало, что они перекрываются (Рис.4А-Б), причем трапециобразная область экспрессии гена Xanfl в передней части нервной пластинки целиком лежит внутри области, в которой ген зиксина экспрессируется наиболее сильно (Рис. 4Б').

Для более детального анализа распределения мРНК исследуемых генов по клеточным слоям, фиксированные зародыши шпорцевой лягушки продольно разрезали на две половинки, которые по отдельности окрашивали методом гибридизации in situ с антисмысловым зондом, комплементарным мРНК Xanfl или зиксина (Рис. 4В). Сопоставление окрашенных половин показало, что оба гена экспрессируются в клетках нейроэктодермы, из которой в ходе развития формируются конечный (большие полушария) и промежуточный отделы головного мозга и

глаза (Kazanskaya et al., 1997; Zaraisky et al., 1995; Zaraisky et al., 1992). При этом область экспрессии гена зиксина распространяется более широко, выходя за границы будущего переднего мозга в антериорном и постериорном направлениях.

Полученные данные подтверждают возможность взаимодействия белков зиксина и Xanfl in vivo.

Зиксин способе» связываться с Xanfl in vivo

Для тестирования способности зиксина взаимодействовать с белком Xanfl in vivo мы использовали метод ко-иммунопреципитации. Синтез белков проводили в клетках развивающихся эмбрионов шпорцевой лягушки, поскольку в данной системе могут быть реализованы все возможные посггрансляционные модификации белков. Для этого в зародыши на стадии 2-4 бластомеров были инъецированы следующие смеси синтетических мРНК, полученных на основе соответствующих плазмидных конструкций: 1) мРНК FLAG-C'Zyxin, кодирующая С-концевой участок зиксина, содержащий NES и три LIM-домена (373 - 664 а.о.), слитый с FLAG-пептидом; и мРНК myc-Xanfl, кодирующая полноразмерный Xanfl, слитый с шестью тус-эпитопами; 2) мРНК myc-Xanfl. Иъецированные зародыши инкубировали до стадии ранней нейрулы (ст.12,5-13) и лизировали. В первом случае комплексы гибридных белков FLAG-C'Zyxin и myc-Xanfl осаждали из лизата зародышей двумя способами: 1) с использованием анти-myc антител, иммобилизованных на протеин-G агарозе, и анализировали методом иммуноблота с анти-FLAG антителами, конъюгированными со щелочной фосфатазой (Рис.5, дорожка 1); 2) с использованием анти-FLAG антител, ковалентно пришитых на агарозный носитель (Red ANTI-FLAG М2 Agarose Affinity Gel (Sigma), и анализировали методом иммуноблота с анти-myc антителами, конъюгированными со щелочной фосфатазой (Рис.5, дорожка 3). Во втором случае комплексы гибридного белка myc-Xanfl с эндогенным зиксином осаждали с использованием анти-myc антител, иммобилизованных на протеин-G агарозе, и детектировали при помощи иммуноблота с использованием поликлональных кроличьих антител, специфичных к С-концевому участку зиксина, с последующей инкубацией с вторичными антителами, связанными со щелочной фосфатазой (Рис.5, дорожка 8). В обоих случаях на иммуноблоте был детектирован четкий сигнал, что свидетельствует об образовании вышеуказанных белковых комплексов в клетках зародышей.

Ко-нммупопрсцнпнтацни с Экспрессия в $ а роды шах Ко-ИП с антн-тус антителами Экспрессия в зародышах

анти-тус антителами анти-FLAG антителами

1а и — % а. FLAG-C^Zyxin myc-Xanfl + + + — + + -

+ — + + + - + + — + -

5 » 5 S 4 и « V.C 1С о 5 = 2 7. £ а зикенн эндогенный FLAG-C'Zyxin •—

mm 4НИ

0» я t=t = myc-Xanf 1 шшш «тшт —.....^ шл

Дорожка 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Рис.5. Анализ взаимодействия белков зиксина и Xanfl в зародышах Xenopus laevis методом ко-

иммунопреципитации (Ко-ИП). Результаты иммуноблота белковых комплексов, осажденных при помощи анти-шус (дорожки 1,8) или анти-FLAG (дорожка 3) антител из лизатов зародышей, инъецированных мРНК myc-Xanfl вместе с мРНК FLAG-C'Zyxin (дорожки 1-4), или только мРНК myc-Xanfl (дорожки 8-9). Для детекции уровня синтеза белков использовали исходные лизаты зародышей (дорожки 5-7 и 10-11)

Второй LIM-домен зиксина отвечает за связывание с Engrailed-подобным репрессорным доменом Xanfl

Для локализации областей взаимодействия зиксин и Xanfl были созданы делеционные мутанты обоих белков и проанализировано их связывание в дрожжевой двугибридной LexA-системе.

Поскольку в результате скрининга кДНК библиотеки было обнаружено взаимодействие Xanfl с С-концевым фрагментом зиксина, содержащим три LlM-домена, которые, как известно, отвечают за белок-белковые взаимодействия (Schmeicliel and Beckerle, 1994; Schmeichel and Beckerle, 1997), можно предположить, что связывание зиксина с Xanfl опосредовано одним из трех LIM-доменов. Для проверки данного предположения фрагменты кДНК, кодирующие LIM-домены зиксина попарно и по отдельности, были клонированы в bait-вектор pMW103 в открытой рамке считывания с кДНК, кодирующей LexA белок. В качестве ргеу-вектора использовали плазмидную конструкцию на основе вектора pB42AD, кодирующую гибрид полоразмерного Xanfl с белком В42, активатором транскрипции. После ко-трансформации этих плазмид в дрожжевые клетки оценивали уровень экспрессии двух репортерных генов, который напрямую зависит от силы взаимодействия исследуемых гибридных белков: ауксотрофного гена LEU2 по росту дрожжевых колоний на селективной среде без лейцина и колометрического гена LacZ по активности ферментаР -галактозидазы с помощью цветной ферментативной реакции с использованием субстрата ONPG в жидкой

среде. В результате было выявлено, что второй LIM-домен зиксина сильнее других доменов связывается с Xanfl (Рис.бА).

Ранее было показано, что некоторые фрагменты зиксина, расположенные на //-конце его молекулы (110-167 и 345-362 а.о., содержащие два пролин-богатых мотива и NES, соответственно), способны самостоятельно активировать экспрессию репортерных генов в дрожжах (Li and Trueb, 2001). Поэтому для того, чтобы проверить взаимодействие /V-концевого участка (1-455 а.о.) белка зиксина с Xanfl в двугибридной системе, фрагмент кДНК, кодирующий этот участок зиксина, был клонирован в вектор pB42AD. В этом случае в качестве bait-вектора использовали плазмидную конструкцию на основе вектора pMW103, кодирующую гибрид Xanfl с LexA. В результате ко-трансформации описанных плазмид в дрожжевые клетки и анализа транскрипционной активности репортерных генов не было выявлено значимое взаимодействие данного фрагмента зиксина с Xanfl (Рис.бА).

Схема делеционных мутанта белка зиксина из Xenopuslaevis Взаимодействие с Xanfl в двугибридной пролин-оогатыс ' участки NES системе: 1-1 МП I |хдм« НЯ имз ||-ббз Н III) ■ \*> 3731 I 1 L1M1 ЩШ51« + осаждение на ^ глугатион-сефарозе за: z S N - т lass s s | j 3 3 ¡1 & Ъ i В S О (j о

4551 i "Ml IjfiMB ÉB И6* + ■455| [ 1.IM1 Biffai» + 530ЩЩ ШЙЦ-ббЗ + JS51I JLtMl 1530 — 53(||ДН-5'Х) + Д 5ЗД-| ЦМЗ |«3 — тус-ХапП-»- - j ■-— -32 g -30 t

Дорожка 12 3 4 ИммуноаЮ! с анти-тус анппе-чами Б

Рис. 6. Определение участков в молекуле белка зиксина, отвечающих за связывание транскрипционного фактора Xanfl. А. Анализ взаимодействия делеционных мутантов белка зиксина с полноазмерным Xanfl с помощью дрожжевой двугибридной ЬехА-системы. Доменная организация делеционных мутантов зиксина представлена в виде схем; знаком «+» напротив каждой схемы отмечена способность соответствующего мутанта активировать экспрессию двух репортерных генов (LEII2 и LacZ) в дрожжах. Б. Результаты иммуноблота белковых комплексов myc-Xanfl с GST-гибридами различных LIM-доменов зиксина, полученных в результате осаждения myc-Xanfl из лизатов зародышей шпорцевой лягушки, инъецированных соответствующей синтетической мРНК, на глутатион-сефарозе (дорожки 2-4). Для детекции уровня синтеза myc-Xanfl использовали исходные лизаты зародышей (дорожка 1).

Данные, полученные с помощью двугибридной системы, были проверены в системе in vitro с помощью метода pull-down. Каждый из трех LIM-доменов зиксина (первый (454-530 а.о.), второй (530-590 а.о.) и третий (592-664 а.о.)) был синтезирован в бактериях E.coli (штамм CodonPlus BL21(DE3)) в виде гибрида с ферментом глутатион S-трансферазой (glutathione S-transferases, GST) и специфично связан с глутатион-сефарозой. Гибридный белок myc-Xanfl

14

нарабатывали в ооцитах лягушки, инъецированных соответствующей синтетической мРНК. Грубые лизаты ооцитов затем использовали для анализа способности различных LIM-доменов зиксина, слитых с GST, осаждать myc-Xanfl. Белковые комплексы элюировали со смолы и анализировали методом иммуноблота с использованием анти-шус антител, конъюгированных со щелочной фосфатазой. В результате было показано, что только GST-гибрид второго LIM-домена зиксина обладает способностью связываться с myc-Xanfl в условиях in vitro (Рис.6 Б, дорожка 2).

А

Схема дслеционных мутантов белка Xanfl EH 1-доме! I

Взаимодействие в двугибридной системе с фрагментами зиксина:

i-p

X

С-концевой частью ИМ2-домеиом >187 + +

Ц-77

77-1 I

1 1-187

3

Xanfl -dullaF.HI

экспрессия и осаждение на зародышах смоле за GST-LIM2

myc-Xanfl -myc-Xanfl-dcllaEHlH

-45 3

-3(1 I

Дорожка 12 3 4

Иммуноблот с анти-myc антителами

В

FLA G-C'Zyxin myc-Xanfl myc-Xanfl-deltaEHl

FLAG-CZyxin

myc-Xanfl myc-Xanfl-deltaEH 1

Ко-ИП с an i H-niyc

+ + + - +

+

Экспрессия в зародышах

-32 £ -30 "

Зиксин

пролнп-богатые участки

IIII

iNES_

■ I "Ml

LIM3 11-663

Xanf-1 1-d

□-I87

Рнс.7: Определение участков в молекуле белка Xanfl, отвечающих за связывание цитоскелетного белка зиксина. А. Анализ взаимодействия делеционных мутантов белка Xanfl с С-концевым участком или вторым LIM-доменом зиксина с помощью дрожжевой двугибридной ЬехА-системы. Доменная организация делеционных мутантов Xanfl представлена в виде схем; знаком «+» напротив каждой схемы отмечена способность соответствующего мутанта активировать экспрессию двух репортерных генов (LEU2 и LacZ) в дрожжах. Б. Результаты иммуноблота белковых комплексов myc-Xanfl или myc-Xanfl -deltaEHl с GST-гибридом второго LIM-домена зиксина, полученных в результате осаждения myc-Xanfl (дорожка 3) или myc-Xanfl-deltaEHl (дорожка 4) из лизатов зародышей шпорцевой лягушки, инъецированных соответствующей синтетической мРНК, на глутатион-сефарозе. Для детекции уровня синтеза гибридных белков myc-Xanfl (дорожка 1) или myc-Xanfl-deltaEHl (дорожка 2) использовали исходные лизаты зародышей. В. Результаты иммуноблота белковых комплексов myc-Xanfl (дорожка 2) или myc-Xanfl-deltaEHl (дорожка 3) с FLAG-C'Zyxin, осажденных при помощи анти-myc антител из лизатов зародышей, инъецированных смесью соответствующих синтетических мРНК. Для детекции уровня синтеза белков использовали исходные лизаты зародышей (дорожки 4-6).

15

Г. Схематичное изображение, доменной структуры белков зиксина и Xanfl с указанием доменов, отвечающих за взаимодействие этих белков.

Аналогичный подход был применен для локализации участка в молекуле Xanfl, отвечающего за взаимодействие со вторым LIM-доменом зиксина.

Белок Xanfl содержит два консервативных домена: N-концевой Engrailed-подобный домен (Engrailed Homology 1,' ЕН1), отвечающий за взаимодействие с транс-регуляторными факторами, например, с Groucho-подобным ко-репрессором TLE1 (Dasen et al., 2001), и ДНК-связывающий гомеодомен на С-конце молекулы (Kazanskaya et al., 1997). Логично предположить, что именно ЕН1-домен непосредственно участвует в связывании ЫМ2-домена зиксина. Для проверки этого предположения фрагменты кДНК, кодирующие полноразмерный белок Xanfl и его N- и С-концевые части (1-77 и 77-187 а.о., соответственно), а также делеционный мутант Xanfl без EHl-домена (Xanfl-deltaEHl, удалены остатки 16-33), были клонированы в ргеу-вектор pB42AD. В качестве bait-векторов использовали плазмидную конструкцию на основе вектора pMW103, кодирующую гибрид LexA либо с тремя LIM-доменами зиксина (455 - 664 а.о.), либо только со вторым LIM-доменом (530-590 а.о.). В результате котрансформации этих плазмид в клетки дрожжей и анализа активности двух репортерных генов было определено, что EHl-домен необходим для связывания Xanfl со вторым LIM-доменом зиксина (Рис.7А).

Для подтверждения полученных данных мы синтезировали полноразмерный Xanfl и его делеционный мутант без EHl-домена в виде белков слияния с шестью myc-эпитопами в зародышах Xertopus laevis и сравнили их способность связываться с: 1) GST-гибридом второго LIM-домена зиксина, иммобилизованным на глутатион-сефарозе (Рис.7Б); 2) гибридным белком FLAG-C'Zyxin в клетках развивающихся зародышей (Рис.7В). Результаты, полученные методами pull down и ко-иммунопреципитации, показали, что делеционный мутант Xanfl-deltaEHl гораздо слабее связывается с указанными фрагментами зиксина по сравнению с целым белком Xanfl.

Таким образом, по совокупности данных, полученных в различных экспериментах, можно утверждать, что связывание зиксина с Xanfl опосредовано вторым LIM-доменом зиксина и EHl-доменом Xanfl (Рис.7Г). Консервативность доменов, участвующих в связывании, может свидетельствовать о наличии некоторого эволюционно значимого механизма передачи сигнала из области межклеточных контактов в ядро, приводящего к изменению работы специфических генов и особой важности функциональных исследований этого механизма.

Ко-локализация белков Xanfl и зиксина в клетках линии CV-1

Ко-локализации белков-партнеров в определённых компартментах клетки является хорошим подтверждением возможности их взаимодействия в живых клетках, поэтому мы

изучили внутриклеточную локализацию белков зиксина и Xanfl в культуре клеток CV-1 (эпителиальные клетки почки зеленой мартышки). Поскольку Xanfl является фактором транскрипции, логично предположить, что в клетках он будет находиться в ядре. Проведенные исследования распределения известных гомологов зиксина в клетках показали, что зиксин преимущественно локализован в фокальных контактах и вдоль стресс-фибрилл (пучков актиновых филаментов, крепящихся к контактам) (Beckerle, 1986; Macalma et al., 1996), но способен перемещаться в ядро (Nix and Beckerle, 1997). Поэтому, можно ожидать, что белки Xanfl и зиксин могут одновременно находиться в клеточных ядрах.

Клетки CV-1 были трансфицированы следующими экспрессионными конструкциями по отдельности: 1) pZyxin-EGFP, кодирующей гибрид полноразмерного зиксина человека с зеленым флуоресцентным белком, 2) pCS-MT-Xanfl, кодирующей полноразмерный транскрипционный фактор Xanfl, слитый с шестью rnyc-эпитопами. После проведения трансфекции клетки инкубировали 24 часа и фиксировали 4% параформальдегидом. Для визуализации myc-Xanfl клетки последовательно окрашивали мышиными анти-тус антителами и специфичными к иммуноглобулинам мыши кроличьими антителами, конъюгированными с красителем Texas Red. Распределение в клетках EGFP-Zyxin наблюдали по естественному свечению зеленого флуоресцентного белка. Анализ трансфицированных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии выявил следующие особенности распределения гибридов исследуемых белков в клетках: EGFP-Zyxin преимущественно находится в фокальных контактах и вдоль стресс-фибрилл (Рис.8Б), a myc-Xanfl - в ядре (Рнс.8А), как мы и предполагали.

Далее мы проверили, изменяют ли исследуемые гибридные белки свою локализацию, когда синтезируются в клетках вместе. Для этого клетки линии CV-1 были ко-трансфицированы вышеописанными плазмидными конструкциями. В результате анализа ко-трансфицированных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии было показано, что во многих клетках происходит перераспределение обоих белков-партнеров: EGFP-Zyxin появляется в ядре (Рис.8Г), a myc-Xanfl равномерно распределяется между ядром н цитоплазмой (Рис.8В). Таким образом, оба белка могут находиться в одном и том же клеточном компартменте и влиять на распределение друг друга, что подтверждает реальность взаимодействие зиксина с Xanfl.

Зиксин подавляет активность транскрипционного репрессора Xanfl в клетках зачатка переднего мозга зародышей шпорцевой лягушки Xenopus laevis

Как известно, работа транскрипционных факторов, в том числе гомеодоменных белков, часто регулируется посредством физического взаимодействия с различными белками, которые влияют на их внутриклеточное распределение, связывание с ДНК или другими белками - кофакторами и т.п. Поскольку нами было показано, что зиксин способен связываться с Xanfl и

способствовать его накоплению в цитоплазме клеток, было решено выяснить, влияет ли зиксин на транскрипционную активность Xanfl. Принимая во внимание известную способность зиксина активировать транскрипцию репортерных генов в дрожжах (Li and Trueb, 2001) и в культуре клеток млекопитающих (Degenhardt and Silverstein, 2001), предварительно было сделано предположение, что данный белок играет роль отрицательного регулятора репрессорной активности Xanfl.

В качестве экспериментальной модели были выбраны зародыши шпорцевой лягушки. Ранее в нашей лаборатории с помощью данной модели было показано, что Xanfl подавляет в зачатке переднего мозга экспрессию двух гомеобоксных генов, регулирующих развитие среднего и промежуточного отделов мозга: Otx2 и Рахб. В связи с этим, паттерны экспрессии данных генов имеют характерный «пробел» в передней части нервной пластинки, как раз в той области, в которой экспрессируется ген Xanfl (Ermakova et al., 1999; Ermakova et al., 2007) (Рис. 9A1-2). Ингибирование трансляции эндогенной мРНК Xanfl с помощью морфолиновых анти-смысловых олигонуклеотидов (МО) вызывает эктопическую экспрессию генов Otx2 и Рахб в передней части нервной пластинки на стадии нейрулы (Рнс.9Б1-2), а в ходе дальнейшего развития приводит к сильной редукции переднего мозга и циклопии (сближение или слияние глаз) (РисЛОБ). В то же время, эктопическая экспрессия гена Xanfl приводит к развитию аномальных выростов переднего и среднего мозга (Ermakova et al., 1999). Принимая во внимание эти данные, можно предположить, что, если зиксин действительно влияет на транскрипционную активность Xanfl, то изменение работы гена зиксина или его продукта должно повлиять на экспрессию генетических мишеней Xanfl в передней части нервной пластинки, и, как следствие, привести к видимым морфологическим аномалиям в развитии.

Для проверки выдвинутого предположения зародыши шпорцевой лягушки были микроинъекцированы синтетической мРНК, кодирующей зиксин, на стадии 2-4 бластомеров в два бластомера со стороны анимального полюса зародыша. Чтобы отследить распределение инъецированного материала в развивающемся зародыше использовали флуоресцентный краситель Fluorescein lysine dextran (FLD). Часть инъецированных зародышей инкубировали до стадии нервных валиков (ст. 15), фиксировали и анализировали экспрессию генов Otx2 и Рахб методом гибридизации in situ. Остальные зародыши инкубировали до стадии головастика (ст.45), и анализировали морфологические изменения.

Инъекция Инъекция Инъекция мРНК Инъекция мРНК Контроль anti-Xanfl-MO мРНК зиксин зиксин-NLS En R-jukcuh-NLS

В1

Г1

Д1

Гибридизация in situ с зондами к мРНК Ot\2

>л

А2

Схема окрашенных зародышей

Б2

Свечение флуоресцентной метки

В2

/ V

Д2

Гибридизация m situ с зондами к мРНК Рахб

Схема окрашенных зародышей

Свечение флуоресцентной метки

Рис.9: Изменения паттернов экспрессии генов Otx2 (Б1-Д1) и Рахб (Б2-Д2) в зародышах шпорцевой лягушки на стадии средней нейрулы (ст.15), вызванные микроинъекцией морфолино олигонуклеотидов, специфичных к мРНК Xanfl (Б1-2) или различных синтетических мРНК, кодирующих: зиксин (В1-2), мутант зиксина, содержащий NLS (Г1-2), доминантно-репрессорный гибридный белок EnR-3HKCHH-NLS (Д1-2). Области экспрессии генов Otx2 (А1) и Рахб (А2) в нормальных, неиъецированных зародышах (ст. 15). Анализ областей экспрессии исследуемых генов проводили с помощью метода гибридизации in situ. Для контроля распределения материала микроинъекции в тканях зародыша использовали флуоресцентный краситель FLD (БГ-ДГ, Б2'-Д2'). Пунктирной линией черного цвета обозначены границы нервной пластинки, красного цвета - передний край нервной пластинки, желтого цвета - границы зоны экспрессии гена Xanfl. «Пробел» в зонах экспрессии исследуемых генов в передней части нервной пластинки обозначен звездочкой.

'• '••... ядро I <*'\ тус-ХапП Д контакты ядро -гух1п-' Б

ядро тус-ХапП 3 ядро / -7,ухт 1 '

Рис.8. Колокализация зиксина и ХапП в клетках С\'-1. Микрофотографии клеток СУ-1, синтезирующих туе-ХапП (А), ЕОРР-гухт (Б) и тус-ХапП совместно с ЕвРР^ухт (В, Г). Масштаб 10 мкм.

Рис. 10. Морфологические аномалии в зародышах шпорцевой лягушки, вызываемые нарушением нормальной работы гена зиксина и его продукта. Контрольный неинъецированный зародыш, ст.45, головной отдел, вид с дорсальной стороны (А). В результате микроинъекций синтетической мРНК, кодирующей зиксин (В) или мутант зиксина, содержащий N1^ (Г), наблюдается весь спектр аномалий развития, характерных для случаев нарушения трансляции мРНК Хап/1, вызванных микроинъекцией соответствующих морфолино олигонуклеотидов (Б): редукция переднего мозга, циклопия. Микроинъекции мРНК, кодирующей доминантно-репрессорную форму зиксина (ЕпИ-зиксин-1МЬ5), наоборот приводят к увеличению размеров переднего мозга (Д). Стрелка указывает на ту половину зародыша, в которую попал материал микроиъекции. Распределение материала микроинъекции в тканях зародыша контролировали с помощью флуоресцентного красителя РЬО (В'-Д').

20

В результате было обнаружено, что сверхэкспрессия гена зиксина приводит к расширению зоны экспрессии генов Otx2 и Рахб в передней части нервной пластинки у 64 и 73% зародышей на стадии средней нейрулы (всего было проанализировано 14 и 15 зародышей, соответственно, в двух экспериментах) так, что у некоторых из этих зародышей ростральный "пробел" в экспрессии Oíx2 и Рахб, в норме вызываемый активностью Xanfl, совершенно закрывался (Рис. 9В1 и В2). У инъецированных зародышей на более поздних стадиях развития наблюдался комплекс морфологических аномалий, который возникает при нарушении экспрессии гена Xanfl в результате микроинъекции соответствующих аити-смысловых МО: редукция головного отдела зародыша (нарушение развития жаберного аппарата и головных хрящей), нарушение структуры глаза или циклопия, уменьшение размеров и слияние обонятельных ямок, редукция конечного и промежуточного мозга (81% зародышей, всего было проанализировано 21 зародыш в двух экспериментах) (Рис.ЮВ). Полученные данные указывают на то, что искусственно усиленный синтез белка зиксина приводит к подавлению репрессорной активности ХапП.

Чтобы еще больше усилить влияние зиксина на работу ХапП, мы использовали мутант зиксина, содержащий сигнал ядерной локализации (nuclear localization signal, NLS: RKKRK.) вместо NES (зиксин-NLS). Благодаря такой замене сигнальных последовательностей мутант зиксина накапливается в ядрах клеток и, как следствие, с большей вероятностью взаимодействует с ХапП по сравнению с зиксином дикого типа, который преимущественно локализован в цитоплазме. Инъецирование в зародыши мРНК, кодирующей зиксин-NLS, оказывает такой же по силе эффект, как и закол МО, специфичных к мРНК Xanfl, на экспрессию генов Otx2 (Рис.9Г1) и Рахб (Рис.9Г2) и вцелом на нормальное развитие зародышей шпорцевой лягушки (РисЛОГ). Эктопическая экспрессия генов Otx2 и Рахб в зачатке переднего мозга зародышей на 15 стадии наблюдалась, соответственно, в 88 и 89% зародышей, всего было проанализировано 16 и 18 зародышей, соответственно, в двух экспериментах. Редукция переднего мозга и циклопия развивались у 96% зародышей, доживших до стадии головастика (ст.45), всего было проанализировано 25 зародышей.

Для подтверждения ингибирующего влияния зиксина на транскрипционную активность ХапП нами была создана генетическая конструкция, кодирующая гибрид: 1) ÏV-концевого фрагмента транскрипционного фактора Drosophila Engrailed (EnR, 1-288 а.о), содержащего репрессорный домен (228-282 а.о.) (Han and Manley, 1993), 2) NLS и 3) трех LIM-доменов зиксина. Синтетическая мРНК, синтезированная на основе полученной конструкции, была микроинъецирована в зародыши шпорцевой лягушки. Анализ инъецированных зародышей на стадии нервных валиков с помощью гибридизации in situ показал, что синтез доминантно-репрессорного гибрида EnR-3HKCHH-NLS приводит к незначительному расширению «пробела» в передней части нервной пластинки в зонах экспрессии генов Otx2 (Рис.9Д1) и Рахб (Рис.9Д2)

у 69 и 79% зародышей, соответственно (всего 16 и 19 зародышей в двух экспериментах). В ходе дальнейшего развития у 80% инъецированных зародышей (всего 15 зародышей в двух экспериментах) наблюдалось увеличение размера переднего мозга (Рис.ЮД), как и в случае сверхэкспрессии гена Хап/1 (Егтакоуа е1 а1., 1999). Полученные данные свидетельствуют о том, что ингибирующее влияние зиксина на транскрипционную активность ХапП полностью исчезает в случае функционирования зиксина в качестве транскрипционного репрессора.

Перечисленные факты подтверждают способность зиксина подавлять репрессорную активность одного из важных регуляторов эмбриогенеза - гомеодоменного белка ХапП в клетках зачатка переднего мозга зародышей шпорцевой лягушки X. из которого

впоследствии формируются такие отделы головного мозга, как промежуточный мозг и конечный мозг, отвечающий за высшие формы нервной деятельности. Подобное влияние цитоскелетного белка зиксина на работу транскрипционных факторов в ходе раннего развития представителя позвоночных животных - шпорцевой лягушки было показано впервые. Исходя из этого, а также учитывая литературные данные о функции зиксина как регулятора динамики актинового цитоскелета, логично предположить, что в нормальном развитии зиксин может участвовать в передаче информации о состоянии клеточных контактов в ядро, осуществляя таким образом координацию морфогенеза зачатка переднего мозга с экспрессией генов в слагающих его клетках.

Поиск белков, способных взаимодействовать с зикснном в ходе раннего развития шпорцевой лягушки

Полученные данные о возможности физического взаимодействия зиксина с гомеодоменным фактором ХапП и его влиянии на транскрипционную функцию последнего позволяют предположить, что в эмбриональном развитии зиксин способен также взаимодействовать и с другими важными белками-регуляторами раннего развития. Очевидно, что поиск таких белков мог бы стать одним из перспективных подходов к выяснению механизмов координации морфогенетических движений и дифференцировки клеток в эмбриональном развитии.

В рамках настоящей работы нами был проведен поиск возможных новых белковых партнеров зиксина в клетках эмбриона шпорцевой лягушки с помощью дрожжевой двугибридной ЬехА-системы. В качестве целевой последовательности в векторе рМ\У103 (Ьа^-вектор) был использован фрагмент кДНК, кодирующий три ЫМ-домена (455-664 а.о.) белка зиксина из Хепорш ¡аеу^я. Скрининг кДНК-библиотеки из зародышей шпорцевой лягушки на стадии поздней гаструлы - ранней нейрулы в векторе рВ42АО (ргеу-вектор) был проведен согласно рекомендациям производителя (СШИТЕСН), также как и в случае поиска белковых партнеров ХапП. В результате было выявлено 104 положительных клона, из которых 39

клонов оказались действительно положительными после проверки подлинности белок -белковых взаимодействий.

Секвенирование вставок кДНК, содержащихся в плазмидах, выделенных из найденных клонов, с последующим анализом полученных последовательностей с помощью пакета программ BLAST показало, что они кодируют 12 различных белков. Среди найденных белков оказались три белка, участвующих в сигнальном каскаде, запускаемом секреторными белками семейства Hedgehog (Hh): Patched2 (Ptc2) (GenBank AB037688), Glil (GenBank Q91690) и Ziel (GenBank AAC14214), также известный как Zic-related-1 (Mizuseki et al., 1998). Данный сигнальный каскад регулирует клеточную дифференцировку в эмбриогенезе и онтогенезе как у беспозвоночных, так и у позвоночных животных (Ekker et al., 1995а; Ekker et al., 1995b). В частности, Hh-сигнализация необходима для формирования нормальной дорсо-вентралыюй разметки нервной трубки и сомитов. Нарушение передачи Hh-сигнала в ходе эмбриогенеза ведет к порокам развития, а в онтогенезе служит причиной развития раковых заболеваний, например, базально-клеточной карциномы и глиобластомы.

Белок Ptc2, содержащий 12 трансмембранных доменов, непосредственно связывает Hh-белки, таким образом, отвечает за первичное восприятие сигнала на клеточной поверхности. Транскрипционный фактор Glil относится к семейству Gli белков (Glil, G1Í2, Gli3), которые регулируют экспрессию геномных мишеней Hh-каскада (Johnson and Scott, 1998; Stone et al., 1999). При этом Glil в отличие GH2 и GH3 не подвергается протеолитическому расщеплению с образованием репрессорной формы, и поэтому всегда выполняет функцию активатора транскрипции (Dai et al., 1999; Ruiz i Altaba, 1998; Sasaki et al., 1997; Sasaki et al., 1999; Wang et al., 2000). Транскрипционный фактор Ziel способен связываться с Gli белками, модулируя их внутриклеточную локализацию и транскрипционную активность (Koyabu et al., 2001; Nguyen et al., 2005; Ruiz i Altaba, 1999).

Найденное взаимодействие зиксина с компонентами Hh-каскада может быть одним из способов регуляции данного каскада, поэтому представляет особый интерес для дальнейшего изучения.

Зиксин связывается с белками Ptc2, Ziel и Glil in vivo

Для подтверждения найденного с помощью дрожжевой двугибридкой системы взаимодействия зиксина с белками Ptc2, Ziel и Glil, мы проверили, сохраняется ли данное взаимодействие в клетках развивающихся эмбрионов Xenopus laevis с помощью метода ко-иммунопреципитации. Также мы посмотрели, связывается ли зиксин с другими Gli белками на примере GH3. Для этого мы инъецировали в зародыши лягушки на стадии 2-4 бластомеров мРНК, кодирующую С-концевой участок зиксина (373 - 664 а.о.), меченный FLAG-эпитопом (FLAG-C'-Zyxin), совместно с мРНК, кодирующей С-концевой участок Ptc2 (1159 - 1413 а.о.),

или полноразмерные белки Ziel, GUI, или GH3, меченные шестью myc-эпитопами (тус-С-Ptc2, myc-Zicl, myc-Glil и myc-Gli3, соответственно). Затем зародыши инкубировали до стадии ранней нейрулы (14-15 стадия) и лизировали. Комплексы гибридных белков осаждали из лизата зародышей с использованием анти-FLAG антител, ковалентно пришитых на агарозный носитель (Red ANTI-FLAG М2 Agarose Affinity Gel (Sigma), затем специфически элюировали ЗхРЬАО-пептидом и анализировали при помощи иммуноблота с анти-шус антителами, конъюгированными со щелочной фосфатазой. Во всех случаях, кроме связывания фрагмента зиксина с GH3 (Рнс.П, дорожка 12), на иммуноблоте был детектирован четкий сигнал (Рис.11, дорожка 2,6,10), что свидетельствует о взаимодействии зиксина с Ptc2, Glil и Ziel в клетках зародышей.

Инъекиии мРНК Ко-ИП с шпи-FLAG Экспрессия в рол мш ах Ко-ИП с airni-FLAG Экспрессия в зародышах Ко-НПс анти-FLAG ашнтеламн Экспрессия в зародьппах

myc-Glti - - + + - - + +

myc-Glil + + - - + + - -

m\x-ZicI + + + +

mvc-C'-l'/c2 + + + +

FLAG-CZvxin + - + + - + - + - + + - + -

niyc-Gltf-* jv myc-Gli 1 •+■ myc-Zicl"* о § myc-C-Ptc2** в FLAG-CZyxin-» -W и—,

г - -г-—г ( ;. 3 г 1

Дорожка 12 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16

Рис.11. Анализ взаимодействия зиксина с участниками Ш-каскада методом ко-иммунопреципитации (Ко-ИП). Результаты иммуноблота белковых комплексов, осажденных при помощи анти-РЬАО антител (дорожки 2, 6,10, 12) из лизатов зародышей после микроинъекции мРНК РЬАС-С'2ухт совместно с мРНК, кодирующей шус-С'Р1с2 (дорожки 1-2), или тус-гю1 (дорожки 5-6), или тус-СН1 (дорожки 9-10), или тус-вИЗ (дорожки 11-12). Для детекции уровня синтеза белков использовали исходные лизаты зародышей (дорожки 3-4,7-8 н 13-16).

На основе полученных в данной работе результатов можно предположить, что существует универсальный механизм координации клеточной подвижности и дифференцировки, в котором ключевую роль играют цитоскелетные белки, такие как зиксин, которые, с одной стороны, обеспечивают клеточную подвижность, а с другой -взаимодействуют с ключевыми регуляторами клеточной дифференцировки и корректируют их активность в ответ на изменения состояния цитоскелета клеток, возникающее в ходе морфогенетических движений.

Выводы

1. В результате поиска белковых партнеров гомеодоменного фактора Xanfl с помощью дрожжевой двугибридной системы был впервые идентифицирован гомолог цитоскелетного LIM-доменного белка зиксина у шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Клонирована полная последовательность кДНК этого белка и проведен структурный и сравнительный анализ его аминокислотной последовательности.

2. Изучен пространственно-временной паттерн экспрессии гена зиксина в раннем развитии шпорцевой лягушки. Показано, что область повышенной экспрессии зиксина в области головной части нервной пластинки совпадает с зоной экспрессии гена Xanfl.

3. Подтверждена несколькими независимыми методами способность зиксина связываться с ХапП. Установлено, что связывание этих белков опосредовано вторым LIM-доменом зиксина и Engrailed-подобным репрессорпым доменом ХапП.

4. На модели раннего развития ЦНС эмбрионов шпорцевой лягушки показано, что зиксин способен ослаблять репрессорную активность транскрипционного фактора Xanfl в клетках зачатка переднего мозга.

5. В результате поиска белковых партнеров зиксина с помощью дрожжевой двугибридной системы, впервые показано, что зиксин физически связывается с тремя компонентами сигнального каскада, запускаемого Hedgehog-белками: рецептором Ptc2 и транскрипционными факторами Glil и Ziel.

Список публикаций по теме диссертации

1. Martynova NY, Eroshkin FM, Ermolina LV, Ermakova GV, Korotaeva AL, Smurova KM, Gyoeva FK, Zaraisky AG.. The LIM-domainprotein Zyxin binds the homeodomain factor Xanfl/Hesxl and modulates its activity in the anterior neural plate of Xenopus laevis embryo. // Developmental Dynamics, 2008,237 (3): 736 - 749.

2. Н.Ю. Мартынова, JI.B. Ермолина, Ф.М. Ерошкин, Ф.К. Гиоева, А.Г. Зарайский. Транскрипционный фактор Xanfl взаимодействует с белком зиксином комплекса фокальной адгезии в раннем периоде развития головного мозга шпорцевой лягушки. //Биоорганическая химия, 2008, том 34, №4, с. 573-576.

3. Л.В. Ермолина, Н.Ю. Мартынова, А.Г. Зарайский. Цитоскелетный белок зиксин -универсальный регулятор клеточной адгезии и экспрессии генов.// Биоорганическая химия, 2010, том 36, №1, с. 26-34.

4. Ермолина Л .В., Мартынова Н.Ю., Коротаева А.Л., Зарайский А.Г. Поиск потенциальных партнеров белка комплекса фокальной адгезии зиксина. // III Российский симпозиум «Белки и пептиды», г. Пущино, 16-21 сентября 2007 г., с.71.

5. Ермолина Л.В., Мартынова Н.Ю., Ерошкин Ф.М., Ермакова Г.В., Зарайский А.Г. Транскрипционный фактор Xanfl взаимодействует с цитоскелетным белком зиксином в раннем развитии головного мозга шпорцевой лягушки Xenopus laevis. II XX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», г. Москва, 11-15 февраля 2008 г., с. 126.

6. Ермолина Л.В., Мартынова Н.Ю., Ермакова Г.В., Зарайский А.Г. Цитоскелетный LIM домен - содержащий белок зиксин взаимодействует с трансмембранным рецептором patched2 в эмбриогенезе шпорцевой лягушки Xenopus laevis. II IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», г. Казань, 23-27 июня 2009 г., с.338.

7. Ермолина Л.В., Мартынова Н.Ю., Зарайский А.Г. Локализация областей взаимодействия LIM-доменного белка зиксина и трансмембранного рецептора patched2. И Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова, г. Москва- г. Пущино, 28 сентября - 2 октября 2009 г., с.193-194.

8. Ермолина Л.В., Мартынова Н.Ю., Зарайский А.Г. Цитоскелетный белок зиксин взаимодействует с участниками Hedgehog-каскада в раннем развитии шпорцевой лягушки Xenopus laevis. // XVIII Международная конференция и дискуссионный научный клуб «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Украина, Ялта-Гурзуф, 31 мая-10 июня 2010 г., с.126-128.

Заказ № 182-1/01/2011 Подписано в печать 13.01.2011 Тираж 80 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таП:т/о@с/г.ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ермолина, Людмила Викторовна

2. ВВЕДЕНИЕ.

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ.

3.1 Нейральная индукция и регионализация эмбриональной эктодермы.

3.2. Дифференцировка нервной пластинки.

3.3. Роль гомеобоксного гена Xanfl в раннем развитии переднего мозга эмбрионов шпорцевой лягушки.

3.4. Участие белка Sonic hedgehog в формировании дорсо-вентральной разметки нервной трубки.

3.4.1. Основные компоненты сигнального каскада, запускаемого белками семейства Hedgehog.

3.5. Цитоскелетный белок зиксин — универсальный регулятор клеточной адгезии и экспрессии генов.

3.5.1. Белок зиксин: локализация и гомологи.

3.5.2. Молекулярная структура зиксина.

3.5.3. Зиксин как компонент клеточных контактов и его роль в регуляции сборки актинового цито скелета.

3.5.4. Механизмы перемещения зиксина между цитоплазмой и ядром.

3.5.5. Зиксин как регулятор генной экспрессии.

3.6. Дрожжевая двугибридная ЬехА-система.

3.7. Зародыши шпорцевой лягушки Xenopus laevis как экспериментальная модель для изучения молекулярно-генетических механизмов эмбриогенеза

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Поиск белков, взаимодействующих с транскрипционным фактором Xanfl, при помощи дрожжевой двугибридной ЬехА-системы.

4.2. Клонирование полноразмерной последовательности кДНК зиксина Xenopus laevis.

4.3. Экспрессия гена зиксина в эмбриональном развитии Xenopus laevis.

4.4. Зиксин способен связываться с Xanfl in vivo.

4.5. Второй LIM-домен зиксина отвечает за связывание с Engrailedподобным репрессорным доменом Xanfl.

4.6. Ко-локализация белков Xanfl и зиксина в клетках линии CV-1.

4.7. Зиксин подавляет активность транскрипционного репрессора Xanfl в клетках зачатка переднего мозга зародышей шпорцевой лягушки Xenopus laevis.

4.8. Поиск белков, способных взаимодействовать с зиксином в ходе раннего развития шпорцевой лягушки.

4.9. Зиксин связывается с белками Ptc2, Ziel и Glil in vivo.

5. ВЫВОДЫ.

6. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

6.1. Материалы.

6.1.1 Реактивы.

6.1.2. Ферментные препараты.

6.1.3. Лабораторное оборудование.

6.1.4. Лабораторные животные.

6.1.5. Буферы и растворы.

6.1.6. Микробиологические среды.

6.1.7. Предоставленные штаммы.

6.1.8. Предоставленные плазмиды.

6.2. Методы.

6.2.1. Амплификация ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР).

6.2.2. Электрофорез в агарозном геле.

6.2.3. Элюция ДНК из агарозного геля.

6.2.4. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.

6.2.5. Достройка З'-конца двухцепочечных молекул ДНК.

6.2.6. Отщепление выступающего У- конца двухцепочечных молекул ДНК.

6.2.7. Лигирование молекул ДНК.

6.2.8. Трансформация клеток Escherichia coli.

6.2.9. Выделение плазмидной ДНК из бактерий Escherichia coli.

6.2.10. Изготовление ДНК конструкций.

6.2.11. Трансформация плазмидной ДНК в дрожжевые клетки с использованием ацетата лития.

6.2.12. Выделение плазмидной ДНК из дрожжей.

6.2.13. Изучение белковых взаимодействий в дрожжах с помощью Colony-lift filter assay.

6.2.14. Изучение белок-белковых взаимодействий в дрожжах с помощью цветной ферментативной реакции с использованием субстрата ONPG в жидкой среде (Liquid Culture Assay).

6.2.15. Транскрипция in vitro.

6.2.16. Получение зародышей шпорцевой лягушки Xenopus laevis.

6.2.17. Получение ооцитов шпорцевой лягушки Xenopus laevis.

6.2.18. Синтез белков в ооцитах или зародышах Xenopus laevis.

6.2.19. Экспрессия клонированных генов в E.coli с использованием IPTG-зависимого промотора.

6.2.20. Электрофоретическое разделение белков в денатурирующих условиях в ПААГ.

6.2.21. Иммуноблот (Western Blotting).

6.2.22. Изучение белок-белковых взаимодействий в системе in vitro с помощью метода pull down.

6.2.23. Изучение белок-белковых взаимодействий в системе in vivo с помощью метода коиммунопреципитации.

6.2.24. Блокирование трансляции эндогенных мРНК, кодирующих Xanfl, при помощи микроинъекций синтетических анти-смысловых олигонуклеотидов.

6.2.25. Фиксация зародышей.

6.2.26. Гибридизация in situ на целых зародышах шпорцевой лягушки.

6.2.27. Синтез дигоксигенин-меченной антисмысловой РНК для проведения гибридизации in situ.

6.2.28. Экстракция тотальной РНК из зародышей шпорцевой лягушки. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР).

6.2.29. Поддержание в культуре и трансфекция клеток линии CV-1.

7 БЛАГОДАРНОСТИ.

8. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.