Изучение свойств и молекулярных механизмов действия Rho ГТФазы Chp/Wrch2

Шепелев, Михаил Валентинович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение свойств и молекулярных механизмов действия Rho ГТФазы Chp/Wrch2
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение свойств и молекулярных механизмов действия Rho ГТФазы Chp/Wrch2"

На правах рукописи

005020594

Шепелев Михаил Валентинович

Изучение свойств и молекулярных механизмов действия Шш ГТФазы СЬрА¥гсЬ2

Специальность 03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДПР 2012

МОСКВА 2012

005020594

Работа выполнена в лаборатории молекулярной онкогенетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Коробко Игорь Викторович

Официальные оппоненты:

Прасолов Владимир Сергеевич, доктор биологических наук, профессор, ИМБ РАН, заведующий лабораторией

Ведущая организация:

Соболев Александр Сергеевич, доктор биологических наук, профессор, ИБГ РАН, заведующий лабораторией

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Защита диссертации состоится

апреля 2012 года

в« У/

» часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан

«г?-*

марта 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета канд. фарм. наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Жизнедеятельность всех клеток эукариот подвержена сложной регуляции, в которой важную роль играют внеклеточные стимулы, такие как гормоны, факторы роста, цитокины, молекулы внеклеточного матрикса и многие другие. Внеклеточные молекулы, взаимодействуя со своими рецепторами на поверхности клеток, вызывают активацию внутриклеточных сигнальных каскадов, представляющих собой цепь белок-белковых взаимодействий и биохимических реакций. В конечном итоге в результате активации определенного сигнального каскада в клетке формируется адекватный биологический ответ на поступивший внеклеточный стимул.

Представители суперсемейства Яая-подобных ГТФаз, к которым относится семейство Шю ГТФаз, являются одними из ключевых регуляторов множества сигнальных путей у эукариот. Семейство Шю ГТФаз человека насчитывает 20 белков, разделяемых на 8 подсемейств. «Атипичная» Шю ГТФаза СЬр/Шю\7\УгсЬ-2 и ее близкий гомолог \УгсЬ-1/Шюи составляют подсемейство Шюи/У.

Мо ГТФазы реализуют свои биологические функции через специфические взаимодействия с белками-эффекторами. Очевидно, что чем шире спектр известных эффекторов ГТФазы, тем глубже наши представления о свойствах и функциях этой ГТФазы. Поэтому одним из главных подходов к изучению молекулярных механизмов действия Шю ГТФаз является поиск специфических белков-партнеров по взаимодействию. Опираясь на свойства и функции обнаруженных белков, можно ассоциировать ГТФазу с определенным клеточным процессом, в который вовлечен ее партнер по взаимодействию.

К настоящему времени был идентифицирован ряд потенциальных эффекторов ГТФазы СЬр, включающий р21-активируемые киназы (Рак1, Рак2 и Рак4) и белки >)-\УА8Р, Рагб и МЬКЗ, и выявлено участие СЬр в ряде клеточных процессов. В частности, СЬр может активировать протеинкиназы Рак1 и ЖК, регулировать локализацию Е-кадгерина на адгезионных межклеточных контактах при участии протеинкиназы Рак1 и белка (ЗР1Х, а также участвует в дифференцировке клеток нервного гребня. Тем не менее, молекулярные механизмы действия ГТФазы СЬр во многом остаются неизвестными. Это определяет актуальность исследования свойств белка СИр для расширения фундаментальных представлений о биологии клеток эукариот и о сигнальных путях, регулируемых Шю ГТФазами.

Кроме того, белок СЬр способен вызывать злокачественную трансформацию фибробластов мыши. Это определяет актуальность исследования свойств ГТФазы СЬр с прикладной точки зрения, так как это способствует более глубокому пониманию механизмов возникновения и прогрессии опухолей, а в перспективе - выявлению новых молекулярных мишеней для направленного воздействия.

Важно отметить, что в настоящее время находят все более широкое применение лекарственные средства направленного действия («таргетные» препараты), влияющие на различные этапы процессов внутриклеточной передачи сигнала, от лиганд-рецепторных взаимодействий до процессов, протекающих в ядре клеток. Поэтому изучение белков, участвующих во внутриклеточных сигнальных каскадах, безусловно, важно не только для расширения фундаментальных представлений о биологии клеток эукариот, но и для понимания молекулярных механизмов патогенеза различных заболеваний человека и выявления новых молекулярных мишеней для направленного воздействия на них.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось выявление и изучение новых свойств и функций атипичной Rho ГТФазы Chp.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Исследовать взаимодействие белка Chp с возможными эффекторами, протеинкиназами Рак5 и Ракб.

2. Провести поиск новых белков, взаимодействующих с ГТФазой Chp, с помощью различных экспериментальных подходов.

3. Создать экспериментальную модель для изучения влияния ГТФазы Chp на клеточные процессы.

4. Выявить и исследовать клеточные процессы, в которых принимает участие ГТФаза Chp.

5. Изучить экспрессию гена RHOV, кодирующего белок Chp, в образцах немелкоклеточного рака легких человека.

Научная новизна и практическая ценность работы

ГТФаза Chp является одним из наименее изученных представителей семейства Rho ГТФаз человека, что определяет актуальность исследования свойств и функций Chp с точки зрения понимания фундаментальных механизмов функционирования клеток и организма. Исследуя молекулярные механизмы действия Chp, нами был идентифицирован ряд новых белков-партнеров по взаимодействию с ГТФазой Chp. Это открывает дальнейшие перспективы для изучения клеточных процессов, в которых принимает участие Chp. Выявленные в данной работе взаимодействие Chp с белком IRSp53 и способность Chp индуцировать формирование филоподий, вместе с ранее описанным Chp-зависимым формированием ламеллиподий и фокальных контактов, предполагают участие Chp в контроле адгезионных, миграционных и инвазивных свойств клеток, изменения которых лежат в основе процесса метастазирования. Кроме того, была выявлена способность Chp взаимодействовать с Р -тубулином и микротрубочками, что является механистической основой для возможной роли Chp как регулятора координированных перестроек

актинового и микротрубочкового цитоскелетов клеток. Наконец, в результате работы впервые была выявлена способность Chp вызывать апоптотическую гибель клеток линии PC12TetOn, частично опосредованную активацией протеинкиназы JNK. Таким образом, результаты работы существенно расширяют представления о фундаментальных свойствах атипичной Rho ГТФазы Chp. Кроме того, было выявлено частое повышение уровня транскрипта гена RHOV, кодирующего белок Chp, при немелкоклеточном раке легких человека. Высокая специфичность экспрессии RHOV для опухолей легкого открывает перспективы использования уровня экспрессии гена RHOV в качестве молекулярного маркера рака легких. Современные тенденции в молекулярной медицине указывают на то, что персонализированная медицина будет получать все большее распространение. Статус экспрессии гена RHOV в перспективе может быть использован как биомаркер, используемый в диагностических и/или прогностических целях. Это определяет практическую значимость результатов работы, так как в настоящее время существуют насущная потребность в улучшении методов, как диагностики, так и лечения рака легких, одного из наиболее распространенных онкологических заболеваний человека. Полученные нами данные предполагают участие Chp как в контроле миграционных и инвазивных свойств клеток, так и в регуляции внутриклеточных сигнальных путей, гиперакгивация которых наблюдается в опухолевых клетках. Результаты данной работы являются основанием для дальнейшего исследования роли Chp в процессах возникновения и прогрессии опухолей, а также позволяют рассматривать Chp как потенциальную молекулярную мишень для противоопухолевой терапии.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на международной научной школе для молодых ученых «The ЕМВО / FEBS Advanced Lecture Course on the Island of Spetses - Molecular mechanisms in signal transduction and cancer» (Spetses, Greece, 15-26 August, 2005), на XVII (Москва, Россия, 10-13 Февраля, 2005) и XX (Москва, Россия, 11-15 Февраля, 2008) Международных зимних молодёжных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; на международных конференциях «International Conference on Biomolecular Science in honor of the 75lh anniversary of the birth of Professor Yuri Ovchinnikov (1934-1988)» (Moscow-Pushchino, Russia, September 28-October 2,2009), «EMBO Conference Series Microtubules -Structure, Regulation and Functions» (Heidelberg, Germany, 2-5 May, 2010); на международном симпозиуме «Control of gene expression and cancer» (Moscow, Russia, 21-25 June, 2010), на VII международном симпозиуме «Biological foundations of therapy of oncological and hematological diseases» (Moscow, Russia, 1-4 June, 2011), на международном симпозиуме «U.S.-Russia Scientific Forum Meeting» (Moscow, Russia, 16-18 November, 2011).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ. Из них статей в рецензируемых научных журналах - 3, тезисов в материалах конференций, школ и симпозиумов - 8, патентов -1.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на I SB страницах, содержит 3>-S рисунков, таблиц и

включает следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы»^ «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы» цитированных работ).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Идентификация протеинкиназ Рак5 и Ракб как новых потенциальных эффекторов ГТФазы Chp

Ранее было выявлено взаимодействие ГТФазы Chp с протеинкиназами Pakl, Pak2 и Pak4, однако взаимодействие с другими белками семейства Рак не исследовалось. Поэтому была исследована возможность взаимодействия Chp с протеинкиназами Рак5 и Ракб, наименее охарактеризованными на данный момент представителями семейства Рак. В результате анализа в дрожжевой двугибридной системе было обнаружено, что активная форма Chp G40V и белок дикого типа, но не неактивная, ГДФ-связанная форма Chp S45N, взаимодействуют с Рак5 и Ракб (Рис. 1А и Б). Таким образом, впервые было продемонстрировано специфическое взаимодействие между ГТФазой Chp и протеинкиназами Рак5 и Ракб.

Для более детального изучения взаимодействия была выбрана протеинкиназа Ракб. Для подтверждения возможности взаимодействия Chp и Ракб исследовалось их взаимодействие в лизатах клеток млекопитающих с помощью коиммунопреципитации (ко-ИП), и было обнаружено, что Ракб копреципитируется с Chp G40V и Chp дикого типа (Рис. 2). Так же, как и в двугибридной системе, было установлено что, активная форма Cdc42 Q61L взаимодействует с Ракб, тогда как взаимодействие между Wrch-1 Q107L и Ракб было значительно слабее по сравнению с Cdc42 Q61L или Chp G40V (Рис. 2). В целом данные, полученные в дрожжевой двугибридной системе, и результаты ко-ИП указывают на то, что Chp взаимодействует с Ракб только в активной, ГТФ-связанной форме. Полученные результаты позволяют рассматривать протеинкиназы Рак5 и Ракб как потенциальные эффекторы ГТФазы Chp.

Анализ молекулярных механизмов взаимодействия Chp и Ракб

Cdc42 связывается с последовательностью из 16 аминокислот, называемой CRIB (Cdc42/Racl interactive binding), которую находят у многих эффекторов Cdc42, включая белки семейства Рак. Замена консервативных остатков гистидина на лейцин в CRIB-носледовательности Pakl (Pakl

H83,86L) нарушает взаимодействие Pakl с ГТФазами Cdc42, Racl и Clip. Исследование способности Chp взаимодействовать с протеинкиназой Ракб, содержавшей гомологичные замены в CRIB-последовательности, показало, что в дрожжевой двугибридной системе Ракб H20,23L не взаимодействует ни с Chp G40V, ни с Cdc42 Q61L (Рис. 1Б). Результаты ко-ИП показали, что мутации в CRIB-последовательности Ракб существенно снижают связывание с активными формами ГТФаз Cdc42 и Chp по сравнению с Ракб дикого типа (данные не приведены). Эти данные свидетельствуют о том, что CRIB-последовательность Ракб участвует во взаимодействии с Chp.

Cdc42 Q61L в D Ul

Wrch-1 Q107L О в □ 2П

Chp G40V □□ □□□

Chp wt □□ □ □□□

Chp S45N pPC97 в □□□

il ■ a □□□

Chp S45N рРС97

СО ra Q. X со ¿S CO Q. СО со о 0. о. X со со (о 59 J* о аз го Q. Q- 0. Q.

В в □ПО

В в шшшяш нян штет yu-;:

□ в в □□□

□ в □ □□□

в в □О

в в в ООО

Рис. 1. СЬр взаимодействует с Рак5 и Ракб в дрожжевой двугибридной системе. Дрожжи З.сегеушае штамма У153, компрессирующие Рак5 или Рак5 Н19,22Ь (А), и Ракб или Ракб Н20,23Ь (Б), слитые с активационным доменом транскрипционного фактора вАЬ4 (САЬ4АП), или только САЬ4АО (рРС86) и указанные И^ю ГТФазы или их мутантные формы, слитые с ДНК-связывающим доменом транскрипционного фактора вАЬ4 (ОАЬ4ВО), или только САЬ4ВБ (рРС97), растили в присутствии (25 мМ) или в отсутствии (0 мМ) 3-амино-1,2,4-триазола (ЗАТ). Активацию репортерного гена Я/В оценивали по способности дрожжей расти в присутствии ЗАТ.

FLAG-Pak6

Пустой Cdc42 Wrch-1 Chp вектор Q61L Q107L G40V

Chp

ИП: FLAG

ИП: c-myc

Лизат: FLAG

Лизат: c-myc

IgG

Рис. 2. СЬр взаимодействует с Ракб в лизатах клеток млекопитающих. Плазмиду для продукции Ракб с РЬАО-эпитопом трансфицировали в клетки НЕК293 вместе с плазмидами для продукции активных форм ГТФаз и СЬр дикого типа (\у1) с шус-эпитопом или вместе с «пустым» вектором и через 48 ч после трансфекции проводили ко-ИП. Показаны результаты Вестерн-блот анализа

иммунопрецилитатов (ИП) и лизатов (Лизат) с использованием указанных антител. * - СЬр и \УгсЬ-1; ** - Cdc42; - легкие цепи антител, использованных в ко-ИП.

Эффекторный домен Rho ГТФаз необходим для взаимодействия с эффекторами, а точечные мутации в данном домене достаточны для нарушения взаимодействия с определенным

эффектором. Ранее был описан ряд мутаций в эффекторном домене Сс1с42 и других ГТФаз, которые влияли на связывание с различными эффекторами, включая протеинкиназы Рак, однако подобные мутации не были описаны для СЬр. Поэтому для изучения роли эффекторного домена ГТФазы СЬр во взаимодействии с Ракб были введены эквивалентные мутации (Т63А, Ь65А, Б66А и Б68С) в эффекгорный домен в контексте активной формы СЬр С40У, и было оценено их влияние на взаимодействие с Ракб в ко-ИП. При этом было установлено, что мутации Т63А, 1.65А и 066А, но не Р68С, существенно нарушают взаимодействие П^АО-Ракб с шус-СЬр в40У (данные не приведены). Таким образом, впервые были охарактеризованы мутации эффекторного домена ГТФазы СЬр. Полученные данные подтверждают специфичность взаимодействия СЬр и Ракб, и свидетельствуют о том, что СЬр связывается с Ракб через эффекторный домен, а аминокислотные остатки Т63,1.65 и Обб критически важны для взаимодействия с Ракб.

СЬр не влияет на уровень фосфорилирования аминокислотного остатка 8560 у Ракб

Протеинкиназа Ракб, как и все протеинкиназы подсемейства Рак II, обладает высоким уровнем базальной каталитической активности, а взаимодействие с активной формой С(1с42 не увеличивает киназную активность Ракб. Было показано, что статус фосфорилирования остатка Б560 в каталитическом домене Ракб может быть использован как индикатор уровня активности Ракб. Поэтому была исследована возможность регуляции киназной активности Ракб ГТФазой СЬр посредствам влияния на статус фосфорилирования остатка 8560 и было установлено, что уровень фосфорилирования Б560 у РЬАО-Ракб, экспрессированной вместе с контрольным «пустым» вектором, был сходен с таковым у РЬАО-Ракб, экспрессированной вместе с активными формами как С<1с42, так и СЬр (данные не приведены). На основании этих данных можно сделать вывод, что, как и Сс1с42, СЬр, по-видимому, не активирует Ракб или, по меньшей мере, не вызывает повышение уровня фосфорилирования аминокислотного остатка 8560.

СЬр колокализуется с Ракб на везикулярных структурах в клетках 1ЧС1-Н1299

Для дальнейшего подтверждения данных белок-белковых взаимодействий и выявления внутриклеточных структур, на которых могут быть локализованы белки СЬр и Ракб, исследовали возможность колокализации СЬр и Ракб в клетках карциномы легкого N0-111299. Было обнаружено, что транзиторно продуцируемый белок Ракб, слитый с Ев ИР (ЕОРР-Ракб), часто локализуется на везикуло-подобных структурах в цитозоле клеток N01-111299 и НеЬа В (данные не приведены). Далее при оценке возможной колокализации ЕОРР-Ракб и РЬАв-СЬр было установлено, что при транзиторной продукции данные белки действительно колокализуются на везикулярных структурах (Рис. 3). При этом колокализация наблюдалась лишь в случае активной формы ГТФазы СЬр в40У. Неактивная форма СЬр 845Ы не колокализовалась с Ракб, хотя белок СЬр Б45М также был локализован на точечных структурах в цитозоле (Рис. 3). Таким образом,

колокализация СЬр и Ракб указывает на возможность взаимодействия этих белков в клетках и открывает перспективы дальнейшего изучения функциональных следствий их взаимодействия посредствам характеризации везикулярных структур, на которых наблюдается колокализация СЬр и Ракб.

Рис. 3. СИр колокализуется с Ракб на везикулярных структурах в клетках N€1-111299. Клетки ЫС1-Н1299, транзиторно трансфицированные плазмидами для продукции ЕвРР-Ракб (зеленый канал, левые панели) и РЬАС-СЬр в40У или РЬАО-СЬр Б45М (красный канал, центральные панели), окрашивали первичными кроличьими анти-РЬАО антителами и далее вторичными , антителами против иммуноглобулинов кролика, конъюгированными с флуоресцентным красителем А1ехаР1иог546. На панелях справа (Наложение) показано наложение зеленого и красного каналов. На вставках под основными панелями показано увеличенное изображение I областей, выделенных белыми прямоугольниками.

Поиск белков взаимодействующих с СЬр в дрожжевой двугибридной системе

С целью поиска новых белков, взаимодействующих с ГТФазой СЬр, был проведен скрининг кДНК-библиотеки мозга человека в дрожжевой двугибридной системе. В результате скрининга был выявлен ряд клонов, кодирующих белки, специфически взаимодействующие с активной формой СЬр и белком дикого типа, но не с неактивной формой ГТФазы СЬр. 13 клонов содержали кДНК белка П18р53, который является эффектором ЯЬо ГТФаз С<1с42 и Яас1, и вызывает формирование филоподий и ламеллиподий, представляющих собой богатые актиновыми микрофиламентами выпячивания плазматической мембраны, играющие важную роль в клеточной подвижности.

Картирование фрагмента 1И5р53, необходимого для взаимодействия с СЬр

Ранее было установлено, что Cdc42 связывается с частичной CRIB-последовательностью IRSp53 (268-280 аминокислотные остатки, а.о., Рис.4), находящейся в пределах I-BAR домена, а мутация трех аминокислотных остатков в пределах CRIB-последовательности (I268A, S269A, Р271А) блокирует связывание с Cdc42. Так как Chp является гомологом Cdc42 и взаимодействует с рядом эффекторов через CRIB-последовательность, то было исследовано влияние указанной тройной мутации на взаимодействие IRSp53 и Chp в дрожжевой двугибридной системе. При этом было установлено, что данные мутации не влияют на связывание Chp и IRSp53 (данные не приведены). Этот результат указывает на то, что CRIB-последовательность у IRSp53 не является мишенью для Chp. ГТФаза Racl связывается со многими эффекторами через CRIB-последовательность, однако Racl связывается с участком I-BAR домена IRSp53, отличным от CRIB, и включающим 180-228 а.о. Поэтому далее была исследована возможность связывания Chp с данным фрагментом IRSp53 в дрожжевой двугибридной системе. В результате анализа взаимодействия Chp с различными делеционными мутантами IRSp53 в дрожжевой двугибридной системе было установлено, что сайт взаимодействия с Chp находится в районе 180-228 а.о. IRSp53, что совпадает с результатами, полученными ранее для Rae 1 (Рис.4).

Рис. 4. Схема доменной организации белка IRSp53 и фрагментов доменов, использованных для картирования сайта взаимодействия с Chp.

Цифрами справа от рисунка показаны а.о., которые включали в себя фрагменты белка IRSp53. Красным цветом выделены а.о. фрагментов,

взаимодействовавших с Chp в дрожжевой двугибридной системе. Полноразмерный белок IRSp53 - 521 а.о.; 1-BAR домен - 1-250 а.о.; частичный CRIB-домен - 268-280 а.о.; SH3 домен - 378-434 а.о.; сайт связывания доменов типа WW1 - 468-471 а.о.

Взаимодействие Chp и IRSp53 в лизатах клеток млекопитающих

Для подтверждения возможности взаимодействия Chp и IRSp53 в лизатах клеток млекопитающих, проводили ко-ИП. При этом было установлено, что все три формы Chp преципитируют IRSp53 (Рис. 5). В контрольном образце (дорожка «-») не наблюдалось преципитации IRSp53 в отсутствие ГТФазы Chp, что подтверждает специфичность связывания Chp и IRSp53. |

Для подтверждения возможности взаимодействия Chp с IRSp53 проводили GST пул-даун анализ с использованием рекомбинантного белка Chp, слитого с глутатион-8-трансферазой (GST-

Chp). В итоге было выявлено, что белок GST-Chp, нагруженный как ГТФуЭ (негидролизуемый I

SH]-

аналог ГТФ), так и ГДФ, преципитировал эндогенный белок IRSp53 из цитозольной фракции клеток линии HeLa В. В то же время белок GST, нагруженный как ГТФуЭ , так и ГДФ, не преципитировал IRSp53 (Рис. 6). Полученные данные указывают на возможность взаимодействия ГТФазы Chp с эндогенным белком IRSp53. В данном эксперименте, как и при проведении ко-ИП, наблюдалось нуклеотид-независимое связывание GST-Chp и IRSp53. Это указывает на то, что взаимодействие между Chp и IRSp53 может не зависеть от активации Chp.

myc-IRSp53

FLAG-Chp: ИП: анти-myc

ИП: анти-FLAG Лизат: анти-myc Лизат: анти-FLAG

GV wt SN

Рис. 5. Коиммунопреципитация белков СЬр и Ш8р53, транзиторно продуцированных в клетках НЕК293.

Плазмиду для продукции Ж3р53 с тус-эпитопом трансфицировали в клетки НЕК293 вместе с плазмидами для продукции ГТФазы СЬр с РЬАО-эпитопом (СУ - СЬр в40У; М - СЬр дикого типа; БЫ -СЬр 545Ы) или вместе с «пустым» вектором (-). Через 48 ч после трансфекции получали клеточные лизаты и белки с РЬАО-эпитопом преципитировали с помощью анти-РЬАО-агарозы. Показаны результаты Вестерн-блот анализа иммунопреципитатов (ИП) и лизатов (Лизат) с использованием анти-шус и анти-РГАО-антител.

Колокализация СИр и Ш8р53 на филоподиях в клетках НеЬа В

Для дальнейшего подтверждения взаимодействия СЬр с ЖБр53 проводили иммунофлуоресцентное окрашивание клеток НеЬа В, коэкспрессирующих тус-СЬр и РЬАв-1 iRSp53. Ранее было показано, что Щ3р53 вызывает формирование филоподий в различных клеточных линиях и локализуется на филоподиях. Было установлено, что при транзиторной продукции СЬр и Ж5р53 действительно колокализуются на филоподиях (Рис. 7). При этом колокализация зависела от активационного состояния ГТФазы СЬр, так как в случае СЬр S45N не наблюдалось колокализации с ЖБр53 на филоподиях, и количество и длина филоподий были 'I меньше, чем при экспрессии активных форм СЬр. Результаты этого эксперимента указывают на возможность взаимодействия между СЬр и ЖБр53 в клетках.

GST

GST-CbP Лизат ГДФ ГТФуЭ ГДФ ГТФуЭ 1/150V

aHTH-IRSp53

Окраска Кумасси

GST-

Рис. 6. GST-Chp преципитнрует эндогенный белок IRSp53 из цитозольной фракции клеток HeLa В. GST или GST-Chp нагружали указанными

нуклеотидами (ГТФуБ и ГДФ) и GST-Cho инкУбировали с цитозолем клеток линии HeLa В. GST и GST-Chp осаждали с помощью глутатион-сефарозы, связавшиеся белки элюировали и анализировали с

помощью Вестерн-блотгинга с использованием aHTH-IRSp53 антител. Параллельно образцы разделяли с помощью ДСН-ПААГ и окрашивали гель с помощью красителя Кумасси для выявления рекомбинантных белков GST и GST-Chp.

Рис. 7. Колокализация ЕОКР-СЬр и ПАС-ШЙрзЗ на филоподиях в клетках НеГ а В. Клетки НеЬа В, транзиторно экспрессирующие ЕвРР-СЬр в40У, ЕвРР-СЬр, ЕСРР-СЬр845Ы (зеленый канал, левые панели) и РЬАС-1К5р53 (красный канал, центральные панели), окрашивали первичными кроличьими анти-НАО антителами и вторичными антителами против иммуноглобулинов кролика, конъюгированными с флуоресцентным красителем А1ехаР1иог546. На панелях справа (Наложение) показано наложение зеленого и красного каналов. На вставках под основными панелями показано увеличенное изображение областей, выделенных белыми прямоугольниками.

ГТФаза СЬр вызывает формирование филоподий в клеточной линии НсЬа В

Так как белок !Л5р53 вызывает формирование филоподий, и наблюдается колокализация СЬр и Ш5р53 на филоподиях, то было предположено, что СЬр сам по себе также может вызывать формирование филоподий в клетках НеЬа В. Для проверки данного предположения в клетках НеЬа В транзиторно продуцировали различные формы ГТФазы СЬр, слитые с ЕОРР, и оценивали формирование филоподий. При этом было обнаружено, что только активные формы СЬр, но не СЬр 545Ы, вызывают формирование филоподий (Рис. 8). Удаление С-концевого домена СЬр у активной формы ГТФазы блокировало ее способность вызывать формирование филоподий (Рис. 8). Эти результаты подтверждают специфичность эффекта СЬр и указывают на то, что для реализации своих биологических функций ГТФаза СЬр должна находится в активном состоянии и быть локализована на плазматической мембране.

Полученные данные позволяют выдвинуть гипотезу, согласно которой ГО5р53 является эффектором, опосредующим формирование филоподий под влиянием СЬр. При этом СЬр и ЖБрбЗ

формируют комплекс вне зависимости от нуклеотид-связанного состояния ГТФазы, вероятно, с участием нескольких сайтов связывания. ГТФаза СЬр активируется либо в комплексе с 1К5р53, либо перед формированием комплекса, и данный комплекс вызывает формирование филоподий, возможно за счет также и активации ЖБрбЗ в этом комплексе или рекрутирования дополнительных белков, непосредственно отвечающих за полимеризацию актина и формирование филоподий.

Рис. 8. СЬр вызывает формирование филоподий в клетках НеЬа В. Клетки HeLa В трансфицировали плазмидами, для продукции £ЮРР или указанных форм ГТФазы СЬр, слитых с ЕвРР. Через 18-20 ч после трансфекции клетки фиксировали и производили подсчет клеток, имеющих филоподии. Данные представлены в виде среднего значения процента

трансфицированных клеток, имевших филоподии, для двух независимых экспериментов ± стандартное отклонение. Для каждого образца считалось не менее 70 трансфицированных клеток.

Chp Chp Chp G40V wt S45N

Chp Chp EGFP G40V G40V AN30 ДС208

Идентификация а-тубулина как партнера по взаимодействию с ГТФазой Chp

Для идентификации белков, взаимодействующих с Chp, также был использован протеомный подход, заключающийся в аффинной очистке белка Chp с N-концевым FLAG эпитопом из лизатов клеток РС12ТеЮп с доксициклин-индуцируемой экспрессией Chp (см. ниже), и последующей масс-спектрометрической идентификацией белков, соочищающихся с Chp. При этом была идентифицирована белковая полоса с молекулярным весом около 50 кДа, которая специфически и повторяемо соочищалась с FLAG-Chp G40V, но не с контрольным матриксом (Рис. 9А). Идентификация белка в данной полосе с помощью масс-спектрометрии показала, что этим белком является al-тубулин. Результаты Вестерн-блот анализа элюатов с FLAG-агарозы с помощью антител против a-тубулина подтвердили, что a-тубулин соочищается с FLAG-Chp G40V, но не с контрольной FLAG-агарозой (Рис. 9Б). Полученные данные указывают на то, что идентифицированный с помощью масс-спектрометрии белок действительно является а-тубулином.

а-тубулин связывается с ГТФазой Chp при проведении коиммунопрецшштации и GST пул-даун анализа

Для подтверждения взаимодействия Chp с a-тубулином проводили ко-ИП и GST пул-даун анализ. В результате ко-ИП было установлено, что эндогенный a-тубулин копреципитируется как с активными формами Chp, так и с неактивной формой Chp S45N, транзиторно

продуцированными в клетках НЕК293 (данные не приведены). Эти результаты указывают на то, что взаимодействие с а-тубулином, по-видимому, не зависит от активности ГТФазы СЬр.

Доке

■ 97.4

"jfe..... а-тубупин

НК~43

FLAG-Chp G40V НВ- 29

Элюат: анти - а-тубулин

Элюат: анти-FLAG

Лизаг. анти - а-тубулин

Лизат: анти-FLAG

Рис. 9. Идентификация а-тубулина как партнера по взаимодействию для ГТФазы СЬр. (А)

Электрофоретический анализ белков, очищающихся на анти-РТАС аффинном матриксе из лизатов клеток РС12ТеЮп с индукцией экспрессии РЬАО-СЬр С40У при добавлении доксициклина (Докс+) и без индукции (Доке-). Показано изображение гель после окраски красителем Кумасси. Стрелки указывают положение в геле РЬАС-СЬр 040У и а-тубулина. (Б). Вестерн-блот анализ тех же образцов с помощью антител против а-тубулина и РЬАО-эпитопа.

В результате проведения GST пул-даун анализа было выявлено, что белок GST-Chp, но не GST, способен преципитировать эндогенный а-тубулин из цитозольной фракции клеток линии HeLa В. При этом, как и в случае ко-ИП, было установлено, что а-тубулин связывается как с активной формой GST-Chp, нагруженной ГТФуБ, так и с неактивной формой GST-Chp, нагруженной ГДФ (Рис.10). Результаты данных экспериментов подтверждают возможность связывания Chp с а-тубулином, и указывают на то, что, как и в случае взаимодействия Chp и IRSp53, наблюдается нуклеотид-независимое связывание между ГТФазой Chp и взаимодействующим с ней белком.

GST GST-Chp „ Рис- Ю- GST-Chp преципитирует

_ ____Лизат _

гдф n®YS гдф rr<t>ys 1/150V а-тубулин из цитозольнои

фракции клеток HeLa В. GST или

GST-Chp нагружали

соответствующими нуклеотидами (FTOyS или ГДФ) и инкубировали с цитозолем клеток линии HeLa В. GST и GST-Chp преципитировали с помощью глутатион-сефарозы, связавшиеся белки элюировали и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антител против а-тубулина.

Я! — 66.2

Окраска — GST-Chp

Кумасси

Параллельно образцы разделяли с помощью ДСН-ПААГ и окрашивали гель красителем Кумассн для выявления белков GST и GST-Chp.

Взаимодействие Chp с микротрубочками

Взаимодействие с а-тубулином указывает на возможность связывания Chp с микротрубочками (МТ). Поэтому далее исследовали взаимодействие рекомбинантного белка GST-Chp с МТ, полимеризованными in vitro из препарата очищенного тубулина. В результате было обнаружено, что GST-Chp осаждает МТ (а-тубулин присутствует в осадке). В контрольном образце белок GST не осаждал МТ (Рис. 11).

Рис. 11. Взаимодействие GST-Chp с in vitro полимеризованными микротрубочками.

Полимеризованные микротрубочки

инкубировали с белками GST или GST-Chp, связанными с глутатион-сефарозой. Связавшиеся с носителем белки элюировали и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антител к а-тубулину и GST. С/н - супернатант, содержащий не связавшиеся с глутатион-сефарозой белки.

GST GST-Chp

С/н Осадок С/н Осадок

анти - а-тубулин

Результаты эксперимента с in vitro полимеризованными МТ указывают на возможность взаимодействия Chp с МТ в клетках. Поэтому далее исследовали возможность связывания ГТФазы Chp с МТ, полимеризованными из эндогенного тубулина непосредственно в клеточных лизатах. При этом было выявлено, что myc-Chp G40V и myc-Chp S45N соосаждаются с полимеризованными МТ (Рис. 12, образцы МТ+, осадок, панель анти-mye), но отсутствуют в осадке в образцах, где МТ были деполимеризованы (Рис. 12, образцы МТ-, осадок, панель анти-шус).

ChpG40V МТ- МТ+-

s с;

с;

ChpS45N МТ- МТ+

С/н Осадок с/н Осадок

анти - а-тубулин

анти - туе

Рис. 12. Транзиторно продуцированный белок СЬр соосаждается с микротрубочками. Клетки НЕК293 трансфицировали плазмидами для продукции тус-С1)р 040У и тус-СЬр 545Ы. Микротрубочки в лизате полимеризовали при +37°С и стабилизировали добавлением таксола (МТ+), либо инкубировали лизаты на льду для деполимеризации микротрубочек (МТ-). Полимеризованные микротрубочки осаждали центрифугированием и анализировали осадки и

супернатанты (С/н), а также исходные лизаты, с помощью Вестерн-блоттинга с антителами против а-тубулина и тус-эпитопа.

Результаты данного эксперимента указывают на то, что Chp способен связываться не только с димерами тубулина, но и может быть ассоциирован с МТ. Кроме того, в подтверждение результатов ко-ИП и GST пул- даун анализа, неактивная форма ГТФазы rayc-Chp S45N также соосаждалась с полимеризованными МТ. В целом, полученные данные позволяют предположить, что ГТФаза Clip способна связываться с микротрубочками независимо от активационного состояния, а активность ГТФазы может быть важна для взаимодействия с эффекторными белками, такими как протеинкиназа Pakl, которые могут быть также ассоциированы с МТ.

ГТФаза Chp напрямую связывается с р-тубулином

Во всех описанных выше экспериментах нельзя исключить возможности непрямого связывания Chp как с а-тубулином, так и с МТ. Поэтому далее исследовали возможность прямого связывания GST-Chp с тубулином с использованием метода гель-оверлей. При проведении ДСН-ПААГ в денатурирующих условиях димеры тубулина мигрируют в виде двух четко различимых полос, соответствующих а- и Р-тубулинам (Рис. 13, панель СВВ). Вестерн-блот анализ выявил связывание GST-Chp с белками на мембране, соответствующими а- и (3-тубулинам, однако, к удивлению, GST-Chp связывался с р-тубулином намного эффективнее по сравнению с а-тубулином. В случае GST связывание с мембраной не детектировалось (Рис. 13). Результаты данного эксперимента явно указывают на то, что Chp непосредственно взаимодействует с р-тубулином, а не с а-тубулином. В растворе при +4°С тубулин существует преимущественно в виде димеров. Следовательно, выявленное нами в ряде экспериментов связывание Chp с а-тубулином является непрямым, и скорее всего, опосредовано взаимодействием Chp с р-тубулином.

GST GST-Chp GST GST-Chp

а-тубулин _ $-тубулин~

100-g 75-1

► 50 -fl

Рис. 13. Прямое связывание GST-Chp с р-тубулином при проведении гель-оверлей анализа. Препарат тубулина разделяли с помощью ДСН-ПААГ, переносили на мембраны и инкубировали их с GST или GST-Chp. Белки, связавшиеся с иммобилизованным на мембране тубулином, детектировали с помощью Вестерн-блот анализа с антителами против GST (анти-GST). Те же самые мембраны окрашивали антителами против а-тубулина для верификации одинакового количества тубулина на мембранах, инкубированных с GST и GST-анти-а-тубулин с}]р (анти.а.тубулин). Панель (СВВ):

ДСН-ПААГ анализ препарата тубулина, окраска геля красителем Кумасси. Видно, что димер тубулина мигрирует в геле в виде двух полос (стрелками показано положение в геле а- и р-тубулинов). Слева показано положение маркеров молекулярного веса белков в кДа.

37-

25-

СВВ

анти-GST

Суммируя, в ряде экспериментов была выявлена способность ГТФазы СЬр связываться с микротрубочками, которая вероятно опосредована способностью СЬр взаимодействовать с р-тубулином. В свете полученных результатов можно выдвинуть гипотезу о том, что димсры тубулина или МТ могут являться платформой для сборки сигнального комплекса, включающего СЬр, эффекторные белки, например Рак1, и, возможно, субстраты Рак1 или другие регуляторные белки. Поэтому можно предположить, что даже неактивная ГТФазы СЬр может быть ассоциирована с МТ, а после активации под влиянием неких факторов СЬр может рекрутировать на МТ протеинкиназу Рак1, которая, как было показано, способна фосфорилировать тубулин-ассоциированные субстраты. Безусловно, данная модель требует экспериментальной валидации.

Изучение влияния экспрессии ГТФазы СИр на жизнеспособность клеток РСИТеЮп

Для изучения влияния ГТФазы СЬр на клеточные процессы были получены стабильные клеточные линии РС12ТеЮп с доксициклин-индуцируемой экспрессией активной формы ГТФазы СЬр в40У (клоны ¡»у2, ¡*уЗ, ¡^5 и или белка дикого типа (клон Ш5) с И-концевым РЬАО-эпитопом. При исследовании влияния экспрессии СЬр на жизнеспособность клеток клонов РС12ТеЮп было установлено, что индукция экспрессии ГТФазы СЬр приводила к статистически достоверному снижению количества живых клеток (Я<0.005 для всех клонов, данные не приведены). При этом максимальный эффект наблюдался в клетках, экспрессирующих активную форму СЬр, по сравнению с клетками, экспрессирующими СЬр дикого типа, а в исходной клеточной линии РС12ТеЮп при добавлении в среду доксициклина не наблюдалось снижения количества живых клеток.

Экспрессия СЬр является токсичной для клеток РС12ТеЮп

Было выдвинуто предположение, что экспрессия СЬр вызывает гибель клеток РС12ТеЮп. Для подтверждения данного предположения проводили измерение высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ) из клеток в культуральную среду, что является индикатором клеточной гибели. При этом было обнаружено, что экспрессия СЬр вызывает статистически достоверное увеличение высвобождения ЛДГ во всех исследованных клонах (Р<0.005) по сравнению с необработанными доксициклином клетками (Рис. 14). Эти данные указывают на то, что экспрессия СЬр действительно вызывает гибель клеток РС12ТеЮп. Максимальный цитотоксический эффект отмечался в клонах gv5 и ¡^7, что соответствует максимальному снижению количества живых клеток, наблюдаемому в данных клонах. Полученные данные указывают на то, что снижение количества живых клеток является следствием клеточной гибели, нежели следствием снижения пролиферативной активности клеток.

Рис. 14. СЬр вызывает гибель клеток РС12ТеЮп. Клетки клонов РС12Тм()п культивировали на коллагене [V в присутствии (Докс+) или отсутствии (Доке-) доксициклина в течение 3 дней, после чего измеряли активность ЛДГ в культуральной среде. Данные являются репрезентативными, по меньшей мере, для двух независимых экспериментов для каждого клона и представлены в виде условных единиц (УЕ) активности ЛДГ как среднее значение трех независимых измерений ± стандартное отклонение. Активность ЛДГ в культуральной среде необработанных доксициклином клеток принята за 1. * - Я<0.005.

Так как ГТФазы Cdc42 и Racl способны индуцировать апоптоз в клетках PC 12, то было предположено, что Chp также может вызывать апоптотическую гибель клеток клонов РС12ТеЮп. Активация каспаз является характерным признаком апоптоза, поэтому была исследована активация эффекторных каспаз-3/7 при индукции экспрессии Chp. При этом было обнаружено, что индукция экспрессии Chp в клетках клонов wt5, gv5 и gv7 приводила к -1.4-, ~3.5- и -1.6-кратному увеличению активности каспаз-3/7, соответственно (Рис. 15 А). Максимальная активация каспаз-3/7 была отмечена в клоне gv5, что соответствует максимальным снижению выживаемости клеток и высвобождению ЛДГ для этого клона. Таким образом, вероятнее всего, именно апоптоз является механизмом клеточной гибели, вызываемой ГТФазой Chp в клетках PC12TetOn при их культивации на коллагене IV. Важно отметить, что в исходной клеточной линии PC12TetOn не наблюдалось активации каспаз-3/7 при обработке клеток доксициклином (Рис. 15А). Это подтверждает специфичность данного эффекта для Chp. Помимо анализа активации каспаз также было проведено окрашивание клеток клона wt5 специфическим маркером апоптоза аннексином V, конъюгированным с флуоресцентным красителем F1TC, и последующим анализом клеток с помощью проточной цитофлуориметрии. В итоге было обнаружено, что индукция экспрессии Chp вызывает увеличение окрашивания клеток клона wt5 аннексином V-F1TC (Рис. 15Г). Это подтверждает то, что Chp индуцирует апоптоз клеток РС12ТеЮп. Кроме того, была исследована активация инициаторных каспаз-8/9 при индукции экспрессии Chp, и было выявлено, что Chp активирует каспазы-8/9 (Рис. 15Б и В). Важно отметить, что активности каспаз-8/9 не были увеличены в исходных клетках PC12TetOn, что подтверждает специфичность эффекта ГТФазы Chp (Рис. 15Б и В). Таким образом, Chp способен активировать как митохондриальный, так и опосредованный рецепторами смерти апоптотические сигнальные каскады в клетках PC12TetOn.

Доке:

gv2

gv3

gv5

gv7

Chp вызывает апоптоз клеток PC12TetOn

Chp активирует протеинкиказу JNK в клетках PC12TetOn

Активация JNK-сигнального пути играет центральную роль в развитии апоптоза в различных типах клеток. В частности, JNK активируется под влиянием ГТФаз Cdc42 и Racl при индукции апоптоза в клетках РС12. Поэтому была исследована активация протеинкиназы JNK в клонах wt5 и gv7 при экспрессии Chp. Экспрессия Chp как дикого типа, так и активной формы, вызывала активацию JNK (увеличение уровня фосфорилирования JNK в 2±0.22 и 3.79±1.24 раза в клонах wt5 и gv7, соответственно) (Рис. 16). В клетках gv7 увеличение уровня фосфорилирования JNK сопровождалось ~2.7-кратным увеличением фосфорилирования белка c-Jun по сайту Ser73, который является мишенью для JNK, тем самым указывая на то, что активация JNK под влиянием Chp приводит и к активации транскрипционного фактора АР-1. При этом не было выявлено активации протеинкиназы р38 МАРК под влиянием Clip, которая также может индуцировать апоптоз (Рис. 16А). В целом, полученные данные указывают на то, что Chp-индуцируемый апоптоз клеток PC12TetOn сопровождается активацией про-апоптотического JNK-сигнального пути.

□

Н.Д.

gv7 PC12TetOn

CO 0-W

gv7 PC12TetOn

[il

-fi

fii

□Q

й15 д';5 ду? РС12ТеГОп

Рис.15. СЬр вызывает апоптоз клеток РС12ТеЮп. Показаны результаты измерения активности каспаз-3/7 (А), каспазы-8 (Б) и каспазы-9 (В) в исходных клетках РС12ТеЮп и в клонах \vt5j gv5 и gv7, культивированных на коллагене IV в течение 48 ч в присутствии (Докс+) или отсутствии (Доке-) доксициклина. Данные являются репрезентативными для двух независимых экспериментов и представлены в виде условных единиц активности каспаз (УЕ) после нормализации на количество жизнеспособных клеток как среднее значение трех независимых измерений ± стандартное отклонение. * - Р<0.005; ** - /><0.05; н.д. - различия не являются статистически достоверными. (Г) Цитофлуориметрический анализ клеток клона \»Л5, окрашенных аннексином У-Р1ТС. Клетки культивировали на коллагене IV в течение 72 ч в присутствии

(Докс+) или отсутствии (Доке-) доксициклина и анализировали с помощью проточной цитофлуориметрии.

Доке: P-JNK

JNK

P-c-Jun c-Jun

р-рза

р38 а-тубулин

gv7

Доке:

wt5

gv7

Рис. 16. СЬр активирует протеинкиназу Л!\К в клетках РС12ТеЮп. (А) Клетки клонов \tft5 и культивировали на коллагене IV в течение 48 ч в присутствии (Докс+) или в отсутствии (Доке-)

доксициклина. Клеточные лизаты анализировали с помощью Вестерн-блогтинг с использованием указанных антител. Показаны

репрезентативные результаты одного из трех независимых

экспериментов. (Б) Денситометрическая обработка результатов Вестерн-блот анализа. Изменение активности JNK показано как среднее значение трех независимых измерений ± стандартное отклонение. Активность JNK в образцах, необработанных доксициклином (Доке-) принята за 1. Приведены средние данные для обеих изоформ JNK. * - ,Р<0.05.

Для подтверждения того, что цитотоксический эффект экспрессии Chp в клетках PC12TetOn зависит от активации JNK, было проведено измерение высвобождения ЛДГ из клеток клона gv5 в присутствии различных концентраций SP600125, специфического ингибитора JNK. При этом было установлено, что SP600125 дозо-зависимым образом снижал высвобождение ЛДГ и отменял Chp-индуцированную цитотоксичность, тем самым подтверждая, что активация протеинкиназы JNK, по крайне мере частично, необходима для СЬр-индуцированной апоптотической гибели клеток PC12TetOn (данные не приведены).

Для того чтобы подтвердить, что Chp-индуцированный апоптоз зависит от активации JNK, было исследовано влияние SP600125 на активацию каспаз под влиянием Chp. В результате было установлено, что обработка клеток ингибитором JNK не влияет на активацию каспазы-8 (Рис.17Б). Напротив, активность каспазы-9 в клетках wt5 и gv5 при добавлении SP600125 снижалась. (Рис. 17В). Это указывает на то, что активация каспазы-9 под влиянием Chp зависит от активации протеинкиназы JNK. Соответственно, активность эффекторных каспаз-3/7 также снижалась при обработке клеток клонов wt5 и gv5 ингибитором SP600125 (Рис. 17А). Полученные данные, во-первых, подтверждают, что Chp-индуцированный апоптоз клеток PC12TetOn зависит от активации JNK, и, во-вторых, указывают на то, что вероятнее всего, Chp активирует два параллельных проапоптотических каскада: JNK-зависимый каскад, активирующий митохондриальный апоптотический путь и каспазу-9, и JNK-независимый каскад, приводящий к активации каспазы-8.

Рис. 17. Ингибитор ЛМК, 8Р600125, снижает СЬр-индуцированную активацию каспаз в клетках РС12ТеЮп. Приведены результаты измерения активностей каспаз-3/7 (А), каспазы-8 (Б) и каспазы-9 (В) в исходных клетках РС12ТеЮп и в клонах и gv5 культивированных на коллагене IV в течение 48 ч в присутствии доксициклина и в присутствии (+) или в отсутствии (-) 10 мкМ БР600125 (БР). Данные обработаны и представлены также, как описано на Рис. 15. * - Р<0.05; н.д. - различия не являются статистически достоверными.

< SP: _-__+_ _

w!5 gv5 РСШвЮп

Chp активирует протеиикиназу JNK и AP-1-зависимую транскрипцию в клетках НЕК293

Транскрипционный фактор АР-1 является мишенью JNK, а активация АР-1-зависимой транскрипции необходима для развития JNK-индуцированного апоптоза в нейрональных клетках. Исследование активации АР-1-зависимой транскрипции в клетках НЕК293 с помощью люциферазного анализа показало, что при транзиторной экспрессии в клетках НЕК293 активной формы ГТФазы Chp, белка дикого типа и неактивной, ГДФ-связанной формы Chp, слитых с EGFP, наблюдается более чем 10-кратная активация (,Р<0.0001) АР-1-зависимой транскрипции по сравнению с клетками, экспрессирующими только EGFP (Рис. 18А). Вестерн-блот анализ лизатов транзиторно трансфицированных клеток показал, что экспрессия EGFP-Chp G40V, EGFP-Chp и EGFP-Chp S45N вызывала активацию JNK (Рис. 18Б). Таким образом, полученные результаты подтверждают, что Chp действительно активирует JNK-сигнальный каскад и, как следствие, АР-1-зависимую транскрипцию в клетках НЕК293.

Иигибирование JNK блокирует активацию АР-1 под влиянием Chp

Для того чтобы подтвердить, что активация АР-1 - зависимой транскрипции под влиянием ГТФазы Chp опосредована протеинкиназой JNK, проводили анализ активации АР-1-зависимого репортерного гена при обработке клеток НЕК293 ингибитором JNK. При этом было установлено, что SP600125 дозо-зависимым образом ингибирует активацию АР-1-зависимой транскрипции при экспрессии EGFP-Chp в клетках НЕК293 (Рис. 19). Полученные данные свидетельствуют о том, что активация транскрипционного фактора АР-1 под влиянием Chp опосредована протеинкиназой JNK.

п; ш О 0.1D

Ш Basic О АР-1

+ + l -L

гп ___

ffisjr*""]

t 5 X > 2

X + -ч-О <У)

а. а. а а. а.

X О о О О О

P-JNK 2 ь jjg 4s*

S45N G40V G40V S45N GFP &N30 ДС208 ¿N30

JNK (

Р-Р38 р38

Рак1 а-тубулин

Рис. 18. Chp активирует протеинкиназу JNK и АР-1-зависимую транскрипцию в клетках НЕК293. (А) Клетки НЕК293 трансфицировали плазмидами для экспрессии EGFP или указанных форм ГТФазы Chp, слитых с EGFP, вместе с репортерными плазмидами, кодирующими люциферазу светлячка ('Basic' - pGL3-Basic, 'АР-Г - pfLuc-AP-1) и репортерной плазмидой, кодирующей люциферазу Renilla под контролем конститутивно активного промотора. Через 48 ч после трансфекции проводили люциферазный анализ. Активность люциферазы светлячка нормализовали на активность люциферазы Renilla. Данные являются репрезентативными, по меньшей мере, для трех независимых экспериментов и представлены в виде относительных единиц люминесценции (ОЕЛ) как среднее значение трех независимых измерений ± стандартное отклонение. (Б) Клетки НЕК293 транзиторно трансфицировали плазмидами, экспрессирующими указанные белки, либо оставляли нетрансфицированными (Нетрансф.), и культивировали в течение 48 ч. Перед лизисом контрольные клетки обрабатывали анизомицином в концентрации 10 мкг/мл в течение 30 мин для индукции активации JNK (GFP+анизомицин). Клеточные лизаты анализировали с помощью Вестерн-блот анализа с использованием указанных антител.

— ш Basic а АР-1

1-Е-,

i-i-i

......саСП ПпПп

G40V

GFP pBK-CMV

для двух независимых экспериментов и люминесценции (ОЕЛ) как среднее значение отклонение. * -Р=0.0018.

Рис.19. Ингибирование протеинкиназы JNK блокирует активацию АР-1 под влиянием Chp.

Клетки НЕК293 культивировали и трансфицировали, как описано в Рис. 18А. Кроме того, клетки трансфицировали репортерными плазмидами вместе с вектором pBK-CMV. После трансфекции клетки культивировали в течение 48 ч в среде, содержащей различные концентрации SP600125 (SP) (0, 5, 10 и 20 мкМ), после чего проводили люциферазный анализ. Активность люциферазы светлячка нормализовали на активность люциферазы Renilla. Данные являются репрезентативными, по меньшей мере, представлены в виде относительных единиц трех независимых измерений ± стандартное

Мембранная локализация и N-концевой домен Chp необходимы для активации JNK сигнального каскада

С целью анализа молекулярных механизмов активации JNK сигнального каскада под влиянием Chp был проанализирован эффект удаления N- и С- концевых доменов Chp (1-28 и 208236 а.о., соответственно) на способность активировать АР-1-зависимый репортер и JNK. При этом было обнаружено, что делеция С-концевого домена Chp блокирует активацию JNK и АР-1-зависимой транскрипции (Рис. 18А и Б). Этот результат подтверждает важность мембранной локализации для функционирования ГТФазы Chp, которая определяется ее С-концевым доменом, и еще раз подтверждает специфичность эффекта Chp на АР-1-зависимую транскрипцию.

К удивлению, было обнаружено, что предположительно неактивная, ГДФ-связанная форма Chp S45N также активировала АР-1-зависимую транскрипцию (примерно 10-кратное увеличение по сравнению с EGFP, Р<0.0001) и вызывала активацию JNK (Рис. 18А и Б). Мутация S45N должна блокировать Chp в ГДФ-связанном состоянии, но при этом не должна влиять на N-концевой пролин-богатый домен или мембранную локализацию. Известно, что Chp связывается с белком POSH, БИЗ-домен содержащим белком-скаффолдом, который играет важную роль в активации JNK сигнального пути при развитии апоптоза в клетках PC 12. Можно предположить, что мембранно-ассоциированный Chp S45N в своем ГДФ-связанном состоянии рекрутирует эндогенный белок POSH на мембрану, который обеспечивает частичную активацию JNK. каскада в клетках НЕК293. Действительно, делеция N-концевого домена у Chp G40V, который, вероятнее всего, обеспечивает взаимодействие с белком POSH, снижала примерно в два раза эффект Chp G40V на АР-1-зависимую транскрипцию (Я=0.000!) и снижала активацию JNK. (Рис. 18А и Б). Сходно, делеция N-концевого домена у неактивной формы Chp S45N приводила к 1.5-кратному снижению активации АР-1-зависимой транскрипции по сравнению с полноразмерным белком Chp S45N (/*=0.0018) (Рис. 18А). Эти данные говорят о том, что N-концевой пролин-богатый домен Chp вносит вклад в активацию JNK сигнального каскада.

Изучение экспрессии гена RHOV в образцах немелкоклеточного рака легких человека

Ген RHOV, кодирующий ГТФазу Chp, и некоторые эффекторы Chp (протеинкиназы Pakl и Рак4) обладают свойствами онкогенов. Показанная нами индукция формирования филоподий под влиянием Chp указывает на то, что Chp может влиять на инвазивные свойства клеток. Исходя из вышесказанного, можно предположить, что сверхэкспрессия гена RHOV будет способствовать развитию и прогрессии опухолей человека. Анализ экспрессии гена RHOV у человека не выявил присутствия транскрипта в легких, однако экспрессия гена RHOV обнаруживалась в клеточной линии карциномы легкого человека А549. Анализ экспрессии RHOV в образцах рака легкого человека ранее не проводился. Поэтому с помощью полуколичественной ПЦР был проведен анализ экспрессии гена RHOV в образцах немелкоклеточного рака легких человека (HMKPJI) по

сравнению с прилежащей неопухолевой тканью. Было проанализировано 29 пар образцов легочных тканей (опухоль - условная норма) пациентов с НМКРЛ. За условную норму принимали гистологически нормальные ткани легких, взятые из прилегающей к опухоли ткани ближе к краю резекции. В результате было установлено, что в 22 парах опухоль-норма (76%) уровень транскрипта ЯНОУ повышен в опухолях по сравнению с условной нормой. В прилежащих к опухоли условно нормальной ткани легких транскрипция ЯНОУ была обнаружена лишь в 2 индивидуальных образцах из 29, при этом транскрипт детектировался лишь при максимальном числе циклов амплификации. В 7 парах образцов (24%) транскрипт ¡ШОУ не обнаруживался ни в норме, ни в опухоли (данные не приведены). Статистический анализ с помощью точного критерия Фишера выявил, что увеличение уровня экспрессии гена ЯНОУ в опухоли является статистически достоверным (Р=0.0004).

Полученные результаты явно свидетельствуют о том, что экспрессия гена ЯНОУ высокоспецифична для опухолей легкого по сравнению с условной нормой. Поэтому уровень транскрипта гена ЯНОУ можно рассматривать как потенциальный молекулярный маркер НМКРЛ, который в перспективе может быть использован в диагностических и/или прогностических целях. ГТФаза СЬр и ее эффекторные белки обладают свойствами онкогенов и способны вызывать злокачественную трансформацию. Учитывая биологические свойства ГТФазы СЬр, увеличение экспрессии транскрипта ЯНОУ представляется перспективным молекулярным маркером опухолей легкого.

Выводы

1. Анализ взаимодействия белков в дрожжевой двугибридной системе выявил протеинкиназу Рак5 как новый потенциальный эффектор ГТФазы СЬр.

2. С использованием анализа взаимодействия белков в дрожжевой двугибридной системе и коиммунопреципитации экзогенно продуцированных белков выявлено взаимодействие протеинкиназы Ракб и ГТФазы СЬр, которое опосредовано эффекторным доменом ГТФазы СЬр и СМВ-доменом протеинкиназы Ракб, и зависит от активации ГТФазы СЬр. Продемонстрирована колокализация СЬр и Ракб на везикуло-подобных структурах при их совместной продукции в клетках линии >ГС1-Н1299.

3. Выявлена способность ГТФазы СЬр взаимодействовать с белком НУ»р53 в дрожжевой двугибридной системе и при проведении коиммунопреципитации экзогенно продуцированных белков, картирован сайт взаимодействия в белке 1К5р53. Было выявлено, что ГТФаза СЬр при транзиторной продукции в клетках линии НеЬа В индуцирует формирование филоподий, а при совместной продукции колокализуется с белком Ж5р53 на филоподиях.

4. Показана способность ГТФазы Chp взаимодействовать ffc -тубулином и с микротрубочками.

5. Установлено, что ГТФаза Chp индуцирует апоптотическую гибель клеток линии РС12ТеЮп, которая частично опосредована активацией протеинкиназы JNK.

6. Выявлено частое повышение уровня транскрипта гена RHOV, кодирующего белок Chp, в образцах немелкоклеточного рака легких человека по сравнению с условной нормой, которое потенциально может использоваться как молекулярный маркер немелкоклеточного рака легких человека.

Личный вклад автора

Основные результаты работы получены автором лично. Масс-спектрометрический анализ белков проводился Р. Зиганшиным (ИБХ РАН, г. Москва), образцы кДНК опухолей легкого человека и прилежащей нормальной ткани были получены от Е.Д. Свердлова, Т.В. Виноградовой, Е.П. Копанцева (ИБХ РАН, г. Москва). Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Список опубликованных работ по теме диссертации Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК

1. Hofmann С, Shepelev М, ChernofF J. "The genetics of Рак." Journal of Cell Science. 2004; 117 (19):4343-54.

2. Shepelev MV. Chernoff J, Korobko IV. "Rho family GTPase Chp/RhoV induces PC12 apoptotic cell death via JNK activation". Small GTPases. 2011; 2(l):17-26.

3. Шепелев MB. Коробко ИВ. «Протеинкиназа Ракб - новый эффектор атипичной Rho ГТФазы Chp/RhoV". Биохимия. 2012; 77(1):34-42.

Тезисы конференций

1. Shepelev MV. Chernoff J. "Cdc42 - like GTPase Chp interacts with Pak kinases". "Molecular mechanisms in signal transduction and cancer", The EMBO / FEBS Advanced Lecture Course on the Island of Spetses, Greece, August 15-26,2005, p.92.

2. M.B. Шепелев. Д. Чернофф. «Взаимодействие Cdc42 - подобных ГТФаз Chp и Wrch-1 с РАК В киназами». Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии. XVII Международная зимняя молодёжная научная школа. Институт Биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия, Февраль 10-13,2005, с. 17.

3. М.В. Шепелев. Д.Чернофф, И.В. Коробко. «Rho ГТФаза Chp/Wrch2 взаимодействует с а-тубулином». Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии. XX Международная зимняя молодёжная научная школа. Институт Биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия, Февраль 11-15,2008, с.26.

4. Shepelev MY. Chemoff J, Korobko IV. "Rho family GTPase Chp/Wrch2 induces PC 12 apoptotic cell death accompanied by JNK activation and suppression of Akt". International Conference on Biomolecular Science in honor of the 75lh anniversary of the birth of Professor Yuri Ovchinnikov (1934-1988), Moscow-Pushchino, September 28-October 2,2009, p.418-420.

5. Shepelev MV. Korobko IV. «The Rho family GTPase Chp/Wrch2 associates with microtubules». "EMBO Conference Series Microtubules - Structure, Regulation and Functions", 2-5 May, 2010, Heidelberg, Germany, p.217.

6. Shepelev MV. Korobko IV. "Rho GTPase Chp/RhoV as a regulator of cytoskeleton: implications for cancer cell biology". International symposium "Control of gene expression and cancer", June 21-25,

2010, Moscow, Russia, p.45-46.

7. Шепелев M.B.. Коробко И.В. «Атипичная Rho ГТФаза Chp/RhoV: новый участник канцерогенеза?». Материалы VII Российского симпозиума «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва, 1-4 Июня, 2011. Онкогематология.

2011.(2). с.56.

8. Shepelev MV. "Elucidating the function and regulation of the atypical Rho GTPase Chp/RhoV in epithelial and fibroblastic cells". U.S.-Russia Scientific Forum Meeting. November 16-18, 2011. Moscow, Russia, p.27.

1. М.В. Шепелев. Н.В. Гнучев, Г.П. Георгиев, И.В. Коробко. «Способ диагностики немелкоклеточного рака легких и набор для его осуществления». (Заявление о выдаче патента Российской Федерации на изобретение в Федеральную службу по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам №2010136681 от 02.09.2010; принято решение о выдачи патента на изобретение).

Патент

Заказ № 110-П/03/2012 Подписано в печать 22.03.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1,25

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:т/о@с/г.ги

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шепелев, Михаил Валентинович, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

61 12-3/828

На правах рукописи

Шепелев Михаил Валентинович

«Изучение свойств и молекулярных механизмов действия Шю ГТФазы СЬрА¥гсЬ2»

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

научный руководитель: доктор биол. наук. Коробко И.В.

МОСКВА 2012

Оглавление

Оглавление.....................................................................................................................2

Список используемых сокращений...........................................................................6

1. ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................8

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................10

2.1. Семейство Юю ГТФаз человека.....................................................................................10

2.1.1. Введение.......................................................................................................................10

2.1.2. Структура Шю ГТФаз и регуляция ГТФазного цикла......................................11

2.1.3. Регуляция мембранной локализации Шю ГТФаз...............................................15

2.2. Подсемейство ШюХТУ........................................................................................................16

2.3. Шю ГТФаза СЬр/КЬоУ/\УгсЬ2........................................................................................17

2.3.1. Экспрессия гена ЛНОУ в нормальных и опухолевых тканях и клеточных

линиях млекопитающих.....................................................................................................17

2.3.2. Регуляция экспрессии гена ЯНОУ..........................................................................18

2.3.3. Характеристика белка СЬр и его биохимические свойства..............................18

2.3.4. Взаимодействие с регуляторными белками и активация ГТФазы СЬр.........19

2.3.5. Взаимодействие СЬр с предполагаемыми эффекторами....................................20

Протеинкиназа Рак1........................................................................................................20

Протеинкиназы Рак2, РакЗ, Рак4..................................................................................22

Другие белки.....................................................................................................................22

2.3.6. Внутриклеточная локализация СЬр и липидные модификации С-конца......23

2.3.7. Биологические эффекты ГТФазы СЬр..................................................................24

Активация протеинкиназы Л\К...................................................................................24

Влияние на актиновый цитоскелет..............................................................................24

Возможное влияние ГТФазы СЬр на процесс митоза...............................................25

Возможная роль ГТФазы СЬр в злокачественной трансформации......................25

Экспрессия и функции ГТФазы СЬр в эмбриональном развитии позвоночных 26

2.3.8. Резюме...........................................................................................................................29

2.4. Шю ГТФаза \¥гсЬ-1/Шши...............................................................................................29

2.4.1. Экспрессия гена ЛН017 в тканях и клеточных линиях......................................29

2.4.2. Регуляция экспрессии гена ЯН017..........................................................................30

2.4.3. Характеристика белка \Vrch-l и его биохимические свойства.........................31

2.4.4. Взаимодействие с регуляторными белками..........................................................33

2.4.5. Внутриклеточная локализация и липидные модификации С-конца..............33

2.4.6. Взаимодействие с эффекторами..............................................................................33

Протеинкиназа Рак1............................................................................................................33

2.4.8. Протеинкиназы Рук2 и ГАК и регуляция \Vrch-l протеинкиназой 8гс.........36

2.4.9. 8НЗ-домен содержащие белки ]Чск, вгЬ2 и РЬСу.................................................38

2.4.10. АМГСАРЗО и С(ЮАР...............................................................................................39

2.4.11. Биологические эффекты ГТФазы \УгсЬ-1...........................................................40

Активация ЛЧК.................................................................................................................40

Влияние на актиновый цитоскелет..............................................................................40

Возможная роль ГТФазы \¥гсЬ-1 в злокачественной трансформации.................41

Влияние ГТФазы \Vrch-l на фокальные контакты..................................................42

Роль \Vrch-l в дифференцировке остеокластов.........................................................44

Другие эффекты................................................................................................................45

2.4.12. Резюме.........................................................................................................................46

2.5. Эффекторные молекулы ГТФазы СЬр: Семейство протеинкиназ Рак человека46

2.5.1. Общая характеристика семейства протеинкиназ Рак человека......................47

2.5.2. Структура протеинкиназ Рак..................................................................................48

2.5.3. Механизмы активации протеинкиназ Рак............................................................49

Активация протеинкиназ Pak I с участием Rho ГТФаз...........................................49

Механизмы активации протеинкиназ Pak I без участия ГТФаз............................50

2.5.4. Регуляция активности протеинкиназ Pak II........................................................50

2.6. Серин-треониновая протеинкиназа Рак5.....................................................................51

2.6.1. Ген РАК7 и его экспрессия у млекопитающих.....................................................51

2.6.2. Свойства и структура протеинкиназы Рак5.........................................................52

2.6.3. Характеристика и регуляция каталитической активности Рак5....................53

2.6.4. Влияние Rho ГТФаз на киназную активность Рак5...........................................54

2.6.5. Интерактом протеинкиназы Рак5..........................................................................56

Взаимодействие Рак5 с Rho ГТФазами........................................................................56

Протеинкиназа MARK2/Par-1.......................................................................................56

Протеинкиназа Raf-1.......................................................................................................57

2.6.6. Внутриклеточная локализация Рак5.....................................................................58

Локализация Рак5 на митохондриях............................................................................58

Локализация Рак5 на везикуло-подобных структурах.............................................59

Ядерная локализация Рак5............................................................................................60

Локализация Рак5 на фокальных контактах и центросомах..................................61

2.6.7. Влияние Рак5 на актиновый и тубулиновый цитоскелеты...............................61

2.6.8. Индукция роста нейритов под влиянием Рак5....................................................62

2.6.9. Роль Рак5 в активации МАРК сигнальных путей: активация JNK...............63

2.6.10. Ингибирование апоптоза под влиянием Рак5....................................................64

2.6.11. Экспрессия Рак5 в опухолевых клеточных линиях и образцах опухолей человека.................................................................................................................................65

2.6.12. Возможная роль протеинкиназы Рак5 в развитии диабета.............................66

2.6.13. Нокаут гена Рак7 у мыши.......................................................................................66

2.6.14. Резюме.........................................................................................................................67

2.7. Серин-треониновая протеинкиназа Ракб.....................................................................67

2.7.1. Структура Ракб и регуляция киназной активности...........................................68

2.7.2. Белки, взаимодействующие с Ракб.........................................................................69

Rho ГТФазы.......................................................................................................................69

Транскрипционные факторы........................................................................................69

Другие белки.....................................................................................................................70

2.7.3. Экспрессия гена РАК6 в нормальных и опухолевых тканях и возможная роль Ракб в онкогенезе........................................................................................................70

2.7.4. Нокаут гена Ракб........................................................................................................73

2.7.5. Резюме...........................................................................................................................74

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................................................74

3.1. Реактивы.............................................................................................................................74

3.2. Бактериальные штаммы, среды, реактивы, антибиотики.......................................75

3.3. Получение химически компетентных клеток Е. coli..................................................75

3.4. Приготовление электрокомпетентных клеток Е.coli XL 1 Blue MRF'....................75

3.5. Электропорация бактериальных клеток......................................................................76

3.6. Трансформация клеток Е. coli........................................................................................76

3.7. Гидролиз ДНК с помощью эндонкуклеаз рестрикции...............................................76

3.8. Секвенирование ДНК.......................................................................................................76

3.9. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli (мини-преп).....................................77

3.10. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli (макси-преп)..................................77

3.11. Очистка фрагментов ДНК из агарозного геля и растворов...................................77

3.12. Электрофорез ДНК в агарозном геле..........................................................................77

3.13. Лигирование фрагментов ДНК....................................................................................78

3.14. Клонирование продуктов ПЦР.....................................................................................78

3.15. Получение плазмидных конструкций.........................................................................78

3.16. Культуры клеток, реагенты и трансфекция..............................................................81

3.17. Вестерн-блот анализ и антитела...................................................................................82

3.18. Очистка рекомбинантных белков GST и GST-Chp.................................................83

3.19. Коиммунопреципитация myc-Chp и FLAG-Ракб......................................................84

3.20. Коиммунопреципитация FLAG-Chp и myc-IRSp53.................................................85

3.21. Коиммунопреципитация myc-Chp и а-тубулина......................................................85

3.22. Иммунофлуоресценция..................................................................................................85

3.23. Анализ формирования филоподий в клетках HeLa В.............................................86

3.24. Аффинная очистка ГТФазы Chp с FLAG-эпитопом из лизатов клеток РС12ТеЮп..................................................................................................................................87

3.25. Масс-спектрометрия.......................................................................................................87

3.26. GST пул-даун анализ с использованием цитозоля клеток HeLa В........................88

3.27. Анализ взаимодействия GST-Chp с микротрубочками полимеризованными in vitro..............................................................................................................................................89

3.28. Анализ взаимодействия myc-Chp с микротрубочками полимеризованными в лизатах клеток НЕК293 ..........................................................................................................89

3.29. Гель-оверлей анализ.......................................................................................................90

3.30. Измерение жизнеспособности клеток PC12TetOn....................................................90

3.31. Измерение активности ЛДГ в культуральной среде...............................................90

3.32. Измерение активности каспаз......................................................................................91

3.33. Проточная цитофлуориметрия.....................................................................................91

3.34. Анализ активации протеинкиназы JNK в клетках PC12TetOn............................91

3.35. Измерение активности АР-1 репортерного гена.......................................................92

3.36. Статистический анализ..................................................................................................92

3.37. Анализ белок-белковых взаимодействий в дрожжевой двугибридной системе.92

3.37.1. Штаммы дрожжей....................................................................................................92

3.37.2. Среды и реактивы....................................................................................................93

3.37.3. Трансформация дрожжей плазмидной ДНК.......................................................93

3.37.4. Анализ белок-белковых взаимодействий в дрожжевой двугибридной системе (штамм Y153)..........................................................................................................94

3.37.5. Анализ активации репортерного гена LacZ в дрожжах....................................94

3.37.6. Скрещивание штаммов Y187 и CG-1945.............................................................95

3.38. Скрининг библиотеки кДНК в дрожжевой двугибридной системе «Matchmaker GAL4 Two-Hybrid System 2»...................................................................................................95

3.38.1. Проверка активации транскрипции репортерных генов «приманкой».......95

3.38.2. Скрещивание штамма CG-1945, содержащего «приманку», со штаммом Y187, трансформированным библиотекой кДНК..........................................................96

3.38.3. Выделение плазмидной ДНК (библиотечной плазмиды) из клеток дрожжей ..................................................................................................................................................96

3.38.4. Анализ LacZ? HIS3+ позитивных клонов.............................................................97

3.39. Выделение РНК из клеточных линий и синтез кДНК.........................................97

3.40 Анализ уровня транскрипта гена RHOVс помощью полуколичественной ПЦР.........................................................................................................................................97

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.....................................................................99

4.1. Идентификация протеинкиназ Рак5 и Ракб как новых потенциальных эффекторов ГТФазы Chp........................................................................................................99

4.2. Chp взаимодействует с Ракб в лизатах клеток млекопитающих..........................100

4.3. Chp связывается с CRIB-последовательностью в Ракб..........................................102

4.4. Эффекторный домен Chp необходим для взаимодействия с Ракб........................102

4.5 Chp не влияет на уровень фосфорилирования аминокислотного остатка S560 у

Ракб...........................................................................................................................................ЮЗ

4.6. Chp колокализуется с Ракб на везикулярных структурах в клетках NCI-H1299 ....................................................................................................................................................105

4.7. Поиск белков взаимодействующих с ГТФазой Chp в дрожжевой двугибридной

системе......................................................................................................................................106

4.8. Анализ результатов скрининга....................................................................................108

4.8.1. IRSp53 (Insulin Receptor Substrate p53)/BAIAP2 и Cyfip2 (Cytoplasmic FMR1 interacting protein 2)/PIR121/Sra-l...................................................................................109

4.9. Картирование фрагмента IRSp53, необходимого для взаимодействия с Chp.....110

4.10. Взаимодействие Chp и IRSp53 в лизатах клеток млекопитающих.....................112

4.11. Взаимодействие GST-Chp и эндогенного белка IRSp53........................................114

4.12. Колокализация Chp и IRSp53 на филоподиях в клетках HeLa В........................115

4.13. ГТФаза СЬр вызывает формирование филоподий в клеточной линии НеЬа В. ....................................................................................................................................................116

4.14. Идентификация ос-тубулина как партнера по взаимодействию для ГТФазы СЬр

....................................................................................................................................................117

4.15. а-тубулин связывается с ГТФазой Chp при проведении

коиммунопреципитации и GST пул-даун анализа..........................................................119

4.16. Взаимодействие Chp с микротрубочками................................................................120

4.17. ГТФаза Chp напрямую связывается с 0-тубулином..............................................122

4.18. Получение стабильных клеточных линий РС12ТеЮп с тетрациклин-регулируемой экспрессией ГТФазы Chp с N-концевым FLAG эпитопом..................124

4.19. Экспрессия Chp снижает жизнеспособность клеток PC12TetOn.........................125

4.20. Экспрессия Chp является цитотоксичной для клеток PC12TetOn.....................127

4.21. Chp вызывает апоптоз клеток PC12TetOn...............................................................128

4.22. Chp активирует протеинкиназу JNK в клетках PC12TetOn................................129

4..................................................................................................................................................131

.23. Цитотоксический эффект Chp блокируется ингибитором JNK, SP600125..........131

4.24. Ингибитор JNK, SP600125 снижает Chp-индуцированную активацию каспаз в клетках РС12ТеЮп................................................................................................................132

4.25. Chp активирует протеинкиназу JNK и AP-1-зависимую транскрипцию в клетках НЕК293......................................................................................................................132

4.26. Ингибирование JNK блокирует активацию АР-1 под влиянием Chp................135

4.27. Мембранная локализация и N-концевой домен Chp важны для активации JNK сигнального каскада..............................................................................................................135

4.28. Резюме: роль Chp в развитии апоптоза в клетках PC12TetOn............................137

4.29. Изучение экспрессии гена RHOV в образцах немелкоклеточного рака легких человека...................................................................................................................................139

4.30. Экспрессия гена RHOVв клеточных линиях рака легкого человека................141

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................................149

6. ВЫВОДЫ...............................................................................................................150

Личный вклад автора.............................................................................................151

Благодарности...........................................................................................................151

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................152

Список используемых сокращений

А.о. Аминокислотный остаток

АТФ Аденозинтрифосфат

ГДФ Гуанозиндифосфат

ГТФ Гуанозинтрифосфат

ГТФаза Гуанозинтрифосфатаза

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСН-ПААГ Додецилсульфат натрия-полиакриамидный гель-электрофорез

ЖКТ Желудочно-кишечный тракт

кДа килодальтон

кДНК кодирующая ДНК

Ко-ИП Коиммунопреципитация

ЛДГ лактатдегидрогеназа

мРНК матричная РНК

нт нуклеотиды

МТ микротрубочки

MX митохондрии

НМКРЛ Немелкоклеточный рак легкого

ОТ-ПЦР ПЦР, сопряженная с обратной транскрипцией

ПЦР Полимеразная цепная реакция

РНК Рибонуклеиновая кислота

т.п.н. тысяч пар нуклеотидов

тэс Трансэпителиальное сопротивление

УЕ условные единицы

цАМФ Циклический аденозинмонофосфат

ЭДТА этилендиаминтетраацетат

ЗАТ 3-амино-1,2,4-триазол

AID Autoinhibitory domain (Аутоингибиторный домен)

AR Androgen Receptor (Рецептор андрогена)

CFP Cyan fluorescent protein (Циановый флуоресцентный белок)

CRIB Cdc42/Rac interactive binding (последовательность связывания с Cdc42/Rac)

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium (Среда Игла, модифицированная

Дюльбекко)

EGF Epithelial growth factor (Фактор роста эпителия)

EGFR Рецептор фактора роста эпителия

EGFP Enhanced green fluorescent protein (Усиленный зеленый флуоресцентный белок)

ER Estrogen Receptor (Рецептор эстрогена)

GAL4AD Трансактивационный домен транскрипци

Информация о работе

Шепелев, Михаил Валентинович
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.03

Диссертация

Изучение свойств и молекулярных механизмов действия Rho ГТФазы Chp/Wrch2 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Изучение свойств и молекулярных механизмов действия Rho ГТФазы Chp/Wrch2 ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение свойств и молекулярных механизмов действия Rho ГТФазы Chp/Wrch2"

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шепелев, Михаил Валентинович, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение свойств и молекулярных механизмов действия Rho ГТФазы Chp/Wrch2
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология