Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ras-dva - новое семейство малых ГТФаз. Роль малой ГТФазы Ras-dva в раннем развитии шпорцевой лягушки

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Ras-dva - новое семейство малых ГТФаз. Роль малой ГТФазы Ras-dva в раннем развитии шпорцевой лягушки"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Институт биоорганической химии

им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова

На правах рукописи

Терешина Мария Борисовна

11а8-с1уа - новое семейство малых ГТФаз.

Роль малой ГТФазы Иак-йуа в раннем развитии шпорцевой лягушки.

Специальность - 03.00 03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

иилб42Ш

Москва, 2008

003164210

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза Института биоорганической химии

им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Зарайский А Г

Официальные оппоненты*

доктор биологических наук Белявский А В кандидат биологических наук Минин А А

Ведущая организация

Московский государственный университет имени М В Ломоносова, Биологический факультет

Защита состоится 2008 года ъ/О часов на заседании специализированного

совета Д 002 019 01 при Институте биоорганической химии им академиков ММ Шемякина и Ю А Овчинникова РАН по адресу 117997, ГСП-7, Москва, В-437, ул Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Автореферат разослан «-¿>>, 02. 2008 г

Учёный секретарь Специализированного совета, Доктор физ -мат. наук

Олейников В А

Актуальность проблемы

Изучение механизмов реализации генетической информации в процессе онтогенеза является одной из фундаментальных проблем биологии Одной из важных задач молекулярной биологии развития является поиск и исследование молекулярно-генетических механизмов и сигнальных каскадов, необходимых для нормального развития головного отдела зародышей позвоночных животных Особый интерес в этой области представляет исследование механизмов развития головного мозга, в частности, его переднего отдела, отвечающего за высшую нервную деятельность

Известно, что важную роль в регионализации и клеточной дифференцировке в ходе развития i оловного мозга играют гомеодоменные транскрипционные факторы и их геномные мишени fírmakova et al, 1999, Boyl et al, 2001, Kiecker and Lumsden, 2005] Так, одним из ключевых звеньев молекулярных механизмов, обеспечивающих развитие переднего мозга у позвоночных является гомеодоменный белок Anf Ген Anf специфически экспрессируется на ранних стадиях развития зародышей позвоночных в зачатке переднего мозга, из которого в ходе развития формируются большие полушария головного мозга, а также его промежуточный отдел и глаза (Zaraisky et al, 1992, Kazanskaya et al, 1997] В результате поиска геномных мишеней Anf на модели эмбрионов шпорцевой лягушки Xenopus laevis был идентифицирован ген, кодирующий ранее неизвестную Ras-подобную малую ГТФазу Было установлено, что в раннем эмбриогенезе найденный ген экспрессируется вдоль границы, отделяющей зачаток переднего мозга, расположенный в передней части спинной стороны зародыша, от брюшной его части [Novoselov et al, 2003] На основании такой пограничной локализации экспрессии данного гена, а также принадлежности кодируемой им малой ГТФазы к суперсемейству Ras-подобных ГТФаз, он получил название - Ras-dva (последнее сокращенно dorsal-ventral-anterior спина-брюхо-перед)

Малые ГТФазы представляют собой суперсемейство регуляторных ГТФ-гидролаз, в котором выделяют 8 семейств Ras, Rab, RJL, Ran, RGK, Rho/Rac/Cdc42, Arf/Sar и Gie Белки этих сем< йств принимают участие в таких разнородных клеточных процессах, как передача сигналов и регуляция экспрессии генов, реорганизация и функционирование цитоскелета, везикулярный и ядерно-цитоплазматический транспорт [Hall, 2000, Finlin et al, 2000, Takai et al, 2001, Nepomuceno-Silva et al, 2004, Okai et a1, 2004]

Специфическая экспрессия Ras-dva вдоль границы зачатка переднего мозга позволяет предположить, что малая ГТФаза Ras-dva может играть важную роль в сигнальных механизм ах, регулирующих развитие мозга и прилежащих головных структур В связи с этим, поиск гомологов Ras-dva и дальнейшее изучение их биологических функций представляется перспективным подходом для понимания механизмов раннего эмбрионального развития

Кроме того, сравнительно низкая степень гомологии Ras-dva с представителями восьми других известных семейств малых ГТФаз делает изучение ГТФазы Ras-dva и ее гомологов важным как с классификационно-структурной точки зрения, так и для выявления возможных новых типов внутриклеточных сигнальных каскадов

Цели и задачи работы

I Выяснение систематического положения белка Ras-dva в суперсемействе малых ГТФаз

II Изучение функций малой ГТФазы Ras-dva в процессах раннего эмбрионального развития на модели зародышей шпорцевой лягушки X laevts

Исходя из I цели, были сформулированы следующие задачи

1 Поиск гомологов белка шпорцевой лягушки XIRas-dva у разных организмов и анализ их аминокислотных последовательностей

2 Построение филогенетического дерева суперсемейства малых ГТФаз, включающего в себя как представителей всех известных на данный момент семейств, так и новые белки Ras-dva

3 Сравнительный анализ консервативных аминокислотных остатков в консенсусах G-домена у белков Ras-dva и малых ГТФаз из описанных семейств

Для достижения II цели работы были поставлены следующие задачи

1 Изучение внутриклеточной локализации белка Ras-dva

2 Исследование паттерна экспрессии гена Ras-dva на последовательных стадиях развития зародышей шпорцевой лягушки

3 Изучение механизма регуляции начальных этапов экспрессии гена XIRas-dva

4 Анализ аномалий развития, возникающих при нарушении функционирования гена Ras-dva на ранних этапах развития, и подтверждение их специфичности

5 Изучение влияния ингибирования Ras-dva на экспрессию специфичных генов-маркеров, регуляторов раннего развития зародышей шпорцевой лягушки

6 Поиск специфического сигнального каскада, в котором может принимать участие малая ГТФаза Ras-dva на ранних этапах развития зародышей шпорцевой лягушки

Научная новизна Впервые установлено, что малая ГТФаза XIRas-dva и её гомологи формируют новое семейство малых ГТФаз наряду с восемью описанными ранее и, в отличие от последних, присутствуют только у позвоночных животных Показано, что белки семейства Ras-dva имеют ряд особенностей в первичной последовательности «switch 1» и «switch2» участков каталитического G-домена и несут на fc-конце сайт пренилирования Выявлено, что пост-трансляционные модификации С-концевого сайта пренилирования определяют примембранную локализацию белка XIRas-dva в клетках

Изучена динамика экспрессии гена Ras-dva в зародышах шпорцевой лягушки и регуляция ее начальных этапов Впервые установлено, что прямыми регуляторами экспрессии гена Ras-dva в головной эктодерме на ранних стадиях развития (ст 11-15) являются гомеодоменные факторы Ctx-2 и Xanf-1, контролирующие развитие переднего и среднего мозга, а также органов чувств и присоски На поздних стадиях развития эмбрионов X laevis (ст 25-46) ген Ras-dva эк<,прессируется в клетках дифференцированных органов, обладающих секреторной активностью в клетках присоски, железы вылупления, обонятельных ямок, эпифиза, гипофиза, жаберных дуг, желчного пузыря, пищевода и желудка

Проведено исследование роли малой ГТФазы Ras-dva в раннем развитии эмбрионов X ¡ae\js Е'.первые выявлено, что малая ГТФаза Ras-dva играет ключевую роль в процессах регионализации и дифференцировки зачатков мозга, присоски, органов чувств и головных хрящей Показано, что в головной эктодерме зародышей на стадии нейрулы (ст 15) функционирование Ras-dva необходимо для передачи сигнала от фактора роста фибробластов 8а

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 экспериментальные статьи и 3 тезисов Структура и объем диссертации

Диссер тация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результате ä и их обсуждения и выводов, изложена на 114 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка и 5 таблиц Список литературы включает 112 работ

Основное содержание работы

I. Выяснение систематического положения новой малой ГТФазы Ras-dva в суперсемействе малых ГТФаз.

1.1 Поиск ,'омологов новой малой ГТФазы XlRas-dva.

С помощью пакета программ BLAST был проведен поиск гомологов нового белка XlRas-dva в р<13ных базах данных (NCBI Genbank (http //nebí nlm nih gov), Saccharomyces http //www yeastgenome org/, The Arabidopsis Information Resource (TAIR) (http //www arabidopsis org/), Xenbase (http//www xenbase org), JGI (http//genome jgi-psf org), University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser Database (http //genome ucsc edu), Strongylocentrotus purpuratus sea urchin (морской еж) genome project (http //sugp caltech edu), степень гомологии которых составляла 50% и более В итоге, было обнаружено и зарегистрировано 15 гомологов XlRas-dva у различных позвоночных организмов 1 гомолог у бесчелюстной рыбы миноги (Petromyzon marinus, EU 379655), 9 гомологов у костистых рыб 2 - у Danto reno (DQ278181, AY729884), 3 - у Takifugu rubipes (DQ278182, DQ278183, DQ278184) и по одному у Gasterosteus aculeatus (DQ278185), Oncorhynchus mykkis (ABB84863) и Ozyrias Iatipes (DQ278187), Tetraodon nigroviridis (CAG02679), 3 - у лягушек X tropicalis

(AY729885, DQ278180) и X laevis (АВМ63371), 1 гомолог у ящерицы Anolis carolinensis (EU380237) и 1 гомолог у курицы Gallus gallus (AY729886) Кроме того, среди программно-предсказанных кДНК был обнаружен гомолог Ras-dva у опоссума (класс Млекопитающие, отр Сумчаггые) Monodelphis domestica (ХР_001377674) У растений, беспозвоночных животных и высших млекопитающих гомологов малой ГТФазы Ras-dva не было выявлено Проведенный анализ позволяет сделать следующие предварительные выводы

- Вероятно, малые ГТФазы Ras-dva впервые появились в эволюции только у позвоночных организмов В связи с этим важно отметить, что ген, кодирующий гомеодоменный белок Anf, чьей мишенью у шпорцевой лягушки X laevis является ген Ras-dva, также впервые появляется лишь у позвоночных животных, где он выполняет функцию регулятора развития переднего мозга Можно предположить, что именно появление новых генов, очевидно возникших путем дупликаций и последующей быстрой дивергенции каких-то генов-предшественников, создало предпосылки для возникновения у позвоночных такой новой анатомической структуры как передний мозг

- Обнаружение гена Ras-dva у опоссума, сумчатого млекопитающего, позволяет предположить, что и у высших млекопитающих могут присутствовать гомологи Ras-dva Возможно, найти ген малой ГТФазы Ras-dva, кодирующая рамка которого составляет всего лишь около 650 п о и не содержит интронов, у высших млекопитающих организмов пока не удается из-за недостаточной полноты геномных баз данных

1.2 Систематическое положение белков Ras-dva в суперсемействе малых ГТФаз.

С целью определения систематического положения новых белков Ras-dva в суперсемейспгве малых ГТФаз было построено филогенетическое дерево этого суперсемейства, включающее в себя и новые белки Ras-dva Известно, что степень гомологии между белками внутри отдельного семейства малых ГТФаз превышает 50%, тогда как между любыми двумя белками из разных семейств составляет менее 40% Кроме того, информация, заложенная в аминокислотной последовательности каталитического G-домена белка, достаточна для отнесения малой ГТФазы к тому или иному семейству [Jiang and Ramachandran, 2006] Исходя из этого, для построения филогенетического дерева в базе данных NCBI были найдены аминокислотные последовательности G-доменов малых ГТФаз представителей 8-ми уже описанных семейств (Ras, Rho, Rab, Ran, Arf, RJL, RGK и Gie) Далее при помощи программы Clustal W1 83 было проведено множественное выравнивание последовательностей G-доменов малых ГТФаз уже известных семейств и найденных нами белков Ras-dva На основании данных этого множественного выравнивания в программе Mega (http //megasoftware net) по алгоритму «ближайшего соседа» (neighbour-joining algonthm) было построено неукорененное филогенетическое дерево суперсемейства малых ГТФаз, которое показало, что белки Ras-dva

формируют отдельный кластер того же ранга, что и известные семейства (Рис 1) Степень гомологии между белками, входящими в Ras-dva кластер и белками других кластеров составляет 10-40% Степень же гомологии внутри Ras-dva кластера составляет >52% Таким образом, можно сделать вывод, что белки Ras-dva составляют новое, девятое семейство малых ГТФаз Заметим, что белки нового семейства Ras-dva наиболее гомологичны бечкам семейства Ras, которые в свою очередь являются важными элементами сигнальных каскадов в клетке [Hall, 2000]

Анализ представленности каждого семейства в организмах разных царств/классов живых существ (бактерий, грибов, растений, позвоночных и беспозвоночных животных) показал, что в отличие от всех известных семейств, которые присутствуют у 2 и более царств/классов, малые ГТФазы семейства Ras-dva проявляются только в 1 классе - у позвоночных животных

13 Анализ аминокислотных последовательностей малых ГТФаз Ras-dva. Сравнительный анализ консервативных аминокислотных остатков в консенсусах G-домена у белков семейства Ras-dva и у малых ГТФаз из описанных семейств.

Все ГТФазы, в том числе и малые, существуют в ГДФ-связанной - неактивной или ГТФ-связанной - активной конформациях и имеют так называемый G-домен, который включает в себя консенсусные аминокислотные последовательности (G1-5), необходимые для специфического взаимодействия с ГТФ и ГДФ и для ГТФазной активности Эти три свойства чрезвычайно важны для осуществления цикла активации/инактивации белков который регулируется специфическими белками-помощниками GEP (guanine nucleotide exchange protein) и GAP (GTPase activating protein), соответственно

С целью выявления функциональных участков, характерных для группы обнаруженных малых ГТФаз Ras-dva, нами было проведено множественное выравнивание их аминокислотных последовательностей, которое показало что белки Ras-dva имеют все консенсусные аминокислотные последовательности (G1-5), характерные для каталитического G-домена ГТФаз Кроме того, у всех Ras-dva белков было выявлено наличие С-концевого сайта пренилирсвания -СХАХ, где С- аминокислотный остаток (а о) цистеина (Cys), -SH группа которого подвергается пренилированию, А - алифатический а о, а X - любой а о Известно, что такие сайты пренилирования могут обусловливать связывание белков с мембранными структурами клетки [Сох and Der, 1992]

В составе консенсусных последовательностей G1-G5 выделяют как высоко-консервативные аминокислотные остатки, присутствующие у всех известных семейств малых ГТФаз, так и а о, консервативные только внутри отдельных семейств малых ГТФаз Для того чтобы выяснить, есть ли у малых ГТФаз семейства Ras-dva какие-либо особенности в строении консенсусных участков G1-G5 по сравнению с таковыми других семейств, мы провели сравнительный анализ

последовательностей Gl- G5, характерных для белков Ras-dva и малых ГТФаз семейств Ras, Rab, Ran, Rho, RJL, RGK, Arf и Gie (Табл.1)

В результате, было выяснено, что у малых ГТФаз Ras-dva в консенсусных последовательностях G1-G5 присутствуют все высококонсервативные а о, но кроме того, имеется несколько особенностей в строении консенсусов G2 (он же switch!) и G3 (он же switch2), наиболее важных для ГДФ/ГТФ обмена и гидролиза последнего В частности, было показано, что в консенсусе G2 малые ГТФазы Ras-dva, в отличие от всех остальных малых ГТФаз, перед высококонсервативным остатком треонина имеют 1-2 положительно заряженных аминокислотных остатка аргинина (выделен синим в таблице 1) или лизина, аналогично а субъединице тримерных G-белков

У тримерных ГТФаз этот остаток аргинина участвует в катализе реакции гидролиза ГТФ в то время как GAP только участвует в поддержании правильной пространственной структуры белка в процессе его самоинактивации [Warner and Weinsrtein,1999] У малых ГТФаз белок-помощник GAP выполняет обе эти функции, те он привносит, как правило, в составе тн «аргининового пальца» положительно заряженные а о для катализа реакции гидролиза ГТФ и одновременно поддерживает определенную структуру малой ГТФазы [Hall, 2000]

Еще одной особенностью каталитического домена ГТФаз Ras-dva является то, что у них в консенсусной последовательности switch2 вместо сильно консервативного а о глутамина (Gin), который, как известно, также очень важен при гидролизе ГТФ [Paduch et al, 2001], находится Ser (Табл 1, выделен зеленым)

Обнаруженные особенности аминокислотных последовательностей switchl и switch2 малых ГТФаз Ras-dva свидетельствуют о специфическом для этих белков механизме гидролиза ГТФ, возможно, сходном с таковым у тримерных ГТФаз

Наличие особенностей в первичной последовательности функциональных участков каталитического домена G-домена Ras-dva ГТФаз, наряду с данными по общей гомологии их аминокислотных последовательностей, служат еще одним подтверждением того, что белки Ras-dva формируют отдельную новую группу малых ГТФаз и, вероятно, обладают специфической функцией Изучению функциональной роли малых ГТФаз Ras-dva посвящен следующий отдел диссертации

IL Изучение функциональной роли малой ГТФазы Ras-dva в процессах раннего эмбрионального развития на модели зародышей шпорцевой лягушки X. laevis 21 Внутриклеточная локализации белка Ras-dva.

Известно, что важную роль в определении функций малых ГТФаз разных семейств играет их внутриклеточная локализация [Takai et al ,2001] Внутриклеточная локализация, как правило, детерминируется специфическими сигнальными мотивами в первичной

последовательности этих белков Как мы выяснили ранее, у всех Ras-dva белков имеется С-концевой сайт пренилирования -СХЛХ, где С- Cys, -SH группа которого подвергается пренилироЕанию, А - алифатический а о , а X - любой а о (непосредственно у XIRas-dva -CTLS) Из литературных данных известно, что аналогичный сайт пренилирования отвечает за прикрепление к мембранам некоторых малых ГТФаз семейств Ras и Rho [Rocks et al ,2006, Michaelson et al ,2001]

Кроме того, мы обнаружили, что белок XIRas-dva имеет небольшой С-концевой полиосновный участок, состоящий из 2 остатков Lys и 6 а о Arg Похожий полиосновной участок та»зке присутствует у некоторых связанных с мембранами малых ГТФаз семейств Ras и Rho В общем, структура С-концевого участка малой ГТФазы Ras-dva наиболее сходна с таковой белка KiRas4B (иногда называемого KiRas2B) Известно, что белок KiRas4B локализуется в основном на плазматической мембране (ПМ), а также на мембранах аппарата Гольджи (АГ) [Choy et al ,1999]

Для экспериментальной проверки предположения о мембранной локализации белка Ras-dva мы сравнили внутриклеточное распределение белка Ras-dva шпорцевой лягушки и малой ГТФазы KiRas4B Для визуализации этих белков мы использовали генетические конструкции, кодирующие белки Ras-dva и KiRas4B, меченные флюоресцентным белком EGFP по N-концам Дая создания этих конструкций гены Ras-dva и KiRas4B клонировали в вектор pEGFP-Cl (Clontech) Полученные конструкции (pEGFP-Ras-dva и pEGFP-KiRas4B) инъецировали в эмбрионы X laevis на стадиях 4-8 бластомеров и через 1-2 дня инкубации анализировали паттерн флюоресценции EGFP в поверхностных клетках

В результате было установлено, что малая ГТФаза Ras-dva локализуется на ПМ и в области ядра (Рис !,Б), а белок KiRas4B находится в основном на ПМ (Рис.2,А) Для более подробного анализа локализации малой ГТФазы Ras-dva в клетке была проведена трансфекция клеток линии эмбриональных мышиных фибробластов NIH-3T3 конструкцией pEGFP-Ras-dva С помощью конфокального микроскопа мы обнаружили, что гибридный белок EGFP-Ras-dva был лок.шизован на ПМ и в околоядерной области, вероятно, на мембранах эндоплазматического ретикулума (ЭПР) Кроме того, флюоресцентный сигнал наблюдался в виде отдельных кластеров в цитоплазме (вероятно, АГ и везикулы) При этом сигнал отсутство! ал в клеточном ядре (Рнс.2,В)

Для выяснения роли С-концевого сайга пренилирования белка Ras-dva в определении его примембр шной локализации, мы сравнили локализацию Ras-dva дикого типа и мутантного по сайту пренилирования Ras-dvaC206S Было обнаружено, что EGFP-Ras-dvaC206S, в отличие от не мутантного EGFP-Ras-dva (Рис 2,Б) и маркера АГ и ПМ - мембрано-связанный вариант красного флюоресцентного белка KFP, имеющий на N-конце сигнал мембранной локализации нейромодулина, GAP-43 (Рис 2,Г'), равномерно распределён в цитоплазме и, возможно, в

ядрах клеток эмбриона шпорцевой лягушки (Рнс.2,Г) Аналогичное равномерное распределение EGFP-Ras-dvaC206S было выявлено и в фибробластах линии NIH-3T3 Причем в последнем случае, было отчетливо видно, что белок EGFP-Ras-dvaC206S равномерно распределялся как в цитоплазме, так и в ядре, и не имел выраженной локализации на плазматической и эндомембранах клетки (Рис.2,Д)

Суммируя полученные результаты, можно сделать вывод, что необходимым условием локализации малой ГТФазы Ras-dva на плазматической мембране и внутриклеточных мембранах (ЭПР, АГ и везикулах) являются посггрансляционные модификации С-концевого сайта пренилирования

Известно, что малые ГТФазы семейства Ras, вовлеченные в процессы передачи сигналов от разных факторов роста в клетке посредством мембранных рецепторов и МАР-киназного каскада, имеют аналогичную локализацию в клетке [Whitman and Melton, 1992] Исходя из этого, можно выдвинуть предположение, что белки Ras-dva имеют схожую функцию - участие в процессе передачи сигнала в клетку Наличие EGFP-Ras-dva на внутриклеточных мембранах (ЭПР, АГ, везикулах) может обозначать «транзитный путь» EGFP-Ras-dva на маршруте «рибосома-плазматическая мембрана» или указывать на вовлеченность Ras-dva в процессы внутриклеточных мембранных перестроек, например, в ходе везикулярного транспорта

2 2 Динамика паттерна экспрессии гена Ras-dva в зародышах шпорцевой лягушки.

Для изучения динамики экспрессии гена Ras-dva в ходе раннего развития шпорцевой лягушки была проведена т situ гибридизация на целых зародышах-альбиносах, находящихся на различных стадиях развития, в результате чего клетки, содержащие транскрипты гена Ras-dva приобретали темно-синюю окраску Ранее в лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза было показано, что на стадии нервной пластинки (стадия 15) ген XIRas-dva экспрессируется в подковообразной области, огибающей нервную пластинку спереди и с боков [Novoselov et al, 2003] В данной работе мы подробно исследовали пространственную динамику паттерна экспрессии этого гена в зародышах шпорцевой лягушки начиная со стадии гаструляции (ст 10) и заканчивая стадией головастика (ст45) В результате было установлено, что ген Ras-dva начинает экспрессироваться в клетках головной эктодермы эмбриона на стадии средней гаструлы (ст 11), причем как в области проспективной (будущей) нервной пластики, так и около нее (Рис. 3,А) Далее наблюдалось усиление уровня экспрессии гена Ras-dva в головной эктодерме при одновременном ингибировании его экспрессии в области формирующейся нервной пластинки, особенно ее передней части (Рис.3,Б) В итоге, к стадии средней нейрулы (ст 14-15) экспрессия гена Ras-dva была полностью исключена из клеток нервной пластинки (предшественник головного и спинного мозга) и занимала подковообразную зону эктодермы, прилегающей к нервной пластинке спереди и с боков

(Рис.3, В) В итоге, на стадии нервных валиков (ст 16) зона экспрессии Ras-dva подковообразно окаймляла переднюю часть нервной пластинки, а так же распространялась на область боковых нервных валиков (Рис 3, Г) В результате сравнения данной области экспрессии Ras-dva на стадии нервных валиков с картой презумптивных зачатков (Рис.3,3) было выяснено, что эта область клеток перекрывается с зачатком присоски, областью пан-плакодной эктодермы (из которой развиваются парные органы чувств, эпифиз и аденогипофиз) и ротового отверстия, областью нервного гребня (клетки которого участвуют в формировании головных хрящей и периферической НС) и граничит с нервной пластинкой (предшественником ЦНС) спереди и боков

Анализ последующей экспрессии гена Ras-dva показал, что со стадии нервного желобка (сг 18) до стадии хвостовой почки (ст25) происходит ограничение зоны экспрессии Ras-dva областью присоски, железы вылупления (также называемой фронтальной железой) и частично областью головного нервного гребня (Рис.3, Д,Е) На стадии поздней хвостовой почки (стадия 30 и далее) экспрессия гена Ras-dva была обнаружена в эктодерме лишь по верхнему краю присоски (проспективная выстилка ротового отверстия), и в зачатках головного мозга, в частности, в эпифизе (РисЗ, Ж) На более поздних стадиях развития, когда большинство органов и систем органов уже сформировано (ст 45-46), экспрессия гена Ras-dva была выявлена в следующих структурах 1) в уже сформированном головном мозге - в клетках эпифиза и гипофиза (Рис.З.И), 2) в головном отделе - в присоске, выстилке ротовой полости, жаберных хрящевых дугах, обонятельных ямках и в тканях глаза (РисЗ, К,Л) На поперечных парафиновых срезах глаза, окрашенных гематоксилином, было показано, что Ras-dva экспрессируется в сетчатке глаза, во внешнем сетчатом слое (Outer Plexiform Layer [Perron et al, 1998]) (Рис.3,H,О), 3) в клетках желчного пузыря и небольшого участка кишечника (Рис.3, К,М)

Для более подробного изучения экспрессии Ras-dva в кишечнике была проведена гибридизация in situ на вырезанных кишечниках зародышей шпорцевой лягушки на ст 46 В результат: сопоставления области экспрессии Ras-dva с морфологическими и гистологическими данными по строению кишечника зародышей шпорцевой лягушки [Chalmers, Slack, 2000] было выяснено, что Ras-dva экспрессируется в желудочном отделе кишечнига Для более точной локализации области экспрессии Ras-dva в кишечнике, мы провели сопоставление областей экспрессии Ras-dva и маркера развивающегося желудка, гомеобоксного гена Sox-2 [Chalmers et а!, 2000], которое показало, что эти гены ко-экспрессируются в пищеводе и желудочном отделе кишечника вплоть до впадения проток от пищеварительных желез у зародышей шпорцевой лягушки на сг 45-47 (РисЗ П,Р) Отметим тот факт, что на стадиях развития, начиная с хвостовой почки (ст25) и далее ген Ras-dva специфично экспрессируется в клетках нескольких дифференцированных органов,

обладающих секреторной активностью (присоска, железа вылупления, эпифиз, гипофиз, обонятельные ямки, желчный пузырь, пищевод, желудок) Исходя из этого можно предположить, что малая ГТФаза Ras-dva вовлечена в секреторные процессы в клетках, прошедших дифференцировку в соответствующем направлении Изучение данного вопроса является темой отдельного исследования в будущем

Данная работа посвящена изучению роли Ras-dva именно на начальных этапах его функционирования - в период формирования границ презумптивных органов и систем органов в эмбриональных тканях (ст 11-16) В связи с этим было проведено исследование регуляции начальных этапов экспрессии гена Ras-dva в зародышах шпорцевой лягушки

2 3 Механизм регуляции начальных этапов экспрессии гена XIRas-dva.

Для изучения регуляции экспрессии гена XIRas-dva на ее начальных этапах были проанализированы гены транскрипционных факторов, известных переднеголовных генов-маркеров, области экспрессии которых коррелировали с таковой Ras-dva на стадиях средней-поздней гаструлы В итоге, мы выдвинули предположение о вовлеченности транскрипционных факторов Otx-2 и Xanf-1 в регуляцию экпсрессии гена Ras-dva на ранних этапах развития зародышей шпорцевой лягушки В качестве возможного активатора был предложен гомеодоменный транскрипционный фактор Otx-2 Интенсивная экспрессии этого гена наблюдалась как раз в той же области передней эктодермы зародыша шпорцевой лягушки на стадии средней гаструлы, где обычно начинает зкспрессироваться ген XIRas-dva В качестве ингибитора экспрессии гена Ras-dva в области передней нервной пластинки был предложен гомеодоменный транскрипционный фактор Xanf-1, исходя из следующих положений 1 ранее, Ras-dva был обнаружен именно как генетическая мишень Xanfl [Novoselov et al, 2003], 2Xanfl известен как сильный транскрипционный ингибитор [Ermakova et al, 1999], 3 в нормальном эмбриогенезе экспрессия гена Xanf-1 активируется более ранним транскрипционным фактором Otx-2 в клетках передней части нервной пластинки, т е как раз в той области, где начинает пропадать экспрессия генов Ras-dva и Otx-2

Для проверки выдвинутых предположений были проанализированы изменения экспрессии гена Ras-dva в условиях оверэкспрессии транскрипционных факторов Otx-2 или Xanf-1 Для этого были проведены микроинъекции мРНК, кодирующих эти факторы, в смеси с флюоресцентной меткой флюоресцеин-лизин-декстраном (FLD) в один или 2 бластомера в анимальном полюсе зародыша. На стадии средней нейрулы зародыши, которые содержали FLD-метку в передней эктодерме, были зафиксированы и методом in situ гибридизации проанализированы на предмет изменений экспрессии гена Ras-dva в этих областях

Суперсемейство малых ГТФаз

Rho/Rac/Cdc42

Hi«»014

Arf/Sar

Рис.1 Неукоренённое филогенетическое дерево суперсемейства малых ГТФаз, построенное при помощи программы MEGA 2.1, используя метод «ближайшего соседа» и модель попарных расстояний (neighbor-joining algorithm and p-distance model). Масштабный отрезок в левом нижнем углу соответствует значению параметра р равному 0.1 (p=nd/L, где nd - количество аминокислот различающихся у 2-х сравниваемых последовательностей и L - общее количество сравниваемых аминокислот). Hs - Homo sapiens (человек), Mm - Mus msculus (мышь), Md -Monoderphis domestica (опоссум), Gg - Gallus gallus (курица), Ac - Anolis carolinensis (ящерица), XI - X. laevis (лягушка), Tr - Takifugu rubripes (рыба), Eh -Entamoeba histolytica (амёба)

Таблица 1. Консенсусные последовательности Gl- G5, характерные для белков Ras-dva, малых

Белок Gl GXXXXGKS/T G2(switchl) xtx G3(switch2) DXXGQ G4 NKXD/E G5 EX.s/ca

Ras-dva gaagvgkt HRRTVEE IXDTSGSY VGNKXD FV/LEXSAK

Ras GXKGVGKS YDPTIED ILDTAGQE VGNKXD YIETSAK

Rab GD3GVGKS YISTIGV IWDTAGQE VGNKXD FLETSAK

RhoA GDGACGKT YVPTVFD LWDTAGQE VGNKKD YMECSAK

Ran GDGGTGKT YVATLGV NVWDTAGQE CGNKVD YYDXSAK

RJL gnaevgks YGVTKVQ FYKDTQGVI CANKID YFETSAQ

Arf ::ldaagkt TIPTIGF VWDVGGQD fankqd iqatcat

rgk gdpgvgkt V/LMDTWE VGNKAD FIETSAT/A

Gie GLQYSGKT MIPTVG I/LWDIGGQP LGNKRD DREICCY

gj-a GA3ESGKS RVKTTGI LFDVGGQR FLNKKD THFTCAT

Рис.2. Мембранная локализация малой ГТФазы Ras-dva зависит от

модификаций её С-концевого сайта пренилирования. (А,Б,Г,Г'):

Наблюдаемые в флюоресцентный микроскоп клетки шпорцевой лягушки, экспрессирующие меченные зелёным флюоресцентным

белком EGFP по N-концам белки: (А) белок KiRas4B, в качестве контроля мембранной локализации; (Б) исследуемая малая ГТФаза Ras-dva, дикий тип; (Г) мутантный по сайту пренилирования вариант Ras-dvaC206S; (Г'| маркер АГ и ПМ - mem-K.FP. (В,Д): Мышиные эмбриональные фибробласты NIH-3T3, экспрессирующие меченные зелёным флюоресцентным белком EGFP по N-концам белки: малую ГТФазу Ras-dva, дикий тип (В) или мутантный по сайту пренилирования вариант Ras-dvaC206S (Д). наблюдаемые с конфокальный микроскоп.

,^/ппэ

'Присоска

Отделы г< Td-консчныи Die-промежуточный

Мсь-сроднии _

Hind-,.га,.» Пю&ю л

Ст.45 патер

Gb-gaM-bladder (желчный пузырь).

Ой - oescphaguslnniuoeoA),

Pa-pancreas (поджелудочная жепеаэ),

St-stomach (желудок!.

Si-small intestine (тонкий кишечник).

Рис.3. Паттерн экспрессии гена Ras-dva в зародышах X. laevis на последовательных стадиях развития. Тёмно-синяя окраска, проявляющаяся в результате гибридизации in situ, маркирует клетки зародыша, содержащие мРНК Ras-dva. Пунктирная линия показывает границы нервной пластинки. Ст.11- стадия развития 11. Ант - передняя (антериорная) область зародыша); Доре. - вид зародыша со спины (дорсальный); латер - вид сбоку (латеральная сторона); (Н) -парафиновый поперечный срез глаза зародыша шпорцевой лягушки на ст.45 после гибридизации in situ. (О) -парафиновый поперечный срез глаза зародыша шпорцевой лягушки на ст.45 после гибридизации in situ, окрашенный гематоксилином. Фиолетовое

окрашивание - ядра клеток, светлосерое - цитоплазма, темно-синее -мРНК Ras-dva. Экспрессия генов Ras-dva (Г1) и Sox2 (Р) в кишечниках головастиков (ст.46).

Рис.4. Транскрипционные факторы 01х-2 и Хап I-1 являются непосредственными регуляторами гена Ras-dva. (А,А') Оверэкспрессия О/х-2 приводит к расширению области экспрессии гена Ras-dva в ненейральной эктодерме (красная стрелка). (Б,Б') Инъекции мРНК Хап/1 вызывают ингибирование гена \ias-dvci в передней эктодерме зародышей шпорцевой лягушки (черная стрелка). (В,В') При микроинъекции мРНК доминантно-репрессорной версии ХапП (ЕпЯ-ХапП) наблюдается подавление экспрессии гена Ras-dva (черн.стрелки). (Г,Г') Оверэкспрессия доминантно-активаторной версии ХапП (УР16-ХапП) приводит к эктопичекой экспрессии гена Ras-dva в латеральной ненейральной эктодерме (краен.стрелки). (Д,Д\ Е,Е') Дексаметазон-индуцируемая версия 01х-2 (СНх2-ВООК) вызывает эктопическую экспрессию Ra.s-dvcl в условиях подавления общего белкового синтеза циклогексимидом (СНХ) только при активации дексаметазоном (БЕХ). (Ж,Ж', 3,3') Дексаметазон индуцированная версия доминантно-активаторной версии ХапЯ (УР1б-ХапП-ВООК) вызывает эктопическую экспрессию Ras-dva в условиях подавления общего белкового синтеза циклогексимидом (СНХ) только при активации дексаметазоном (ОЕХ). Ин. - инъекция. Все мРНК инъецировали в смеси с флюоресцентной меткой флюоресцеин-лизин-декстраном (ЕЦЭ), фото А'-З' показывают флюоресценцию распределенного материала инъекции.

к • . /

Заборные хрящи —

А

Присоска '-¿у

И*4"

ПРИСОСИ»

Рис.5. Морфологические аномалии в зародышах шпорцевой лягушки, вызываемые нарушением функционирования Ras-dva путем инъекций разных «блокаторов». (А) - контрольный неинъецированный зародыш, ст.45, головной отдел, дорсальный вид. Морфологические аномалии: редукция конечного отдела мозга Telencephalon, слухового пузырька, обонятельной ямки, глаза и жаберных дуг, возникают в зародышах инъецированных в правую половину на ранних стадиях мРНК dnRas-dvaT22N (В) или aHimi-Ras-dva олигомерами: морфолино олигонуклеотидами МО (Б): pHypNA (Г); HypNA-pPNA (Д). В зародыше, инъецированном анти-Ras-dva олигомером pHypNA с 2 mismatch заменами, перечисленных выше аномалий выявлено не было (Е). (Ж-М) Поперечные срезы головного отдела зародыша, инъецированного cmmu-Ras-dva МО, обработанные гематоксилином. На инъецированной стороне зародыша (указана красной стрелкой, граница прочерчена красным пунктиром) нарушено строение соответствующих структур головного отдела зародыша: конечного мозга (Ж,3), глаза (3,И), жаберных хрящей (К) и присоски (М). Поперечный срез присоски контрольного зародыша (J1).

Рис.6. Влияние ингибирования работы белка Ras-dva на экспрессию специфичных генов-маркеров, регуляторов раннего развития зародышей.

(А-М) Результаты гибридизации in situ со специфичными к разным маркерным генам зондами в зародышах X. laevis, инъецированных в одну половину анти-Ras-dva Mo, мРНК dnRas-dvaT22N, или смесью aHinu-Ras-dva Mo + мРНК flag-Ras-dva.

(Н,0) Результаты ОТ-ПЦР.

Рис.7. Доминантно-негативный вариант белка Ras-dva способен блокировать индукционный сигнал от FGF8a в передней эктодерме. (А) Результат гибридизации in situ в зародыше (ст.15), разрезанном пополам (белый пунктир), где одну половину гибридизовали с Fgf8a зондом, а вторую - с зондом Ras-dva. Области экспрессии генов Fgf8a и Ras-dva на стадии нервной пластинки пересекаются в передней эктодерме. (Б-Г) Эффекты, возникающие в сигнальном каскаде, запускаемом молекулами FGF-8a, при нарушении действия малых ГТФаз Ras или Ras-dva,.

(Б,Б') Оверэкспрессия FgfSa индуцирует эктопическую экспрессию маркера передней границы нервной пластинки BF-1. (В,В') оверэкспрессия Fgf8a не приводит к активации экспрессии BF-1 в условиях подавления функции малой ГТФазы Ras-dva посредством микроинъекций мРНК её доминантно-негативной версии DN-Ras-dvaT22N. Более того, при коинъекции мРНК FgfSa и DN-Ras-dva наблюдается ингибирование экспрессии BF-1 в области распространения материала инъекции (В'). (Г,Г') Коинъекция мРНК конкурентного блокатора Ras, DN-RasS17N, никак не влияла на эктопическую экспрессию BF-1, вызванную параллельной оверэкспрессией мРНК FgfSa.

Было выявлено, что оверэкспрессия Otx-2 приводила к эктопической экспрессии гена ¡lasciva, как правило, в ненейральной эктодерме в вентрально-латеральной области зародыша (Рис.4 АД') Однако в клетках передней эктодермы, содержащих эктопическую мРНК Xanf-1, наблюдалось подавление транскрипции гена Ras-dva (Рис.4, Б,Б') Для подтверждения репрессорной функции транскрипционного регулятора Xanf-1 мы синтезировали мРНК, кодирующие гибридные версии ДНК-связывающего домена Xanf-1 с репрессорным доменом транскрипционного фактора Engrailed (EnR) дрозофилы или с сильным актриваторным доменом белка VP16 из вируса герпеса В результате мы наблюдали, что оверэкспрессия мРНК доминантно-репрессорного гибрида EnR-Xanf-1 вызывала ингибирование экспрессии гена Ras-dva (Рис 4, В,В'), как и в случае оверэкспрессии мРНК полноразмерного гена Xanf-1 Кроме того, было выявлено, что в клетках ненейральной эктодермы, содержащих инъецированную мРНК доминантно-акггиваторного гибрида VP16-Xanf-l, область экспрессии гена Ras-dva расширялась (Рис 4, Г,Г'), как и в случае микроинъекций мРНК Otx-2 Результаты данных экспериментов показали, что в процессе регуляции начальных этапов экспрессии гена Ras-dva транскрипционные гомеодоменные факторы Otx-2 и Xanf-1 выполняют активаторную и репрессорную роли, соответственно

Для выяснения, является ли ген Ras-dva прямой мишенью для транскрипционого активатора Otx-2 и репрессора Xanf-1, были проведены эксперименты с использованием мРНК, кодирующих их гибридные версии, состоящие из доминантно-активаторного варианта исследуемого фактора (Otx-2 или VP16-Xanf-l) и дексаметозон-индуцируемой части Дексаметаюн-индуцируемая часть представлена доменом глюкокортикоидного рецептора (Binding Domain of Glucocorticoid Receptor, BDGR), который связывается с комплексом белков теплового шока в цитоплазме и тем самым обеспечивает инактивацию синтезированного гибридного белка. Но при появлении в среде синтетического глюкокортикоида, дексаметазона (DEX) происходит высвобождение BDGR-связанного гибрида из комплекса с белками теплового шока, вследствие чего доминантно-активные версии факторов получают возможность связываться с регуляторными элементами промоторов генов-мишеней Если проводить активацию BDGR-связанных факторов путем добавления DEX после предварительного подавления общего синтеза белка циклогексимидом (СНХ), то в таких условиях транскрипционные факторы будут активировать только свои непосредственные генетические мишени, но не те гены, для активации которых требуется наличие каких-либо промежуточных факторов-посредников Исходя из этого, мы провели микроинъекции зародышей шпорцевой лягушки на стадии 4-8 бластомеров мРНК, кодирующими Otx-2-BDGR или VP 16 Xanf-1 -BDGR, в смеси с флюоресцентной меткой FLD На стадии поздней гаструлы (ст 12) в инкубационную среду с целью блокирования общего синтеза белка был добавлен СНХ до конечной концентрации 10 мкг/мл Через 60-90 минут инкубирования с СНХ для

активации белков Otx-2-BDGR и VP16-Xanf-l-BDGR в ту же среду был добавлен дексаметазон (DEX) в концентрации 2мкМ, зародышей инкубировали до стадии средней нейрулы (сг 14-15), после чего их фиксировали и методом in situ гибридизации выявляли изменения экспрессии гена Ras-dva В результате мы наблюдали эктопическую экспрессию Ras-dva как в клетках, содержащих мРНК Otx-2-BDGR, так и VPl6-Xanf-l-BDGR Эффекты активации каждой конструкции были проанализированы в сумме в 34 зародышах в 2 независимых экспериментах, у 80-82% зародышей наблюдалась эктопическая экспрессия гена Ras-dva (Рис.4, Д,Д\ Ж,Ж') В то же время, в контрольных зародышах, инъецированных мРНК, кодирующими Otx-2-BDGR или VP] 6-Xanf-l -BDGR, но инкубированных только с циклогексимцдом без последующей активации дексаметазоном, область экспрессии гена Ras-dva не была расширена (Рис.4, Е,Е', 33') Интересно, что эктопическая экспрессия гена Ras-dva, вызываемая оверэкспрессией разных конструкций, наблюдалась только в областях ненейральной эктодермы, что может свидетельствовать о существовании дополнительных негативных регуляторов гена Ras-dva в области нервной пластинки, помимо Xanfl

Кроме того, в базе данных Xenbase (http //www xenbase org) была найдена нуклеотидная последовательность промотора гена Ras-dva у X tropicalis В результате её анализа было обнаружено 3 сайта связывания для фактора Otx-2, ТААТСС в районе от -1581 до -1513 (считая от старт кодона), а также тн РЗ палиндромные сайты TAATnnnATTA (между позициями -1600 и -1589, -496 и -485), с которыми может связываться гомеодоменный фактор Xanf-1

Суммируя полученные результаты, можно сделать вывод, что транскрипционные гомеодоменные факторы Otx-2 и Xanf-1 напрямую регулируют начальную экспрессию гена Ras-dva в головной эктодерме зародышей шпорцевой лягушки предположительно по следующей схеме 1) транскрипционный фактор Otx-2 активирует экспрессию гена Ras-dva в области передней эктодермы зародыша на стадии средней гаструлы 2) по ходу развития зародыша из части передней и дорзальной эктодермы формируется нервная пластинка В ей передней и средней части происходит исключение экспрессии гена Ras-dva, благодаря действию на него транскрипционного репрессора Xanf-1 и пока не известных транскрипционных факторов, соответственно В результате, к стадии средней нейрулы экспрессия гена Ras-dva остается только в группе ненейральных клеток, подковообразно окаймляющих нервную пластинку спереди и с боков

2 4 Функционирование гена Ras-dva необходимо для правильной дифференцировки зачатков мозга, присоски, органов чувств и головных хрящей.

Сопоставление области экспрессии гена Ras-dva с презумптивными картами развития X laevts позволяет сделать предположения о вовлеченности исследуемой малой ГТФазы в

процессы формирования и развития тех ичи иных структур зародыша Мы выяснили, что область экспрессии гена Ras-dva на стадии средней нейрулы перекрывается с зачатком присоски, областью эктодермальных плакод (из которых развиваются парные органы чувств), нервного гребня (клетки которого участвуют в формировании головных хрящей и периферической НС) и граничит с нервной пластинкой (предшественником ЦНС) Логично предположить, что малая ГТФаза Ras-dva вовлечена в процессы развития этих областей зародыша В связи с этим был проведен ряд экспериментов по нарушению функционирования гена Ras-dva или его продукта и проанализированы возникающие при таких условиях аномалии развития Для блокирования Ras-dva мы использовали инъекции следующих «блокаторов»

1 Морфотиновые олигонуклеотиды aumu-Ras-dva Mo - это химически синтезированные модифицированные анти-смысловые олигонуклеотиды (www gene-tools com), которые связываются с 5'-НТО мРНК Ras-dva, препятствуют посадке рибосомы на мРНК и, следовательно, блокируют синтез белка Ras-dva

2 гетеро-олигомеры aumu-Ras-dva HypNA-pPNA, состоящие из фофсоно-PNA мономеров и PNA-подобных мономеров, синтезированных на основе транс-4-гидрокси-Ь-пролина (См Методы Рис 15а) [Efimov et al, 1998] Или онти-Ras-dva pHypNAs - олигомеры, содержащие производные транс-4-гидрокси->)-ацетил-пирролидин-2-фосфоновой кислоты - pHypNAs (Рис 156) [Efimov et al, 2003] Механизм действия этих синтетических анти-смысловых ДНК-миметиков аналогичен таковому морфолиновых олигонуклеотидов

3 синтетическая мРНК, кодирующей доминантно-негативный вариант белка Ras-dva с точечной заменой Thr в положении 22 на Asn (по аналогии с dnRasS17N [Ribisi et al, 2000]) Белок dnRas-dvaT22N может связывать некий специфичный для Ras-dva белок-активатор -фактор нуклеотидного обмена GEP, но не способен переходить в активную ГТФ-связанную форму, и поэтому блокирует дальнейшую передачу сигнального каскада. В результате, происходит общее снижение количества свободных белков-активаторов GEP и занижение уровня активированных Ras-dva белков в зародыше, которые бы осуществляли сигнальный каскад

Зародышей шпорцевой лягушки инъецировали смесью «блокатора» и флюоресцентной метки FLD на стадии 2-4 бластомеров и растили до стадии 45, когда большинство органов головастика уже сформированы, и анализировали области зародышей, содержащие метку FLD, на предмеп наличия аномалий развития В результате было выяснено, что эффекты всех трех вариантов «блокаторов» приводят к качественно одинаковым, но немного разным по силе аномалиям редукции головного отдела зародыша (нарушения развития жаберного аппарата и головных хрящей), нарушению структуры глаза, уменьшению или полной редукции обонятельной луковицы и слухового пузырька, редукции конечного отдела мозга telencephalon (Рис 5, Б-Д) На поперечных срезах, обработанных гематоксилином для выявления ядер и цитоплазмы клеток, видно, что на инъецированной стороне зародыша (указана красной стрелкой) нарушено строение соответствующих структур головного отдела зародыша конечного мозга (Рис.5,Ж,3), глаза (Рис 5,3,И), жаберных хрящей (Рис 5,К) и присоски (Рис 5,М) Таким образом, видно, что функциональная активность малой ГТФазы Ras-dva на ранних стадиях развития зародышей шпорцевой лягушки играет важную роль в процессах

закладки и развития зачатков соответствующих органов в головном отделе зародыша Заметим, что аномалии вызванные нарушением функционирования Ras-dva на ранних этапах развития хорошо коррелируют с предположениями, выдвинутыми по карте презумптивных зачатков

Качественная универсальность аномалий, возникающих при использовании «блокаторов» Ras-dva с разными механизмами действия, а именно, dnRas-dvaT22N и анти-смысловых олигомеров, указывает на их специфичность Это подтверждается также тем, что микроинъекции синтетических олигомеров (anmu-Ras-dva Мо, pHypNA или HypNA-pPNÁ), в последовательности которых были введены 4-2 замены азотистых оснований (mismatched, ММ), не вызывали описанных выше аномалий (Рис 5, Е)

Для более четкого подтверждения специфичности эффектов, возникающих, при блокировании функции Ras-dva, например, антисмысловыми морфолиновыми олигонуклеотидами mmu-Ras-dva Mo, был проведен эксперимент по спасению аномального (мутантного) фенотипа при помощи коинъекции синтетической Jlag-Ras-dva мРНК Эта мРНК имеет измененную 5'-нетранслируемую область, и, следовательно, онти-Ras-dva Мо не может препятствовать трансляции Ras-dva с этой экзогенной матрицы Зародыши шпорцевой лягушки были разделены на 2 группы Зародышей первой группы инъецировали на стадии 2-х бластомеров (в один из них) смесью antnu-Ras-dva Mo +FLD (метка) Зародышей второй группы - смесью anmu-Ras-dva Mo+flag-Ras-dva мРНК+ FLD Зародышей анализировали на предмет наличия вышеназванных аномалий развития на 43-45 стадиях развития, подсчитывали соотношения отдельных аномалий развития В результате эксперимента было выяснено, что процент аномальных зародышей снижается в группе 2 в два раза А именно, в группе 1 аномальные зародыши составляли 63% от общего числа инъецированных зародышей (185шт), а во 2-ой группе - 30% (193шт) Снижение количества аномальных зародышей свидетельствует о том, что такие аномалии, как асимметрия головного отдела зародыша, уменьшение размера глаза, уменьшение или полная редукция обонятельной луковицы и слухового пузырька, редукция переднего отдела мозга telencephalon, специфично возникают при нарушении синтеза именно Ras-dva белка То есть, онти-Ras-dva Мо блокируют трансляцию только эндогенной Ras-dva мРНК, и что Ras-dva белок, образующийся на основе flag-Ras-dva мРНК, функционален, т к способен специфично компенсировать недостаток эндогенного белка Ras-dva

2 5 Функция Ras-dva необходима для нормальной экспрессии специфичных генов-маркеров, регуляторов раннего развития зародышей X laevis

Так как малые ГТФазы Ras-dva наиболее гомологичны белкам семейства Ras, которые являются участниками разных сигнальных каскадов в клетке, то можно предположить, что белок шпорцевой лягушки Ras-dva может участвовать в процессе передачи некоторого сигнала

на ранних стадиях развития, нарушение которого и приводит к аномалиям развития головного отдела заро пыша, описанным выше С целью выяснения потенциальных мишеней сигнального каскада Ras-dva мы провели ряд экспериментов по блокированию функционирования белка Ras-dva на ранних стадиях развития и исследовали изменения экспрессии ряда специфичных генов-маркеров, регуляторов раннего развития зародышей шпорцевой лягушки Анализ возможных изменений экспрессии этих генов в ответ на подавление функции Ras-dva изучали методами ОТ-П1ДР (RT-PCR) и гибридизации in situ Так, методом ОТ-ПЦР анализировали маркерные гены BF-1, Otx-2, Xag2, NCAM, Ventl, Vent2b и BMP4 Методом гибридизации m situ исследовали изменения экспрессии генов BF-1, Olx2, Sox9, Slug, Рахб, Msx-I, tlcxB9 и Xag2 В результате были установлены гены, экспрессия которых либо не изменяется, либо специфично подавляется, либо, наоборот, усиливается в ответ на подавление функции Ras-dva

Для анализа методом ОТ-ПЦР использовали экспериментальную систему эксплантатов анимальной эктодермы В случае отсутствия внешнего воздействия такие эксплантаты развиваются в атипичный эпидермис, клетки которого не экспрессируют ни нейральные маркеры, ни маркеры головных эктодермапьных структур Так как нас интересовали изменения в экспрессии как нейральных, так и ненейральных генов-маркеров переднеголовного отдела зародыша шпорцевой лягушки на стадии средней нейрулы, мы активировали эксплантаты транскрипционными фактороми Otx2 или Noggin, которые способны индуцировать различные переднеголовные маркеры (Xagr2, Xag2, Ventl, BF-1, Xanfl, Ras-dva и тд) В качестве контроля мы использовали эксплантаты эктодермы зародышей шпорцевой лягушки, инъецированных мРНК otx-2 или noggin, а как экспериментальные (в которых блокирована функция Ras-dva) - эксплантаты зародышей, инъецированных следующими вариантами смесей мРНК Otx-2 + aumu-Ras-dva Mo, мРНК Otx-2 + мРНК dnRas-dva, мРНК Noggin + Анти-Ras-dva Mo или мРНК Noggin + мРНК dnRas-dva

После выделения пулов мРНК из контрольных и экспериментальных групп эксплантатов была проведена реакция обратной транскрипции, в результате чего были получены соответствующие пулы кДНК Сравнительный анализ контрольных и экспериментальных пулов кДНК был проведен при помощи ПЦР со специфическими для различных генов-маркеров граймерами

Результаты ОТ-ПЦР показали, что ингибирование синтеза Ras-dva белка в эксплантатах специфично активирует экспрессию эпидермальных генов Ventl, Vent2b и BMP4 и ингибируст эксперссию генов Xagr2, Xag2, Otx-2, BF-1, маркеров передней эктодермы присоски, эктодермальных плакод и нервной пластинки В то же время, нарушение функционирования Ras-dva никак не влияло на экспрессию паннейрального маркера NCAM (Рис.б, Н,0)

Для анализа изменений паттернов экспрессии генов-маркеров в целых зародышах использов.ши метод гибридизации m situ Зародышей шпорцевой лягушки инъецирорали

смесью «блокатора», Лнти-Ras-dva Мо или мРНК dnRas-dva, и флюоресцентной метки FLD на стадии 2-4 бластомеров и растили до стадии средней нейрулы (ст 15), когда уже должен активно функционировать ген Ras-dva и экспрессируются многие маркерные гены, регуляторы раннего развития шпорцевой лягушки Далее зародышей фиксировали и методом in situ гибридизации анализировали области зародышей, содержащие метку FLD, на предмет наличия каких-нибудь изменений в паттерне экспрессии генов-маркеров, используя специфические для них дигоксигенин-меченные зонды В итоге было показано, что подавление функционирования малой ГТФазы Ras-dva, как при использовании в качестве «блокатора» Анти-Ras-dva Мо, так и мРНК dnRas-dvaT22N, приводит к ингибированию генов-маркеров нервного гребня (Sox-9, Slug) (Рис 6,А,Б), передней границы нервной пластинки (BF-/) (Рис 6Д), присоски и среднего мозга (Xag-2, Otx-2) (Рис 6,Е,Ж) и обонятельной плакоды (Рах-6) (Рис 6,3) При этом экспрессия гена-маркера задней части нервной пластинки (НохВ9) никак не изменялась в этой области зародыша, содержащей FLD метку распространения «блокатора» (Рис.6,Г) Описанные эффекты наблюдались в 60% и более случаях для каждого маркера (всего 25-40 зародышей в 2-3-х независимых экспериментах) Кроме того, мы обнаружили, что область экспрессии одной из генетических мишеней сигнального каскада ингибитора нейрального развития ВМР-4 (Bone morphogenetic protein 4), гена Msx-1 была расширена в районе зародыша, где функция Ras-dva была подавлена (Рис.6,В) Этот результат хорошо дополняет данные ОТ-ПЦР, где мы видели активацию экспрессии сигнальной молекулы ВМР-4 и 2-х мишеней его сигнального каскада, Ventl и Vent2b, при бчокировании Ras-dva. Можно предположить, что в норме функция Ras-dva направлена на регулирование ВМР-4 каскада, который препятствует развитию эктодермальных клеток в нейральном направлении и, следовательно, экспрессии в них нейральных и плакодных маркерных генов

Кроме того, мы показали, что изменения экспрессий генов-маркеров, вызываемые микроинъекциями Анти-Ras-dva Мо, являются специфичными На примере гена Slug нами было выявлено, что подавление его экспрессии, вызванное блокированием трансляции мРНК Ras-dva морфолиновыми олигонулеотидами (Рис 6JI), может быть скомпенсировано при коинъекции мРНК Jlag-Ras-dva с измененной 5' НТО (см п 2 4), которая может служить альтернативной матрицей для синтеза белка Ras-dva в зародышах шпорцевой лягушки (Рис 6,М) В то время, как у 9 из 14 зародышей, инъецированных Анти-Ras-dva Мо + FLD, наблюдалось ингибирование экспрессии гена Slug, у 10 из 14 зародышей, инъецированных смесью Анти-Ras-dva Мо + мРНК Jlag-Ras-dva + FLD, мы наблюдали нормальную экспрессию гена Slug на стадии 15 То есть коинъекции мРНК Jlag-Ras-dva приводили уменьшению количество аномальных эффектов в 2,25 раза

Важно отметить, что изменения экспрессии специфических генов-маркеров раннего развития, возникающие при нарушении функционирования малой ГТФазы Ras-dva на ранних

стадиях развития, коррелируют с аномалиями развития, возникающими при тех же условиях, но на поздн « стадиях развития

В сумме полученные результаты ОТ-ПЦР и гибиридизации in situ показали, что функционирование малой ГТФазы Ras-dva на ранних стадиях развития необходимо для нормального патгернинга передней эктодермы зародышей шпорцевой лягушки

2 6 Малая ГТФаза Ras-dva способна контролировать сигнальный каскад от FGF8a в клетках го говной эктодермы зародышей шпорцевой лягушки

Выше мы предположили, что малая ГТФаза Ras-dva может участвовать в регуляции сигнального каскада нейрального ингибитора ВМР-4 Анализ литературных данных выявил, что при развитии задней части нервной системы антагонистическими по отношению к ВМР-каскаду являются сигналы от факторов роста фибробластов (Fibroblast Growth Factors) FGF способен индуцировать синтез секретируемых BMP-антагонистов (noggin, chordin) в параксиальной мезодерме, подстилающей края нервной пластинки, и, соответственно, уменьшать количество BMP сигналов в этой области [Koshida et al, 2002] Кроме того, известно, что для передачи сигнала от bFGF (basic Fibroblast Growth Factor, также называемый FGF1), приводящего к индукции туловищной нейроэктодермы, важен белок Ras и активируемый им МАР-киназный каскад Доминантно негативный белок RasS17N блокирует нейральную индукцию молекулами bFGF, те без малой ГТФазы Ras bFGF не способен индуцировать экспрессию ни гена hoxB9 - маркера спинного мозга, ни гена еп2- маркера среднего и заднего отделов мозга При этом индукция передней (головной) нейроэктодермы не нарушала«. [Ribisi et al, 2000]

Так как малые ГТФазы семейства Ras-dva наиболее гомологичны белкам семейства Ras и имеют аналогичную им примембранную локализацию, логично предположить, что в головной эктодерме зародыша белок Ras-dva мог бы участвовать в передаче сигнала от молекул FGF, например, от FGF8a Мы обнаружили, что область экспрессии Fgf-8a в головной эктодерме на стадии нервной пластинки перекрывается с таковой Ras-dva (Рис.7, А) Кроме того, известно, что сигнал FGF-8 необходим для экспрессии гена важного регулятора развития конечного отдела моз! а - транскрипционного фактора BF-1 Показано, что эктопическая экспрессия Fgf-8а приводит к расширению области экспрессии BF-1 в передней эктодерме зародышей позвоночных [Shimamura, Rubenstein, 1997, Kobayashi et al, 2002] Мы же в свою очередь наблюдали ингибирование экспрессии BF-1 при подавлении функции Ras-dva Кроме того, известно, что именно FGFSa-сигнал важен для развития и дифференцировки пан-плакодной области [Airens, Schlosser, 2005], нарушение развития которой мы наблюдали при подавлении функции Ras-dva К тому же область экспрессии Ras-dva перекрывается с областью экгодермальных плакод

Для проверки предположения об участии Ras-dva в процессе сигнального каскада от FGF8a, приводящего к активации экспрессии гена BF-1, мы провели сравнительный анализ эффектов, возникающих в этом каскаде при нарушении действия малых ГТФаз Ras или Ras-dva

Известно, что эктопическая экспрессия Fgf-8a приводит к расширению области экспрессии BF-1 в передней эктодерме зародышей шпорцевой лягушки В соответствии с этим мы провели серию микроиньекций зародышей на стадии 2-4 бластомеров либо чистой мРНК Fgf-8a (контроль), либо мРНК Fgf-8a в смеси с мРНК конкурентного блокатора Ras-dva - dnRas-dvaT22N Для сравнения мы также инъецировали в отдельных опытах мРНК Fgf-8a в смеси с мРНК блокатора ГТФазы Ras - dnRasS¡7N Во всех опытах в качестве витальной метки использовали FLD На стадии средней нейрулы зародыши, несущие FLD метку в головной эктодерме, были зафиксированы и проанализированы на предмет изменений паттерна экспрессии гена BF-1 методом гибридизации in situ В результате было выявлено что, в соответствии с литературными данными, оверэкспрессия Fgf3a приводит к расширению области экспрессии гена BF-1 в головной эктодерме зародышей шпорцевой лягушки (79%, всего 34 зародыша в 2 экспериментах) (Рис 7, Б,Б') При этом коинъекция мРНК конкурентного блокатора Ras, dnRasS17N, никак не влияла на эктопическую экспрессию BF-1, вызванную параллелной оверэкспрессией мРНК FgfSa (Рис.7, Г,Г') Описанные эффекты наблюдались в 80% случаев (всего 35 зародышей в 2 независимых экспериментах) Напротив, при коинъекции мРНК блокатора Ras-dva, dnRas-dvaT22N, мы наблюдали не только отсутствие эктопической экспрессии гена BF-I, но даже ее ингибирование в головной эктодерме зародышей, содержащих FLD метку (81% из 32 в двух независимых экспериментах) (Рис.7, В,В')

Таким образом, мы показали, что малая ГТФаза Ras-dva, в отличие от белка K-Ras, проявляет специфическую функцию, выражающуюся в способности контролировать сигнальный каскад от молекулы FGF8a в клетках передней эктодермы зародышей шпорцевой лягушки

Выводы

1 Открыто новое семейство малых ГТФаз - Ras-dva, присутствующее только у позвоночных животных Установлено, что белки этого семейства имеют особенности в строении switch 1 и switch2 участков каталитического G-домена и на С-конце несут сайт пренилирования

2 На модели эмбрионов шпорцевой лягушки установлено, что на ранних стадиях развития ген Ras-dva экспрессируется в головной эктодерме - в клетках зачатков нервной пластинки, нервного гребня, присоски и органов чувств Начальные этапы экспрессии Ras-dva в данных клетках напрямую регулируются транскрипционными гомеодоменными факторами Otx-2 и Xanf-1

3 Впервые показано, что малая ГТФаза Ras-dva локализована на клеточных мембранах и способна контролировать сигнальный каскад, запускаемый фактором FGF8a в клетках головной эктодермы зародышей шпорцевой лягушки

4 Результаты экспериментов по блокированию синтеза Ras-dva на ранних стадиях развития показали, что функционирование этой ГТФазы в клетках головной эктодермы необходимо для правильной дифференцировки зачатков присоски головного мозга, органов чувств и головных хрящей

5 На поздних стадиях развития эмбрионов шпорцевой лягушки ген Ras-dva экспрессируется в клетках дифференцированных органов, обладающих секреторной активностью, в клетках присоски, железы вылупления, обонятельных ямок, эпифиза, гипофиза, жаберных дуг, желчного пузыря, пищевода и желудка Данное обстоятельство указывает на возможную вовлеченность малой ГТФазы Ras-dva в регуляцию секреторных процессов в дифференцированных клетках

Список публикаций по теме диссертации;

1. М.Б.Терешина, В В Белоусов, А Г Зарайский Изучение механизма внутриклеточной локализации малой ГТФазы Ras-dva Биоорганическая химия, 2007, том 33, № 5, стр 574-576

2. Efimov VA, Birikh KR, Staroverov DB, Lukyanov SA, Tereshma MB, Zaraisky AG, Chakhmakhcheva OG Hydroxyprolme-based DNA mimics provide an efficient gene silencing in vitro and in vivo Nucleic Acids Res 2006 May 2;34(8) 2247-57

3. Tereshina M.B , Zaraisky A G , Novoselov V V Ras-dva, a member of novel family of small GTPases, is required for the anterior ectoderm patterning in the X laevis embryo Development 2006 Feb, 133(3) 485-94

4. Tereshina M.B , Novoselov V V , Zaraisky A G Ras-dva-novel family of small GTPases Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of MI Vavilov 20-22 September 2007, Kiev, Ukraine p 95

5. Терёшина М.Б , Новоселов В В , Зарайский А Г Новая малая ГТФаза Ras-dva систематическое положение и роль в эмбриогенезе шпорцевой лягушки Тезисы докладов и стендовых сообщений VIII чтений, посвященных памяти академика Ю А Овчинникова 25-27 октября 2006г стр 19

6. Терёшина М.Б. Новая малая ГТФаза Ras-dva систематическое положение и функция (2005) Тезисы докладов XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005», (МаксПресс, Москва, 2005), стр 212

Подписано в печать31 01 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 44 Тираж 80 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Терёшина, Мария Борисовна

Введение

1. Обзор литературных данных 8 1.1 Нейральная индукция и регионализация эмбриональной 8 эктодермы. h 1 í 1. Дифференцировка нервной пластинки.

1.1.2. Дифференцировка пан-плакодной области эктодермы.

1.1.3 Дифференцировка области нервного гребня. 14 1.2. Гомеодоменный транскрипционный фактор Anf - регулятор 16 раннего развития переднего мозга позвоночных

1.3 Генетические мишени гомеодоменного транскрипционного 18 фактора Xanfl.

1.4 ГТФ-связывающие белки

1.5 Суперсемейство малых ГТФаз

1.5.1 Основные характеристики и свойства малых ГТФаз.

1.5.1.1 Цикл активации/инактивации малых ГТФаз

1.5.1.2 Строение и функция каталитического G-домена

1.5.1.2.1 Связывание ГТФ

1.5.1.2.2 Гидролиз ГТФ и вспомогательные GAP белки

1.5.1.3 Внутриклеточная локализация малых ГТФаз

1.5.2 Семейства малых ГТФаз и их роль в эмбриогенезе.

1.5.2.1 Ras семейство малых ГТФаз

1.5.2.2 Rho семейство малых ГТФаз

1.5.2.3 Rab семейство малых ГТФаз

1.5.2.4 Arf7 Sari семейство малых ГТФаз

1.5.2.5 Ran семейство малых ГТФаз

1.5.2.6 RGK семейство малых ГТФаз.

1.5.2.7 RJL семейство малых ГТФаз.

1.5.2.8 Gie семейство малых ГТФаз.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ras-dva - новое семейство малых ГТФаз. Роль малой ГТФазы Ras-dva в раннем развитии шпорцевой лягушки"

Изучение механизмов реализации информации, заложенной в геноме, в процессе онтогенеза является одной из фундаментальных проблем биологии. Важной задачей молекулярной биологии развития является поиск и исследование молекулярно-генетических механизмов и сигнальных каскадов, необходимых для нормального развития и регионализации головного отдела зародышей позвоночных животных. Особый интерес в этой области представляют исследования механизмов развития: головного мозга,-в частности, его переднего отдела, отвечающего за высшие формы нервной деятельности.

Известно, что важную роль в регионализации и клеточной дифференцировке в ходе развития головного мозга, играют гомеодоменные транскрипционные факторы и их геномные мишени [Ermakova et al., 1999; Boyl et al., 2001; Kiecker and Lumsden, 2005]. Так, одним из ключевых звеньев молекулярных механизмов, обеспечивающих развитие переднего мозга, у позвоночных является-гомеодоменный белок Anf. Ген Anf специфически экспрессируется на ранних, стадиях развития зародышей позвоночных в зачатке переднего мозга; из которого в ходе развития формируются большие полушария мозга (т.н. конечный; мозг); а также промежуточный отдел головного мозга, включая глаза [Zaraisky,1992, Kazanskaya et al., 1997]. В результате поиска геномных мишеней Anf "на: модели : эмбрионов Xenopus laevis был идентифицирован ген, кодирующий ранее неизвестную Ras-подобную малую ГТФазу. Было установлено,, что в раннем эмбриогенезе найденный ген экспрессируется вдоль границы, отделяющей-зачаток: переднего мозга, расположенный! в передней части спинной стороны, зародыша, от брюшной его части [Novoselov et al., 2003]. На основании подобной, пограничной, локализации экспрессии данного гена, а также принадлежности, кодируемой им малой ГТФазы к суперсемейству Ras ГТФаз,. он получил название - Ras-dva (последнее сокращенно - dorsal-ventral-anterior: спина-брюхо-перед).

Малые ГТФазы представляют собой суперсемейство регуляторных ГТФ-гидролаз, в котором выделяют 8 семейств: Ras, Rab, RJL, Ran, RGK, Rho/Rac/Cdc42, Arf/Sar и Gie. Белки этих семейств принимают участие в таких разнородных клеточных процессах, как трансдукция сигналов: и регуляция экспрессии генов (Ras, Rho), реорганизация цитоскелета (Rho, RGK), организация микротрубочек и их функционирование (Ran, Gie), везикулярный (Rab, Arf/Sarl) и ядерно-цитоплазматический транспорт (Ran) [Hall, 2000; Finlin et al., 2000; Takai et al, 2001; Nepomuceno-Silva et al., 2004; Okai et al., 2004].

Учитывая специфичную экспрессию Ras-dva вдоль границы зачатка переднего мозга, логично предположить, что малая ГТФаза Ras-dva может играть важную роль в сигнальных механизмах, регулирующих развитие мозга и прилежащих головных структур. В связи с этим, поиск гомологов Ras-dva и дальнейшее изучение их биологических функций представляется перспективным подходом для понимания механизмов раннего эмбрионального развития переднего мозга.

Кроме того, сравнительно низкая степень гомологии Ras-dva с представителями восьми других известных семейств малых ГТФаз делает изучение ГТФазы Ras-dva и ее гомологов важным как с классификационно-структурной точки зрения, так и с точки зрения выявления возможных новых типов внутриклеточных сигнальных каскадов

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Терёшина, Мария Борисовна

1.6 Заключение

Обзор литературных данных о разных семействах малых ГТФаз показывает, что белки каждого семейства, наряду с общими характеристиками, .имеют особенности в первичных аминокислотных последовательностях, в частности, в строении G1-G5 консенсусов, сайтов пост-трансляционных липидных модификаций, эффектор-связывающих доменов и специфических консервативных доменов. В результате этого, степень гомологии между белками разных семейств составляет менее 35%, а между белками> одного семейства - более 50%. При этом белки разных семейств выполняют различные важные функции в клетке: трансдукция сигналов и регуляция экспрессии генов (Ras, Rho), реорганизация цитоскелета (Rho, RGK), организация микротрубочек и их функционирование (Ran, Gie), регуляция везикулярного (Rab, Arf/Sarl) и ядерно-цитоплазматического транспорта (Ran). А, следовательно, малые ГТФазы играют важную роль в обеспечении нормальной жизнедеятельности как клетки, так и многоклеточного^ организма. Многие малые ГТФазы вовлечены в процессы формирования и развития многоклеточных организмов на самых ранних этапах эмбриогенеза. В частности, была доказана важная роль малых ГТФаз в таких процессах, как созревание ооцитов, гаструляция, нейральная индукция, регионализация зародышевых тканей и их последующая дифференцировка. В тоже время, роль многих малых ГТФаз в развитии остается не изученной. Кроме того, остается актуальной задача поиска.и изучения функций новых членов этого суперсемейства белков - важных регуляторов эмбриогенеза.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1 Систематическое положение новой малой ГТФазы Ras-dva в суперсемействе малых ГТФаз.

2.1.1 Поиск гомологов белка Ras-dva шпорцевой лягушки у разных организмов и анализ их аминокислотных последовательностей.

Известно, что более 200 малых ГТФаз, описанных на данный момент, формируют 8 семейств (Ras, Rab, Rho/Rac/Cdc42,Ran, RGK, RJL, Gie и Arf/Sar) внутри общего суперсемейства малых ГТФаз. Так как степень гомологии нового белка шпорцевой лягушки, малой ГТФазы Ras-dva, с белками известных семейств не превышает 35%, то поиск гомологов малой ГТФазы Ras-dva у разных живых организмов и их сравнение с другими малыми ГТФазами представляет интерес, как с классификационной точки зрения, так и с целью выявления их структурных особенностей.

С помощью пакета программ BLAST был проведен поиск гомологов, нового белка XIRas-dva (GenBank Accession Number: AF513854) у прокариот и эукариот (грибов, растений, позвоночных и беспозвоночных животных) в разных базах данных: NCBI Genbank (http://ncbi.nlm.nih.gov), Saccharomyces http://www.yeastgenome.org/, The Arabidopsis Information Resource (TAIR) (http://www.arabidopsis.org/), Xenbase (http://www.xenbase.org), JGI (http://genome.jgi-psf.org), University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser Database (http://genome.ucsc.edu), Strongylocentrotus purpuratus sea urchin (морской ёж) genome project (http://sugp.caltech.edu), степень гомологии которых составляла 50% и более. В итоге было обнаружено и зарегистрировано 15 гомологов XIRas-dva у различных позвоночных огранизмов: 1 гомолог у бесчелюстной рыбы миноги (Petromyzon marinus, EU379655), 9 гомологов у костистых рыб: 2 - у D anio rerio (DQ278181, AY729884), 3 - у Takifugu rubipes

DQ278182, DQ278183, DQ278184) и по одному у Gasterosteus aculeatus (DQ278185), Oncorhynchus mykkis (ABB84863) и Ozyrias latipes (DQ278187), Tetraodon nigroviridis (CAG02679), 3 - у лягушек X. tropicalis (AY729885, DQ278180) и X. laevis (ABM63371), 1 гомолог у ящерицы Anolis carolinensis (EU380237) и 1 гомолог у курицы Galliis gallas (AY729886). Кроме того, среди программно-предсказанных кДНК был обнаружен гомолог Ras-dva у опоссума (класс. Млекопитающие, отр.Сумчатые) Monodelphis domestica (XP001377674). У прокариот и растений гомологов малой ГТФазы Ras-dva не было выявлено. Кроме того, недавно при анализе генома морского ежа Stongylocentrotus purpuratus Beane W.S. и коллеги нашли ген, кодирующий малую ГТФазу наиболее гомологичную белкам Ras-dva [Beane et al., 2006]. Однако, степень гомологии упоминаемого в статье белка с перечисленными выше составляет менее 45%, что может говорить о его принадлежности к какой-то отдельной группе малых ГТФаз, близкой к белкам Ras-dva. В связи с этим, вопрос о представленности малых ГТФаз Ras-dva у беспозвоночных животных остается открытым.

Проведенный анализ позволяет сделать следующие предварительные выводы.

- Вероятно, малые ГТФазы Ras-dva впервые появились в эволюции только у позвоночных организмов. В связи с этим важно отметить, что ген, кодирующий гомеодоменный белкок Anf, чьей мишенью является ген Ras-dva у шпорцевой лягушки X. laevis, также впервые появляется лишь у позвоночных животных, где он выполняет функцию регулятора развития переднего мозга. Можно предположить, что именно появление новых генов, очевидно возникших путем дупликаций и последующей быстрой дивергенции каких-то генов-предшественников, создало предпосылки для возникновения у позвоночных таких новых анатомических структур как передний мозг, нервный гребень и единая область зачатков органов чувств (пан-плакодная зона).

- Обнаружение гена Ras-dva у опоссума, сумчатого млекопитающего, позволяет предположить, что и у высших млекопитающих могут присутствовать гомологи Ras-dva. Возможно, найти ген малой ГТФазы Ras-dva, кодирующая рамка которого составляет всего лишь около 650 пар оснований (п.о.) и не содержит интронов, у высших млекопитающих организмов пока не удается из-за недостаточной полноты геномных баз данных.

С целью выявления функциональных участков, характерных для группы обнаруженных малых ГТФаз К.аэ-с1уа, нами было проведено множественное выравнивание их аминокислотных последовательностей (Рис.9).

На множественном выравнивании видно, что белки Яаэ-ёуа имеют консервативные участки в районах консенсусов С1-С5, входящих в состав каталитического в-домена ГТФаз (Рис.9, С1-С5 выделены красным). У малых ГТФаз 11аз-сЬ/а они имеют следующие консенсусные последовательности (Табл.3). Таблица 3. Консенсусные поледовательности С1-С5 участков белков Лаз-буа.

G1 G2 (switchl) G3(switch2) G4 G5

GAAGVGKT HRRTVEE YXDTSGS VGNKXD FXEXSAK

Кроме того, у всех Ras-dva белков было выявлено наличие С-концевого сайта пренилирования -СХАХ, где С- а.о. цистеина (Cys), -SH группа которого подвергается пренилированию, А - алифатический а.о., а X - любой а.о. (Рис.9, выделен желтым). Известно, что такие сайты пренилирования могут обусловливать связывание белков с мембранными структурами клетки [Pechlivanis and Kuhlmann,2006].

Рис.9 Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей белков Яаз-й\а (в программе СШБТАЬ (1.83)) в! 02 (switchl)

ТгИаз-С^аЗ МЭЬЕ - УКЕКТНУЯЬУП^еаАбУбкфЬ! 0ЕРЬ0РКРЕАКрШКТУЕЕ|МНЗКЕ УР1С - - СУК 57

GaRas-dva МЗЬЕ-УКЕКТ0УНЬУРЬСААСУСКТАЬ^РЬ0ОТГЕРКНККТУЕЕШЗКЕУВ1О--СУК 57

Оп&ав^уаЗ МЗЬУ-УКЕКТЕУНЬУРЬСААСУСКТАЫЗИГЬ0ВТГЕРКНГ®.ТУЕЕШЗКЕРШС--ИАК 57 МЗЬЕ-УКЕКТЕтаЬУГМСААСУСКТАЬ1КНЕЕ0РЗРЕРЮтКТУЕЕШЗКЕУЕУА--СУК 57

ТгЕав-^а1 МЗРК-УКЕКТЕтаЬУРЬС2^АОТСКТАЫОКРЬКСТРЕРКНКаТУЕЕ1лНМСЕУУУа--СУК 57

TnRas-dva МЗРК-УКЕКХЕУЕЬУРЬСААСУСКТАЫОНГЬКОТРЕРЮЮаТУЕЕЬНЯКЕУУУС--СУК 57

НЫ1ав-ауа НЗМЕ-УКЕЯТЕУНЬУРЕСААСУСКТА110НРЬКВТРЕРКШЖТУЕЕШНКЕУЕУС--СМК 57

01лаа-с^а М31А-УКЕКТВУЕЬУРЬСАССУСКТАЫНКРЬ0ВТГОРКНККТУЕЕ1НШСЕУЕУС--ОУК 57

АсИаз-^а МЗЬА-УКЕКЗОУКЬУРЬОААСУСКТАЫОНРЬОВТРЕРКНКНТУЕЕЬНЗКЕУОУЗ--САТ 57

G9Ras-dva МЗЬУ-СКЕКЗНУНЬУРЕСААСУаКТАЫЯИРЬЬОТРЕРКЮШ.ТУЕЕШЗКЕУЕУЗ- -йАТ 57

Х^ав-^Уа2 МБЕБ-ТКЕКК01РЬУРЬСААСУОКТЭЬ 11тГЕ0ОТтРК1ПШ.ТУЕЕЬНЗТЕУЕАТС-йТО 58

Хйиав-ауаг МЗЬЗ-ТКЕКНОШЬУРЬСААСУСКТЗЬХЗНРЬЬПТРВРКНШШ/ЕЕШЗТЕУЕАТС-СТО 58

ПгИав^а1 МЗЬЬ-У0ЕНКТУНРУРЬСААСУСКТАЫТНЕЬаОНГПЗКУТаТУЕЕи1АЬЕУПТЕС--ЛН 57

TrRas-dva2 МЗРР-ЛКТН-ТтаЬУРЬСААСУСКЗАЫННРЬИВЗРЕНКУТКТУБЕШУЬЕУАУТСЗССК 58

Х^аз^Уа ИЭ---У335ВТУРЬУРРСААСУСКТАЬ10НЕ12ГОЗРЕЕРУ1тТУЕЕМНСЕМРЕРС--ЕЕ0 55

ХЬНаз-йУа МЗЬЗ-УЗРЗПТУКЬУРРСЛАСУСКТАЫ0РР1ЛВНРППКУККГУЕЕМУСЬНРЕРС--АЕ0 57

ГЙНаз^Уа МАЕОРАКРКЗСУКЬУРРСААСУСКТЛЫ0РР1АПТРЕА0НКНТУЕЕЬУСЬЕУЕЬП- -ТОО 58

TrRas Саиав Отдав Е^ав ТгКав Тгтаз НЬиаз 01Иаз АсИав Сдйаз Х1иав ХСИаБ РгКав ТгИав Х1наэ XtRas ШЯав

ТгИаз GaRas ОтНав РгНав ТгИаз ТпИаз Н1Шаз 01Еав АоНав йдНав XlRas XtRas ИгНаа TrRas XlRas XtRas МйЛав

-dvaЗ ^уа dvaЗ уа1

Зуа уа

-йуа

-йуа йуа уа2

-йуа2 уа2 -dva

-dva dvaЗ

-йуа

-ёуаЗ

-dval ^уа ^уа -ёуа уа2

-dva2 уа1

-dva2 уа

-ауа1

-dva

1ТУЕ|и.РТЗСЗ|У5РРАМ1гКЬЗ ИЭМЗОЛРАЬУУАУЦОРЕЗЬЕУУКЗЬМЖIЬЕ1КЕБКРТР 117 1ТУЕ11Л)ТЗСЗУЗГРАЖКЪ510НЗРАРАЬУУАУБПРЕЗЬЕАУКТЬНШ1ЬЕ1КЕВКМТР 117 VTIHXMDTSGSYSFPAMRKLCIQNSDЛFALVYAINDPDSLEAVKSLRDEILAVKEDKFTP 117 УТ1Ы1МПТЗСЗУЗРРА1^1ЖЬ310КСОАРАЕУУЗУОЕРЕЗЬЕУУ13Г!Ъ1«гЕ1ЪЕУКЕОКРТР 117 УТ151№ТЗСЗУЗРРЛМЕКЬ510113РЛРЛЬУУАУЕРР03ЬЕЛУКЗЕНЕЕ1ЕЕУКЕПКРТР 117 VT1SIMDTSGSУSFPAMRKLSIQNSDAFALVYAVDDPQSЬEЛVKSLREEILEVKEDKFTP 117 УТ1ШМОТЗСЗУЗРРАМНКЬ310НЗВАРАЬУУАТООРЕЗЕУАУК31ЛУ)Е11,ЕУКЕПК:РТР 117 VTINIIDTSGSYSFPAMRKLSI^TGDAFALVYSVDDPDSLETVKRLRDEI 1ЕЬКЕВКНАР 117 IKУEILDTSGSYSFPAMRKЪSIQNSDAFALVYAVDDAESFECVKSLHEEILELKEDKFPP 117 УТЬЕХШТЗСЗУЗРРАтКЬЗХОЫЗОАРАЬУУЛУВПАЕЗРЕЗХКЗЬЕЕЕХЬЕУКЕПКРРР 117 VRIEILDTSGSYEFPAMRKIlNMKSGDAFALVYTHDDPDSFEMVKHLREEILEAKGDKSPP 118 VRVEI^ШTSGSYEFPAMRKLNMKSGDЛFALVYTMDDPDSFEMVИ^LREEILEЛKGDKSPP 118 УН1Е1ЬРТ363УРРРАМНАЬС1НТСПАРАЬУУЛАВЕРВЗЬЕЕУ0КЬНЕЕ1ЬЕЬКСЕЗРТС 117 УКЬЕ1ЫЭТЗСЗУЗЕРАМРЕЬС1Ш15РЛРЛЬУУАУРВРСЗЬАЕУ0НЬНГ)Е11|0ЬРССКСАР 118 LRIQILDTSGSYSFPAMRKLSI^QGDAFALVFSLSEPDSFQEVERLRSEI ЮУКСРАЕУР 115 ЬК1011£>ТЗС8УЗРРАМККЕ3100СВАРАЬУРЗЬЗЕРПЗР0ЕУЕК1ЛЗЕ11С>УКСПАЕУР 117 таЬЕ ХМОТБСБ УЭ РРАМККЬСI КНСОАРЛЬУУЗЬОЕРЕЗРОЕУГЖЕРЛЬаЬЕТКСЕЛРЗР 118

• ******

04 й5

--1УУ|УС:ЖТР[КЕО-ЕР0--УЗЗЕРУЬ5ТУЕЕРУгеЫЗ[У1ЕАБАК|Е11АМУУЕУРКЕЬЬ00У 172

-- IVWGNKTDREK-ERR- -УЗтеРУЬЗТУЕМЕНтЗТП/ЕАЗАКООТНУУЕУГКЕЬЬООА 172

--1УУУС1ЖТОННС-ЕНТ--УЗЗЕОУЬЗТУЕизНШЗГЬЕТЗАКЕ1ЛШУЬЕУГКЕЬЬ00А 172

- - ХУУУСШгаЖЫ -Еиг--УЗАРРУЬАКУЕХРЯЖСГМЕАЗАКЕ[)ЕМтаЕУЕКЕЫ00А 172 --цлшзтоижоз-^о- -ЬЗЗЕБУЪЗТУЕЬЕШНЗРМЕЗЗАК01Ш1УУЕЗРНЕЬЬЗОА 172 --1УУ1СНК10КОЗ-ЕЯО--ЕЕЗКВУЬЗТУЕЬЕ'ЛгаЗЕМЕ$ЗАКР111НУУЕЗЕКЕЬЬЗОА 172 --1УУ1СИКЮНдС-ВН0--УРЗга)УЬЗТУЕЬР'ЛШЗРЫ:ЗЗАКРИЮТЬЕАЕКЕЬЬЬ0А 172 --IWIGNKIDRHN-ERL--VSSRDVLAMVELDWDHIEVESSAKD1Ш1VLEAFMELL^QT 172

- -1VWGNKAEVGG-LRQ- -УЪРЕРАЬЗЬУЕЬР'лИЗНЕЬЕАЗАКЕ^ЕИУУЕУЕНЕЬЬООА 172

- - 1УУУСМКАЕЗСС-ЕЯ0- -УРАЕБА1,31|УЕ1ЛЭШЗНГУЕТЗАКИ1Е11УЬЕУЕНЕ1,ЬС0А 172

- - 1УУУашаш1/зо-Р1 к--узнееаьзтуеьето;гнн1ХЕтзак011Ъ11Утеуетеуенеу 173

--1УУУАИККЛ1/дС-1чМК- -УРНЕЕАЬЗТУЕЬЕНЫНЯЫ^ЕТЗАКЕПЪНУТЕУЕТЕУЬКЕУ 173

- - 1ТУ1ЕША0ЬСЗ-НЗК--дАТАЕАМРАУЕЕОКСАСГУЕТБАКТСРНУТАУГКРЬЬООМ 172 --МУУУСЗКАРЬЗЕ-ЕЕСКУЬРААВУМАТУЕООНРАЕЕУЕАЗАКТССМАУОУЕКАЬЬОНУ 175 --1УУУС№МОЗЕРСУЕАС0МУВЕЕАААТАЕЬЕШЗССУУЕТЗАКУРУКУ110УЕ0ЕЫККУ 173

- -1УУУОНОМОЬРРаЬЕАСООУРЬНАААТАЕЬЕИВССТУЕТЗАКУОУКТООУЕН0Ъ1ККУ 175 РР1УУУ&ЗКЗБЬАР---5СЗЕРН-АУ1ААУЕЬЕКСС1УЬЕАЗАКЯСЕ11УЬЗЬГ0ЕЬЬ0ЬУ 174

ТгЕаа GaRas Опдаав DrRas TrRas ТпНав НЬИав 01Нав АсНав СдНаэ Х1нав XtRas DrRaв ТгНав ХШав ХЬНав Гй^ав

•йуаЗ ^уа •йуаз ауа2 dva ^уа ^уа •йуа ■ёуа

-дуа2 с1уа2 ^уа ■с!уа1 ■с!уа сайт прекщшрования

НЬРЗНЬЗРАЬНННКЕТРРЮт^Р.-- - РМИКТИЭ^УЕЗ!.208

ИЬРЗКЬЗРА1^ии1НЕТРРКПЫШ1Р---------РМПК11НЗС1ЕЗ--------208

1Л.РЗЮ^ЗРА1Лиш*ЕТРР01ХЗНЮ1Р. .РМИКВНЗСЫЗЬСЕСАСаУ 216

NLPSRLSPALRRRRETFPKDLSLRP.-РМНКТНЗСЗУЗ---.208

ИЪРЗИ.ЗРА1ЛЗи«Ш- -ТУЕСЗООР.РЬНКЫНБСЗУЗ--------206

1ТЬРЗИ1ЛРАЬСКЯКЕ- -РАЕЗБННР---------БЬИКТИБСЗУЗ--------206

ИЬРЗИЬиРАЬСННКЕТРРКЕЗМЮП1.- -РМЫКТЫЗСПЗ-- -.208

Ш,Р301ЛРАЬСКККЕТЬРЕКСЗКНР---------РММКТИЗСЫЗ--------208

1ILPSRLSPALRRRRETLPKEPPLRP---------РМИКАИБСТУС--------208

НЬРИгЬЗРАХ^НРЕТРРЗЕНМЛР---------РМНКТИгСЗУС--------208

NLPSRLSPALRRRRETIPNGVKYKP---------РМ1ЖТНБС31С

NLPSRLSPALRRRRETIPKGGSFKP---------РМИКТИБСЗК!

KLPSRVSPALRRRTQTMSRELTEKRE------КРРМККННЗСХЬЗ

KSTERLSPAVWRRRGRQCTTSVTKR--------РРЬККИЗЗСХЕЗ

N3 PAWLSPALERRR---АЭАОРЕ------ЗИНКАОИЕКРОЗСТЕЗ

НЭ РАНЬЗРАЬЕНЕК- --АБАОРЕ------А1т300ЯНКР03СТ1,3

НЬРЗКЬЗРАЗЖККЕОТГРбСРРОЕАУбТУБТККАСТШаШЗСАУЗ

209 20Э 211 212 209 211 219

2.1.2 Филогенетическое дерево суперсемейства малых ГТФаз с новыми белками, Ras-dva.

С целью проверки нашего предположения об обособленности группы ГТФаз Ras-dva и определения их систематического положения в суперсемействе малых ГТФаз было построено филогенетическое древо этого суперсемейства.

Известно, что малые ГТФазы имеющие степень гомологии между собой более 50% относят к одному семейству, но при степени их гомологии менее 40% -к разным семействам [Macaluso et al., 2002]. Кроме того, для отнесения малой ГТФазы к тому или иному семейству достаточно информации заложенной* в аминокислотной последовательности ее каталитического G-домена- [Jiang, Ramachandran, 2006]. Исходя из этого, для построения филогенетического древа в базе данных National Center for Biotechnology Information (NGBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov) были найдены аминокислотные последовательноти G-доменов малых ГТФаз представителей 8-ми уже описанных семейств (Ras, Rho, Rab, Ran, Arf, RJL, RGK и Gie). Далее при помощи программы Clustal W1.83 было проведено множественное выравнивание последовательностей G-доменов. малых I

ГТФаз уже известных семейств и найденных нами белков Ras-dva. На основании, данных этого множественного выравнивания в программе Mega 2.0 (http://megasofitware.net) по алгоритму «ближайшего соседа» (neighbour-joining algorithm with p-distance model) было построено неукорененное филогенетическое древо суперсемейства малых ГТФаз, которое показало, что белки Ras-dva формируют отдельный кластер того же ранга, что и ранее известные семейства. (Рис.10). При этом степень гомологии между белками, входящими bi Ras-dva кластер и белками других кластеров составляет 10-40%. Степень же гомологии внутри Ras-dva кластера - более 52%. Таким образом, можно сделать вывод, что белки Ras-dva составляют отдельное, девятое семейство малых ГТФаз. Заметим, что белки нового семейства Ras-dva наиболее гомологичны белкам семейства Ras, которые в свою очередь являются важными элементами сигнальных каскадов в клетке (подробнее см. литобзор).

Рис.10 Филогенетическое дерево суперсемейства малых ГТФаз, построенное при помощи программы MEGA 2.1, используя метод «ближайшего соседа» и модель попарных расстояний (neighbor-joining algorithm и p-distance model). Масштабный отрезок в левом нижнем углу соответствует значению параметра р равным 0.1 (p=nd/L, где nd -количество аминокислот различающихся у 2-х сравниваемых последовательностей и L — общее количество сравниваемых аминокислот). Hs - Homo sapiens (человек), Mm — Mus musculus (мышь), Md — Monoderphis domestica (опоссум), Gg - Gallus gallus (курица), Ас - Anolis carolinensis (ящерица), XI - X. laevis (лягушка), Tr — Takifugu rubripes (рыба), Eh - Entamoeba

При сравнении представленнности каждого семейства малых ГТФаз в разных царствах/классах живых существ (бактерий, грибов, растений, позвоночных и беспозвоночных животных), мы обнаружили, что семейство Яаз^уа- -единственное, присутствующее только в 1 классе - у позвоночных организмов. Все другие семейства были представлены в 2-х и более классах/царствах живых организмов.

2.1.3 Сравнительный анализ консенсусных аминокислотных последовательностей G-домена белков Ras-dva и других малых ГТФаз.

Как известно, все ГТФазы, имеют каталитический G-домен, который включает в себя пять консенсусных аминокислотных последовательностей Gl- G5 , отвечающих за взаимодействие белка с ГТФ и ГДФ, а также за его ГТФазную активность. Последние три свойства чрезвычайно важны для осуществления цикла активации/инактивации ГТФазы, который регулируется специфическими белками-помощниками GEP (guanine nucleotide exchange protein) и GAP (GTPase activating protein) соответственно (подробнее см. литобзор).

Ras

Суперсемейство малых ГТФаз

Rho/Rac/Cdc42

Ras-dva

RJL

Rab

Arf/Sar

Gie histolytica (амеба)

В составе консенсусных последовательностей G1-G5 выделяют как высококонсервативные аминокислотные остатки (а.о.), присутствующие у малых ГТФаз всех известных семейств, так и а.о., консервативные только внутри отдельных семейств малых ГТФаз. Для того чтобы выяснить, есть ли у малых ГТФаз Ras-dva какие-либо особенности в строении консенсусных участков G1-G5 по сравнению с таковыми малых ГТФаз уже описанных семейств, мы провели сравнительный анализ последовательностей Gl- G5, характерных для белков Ras-dva и малых ГТФаз семейств Ras, Rab, Ran, Rho, RJL, RGK, Arf и Gie (Табл.4).

В результате, было выяснено, что у малых ГТФаз Ras-dva в консенсусных последовательностях G1-G5 присутствуют все высоко-консервативные а.о., но кроме того, имеется несколько особенностей в строении наиболее важных для ГДФ/ГТФ обмена и гидролиза последнего консенсусов, G2 (он же switch 1) и G3 (он же switch2). В частности, было показано, что в консенсусе G2 малые ГТФазы Ras-dva, в отличие от всех остальных малых ГТФаз, перед высоко-консервативным остатком треонина имеют 1-2 положительно заряженных аминокислотных остатка аргинина (выделены синим в Таблице 4) или лизина.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Терёшина, Мария Борисовна, Москва

1. Зарайский, А.Г. (2007) Нейрапьная индукция: новые достижения и перспективы. Молекулярная биология 41:2, 200-215

2. Зарайский А.Г. (2004) Изучение молекулярно-генетических механизмов развития мозга на модели эмбрионов шпорцевоя лягушки. Молекулярная биология 38:1,40-47 Степанов В.М. (1996) Молекулярная биология. Структура и функции белков. 335 (Высшая Школа, М)

3. Aberger, F., Weidinger, G., Grunz, H. and Richter, К. (1998). Anterior specification of embryonic ectoderm: the role of the Xenopus cement gland-specific gene XAG-2. Mech Dev 72, 115-30.

4. Adachi, M., Fukuda, M. and Nishida, E. (1999). Two co-existing mechanisms for nuclear import of MAP kinase: passive diffusion of a monomer and active transport of a dimer. Embo J 18, 5347-58.

5. Ahrens, K. and Schlosser, G. (2005). Tissues and signals involved in the induction of placodal Sixl expression in Xenopus laevis. Dev Biol 288, 40-59.

6. Alto, N. M., Shao, F., Lazar, C. S., Brost, R. L., Chua, G., Mattoo, S., McMahon, S. A., Ghosh, P., Hughes, T. R., Boone, C. et al. (2006). Identification of a bacterial type Ш effector family with G protein mimicry functions. Cell 124,133-45.

7. Baker, С. V. and Bronner-Fraser, M. (2001). Vertebrate cranial placodes I. Embryonic induction. Dev Biol 232,1-61.

8. Boyl, P. Pi, Signore, M., Annino, A., Barbera, J. P., Acampora, D. and Simeone, A\ (2001). Otx genes in the development and evolution of the vertebrate brain. Int J Dev Neurosci 19, 35363

9. Chalmers, A. D., Slack, J. M. and Beck, C. W. (2000). Regional gene expression in the epithelia of the Xenopus tadpole gut. Mech Dev 96,125-8.

10. Deardorff, M. A., Tan, C., Saint-Jeannet, J. P. and Klein, P. S. (2001). A role for frizzled 3 in neural crest development. Development 128, 3655-63.

11. Dickinson, A. and Sive, H. (2007). Positioning the extreme anterior in Xenopus: Cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Semin Cell Dev Biol 19, 19.

12. Eagleson, G. W. and Harris, W. A. (1990). Mapping of the presumptive brain regions in the neural plate of Xenopus laevis. JNeurobiol 21, 427-40.

13. Efimov, V. A., Buriakova, A. A., Chub, M. B. and Chakhmakhcheva, O. G. (1998). Peptide nucleic acids and their phosphonate analogues: synthesis and hybridization characteristics. BioorgKhim 24, 696-709.

14. Efimov, V. A., Klykov, V. N. and Chakhmakhcheva, O. G. (2003). Phosphono peptide nucleic acids with a constrained hydroxyproline-based backbone. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 22, 593-9.

15. Ermakova, G. V., Solovieva, E. A., Martynova, N. Y. and Zaraisky, A. G. (2007). The homeodomain factor Xanf represses expression of genes in the presumptive rostral forebrain that specify more caudal brain regions. Dev Biol 307, 483-97.

16. Jiang, S. Y. and Ramachandran, S. (2006). Comparative and evolutionary analysis of genes encoding small GTPases and their activating proteins in eukaryotic genomes. Physiol Genomics 24,235-51.

17. Jordens, I., Marsman, M., Kuijl, C. and Neeljes, J. (2005). Rab proteins, connecting transport and vesicle fusion. Traffic 6, 1070-7.

18. Kauffmann-Zeh, A., Rodriguez-Viciana, P., Ulrich, E., Gilbert, C., Coffer, P., Downward, J. and Evan, G. (1997). Suppression of c-Myc-induced apoptosis by Ras signalling through PI(3)K and PKB. Nature 385, 544-8.

19. Kiecker, C. and Lumsden, A. (2005). Compartments and their boundaries in vertebrate brain development. Nat RevNeurosci 6, 553-64.

20. McGinnis, W. and Krumlauf, R. (1992). Homeobox genes and axial patterning. Cell 68,283302.

21. Morgan, R. and Sargent, M. G. (1997). The role in neural patterning of translation initiation factor eIF4AII; induction of neural fold genes. Development 124,2751-60.

22. Novoselov, V. V., Alexandrova, E. M., Ermakova, G. V. and Zaraisky, A. G. (2003). Expression zones of three novel genes abut the developing anterior neural plate of Xenopus embryo. Gene Expr Patterns 3, 225-30.

23. Okai, T., Araki, Y., Tada, M., Tateno, T., Kontani, K. and Katada, T. (2004). Novel small GTPase subfamily capable of associating with tubulin is required for chromosome segregation. J Cell Sci 117,4705-15.

24. Paduch, M., Jelen, F. and Otlewski, J. (2001). Structure of small G proteins and their regulators. Acta Biochim Pol 48, 829-50.

25. Pan, J. Y., Fieles, W. E., White, A. M., Egerton, M. M. and Silberstein, D. S. (2000). Ges, A human GTPase of the Rad/Gem/Kir family, promotes endothelial cell sprouting and cytoskeleton reorganization. J Cell Biol 149,1107-16.

26. Reynet, C. and Kahn, C. R. (1993). Rad: a member of the Ras family overexpressed in muscle of type II diabetic humans. Science 262,1441-4.

27. Ribisi, S., Jr., Mariani, F. V., Aamar, E., Lamb, T. M., Frank, D. and Harland, R. M.2000). Ras-mediated FGF signaling is required for the formation of posterior but not anterior neural tissue in Xenopus laevis. Dev Biol 227, 183-96.

28. Rocks, O., Peyker, A. and Bastiaens, P. I. (2006). Spatio-temporal segregation of Ras signals:one ship, three anchors, many harbors. Curr Opin Cell Biol 18, 351-7.

29. Rommel,* C. and Hafen, E. (1998). Ras-a versatile cellular switch. Curr Opin Genet Dev 8,412.8.

30. Sasaki, T. and Takai, Y. (1998). The Rho small G protein family-Rho GDI system as a temporal and spatial determinant for cytoskeletal control. Biochem Biophys Res Commun 245, 641-5.

31. Sebti, S. M: (2003). Blocked pathways: FTIs shut down oncogene signals. Oncologist 8 Suppl 3, 30-8.

32. Seewald; M. J., Korner, C., Wittinghofer, A. and Vetter, I. R. (2002). RanGAP mediates

33. GTP hydrolysis without an arginine finger. Nature 415, 662-6.

34. Sepp, K. J. and Auld, V. J. (2003). RhoA and Racl GTPases mediate the dynamicrearrangement of actin in peripheral glia. Development 130, 1825-35.

35. Shimamura, K. and Rubenstein, J. L. (1997). Inductive interactions direct earlyregionalization of the mouse forebrain. Development 124, 2709-18.

36. Sive, H.j Grainger, R. and Harland, R. (2000). Early Development of Xenopus laevis., 338 (Cold Spring Harbor Laboratory Press).

37. Sokol, S. Y. (1999). Wnt signaling and dorso-ventral axis specification in vertebrates. Curr Opin Genet Dev 9; 405-10.

38. Spemann, H. and Mangold, H. (2001). Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species. 1923. Int J Dev Biol 45j 13-38.

39. Spokony, R. F., Aoki, Y., Saint-Germain, N., Magner-Fink, E. and Saint-Jeannet, J. P. (2002). The transcription factor Sox9 is required for cranial neural crest development in Xenopus. Development 129,421-32.

40. Stenmark, H. and Olkkonen, V. M. (2001). The Rab GTPase family. Genome Biol 2, REVIEWS3007.

41. Takai, Y., Sasaki, T. and Matozaki, T. (2001). Small GTP-binding proteins. Physiol Rev 81, 153-208.

42. Tríbulo, C., Aybar, M. J., Nguyen, V. H., Mullins, M. C. and Mayor, R. (2003). Regulation of Msx genes by a Bmp gradient is essential for neural crest specification. Development 130, 6441-52.

43. Tsai, 1. C., Amack, J. D., Gao, Z. H., Band, V., Yost, H. J. and Virshup, D. Mi (2007). A Wnt-CKIvarepsilon-Rapl pathway regulates gastrulation by modulating SIPA1L1, a Rap GTPase activating protein: Dev Cell 12,335-47.

44. Van Aelst, L. and Symons, M. (2002). Role of Rho family GTPases in epithelial morphogenesis. Genes Dev 16,1032-54.

45. Van Aelst, L. and D'Souza-Schorey, C. (1997). Rho GTPases and signaling networks. Genes Dev 11,2295-322.

46. Vernoud, V., Horton, A. C., Yang, Z. and Nielsen, E. (2003). Analysis of the small GTPase gene superfamily of Arabidopsis. Plant Physiol 131, 1191-208.

47. Wang, D. A. and Sebti, S. M. (2005). Palmitoylated cysteine 192 is required for RhoB tumor-suppressive and apoptotic activities. J Biol Chem 280, 19243-9.

48. Ward, Y., Yap, S. F., Ravichandran, V., Matsumura, F., Ito, M., Spinelli, B. and Kelly, K.2002). The GTP binding proteins Gem and Rad are negative regulators of the Rho-Rho kinase pathway. J Cell Biol 157,291-302.

49. Wettschureck, N. and Offermanns, S. (2005). Mammalian G proteins and their cell type specific functions. Physiol Rev 85; 1159-204.

50. Whitman, M. and Melton, D. A. (1992). Involvement of p21ras in Xenopus mesoderm induction. Nature 357,252-4.

51. Wunnenberg-Stapleton, K., Blitz, I. L., Hashimoto, C. and Cho, K. W. (1999). Involvement of the small GTPases XRhoA and XRndl in cell adhesion and head formation in early Xenopus development. Development 126, 5339-51.

52. Yamada, M., Tachibana, T., Imamoto, N. and Yoneda, Y. (1998). Nuclear transport factor plO/NTF2 functions as a Ran-GDP dissociation inhibitor (Ran-GDI). Curr Biol 8,1339-42".

53. Yamamoto, T. S., Takagi, C., Hyodo, A. C. and Ueno, N. (2001). Suppression of head formation by Xmsx-1 through the inhibition of intracellular nodal signaling. Development 128, 2769-79.

54. Ye, W., Shimamura, K., Rubenstein, J. L., Hynes, M. A. and Rosenthal, A. (1998). FGF and Shh signals control dopaminergic and serotonergic cell fate in the anterior neural plate. Cell 93, 755-66.

55. Zaraisky, A. G., Ecochard, V., Kazanskaya, O. V., Lukyanov, S. A., Fesenko, I. V. and Duprat, A. M. (1995). The homeobox-containing gene XANF-1 may control development of the Spemann organizer. Development 121, 3839-47.

56. Zaraisky, A. G., Lukyanov, S. A., Vasiliev, O. L., Smirnov, Y. V., Belyavsky, A. V. and Kazanskaya, O. V. (1992). A novel homeobox gene expressed in the anterior neural plate of the Xenopus embryo. Dev Biol 152, 373-82.