Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Формирование структуры и планарной полярности эмбрионального ресничного эпителия шпорцевой лягушки

ВАК РФ 03.03.05, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Формирование структуры и планарной полярности эмбрионального ресничного эпителия шпорцевой лягушки"

На правах рукописи

Евстифеева Алёна Юрьевна

ФОРМИРОВАНИЕ СТРУКТУРЫ И ПЛАНАРНОИ ПОЛЯРНОСТИ ЭМБРИОНАЛЬНОГО РЕСНИЧНОГО ЭПИТЕЛИЯ ШПОРЦЕВОЙ

ЛЯГУШКИ

03.03.05 - биология развития, эмбриология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 7 МАР 2014

Москва-2014

005546399

005546399

Работа выполнена на кафедре эмбриологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Белоусов Лев Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Буданцев Аркадий Юстианович заведующий лабораторией функциональной гистохимии Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

доктор биологических наук, профессор Исаева Валерия Васильевна ведущий научный сотрудник Института проблем экологии и эволюции РАН им. А.Н. Северцова

Ведущая организация: Институт биологии развития

им. Н.К. Кольцова РАН

Защита состоится 20 мая 2014 года в 15:30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, биологический факультет МГУ, ауд. М-1.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и на сайте http://www.bio.ш5и.ги/с11з5еПа11оп5/у1еш.рЬр?Ю=614.

Автореферат разослан « » марта 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.Н. Калистратова

Список сокращений

АР - переднезадний

ЗК - задняя часть крыши бластоцеля

ЗКс - сэндвич из задней части крыши бластоцеля

ЗКстян - растянутый ЗКс

ЗКт - трансплантат из задней части крыши бластоцеля

КБс - сэндвич из крыши бластоцеля

ЛЭс - сэндвич из латеральной эктодермы

МН - механическое напряжение

ПК - передняя часть крыши бластоцеля

ПКс - сэндвич из передней части крыши бластоцеля

ПКстян- растянутый ПКс

ПК+ЗК - сэндвич из сложенных вместе передних и задних частей крыши бластоцеля ПКт - трансплантат из передней части крыши бластоцеля ПП - планарная полярность РК - ресничные клетки РЭ - ресничный эпителий

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Ресничный эпителий выстилает полости многих систем органов позвоночных, например, дыхательной, репродуктивной, мочевыделительной. Он создаёт направленный поток жидкости в полостях. В дыхательной системе он способствует выведению частиц пыли и болезнетворных микроорганизмов наружу, а в репродуктивной системе способствует продвижению яйцеклетки по яйцеводам в матку. Нарушения в формировании ресничек и их направленного биения лежат в основе многих заболеваний (Е1еу е! а!., 2005).

Направленное биение ресничек отражает широко распространённое в природе явление планарной полярности (ПП). Оно является фундаментальным для морфогенеза многочисленных структур от крошечных волосков до целых организмов. Молекулярные механизмы планарной полярности, действующие на локальном (межклеточном) уровне изучены к настоящему моменту достаточно подробно. Однако до сих пор остаются

нераскрытыми механизмы ориентации осей планарной полярности клеток вдоль целого органа или организма («глобальный» уровень) (Wang, Nathans, 2007; Goodrich and Strutt, 2011).

Ресничные клетки имеют регулярное расположение в эпителии. Данное явление отражает тот факт, что биологические ткани имеют модульное строение (Савостьянов Г.А., 2005) и обладают определённой топологией (Isaeva et al., 2012). Нарушение структуры1 ткани может лежать в основе патологических процессов. Следовательно, изучение механизмов формирования структуры ткани является актуальным для медицины, особенно, учитывая то, что основное внимание в исследованиях уделяется молекулярным механизмам тканевой патологии, а структурный фактор остается без внимания.

Ряд сравнительно недавно полученных данных свидетельствует о том, что в установлении ПП и структуры ткани могут участвовать механические напряжения (МН) в клеточном пласту. Полученные на зачатке крыла дрозофилы результаты (Aigouy et al., 2010) позволяют предположить, что МН могут являться глобальным поляризующим фактором. Кроме того, в теоретических работах по моделированию плотных клеточных упаковок (эпителиев) было показано, что в зависимости от механических параметров клеточного пласта (сил клеточной адгезии и сократимости поверхности клеток) могут существовать клеточные мозаики с различными топологиями (Farhadifar et al., 2007; Staple et al., 2010). Однако экспериментальные данные о влиянии механического напряжения на структуру клеточной мозаики в биологических тканях практически отсутствуют.

Данная работа предпринята, чтобы прояснить на примере ресничного эпителия шпорцевой лягушки (Xenopus laevis) механизмы формирования тканевой структуры и ориентации оси ПП клеток вдоль целого органа, и сконцентрирована на роли механических напряжений в тканях. Ресничный эпителий X. laevis в качестве модельной системы выбран неслучайно: его структура и планарная полярность подробно изучены и легки для идентификации. Поскольку механизмы ПП высоко консервативны среди животных, результаты, полученные на X. laevis, будут актуальны для исследования ПП у других организмов, в т.ч. и у млекопитающих.

1 Под структурой ткани мы будем понимать особенности взаимного расположения относительно друг друга разных типов клеток в ткани и их численные соотношения.

Цели и задачи

Цель данной работы - экспериментальное изучение факторов, определяющих структуру и планарную полярность (ПП) ресничного эпителия у зародышей шпорцевой лягушки.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующее задачи:

1) Разработать метод оценки структуры и ПП ресничного эпителия (РЭ) X. laevis и описать с использованием данного метода его структуру и ПП у интактных зародышей.

2) Исследовать влияние релаксации механических натяжений у зародышей на стадии ранней нейрулы на структуру и ПП их РЭ.

3) Оценить, как эксплантация передней и задней части крыши бластоцеля на стадии ранней гаструлы и латеральной эктодермы на стадии ранней нейрулы влияет на структуру и ПП РЭ.

4) Изучить влияние механического растяжения эксплантированных на ранней гаструле участков крыши бластоцеля на структуру и ПП их РЭ.

5) Поставить опыты по поворотам на 180° на стадии ранней гаструлы передних и задних областей крыши бластоцеля и оценить ПП повернутых трансплантатов относительно ПП зародышей-реципиентов.

Научная новизна работы

Разработана компьютерная программа для анализа структуры ресничного эпителия, которая на изображениях образцов, полученных с помощью сканирующей электронной микроскопии, подсчитывает число ресничных клеток (РК), находит ряды из РК и вычисляет их ориентацию относительно заданной оси. С помощью данной программы обнаружено, что у интактного зародыша 28 стадии развития (стадия хвостовой почки) РК располагаются отдельными рядами, причём ряды располагаются преимущественно под прямым углом к длинной оси зародыша. Обнаружено, что эксплантация нарушает данный паттерн расположения РК, а механическая релаксация на стадии ранней нейрулы и растяжение на стадии ранней гаструлы практически не влияют на структуру эпителия.

На двойных эксплантатах (сэндвичах) крыши бластоцеля ранней гаструлы шпорцевой лягушки показано, что механическое растяжение приводит к повышению порядка ПП РЭ, причём ось ПП ориентируется поперёк оси растяжения. Также обнаружена региональная специфичность реакции тканей зародыша на растяжение. Кроме того, показано, что релаксация механических натяжений целого зародыша на стадии ранней нейрулы может приводить к изменению паттерна ПП.

Таким образом, нами впервые на примере эмбрионального ресничного эпителия X. laevis удалось показать, что механические напряжения могут быть глобальным ориентирующим фактором ПП у позвоночных.

Научно-практическая значимость работы

Изучение механизмов формирования структуры и планарной полярности ресничного эпителия имеет не только большой теоретический интерес, но и прикладное значение. Поскольку механизмы формирования клеточных мозаик и ПП консервативны среди животных, результаты, полученные на X. laevis могут быть использованы в медицине. Нарушения формирования ресничек и их полярности лежат в основе многих заболеваний человека: в частности, это касается заболеваний дыхательной и репродуктивной систем (Eley et al., 2005). Показано, что в основе патологических процессов в эпителиях могут лежать перестройки в их структуре (Савостьянов, 2005). Знание механизмов формирования структуры ткани важно и для тканевой инженерии.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были доложены на конференции «Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии: симметрия и асимметрия» (Москва, 2012), международной конференции «Biological motility: Fundamental and applied science» (Пущино, 2012), конференции «Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии» (Москва, 2011), международной конференции «Biological Motility: from fundamental achievements to nanotechnologies» (Пущино, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Цели и задачи», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список сокращений», «Список литературы», содержит шесть приложений. Работа изложена на 97 страницах, включает 26 рисунков. В списке литературы 152 публикации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили на зародышах шпорцевой лягушки (Xenopus laevis, Daudiri), полученных методом гормональной стимуляции самок. Использовали стандартный метод синхронного оплодотворения in vitro, стандартные растворы для инкубации холоднокровных (10%, 100% MMR, рН 7,4). Стадии развития зародышей определяли по таблицам развития (Nieuwkoop and Faber, 1967).

Микрохирургические операции проводили на стадиях 10-10,5 (ранняя гаструла) и 1314 (ранняя нейрула). После операций MMR постепенно разбавляли до 0.5XMMR и оставляли в нем образцы при комнатной температуре 21-27°С примерно на сутки до достижения стадии, аналогичной 28 стадии у интактных зародышей (стадия хвостовой почки).

Изготовление сэндвичей. Изготавливали несколько типов двойных эксплантатов (сэндвичей) (рис. 1), попарно совмещая своими внутренними сторонами одинаковые фрагменты эктодермы от двух зародышей:

• Крыши бластоцеля ранней гаструлы, КБ-сэндвичи (КБс);

• передние половинки крыш бластоцеля ранней гаструлы, ПК-сэндвичи (ПКс);

• задние половинки крыш бластоцеля ранней гаструлы, ЗК-сэндвичи (ЗКс);

• передние и задние половины крыши бластоцеля ранней гаструлы (ПК+ЗК);

• латеральную эктодерму с подстилающей мезодермой ранней нейрулы, ЛЭ-сэндвичи (ЛЭс).

Чтобы сэндвичи не сворачивались в шарик, их прикапывали четырьмя тонкими стеклянными иглами (40-50 мк в диаметре) ко дну чашки Петри, покрытому 2% агаром.

Растяжение сэндвичей. После изготовления растяжению подвергали ПК-сэндвичи и ЗК-сэндвичи, переставляя иглы на большее расстояние друг от друга, либо вдоль презумптивной передне-задней оси (AP-ось), либо поперёк неё. Первое растяжение проводили через 5 мин после изготовления сэндвича, а два последующих - с интервалом в 20 мин. Общее растяжение составляло примерно 200% от первоначальной длины сэндвича.

Релаксация механических натяжений. Релаксацию проводили, вставляя на 13-14 стадии в нервную пластинку зародыша клин из вентрального материала другого зародыша той же стадии (рис. 1г). Данным способом мы не только сбрасывали механическое натяжение в латеральных регионах эмбриона, но даже слегка сжимали ткани зародыша.

Повороты трансплантатов. Для того чтобы отличить трансплантат от зародыша-реципиента, зародышей-доноров окрашивали флуоресцеин-декстраном (в каждую зиготу инъецировали микроинъектором примерно по 10 нл флуоресцеин-декстрана).

Проводили несколько типов операций на ранней гаструле (рис. 2): пересаживали участки вентральной или дорсальной части крыши бластоцеля в аналогичное положение зародыша-реципиента той же стадии, вырезав у него предварительно соответствующую область. Все пересадки проводили с поворотом трансплантата на 180° относительно переднезадней оси зародыша. В контрольных опытах пересадки осуществляли без поворота. После инкубации для оперированных и контрольных образцов составляли карты потоков окружающей жидкости, создаваемых PK.

(а)

Крыша бластоцеля

Ранняя гаструла

(б)

Крыша бластоцеля

< ^

Инкубация 24 ч

ЗКс

Дорсальная губа бластопора

(В)

Ранняя нейрула

(Г)

Релаксированный зародыш, 28-я стадия

ЛЭс

Интактный зародыш, 28-я стадия |

зк

■ ПК

'—I

лэ

Рисунок 1. Схема экспериментов и топография эксплантированных участков на поверхности зародышей 28-й стадии, а-б: изготовление КБс, ПКс и ЗКс; в - изготовление ЛЭс; г - получение релаксированных зародышей; д - расположение различных эксплантированных областей в интактном зародыше 28-й стадии. ЗК, ПК, ЛЭ - области, образовавшиеся соответственно из задней и передней частей крыши бластоцеля ранней гаструлы и из латеральной эктодермы с подстилающей мезодермой ранней нейрулы.

10,5 стадия

Составление карт потоков окружающей жидкости, создаваемых РК, и их анализ.

После инкубации составляли карты потоков окружающей жидкости, по которым оценивали направление планарной полярности (ПП) образцов. Для визуализации потоков в инкубационный раствор помещали взвесь древесного угля. На фотографиях образцов в программе Paint.Net зарисовывали траектории движения частичек угля.

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). После составления карт потоков окружающей жидкости образцы подготавливали для СЭМ по стандартной методике (Евстифеева, 2013).

Обработка изображений, полученных с помощью СЭМ. Для характеристики структуры эпителия на изображениях измеряли следующие показатели:

• плотность РК - отношение общего числа РК в образце к его площади;

• ориентация рядов из РК относительно переднезадней оси образца (рис. 4).

Площади образцов измеряли в программе ImageJ. Поиск рядов из РК, оценку их ориентации относительно переднезадней оси образца и подсчет общего числа РК в образце проводили с помощью оригинальной программы Ыпев_Ртс1ег.

Рисунок 4. Определение угловой ориентации рядов. Справа: / - ряды из РК, найденные с помощью оригинальной программы, 2 - РК. А - угол ряда из РК. под которым он располагается к продольной оси зародыша.

Статистический анализ. Статистическую обработку данных проводили в программе 81а11з11са модуль Мопрагате1псз. Достоверность данных определяли по и-критерию Манна-Уитни и критерию Уилкоксона для связных выборок.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Структура ресничного эпителия Достоверных различий между плотностями РК в растянутых и нерастянутых эксплантатах обнаружено не было (рис. 5). Однако были обнаружены различия между разными типами нерастянутых сэндвичей по морфологическим признакам и по плотностям РК. Большинство ЗКс на дорсальной стороне к 28 стадии образовывали присоску, а ПКс не формировали присосок, но через несколько часов инкубации образовывали на своей поверхности многочисленные складки. Поверхность ЗКс и ЛЭс была более сглаженной, что свидетельствует о её большей натянутости. У ЗКс и ЛЭс плотность РК была достоверно больше плотности РК у ПКс, хоты эктодермы ПКс и ЛЭс имеют одинаковые проспективные значения (см. рис. 1д). Кроме того, у ЛЭс плотность РК была достоверно больше по сравнению с плотностью РК в интактном зародыше, КБс и ПКстян (рис. 5). х105 100

5

•2.

и .3. КБс ПКс. р.з. ПКс

ЗКс,.

тян ^'^тян

ЗКс ЛЭс

Рисунок 5. Плотность РК. По оси абсцисс — типы образцов, по оси ординат - плотность РК (число РК/мк2). И.з. - интактный зародыш; р.з. - релаксированный зародыш; ПКстян и ЗКстян — ПКс и ЗКс, растянутые поперёк переднезадней оси,

соответственно. -

ошибка для рис. 5,7.

стандартная

Нами обнаружено (с помощью применения авторской компьютерной программы), что у интактных зародышей на 28 стадии РК располагаются не однородно, а отдельными рядами (рис. 6а), причём ряды преимущественно направлены перпендикулярно к продольной оси эмбриона (рис. 7). Мы предполагаем, что данный паттерн мог образоваться в результате существенного удлинения зародыша на стадии хвостовой почки и, как следствие, расхождения ресничных клеток друг от друга по длинной оси эмбриона за счёт активного деления гладких клеток. Релаксация механического натяжения существенно не повлияла на данный паттерн расположения РК и их плотность (рис. 5,6в, 7).

На рис. 6 приведены примеры рядов РК, найденных оригинальной программой в эксплантатах (б, г-ж). Эксплантация привела к нарушению паттерна расположения РК, присущего интактному зародышу: ряды РК располагались беспорядочно (рис. 7). Возможно, это произошло из-за того, что эксплантация сама по себе приводит к релаксации МН, поскольку в интактном зародыше эксплантированные участки находились под натяжением.

?

Рисунок 6. Примеры рядов (/) из РК (2), найденных с помощью оригинальной программы Ыпех РтЛег.

а - 28-я стадия интактного зародыша; б - ЛЭс; в - 28-я стадия релаксированного зародыша; г - ПКс; д - ЗКс; е - ПКстя11; ж - ЗКстян. Расположение осей показано стрелками.

Наши результаты свидетельствуют о том, что на стадии ранней гаструлы и нейрулы

механические натяжения не влияют на структуру РЭ хотя, возможно, они могут оказывать

влияние на более поздних стадиях, когда предшественники РК перемещаются из

внутреннего слоя эктодермы во внешний.

Паттерны потоков окружающей жидкости, создаваемые ресничными клетками, в

интактных и релаксированных зародышах

У интактных зародышей 26-28 стадий развития имеется дорсолатеральный регион, в

котором потоки направлены спереди назад, как и у всего зародыша, но вентродорсально

(рис. 8, а-в). Потоки в головном регионе эмбрионов идут ближе к продольной оси, по

сравнению с потоками в остальной части зародышей, и огибают присоску.

11

Релаксация механического натяжения вставлением клина в нервную пластинку вызвала изменение данного паттерна потоков: дорсальный регион практически отсутствовал, а в латеральном регионе направление потоков стало ближе к дорсовентральной оси (8, г-е).

0-30 30-60 60-90

р.з.

0-30 30-60 60-90

ПКсТЯн

IIII

0-30 30-60 60-90 ЗКс тян

0-30 30-60 60-90

ЛЭс

0-30 30-60 60-90

■в

111

№ ша

0-30 30-60 60-90

0-30 30-60 60-90

0-30 30-6 0 60-90

Рисунок 7. Угловая ориентация рядов из РК относительно переднезадней оси образцов, и.з. и р.з. - интактный и релаксированный зародыши соответственно. По оси абсцисс — угловые градусы, по оси ординат — доля рядов из РК в данном угловом промежутке (в %).

шл - ".

Рисунок 8. Карты потоков окружающей жидкости, создаваемые РК, для интактных (а-в) и релаксированных зародышей (г-е). Передний конец располагется слева, дорсальная сторона - вверху.

Паттерны потоков окружающей жидкости у эксплантированных и растянутых участков эктодермы

Эксплантация целых крыш бластоцеля (КБс) и её передних частей (ПКс) приводила к нарушению глобального порядка ПП, присущего интактному зародышу (рис. 9а). Треть ПКс и КБс обладала хаотическим паттерном потоков (рис. 96). Однако у остальной части образцов сохранялся ближний порядок ПП: в пределах сэндвичей можно было выделить несколько зон с одинаковым направлением оси ПП. У ЗКс в целом сохранялся глобальный порядок ПП и потоки были направлены от присоски назад, либо радиально расходились от неё (рис. 9а).

(А)

(а) (б)

ПКс (сэндвичи из передней части крыши бластоцеля)

(3) (4) (0) (3)

ПКс, растянутые вдоль переднезадней оси

(2) (2) (3) (2)

ПКс, растянутые поперёк переднезадней оси

Ж ш ыш щш

© Щж

(2) (2) (0)

(3)

ЗКс (сэндвичи из задней части крыши бластоцеля)

(1)

(2)

(2)

(0)

ЗКс, растянутые вдоль переднезадней оси

(2) (3) (1) (3)

ЗКс, растянутые поперёк переднезадней оси

• ЬМ

Лы

ш

Шш

МВ

1

цр.

Рисунок 9. Карты потоков окружающей жидкости, создаваемых РК на 28-й стадии развития (а). Переднезадняя ось располагается горизонтально. Стрелки - направления потоков, овалы - области с одинаковым направлением потоков, в скобках указано число таких областей в сэндвиче: 1 - паттерн потоков полностью упорядочен вдоль одного направления в сэндвиче, 0 - потоки хаотичны и в пределах сэндвича нельзя выделить крупные области с одинаковыми направлениями потоков жидкости; б - доли сэндвичей (в процентах) по числу (в скобках) имеющихся в них областей с одинаковым паттерном потоков.

Известно, что передние части крыш содержат ингибиторы формирования присоски и, если сложить передние и задние части крыш, то присоска в задних частях крыш не образуется (Bradley et al., 1996). Мы решили повторить данные опыты и проверить, меняется ли при этом паттерн потоков в задней части крыши. Оказалось, что по сравнению с ЗКс в ПК+ЗК помимо исчезновения присоски в задних частях крыш происходила хаотизация потоков (данные не показаны).

Сохранившийся в сэндвичах ближний порядок ПП может определяться гидродинамическими факторами (Mitchel et al., 2007). В последних исследованиях показано, что в установлении локального порядка ПП участвуют микротрубочки, оплетающие базальные тельца, а в установлении глобального порядка ПП - актиновый цитоскелет, также оплетающий основания ресничек (Werner et al., 2011). Нельзя исключить также воздействие местных паттернов натяжений, установившихся в эксплантатах. Возможно также, что большие масштабы ближнего порядка в ЗКс связаны с наличием во многих из них присоски (которая может участвовать в организации полей натяжений). Нельзя исключить, что ПК содержат химические факторы, ингибирующие установление глобального порядка ПП в ЗК.

Механическое растяжение ПКс как вдоль, так и поперёк АР оси приводило к восстановлению глобального порядка ПП: число зон с одинаковым направлением ПП уменьшалось, что служило показателем повышения порядка ПП (рис.9). У ЗКс только поперечное растяжение приводило к повышению порядка ПП, тогда как продольное растяжение приводило даже к некоторой хаотизации порядка ПП. Таким образом, мы показали, что реакции на растяжение различных участков крыш бластоцеля регионально специфичны.

Мы оценили направление, вдоль которого происходило упорядочивание ПП в сэндвичах (данные не показаны). Оказалось, что ось ПП ориентировалась преимущественно перпендикулярно оси растяжения. Интересно, что механическое натяжение в зачатке крыла дрозофилы, напротив, ориентирует полярность клеток вдоль оси растяжения (Aigouy et al., 2010).

Результаты опытов по растяжению согласуются с результатами релаксации МН. Исчезновение дорсального домена ПП и приближение оси ПП в латеральном домене релаксированных зародышей к дорсо-вентральной оси можно объяснить тем, что при релаксации клином непосредственно ослабляется только дорсо-вентральное натяжение поверхности зародыша, тогда как переднезаднее не только сохраняется, но даже и усиливается, что видно по выпуклой форме вентральной поверхности и заворачиванию ее переднего и заднего концов (см. рис. 8г-е). Следовательно, в данном опыте, так же как и в экспериментах по искусственному растяжению эксплантатов ось планарной полярности приобретает тенденцию к ориентации перпендикулярно доминирующему натяжению.

Такое соответствие результатов опытов по растяжению и релаксации эмбриональных тканей подтверждает наше предположение о важной роли механических факторов в ориентации оси планарной полярности.

Трансплантация участков эктодермы

Из данных по трансплантациям известно, что полярность ресничного эпителия шпорцевой лягушки необратимо устанавливается между 10 и 16 стадиями развития (Mitchel et al., 2009). В связи с тем, что в наших опытах по растяжению передних и задних половин крыш бластоцеля мы обнаружили, что ПП ПКс значительно лучше поддаётся упорядочиванию путём механического растяжения, мы решили изучить степень детерминированности ПП данных участков крыши.

С этой целью мы провели на стадии ранней гаструлы (10-10,5 стадия) трансплантации ПКт и ЗКт с поворотом на 180° относительно оси зародыша-реципиента. В контрольных опытах трансплантации проводили без поворота.

Оказалось, что ПКт по сравнению с ЗКт лучше подстраивают свою полярность под полярность зародыша-реципиента (ср. ПКт и ЗКт на рис. 116).

Отметим, что на рис. 11а повёрнутый ПКт с классом полярности 3 приведён для примера и он не учитывался при расчётах. Трансплантат в данном случае не прирос полностью к тканям хозяина. То, что он сохранил свою исходную полярность (и плохо прирос к тканям хозяина), иллюстрирует тот факт, что в установлении локального порядка ПП важную роль играют межклеточные взаимодействия (в данном случае взаимодействия с клетками хозяина).

Наши опыты по региональным различиям в «подстройке» повернутых участков к ПП окружения в целом согласуются как с результатами опытов по растяжению, так и с масштабами ближнего порядка. Действительно, ПКт, которые лучше подстраиваются к ПП зародыша-реципиента, сильнее реагируют и на растяжение. Кроме того, меньшие (по

сравнению с ЗКс) масштабы их ближнего порядка указывают на меньшую устойчивость их собственной ПП.

(а) (б)

ПКт, повёрнутые на 180°

ПКт (контроль)

ЗКт, повёрнутые на 180°

ЗКт (контроль)

Рисунок 11. (а) Карты потоков окружающей жидкости у оперированных зародышей и трансплантатов (обведены пунктиром). Ориентация осей такая же, как на рис. 8. Для трансплантатов указан класс полярности (степень совпадения направления их ПП с ПП зародыша-реципиента), где «0» означает полное совпадение полярности трансплантата с полярностью реципиента, «1» - полярность трансплантата в целом совпадает с полярностью реципиента, но имеются отклонения, «2» — полярность трансплантата нарушена относительно полярности реципиента, «3» — полное сохранение трансплантатом своей исходной полярности (т.е. его полярность была на 180° повернута относительно полярности реципиента), (б) Процентное соотношение трансплантатов по классу полярности (в скобках).

Возможная роль натяжений на поверхности интактных зародышей в ориентации оси планарной полярности ресничного эпителия

Поскольку паттерн ПП, наблюдаемый в интактных зародышах, существенно

нарушается при эксплантации отдельных участков крыши бластоцеля, очевидно, что он

определяется в норме какими-то целостными факторами. Мы попытались сопоставить

двухдоменную структуру ПП, характерную для интактных зародышей, с имеющимися

16

класс О

сведениями о распределении на их поверхности механических натяжений (МН) (Beloussov et al., 1975).

Решающее значение для определения структуры МН на поверхности зародыша имеют морфогенетические клеточные движения гаструляции и нейруляции. Первые - это движение клеток к бластопору и их подворачивание внутрь зародыша через губу бластопора. Данные движения создают градиент натяжений, направленный к губе. Во время нейруляции возникают дорсо-вентральные натяжения в латеральных и особенно в дорсальных областях зародыша из-за сворачивания нервной пластинки в нервную трубку. Данные натяжения имеют градиент, направленный в сторону сворачивающейся нервной пластинки (рис. 12А, 2). В нашей лаборатории (Глаголева Н.С., неопубликованные данные) были обнаружены в дорсальном регионе клеточные потоки, направленные в передне-дорсальном направлении. Это свидетельствует о существовании дополнительного градиента натяжений в данном направлении (рис. 12Б, 3), который, видимо, перекрывает натяжения от бластопора, предположительно сохраняющиеся после завершения гаструляции (рис. 12А, 1).

Рисунок 12. Паттерн натяжений на стадии ранней нейрулы в латеральном (А) и дорсальном (Б) регионе зародыша. Тонкие стрелки - направление предполагаемых градиентов натяжений, создаваемых клеточными движениями гаструляции (1), сворачиванием нервной пластинкой (2), и клеточными движениями при нейруляции (3). Жирные стрелки - направление результирующего градиента натяжений. Пунктирная линия -перпендикуляр к результирующему градиенту натяжений.

На рис. 12 жирными стрелками обозначено результирующее направление натяжений. Ориентация оси ПП в латеральном и дорсальном регионах совпадает с ориентацией перпендикуляра к результирующему направлению натяжений (пунктирная линия). Таким образом, ортогональное к результирующим натяжениям направление осей планарной

полярности в обоих регионах зародыша полностью согласуется с результатами наших опытов по растяжению участков крыш бластоцеля. Интересно, что отсутствует плавный переход между направлениями осей ПП в рассматриваемых регионах интактного зародыша, т.е. между ними имеется четкая бифуркация направления ПП. Это может указывать на нелинейный характер зависимости между доминирующими натяжениями и ПП.

Более близкое к длинной оси зародыша направление ПП ресничных клеток в головной области может быть связано с тем, что в данной области доминируют натяжения, создающиеся сворачивающейся нервной пластинкой (рис. 12А, 2), а гаструляционные натяжения ослабевают (рис. 12А, 1).

Заметим, что в механически напряженных трубчатых телах доминируют кольцевые натяжения. Продольное направление биения ресничек в трубчатых органах соответствует предположению о механозависимости ПП и в этих случаях. Поэтому соответствующие исследования на зародышах амфибий могут рассматриваться в качестве модельных для решения медицинских и биотехнологических проблем.

выводы

1. Структура эмбрионального ресничного эпителия (РЭ) шпорцевой лягушки характеризуется наличием отдельных рядов ресничных клеток, ориентированных преимущественно перпендикулярно длинной оси зародыша. Релаксация натяжений, поперечных длинной оси зародыша, не нарушает этого распределения, а эксплантация презумптивной эктодермы нарушает: доли рядов ресничных клеток, расположенных под разными углами, уравниваются. Растяжение эксплантированных участков эктодермы не приводит к восстановлению исходной сруктуры РЭ.

2. Планерная полярность (ПП) РЭ интактных зародышей, определяемая по паттерну потоков окружающей жидкости, характеризуется дальним порядком - наличием всего двух крупных доменов, с единым направлением ПП (дорсального и вентро-латерального).

3. При эксплантации крыши бластоцеля и вентро-латерального её участка дальний порядок ПП нарушается, однако сохраняется ближний: в пределах каждого сэндвича возникает несколько зон с одинаковой ориентацией потоков. В головной эктодерме при эксплантации дальний порядок преимущественно сохраняетя. Эксплантация головной эктодермы вместе с вентро-латеральной приводит к нарушению дальнего порядка ПП в первой.

4. Ортотопные трансплантации участков эктодермы с поворотами на 180" показали, что ПП презумптивной головной эктодермы более жестко детерминирована, нежели ПП вентро-латеральной эктодермы.

5. Релаксация поперечных натяжений у целых зародышей приводит к исчезновению дорсального домена и реориентирует потоки вентро-латерального домена в поперечном направлении.

6. На примере РЭ шпорцевой лягушки впервые у зародышей позвоночных обнаружено, что растяжение тканей восстанавливает дальний порядок ПП и ориентирует ее. Реакции на растяжение регионально специфичны: если в презумптивной вентро-латеральной эктодерме как поперечное, так и продольное растяжение ориентирует потоки перпендикулярно растяжению, то в головной эктодерме только поперечное растяжение вызывает перпендикулярную к нему ориентацию потоков.

7. Структура и планарная полярность РЭ — независимые признаки. В определении планарной полярности существенную роль играют механические натяжения, которые в норме могут быть связаны с гаструляционными движениями, а также с замыканием нервной трубки и удлинением хорды.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в журналах, включенных в перечень ВАК:

1. Евстифеева, А.Ю. Топология и пленарная полярность эмбрионального ресничного эпителия шпорцевой лягушки / А.Ю. Евстифеева // Изв. РАН. Сер. биол. — 2013. — Том 40. - № 6. - С. 661-667.

2. Евстифеева, А.Ю. Изменения топологии и геометрии эмбриональных эпителиев шпорцевой лягушки при релаксации механических натяжений / А.Ю. Евстифеева, С.В. Кремнёв, JI.B. Белоусов // Онтогенез. - 2010. - Т. 41. - № 3. - С. 1-9.

Тезисы:

1. Евстифеева, А.Ю. Изучение взаимосвязи планарной полярности, топологии и механического напряжения в эмбриональном ресничном эпителии шпорцевой лягушки / А.Ю. Евстифеева // Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии: симметрия и асимметрия: материалы конф., 14-16 нояб. 2012 г., г.Москва. — Москва: ОПТ ПИН РАН, 2012.-С. 14-15.

2. Evstifeeva, A.Yu. Topology and polarity of ciliary epithelium in Xenopus laevis embryonic ectoderm as related to mechanical stresses / A.Yu. Evstifeeva // Biological motility: Fundamental and applied science: Materials of the International Symposium, 11-15 may 2012, Pushchino. - Pushchino: Foton-Vek, 2012. - P. 81-82.

3. Евстифеева, А.Ю. Формирование ресничного эпителия у зародышей шпорцевой лягушки: клеточные мозаики и направление потоков жидкости / А.Ю. Евстифеева // Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии: материалы конф., 16-18 марта 2011 г., г. Москва. - Москва: ОПТ ПИН РАН, 2011,-С. 13-14.

4. Evstifeeva, A.Yu. Influence of relaxation of mechanical stress upon cell topology and geometry in Xenopus laevis embryonic ectoderm / A.Yu. Evstifeeva. S.V. Kremnev // Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies: Materials of the International Symposium, 10-15 may 2010, Pushchino. - Pushchino: Synchrobook, 2010. - P. 81-82.

Заказ № 18-Р/03/2014 Подписано в печать 06.03.14 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 VViЛ www.cfr.ru ; e-mail:info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Евстифеева, Алёна Юрьевна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. М.В. Ломоносова

Биологический факультет 04201457451 На правах рукописи

Евстифеева Алёна Юрьевна

ФОРМИРОВАНИЕ СТРУКТУРЫ И ПЛАНАРНОЙ ПОЛЯРНОСТИ ЭМБРИОНАЛЬНОГО РЕСНИЧНОГО ЭПИТЕЛИЯ ШПОРЦЕВОЙ

ЛЯГУШКИ

Специальность 03.03.05 - «биология развития, эмбриология»

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, проф. Л.В. Белоусов

Москва - 2014

Оглавление

ОГЛАВЛЕНИЕ.............................................................................................................................2

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................................4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................................7

1.1. Механическое напряжение как важный морфогенетический фактор............................................7

1.1.1. Источники механических напряжений в тканях зародыша и механизмы их передачи на расстояние и внутрь клетки.................................................................................7

1.1.2. На что могут влиять механические напряжения........................................................12

1.1.3. Реакция участков эмбриональных тканей амфибий на механическое растяжение и релаксацию...................................................................................................................................14

1.2. Структура биологических тканей................................................................................................16

1.2.1. Биологический смысл клеточной мозаики.....................................................................16

1.2.2. Механизмы, определяющие структуру ткани............................................................18

1.3. планарная полярность биологических тканей...........................................................................22

1.3.1. Что такое планарная полярность, её функции и примеры........................................22

1.3.2. Молекулярные механизмы планарной полярности, действующие на

локальном уровне.........................................................................................................................23

1.3.3. Механизмы планарной полярности, действующие на глобальном уровне.............29

1.4. Эмбриональный ресничный эпителий хегмориб ьаеу^.................................................................31

1.4.1. Строение и развитие ресничного эпителия.................................................................31

1.4.2. Механизмы, задающие регулярный паттерн расположения ресничных клеток ...31

1.4.3. Цилиогенез........................................................................................................................32

1.4.4. Механизмы установления планарной полярности ресничного эпителия................34

2. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ................................................................................................................38

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................................................................39

3.1. Материалы................................................................................................................................39

3.1.1. Реактивы...........................................................................................................................39

3.1.2. Лабораторное оборудование.........................................................................................39

3.1.3. Лабораторные животные..............................................................................................39

3.1.4. Буферы и растворы..........................................................................................................40

3.1.5. Фиксаторы........................................................................................................................40

3.2. Методы......................................................................................................................................40

3.2.1. Получение и инкубация зигот.........................................................................................40

3.2.2. Микрохирургические операции.......................................................................................41

3.2.3. Составление карт потоков окружающей жидкости, создаваемых РК, и их анализ 45

3.2.4. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)...........................................................46

3.2.5. Вычисление степени растяжения сэндвичей................................................................46

3.2.6. Обработка изображений, полученных с помощью СЭМ..............................................47

3.2.7. Алгоритм поиска рядов из РК.........................................................................................48

4. РЕЗУЛЬТАТЫ......................................................................................................................49

4.1. Структура ресничного эпителия.................................................................................................49

4.2. планарная полярность ресничного эпителия.............................................................................52

5. ОБСУЖДЕНИЕ....................................................................................................................63

5.1. Структура ресничного эпителия.................................................................................................63

5.2. Планарная полярность в эксплантатах крыши бластоцеля.........................................................64

5.3. Влияние механического растяжения и релаксации на планарную полярность ресничного эпителия.............................................................................................................................................66

5.4. Возможная роль натяжений на поверхности интактных зародышей в ориентации оси планарной полярости ресничного эпителия.........................................................................................................68

6. ВЫВОДЫ..............................................................................................................................71

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................................73

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................................74

ПРИЛОЖЕНИЕ 1.......................................................................................................................92

ПРИЛОЖЕНИЕ 2.......................................................................................................................93

ПРИЛОЖЕНИЕ 3.......................................................................................................................94

ПРИЛОЖЕНИЕ 4.......................................................................................................................95

ПРИЛОЖЕНИЕ 5.......................................................................................................................96

ПРИЛОЖЕНИЕ 6.......................................................................................................................97

Введение

Биологические ткани - это не просто набор определённых клеток, механически связанных между собой. Ткани развивающихся зародышей характеризуются определённой топологией (Ьаеуа е1 а1. 2012). Клетки в тканях организованы в клеточные ансамбли (гистионы), являющиеся структурной единицей ткани (Савостьянов, 2005). Таким образом, ткани, как и многие биологические структуры более высоких уровней организации, имеют модульное строение. Как следствие, клетки в тканях образуют регулярные клеточные упаковки (клеточные мозаики).

Изучение топологии тканей и факторов, влияющих н клеточную мозаику, может быть важным для медицины и тканевой инженерии, задачей которой является управление развитием ткани. Следует отметить, что в настоящее время патологические процессы в тканях исследуются преимущественно на молекулярном уровне. Между тем, в основе патологических процессов в эпителиях могут лежать перестройки в их структуре1 (Савостьянов, 2005).

Биологические ткани не только представляют собой регулярную решётку из клеток, но и обладают также и полярностью. Эпителиальные ткани обладают ярко выраженной апикобазальной полярностью, вследствие выполняемой ими барьерной функции. Помимо этого, клетки в тканях полярны вдоль поверхности пласта. Это называется планарной полярностью (ПП). Она проявляется как на уровне отдельных клеток, так и на уровне многоклеточных структур. Примерами планарно полярных тканей и структур могут служить сенсорный эпителий в улитке уха, моноцилиарный эпителий гензеновского узелка, фасетчатый глаз и крыло дрозофилы, волосяной покров мыши.

Исследования последних лет показали, что признаки ПП присущи многим типам клеток. Она необходима для нормального морфогенеза многочисленных структур от крошечных волосков до целых организмов. Поэтому понимание

1 Мы считаем термин «клеточная мозаика» синонимом словосочетания «структура ткани». Под структурой ткани мы будем понимать особенности взаимного расположения относительно друг друга разных типов клеток в ткани и их численные соотношения.

механизмов, лежащих в основе ПП, представляет большой интерес (Goodrich and Strutt, 2011).

ПП к настоящему моменту довольно подробно исследована на молекулярном уровне. В основе локального выстраивания полярностей клеток лежит асимметричная локализация определенных консервативных белков. Однако до сих пор неизвестны механизмы глобального выстраивания полярностей клеток, т.е. их ориентирования относительно оси органа или организма (Wang, Nathans, 2007; Goodrich and Strutt, 2011). Следовательно, исследование глобальных факторов ПП является актуальным вопросом.

Ряд данных свидетельствует о том, что в установлении ПП и структуры ткани могут участвовать механические напряжения (МН) в клеточном пласту. Полученные на зачатке крыла дрозофилы результаты (Aigouy et al., 2010; см. п. 1.3.3) позволяют предположить, что МН могут являться глобальным поляризующим фактором. Кроме того, в теоретических работах по моделированию плотных клеточных упаковок (эпителиев) было показано, что в зависимости от механических параметров клеточного пласта (сил клеточной адгезии и сократимости поверхности клеток) могут существовать клеточные мозаики с различными топологиями (Farhadifar et al., 2007; Staple et al., 2010). Однако экспериментальные данные о влиянии механического напряжения на структуру клеточной мозаики в биологических тканях практически отсутствуют.

Цель данной работы - экспериментальная проверка на примере ресничного эпителия возможной роли МН в определении структуры ткани и задании глобального направления её планарной полярности.

В качестве модельной системы мы использовали эмбриональный покровный эпителий шпорцевой лягушки {Xenopus laevis). На стадии хвостовой почки он включает ресничные клетки, создающие направленный поток окружающей жидкости от переднего конца зародыша к заднему, поэтому он является ярким примером планарно поляризованной ткани. Ресничные клетки легко отличимы от гладких клеток и располагаются в виде регулярного паттерна

на коже эмбрионов. Поэтому ресничный эпителий является также удобной системой для изучения механизмов формирования клеточной мозаики.

1. Обзор литературы

1.1. Механическое напряжение как важный морфогенетический фактор

1.1.1. Источники механических напряжений в тканях зародыша и механизмы их передачи на расстояние и внутрь клетки

При отсепаровке поверхностного слоя клеток зародышей амфибий он мгновенно отгибается. Это свидетельствует о том, что его апикальная поверхность натянута. Подобным методом были составлены карты механических напряжений (МН) для амфибий (Beloussov et al., 1975). Оказалось, что карты остаются топологически постоянными в течение довольно продолжительных последовательных периодов развития (от бластулы до ранней гаструлы; с ранней гаструлы до поздней гаструлы и так далее). Нарушение данных «рисунков» (полей) МН приводит к сильным аномалиям морфогенеза. Например, искусственное ослабление МН в вентро-вегетативной области зародыша на стадии ранней гаструлы приводило к серьёзным аномалиям в развитии осевых зачатков или даже к нарушению переднезадней полярности эмбриона (Beloussov etal., 1990).

У низших беспозвоночных (гидроидные полипы) основным источником МН является тургорное давление в вакуолях (Beloussov et al., 1993). В бластоцеле зародышей иглокожих и позвоночных существует тургорное давление, достигающее 70 Н/см (Wilson et al., 1989). Это давление растягивает клеточные стенки бластоцеля. На более поздних стадиях развития МН генерируются в основном кооперативными клеточными движениями. Например, процессы интеркаляции (встречных движений клеток и их взаимного встраивания) создают давление в направлении, перпендикулярном интеркаляции (Beloussov et al., 2000). МН генерируются при подворачивании клеток во время гаструляции и при смыкании нервной трубки. Поля МН образуются благодаря тому, что созданные в каком-либо участке зародыша МН способны передаваться на большие расстояния, сравнимые с размерами самого зародыша (Beloussov and Grabovsky, 2006).

Одиночная клетка может генерировать механическое напряжение порядка 10"7 N (Mitrossilis et al, 2009; Crow et al., 2012). Механическое состояние отдельных клеток определяется балансом сил между элементами цитоскелета (промежуточными и актиновыми филаментами, которые работают на сжатие, и микротрубочками, создающими силы распора) и компонентами внеклеточного матрикса (Ingber, 2006). ^

Актиновый цитоскелет генерирует в клетке силы порядка 10"п-10"9 N (Ladoux В., Nicolas А., 2012). В цитоплазме цитоскелет образует прочную сеть, а у поверхности клетки - так называемый кортекс. Цитоскелет связан в некоторых местах с мембраной через адаптерные белки. Его реорганизация, следовательно, может вызывать натяжение клеточной мембраны, а также изменять форму клетки. В свою очередь, форма клетки может напрямую влиять на экспрессию определённых генов (McBeath et al., 2004).

Через цитоскелет внешние механические силы передаются на ядро, вызывая активацию механочувствительных каналов ядерной мембраны. Последнее приводит к изменению активности внутриядерных образований: происходит конденсация хроматина, деформация кручения внутри ДНК, изменяется доступ ключевых белков к сайтам регуляции (Ingber, 1997) и транскрипция генов (Itano et al., 2003). Дефекты промежуточных филаментов ядра приводят не только к понижению механической жёсткости клетки, но и к ослаблению механозависимой активации транскрипции генов (Maniotis et al., 1997; Eckes et al., 1998; Lammerding et al., 2004).

Благодаря тому, что клетки связаны между собой и с субстратом посредством специальных адгезионных контактов, изменения формы одних клеток могут менять форму других, а растяжение субстрата, вызванное одной клеткой, передаётся соседним клеткам. Адгезионные контакты образованы интегральными белками, которые посредством адаптеров соединены с цитоскелетом и с молекулами сигнальных путей. Отсоединение адаптерных молекул приводит к разрушению контакта. Таким образом, цитоскелет может

влиять на адгезионную способность, а адгезионные контакты на цитоскелет (Lodish et al., 2003).

Известно несколько типов интегральных белков, участвующих в адгезии. В межклеточном соединении принимают участие в основном кадгерины и рецепторы из суперсемейства иммуноглобулинов, а в соединении с матриксом -интегрины и селектины (Lodish et al., 2003). Отдельные интегриновые рецепторы способны объединяться и образовывать так называемые фокальные контакты. Механическое напряжение, генерируемое клеткой на фокальных контактах, имеет порядок 10"9-10"7 N (Ladoux В., Nicolas А., 2012).

Механическое давление на клеточную поверхность немедленно вызывает перестройку фокальных контактов (Hu et al., 2003). Кроме того, некоторые структурные компоненты фокальных контактов чувствительны к механическому напряжению. Например, при ослаблении механического напряжения константа высвобождения зиксина повышается, в то время как винкулин не реагирует на изменение механического напряжения. Отсоединившись от фокальных контактов, зиксин может перемещаться в ядро и изменять транскрипцию генов, таких как эндотелии-1 (Chicurel et al., 1998).

Механические сигналы могут передаваться через кадгерины (Ко et al., 2001). В остеобластах давление жидкости приводит к перемещению ассоциированного с кадгеринами ß-катенина в ядро, где он активирует транскрипцию генов (Norvell et al., 2004). Также было обнаружено, что механическое раздражение вызывает открытие полуканалов щелевых контактов в хрусталике глаза (Bao et al., 2004).

Важную роль в механотрансдукции - передаче механических напряжений -играет внеклеточный матрикс, поскольку с ним связаны интегрины. Он состоит из различных белков и полисахаридов, синтезируемых самими клетками. Синтезируемый фибробластами фибронектин имеет сайты связывания с интегринами и с компонентами внеклеточного матрикса (коллаген, протеогликаны) и, таким образом, способствует прикреплению клеток к матриксу.

Он играет важную роль в клеточной миграции и в дифференцировке при эмбриогенезе.

Опосредованное цитоскелетом движение интегринов, связанных с фибронектином, вызывает его растяжение. Натяжение фибронектина может передаваться другим клеткам, что упорядочивает их движения и влияет на их дифференцировку. Кроме того, сами фибробласты упорядочивают нити фибронектина и, таким образом, могут влиять на движение других клеток (Larsen et al., 2006).

В перестройке актинового цитоскелета (полимеризации-деполимеризации актина) и в миозин-опосредованном скольжении актиновых нитей участвуют сигнальные пути, регулируемые малыми ГТФазами из семейства Rho (Lodish et al., 2003). Наиболее изученными представителями этого семейства являются RhoA, Racl и Cdc42. Активация RhoA стимулирует связывание актиновых филаментов в пучки (стресс-фибриллы) и сборку интегринов в фокальные контакты. RhoA также активирует киназу, которая в свою очередь активирует АТФазу лёгких цепей миозина. Это вызывает скольжение миозина по актину, т.е. сокращение актомиозинового аппарата. Rae ¡вызывает полимеризацию актина de novo на периферии клетки и формирование плоских мембранных выступов (ламеллоподий). Cdc42 участвует в образовании тонких, богатых актином мембранных выступов (филлоподий). Активация RhoA может происходить при воздействии на интегрины механическими стимулами (Ingber, 2003). Баланс между активностью Rho и Rae определяет способность клеток чувствовать физическое окружение и двигаться в определённом направлении (Brock and Ingber, 2005). Было показано участие ГТФаз семейства Rho в регуляции митоза и морфогенетических движений за счёт участия в процесса