Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые функции белков семейства Noggin: ингибирование сигнальных каскадов Activin/Nodal и Wnt в эмбриональном развитии

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Новые функции белков семейства Noggin: ингибирование сигнальных каскадов Activin/Nodal и Wnt в эмбриональном развитии"

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова

На правах рукописи

Ерошкин Федор Михайлович

Новые функции белков семейства Noggin: ингибирование сигнальных каскадов Activin/Nodal и Wnt в эмбриональном развитии.

Специальность - 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

| 3 t/iAll ZG12

005015940

Москва, 2012

005015946

Работа выполнена

в лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (ИБХ РАН)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, руководитель лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН, профессор Зарайский Андрей Георгиевич

Официальные оппоненты:

Академик РАН, доктор биологических наук, руководитель лаборатории молекулярных технологий и инновационного центра «технопарк ИБХ» ИБХ РАН Лукьянов Сергей Анатольевич

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной эмбриологии института биологии развития им. Н.К.Кольцова (ИБР) РАН, ведущий научный сотрудник лаборатории лаборатории молекулярной генетики гидробионтов всероссийского научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии (ВНИРО) Мюге Николай Сергеевич

Ведущая организация:

Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Биологический факультет

Защита состоится «16» мая 2012 года в 10 часов на заседании специализированного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан «13» апреля 2012 г.

Учёный секретарь Специализированного совета, Доктор физико-математических наук

Актуальность проблемы

Одной из важнейших задач современной биологии развития является поиск и изучение факторов, обеспечивающих индукционные взаимодействия клеток и тканей в ходе эмбриогенеза. Секретируемый белок Noggin (Noggin 1) является первым идентифицированным белковым фактором, участвующим в первичной эмбриональной индукции. Он был открыт Ричардом Харландом в 1992 г. у шпорцевой лягушки Xenopus как нейральный индуктор, продуцируемый шпемановским организатором. Noggin 1 способен связывать белки одной из субгрупп цитокинов TGF-P, а именно Bone Morphogenetic Proteins (BMP) (Smith and Harland, 1992). Действуя вне клетки, BMP индуцирует ассоциацию специфических рецепторных серин-треониновых киназ I и II типа, что приводит к внутриклеточному фосфорилированию цитоплазматических белков Smad 1/5/8, которые в паре со Smad4 мигрируют в ядро и регулируют ранскрипцию специфических генов-мишеней (Shi and Massague, 2003). Так как Noggin препятствует связыванию BMP с рецепторами (Groppe et al., 2002), то это приводит к ингибированию сигнального пути, опосредованного Smadl/5/8. Благодаря этой функции, Nogginl, будучи эктопически экспрессирован в вентральной части эмбриона Xenopus, способен индуцировать вторичные оси, лишенные голов. В нормальном развитии Nogginl играет ключевую роль в различных процессах, включая индукцию нервной ткани и скелетной мускулатуры в раннем эмбриогенезе (Smith and Harland, 1992), развитие хрящей (Botchkarev et al., 1999) и дифференцировку волосяных фолликулов (Brunet et al., 1998; Botchkarev et al., 1999; Shi and Massague, 2003). Во многих экспериментальных системах, например, при изучении стволовых или раковых клеток, Nogginl используется в качестве искусственного ингибитора ВА/Р-каскада. Считается общепризнанным, что Nogginl не является антагонистом для другой субгруппы лигандов TGF-p, Activin/Nodal/TGFbeta, которые связываются с другими серин-треонин киназными рецепторами и регулируют транскрипцию другого набора генов-мишеней через внутриклеточный белок-посредник Smad2/3 (Branford and Yost, 2002). Известно, что ингибирование этого сигнального пути необходимо для правильной разметки мезодермы при гаструляции (Piccolo et al., 1999), развития переднего мозга (Meno et al., 2001) и установления право-левой ассимметрии (Grande and Patel, 2009).

Помимо "классического" Nogginl, у позвоночных были найдены две других группы белков семейства Noggin, Noggin2 и Noggin4 (Furthauer et al., 1999; Fletcher et al., 2004; Eroshkin et al., 2006). Биологическая функция была показана в экспериментах только для Noggin2, который экспрессируется специфически в зачатке конечного мозга эмбрионов Xenopus и Danio, на основании которых было предположено, что Noggin2 может, по большей части, дублировать BMP-антагонистическую функцию Nogginl (Furthauer et al., 1999). Однако, по нашему предположению, значительные различия в первичной структуре белков Noggin, которые принадлежат к разным белковым подсемействам (Eroshkin et al., 2006), и различающиеся паттерны их экспрессии указывают на возможные различия в репертуаре связываемых ими белков и предполагают различную биологическую функцию.

В связи с этим, задача настоящей работы - изучение механизмов функционирования данных белков и их роли в ранней тканевой дифференцировке - представляется весьма актуальной, как с точки зрения получения новых фундаментальных знаний, так и ввиду необходимости создания новых генно-инженерных продуктов для специфичного управления процессами жизнедеятельности и дифференцировки клеток.

Особенностью данной работы является использование в качестве основной экспериментальной модели эмбрионов шпорцевой лягушки Xenopus. Данная модель признается одной из наиболее перспективных для изучения механизмов реализации генетической информации в раннем эмбриогенезе и, кроме этого, представляет собой удобную тест-систему, позволяющую исследовать процессы in vivo.

Цель и задачи работы

Целью данной работы было изучение свойств белков семейства Noggin и их функций в раннем развитии шпорцевой лягушки. В рамках поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ нуклеотидной и белковой последовательностей белков семейства Noggin.

2. Изучить временную и пространственную динамику экспрессии генов Noggin в раннем развитии шпорцевой лягушки.

3. Изучить влияние оверэкспрессии белков Nogginl и Noggin2 на развитие эмбрионов шпорцевой лягушки.

4. Для изучения роли белков Nogginl и Noggin2 в нормальном развитии шпорцевой лягушки идентифицировать белковые секретируемые факторы, связывающиеся с белками Nogginl и Noggin2 и установить влияние их связывания на соответствующие сигнальные каскады.

5. Выяснить роль белков Nogginl и Noggin2 в нормальном развитии шпорцевой лягушки.

Для изучения роли белков Nogginl и Noggin2 в нормальном развитии шпорцевой лягушки

идентифицировать белковые секретируемые факторы, связывающиеся с белками Nogginl и Noggin2 и установить влияние их связывания на соответствующие сигнальные каскады.

Научная новизна и практическая ценность.

В ходе работы впервые был идентифицированы ранее не известные гомологи белков семейства Noggin. Клонированы полные последовательности кДНК и проведен структурный и сравнительный анализ аминокислотной последовательности.

Впервые изучен пространственно-временной паттерн экспрессии гена Noggin2 и Noggin4 Xenopus в ходе эмбриогенеза.

Впервые показана, на примере Noggin2, способность белков семейства Noggin связывать in vitro, помимо BMP, ряд белков Activin/Nodal- и Wnt каскадов - ActivinB, Xnr2, Хпг4 и Wnt8 - и ингибировать эти каскады in vivo. При этом механизм связывания отличается от механизма связывания белков BMP. Обнаружено, что ранее изученный белок Nogginl обладает сходными свойствами, что и Noggin2.

Установлено, что искусственное блокирование трансляции мРНК Noggin2 вызывает редукцию переднего мозга. Впервые показано, что необходимым условием нормального развития этого отдела мозга является продолжительная изоляция его клеток от активности BMP-, Activin- и ^/-сигнальных каскадов. В эмбриогенезе шпорцевой лягушки эта функция осуществляется белком Noggin2.

Обнаруженные новые свойства белков семейства Noggin открывают возможности их применения для регуляции BMP-, ActivinlNodal- и ^/-сигнальных каскадов в различных биологических системах.

Апробация диссертации и публикации

Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на международном конгрессе 16th International Society of Developmental Biologists Congress (Эдинбург, Великобритания, 2009) и симпозиуме "Белки и пептиды" (Петрозаводск, Россия, 2011). По теме диссертации опубликовано 8 работ в рецензируемых журналах, в т.ч. в 6 иностранных, оформлено 4 патентных заявки РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования,

результатов и их обсуждения и выводов, изложена на_страницах машинописного текста, содержит

_рисунков. Список литературы включает_наименования.

Основное содержание работы

Клонирование и анализ последовательностей новых белков семейства Noggin

До недавнего времени считалось, что в геноме позвоночных, так же как и у их близких родственников, асцидий, содержится единственный ген Noggin (далее называемый Nogginl). Единственное исключение - костистые рыбы, у которых было обнаружено три различных гена Noggin (Nogginl, -2, -3), возникших, предположительно, в результате специфических геномных дупликаций в их эволюционной линии. Нами был проведен скрининг генов-мишеней транскрипционного фактора Xanfl, ранее клонированного в нашей лаборатории, методом вычитающей гибридизации (Eroshkin et al., 2006). Для этого ранние зародыши были Xenopus микроинъецированы морфолиновыми олигонуклеотидами (далее МО) против Xanfl и контрольными МО, затем из эксплантатов передней нейроэктодермы была выделена мРНК, которая была подвергнута вычитающей гибридизации. Среди 19 независимых дифференциально экспрессирующихся клонов нами были идентифицированы два новых гена, гомологичных гену Nogginl. Один из кодируемых ими белков обнаружил высокую степень гомологии с белком Noggin2, ранее найденным у рыбы Danio rerio (67% идентичности), и поэтому был назван Noggin2. Другой ген обнаружил только 30% идентичности с белками Nogginl и Noggin2 и был назван Noggin4, как следующий после ранее идентифицированного у Danio Noggin3. Следует отметить, что Noggin3 Danio является близким гомологом Nogginl (62% идентичности), т.к. их гены, по всей видимости, произошли от общего предка в результате недавней дупликации, специфичной для эволюционной ветви Danio.

Для выявления возможных гомологов Noggin2 и Noggin4 у других организмов, мы провели соответствующий компьютерный поиск в доступных геномных базах данных (GenBank). В результате нами были обнаружены прямые гомологи этих генов у рыбы фугу и курицы. Прямых гомологов Noggin4 у Danio не было обнаружено, но был найден еще один ген, эволюционно

равноудаленный от остальных генов, который был назван NogginS. У млекопитающих был обнаружен единственный ранее охарактеризованный ген, Nogginl. У человека нами был обнаружен псевдоген Noggin4 в составе 22 хромосомы, который содержит 3 мутации сдвига рамки считывания и три стоп-кодона, нарушающие предполагаемую кодирующую область. Тем не менее, он без сомнения может быть отнесен к подгруппе Noggin4, т.к. его восстановленная аминокислотная последовательность обнаруживает гораздо более высокую степень гомологии с членами подгруппы Noggin4 (35-43%), нежели с остальными белками Noggin (20-28%) (рис.1 А).

Помимо большего отличия Noggin4 от других Noggin, в его первичной структуре нами было отмечено две важные особенности. Во-первых, он несет аминокислотные замены в положениях, критичных для связывания белков BMP (Groppe et al., 2002). Это предполагает более низкую способность связывать ВМР или отсутствие такой способности вообще. Во-вторых в Noggin4 отсутствует гепарин-связывающий участок, удерживающий другие белки Noggin у клеточной поверхности (Paine-Saunders S et al., 2002). Нами предположено, что скорость диффузии Noggin4 в эмбриональных тканях может быть выше, чем других Noggin, несущих гепарин-связывающий участок (рис.1 А).

На основании полученных данных нами было построено филогенетическое древо белков Noggin позвоночных животных (рис.1 Б).

Кроме того, гены семейства Noggin были обнаружены у некоторых беспозвоночных - губки Suberites domuncula, трихоплакса Trichoplax adhaerens, пресноводной гидры Hydra magnipapillata, асцидии Ciona intestinalis, что свидетельствует о древнем эволюционном происхождении данных генов.

Позже другими авторами были обнаружены гомологи Noggin у некоторых других беспозвоночных животных. Так, у планарии Schmidtea mediterráneo были охарактеризованы 2 гена Noggin, Smed-nogl and Smed-nog2, а также 8 Noggin-подобных генов, Smed-nlgl - Smed-nlg8 (от Noggin-Like Gene), видимо, произошедшие от общего предка в результате дупликации(й) в эволюционной ветви планарий (Molina et al., 2009). У морского анемона Nematostella vecíensis также были идентифицированы два гомолога Noggin, NvNogginl и NvNoggin2 (Matas et al., 2006).

Изучение локализаиии экспрессии генов Noesin в раннем развитии шпорцевой лягушки.

Временная динамика экспрессии генов Nogginl и Noggin4 в раннем развитии шпорцевой лягушки была изучена с помощью метода обратной трансцрипции и ПЦР (ОТ-ПЦР) с праймерами, специфичными для генов Nogginl, -2 и -4. Для контроля общего количества кДНК в образцах были использованы праймеры к кодирующей части одного из генов домашнего хозяйства, орнитин-декарбоксилазы (ODC). Слабый, но превышающий фоновый уровень сигнал транскрипта Noggin2 был впервые отмечен на стадии поздней гаструлы (ст. 12.5). На последующих стадиях развития уровень сигнала постепенно повышался (рис.2 А).

В отличие от Noggin2, присутствие транскриптов Noggin4 выявлялось уже на стадии бластулы (ст. 8). С началом гаструляции (ст. 10.5) их концентрация резко повышалась и оставался в дальнейшем на примерно одинаковом уровне, что в целом напоминает динамику транскрипции гена Nogginl (Smith and Harland, 1992) (рис.2 А).

Пространственный характер распределения транскриптов изучаемых генов был исследован методом гибридизации in situ на целых эмбрионах с помощью антисмысловых РНК-зондов.

X

Ncxj 1 X X.

N<xj 1 X t .

Högl G <1

H<x| 1 F Г .

Hcxj? X 1.

H<x|? X t .

Hcxj 2 G 4

Hex,? F »-.

H<xj-I X 1.

Hex, 4 X t .

Hcxj 4 G <J

Hcx|4 F 1 ■

M<x|l X 1.

Mo<| 1 X 1

H<x|l G q-

Ho<| 1 F r .

H<x|? X 1.

Hcxj 2 X t.

Hcxj? G 4

Ho<|2 F r.

Hcxj 4 X 1 .

Hcx|4 X t

Hcx|4 G g-

Hcx|4 F '' ■

Hcx,l X i.

Hcxj 1 X t.

Mo<| 1 G <j-

Hcxj 1 F r.

Hcx|? X 1.

Hcxj 7 X t.

Hcx|2 G <3-

Hocj2 К r.

Hcx|4 X 1.

Mcx|4 X t

N<x|4 G <1

Hcxj 4 F r-

MÏHSgCLVI lYALMVt LGLHIDOGGqQ JDHfiQO VT IYAIMVFLOLRIDQCGQQ JDHSgt I VI lYAAAVLLGLRLOOGSCX) JjPPRI RVATYI.M.LSVGLI LHGGACÍQ JkkIHLPtMLLC'LWLt LVO HQGCtjí TKKTNI PF AFLI.<'KWLFt .VH HOGS* Д

JlAIGA---LLLC8CLGLLR- PGAGQ-------

je; lsqt i.lfy vlvcvii i gvs]q ТЛМ 1 li lswi v i lg i wgi i a И j.01 H -три ilflsc'iml lgtvfgp lAlí^tptm

yqdpcfylllilclbp¿-plo- -attíl.edprd-¿püps k.ajlwvsahv l ygt a aílfmssaohhplhvtlagtkfh

---I------I.HI^PS

OL- OHYHO'IOKDMDIGSLRRi

pst.hlplvdlieiipto - p8fmlplvdliehps psdillplvol1кhрщ psdslpivi lkedps psi: iilpvkdl 1 ьнмя pshii.pvkdt iehpj

psdhlpvkdivehpS

p8diilpvpdlki - - 88*. 1 RPY8LS l.i H

bsgtrpyblsi.sphMK; bapvrpyslslspeffiyryi .p S Y8(JP 1 R i ytllah

l'FgYüYA! !I.£VIIYM2

! SKDLMETU

3ekdi.metij¿

;KDLMETIJV rdi.het! j QDLDERT&

qdi.dertJ oui m nig eqdi.aert'j 'KIILRVSi KIILRVSRj J'HIlLRI'l.K

ERI.GVKDLGBLDLI I KQKPKGAMPAEIK<. l.lU GVfc l>l i.KLDLl l RQKP SGAMP AE J K<-DIU GVDDI.AKLDLI I RQRPSGANPGEIK». Al II GIIAGHDBLDDI 1>AQRW(.GALPKE1RAÄI| MBVWT 8TQDSI TKMKTI GK TPI.BLKK DI M S V MHS I ODS II KMK'I I.GSVPI.ELKK I"l G P AH А Я AG AF АЛ AG RAR ЛАКLKW VLVHLSASDNIIVKMOGP MPNKIKK ADNGTBI LRГLS QDIYDGASR YRKK ADNDTSI. LS I LS QDLYUG ASKYKKK ¿RHI8AKFDLETMS RELAD88GRYRRJC SEVBGB1IPDDLVPLIIGDKItLl КAAAI НГК.Ж

:aaksmhlti

ip ak8vhltt ll'AI 8TKLTI :pikrvt ktf

iksviktf {pvksvt ktf kpvksihkvf tqaoi.tqikl I>UA«j1,]'uikl pao' ahi.ki. hak i i h ik i

F.FYEGLQ

efyeglq GKKHRL8KKLKRK г fytk. i QP GKKHRLS KK LRRK f DAPQLGKKHKPSKKLKRR •SF.TPY GDRTRMGKKARRK Gt.RlHMGKKARRK Gl'rlrvgkkarrk dltltpy GKKVKVGKKAKRK soeaqai .dfdslqlptels am s so" IONE aoeaqaldkgslolpiielsamssliivohe wkeve«. MFlppelpad - MARL

i:keaeai.elg i lppqvass

mjh^wsiitk' LQ»-C WS ОТ F I-Qtfl WSC.JTF ПЛ LQoS WAYS! I"T riffi WAYTY l'L№ HAYTY¡ V1.Œ WAY WIY IRCE VORAS HE VOItAS LRI<3 VI RAS Hg V R AJIJV 11 A 15!Э

¡JlljWAARI'

pFSRGEDGBKGHKSDVRH

5

Nog4_X.t,

Nog4_G.g.

Nog4 F.r.

Noggin4

Nog C.i

Nog1_X.I.

Nog1_H.si____Nogi_X.t.

- Nog1_G.g. Nog1_F.r.

Nog1_D.r. Nog3_D.r.

Nogginl

Nog2 X.I. Nog2_X.t. Nog2_F.r. Nog2 D.r.

Nog2 G.g.

Noggin2

Рис.1 (А) Выравнивание аминокислотных последовательностей белков семейства Noggin Xenopus laevis, Xenopus tropicalis (X.t.), Fugu rubripes (F.r.) and Gallus gallus (G.g.), Danio rerio (D.r.). Черным помечены аминокислотные остатки, консервативные для всех белков. Аминокислотные остатки, консервативные для каждого типа белков, выделены разными цветами. Ножницами указан сайт протеолитического отщепления лидерного пептида. Цифрами отмечены консервативные остатки цистеина. Стрелками обозначены аминокислоты, критичные для связывания с BMP. Горизонтальным пунктиров отмечен гепарин-связывающий регион. (Б) филогенетическое древо белков Noggin позвоночных и асцидии. СЛ., Ciona intestinalis, D.r., Danio rerio, F.r., Fugu rubripes, G.g., Gallus gallus, H.s., Homo sapiens. X.I., Xenopus laevis, X.t., Xenopus tropicalis.

Рис.3. Экспрессия генов Noggin на стадиях 24 и 26. (А-Е) результаты гибридизации in situ. Вид с правой стороны, дорсальная сторона сверху, передняя часть справа. (Г1-Е4) гистологические срезы эмбрионов, изображенных на (Г) и (Е), линии среза указаны красным пунктиром. (Г1, Е2 и Е2), дорсальная сторона сверху; (Г2, ЕЗ и Е4), передняя сторона справа. Сокращения: Г, глаз; ЖД, жаберные дуги; ЗМ, задний мозг; НГ, нервный гребень; HT, нервная трубка; ПМ, передний мозг; Пр, присоска; ПЭ, презумптивный пигментный эпителий; С- сердце; Сом, сомиты; Ст., стадия; Стч, сетчатка; УП, ушные пузыри; X, нотохорд; Э, презумптивный эпидермис; Mes, mesencephalon.

Nogglnl ст. 10.5

Рис.2. Экспрессия генов Noggin на стадиях 10,5 - 18. (А) Результаты ОТ-ПЦР тотальной РНК разных стадий развития с праймерами на noggin 1 (N1), noggin2 (N2), noggin4 (N4) и EF-1 -alpha (EF) (внутренний контроль). (Б-О) результаты гибридизации in situ. Вид с дорсальной стороны (Б, К, Н), спереди, дорсальная сторона сверху (В, Г, П), с вегетативной стороны, дорсальная сторона сверху (Е, Ж), с правой стороны, дорсальная сторона сверху (JI, О), саггитальный разрез, передняя часть справа (Д, М). Сокращения: Бл, бластопор; Гц, гастроцель; ДГ, дорсальная губа бластопора; Ках, крыша архентерона; НВ, нервные валики; НГ, презумптивный нервный гребень; НХ презумптивный нотохорд; ПК, передний край нервной пластинки; ПНП, передняя нервная пластинка; Пэм, передняя эндомезодерма; Сом, презумптивные сомиты; Э, эпидермис._

В течение гаструляции транскрипция Noggin2 на уровне, отличном от фонового, не была обнаружена. Начало экспрессии гена Noggin2 было обнаружено на стадии средней нейрулы (ст. 14) в тонкой полоске, соответствующей проспективному переднему нервному валику. В течение второй половины нейруляции, интенсивность окраски этой полоски возрастала (рис.2 Б-Г). Как известно, Nogginl также экспресируется в области переднего края нервной пластинки и, кроме того, в клетках хорды и средней лини нервной пластинки (Fletcher et al., 2004).

Для более точного изучения локализации транскриптов изучаемых генов были изготовлены серийные гистологические срезы эмбрионов, прошедших процедуру гибридизации in situ. На саггитальных срезах этих эмбрионов видно, что экспрессия как Nogginl, так и Noggin2 на стадии 15 (средняя нейрула) ограничена треугольным доменом, соответствующем наиболее антериорной части внутреннего (сенсорного) слоя нервной пластинки, (рис.2 Д). На стадии хвостовой почки (ст. 24) экспрессия Noggin2 ограничена зоной презумптивного переднего мозга. На стадии 26 более слабая экспрессия была также детектирована в дорсальной части заднего мозга, дорсальной части сомитов и в зачатке сердца (рис.3 А-В). В отличие от Nogginl, Noggin2 не экспрессируется в присоске, хорде и туловищной части нервной трубки (рис.3 А-В).

В начале гаструляции Noggin4 диффузно экспрессируется в анимальной полусфере, с локальным максимумом в проспективном зачатке передней нейроэктодермы(рис.2 Е, 3). На срезах окрашенных эмбрионов видно, что экспрессия Noggin4 на этой стадии локализуется исключительно в эктодермальных клетках (рис.2 М). Даже в дорсальной краевой зоне экспрессия Noggin4 обнаруживается только в двух внешних слоях клеток, но не в клетках более внутренних слоев, соответствующих презумптивной дорсальной мезодерме. Nogginl, наоборот, на данных стадиях экспрессируется исключительно во внутренних слоях дорсальной губы бластопора, в презумптивных мезодермальных клетках, т.е. комплементарно зоне экспрессии Noggin4 (рис.2 И). В течение гаструляции Noggin4 продолжает экспрессироваться только в эктодерме, с максимумом в зоне презумпивной передней нервной пластинки. На стадии средней и поздней гаструлы максимум экспрессии Noggin4 приходится на передний нервный валик. В отличие от Nogginl, на стадии средней нейрулы Noggin4 обнаруживает крайне низкий уровень экспрессии в средней линии нервной пластинки. Как видно на фронтальных срезах эмбрионов на стадии поздней нейрулы, экспрессия Noggin4 локализована в клетках нервной пластинки и нервных валиков, включая клетки презумптивного нервного гребня. Небольшой уровень экспрессии также отмечен в эпидермальных клетках. В то же время, транскрипты Noggin4 не были обнаружены в передней мезодерме и в подстилающих клетках крыши архентерона (рис.2 О). На стадии 24 и далее, Noggin4 экспрессируется преимущественно в головной и дорсальной части эмбриона. Зона экспрессии включает в себя головной эпидермис, дорсальную часть нервной трубки, включая переднемозговую область, ушные плакоды, присоску и производые нервного гребня, включая жаберные дуги (рис.3 Г-Е). В зачатке глаза Noggin4 экспрессируется в презумптивной сетчатке, но не в клетках презумптивного пигментного эпителия. Единственными мезодермальными производными, в которых была обнаружена экспрессия Noggin4, являются узкие полоски клеток вдоль средней линии сомитов (рис.3 Г-Е).

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о наличии у позвоночных как минимум трех генов Noggin на гаплоидный геном. Два из них - Nogginl и Noggin2 - имеют частично перекрывающиеся зоны экспрессии, тогда как третий ген - Noggin4 - демонстрирует резко отличающийся экспрессионный паттерн. Исходя из различий как в первичной структуре белков Noggin, так и в паттернах экспрессии их генов, можно предположить, что они выполняют различные функции в раннем эмбриогенезе шпорцевой лягушки. В дальнейшей работе мы

7

ограничили область исследований сравнительным анализом молекулярных и физиологических функций генов Nogginl и -2.

Изучение эффектов эктопической экспрессии генов Nossinl и -2 в раннем развитии шпорцевой лягушки.

Из литературных данных известно, что эктопическая экспрессия гена Nogginl в вентральных клетках ранних эмбрионов шпорцевой лягушки приводит к индукции дополнительных туловищных отделов осей тела вследствие ингибирования ÄMP-каскада. Чтобы выявить возможные различия в функциях между Nogginl и Noggin2, мы прежде всего сравнили способность генов Noggin индуцировать вторичные оси. Для этого мы микроинъецировали в вентральные клетки эмбрионов на стадии 4-8 бластомеров полноразмерную мРНК Nogginl или ее производную Д5, у которой отсутствует большая часть 5*-нетранслируемой области (далее НТО) (Smith and Harland, 1992) в дозах от 20 до 400 пикограм на бластомер (далее пг/бл). В результате таких микроинъекций, в соответствии с литературными данными, были индуцированы вторичные оси тела, в которых отсутствовали головные структуры (рис.4 А).

Когда были произведены микроинъекции мРНК Noggin2, у которой отсутствовала, аналогично Д5 мРНК Nogginl, большая часть 5'-НТО, индукция вторичных осей не наблюдалась. Вместо этого нормальное развитие эмбрионов останавливалось на стадии ранней нейрулы (рис.4 Б). Дальнейший анализ таких эмбрионов с помощью гибридизации in situ с зондами на различные гены-маркеры выявил сильнейшую нейрализацию эктодермы, выявляемую по характеру экспрессии пан-нейрального маркера NCAM, и сопровождающуюся распространением экспрессии маркера рострального переднего мозга Xanfl (рис.4 В ,Г). При этом экспрессия эпидермального (keratin) и мышечного (muscle actin) маркеров была сильно подавлена (рис.4 Д, Е). Это указывает на то, что Noggin2 способен к нейрализации эмбрионов за счет эктодермальных и мезодермальных производных, и специализирует нервную ткань по переднемозговому типу.

Чтобы проверить, могут ли более низкие концентрации мРНК Noggin2 позволить эмбрионам пройти стадию нейруляции и индуцировать нормально сформированные вторичные структуры, мы понизили количество микроинъецированной мРНК до 3-5 пг/бл. В результате у 35% инъецированных эмбрионов происходило развитие вторичных голов с циклопическими глазами и другими структурами переднего мозга, маркированными экспрессией генов Рахб и Bfl (рис.4 Ж-И). В дальнейшем влияние мРНК Noggin2 было исследовано с помощью эмбрионов трансгенной линии, в которой ген репортерного флуоресцентного белка RFP находится под контролем промотора мышечного актина (Shcherbo et al., 2007). Микроинъекции мРНК Noggin2 в концентрации 3-5 пг/бл в такие эмбрионы приводили, в отличие от мРНК Nogginl, к сильной редукции мышечной ткани или даже к ее полному исчезновению во вторичных осях (рис.4 И-И"). Таким образом, в отличие от Nogginl, который вызывает усиление развития мышечной ткани в главной оси тела, Noggin2 вызывает ее редукцию.

Изучение эффективности трансляиии мРНК генов Nossinl и -2 в эмбрионах шпориевой лягушки.

Способность мРНК Noggin2 индуцировать вторичные головы напоминает свойства известного головного индуктора - секретируемого белка Cerberus, который способен одновременно подавлять BMP-, Nodal- и Wnt- каскады за счет внеклеточного связывания

8

in situ: Xanfl

Г inj: noggin2 (100 nr)

контроль

in situ: NCAM контроль

t*

in situ: keratin XK81 контроль

В inj: noggin2 (100 nr) in situ: Muscle actin

И' inj: noggir>2 (5 nr)

K'

Рис.4. Микроинъекции мРНК Noggin2 дикого типа вызывает эффекты, отличные от вызванных мРНК Nogginl дикого типа. Название и количество микроинъецированной мРНК приведено на каждом фото снизу, название гибридизационного зонда - сверху. (А-Е, вид с дорсальной стороны; Ж-И, вид сбоку; K-J1, эмбрионы на ст. 10.5, вид с вегетативного полюса) Вентральная микроинъекция мРНК Noggin 1А5 (А) индуцирует вторичные оси, тогда как аналогичная микроинъекция мРНК Nogginl (Б) вызывает образование грибоподобных тел. (В-Е) гибридизация in situ контрольных (слева на каждом фото) и микроинъецированных Noggin2 эмбрионами с различными маркерными генами. (Ж) Вентральная микроинъекция мРНК Noggin2 индуцирует образование вторичных голов с циклопическими глазами. (3) экспрессия переднемозгового маркера XBF1 в таких головах, выявляемая гибридизацией in situ. (И) при аналогичных микроинъекциях в трансгенные эмбрионы, несущие ген флуоресцентного белка под контролем мышечного промотора наблюдается редукция осевой мускулатуры. (И) фото в дневном свете, (И', И") - наложение фото в дневном свете, красной и зеленой флуоресценции. (K-JI) мРНК Noggin2, но не мРНК Nogginl ингибирует экспрессию гена ХВга в краевой зоне бластопора.

1-голова

'2-голова

^^^ контроль 3 inj: noggin2 (5 nr)

Д inj: noggin2 (100 nr) ;E inj: noggin2 (100 nr)

In situ: Brachyury

« t

К inj: noggin2 (5 nr)

И inj: noggin2 (5 nr)

In situ: Brachyury

ОС

о о

Л in¿nogg//j7(100nr)

соответствующих лигандов (Piccolo et al., 1999). Исходя из этого, мы рещили изучить способность белка Noggin2 связываться с различными лигандами методом коиммунопреципитации. Однако, так как в литературе предполагается, что 5'-НТО может снижать эффективность трансляции мРНК Nogginl (Smith and Harland, 1992), мы сначала решили сравнить эффективность трансляции синтетических мРНК Nogginl и Noggin2, несущих разные 5'-НТО, в клетках эмбрионов шпорцевой лягушки. Для этого нами были сконструированы производные Nogginl и Noggin2, меченные специфической антигенной детерминантой туе на N-конце зрелого полипептида (рис.5 А). Соответствующие мРНК были микроинъецированы в эмбрионы в разных концентрациях на стадии двух бластомеров, эмбрионы развивались до стадии средней гаструлы и подвергались лизису, после чего сравнительное количество белка в лизатах эмбрионов определялось методом иммуноблоттинга со специфическими анти-myc антителами. В результате было установлено, что мРНК Nogginl, несущая полноразмерную 5'-НТО, так же как и ее производная Д5, у которой отсутствует большая часть 5'-НТО, транслируются по меньшей мере в 200 менее эффективно, чем мРНК Nogginl, несущая полноразмерную 5'-НТО (рис. 5 Б).. В то же время, не было отмечено существенной разницы в эффективности трансляции мРНК Noggin2 с полноразмерной 5'-НТО дикого типа в сравнении с короткой синтетической 5'-НТО, несущей консенсусную последовательность Kozak (рис. 5 В).

Важно, что столь существенная разница в эффективности трансляции мРНК Nogginl и Noggin2 не компенсируется противоположной разницей в концентрациях их мРНК в нормальном развитии. Нами было установлено с помощью метода ОТ-ПЦР, что мРНК обоих генов присутствует в эмбрионах приблизительно в равных количествах (рис.5 Г). Это означает, что эндогенный белок Noggin2 должен присутствовать в эмбрионах в гораздо больших количествах, чем белок Nogginl. Чтобы подтвердить это напрямую, мы сравнили количества эндогенных белков Nogginl и Noggin2 в эксплантатах переднего нервного валика, используя антитела, полученные против специфических олигопептидов. Хотя нам не удалось детектировать сигнал, специфический для Nogginl, низкий, но четко отличимый от фонового уровня сигнал был получен с антителами на Noggin2 (рис. 5 Д). Так как аффинность обоих использованных антител была равной, что было показано с помощью экзогенных белков (рис. 5 Е), меченных тус-олигопептидом, то можно заключить, что в нормальном развитии концентрация эндогенного белка Noggin2 сильно превышает таковую Nogginl.

Учитывая такую разницу в эфффективности трансляции указанных мРНК, в дальнейших опытах мы использовали myc-меченные варианты Nogginl и -2, с короткой синтетической 5'-НТО, несущей консенсусную последовательность Kozak. Правомерность использования тус-меченых белков Nogginl и -2 в дальнейших экспериментах по коиммунопреципитации белков была подтверждена тем, что мРНК таких варантов, будучи микроинъецированной в эмбрионы в различных функциональных тестах, вызывала такие же эффекты, как и мРНК Nogginl и -2 без тус-метки.

-^

кодирующая область Noggin 1

NSgglnm

AUG

синт»тичеехая S'HTO Nippj

кодирующая область Ыбд&пмГ

Сп

Ко»* кодирующая область Noggln1!2 29/28 30/29 55)54 232/218

мРНК Noggin1/2 дикого mi мРНК SynNoggin1/2 мРНК MycNoggin 1& 5/2\ 5 мРНК SynMycNoggin 1/2 нативный Noggm1(2 MycNoggin1/2 MycAclipNoggin1/2

MycNogl \5 400 пг/эмбр

MycNog2\S 2 пг/эмбр

Мус Western

Tubulin Western

•30kD •20kD

MycNog2.\S 100 пг/эмбр

SynMycNog2 100 пг/эмбр

SynMycNogl 100 пг/эмбр

MycNog2-». MycNogl ■■*■

Tubulin Western

ОТ-ПЦР^ Nog1 Nog2

№

Nog2 Nog1 ^

-30kD :}-20kD

Е| рнк

SynNogginl 50 pg/embryo +

SynNoggin2 50 pg/embryo +

Noggin Western

Nog2 Nog1 -*■ • m ■30kD

Tubulin Western

Tubulin -♦[ 50k D

ж] Мус ко-ИП + Flag-Westerr

MycNogl ■¥

wtMycNogl

Flag-ADM

3 ]Myc ко-ИП + Flag-Western

MycNogl +

Flag-Xnr2

Flag-Zyxin

И {Мус ко-ИП + Flag-Western

MycNogl

Flag-Xnr2

H1

16kD

30kD

2Ш

30 k и

2Ш. 60kD

45kD

■20kD 60kD

Рис.5. Белки Noggin 1 и Noggin2 могут связывать TGF-P- и Wnt-лиганды. (А) Основные мРНК и белки, использованные в экспериментах. (Б, В) Сравнение способности к трансляции MycNoggin 1Д5 и MycNoggin2A5 методом иммуноблоттинга с антителами против шус-пептида. (Г) Количество мРНК Noggin1 и Noggin2 в области передней нервной пластинки, оцененное методом ОТ-ПЦР, примерно одинаково. (Д, Е) Количество белка Noggin2 в эмбрионах, оцененное методом иммуноблоттинга с антителами против этих белков, значительно превышает количество Noggin 1 (на (Д) нанесены эндогенные белки, на (Е) - оверэкспрессированные). (Ж-И) Способность белков Noggin 1 и Noggin2 и их Д-клип мутантов связывать ADMP, BMP, ActivinB, Wnt8, Xnr2, Xnr4 и Wnt8, выявленная методом коиммунопреципитации. Zyxin приведен в качестве отрицательного контроля.

Изучение лиганд-связывающих свойств белков Noggin I и -2.

Для изучения возможного влияния Noggin 1 и -2 на BMP-, ActivinlNodal- и ^¿-каскады, участвующие в раннем эмбриогенезе, методом коиммунопреципитации нами была исследована способность белков Noggin 1 и -2 связываться с соответствующими лигандами. Для этого нами были сконструированы плазмиды, кодирующие производные различных белков, меченные специфической антигенной детерминантой flag на N- или С-конце зрелого полипептида, а именно

ADMP, BMP4 (BMP-каскад); ActivinpB, Xnr2, Xnr4 (ActivuMaA&\ каскад) и Wnt8 (канонический Wnt каскад). Каждый из этих белков был отдельно транслирован в эмбрионах, после чего грубые лизаты белков смешивали, белковые комплексы осаждали с помощью анти-myc антител, иммобилизованных на протеин-G сефарозе и изучали методом иммуноблоттинга с анти-flag антителами.

В результате нами было установлено, что оба белка, Noggin 1 и Noggin2, связываются, помимо ВМР4, со всеми вышеперечисленными белками (рис. 5 Ж-И). В качестве отрицательного контроля нами был выбран внутриклеточный цистеин-богатый белок Zyxin. Когда нами была использована низкотранслируемая мРНК Noggin 1 с 5'-НТО дикого типа, коиммунопреципитация Nogginl наблюдалась только с ВМР4 (рис. 5 Ж, 3). Этот результат подтверждает наше предположение о том, что белок Nogginl, из-за низкой концентрации в эмбрионах, в нормальном развитии способен ингибировать только ВМР-лиганды в силу намного более высокой аффинности к ним, нежели к другим TGF-p- и Wnt-лигандам. Кроме того, это согласуется с представлением, что Nogginl функционирует в эмбриональном развитии только как ингибитор BMP. Необходимо заметить, что нами не было обнаружено разницы между Nogginl и Noggin2 в связывании BMP даже когда концентрация белков, взятых на коиммунопреципитацию, была снижена в 20 раз. Все эти данные говорят о том, что аффинность к TGF-P- и Wnt-лигандам у обоих белков Noggin приблизительно одинакова.

Из литературных данных известно, что N-концевой, т.н. клип-домен Nogginl критически важен для связывания с BMP (Groppe et al., 2002). Чтобы установить, играет ли этот домен важную роль для связывания Nogginl с другими TGF-p-лнгандам и Wnt8, нами была проверена способность делеционных мутантов Nogginl и Noggin2, лишенных 28 N-концевых а/к остатков зрелого полипептида (формирующих клип-домен) связываться с соответствующими лигандами (Д-клип-Noggin 1 и -2). В результате нами было установлено, что удаление клип-домена резко снижает, вплоть до фонового уровня, способность Nogginl и Noggin2 связываться с ВМР4 (рис. 5 Ж). Однако Д-клип-Noggin 1 и -2 продолжают связываться с остальными TGF-p-лигандами, хотя и несколько слабее, чем полноразмерные белки (рис. 5 И). Удаление клип-домена никак не сказалось на способности NogginoB связываться с Wnt8 (рис. 5 И).

В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что не клип-домен, а другие регионы молекул Noggin ответственны за связывание с TGF-P- (кроме BMP) и Wnt-лигандами.

Noeeinl и Nosein2 способны ингибировать активность Activin/Nodal uWnt- каскадов в живых эмбрионах.

Для исследования влияния белков Noggin и их делеционных производных на активность TGF-/3- и РРи?-сигнальных каскадов, в первую очередь мы изучили их способность ингибировать экспрессию специфических люциферазных репортерных конструкций в эмбрионах Xenopus. Для этого нами были использованы плазмиды, несущие ген люциферазы под контролем Smad2-связывающих (pARE-Luc) (Activin/Nodal-каскаа) и P-Catenin (pTOPflash) (FFni-каскад) цис-регуляторных элементов. Было показано, что люциферазная активность и pARE-Luc, индуцированная в эктодермальных эксплантатах мРНК ActivinB и Хпг2, и pTOPflash, индуцированная в эксплантатах вентральной краевой зоны мРНК Wnt8, подавляется мРНК Nogginl и -2, так же как и мРНК A-clip-Noggin 1 и -2, взятой в избытке по отношению к мРНК ActivinB, Хпг2 и Wnt8. В данных условиях оба белка, как и их делеционные мутанты, оказались примерно одинаково эффективны при подавлении ActivinB и Wnt8, тогда как в случае Хпг2 и

12

mm %\m\

Г AcltvinB (pARE-Lucf

I_____i-------

't' miuintnl zjfliitli

\

V

rv I—...............К

'roliibtaVin^............."4..............? I ®

' '' '............''' ' ' ' 'r • // '........*..........'

1S 30 45 180 240 300

микромн ьецироиамиой «РНК, nr/эмбр.

XWntS (pTOP-Flash)

pk Nogginl Zyxinl

, Xnr2 (pARE-Luc) Noggml4

михроимъецироваииой мРНК, пг/змбр.

*олич»ство михроии-ьецировэнной мРНК, пг/змбр.

0.1 0.5 2.S 12.5 количестве микроиимцироваиной мРИК, пг/змбр.

Рис.6. Белки Noggin способны подавлять активность ActivinB, Хпг2 и XWnt8. (А-В) белки Noggin, транслированные с синтетической (SynNoggin) мРНК, ингибируют в эмбрионах активность специфических люциферазных репортеров. Над каждой диаграммой приведены изучаемый каскад и соответствующий ему репортер, снизу - тип и количество мРНК (в пикограммах на эмбрион), добавленнных в смесь для микроинъекции. По вертикали приведена нормализованная люциферазная активность, уровень контроля принят за 1. мРНК RFP в наибольшей концентрации выбрана в качестве отрицательного контроля. Черточками показано стандартное отклонение. (А'-В') относительный уровень экспрессии генов-мишеней изучаемых каскадов, измеренная методом количественной ОТ-ПЦР, уровень контроля принят за 1; условия экспериментов такие же, как в А-В. Черточками обозначено стандартное отклонение. (Г-Ж) Сравнение ингибиторной активности Noggin 1 и Noggin2 с активностью известных ингибиторов, определяемой по количеству их мРНК, необходимом для снижения люциферазной активности в 2 раза при данных условиях эксперимента. Количество микроинъецированной мРНК лигандов - как в А-В. мРНК Zyxin выбрана в качестве отрицательного контроля. Черточками обозначено стандартное отклонение.

Noggin2, и A-clip-Noggin2 подавляли репортерную активность намного сильнее, чем Nogginl и А-clip-Noggiml (рис. 6 А-В).

Способность Noggin и их делеционных мутантов подавлять ActivinB, Хпг2 и IVnt была подтверждена анализом экспрессии генов-мишеней соответствующих сигнальных каскадов в эмбриональных эксплантатах с помощью метода ОТ-ПЦР. Так, нами наблюдалось подавление транскрипции гена Xbra (непосредственная мишень Activin/Nodal- каскада) и ХпгЗ (непосредственная мишень Wnt-каскада) (рис. 6 А'-В1).

Важно, что Noggin и их делеционные мутанты оказались не способными подавить активность данных каскадов в случае активации не секретируемыми лигандами, а внутриклеточными посредниками (Smad2 и ß-Catenin соответственно) (рис. 6 А-В), что подтверждает внеклеточный механизм действия белков Noggin. Кроме того, оверэкспрессия Smad2, так же как и Smadl, не повлияла на подавление Wnt-каскада белками Noggin, равно как и коэкспрессия ß-Catenin или Smadl не повлияла на ингибирующие свойства Noggin. Это подтверждает предположение, что ингибиторная активность Noggin обусловлена их блокированием внеклеточных лигандов, а не опосредованным взаимным влиянием различных сигнальных каскадов.

Нами не было выявлено ингибирования данных сигнальных каскадов в случае использования мРНК Nogginl дикого типа даже при повышении ее концентрации до 500 пг/бл.

Для примерной количественной оценки ингибиторной активности Nogginl и -2, мы сравнили их влияние на активность данных каскадов с влиянием известных белков - Cerberus (ингибитор Nodal и Wnt) и Follistatin (ингибитор Activin) и между собой. Для этого нами была определена концентрация мРНК этих четырех ингибиторов, необходимая для подавления люциферазной активности в 2 раза. Предварительно методом вестерн-блоттинга была определена концентрация мРНК каждого лиганда (ActivinB, Хпг2 и WntS), приводящая к синтезу одинакового количества белка в эмбрионах, для чего были использованы flag-меченные производные этих лигандов. В результате было установлено, что Noggin2 ингибирует ActivinB в 10 раз слабее, чем Follistatin, а Хпг2 и Wnt8 - в 3 раза слабее, чем Cerberus (рис. 6 Г-Е). В то же время, Nogginl ингибирует Wnt8 примерно так же, как и Noggin2, a ActivinB и Хпг2 - в 4 раза слабее, чем Noggin2 (рис. 6 Г-Е). Для сравнения ингибирования BMP белками Noggin мы использовали люциферазный репортер TCFm-Luc, в которм ген люциферазы находится под контролем Smadl-связывающих цис-регуляторных элементов. При этом не было отмечено значимой разницы между Nogginl и Noggin2 в подавлении BMP-каскада в эктодермальных эксплантатах (рис. 6 Ж).

Noeeinl и Noeein2 способны влиять на онтогенетические проиессы. контролируемые Activin/Nodal и Wnt- каскадами в эмбрионах.

На основании способности белков Noggin связывать и ингибировать TGFß- и Wnt-лиганды, можно предсказать, что белки Noggin, будучи экспрессированы в достаточных количествах, способны влиять на физиологические процессы, контролируемые Activin/Nodal- и Wnt- каскадами в развивающихся эмбрионах.

Для изучения влияния Nogginl и Noggin2 на 5>иаг#-зависимые процессы, с помощью метода гибридизации in situ мы проанализировали эффекты влияния Nogginl и -2 на два гена, XBra and goosecoid, напрямую регулируемые Smad2. Для этого нами были использованы высокотранслируемые варианты мРНК Nogginl и Noggin2. Из литературы известно, что

ингибиторы BMP, как, например, транслированный с мРНК дикого типа Nogginl, способны индуцировать экспрессию goosecoid, в вентральной части краевой зоны, но не способны ингибировать экспрессию-Ybra. В то же время, белковые факторы, способные подавлять и Smadl-, и Smad2-опосредуемые каскады (такие как Cerberus) способны ингибировать экспрессию Xbra, но не способны индуцировать экспрессию goosecoid (Bouwmeester et al., 1996; Eimon and Harland, 1999).

При микроинъекциях мРНК Noggin2 нами наблюдалась сильное ингибирование ХВга в экваториальной зоне (90%, п=65) (рис. 7 А), что согласуется со способностью Noggin2 связывать и ингибировать белки Хпг. В то же время, микроинъекции мРНК Nogginl приводила к меньшему проценту эмбрионов, у которых наблюдалось подавление экспресии мРНК Xbra (42%, п=70) (рис. 7 А), что объясняется более низкой ингибиторной активностью в отношении Хпг, и, соответственно, Smad2-каскада. Согласно с результатами коиммунопреципитации, A-clip-Nogginl и -2 также ингибировали эндогенную экспрессию Xbra. Активация экспрессии goosecoid при этом не наблюдалась (рис. 7 В, Г).

Вентральная микронъекция 3-5 пг/бл мРНК Noggin2 дикого типа на стадии 4-8 бластомеров достаточна для индукции вторичных голов, так как данный процесс требует одновременного подавления BMP, Nodal и Writ. Однако микронъекция даже 500 пг/бл низкотранслируемой мРНК Nogginl дикого типа приводит лишь к индукции безголовых вторичных осей, что указывает на подавление только BMP. Чтобы выяснить, способны ли более высокие концентрации белка Nogginl индуцировать вторичные оси с головами, что согласовалось бы со способностью Nogginl подавлять Nodal- и WnZ-каскады, мы микроинъецировали высокотранслируемую мРНК Nogginl. Действительно, в этом случае нами наблюдалось образование вторичных голов с передним мозгом и циклопическими глазами (рис. 7 Д). Однако процент эмбрионов с вторичными головами был ниже, чем в случае микроинъекции Noggin2 (соответственно 15%, п=126 и 35%, п=120). Кроме того, все вторичные оси с головами, индуцированные Nogginl, также включали в себя хорошо развитые туловища с рядами сомитов. Вторичные же оси, индуцированные Noggin2, сомитов не содержали. Это различие может объясняться более сильным ингибирующим влиянием Noggin2 на NodallXnr, чем Nogginl. В этом отношении Noggin2 напоминает Cerberus, который способен индуцировать эктопические головные, но не туловищные структуры вследствие способности эффективно подавлять Nodal- и Wnt-каскады.

При снижении количества микроинъецируемой мРНК Noggin2 в 10 раз, с 3 до 0.3 пг/бл, мы наблюдали формирование исключительно безголовых вторичных осей, которые напоминали оси, индуцированные под действием низкотранслируемой мРНК Nogginl дикого типа (не показано). Такие оси несли хорошо развитые ряды сомитов. Это означает, что Wnt- и Nodal-связывающие функции Noggin2 практически полностью исчезают при значительном снижении концентрации, тогда как эффекты, обусловленные его BMP-связывающей функцией, сохраняются в силу большего сродства к BMP, чем к Wnt или к Nodal. Микроинъеции мРНК Noggin2 в низкой концентрации (0.3 пг/бл) приводит к примерно такому же проценту вторичных осей, что и мРНК Nogginl дикого типа в количестве 50 пг/бл (соответственно 35%, п=118 и 31%, п=117). Это хорошо согласуется с предыдущими результатами, свидетельствующими о разнице транслируемое™ этих мРНК примерно в 200 раз.

При микроинъекции высокотранслируемой мРНК Nogginl и Noggin2 в дорсальные анимальные бластомеры в количестве 2-5 пг/бл нами наблюдалось увеличение переднего мозга, включая глаза (рис. 7 К). Кроме того, в эмбрионах, инъецированных в медиальную область, наблюдался циклопический фенотип на стадии головастиков (рис. 7 3, И,). В этих экспериментах

15

Nogginl оказался более сильным агентом, вызывая более выраженную циклопию и увеличение зачатка переднего мозга. Это не может быть объяснено различным влиянием Noggin 1 и Noggin2 на BMP- and ^«¿-каскады, так как оба белка, экспрессированные с высокотранслируемых мРНК, ингибировали эти два каскада одинаково эффективно. Такое различие является, более вероятно, результатом более сильной ингибиторной активностью Noggin2 по отношению к NodallXnr-каскаду. Это предположение хорошо согласуется с тем фактом, что именно Nodal/Xnr-кжшц необходим для разделения исходно единого глазного поля на два зачатка билатерально расположенных глаз у позвоночных, и ингибирование этого каскада приводит к циклопии (Schier et al., 1996). Похожий циклопический фенотип наблюдается в результате микроинъекции мРНК Cerberus или CerberusS, также способных ингибировать Nodal/Xnr-каскац (Bouwmeester et al., 1996; Piccolo et al., 1999).

Так как Дклип-мутанты Noggin 1 и -2 не способны связывать BMP, но сохраняют способность связывать Хпг и Wnt, то можно предположить, что эти мутанты могут влиять на биологические процессы, регулируемые Хпг и Wnt. Действительно, микроинъекции AclipNogginl и AclipNogginl в дорсальные бластомеры приводят к увеличению переднего мозга и глаз, сопровождаемое циклопией, как и в случае с полноразмерными Noggin (рис. 7 Л, М). В соответствии с неспособностью связывать BMP, Дклип-мутанты Noggin 1 и -2 не индуцируют вторичные оси тела при инъекции в вентральные бластомеры даже при инъекции больших количеств мРНК (100 пг/бл) (не показано).

Далее, нами была изучена способность подавлять возникновение вторичных осей тела, индуцированных эктопической экспрессией Wnt8 в вентральной части эмбрионов на стадии средней бластулы. Такие оси возникают в результате возникновения вторичного ньюкуповского центра под действием Wnt8. Все известные антагонисты Wnl-каскада, включая Cerberus и Dkk, подавляют формирование вторичных осей, когда их мРНК коинъецируется вместе с мРНК Wnt8. Сходным образом, когда вместе с мРНК Wnt8 нами была инъецирована мРНК AclipNogginl или AclipNoggin2, нами наблюдалось резкое уменьшение числа эмбрионов с двойными осями тела (не показано).

Оверэкспрессия Wnt в проспективном головном регионе эмбрионов на стадии гаструлы приводит к микроцефалии. Этот эффект Wnt может быть нейтрализован ко-инъекцией мРНК Cerberus или Dkk (Glinka et al., 1997; Glinka et al., 1998; Piccolo et al., 1999). Чтобы проверить, способны ли мутанты AitnnnNoggin повлиять на активность Wnt в таких опытах, мы микроинъецировали эмбрионы плазмидой pCSKA-Wnt8, которая начинает экспрессировать Wnt8 после начала гаструляции, что вызывает микроцефалию, включая редукцию глаз. Действительно, когда мы ко-иньецировали pCSKA- Wnt8 с мРНК AclipNogginl или AclipNogginl на стадии 8 клеток в дорсальные анимальные бластомеры, которые в норме дают начало передней нервной пластинке, мы наблюдали восстановление нормального развития головы. Таким образом, эти эксперименты также подтверждают способность Noggin влиять на активность Wnt каскада(не показано).

И, наконец, нами была изучена способность мутантов AclipNoggin подавлять Wnt- и Nodal/Xnr- каскады, для чего мы проверили способность этих мутантов комплементировать (дополнять) "чистые" антагонисты BMP, как это было показано для Dkk и доминантно-негативного рецептора tBR при индукции головы (Glinka et al., 1998; Glinka et al., 1997). Нами было использовано два вида ингибиторов BMP - tBR и низкотранслируемый вариант NogginlA5. Когда какой-либо из этих ингибиторов BMP был экспрессирован в зародышах, нами наблюдалась индукция безголовых вторичных осей тела). В результате их ко-инъекции с мРНК AclipNoggin2 образовывались вторичные оси, которые содержали головы в 10% случаев (п=75 и 64). Однако,

16

развитие осей с головами не наблюдалось в случает коинъекции с AclipNogginl. Это может быть объяснено боле низкой способностью AclipNogginl ингибировать Nodal/Xnr- каскад по сравнению с AclipNogginl (не показано).

В целом, данные результаты полностью подтверждают с открытую нами способность обоих белков Noggin к подавлению Wnt- и Nodal/Xnr- каскадов.

Активность Nossin2, но не Noeeinl. необходима для нормального эмбрионального развития Xenopus.

Для выяснения роли Nogginl и Noggin2 в развитии переднего мозга, в зачатке которого они экспрессируются, в ходе нормального эмбриогенеза, нами была осуществлена серия экспериментов по блокированию функций этих генов. Для этого в эмбрионы на стадии 8 клеток в сооответствующие бластомеры нами были микроинъецированы специфические антисмысловые морфолиновые олигонуклеотиды (далее МО), селективно блокирующие трансляцию. В соответствии с литературными данными (Kuroda et al., 2004), нами не было отмечено существенных аномалий при микроинъекции МО к Nogginl (не показано). Этот результат, указывающий на малое значение Nogginl для развития передней нервной складки, косвенно подтверждает наше заключение, что эндогенный белок Nogginl, экспрессирующийся с низко транслируемой мРНК, присутствует в эмбрионах в крайне малых количествах и не способен подавить Activin/Nodal и Wnt- каскады.

У эмбрионов, микроинъецированных в переднюю область МО к Noggin2, наоборот, на стадии головастиков наблюдалась редукция конечного мозга, глаз и назальных плакод (90%, п=116) (рис. 8 А). Соответствено, эти эффекты сопровождались понижением уровня экспрессии маркеров конечного мозга (XBfl) и глаз (Рахб) (рис. 8 В, Д). В то же время, у эмбрионов, инъецированные МО к Noggin2 в туловищную область, видимых аномалий не наблюдалось (не показано). Также аномалий не было отмечено в случае использования контрольного МО, несущего 7 некомплементарных мРНК Noggin2 нуклеотидов (рис. 8 Б, Г, Е).

Для дальнейшего изучения специфичности эффектов, вызванных МО к Noggin2, мы микроинъецировали эмбрионы, помимо МО, мРНК Noggin2 или AclipNoggin2, не несущих участка связывания МО. В результате мы наблюдали гипер-реверсию эффектов МО в случае мРНК Noggin2 и неполную, но значительную реверсию в случае AclipNoggin2 (рис. 8 Ж-И). Помимо специфичности действия МО, эти результаты показывают, что для правильного развития передней нервной пластинки необходима как клип-домен-зависимая, так и клип-домен-независимая активность Noggin2.

Ингибирование Activin-каскада посредством Noggin2 необходимо для развития переднемозговых структур.

Необходимость Noggin2 как ингибитора отличных от BMP сигнальных каскадов может быть объяснена его способностью подавлять Wnt-каскад. Это подавление ((-'«/-каскада в течение нейруляции необходимо для развития переднего мозга (Kiecker and Niehrs, 2001; Lagutin et al., 2003; Onai et al., 2004). Кроме того, потенциально возможно влияние Noggin2 на Smad2-опосредуемый каскад. Насколько известно из литературных данных, единственным лигандом, активирующим этот каскад, и экспрессирующимся в течение нейруляции вблизи переднего края нервной пластинки, является ActivinB (Dohrmann et al., 1993).

17

Чтобы выяснить, играет ли Noggin2 существенную роль в ингибировании ActivinB в зачатке переднего мозга, мы в первую очередь сравнили методом гибридизации in situ паттерны экспрессии ActivinB и Noggin2 в эмбрионах, разделенных пополам (по средней линии) перед гибридизацией. Одна половина была гибридизована с зондом на ActivinB, а другая - с зондом на Noggin2. До нейруляции ActivinB экспрессируется на очень низком уровне (не показано), но уровень его экспрессии начинает существенно возрастать, вместе с уровнем экспрессии Noggin2, в начале нейруляции. Важно, что оба гена экспрессируются комплементарным образом (рис. 9 А-В'). Экспрессия Noggin2 наблюдается в клетках внутреннего слоя переднего нервного валика, в области, соответствующей презумптивному конечому мозгу, маркируемой экспрессией гена Bfl. ActivinB экспрессируется постериорно относительно Noggin2 (рис. 9 Г). После нейруляции экспрессия Noggin2 продолжается в зачатке конечного мозга, находящегося на дорсальной и латеральных сторонах передней части закрытой нервной трубки, тогда как ActivinB экспрессируется вне этой зоны, в вентральной части презумптивного промежуточного мозга и в глазных зачатках (рис. 9 Д-Е). Такой взаимоисключающий паттерн экспрессии указывает на возможное ингибиторное влияние Noggin2 на ActivinB.

Чтобы выяснить, насколько важен низкий уровень экспрессии ActivinB в зоне экспрессии Noggin2 (на переднем крае нервной пластинки) для развития зачатка конечного мозга, мы искусственно расширили зону экспрессии ActivinB с помощью трансгенной технологии. Для этого мы использовали двух-кассетный вектор, несущий кДНК ActivinB под контролем промотора гомеобоксного гена Xanfl, и кДНК Kate RFP под контролем промотора сердечного актина (Martynova et al., 2004; Shcherbo et al., 2007) (рис. 9 Ж). Использование промотора гомеобоксного гена Xanfl позволило ограничить зону эктопической экспрессии ActivinB передним краем нервной пластинки. Принципиально важно, что поскольку промотор Xanfl активируется только в конце гаструляции, то эффекты, наблюдаемые в данном эксперименте, обусловлены исключительно экспрессией ActivinB на постгаструляционных стадиях.

Нами наблюдалась редукция головы, включая глаза, во всех эмбрионах, несущих двухкассетный вектор, в то время как эмбрионы, несущие контрольный однокассетный CardAct-mKate2 вектор, развивались нормально (п=18) (рис. 9 3-3"). Кроме того, сходные аномалии были выявлены в другой серии экспериментов, при микроинъекции мРНК ActivinB в анимальную пару клеток на стадии 16-32 бластомеров в концентрации 0.1 пг/бл (рис. 9 И). Более высокие концентрации мРНК ActivinB вызывают массированное образование колбовидных клеток в анимальной полусфере, что блокирует нормальное развитие. В то же время, нами наблюдалось частичное восстановление переднемозговых структур при ко-инъекции мРНК Noggin2, но не Nogginl, вместе с мРНК ActivinB (рис.9 К, JI). В целом, данные результаты подтверждают исключительную роль Noggin2 в подавлении ActivinB в клетках презумптивного переднего мозга.

Поскольку Noggin2 способен одновременно ингибировать сразу три различных каскада (Activin/Nodal, BMP и Wnt), важно определить роль каждого из этих процессов ингибирования в нормальном развитии. Для этого нами были выполнены эксперименты по индивидуальному восстановлению ингибирования каждого из трех сигнальных каскадов, в эмбрионах с подавленной функцией Noggin2. Такое подавление функции Noggin2 достигалось инъекцией в эмбрионы анти-Noggin2 морфолиновых антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК Noggin2 (aH™Noggin2 МО). Соответственно, нами были использованы кДНК следующих ингибиторов данных сигнальных каскадов: Dkkl (естественный ингибитор Wnt), tBR (доминантно-негативный BMP рецептор 1-ого типа), tALK4 (доминантно-негативный активиновый рецептор 1-ого типа) (Chang et al., 1997; Glinka et al., 1998; Graff et al., 1994; Kondo et al., 1996).

18

In situ: Brachyury % ■ О JCi OCbjO OU1' О контроль A inj: noggin2 In situ: Brachyury О ООО ООО о ООа 0 Б inj: nogginl в контрол ц

г Ф * * V V У -V . v * v i, У м ЧЕ V

A' 4* Б' •JJ ML В' i, ib- r

In situ control Jt Bf1 control .eyes • 1 ф "

ГяМИ

Д Inj: Nog1 E Inj: Nog2 E'lnj: Nog2 Ж контроль 3 Inj: Nog2

cyclopic И f Inj: Nog1 ШШЩШШШЛ jM? Inj: 4dipNog2 control r /4 К ' jffe Шщ • Л inj: AclipNogl fit I M inj: AclipNog2

Рис.7. Белки Noggin, транслированные с синтетической мРНК, влияют на физиологические процессы, контролируемые NodallXnr и Wnt. (А-Г) Влияние вентральных микроинъекций мРНК Noggin на экспрессию генов Xbra (А, Б) и goosecoid (В, Г) (отмечено стрелками). (А'-Г) Флуоресценция FLD, выявляющая распределение микроинъецированного материала. (Д) Индукция эктопических головных структур, вызванная вентральной микроинъекцией мРНК Nogginl. (Е, Е1) Расширение зачатка конечного мозга, вызванное дорсальной микроинъекцией мРНК Nogginl и -2, выявляемое гибридизацией in situ с зондом против соответствующего маркера XBF1. (Ж-М) Микроинъекции мРНК Nogginl и -2 и их Л-клип мутантов вызывают увеличение глаз (К) и циклопию (3, И, Л. М).

Для обеспечения экспрессии данных ингибиторов только в клетках, в норме экспрессирующих Noggin2, нами были сконструированы плазмидные конструкции, несущие гены этих ингибиторов под контролем фрагмента промотора Nogginl в 4172 п.н. (рис.10 А). В предварительных экспериментах мы показали, что этот фрагмент достаточен для обеспечения "правильного" паттерна экспрессии, т.к. зона экспрессии GFP под контролем этого фрагмента совпадает с зоной экспрессии эндогенного Nogginl (рис. 10 Б-В'). Далее, мы микроинъецировали эмбрионы на стадии 8 бластомеров смесью aHTH-Noggin2 МО и вышеописанных плазмид (4 нг/мкл) в различных комбинациях. Эмбрионы развивались до стадии 26, после чего были подвергнуты гибридизации in situ с зондом на маркер конечного мозга — транскрипт гена XBF1. После окрашивания мы измеряли интегральную интенсивность окраски. При коинъекции анти-Noggin2 МО с tALK4- или Dkk 1-экспрессирующими плазмидами, в обоих случаях нами наблюдался статистически значимый эффект частичного восстановления фенотипа (Р<0.001) (рис.10 Г-Е). В тоже время, восстановления фенотипа не наблюдалось в случае ко-инъкции tBR-

экспрессирующей плазмиды. При этом повышение концентрации плазмид в 3 раза не приводило к полному восстановлению фенотипа, или даже уменьшало интенсивнось экспрессии ХВП (Р<0.001). В то же время, при микроинъекции всех трех плазмид (вместе с г^u^v^-Noggin2 МО) нами наблюдалось (статистически значимое) практически полное восстановления фенотипа (Р<0.001) (рис. 10 Г-Ж).

Таким образом, данные результаты свидетельствуют о том, что для нормального развития переднего мозга необходимы все три активности белка Noggm2.

Рис.8. Эффекты, вызываемые нарушением трансляции мРНК Noggin2 с помощью антисмысловых МО. (А, А') Микроинъекции анти- Noggin2 МО вызывают редукцию глаз, назальных плакод и конечного мозга. (В-Е) Микроинъекции анти- Noggin2 МО подавляют экспрессию маркера конечного мозга XBF1 (В, В1) и маркера глаз Рахб (Д, Д'). (Г, Е) отрицательный контроль. (Ж-И) Восстановление фенотипа с помощью ко-инъекции мРНК Noggin2 и Д-клип Noggin2. Скобками отмечен размер головной области, от железы вылупления до присоски._

Обсуждение результатов

TGF-0лиганды (помимо BMP) и Wnt являются мишенями белков семейства Noeein.

Нами впервые показано, что секретируемые белки Noggin 1 и Noggin2 могут связывать, помимо BMP, некоторые другие лиганды суперсемейства TGF-p, а также Wnt8, и ингибировать сигнальные каскады, активируемые данными лигандами. Тот факт, что удаление N-концевого клип-домена, необходимого для связывания с BMP (Groppe et al., 2002), не приводит к потере способности белков Noggin связываться с другими лигандами, указывает на другой, нежели в случае с BMP, механизм белок-белковых взаимодействий. Изучение этих механизмов является перспективным направлением дальнейших исследований.

Хотя нам не удалось обнаружить разницу между Noggin 1 и Noggin2 по эффективности связывания белков ActivinB и Хпг, нами наблюдалась существенная разница в эффективности подавления данного сигнального каскада: Noggin2 блокировал сигнальную активность белков ActivinB и Хпг значительно эффективнее, чем Nogginl. Это может указывать на неконкурентный характер ингибирования, в отличие от прямой конкуренции между Nogginl и BMP-рецептором за BMP, описанной (Groppe et al., 2002).

По сравнению с ингибированием BMP, ингибиторный эффект Nogginl и Noggin2 в отношении других лигандов суперсемейства TGF-P и Wnt проявляется слабее, и не выявляется в экспериментах с использованием мРНК Nogginl дикого типа, имеющей 5'-НТО, которая сильно снижает эффективность трансляции. Эта структурная особенность мРНК Nogginl дикого типа, позволяющая выявить только анти-ВМР активность Nogginl, объясняет тот факт, что остальные активности этого белка не были открыты ранее.

На молекулярном уровне, ингибирование Activin/Nodal и Wnt белками семейства Noggin подтверждается их способностью ингибировать синтетические репортеры SMAD2- и f)-catenin-каскадов. Кроме того, это подверждается способностью белков Noggin подавлять экспрессию эндогенных генетических маркеров, индуцированных ActivinB/Xnr2 и Wnt8.

На функциональном уровне, белки Noggin и их Д-клип мутанты также удовлетворяют критериям ингибиторов Activin/Nodal и Wnt: способность подавлять Wnt-индуцированные эффекты, способность к комплементации "чистых" ингибиторов BMP при индукции головы, способность ингибировать образование мезодермы и способность индуцировать циклопический фенотип.

Ингибирование Activin-. BMP- и Wnt-каскадов посредством Noeein2 необходимо для развития переднемозговых структур.

Нами впервые показано, что ингибирование трех сигнальных путей, Activin, BMP и Wnt, осуществляемое Noggin2 в клетках переднего края нервной пластинки, необходимо для нормального развития переднего мозга. Важность ингибирования BMP- и И-'«/-каскадов в ростральной части нервного зачатка в постгаструляционный период была ранее показана в экспериментах (Kiecker and Niehrs, 2001; Lagutin et al., 2003; Onai et al., 2004). В настоящей работе мы показали, что доминантно-негативный рецептор BMP не способен восстанавливать эффекты, вызванные подавлением трансляции мРНК Noggin2 с помощью МО. Это свидетельствует о том,

что ингибирование только БМР-каскада не достаточно для правильного формирования переднего мозга.

Как известно, функционирование Activin/Nodal-каскада в предгаструляционный период необходимо для индукции мезодермы. Однако при развитии передних структур эмбриона данный сигнальный каскад должен быть ингибирован, вместе с BMP- и (^«/-каскадами, что позволяет развиваться головным структурам, включая конечный мозг и глаза (Niehrs, 1999; Piccolo et al., 1999). Полученные нами данные демонстрируют, что изоляция клеток презумптивного переднего мозга от действия ActivinB (экспрессирующегося рядом с передним краем нервной пластинки) критически важна и в постгаструляционный период развития. У Xenopus эту функцию выполняет Noggin2.

Поскольку Noggin2 не обнаружен у млекопитающих, возникает вопрос, какой белок может замещать у них физиологическую функцию Noggin2. Можно предположить, что таким белком может быть Noggin 1, единственный представитель семейства Noggin у млекопитающих. Однако в экспериментах по генетичекому нокауту гена Nogginl мыши не было обнаружено аномалий развития переднего мозга (McMahon et al., 1998). Следовательно, функция Noggin2 у млекопитающих, вероятно, осуществляется какими-то другими ингибиторами Activin!Nodal- и Wnt-каскадов. Другим возможным объяснением отсутствие аномалий развития мозга при нокауте Nogginl могут быть какие-то глубокие изменения механизмов развития переднего мозга в процессе эволюции предшественников млекопитающих, которые позволили им обходиться без ингибирования сигнальных каскадов каскадов Activin!Nodal, BMP и Wnt) в период нейруляции. Дальнейшие эксперименты по изучению механизмов формирования переднего мозга позволят ответить на эти вопросы.

Выводы

1. Идентифицированы 8 новых гомологов белков семейства Noggin. Клонированы полные последовательности кДНК и проведен структурный и сравнительный анализ аминокислотной последовательности Noggin2 и Noggin4 Xenopus.

2. Изучен пространственно-временной паттерн экспрессии генов Noggin2 и Noggin4 в ходе эмбриогенеза Xenopus.

3. Показано, что белки Nogginl и Noggin2 способны связывать in vitro, помимо BMP, ряд белков Activin/Nodal- и Wnt- каскадов - ActivinB, Xnr2, Хпг4 и Wnt8. Механизм связывания белков Activin/Nodal- и Wnt- каскадов отличен от механизма связывания BMP.

4. Показано, что белки Nogginl и Noggin2 способны ингибировать BMP-, Activin/Nodal- и Wnt-каскады in vivo и способны подавлять эффекты, вызванные эктопической экспрессией в эмбрионах ActivinB, Xnr2 и Wnt8.

5. Показано, что необходимым условием нормального развития переднего мозга является продолжительная изоляция его клеток от активности BMP-, Activin- и Wnt-сигнальных каскадов, что эмбриогенезе шпорцевой лягушки осуществляется белком Noggin2.

Рис.9. Ингибирование Activin в передней части нервной пластинки необходимо для нормального развития переднего мозга. (Обозначения: tel - проспективный конечный мозг (telencephalon); н.п. - нервная пластинка). (А) На стадии средней нейрулы Noggin2 экспрессируется в клетках переднего нервного валика. Гибридизация in situ, вид спереди. (Б) Схема зон гибридизации, приведенных на В-Д. Красной звездочкой отмечена передняя граница нервной пластинки. (В) Экспрессия ActivinB и Noggin2 в половинках эмбрионов на стадии средней нейулы. ActivinB не экспрессируется в зоне экспрессии Noggin2, отмеченной красным пунктиром. (В1) Те же эмбрионы, вид спереди. (Г) Экспрессия маркера конечного мозга XBF1 и Noggin2 в клетках переднего нервного валика. (Д) Экспрессия ActivinB и Noggin2 в половинках эмбрионов на стадии хвостовой почки. В отличие от Noggin2, ActivinB не экспрессируется в зачатке конечного мозга. (Д1) Те же эмбрионы, срезы на указанном уровне. (Е) Схема экспрессии ActivinB, XBF1 и Noggin2 на стадии средней нейрулы, вид спереди. (Ж) Двухкассетный вектор, использованный для направленной экспрессии ActivinB под контролем промотора Xanfl в клетках зачатка переднего мозга. (3-3") В отличие от контрольных трансгенных эмбрионов (верхний ряд), в трансгенных эмбрионах, несущих конструкцию XanfActB-CardKate (нижний ряд), наблюдается редукция глаз и конечного мозга, выявляемая по экспрессии XBF1. (И) Редукция глаз у эмбрионов, микроинъецированных мРНК ActivinB (0.5 пг/бл). (К) Восстановление фенотипа таких эмбрионов с помощью ко-инъекции мРНК Noggin2. (J1) Статистический анализ размеров глаз микроинъецированных эмбрионов. Обозначения: tel - проспективный конечный мозг (telencephalon); н.п. - нервная пластинка.

ActivinB

Е Noggin2/XBf1 ст. 16

CardKate

Промотор cardiac actin

'ActB-CardKate

Inj: ActivinB + Noggin2

Noggin2

ActivinB

эадн. передн эадн ■4-►

Noggin2 ActivinB

Noggin2

CardKate

tel

В' ст. 16

I300] T fi

ho I

I 0 U I У

4 1 S^fs, I

> 2 о 2 о P"

. СТ. 16

ActivinB Noggin2 ActivinB lei Noggin2

3" XanfActB-CardKate

Двухкассетный вектор XanfActB-CardKate TStefb-

tActivinB- _

Промотор Промотор

Xanfl cardiac actin

Контрольный вектор CardKc

3

иШй

CardKate

XanfActB-CardKate

ст. 16

XBfl

Noggin2

V

tel

ст. 16

ст. 24

Плазмиды, экспрессирующие ЕвЯР, йкк1, и 64/.К4 под контролем промотора Ыодд!п2

Б'-итд

/ \ N1

И 72 / \ АТв

присоска

рЫод2-ЕвРР

In situ: XBF1

S,

misMO Nog2 +pNog2-EGFP

Анализ экспрессии pNog2-EGFP в эмбрионах Хепориэ методом ОТ-ПЦР

midblastula late gastrula midneurula tailbud £ (stage 8) (stage 12) (stage 15) (stage 22)

Д

In situ: XBF1 редукция

Щ

MO Nog2 *pNog2-EGFP

E In situ: XBF1

восстановление

w

MO Nog&pNog2-tALK4 pNog2-tBR+pNog2Dkk1

misMONog2 +pNog2-EGFP

MONog2 UMONog2+pNog2-tALK■

*pNog2-EGFP MpNog2-tBR+pNog2-Dk

Ж

% s

Средняя интегральная плотность гибридизационного сигнала экспресионного домена ХВП

статистическая оценка разницы (+ или -) интегральной плотности сигнала (критерий Стьюдента - 0.001)

misMO Ыод2 (контроль)

1

МО(0,5тМ)| Плазмиды (в сумме 12 ng/ul)

11ВВВЫЯР о

I I I

Q pNog2-tBR pNog2-tALK4

рЛ/од2-£ОРР (контроль)

ГВП1

pNog2-Dkk

■ ■■■■■■■

IIBBBSIO

Рис.10. Восстановление фенотипа, вызванного микроинъекциями МО к Noggin2 с помошью специфических ингибиторов сигнальных каскадов. (А) Плазмиды, экспрессирующие ЕвРР, Экк1, 1ВЯ и 1АЬК4 под контролем промотора Noggin2. (Б) Анализ экспрессии pNog2-EGFP в эмбрионах Хепорш методом ОТ-ПЦР с праймерами на ЕСРР. Значение приведены в относительных единицах, черточками показано стандартное отклонение. (В, В1) Типичный эмбрион на стадии 26, экспрессирующий ЕСЕР в области переднего мозга, вид спереди. (Г-Е') Область экспрессии ХВР1 (обозначена желтым пунктиром на Г) в эмбрионах на стадии 26, инъецированных смесью МО к Noggin2 с указанными плазмидами и Е1_£>. Интегральная плотность гибридизационного сигнала была измерена с помощью программы 1гг^е.1. (Ж) Статистический анализ интегральной плотности гибридизационного сигнала по двухвыборочному ^критерию Стьюдента для выборок разного размера с различной дисперсией с пороговым уровнем 0,001.___

Список публикаций по теме диссертации

1. Ерошкн» Ф.М.. Байрамов А.В., Мартынова Н.Ю., Зарайский А.Г.. Использование люциферазных репортерных конструкций для изучения способности белка Noggin2 ингибировать сигнальные каскады в эмбрионах шпорцевой лягушки. //

Биоорганическая химия, 2012, том 38, № 3, с. 385-388

2. Мартынова Н.Ю., Ермолина JI.B., Ерошкин Ф.М.. Гиоева Ф.К., Зарайский А.Г.. Транскрипционный фактор Xanfl взаимодействует с белком зиксином комплекса фокальной адгезии в раннем периоде развития головного мозга шпорцевой лягушки. //

Биоорганическая химия, 2008, том 34, №4, с. 573-576.

3. Bayramov A.V., Eroshkin F.M.*. Martynova N.Y., Ermakova G.V., Solovieva E.A., Zaraisky A.G. Novel functions of Noggin proteins: inhibition of Activin/Nodal and Wnt signaling. //

Development, 2011 Dec;138(24):5345-5356.

4. Martynova N.Y., Eroshkin F.M.. Ermolina L.V., Ermakova G.V., Korotaeva A.L., Smurova K.M., Gyoeva F.K., Zaraisky A.G. The LIM-domain protein Zyxin binds the homeodomain factor Xanfl/Hesxl and modulates its activity in the anterior neural plate of Xenopus laevis embryo. //

Developmental Dynamics, 2008 Mar;237(3):736-749.

5. Eroshkin F.M.. Ermakova G.V., Bayramov A.V., Zaraisky A.G. Multiple noggins in vertebrate genome: cloning and expression of noggin2 and noggin4 in Xenopus laevis. //

Gene Expression Patterns 2006 Jan;6(2):180-186.

6. Bayramov A.V., Martynova N.Y., Eroshkin F.M.. Ermakova G.V., Zaraisky A.G. The homeodomain-containing transcription factor X-nkx-5.1 inhibits expression of the homeobox gene Xanf-1 during the Xenopus laevis forebrain development. //

Mechanisms of Development. 2004 Dec;121(12):1425-1441.

7. Martynova N.Y., Eroshkin F.M.*. Ermakova G.V., Bayramov A.V., Gray J, Grainger R, Zaraisky A.G. Patterning the forebrain: FoxA4a/Pintallavis and Xvent2 determine the posterior limit of Xanfl expression in the neural plate. //

Development. 2004 May;131(10):2329-2338.

8. Eroshkin F.M., Kazanskaya O.V., Martynova N.Y., Zaraisky A.G. Characterization of cis-regulatory elements of the homeobox gene Xanf-1. //

Gene. 2002 Feb 20;285(l-2):279-286.

(* - совмещенное первое авторство)

Тезисы конференций

1. Ерошкин Ф.М., Байрамов А.В., Мартынова Н.Ю., Ермакова Г.В., Соловьева Е.А., Зарайский А.Г. Новые функции белков семейства Noggn: ингибирование сигнальных каскадов TGF-P и Wnt. V российский симпозиум "Белки и пептиды", Петрозаводск, Россия, август 2011.

2. Bayramov A.V., Eroshkin F.M., Martynova N.Y., Ermakova G.V, Solovieva E.A., Serebryakova M. and Zaraisky A.G. Noggin2 can modulate activin signaling and is essential for normal forebrain development. 16th International Society of Developmental Biologists Congress Edinburgh, august 2009, Scotland, U.K.

3. Zaraisky A.G, Ermakova G.V, Eroshkin F.M., Martynova N.Y, Novoselov V.V. Investigation of the the regulatory cascade of the homeobox gene Anf. HHMI Annual meeting 2002. Palm Cove, Australia.

1. Зарайский А.Г., Байрамов A.B., Ерошкин Ф.М. РФ Патент N 2354662 "Способ блокирования активности Activin с помощью Noggin2", 10 мая 2009 г.

2. Байрамов A.B., Ерошкин Ф.М.. Мартынова Н.Ю., Ермакова Г.В., Серебрякова М.В., Соловьева Е.А., Зарайский А.Г. РФ Патент N 2391352 "Способ блокирования сигнального пути, активируемого TGF-beta фактором Vgl в клетках животных", 10 июня 2010 г.

3. Байрамов A.B., Ерошкин Ф.М.. Мартынова Н.Ю., Ермакова Г.В., Серебрякова М.В., Соловьева Е.А., Зарайский А.Г. РФ Патент N 2407799 "Способ блокирования сигнального пути, активируемого TGF-beta фактором Derriere в клетках животных", 27 декабря 2010 г.

4. Байрамов A.B., Ерошкин Ф.М.. Мартынова Н.Ю., Ермакова Г.В., Серебрякова М.В., Соловьева Е.А., Зарайский А.Г. Патентная заявка РФ N 2011139524 "Способ блокирования сигнального пути, активируемого TGF-beta фактором Wnt8 в клетках животных с помощью белков семейства Noggin", 2011 г.

Патенты

Заказ № 73-П/04/2012 Подписано в печать 13.04.2012 Тираж 80 экз. Усл. п.л.1,3

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таП:info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ерошкин, Федор Михайлович, Москва

61 12-3/1139

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА

РАН

На правах рукописи

Ерошкин Федор Михайлович

Новые функции белков семейства Noggin: ингибирование сигнальных каскадов Activin/nodal и Wnt в эмбриональном развитии.

Специальность - 03.01.03 - молекулярная биология

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор А.Г. Зарайский

Москва, 2012

Оглавление

1. Введение 5

2. Обзор литературы 7

2.1. Общие принципы эмбриональной индукции. Нейральная индукция 7

2.2. Сигнальный каскад TGF-P 14

2.2.1. Суперсемейство TGF-J3 14

2.2.2. Каскад Activin/Nodal 17

2.2.3..Внеклеточная регуляция Activin-каскада 20

2.2.4. Рецепторы Activin 22

2.2.5. Регуляция рецепторов Activin 23

2.2.6. Регуляция сигнального каскада Activin через белки Smad 25

2.2.7. Гены-мишени Smad2 каскада 26

2.2.8. Smad-независимый сигнальный путь Activin и перекрестное действие рецепторов 27

2.2.9. Роль Activin и TGF-|3 в канцерогенезе. 27

2.2.10. Activin и стволовые клетки 31

2.2.11. Каскад BMP 34

2.2.12. Функции BMP 34

2.2.13. Внеклеточная регуляция ВМР-каскада 35

2.2.14. Внутриклеточная регуляция ВМР-каскада 39

2.2.15. Гены-мишени Smadl- (BMP-) каскада 40

2.3. Сигнальный каскад Wnt 42

2.3.1. Классификация активностей Wnt лигандов 43

2.3.2. Канонический путь Wnt (Wnt/(3-Catenin) 44

2.3.3. Планарная клеточная полярность (PCP) 46

2.3.4. Неканонический Wnt/Ca2+ путь 49

2.3.5. Секреция Wnt и внеклеточные регуляторы 51

2.3.6. Wnt-индуцированные клеточные ответы 54

2.4. Эволюционное происхождение сигнальных каскадов TGF-(3 и Wnt 58

2.5. Взаимодействие сигнальных каскадов в раннем развитии Xenopus 63

2.6. Регионализация нервной трубки в ходе эмбриогенеза 67

2.7. Семейство белков Noggin 74

2.7.1 Функциональная роль Noggin 75

2.7.2. Структура Noggin 76

2.7.3. Noggin как ингибитор BMP 78

2.7.4. Белок Noggin человека (HNoggin) 80

2.7.5. Мутации гена Noggin. 81

3. Полученные результаты 83

3.1. Клонирование и анализ последовательностей новых белков семейства Noggin 83

3.2. Изучение локализации экспрессии генов Noggin в раннем развитии шпорцевой лягушки 86

3.3. Изучение эффектов эктопической экспрессии генов Nogginl и -2 в раннем развитии шпорцевой лягушки 90

3.4. Изучение эффективности трансляции мРНК генов Nogginl и -2 в эмбрионах шпорцевой лягушки 93

3.5. Изучение лиганд-связывающих свойств белков Nogginl и -2 96

3.6. Nogginl и Noggin2 способны ингибировать активность Activin/Nodal- и Wnt-каскадов в живых эмбрионах 97

3.7. Nogginl и Noggin2 способны влиять на онтогенетические процессы, контролируемые Activin/Nodal- и Wnt- каскадами в эмбрионах 100

3.8. Активность Noggin2, но не Nogginl, необходима для нормального эмбрионального развития Xenopus 106

3.9. Ингибирование Activin-каскада посредством Noggin2 необходимо для развития переднемозговых структур 108

4. Обсуждение результатов 113

4.1. TGF-p лиганды (помимо BMP) и Wnt являются мишенями белков семейства Noggin 113

4.2. Ингибирование Activin-, BMP- и Wnt-каскадов посредством Noggin2 необходимо для развития переднемозговых структур 114

5. Выводы 116

6. Материалы и методы 117

6.1. Материалы 117

6.1.1 Реактивы 117

6.1.2. Ферментные препараты 118

6.1.3. Лабораторное оборудование 118

6.1.4. Лабораторные животные 119

6.1.5. Буферы и растворы 119

6.1.6. Микробиологические среды 121

6.1.7. Предоставленные штаммы 121

6.1.8. Предоставленные плазмиды 122

6.2. Методы 122

6.2.1. Амплификация ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) 122

6.2.2. Электрофорез в агарозном геле 122

6.2.3. Элюция ДНК из агарозного геля 122

6.2.4. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 123

6.2.5. Достройка 3"-конца двухцепочечных молекул ДНК 123

6.2.6. Отщепление выступающего 3" - конца двухцепочечных молекул ДНК 123

6.2.7. Лигирование молекул ДНК 123

6.2.8. Трансформация клеток Escherichia coli 124

6.2.9. Выделение плазмидной ДНК из бактерий Escherichia coli 124

6.2.10. Изготовление плазмидных ДНК конструкций 125

6.2.11. Транскрипция in vitro 132

6.2.12. Получение зародышей шпорцевой лягушки Xenopus laevis 133

6.2.13. Синтез белков в ооцитах или зародышах Xenopus laevis 133

6.2.14. Электрофоретическое разделение белков в денатурирующих условиях в ПААГ 133

6.2.15. Иммуноблот (Western Blotting) 134

6.2.16. Изучение белок-белковых взаимодействий в системе in vivo с помощью метода коиммунопреципитации 135

6.2.17. Блокирование трансляции эндогенных мРНК при помощи микроинъекций синтетических антисмысловых олигонуклеотидов 135

6.2.18. Фиксация зародышей 136

6.2.19. Гибридизация in situ на целых эмбрионах шпорцевой лягушки 136

6.2.20. Синтез дигоксигенин-меченной антисмысловой РНК для проведения гибридизации in situ 138

6.2.21. Экстракция тотальной РНК из зародышей шпорцевой лягушки. 139

6.2.22. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) 140

6.2.23. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) в реальном времени 140

6.2.24. Измерение люциферазной активности специфических репортеров 141

8. Список сокращений 144

7. Благодарности

143

9. Список использованной литературы

145

1. Введение

Одной из важнейших задач современной биологии развития является поиск и изучение факторов, обеспечивающих индукционные взаимодействия клеток и тканей в ходе эмбриогенеза. Секретируемый белок Noggin (Nogginl) является первым идентифицированным белковым фактором, участвующим в первичной эмбриональной индукции. Он был открыт Ричардом Харландом в 1992 г. у шпорцевой лягушки Xenopus как нейральный индуктор, продуцируемый шпемановским организатором. Nogginl способен связывать белки одной из субгрупп цитокинов TGF-(3, а именно Bone Morphogenetic Proteins (BMP) (Smith and Harland, 1992). Действуя вне клетки, BMP индуцирует ассоциацию специфических рецепторных серин-треониновых киназ I и II типа, что приводит к внутриклеточному фосфорилированию цитоплазматических белков Smadl/5/8, которые в паре со Smad4 мигрируют в ядро и регулируют ранскрипцию специфических генов-мишеней (Shi and Massague, 2003). Так как Noggin препятствует связыванию BMP с рецепторами (Groppe et al., 2002), это приводит к ингибированию сигнального пути, опосредованного Smadl/5/8. Благодаря этой функции, Nogginl, будучи эктопически экспрессирован в вентральной части эмбриона Xenopus, способен индуцировать вторичные оси, лишенные голов. В нормальном развитии Nogginl играет ключевую роль в различных процессах, включая индукцию нервной ткани и скелетной мускулатуры в раннем эмбриогенезе (Smith and Harland, 1992), развитие хрящей (Botchkarev et al., 1999) и дифференцировку волосяных фолликулов (Brunei et al., 1998; Botchkarev et al., 1999; Shi and Massague, 2003). Во многих экспериментальных системах, например, при изучении стволовых или раковых клеток, Nogginl используется в качестве искусственного ингибитора BMP-каскада. Считается общепризнанным, что Nogginl не является антагонистом для другой субгруппы лигандов TGF-J3, Activin/Nodal/TGFbeta, которые связываются с другими серин-треонин киназными рецепторами и регулируют транскрипцию другого набора генов-мишеней через внутриклеточный белок-посредник Smad2/3 (Branford and Yost, 2002). Известно, что ингибирование этого сигнального пути необходимо для правильной разметки

мезодермы при гаструляции (Piccolo et al., 1999), развития переднего мозга (Meno et al., 2001) и установления право-левой ассимметрии (Grande and Patel, 2009).

Помимо "классического" Noggin 1, у позвоночных были найдены две других группы белков семейства Noggin, Noggin2 и Noggin4 (Furthauer et al., 1999; Fletcher et al., 2004; Eroshkin et al., 2006). Биологическая функция была показана в экспериментах только для Noggin2, который экспрессируется специфически в зачатке конечного мозга эмбрионов Xenopus и Danio. На основании этих данных было предположено, что Noggin2 может, по большей части, дублировать ВМР-антагонистическую функцию Nogginl (Furthauer et al., 1999). Однако, по нашему предположению, значительные различия в первичной структуре белков Noggin, которые принадлежат к разным белковым подсемействам (Eroshkin et al., 2006), и различающиеся паттерны их экспрессии указывают на возможные различия в репертуаре связываемых ими белков и предполагают различную биологическую функцию.

В связи с этим, задача настоящей работы - изучение механизмов функционирования данных белков и их роли в ранней тканевой дифференцировке - представляется весьма актуальной, как с точки зрения получения новых фундаментальных знаний, так и ввиду необходимости создания новых генно-инженерных продуктов для специфичного управления процессами жизнедеятельности и дифференцировки клеток.

Особенностью данной работы является использование в качестве основной экспериментальной модели эмбрионов шпорцевой лягушки Xenopus. Данная модель признается одной из наиболее перспективных для изучения механизмов реализации генетической информации в раннем эмбриогенезе и, кроме этого, представляет собой удобную тест-систему, позволяющую исследовать процессы in vivo.

2. Обзор литературы

2.1 Общие принципы эмбриональной индукции. Нейральная индукция

Эмбриональная индукция — взаимодействие между частями развивающегося организма у многоклеточных животных. Явление было открыто в 1901 году при изучении образования зачатка хрусталика глаз у зародышей земноводных. При удалении зачатка глаза линза не возникала. Зачаток глаза, пересаженный на бок зародыша, вызывал образование линзы из эктодермы, которая в норме должна была дифференцироваться в эпидермис кожи.

Гипотезу о механизме дифференцировки, получившем название эмбриональной индукции, на основании экспериментальных данных выдвинули Шпеман и Мангольд в 1924 году. Согласно этой гипотезе, существуют определенные клетки, которые действуют как организаторы на другие, подходящие для этого клетки. В условиях отсутствия клеток-организаторов такие клетки пойдут по другому пути развития, отличном от того, в котором они развивались бы в присутствии организаторов. Г. Шпеман и его сотрудница X. Мангольд открыли у зародышей амфибий «организатор». Решающий эксперимент был проведен Хильдой Мангольд в 1921 году. Она вырезала кусочек ткани из дорсальной губы бластопора гаструлы гребенчатого тритона (Triturus cristatus) со слабопигментированным зародышем, и пересадила ее в вентральную область другой гаструлы близкого вида, тритона обыкновенного (Т. vulgaris), зародыш которого характеризуется обильной пигментацией. Эта естественная разница в пигментации позволила различить в химерном зародыше ткани донора и реципиента. Клетки дорсальной губы при нормальном развитии образуют хорду и мезодермальные сомиты (миотомы). После пересадки у гаструлы-реципиента из тканей трансплантата развивалась вторая хорда и миотомы. Над ними из эктодермы реципиента возникала новая дополнительная нервная трубка. В итоге это привело к образованию осевого комплекса органов второго головастика на том же зародыше (Spemann and Mangold, 1924) (рис.1).

(А)

(В)

Рис. 1. Схема экспериментов Шпемана и Мангольд.

Однако индукция, открытая Шпеманом и Мангольд, у эмбрионов амфибий не является самой ранней в ходе эмбриогенеза. Ньюкуп (№егг\¥коор, 1973) брал у зародыша тритона клетки из крыши бластоцеля и помещал их вблизи богатых желтком вегетативных клеток дна бластоцеля, и из этих анимальных клеток развивались не производные эктодермы, а мезодермальная ткань. Поскольку в норме мезодерму образуют анимальные клетки, которые прилежат к предшественникам энтодермы, то вегетативные бластомеры оказывают влияние на прилежащие клетки, побуждая их дифференцироваться в мезодермальные ткани. Эта индукция называется ньюкуповской, а дорсальные вегетативные клетки — соответственно ньюкуповским организатором.

Изучение феномена индукции позволило сформулировать некоторые закономерности. Некоторые индукторы более или менее специфичны в определении судьбы индуцируемой ткани. Об этом свидетельствуют следующие опыты. Если пересадить спинную губу ранней гаструлы, то индуцируется развитие структур переднего мозга (головной индуктор), если же пересадить дорсальную губу поздней гаструлы, то развиваются спинной мозг и мезодермальные ткани (т.н.

И

туловищный индуктор, рис.2).

\

Оогез! 1|р

\/г

0 * О-

МшдаЛотс!

Рис.2. Результат пересадки раннего (А) и позднего (Б) организаторов.

Было показано также, что наиболее сильное нейрализующее влияние оказывает фракция нуклеопротеинов, а мезодермализующим индуктором оказался белок. Если имплантировать оба эти индуктора в виде смеси клеток или смеси веществ, то получаются хорошо развитые зародыши. Другие индукторы действуют как неспецифические пусковые механизмы, как бы высвобождая ответ, уже детерминированный в клетках индуцируемой ткани. Было показано, что, например, слуховой пузырек выступает не только в роли индуктора слухового аппарата, но и является активатором различных морфогенетических процессов. Его пересадка в область боковой линии эмбриона тритона влечет за собой индукцию конечности. Конечность можно индуцировать также пересадкой носовой плакоды или гипофиза. Легче всего добавочные конечности индуцируются в области боковой линии, но они могут быть получены и на брюшной стороне. Эти примеры указывают на то, что специфический ответ зависит не столько от индуктора, сколько от реагирующей области.

Способность эмбрионального материала реагировать на различного рода влияния изменением своей презумптивной судьбы получила название компетенции. Установлено, например, что компетенция к образованию нервной системы у амфибий затрагивает всю эмбриональную эктодерму и возникает с момента начала гаструляции. К концу гаструляции эта компетенция прекращается. Таким образом, изменение хода развития возможно лишь в том случае, если область компетенции к образованию некоторой закладки шире, чем область, из

которой она в норме развивается, а также если индукционное действие происходит в определенный интервал онтогенетического развития.

Говард Хольцер (Нокгег, 1968) выделил два основных типа тканевых взаимодействий. К первому типу относятся пермиссивные (разрешающие) взаимодействия. При этом отвечающая ткань потенциально готова к экспрессии и нуждается только в определенных условиях, которые разрешили бы экспрессию ее признаков. Большинство индукций являются пермиссивными, т.е. индуктор лишь осуществляет запуск процесса, исход которого уже предопределен свойствами самой ткани. Другой тип тканевых взаимодействий - инструктивные взаимодействия. При такого рода взаимодействиях изменяется тип отвечающей ткани. К такому типу индукции относится способность хорды индуцировать формирование будущих клеток дна нервной трубки. На сигнал со стороны хорды способны реагировать все клетки нервной трубки, но индуцируются только ближайшие к хорде. Другие будут дифференцироваться в ином направлении. Кроме того, если у зародыша удалить хорду, то клетки, дающие при нормальном развитии дно будущей нервной трубки, будут дифференцироваться по другому типу, а если зародышу имплантировать дополнительную хорду сбоку от нервной трубки, то эта новая хорда индуцирует вторичный набор клеток дна будущей нервной трубки. Поэтому хорду называют тканью, действующей инструктивно.

Кроме того, различают гетерономную и гомономную виды индукции. К гетерономной относят случаи, подобные описанному, при которых один фрагмент зародыша индуцирует иной орган (хордомезодерма индуцирует появление нервной трубки и всего зародыша в целом). Гомономная индукция заключается в том, что индуктор побуждает окружающий материал к развитию в том же направлении, что и он сам. Например, область нефротома, пересаженная другому зародышу, способствует развитию окружающего материала в сторону формирования головной почки, а прибавление в культуру фибробластов сердца маленького кусочка хряща влечет за собой процесс образования хряща.

Еще Шпеманом было показано, что инактивированные нагреванием ткани организатора сохраняют индуцирующую активность и среда из-под изолированного организатора также индуцирует эктодерму. Организатор присутствует у зародышей всех позвоночных животных. В 30-е гг. исследователи

пытались установить природу индуцирующего действия. Вскоре выяснилось, что разнообразные убитые ткани, вытяжки из самых различных тканей беспозвоночных и позвоночных животных, а также растений, несколько классов химических соединений (белки, нуклеопротеины, стероиды и даже неорганические вещества) могут вызывать индукцию. Таким образом была установлена химическая природа организаторов. Однако попытки идентифицировать молекулы индуктора оказывались безуспешными. Спустя некоторое время после экспериментов Шпемана интерес к индуктору ослаб, и природа индукционных сигналов долго оставалась неясной (Cooke et al. 1987).

Ситуация изменилась, когда в экспериментальной эмбриологии стали широко применяться молекулярно-биологические методы, позволившие выявить молекулярные события, лежащие в основе явления нейральной индукции (Hemmati-Brivanlou and Melton 1992; Hemmati-Brivanlou et al. 1994; Hemmati-Brivanlou and Melton 1994). Были описаны молекулы с прямой нейрализующей активностью, т. е. способные индуцировать образование нейральных структур в эктодерме без сопутствующего образования мезодермы. Первой такой молекулой стал белок Noggin, открытый Ричардом Харландом в 1992 г. (Smith and Harland 1992). Вскоре бы