Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение влияния Т-кадгерина на проницаемость эндотелиального монослоя, организацию цитоскелета и системы внутриклеточной сигнализации

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение влияния Т-кадгерина на проницаемость эндотелиального монослоя, организацию цитоскелета и системы внутриклеточной сигнализации"

На правах рукописи

СЕМИНА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ Т-КАДГЕРИНА НА ПРОНИЦАЕМОСТЬ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОГО МОНОСЛОЯ, ОРГАНИЗАЦИЮ ЦИТОСКЕЛЕТА И СИСТЕМЫ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ

03.00.04 - Биохимия 03.00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009 год

003462159

Работа выполнена в Лаборатории ангиогенеза НИИ ЭК "ФГУ РКНПК" МЗ и СР РФ

Научные руководители:

Академик РАН и РАМН кандидат биологических наук

Ткачук Всеволод Арсеньевич Рубина Ксения Андреевна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Доктор медицинских наук, профессор

Онищенко Галина Евгеньевна Мазуров Алексей Владимирович

Ведущая организация

Учреждение РАН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита состоится 18 марта 2009 г в 13-30 на заседании диссертационного совета Д 208.073.01 по присуждению ученой степени доктора и кандидата биологических наук в ФГУ "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" МЗ и СР РФ (121552 г. Москва, ул. Зя Черепковская, д. 15а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ "РКНПК" МЗ и СР РФ Автореферат разослан 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

д.м.н., профессор В.Е. Синицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Липопротеиды низкой плотности (ЛНП) являются основными переносчиками холестерина и триглицерндов к периферическим тканям в организме. Повышенный уровень ЛНП в крови служит фактором риска развития атеросклероза, так как приводит к накоплению липидов в сосудистой стенке (Goldstein ct al., 1985). Внутриклеточный транспорт ЛНП происходит путем рецептор-опосредованного эндоцитоза (Brown and Goldstein, 1986), однако известно, что ЛНП способны влиять на функциональную активность целого ряда клеток по эндоцитоз-независимому пути: увеличивать проницаемость эндотелия (Liu et al., 1998; Massaeli et al., 1999); стимулировать пролиферацию и миграцию гладко-мышечных клеток (ГМК) сосудов (Gumbiner, 2000); увеличивать тонус сосудов (Sachinidis et al., 1990); активировать макрофага и тромбоциты (Godt, 1998; Kelley et al., 1988); усиливать секрецию сурфактанта альвеолоцитами (Voyno-Yasenetskaya et al., 1993). Такие эффекты сходны с действием гормонов п медиаторов, и поэтому было предложено называть их "гормоноподобными" (Block et al., 1988). В клетках ЛНП стимулируют системы внутриклеточной сигнализации: усиливают фосфоинозитидный обмен, активируют фосфолипазу С и вызывают мобилизацию внутриклеточного Са2+ (Bochkov et al., 1993). Быстрота, насыщаемость и обратимость, характерная для "гормоноподобных" эффектов ЛНП, свидетельствует об участии специфического рецептора в передаче сигнала от ЛНП внутрь клетки, однако ни природа предполагаемого рецептора, ни механизмы его сопряжения с системами вторичных посредников до конца не выяснены.

Изучая сигнальные эффекты, опосредуемые ЛНП, в нашей лаборатории было обнаружено, что на мембранах ГМК сосудов существует участок низкоафшшого связывания ЛНП, опосредующий внутриклеточную сигнализацию ЛНП (Bochkov et al., 1993; Bochkov et al., 1994). Выделение, очистка и сиквеннрование показало, что неизвестным участком связывания ЛНП на мембранах ГМК сосудов является Т-кадгерин (Tkachuk et al, 1998). Во взрослом организме наибольшая экспрессия Т-кадгерина наблюдается в сердечно-сосудистой и нервной системе, и при таких патологических состояниях как атеросклероз и рестеноз, экспрессия Т-кадгерина сосудах возрастает (Kudijashova et al., 2002), однако физиологическое значение этого явления остается неизвестным.

Т-кадгерин является уникальным представителем кадгеринового суперсемейства: отсутствие трансмембранного и внутриклеточного доменов (Vestal and Ranscht, 1992), а также локализация Т-кадгерина в липидиых плотах (Philippova et al., 1998), в местах сосредоточения многих сигнальных путей (Src киназ, малых G белков, рецептора

урокиназы), предполагает участие Т-кадгерина во внутриклеточной сигнализации, а не в обеспечении прочной межклеточной адгезии. В литературе имеются отдельные данные, подтверждающие это предположение: взаимодействие между молекулами Т-кадгерина на поверхности эндотелиальных клеток приводит к активации ШюА и 1Ъс1 сигнальных путей (РЫНрроуа й а1., 2003).

В настоящей работе была поставлена цель - оценить влияние экспрессии Т-кадгерина на активацию систем внутриклеточной сигнализации, реорганизацию компонентов цитоскелета и проницаемость эндотелиального монослоя.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: оценить влияние экспрессии Т-кадгерина на

1. Активацию внутриклеточной сигнализации с участием Юю ГТФаз и реорганизацию цитоскелета.

2. Проницаемость эндотелиального монослоя.

3. Экспрессию и локализацию УЕ-кадгерина и (5-катсшша в межклеточных контактах.

4. Связывание 1251-ЛНП с поверхностью клеток.

5. Изменение концентрации внутриклеточного кальция в ответ на добавление ЛНП в среду инкубирования.

6. Миграцию клеток по градиенту ЛНП.

Научная новизна н практическая значимость работы. В представленной работе методом измерения активности БИЕ, а также методом осаждения с использованием сефарозы для выделения активных Юю ГТФаз было показано, что Т-кадгерин в ГМНЗТЗ клетках активирует 11ас1 и С(1с42 ГТФазы, но не активирует ШюА ГТФазу.

Методом иммунофлуоресцентного окрашивания в сочетании с конфокальной микроскопией и полуколичественным обсчетом интенсивности флуоресценции показано значимое влияние Т-кадгерина на полимеризацию стресс фибрилл актина и сборку микротрубочек в эндотелиальных клетках. Впервые обнаружено, что подавление экспрессии Т-кадгерина достоверно уменьшает проницаемость эндотелиального монослоя для молекукл РГГС-декстрана по сравнению с контролем, а также увеличивает содержание р-катенина в ядре и цитоплазме эндотелиальных клеток.

Созданы клоны клеток линии НЕК293, стабильно ко-экспрессирующие Т-кадгерин и зеленый флуоресцентный белок ОРР, создан контрольный клон, экспрессирующий ОРР. Было обнаружено, что экспрессия Т-кадгерина в полученных клонах увеличивает поверхностное связывание ЛНП с мембранами клеток. Было также показано влияние

экспрессии Т-кадгсрина на увеличение концентрации внутриклеточного кальция в ответ на введение ЛНП в среду культивирования. В работе показано участие эндоплазматического рстикулума и кальциевых каналов цитоплазматической мембраны в регуляции изменений концентрации внутриклеточного кальция в ответ на добавление ЛНП в среду культивирования клеток, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин по сравнению с контролем. Обнаружено, что Т-кадгерин стимулирует спонтанную клеточную миграцию in vitro, а введение ЛНП в качестве хемоаттрактанта в 1,5 раза стимулирует эффект Т-кадгерина.

Результаты работы существенно дополняют современные представления о роли Т-кадгерииа как молекулы внутриклеточной сигнализации, способной регулировать не только полимеризацию цнтоскелета в эндотелиальных клетках и проницаемость эндотелия, но и опосредовать сигнальные эффекты ЛНП.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на межлабораторной конференции в ФГУ "РКНПК Росмедтехнологий" (25 ноября, 2008 г.), на международных конференциях (IVBM2006, Amsterdam, Netherlands; 18th Chicago Signal Transduction Symposium", Chicago, USA, 2005), и на Конкурсе молодых ученых в рамках Российского национального конгресса кардиологов, г. Томск, 2004 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 тезиса докладов, 4 статьи в рецензируемых журналах; одна статья находится в печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 153 страницы машинописного текста, 2 таблицы и 35 рисунков. Список литературы включает 258 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы следующие первые антитела: против Т-кадгерина (ProSci Ine, USA), VE-кадгерина и ß-катенина (Abeam, USA), a-GAPDH (глнцеральдегидфосфатдегндрогеназа) (Sigma, USA), фосфорилнрованной LIMKl (Cell Signaling Technology, USA), а-тубулнна (Sigma, USA), и c-myc (Santa Cruz Biotechnology, USA). Антитела против RhoA, Racl и Cdc42 были любезно предоставлены Т. Войно-Ясенецкой (University of Illinois at Chicago, USA). Вторые антитела, конъюгированные с флуорохромом AlexaFluor594 или AlexaFluor488, а также фаллоидин, конъюгированный с AlexaFluor594 были фирмы Molecular Probes (Eugene, USA).

Культивирование и трансфекцня эукариотических клеток. В работе использовали ЭК человека второго пассажа HUVEC (Cambrex, USA), фибробласты линий L929 (АТСС №CCL-1) и NIH3T3 (АТСС №CRL-1658), и клетки почечного эпителия НЕК293 (АТСС №CRL-1573). Для культивирования клеток L929, NIH3T3 и НЕК293 использовали укомплектованную среду DMEM (Gibco, USA). Клетки HUVEC культивировали в укомплектованной среде EGM-2 (SingleQuotes, Cambrex). Для получения клонов клеток НЕК293, экспрессирующих Т-кадгерин, использовали ко-трансфекцию плазмидой pcDNA3.1/T-cad, содержащей полноразмерную кДНК Т-кадгерина человека и ген пуромицина, и плазмидой pcDNA3.1/GFP, содержащей ген зеленого флуоресцентного белка GFP. В качестве контроля клетки НЕК293 ко-трансфицировали плазмидами pcDNA3.1 (содержит фрагмент кДНК люциферазы в антисмысловой ориентации) и pcDNA3.1/GFP. Для трансфекции NIH3T3 и НЕК293 клеток использовали реагент Lipofectamine2000™ (Invirogen, USA), для трансфекции HUVEC -реагент CytoPure-tav (Qbiogen, USA).

Метод измерения активности SRE. При активации Rho ГТФаз в цитоплазме (RhoA, Racl и Cdc42) происходит активация SRE комплекса в ядре. Трансфекция плазмидой SRE.L, у которой под одним промотором находятся гены SRE и люциферазы, позволяет, измеряя уровень активности люциферазы, оценивать уровень активации Rho ГТФаз. Клетки NIH3T3 ко-трансфицировали плазмидами pcDNA3.1/T-cad, SRE.L и pCMV-b-Gal (для нормирования на уровень трансфекции). В качестве отрицательного контроля NIH3T3 клетки ко-трансфицировали плазмидами pcDNA3.1, SRE.L и pCMV-b-Gal. В качестве положительного контроля использовали клетки, ко-трансфицированные плазмидами pcDNA3.1/T-cad, SRE.L, pCMV-b-Gal, pi 14RhoGEF (кодирует фактор обмена нуклеотидов). Для подавления Т-кадгерин-опосредовашгой активации SRE клетки NIH3T3 ко-трансфицировали плазмидами pcDNA3.1/T-cad, SRE.L, pCMV-b-Gal и одной из плазмид, инактивирующих Rho ГТФазы (RhoN19, RaclN17 и Cdc42N19 для RhoA, Racl и Cdc42, соответственно). Через 24 ч после трансфекции клетки депривировали в течение 4 ч, лизировали, и в полученных лизатах определяли уровень активности люциферазы и Ь-галактозидазы, согласно инструкции производителя (Promega, USA). Эксперимент проводили в 5-ти параллелях и повторяли 5 раз. Данные представлены как среднее + стандартная ошибка среднего отношения активности люциферазы к активности Ь-галактозидазы, р<0,01.

Метод выделения активных Rho ГТФаз. Для выделения активных форм Rho ГТФаз использовали метод сефарозного осаждения GST (Glutathione S-Transferase)-pull down assay с последующим имунноблоттингом осажденных белков. Метод основан на

иммобилизации GST-белков на глутатион-сефарозу. В методе использовали белки, являющиеся эффекторами Rho ГТФаз, и способные связывать активные ГТФ-содержащис Rho ГТФазы. На основе экспрессионного вектора pGEX-2T были созданы две плазмиды, содержащие РАК.-связывающий домен (PBD) для активных Racl и Cdc42, и Rho-связывающий домен (RBD) для связывания активной RhoA. При последующей трансформации E.coli штамма DH5 соответствующими плазмидами были выделены и очищены GST-белки, содержащие PBD (GST-RBD) и RBD (GST-PBD) домены. Иммобилизацию GST-белков на глутатион-сефарозу (Amersham, USA) проводили при 4°С в течение ночи. Клетки NIH3T3 трансфицировали плазмидами pcDNA3.1, pcDNA3.1/T-cad, а также плазмидами, экспрессирующими активные формы Rho ГТФаз (RhoV12, RacV12, Cdc42V12) для положительного контроля. Через 48 ч после трансфекцни клетки лизировали в лтис-буфере (50 мМ Tris, 1% Triton Х-100, 0,5% дезоксихолат натрия, 500мМ NaCl, ЮмМ MgCh, ингибиторы протеаз), и лизаты инкубировали с GST-RBD или GST-PBD сефарозой при 4°С в течение 60 мин. После осаждения сефарозы методом центрифугирования, осадки инкубировали в стандартном лнзнрующем буфере Лаеммли для отделения сефарозы. Активные RhoA, Racl и Cdc42 ГТФазы определяли методом электрофореза в 14% полиакриламидном геле и последующим иммуноблоттннгом с использованием специфичных для каждой ГТФазы моноклональных антител. Общий уровень ГТФаз определяли в лизате, полученным обычным способом.

Гнперэкспрессия Т-кадгернна в HUVEC с использованием аленовнрусной трансдукции. Для гиперэкспрессии Т-кадгерина использовали аденовирусные конструкции, созданные на основе экспрессионной системы AdEasy™ (Quantum Biotechnologies, USA). Система AdEasy™ состоит из двух векторов: вектор pAdEasy, последовательность которого содержит аденовирусные гены, и pShuttle-CMV вектор (Transfer Vector), содержащий сайт множественного клонирования, позволяющий встроить интересующий ген, в нашем случае ген Т-кадгерина (pShuttle-CMV-T-cad) или контрольный ген (люциферазу) (pShuttle-CMV). В бактериях E.Coli штамма BJ5183 ко-трансформация двух плазмид pAdEasy и pShuttle-CMV-T-cad (или pAdEasy и контрольной pShuttle-CMV) позволяет получить одну рекомбинантную вирусную плазмиду pAd-T-cad (или контрольную pAd). Амплификацию и упаковку вируса проводили в клетках НЕК293А.

Подавление экспрессии Т-кадгерниа в HUVEC методом siRNA с использованием лентнвирусной трансдукции. Для подавления экспрессии Т-кадгерина в HUVEC методом siRNA использовали лентивирусный вектор pSIHl-Hl-CopGFP (System Bioscience, USA), предназначенный для экспрессии коротких шпилечных РНК (shRNA,

short hairpin RNA) и несущий ген зеленого флуоресцентного белка CopGFP для маркера трансдукции. Последовательность GGTGAGTGTCTTAGCATAT, способная служить эффективной мишенью мРНК Т-кадгерина, была отобрана при помощи тест-системы ООО "Фирма Мона" (Москва, РФ). Лентивирусная конструкция pSIHl-Hl-CopGFP-shRNA/T-cad, кодирующая shRNA Т-кадгерина, была упакована в VSV-G-псевдотипированные лентивирусные частицы (System Bioscience, USA). В качестве контрольной леитивирусной конструкции использовали вектор pSIHl-Hl-CopGFP-shRNA/Luc, кодирующий shRNA люциферазы.

Метод измерения проницаемости эндотелнальиого монослоя in vitro. HUVEC второго пассажа высаживали в верхнюю камеру на полупроницаемую мембрану трансвелл (Costar, USA) с размером пор 0,4 мкм и радиусом 6,5 мм, в количестве 105 клеток/лунку. Через 72 ч, после достижения монослоя, клеткам меняли среду на фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,1% раствор БСА. Через 10 мин в верхнюю камеру трансвелл вносили раствор декстрана, конъюгированного с флуоресцентным красителем FITC, имеющим молекулярную массу 40 кДа (Sigma, USA), в конечной концентрации 10 мкг/мл. Через 60 мин из нижней камеры отбирали 20 мкл аликвоты и измеряли интенсивность флуоресценции FITC при длине волны 525 нм (возбуждение -495 нм). Далее для последующих измерений пробы отбирали каждые 60 мин. Эксперимент проводили в 4-х параллелях и повторяли 5 раз. Данные представлены как среднее + стандартная ошибка среднего, р<0,001.

Метол экстракции актина. HUVEC высаживали в 6-ти луночные культуральные планшеты. При достижении клетками монослоя в лунки вносили холодный раствор фосфатно-солевого буфера, а затем 100 мкл экстрагирующего буфера (50мМ NaCl, 1мМ ЭГТА, 0,5% Triton Х-100, ингибиторы протеаз) и удаляли. В лунки культуралыюй планшеты, на которых оставались полимерные клеточные компоненты, вносили 1-кратный буфер Лаеммли и далее использовали. Количество полимеризованного актина определяли методом электрофореза клеточных лизатов, полученных после процедуры экстракции. Для этого использовали 10% полиакриламидный гель, с последующей окраской в 0,2% растворе красителя Serva Blau R (Coomassie Brilliant Blue R-250, Serva, Germany). Анализ полученного изображения проводили с использованием программы Scion Image 4.0 (USA).

Выделение и йоднрованне ЛИ П. ЛНП выделяли из свежей плазмы здоровых доноров методом препаративного ультрацентрифугирования в градиенте NaBr по методу Хавеля. Полученные ЛНП диализовали в течение 18 ч при 4°С против 6000 объемов ФСБ. Для йодирования ЛНП радиоактивным 1251 по тирозиновым остаткам белков использовали

моиохлорнд йода. Для определения удельной активности 10 мкл меченных ЛНП разводили в 800 мкл раствора NaCl/ЭДТА, затем добавляли равное количество раствора NaCl/ЭДТА, 100 мкл 0,2% раствора БСА (с конечной концентрацией 10 мг/мл), и 100 мкл 50% ТХУ для осаждения белка. Перемешивали и инкубировали 10 мин при комнатной температуре, после чего центрифугировали в течение 10 мин при 10000-13000 об/мин. Супернатат переносили в новые пробирки. Радиоактивность осадка и супернатата считали на у-счетчике.

Определение поверхностного связывания '"t-ЛНП с клетками. Клетки культивировали до состояния монослоя. Перед экспериментом чашки с клетками помещали на лед и промывали 3 раза холодной средой DMEM. Далее к клеткам добавляли по 1 мл среды DMEM, содержащей 0, 5, 10, 25, 50, 75, 100 мкг/мл меченых 1251-ЛНП. Для определения неспецифического связывания добавляли 50 кратный избыток немеченых ЛНП. Клетки инкубировали на льду 4 ч, через каждые 15-20 мин аккуратно перемешивая. Клетки лизировали раствором, содержащим 1% SDS и 0,1М NaOH, и далее переносили во флаконы, где с помощью у-счетчика определяли связанную с клетками радиоактивность. По известным данным (удельная активность ЛНП, среднее количество белка в лунке) рассчитывали параметры связывания с использованием программы Sigma Plot 8.0.

Определение концентрации виутриклеточиого Са2+. Измерение [Са2+]ш проводили методом флуоресцентной микроскопии с использованием двухволнового зонда Fura-2AM. Для измерения [Ca2+]¡„ клетки инкубировали 40 мин в СО: инкубаторе при 37°С в присутствии Fura-2AM в конечной концентрации 5 мкМ с константой диссоциации 225 нМ. При увеличении связывания молекул зонда с Са'+ спектр флуоресценции зонда смещается в более коротковолновую область. Для возбуждения флуоресценции использовали волны длиной 340 и 380 им, для эмиссии - 505 нм. Измерение минимального (Rmin) и максимального (Rmax) уровня свечения производилось путем последовательной инкубации клеток в следующих калибровочных растворах: для измерения Rmax - 130 мМ KCl, 5 мМ NaCl, 5 мМ СаС12, 5 мМ HEPES, 5 мМ Са2+ /Н+ ионофора иономицина, для измерения Rmin - бескальциевый буфер HBSS, содержащий 5 мМ ЭГТА. Результаты обрабатывали с использованием статистических программ: Graph Pad Prism 3.00 и Statistica 6.0.

Миграция L929 клеток в камере Бондена. За 24 ч до начала эксперимента клетки переводили на бессывороточную среду DMEM. В нижние ячейки камеры помещали раствор ЛНП в концентрации 60 мкг/мл. В качестве контролен использовали среду DMEM, содержащую ЛНП (60 мкг/мл), которые были предварительно проинкубированы с антителами против Т-кадгерина (Fab, 1 мкг/мл), а также DMEM, содержащую Fab (1

мкг/мл) Для отрицательного контроля использовали бессывороточную DMEM, содержащую 1% БСА. Верхние и нижние ячейки камеры разделяли мембраной (Neuro Probe Inc., USA) с размером пор 8 мкм. Промигрировавшие клетки на нижней стороне мембраны фиксировали в 96% этаноле в течение 5 мин, и окрашивали красителем DIFF-QUICK. Далее мембрану анализировали при помощи программы Scion Image 4.0 (USA). Эксперименты проводили в 5-6 параллелях и повторяли 3 раза. Данные представлены в таблице как среднее + стандартная ошибка среднего, р<0,05.

Статистическая обработка результатов. Статистический анализ данных проводили с использованием программы Statistica 6.0. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Т-кадгерин активирует Rho ГТФазы. Для оценки влияния экспрессии Т-кадгерина на активацию Rho ГТФаз мы использовали метод измерения SRE активности, отражающей активацию Rho ГТФаз. Для экспрессии Т-кадгерина клетки NIH3T3 трансфицировали плазмидой pcDNA3.1/T-cad или контрольной pcDNA3.1. Через 48 ч после трансфекции опытные клетки гиперэкспрессировали только зрелую форму Т-кадгерина молекулярной массой 105 кДа, тогда как в контрольных клетках экспрессия Т-кадгерина отсутствовала (данные не приведены).

Для выявления Т-кадгерин-опосредоваиной активации SRE, NIH3T3 клетки ко-трансфицировали плазмидами pcDNA3.1/T-cad, SRE.L и pCMV-b-Gal (T-cad на рис. 1); контрольные клетки ко-траисфицировали плазмидами pcDNA3.1, SRE.L и pCMV-b-Gal (копт на рис. 1). Т-кадгерин активировал SRE до уровня, сравнимого с положительным контролем (р114); уровень SRE для T-cad - 40±6,5, для pi 14 - 38±4 (р<0,05). При ко-экспрессии плазмид, несущих гены Т-кадгерина и pi 14 наблюдался аддитивный эффект, при котором степень активации SRE была в 1,57 раз больше, чем при экспрессии каждой из этих плазмид по отдельности (60±5,3 для T-cad и pi 14; 38±4 для pi 14, и 40±6,5 для Т-cad). На активность SRE влияют все Rho белки: RlioA, Racl и Cdc42 (Ponimashkin et al., 2002). Для выявления роли Т-кадгерина в активации каждой из этих ГТФаз, мы использовали плазмиды, специфически подавляющие активность RhoA, Racl и Cdc42. При ко-экспрессии Т-кадгерина и RacN17, а также Т-кадгерина и Cdc42N19, детектировалось частичное подавление активации SRE по сравнению с экспрессией только Т-кадгерииа. Однако при ко-экспрессии плазмид, несущих гены RhoN17 и Т-кадгерина, активация SRE соответствовала уровню активации SRE при экспрессии одного Т-кадгерина, и была сравнима с положительным контролем. Таким образом, полученные

данные позволяют предполагать, что экспрессия Т-кадгерина в Ы1НЗТЗ клетках опосредует активацию что свидетельствует об участии Т-кадгерина во

внутриклеточной сигнализации с участием ЯЬо ГТФаз, а также, что экспрессия Т-кадгерина вызывает активацию Яас1 и Сс1е42, но не влияет на !Ш>А сигнальный путь.

T-cad pi 14

T-cad T-cad T-cad T-cad pi 14 RhoNl RacN17 Cdc42N19

Рисунок 1. Гиперэкспрессия Т-кадгерина в клетках NIH3T3 (T-cad) активирует SRE до уровня, сравнимого с положительным контролем (р114). Ко-трансфекция Т-кадгерином (Т-cad) и RacN17, а также T-cad и Cdc42N19 вызывает достоверное подавление активации SRE. Ко-трансфекция T-cad и RhoNl7 не влияет на активность SRE, р<0,0!.

2. Т-кадгерин активирует Racl и Cdc42, но не RhoA. Для доказательства предположения о том, что Т-кадгерин избирательно активирует Rae 1 и Cdc42 ГТФазы, но не влияет на активность RhoA, мы выделили активные формы ГТФаз из NIH3T3 клеток методом осаждения с использованием сефарозы (GST pull-down assay). В качестве положительного контроля клетки трансфицировали плазмидами, несущими гены постоянно активных форм Rho ГТФаз: для RhoA -RhoV12, для Racl - RacV12, для Cdc42 -Cdc42V12. Уровень активных форм Racl и Cdc42 ГТФаз определяли по количеству белка, связанного с PBD-Racl и PBD-Cdc42, соответственно; уровень активной формы RhoA ГТФазы определяли по количеству белка, связанного с RBD-RhoA (рис. 2). Общий уровень RhoA, Racl и Cdc42 ГТФаз определяли в клеточном лизате, полученным обычным способом. Было обнаружено, что экспрессия Т-кадгерина активирует Racl и Cdc42 до уровня, сопоставимого с положительным контролем (рис. 2 а, б), в то время как активации RhoA не наблюдается (рис. 2, в). При этом общее содержание белка Racl, Cdc42 и RhoA при экспрессии Т-кадгерина в NIH3T3 клетках остается неизменным, что подтверждается данными иммуноблоттинга. Таким образом, полученные результаты позволяют утверждать, что экспрессия Т-кадгерина в NIH3T3 клетках вызывает активацию Racl и Cdc42 ГТФаз, но не влияет на активность RhoA ГТФазы.

Рисунок 2. Анализ содержания активных форм Rho ГТФаз методом

иммуноблоттинга. Клетки NIH3T3 трансфицировали плазмидой pcDNA3.1/T-cad для гиперэкспрессии Т-кадгерина или контрольной плазмидой pcDNA3.1. В качестве положительного контроля использовали плазмиды, кодирующие активные формы Rho ГТФаз: RhoV12. RacV12 и Cdc42V12 для Rho А, Racl и Cdc42 соответственно.

3. Т-кадгерин увеличивает содержание фосфорилированной LIMK1 и влияет на организацию микротрубочек в HUVEC. Микротрубочки являются динамическими структурами, изменение организации которых влияет на другие компоненты цитоскелета в клетке, в том числе и на формирование стресс фибрилл, а также на фенотип ЭК и проницаемость эндотелиального монослоя (Bishop and Hall, 2000; Wojciak-Stothard and Ridley, 2003; Gorovoy et al., 2005). Серин-треониновая киназа LIMK1 является важным связующим звеном между Rlio ГТФазами, микротрубочками и актиновым цитоскелетом в ЭК, которая в неактивной форме колокализуется с микротрубочками, а при фосфорилировании (активации) LIMK1 происходит диссоциация комплекса LIMK-микротрубочки, что приводит к деполимеризации микротрубочек, полимеризации стресс фибрилл актина и клеточному сокращению (Gorovoy et al., 2005). Для того чтобы оценить влияние Т-кадгерина на активность LIMK1, использовали клетки NIH3T3, ко-трансфицированные плазмидами pcDNA3.1/T-cad для экспрессии Т-кадгерина (или pcDNA3.1 в контроле) и плазмидой myc-LIMKl для усиления экспрессии LIMK1 киназы, содержащей также с-шус эпитоп. Через 48 ч после трансфекции в NIH3T3 клетках, экспрессирующих Т-кадгерин, уровень фософрилированной формы L1MK1 по данным иммуноблоттинга увеличивался. При этом общее количество LIMK1 в контрольных клетках и клетках, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин, не изменялось (рис. 3). Для изучения влияния Т-кадгерина на полимеризацию микротрубочек мы использовали более физиологичную модель - эндотелиальные клетки ранних пассажей, выделенные из

активный Racl общий Racl

активный Cdc42 общий Cdc42

prDN.U.1 pcDNAJ.l/T-cad U:uV12

fl>cl>N.\3.1 [mUVU.I/T™! Ctlc42V12

активный RlioA общий RlioA

(wI)\.U.l pcD'SXi.irr-aá RlmV12

пуповины человека (HUVEC). HUVEC 2 пассажа ко-трансфицировали плазмидой pcDNA3.1/T-cad для гиперэкспрессии Т-кадгерина и плазмидой pcDNA3.1/GFP - для визуализации трансфекции. Интенсивность окрашивания антителами к а-тубулину в GFP-экспрессирующих HUVEC оценивали в условиях временной трансфекции. Для подавления нативной экспрессии Т-кадгерина HUVEC одновременно ко-трансфицировали плазмидой pcDNA3.1/GFP и РНК олигонуклеотидами. направленными против мРНК Т-кадгерина siRNA/T-cad (Dharmacon, USA) в концентрации 100 нМ.

p-LIMKl

с-шус

PCDNA3.1 myc-LIMKl

pcDNA3.1/T-cad myc-LIMKl

Рисунок 3. Гиперэкспрессия Т-кадгерина увеличивает содержание активной формы иМК1 в ИШЗТЗ клетках. Эффективность трансфекции оценивали с использованием антител против с-тус эпитопа.

Рисунок 4. Иммунофлуоресцентное окрашивание НиУЕС антителами против а-тубулина (красная флуоресценция). НЦУЕС 2 пассажа ко-трансфицировали плазмидами рсйМАЗ. 1/Т-сас/ и рсОКАЗА/СРР, или 51ША/Т-сасI и рсОЫА3.1/вГР. Масштаб -Юмкм.

Анализируя результаты иммунофлуоресцентного окрашивания НиУЕС, полученные с помощью конфокальной микроскопии, было обнаружено, что Т-кадгерин влияет на организацию микротрубочек: гиперэкспрессия Т-кадгерина вызывает разборку микротрубочек, а подавление экспрессии Т-кадгерина вызывает противоположный эффект - полимеризацию микротрубочек. На рисунке 4, на верхней панели, представлен характерный паттерн окрашивания: в трансфицированной клетке экспрессируется ОРР (зеленая флуоресценция) и гиперэкспрессируется Т-кадгерин, при этом интенсивность окрашивания антителами к а-тубулину (красная флуоресценция) и количество микротрубочек в этой клетке меньше, чем в окружающих нетрансфицированных клетках. На нижней панели рисунка 4, представлены эндотелиальные клетки, в одной из которых

а-тубулин

наложение

нативная экспрессия Т-кадгерина была подавлена с использованием siRNA/T-cad (зеленая флуоресценция). Интенсивность окрашивания антителами к а-тубулину и количество микротрубочек в этой клетке больше, чем в окружающих нетрансфицированных клетках. Таким образом, при гиперэкспрессии Т-кадгерина в HUVEC происходит деполимеризация микротрубочек, а при подавлении экспрессии Т-кадгерина, наоборот, увеличивается полимеризация микротрубочек.

4. Гиперэкспрессия Т-кадгерина увеличивает содержание стресс фибрилл актина в HUVEC. Для оценки влияния Т-кадгерина на состояние актинового цитоскелета мы использовали HUVEC, в которых гиперэкспрессировали Т-кадгерин методом аденовирусной трансдукции, а также HUVEC клетки, в которых экспрессию Т-кадгерина подавляли методом лентивирусной трансдукции. Состояние актинового цитоскелета оценивали методом иммунофлуоресцентного окрашивания на F-актин с использованием флуоресцентно меченного фаллоидина, и дальнейшим анализом с помощью конфокальной микроскопии и обработкой изображения. На основе коммерческой системы AdEasy™ (USA) был создан аденовирус, позволяющий с высокой степенью эффективности гиперэкспрессировать Т-кадгерин в HUVEC (pAd-T-cad), а также контрольный аденовирус (pAd). Анализ гиперэкспрессии Т-кадгерина в клетках, трансдуцированных вирусом pAd-T-cad и контрольным вирусом pAd, проводили методом иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием антител против Т-кадгерина.

Рисунок 5. Иммуиофлуоресцентное окрашивание HUVEC с

использованием флуоресцентно

меченного фаллоидина (красная флуоресценция). Гиперэкспреспт Т-кадгерина оценивали с помощью антител против Т-кадгерина (зеленая флуоресценция). Масштаб - 30 мкм.

Гиперэкспрессия Т-кадгерина в HUVEC (рис. 5) вызывала усиление полимеризации актина, преимущественно организованного в виде стресс фибрилл (красная флуоресценция) по сравнению с контрольными клетками. При полуколичественной оценке интенсивности флуоресценции с использованием программы Meta Morph было подтверждено, что в HUVEC клетках, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин, интенсивность

GFP F-актин наложение

Ш ■■ ХШ ' V v<- . £ •Ъч- V«" • ШШШШ Ю "¿Sffir "'Г -

флуоресценции фаллоиднна достоверно выше (р<0,05), чем в контроле (данные не приведены).

5. Подавление экспрессии Т-кадгерииа уменьшает содержание стресс фибрилл актина в 1ШУЕС. Для подавления нативной экспрессии Т-кадгерина в НиУЕС использовали лептивирусные конструкции, содержащие бЬШЧА, направленные против мРНК Т-кадгерина. В качестве маркера транедукцин в лентивирусную плазмиду был встроен ген зеленого флуоресцентного белка сорОРР. Были получены две лептивирусные, конструкции, способные эффективно подавлять экспрессию Т-кадгерина ^ЫЖА/Т-сас! 1 и 5ЫША/Т-саё2), а также две конструкции, одна из которых содержала ген сорОРР (сорОРР), а другая - ген сорйРР и вЫША люциферазы (вЫША/Ьис). Подавление экспрессии Т-кадгерина в НиУЕС оценивали через 72 ч после транедукцни лентивирусными конструкциями методом иммуноблоттинга. Анализ экспрессии Т-кадгерина в Н11УЕС, траисдуцированных вирусами 5ЫША/Т-сас11 и БЫША/Т-сасй, показал (данные не приведены), что регистрируется эффективное подавление экспрессии Т-кадгерина (как зрелой формы с молекулярной массой 105 кДа, так и предшественника с молекулярной массой 130 кДа). Экспрессия Т-кадгерина в НиУЕС, траисдуцированных контрольными лентивирусами (сорОРР и вЫША/Ьис) не изменялась и соответствовала экспрессии Т-кадгерина в нетранедуцированных Н1/УЕС. Результаты нормировали по экспрессии а-вАРОН.

Так же, как и при гиперэкспрессии Т-кадгерина, организацию актинового цитоскелета в НиУЕС оценивали методом иммунофлуоресцентного окрашивания Р-актина с использованием флуоресцентно меченного фаллоидина (красная флуоресценция). Полученные данные свидетельствуют о том, что в НИУЕС при подавлении экспрессии Т-кадгерина, наблюдается снижение уровня полимеризованного актина, организованного в виде стресс фибрилл (рис. 6, нижняя панель) по сравнению с контролем (рис. 6, верхняя панель), в то время как содержание актина в кортексе остается неизменным. Для подтверждения полученных результатов иммунофлуоресцентного окрашивания, мы использовали метод полуколичественного обсчета интенсивности флуоресценции фаллоидина, а также применили метод экстракции актина с последующим анализом количества полимеризованного актина в лизатах клеток методом иммуноблоттинга. Оказалось, что в НиУЕС при подавлении экспрессии Т-кадгерина наблюдается снижение интенсивности флуоресценции фаллоидина по сравнению с контролем (данные не приведены), а также снижается содержание полимеризованного актина по сравнению с контрольными клетками (рис. 7). Таким образом, подавление

нативной экспрессии Т-кадгерина вызывает уменьшение количества актиновых стресс фибрилл в НиУЕС клетках.

Р-актин

наложение

Рисунок 6. Иммунофлуоресцентное окрашивание НиУЕС с

использованием флуоресцентно

меченного фаллоидина (красная флуоресценция). Эффективность трансдукции оценивали по экспрессии йЕР (зеленая флуоресценция). Масштаб - 50 мкм

45 кДа

ЧНР'.зИ

11% Ц)_

Рисунок 7. Анализ экспрессии актина в НиУЕС методом иммуноблоттинга лизатов

вЫША/Ьис зЫША/Т-сасН

после экстракции мономерных компонентов. 45 кДа — актин.

6. Т-кадгерин изменяет экспрессию В-катеннна, но не УЕ-кадгерина.

Поскольку известно, что УЕ-кадгерин и Р-катенин участвуют в формировании прочной межклеточной адгезии, а нарушение локализации этих белков приводит к разрушению межклеточных контактов и увеличению проницаемости эндотелиального монослоя (Ногёук е1 а!., 1999), мы оценивали экспрессию и локализацию УЕ-кадгерина и р-катенина в НиУЕС. Методом зИдаА с использованием лентивирусной трансдукции мы подавляли эндогенную экспрессию Т-кадгерина в НиУЕС. Локализацию и уровень экспрессии УЕ-кадгерина и Р-катенина анализировали методом иммунофлуоресцентного окрашивания в сочетании с конфокальной микроскопией, а также методом иммуноблоттинга клеточных лизатов. Было обнаружено, что при подавлении экспрессии Т-кадгсрина уровень экспрессии р-катенина в НиУЕС увеличивается по сравнению с уровнем экспрессии Р-катенина в контроле (рис. 8). Полуколичественный анализ интенсивности флуоресценции показал, что при подавлении экспрессии Т-кадгерина с использованием лентивирусной конструкции, интенсивность окрашивания на р-катенин оказывалась достоверно выше по сравнению с интенсивностью окрашивания на р-катенин в клетках, транедуцированных контрольным вирусом (р<0,05) (данные не приведены). Эти результаты также были

подтверждены методом иммуноблоттинга: в лизатах НиУЕС при подавлении экспрессии Т-кадгерина количество (3-катенина было достоверно больше по сравнению с контрольными клетками (данные не приведены).

ОРР В-катенин наложение

Рисунок 8. Иммунофлуоресцентное окрашивание Н11УЕС антителами против ¡¡-катенина (красная флуоресценция). Эффективность трансдукции оценивали по экспрессии й¥Р (зеленая флуоресценция). Масштаб - Юмкм.

В то же время, ни подавление экспрессии Т-кадгерина, ни гиперэкспрессия Т-кадгерина в НиУЕС не вызывала достоверных отличий по уровню экспрессии и локализации УЕ-кадгерина по сравнению с контролем. Так, в НиУЕС, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин после трансдукции аденовирусом, паттерн окрашивания антителами к УЕ-кадгерину в зоне межклеточных контактов не изменялся по сравнению с контрольными клетками (рис. 9, красная флуоресценция). Полуколичественный анализ интенсивности флуоресценции УЕ-кадгерина также подтвердил этот результат: достоверных отличий в экспрессии УЕ-кадгерина в клетках, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин по сравнению с контрольными клетками обнаружено не было (р>0,05) (данные не приведены).

Подавление нативной экспрессии Т-кадгерина в НиУЕС с использованием лентивирусной трансдукции также не оказывало влияния на экспрессию и локализацию УЕ-кадгерина в зоне межклеточных контактов. Иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к УЕ-кадгерину не выявило различий в экспрессии и локализации этого белка в контрольных и опытных клетках. Полуколичественный анализ интенсивности флуоресценции при подавлении экспрессии Т-кадгерина также не выявил достоверных отличий (р>0,05) в экспрессии УЕ-кадгерина в контрольных и опытных клетках. Анализ методом иммуноблоттинга подтвердил полученные результаты иммунофлуоресцентного

окрашивания: в лизатах ЬШУЕС при подавлении экспрессии Т-кадгерина количество УЕ-кадгерина достоверно не различается в контрольных и опытных клетках, хотя наблюдалась некоторая тенденция увеличения содержания этого белка при подавлении экспрессии Т-кадгерина (данные не приведены). Таким образом было обнаружено, что подавление экспрессии Т-кадгерина в НиУЕС клетках увеличивает содержание р-катенина в ядре и цитоплазме клеток, но не изменяет экспрессию и локализацию УЕ-кадгерина на поверхности ЭК.

Т-кадгерин VE-кадгерин наложение

Рисунок 9. Иммунофлуоресцентное окрашивание HUVEC антителами против VE-кадгерина (красная флуоресценция). Гиперэкспрессию Т-кадгерина оценивали методом иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием антител против Т-кадгерина (зеленая флуоресценция). Масштаб - Юмкм.

7. Подавление экспрессии Т-кадгерина уменьшает проницаемость эндотелиального монослоя. Для оценки влияния Т-кадгерина на проницаемость эндотелиального монослоя in vitro использовали метод измерения проницаемости клеточного монослоя для молекул FITC-декстрана. В HUVEC подавляли эндогенную экспрессию Т-кадгерина методом siRNA с использованием лентивирусной трансдукции. При изучении динамики прохождения FITC-декстрана сквозь монослой HUVEC было обнаружено, что проницаемость монослоя HUVEC, трансдуцированных лентивирусными конструкциями, подавляющими экспрессию Т-кадгерина (shRNA/T-cadl и shRNA/T-cad2) достоверно снижалась на 30% уже через 2 ч после начала эксперимента по сравнению с контролем (р<0,001). В клетках, трансдуцированных контрольными конструкциями (copGFP и shRNA/Luc), проницаемость монослоя HUVEC для молекул FITC-декстрана соответствовала проницаемости в нетрансдуцированных HUVEC (рис. 10). Через 4 ч разница в проницаемости между опытом (shRNA/T-cadl и shRNA/T-cad2) и контролем

оказалась максимальной и составила 40%. Таким образом, экспрессия Т-кадгерина влияет на проницаемость эндотелиалыюго монослоя: подавление нативной экспрессии Т-кадгерина в НиУЕС значительно снижает проницаемость эндотелиалыюго монослоя по сравнению с контролем.

—♦ - контроль - -■- - copGFP bliR>.VLuc

—X— >bittiA/T-caU * АЮШГ-сШ

Рисунок 10. Измерение проницаемости монослоя HUVEC по интенсивности флуоресценции FITC-декстрана (FITC, OD). shRNAÍT-cadl и shRNA/T-cad2 - HUVEC, трансдуцированные лентивирусными конструкциями, подавляющими экспрессию Т-кадгерина; shRNA/Luc и copGFP - HUVEC, трансдуцированные контрольными лентивирусными конструкциями. Контроль - не трансдуцированные HUVEC, р<0,001.

8. Гипспэксппессня Т-кадгернна увеличивает связывание 1251-ЛНП с мембпаиами клеток L929 u НЕК293. Для изучения связывания ЛНП с мембранами клеток использовали ЛНП, выделенные из плазмы крови 8 здоровых доноров. График Скэтчарда, отражающий концентрационную зависимость связывания ,25[-ЛНП с мембранами клеток линий L929 и НЕК293, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин, и контрольных, оказался нелинейным, что свидетельствовало о том, что на мембранах клеток L929 имеется два участка связывания: высокоаффинный, имеющий Kd 1-2 мкг/мл, соответствующий классическому ano В, Е рецептору, и низкоаффинный сайт связывания ЛНП с Kj 40-50 мкг/мл, предположительно Т-кадгерин (данные не приведены). Специфическое низкоафшшое связывание ,251-ЛНП с клетками L929 представлено на рисунке 11 в виде кривых насыщения, из которого следует, что связывание 1251-ЛНП с мембранами клеток, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин, достоверно выше по сравнению с мембранами контрольных клеток. В таблице рисунка представлены параметры специфического связывания для низкоафинного участка. Поскольку достоверная разница

наблюдается только для величины Втах низкоафиниого участка связывания ЛНП в опытных клетках (р<0,05) по сравнению с контрольными, то можно сделать вывод о том, что пшерэкспрессия Т-кадгерина увеличивает число сайтов связывания ЛНП на поверности клеток по сравнению с контрольными клетками.

О 10 20 J0 40 50 60 70 S0 90 100 110

ЛНП, икг/ил

Рисунок 11. Кривая насыщения низкоафинного участка связывания 1-ЛНП с клетками L929. ТСЗ - клон, гиперэкспрессирующий Т-кадгерин; К9 — контрольный клон. Представлены результаты 6-ти независимых экспериментов, р<0,05.

9. Введение ЛНП в среду культивирования клеток, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин, повышает концентрацию внутриклеточного кальция. Измерение [Са2+]щ в клетках показало, что при добавлении ЛНП в среду культивирования происходит быстрое повышение концентрации [Са2+]т как в опытных клетках, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин (ТСЗ), так и в контрольных (К9) (рис. 12), длительность кальциевого ответа составляла около 120 сек. Амплитуда кальциевого ответа (разница [Са2+]|„ между исходным значением и значением после введения ЛНП) в клоне ТСЗ, гиперэкспрессирующим Т-кадгерин, составила 1200 нМ, а в контрольном К9 - 570 нМ. Результаты, полученные при измерении кальциевого ответа в клетках НЕК293, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин, и контрольных, были аналогичны результатам, полученным при измерении кальциевого ответа в клетках линии L929 (данные не приведены).

Для выявления участия ретикулума опосредовать увеличение [Са2>],„ при введении ЛНП мы использовали циклопиазоновую кислоту (CPA, cyclopiazonic acid), которая блокирует кальциевую АТФазу ЭПР и вызывает полное опустошение ЭПР (Beck et al.,

2003). Добавление CPA в концентрации 20 мкМ в течение 5 мин в среду инкубирования контрольных и гнпсрэкспрессирующих Т-кадгсрин клеток, приводило к быстрому увеличению [Ca2+]in. При этом последующее добавление ЛНП в клетки не вызывало увеличение концентрации кальция ни в контрольных клетках, ни в клетках, гиперэкспрессирующнх Т-кадгсрин. Этот эксперимент был проведен на двух клеточных линиях (L929 и НЕК293), где были получены аналогичные результаты (данные не приведены).

Для определения участия внеклеточного кальция и кальцивых каналов цитоплазматической мембраны опосредовать увеличение [Са2+]ш при добавлении ЛНП в среду инкубирования, мы регистрировали [Са2+]|„ в среде, содержащей 100 мкМ ЭГТА. Было обнаружено, что добавление ЛНП в бескальцневой среде инкубирования клеток увеличивает [Ca2+]jn, однако амплитуда кальциевого ответа оказалась значительно меньше амплитуды кальциевого ответа в среде со стандартным содержанием кальция (данные не приведены). В клетках линии НЕК293, гиперэкспрессирующнх Т-кадгерин (клон Th5), амплитуда кальциевого ответа составила 280 нМ, в контрольных клетках (клон GFP) - 80 нМ. В среде со стандартным содержанием кальция эти показатели были следующими: в контроле 180 нМ, в опыте - 380 нМ (клон Th5). Аналогичные результаты были получены для клеточной линии L929.

Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что повышение [Са2+];„ в клетках, гнпсрэкспрессирующих Т-кадгерин, в ответ на введение ЛНП, обусловлено в основном выходом Са2+ из ЭПР.

1500 1230 1 1000

Т, 780 ■

О

son-

239' О

ЛНП (60 июЛгл)

ПНП (60 мег/мл)

200 300 400 Время (се*)

гол зоо tea яю Время (сек)

Рисунок 12. Гипержспрессия Т-кадгерипа повышает [Са *]1п в ответ на введение ЛНП. ЛНП (60 мкг/мл) добавляли в среду культивирования клеток линии ¿929, контрольных (А, клон К9), или гипержепрессирующих Т-кадгсрин (Б, клон ТСЗ).

10. ЛНП стимулируют миграцию клеток, гиперэкспрессирующнх Т-калгсрнн.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что Т-кадгерин опосредует сигнальные эффекты ЛНП в разных типах клеток. При изучении физиологического значения ЛНП-опосредованных сигнальных эффектов с участием Т-кадгерина мы обнаружили, что клетки, гиперэкспрессирующие Т-кадгерин, обладают более высокой способностью к спонтанной миграции и активнее мигрируют в ответ на добавление ЛНП в качестве хемоагграктанта. В верхнюю миграционную камеру Бойдена помещали клетки 1.929, гиперэкспрессирующие Т-кадгерин (клон ТСЗ), или контрольные (клон К9), а в нижнюю камеру добавляли раствор ЛНП (60 мкг/мл). Изучая миграцию клеток мы обнаружили, что клетки ТСЗ обладают сами по себе более выраженой спонтанной миграцией по сравнению с контрольными клетками К9, кроме того, ТСЗ клетки мигрируют по градиенту ЛНП в 1,5 раза сильнее по сравнению с контрольными клетками К9 (таблица). Специфичные РаЬ-фрагменты иммуноглобулинов против Т-кадгерина достоверно снижают стимулирующий эффект липопротеидов на клеточную миграцию для обоих типов клеток, что предполагает блокирование связывания ЛНП с Т-кадгерином, а также специфичность миграции Т-кадгерина по градиенту ЛНП. Таким образом, экспрессия Т-кадгерина стимулирует спонтанную клеточную миграцию, однако добавление ЛНП в качестве хемоаттрактанта стимулирует этот эффект.

Таблица. Миграция клеток линии Ь929 по градиенту ЛНП (60 мкг/мл).

Условия Миграция, относительные единицы

Ь929 клетки, контроль (К9) 1*929 клетки, экспрессирующне Т-кадгерин (ТСЗ)

1 % БСА 9,4±2,5 22±3

ЛНП 40±3 60±2

ЛИП+ИаЬ 18,7±3,7 15,3±5

РаЬ 10,7±1,5 19,6±3

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, суммируя полученные в настоящей работе результаты в виде схемы на рисунке 13, можно сделать выводы о том, что Т-кадгерин является низкоаффинным сайтом связывания ЛНП на поверхности клеток; связывание ЛНП с Т-кадгерином вызывает активацию внутриклеточной сигнализации в виде повышения концентрации [Са2+]1„, что, в основном, происходит за счет выхода кальция из ЭПР. Кроме того, Т-кадгерин участвует в активации внутриклеточной сигнализации с участием ШюГТФаз: вызывает активацию Лас! и С<1с42, и не влияет на активацию ШюА ГТФазы. Активация 11ас1/С<1с42 вызывает фосфоршшрование 1ЛМК1 киназы, что приводит к

перестройкам актинового и мнкротрубочкового цитоскелста. Подавление экспрессии Т-кадгерина в ЭК уменьшает проницаемость эндотелиалыюго монослоя, и увеличивает содержание (З-катешша в клетках, однако не влияет на экспрессию и локализацию УЕ-кадгерина на поверхности ЭК.

Т-кадгерин УЕ-кадгерин

Рисунок 13. Влияние экспрессии Т-кадгергша па активацию систем внутриклеточной сигнализации.

ВЫВОДЫ

1. Т-кадгерин активирует Яас1 и С(1с42 ГТФазы и вызывает реорганизацию микротрубочек и актинового цитоскелета в эндотелиальных клетках.

2. Подавление экспрессии Т-кадгерина снижает проницаемость эндотелиалыюго монослоя.

3. Подавление экспрессии Т-кадгерина в эндотелиальных клетках увеличивает содержание (3-катенина, однако не влияет на экспрессию и локализацию УЕ-кадгерина.

4. Увеличение экспрессии Т-кадгерина повышает связывание липопротеидов низкой плотности с мембранами клеток, и стимулирует выход ионов кальция из эндоплазматического ретикулума в цитозоль.

5. Гиперэкспрессия Т-кадгерина стимулирует миграцию клеток, а липопротеиды низкой плотности усиливают эффект Т-кадгерина.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БСА бычий сывороточный альбумин

ГМК - гладко-мышечные клетки

ЛНП - липопротеиды низкой плотности

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭК - эндотелиальные клетки

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

GFP - зеленый флуоресцентный белок

HUVEC - эндотелиальные клетки пуповины человека

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ]. Таловская Е.В., Черенков В., Гурченко И., Рубина К.А., Парфенова Е.В., Пинелис В.Г., Сторожевых Т.П., Ткачук В.А. Связывание липопротеидов низкой плотности с Т-кадгерином вызывает повышение внутриклеточного кальция. Российская Кардиология: от центра к регионам. Материалы Конгресса, 2004,468-469.

2. Rubina К.A., Talovskaya E.V., Voyno-Yasenetskaya, Т.А., Tkachuk V.A. The role of T-cadherin as a Guidance Receptor in Tissue Patterning and Morphogenesis. The FASEB Journal,

2004, 18(8): 297.

3. Rubina K.., Talovskaya E., Cherenkov V., Stambolsky D., Storozhevikh Т., Pinelis V., Shevelev A., Parfyonova Ye., Resink Т., Erne P., Tkachuk V. LDL induces intracellular signaling and cell migration via atypical LDL-binding protein T-cadherin. Mol. Cell. Biochem.,

2005, 273 (1-2): 33-41.

4. Talovskaya E., Rubina K., Cherenkov V., Storozhevikh Т., Pinelis V., Parfyonova Y., Tkachuk V. T-cadherin is an atypical LDL-receptor: LDL binding causes intracellular signaling. FEBS Journal, 2005,272: slO.

5. Ткачук B.A., Стамбольский Д.В., Рубина K.A., Таловская Е.В., Черенков В.А., Сторожевых Т.П., Пинелис В.Г., Иванов Д.Б., Войно-Ясенецкая Т.А., Парфенова Е.В. Т-кадгерин-новый рецептор липопротеидов плазмы крови, влияющий на клеточную миграцию. Технологии живых систем, 2005,2 (1-2): 27 - 36.

6. Talovskaya E., Gorovoy M., Rubina K.., Tkachuk V., Voyno-Yasenetskaya T. T-cadhcrin regulates microtubules and Rlio family proteins. 2006. Vascular Pharmacology, 45 (3): 82-83.

7. Рубина K.A., Калинина Н.И., Семина E.B., Потехина А.В., Ефименко АЛО., Ратнер Е.И., Ткачук В.А., Парфенова Е.В. Роль Т-кадгрина в регуляции роста кровеносных сосудов. Кардиологический вестник, 2007,2 (2): 15-23.

8. Rubina К., Kalinina N., Potekhina A., Efimenko A., Scmina Е., Poliakov A., Wilkinson D., Parfyonova Y., Tkachuk V. T-cadherin suppresses angiogenesis in vivo by inhibiting migration of endothelial cells. Angiogenesis, 2007, 10: 183-195.

9. Семина E.B., Рубина K.A., Руткевич П.Н., Вонно-Ясенецкая Т.А., Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Т-кадгерин активирует Racl и Cdc42 ГТФазы и влияет на проницаемость эндотелия. Биохимия, 2009, 74 (4):

Подписано в печать 20 января 2009 г. Объем 1,0 п. л. Тираж 120 экз. Заказ №41

Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Семина, Екатерина Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Суперсемейство ка'дгеринов

1.2 "Классические" кадгерины. Структура кадгеринового комплекса

1.3 Кадгерины в клетках сосудов

1.4 Механизмы регуляции проницаемости эндотелия

1.5 Регуляция кадгерин-опосредуемой межклеточной адгезии путем фосфорилирования

1.6 Влияние кадгеринового комплекса на активацию внутриклеточных сигнальных путей

1.7 Т-кадгерин опосредует внутриклеточную сигнализацию

1.8 Роль Т-кадгерина в сосудистой системе в норме и при патологии

1.9 Т-кадгерин регулирует пролиферацию клеток и опухолевый рост

1.10 Т-кадгерин опосредует сигнальные эффекты ЛПН в клетках сосудов

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы

2.2 Культивирование эукариотических клеток

2.3 Трансфекция эукариотических клеток и селекция клонов

2.4 Приготовление лизатов клеток

2.5 Определение концентрации белка в лизатах клеток

2.6 Электрофорез белков и иммуноблоттинг

2.7 Метод измерения активности SRE

2.8 Метод выделения активных Rho ГТФаз (GST-pull-down assay)

2.9 Иммунофлуоресцентное окрашивание эндотелиальных клеток

2.10 Гиперэкспрессия Т-кадгерина в ЭК с использованием аденовирусной трансдукции

2.11 Подавление нативной экспрессии Т-кадгерина в ЭК методом siRNA с использованием лентивирусной трансдукции

2.12 Метод измерения проницаемости эндотелиального монослоя in vitro

2.13 Метод экстракции актина

2.14 Выделение и йодирование ЛНП

2.15 Определение поверхностного связывания I-ЛНП с клетками

2.16 Определение концентрации внутриклеточного Са

2.17 Миграция L929 клеток в микрокамере Бойдена

2.18 Статистическая обработка результатов

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Т-кадгерин активирует Rho ГТФазы

3.2 Т-кадгерин активирует Racl и Cdc42, но не влияет на активность RhoA

3.3 Т-кадгерин увеличивает содержание фосфорилированной LIMK1 и влияет на организацию микротрубочек в ЭК

3.4 Гиперэкспрессия Т-кадгерина увеличивает содержание стресс фибрилл актина

3.5 Подавление экспрессии Т-кадгерина уменьшает содержание стресс фибрилл актина в ЭК

3.6 Т-кадгерин изменяет экспрессию Р-катенина, но не VE-кадгерина

3.7 Подавление экспрессии Т-кадгерина уменьшает проницаемость эндотелиального монослоя

3.8 Получение клонов клеток, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин. Анализ экспрессии

Т-кадгерина в клонах

3.9 Гиперэкспрессия Т-кадгерина увеличивает связывание 1251-ЛНП с мембранами клеток L929 и НЕК

3.10 Введение ЛНП в среду культивирования клеток, гиперэкспрессирующих

Т-кадгерин, повышает концентрацию внутриклеточного кальция

3.11 ЛНП стимулируют миграцию клеток, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 104 ВЫВОДЫ 124 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АК - адгезивные контакты

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГМК — гладкомышечные клетки

ГФИ - гликозилфосфатидилинозитол

ГТФаза-гуанозинтрифосфатаза кДНК - комплементарная ДНК

ЛНП - липопротеиды низкой плотности

МТ - микротрубочки

CPA - cyclopiazonic acid, циклопиазоновая кислота

ФБС - фетальная бычья сыворотка

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭК - эндотелиальные клетки

ЭПР - эндоплазматический ретикулум b-Gal - b-galactosidase, b-галактозидаза

DAG - diacyl glycerol, диацил глицерол

DMEM - Dulbecco's Modified Eagle's Medium, среда Игла, модифицированная Дульбекко

DsRed - красный флуоресцентный белок

GAP - GTPase activator protein, белок, активирующий ГТФазы

GAPDH - glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, глицероальдегидфосфатдегидрогеназа

GDI - GDP dissociation inhibitor, ингибитор диссоциации ГДФ

GDP -guanidine diphosphate, гуанин дифосфат

GEF - guanidine exchange factor, фактор обмена гуанина

GFP - green fluorescent protein, зелёный флуоресцентный белок

GPCR — G protein coupled receptor, рецептор, ассоциированный с G белком

GTP - guanidine triphosphate, гуанин трифосфат

HAV- His, Ala, Val, последовательность аминокислот гистамина, аланина, валина НСС - hepatocellular carcinoma, гепатоцеллюлярная карцинома

HUVEC — human umbilical vein endothelial cells, эндотелиальные клетки пуповины человека

IP3 - inositol triphosphate, инозитол трифосфат

LRP - LDL-receptor-related protein, ЛНП-подобный рецептор

Luc - luciferase, люцифераза

МАРК - mitogen activated protein kinase, митоген активируемая протеин киназа

MLC - myosin light chain, легкие цепи миозина

MLCK - myosin light chain kinase, киназа легких цепей миозина

ММР - matrix metalloproteinases, матриксные металлопротеиназы

OD - optical density, оптическая плотность

PIP2 - phosphatidylinositol bisphosphate, фосфатидилинозитол дифосфат

РКС - protein kinase С, протеинкиназа С

PKG - protein kinase G, протеинкиназа G

PLC - phospholipase С, фосфолипаза С

РТК -protein tyrosine kinase, тирозиновая киназа

РТР - protein tyrosine phosphatase, тирозиновая фосфатаза

ROCK - Rho kinase, Rho киназа

ROS - reactive oxygen spies, активные формы кислорода

RPTP — receptor-like protein tyrosine phosphatases, рецепторные тирозиновые фосфатазы

SDS - sodium dodecyl sulphate, додецилсульфат натрия shRNA - short hairpin RNA, короткие РНК шпилечной структуры siRNA - small interfering RNA, малые интерферирующие РНК

SOC - store operated channels, ретикулярные кальциевые каналы эндоплазматического ретикулума SRE - Serum Response Element

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение влияния Т-кадгерина на проницаемость эндотелиального монослоя, организацию цитоскелета и системы внутриклеточной сигнализации"

В нашей лаборатории было обнаружено, что на мембранах гладкомышечных клеток (ГМК) сосудов существует участок низкоафинного связывания липопротеидов низкой плотности (ЛНП), способный активировать системы внутриклеточной сигнализации (Bochkov et al., 1993; Bochkov et al., 1994). Связывание низкоафинного участка с ЛНП на мембранах ГМК стимулирует фосфоинозититидный обмен, активирует фосфолипазу С и вызывает мобилизацию внутриклеточного Са" (Bochkov et al., 1993). В отличие от хорошо изученного "метаболического" действия ЛНП, опосредуемого классическим рецептором ЛНП (апо В,Е-рецептором), механизмы сигнальных ("гормоноподобных") эффектов ЛНП неизвестны. Быстрота, насыщаемость и обратимость, характерная для "гормоноподобных" эффектов ЛНП, свидетельствует об участии специфического рецептора в передаче сигнала от ЛНП внутрь клетки, однако ни природа предполагаемого рецептора, ни механизмы его сопряжения с системами вторичных посредников до конца не выяснены.

В поисках рецептора, опосредующего сигнальные эффекты ЛНП, в нашей лаборатории методом лигандного блоттинга был выделен, очищен и охарактеризован белок, имеющий молекулярную массу 130/105 кДа. Анализ чувствительности к различным ингибиторам показал, что р 105/130 является новым ЛНП-связывающим белком, отличным от всех известных рецепторов (Bochkov et al., 1996). Параметры связывания 1251-ЛНП с р 105/130 совпадают с параметрами ЛНП-опосредованной активации систем вторичных посредников

Bochkov et al., 1996). Сиквенирование очищенного белка р105/130 показало, что его аминокислотная последовательность соответствует последовательности Т-кадгерина; р105 представляет собой зрелую форму белка, а р130 - его предшественник (Tkachuk et al, 1998).

Было показано, что связывание Т-кадгерина с ЛНП ингибируется антителами против ЛНП антитела против апо В белка) и поликлональными антителами против Т-кадгерина, произведенными в нашей лаборатории (Bochkov et al., 1996). Однако эти данные лишь косвенно свидетельствуют о том, что Т-кадгерин, возможно, является низкоафинным участком связывания ЛНП, и возможно участвует во внутриклеточной сигнализации, опосредованной связыванием ЛНП с поверхностью клетки.

Т-кадгерин является уникальным представителем кадгеринового суперсемейства: внеклеточная часть Т-кадгерина, как и у всех "классических" кадгеринов, состоит из пяти Са2+-связывающих доменов (Ivanov et al., 2001), в то же время, Т-кадгерин не имеет ни трансмембранного, ни внутриклеточного доменов и заякорен на цитоплазматической мембране через гликозилфосфатидилинозитол (ГФИ) (Ranscht and Dourz-Zimmermann, 1991; Vestal and Ranscht, 1992). Межклеточные контакты, в состав которых входят "классические" кадгерины, формируются в результате взаимодействия гомологичных N-концевых внеклеточных доменов кадгеринов, расположенных на мембранах соседних клеток. Стабильность адгезивных контактов опосредуется взаимодействием внутриклеточных доменов кадгеринов с компонентами актинового цитоскелета (Angst et al., 2001). Кальций-зависимая гомофильная межклеточная адгезия играет важную роль при формировании органов и тканей в эмбриогенезе и в поддержании нормальной структуры тканей во взрослом организме (Perez-Moreno et al., 2003). Отсутствие трансмембранного и цитоплазматического доменов, а также локализация Т-кадгерина в липидных плотах (Philippova et al., 1998), в местах сосредоточения многих сигнальных путей (Src киназ, малых G белков, рецептора урокиназы и др.), предполагает участие Т-кадгерина во внутриклеточной сигнализации, а не в обеспечении прочной межклеточной адгезии.

Изначально Т-кадгерин был выделен из эмбрионов цыпленка, где он выполняет функцию негативного регулирования прорастания аксонов по механизму гомофильного связывания и контактного торможения (Ranscht et al., 1991; Fredette and Ranscht, 1994; Fredette et al., 1996). Аналогичным образом Т-кадгерин выполняет навигационную функцию при неоангиогенезе, что было показано в нашей лаборатории на модели прорастания сосудов в матригель, вводимого мышам линии NUDE подкожно. При этом Т-кадгерин играет ингибирующую роль, подавляя начальные этапы ангиогенеза in vivo и миграцию эндотелиальных клеток (ЭК) in vitro (Rubina et al., 2007). Локализация Т-кадгерина на конусе роста прорастающих к своим мишеням аксонов мотонейронов (Fredette et al., 1996), участие Т-кадгерина в прорастании мелких сосудов и капилляров при неоангиогенезе и опухолевом ангиогенезе (Wyder et al., 2000; Rubina et al., 2007), а также локализация Т-кадгерина на лидирующем крае мигрирующих эндотелиальных клеток (Ivanov et al., 2004), позволило сделать предположение о том, что Т-кадгерин является навигационным рецептором, участвующим в активации систем внутриклеточной сигнализации. В литературе имеются отдельные данные, подтвержадющие это предположение: в модельных экспериментах на культуре клеток in vitro было показано, что взаимодействие между молекулами Т-кадгерина на поверхности эндотелиальных клеток приводит к активации RhoA и Racl сигнальных путей, изменению организации актинового цитоскелета и смене клеточного фенотипа с нормального на промиграторный (Philippova et al., 2003; Philippova et al., 2005). Кроме того, способность эндотелиальных клеток, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин, прикрепляться и распластываться на субстрате, содержащем рекомбинантный Т-кадгерин, достоверно снижается по сравнению с контролем (Philippova et al., 2005). Тем не менее, следует отметить, что подавление активности RhoA и Racl сигнальных путей лишь частично снимает Т-кадгерин-зависимые изменения клеточного фенотипа, что позволяет предполагать осуществование дополнительных путей передачи сигнала с Т-кадгерина внутрь клетки.

Таким образом, целью данной работы было оценить влияние экспрессии Т-кадгерина на активацию систем внутриклеточной сигнализации, реорганизацию компонентов цитоскелета и проницаемость эндотелиального монослоя.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: оценить влияние экспрессии Т-кадгерина на

1. Активацию внутриклеточной сигнализации с участием Rho ГТФаз и реорганизацию цитоскелета.

2. Проницаемость эндотелиального монослоя.

3. Экспрессию и локализацию VE-кадгерина и р-катенина в межклеточных контактах. 1

4. Связывание I-ЛНП с поверхностью клеток.

5. Изменение концентрации внутриклеточного кальция в ответ на добавление ЛНП в среду инкубирования.

6. Миграцию клеток по градиенту ЛНП.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Семина, Екатерина Владимировна

выводы

1. Т-кадгерин активирует Racl и Cdc42 ГТФазы и вызывает реорганизацию микротрубочек и актинового цитоскелета в эндотелиальных клетках.

2. Подавление экспрессии Т-кадгерина снижает проницаемость эндотелиального монослоя.

3. Подавление экспрессии Т-кадгерина в эндотелиальных клетках увеличивает содержание Р-катенина, однако не влияет на экспрессию и локализацию VE-кадгерина.

4. Увеличение экспрессии Т-кадгерина повышает связывание липопротеидов низкой плотности с мембранами клеток, и стимулирует выход ионов кальция из эндоплазматического ретикулума в цитозоль.

5. Гиперэкспрессия Т-кадгерина стимулирует миграцию клеток, а липопротеиды низкой плотности усиливают эффект Т-кадгерина.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Семина, Екатерина Владимировна, Москва

1. Adler E. M. (2006) Identifying the CRAC channel. Science. (353): 325-360.

2. Aelst L.V., Souza-Schorey S.D. (1997) Rho GTPases and signaling networks. Genes and Development 11 (18); 2295-2322.

3. Allen S., Khan S., Mohanna F., Batten P., Yacoub M. (1998) Native low density lipoprotein-induced calcium transients trigger VCAM-1 and E-selectin in cultured human vascular endothelial cells. J. Clin. Invest. 101 (5): 1064-1075.

4. Angst B.D., Marcozzi C., Magee A.l. (2001) The cadherin superfamily: diversity in form and function. J. Cell. Sci. 114: 629-641.

5. Argraves K.M., Battey F.D., MacCalman C.D., McCrae K.R., Gafvels M., Kozarsky K.F.,

6. Chappell D.A., Strauss J.F., Strickland D.K. (1995) The very low density lipoprotein receptormediates the cellular catabolism of lipoprotein lipase and urokinase-plasminogen activator inhibitor type I complexes. J. В. C. 270 (44): 26550-26557.

7. Bai S., Datta J., Jacob S., Ghoshal K. (2007). Treatment of PC 12 cells with Nerve Growth Factor induces proteasomal degradation of T-Cadherin that requires tyrosine phosphorylation of its cadherin domain. J.B.C. 282 (37): 27171-27180.

8. Bai S., Ghoshal K., Datta J., Majumder S., Yoon S., Jacob S. (2005) DNA methyltransferase 3b regulates nerve growth factor-induced differentiation of PC 12 cells by recruiting histone deacetylase. Mol. Cell. Biol. 25: 751-766.

9. Bai S., Ghoshal K., Jacob S. (2006) Identification of T-cadherin as a novel target of DNA methyltransferase 3B and its ole in suppression of NGF-mediated neurite outgrowth in PC 12 cells. J.B.C. 281 (19): 13604-13611.

10. Beck A., Lohr C., Nett W., Deitmer J.W. (2001) Bursting activity in leech Retzius neurons induced low external chloride. Pflugers Arch. 442 (2): 263-272.

11. Beck A., Nieden R., Schneider H., Deitmer J. (2004) Calcium release from intracellular stores in rodent astrocytes and neurons in situ. Cell Calcium. 35 (1): 47-58.

12. Beisiegel U., Weber W., Ihrke G. (1989) The LDL-receptor-related protein, LRR, is an apolipoprotein E-binding protein. Nature. 341: 162-164.

13. Bershadsky A., Chausovsky A., Becker E., Lyubimova A., Geiger B. (1996) Involvement of microtubules in the control of adhesion dependent signal transduction. Curr. Biol. 6 (10): 1279-1289.

14. Bershadsky A.D., Ballestrem C., Carramusa L., Ziberman Y., Gilguin B. et al. (2006) Assembly and mechanosensory function of focal adhesions: experiments and models. Eur. J. Cell Biol. 85 (3-4): 165-173.

15. Bishop A., Hall A. (2000) Rho GTPases and their effector proteins. Biochem J. 348: 241-255.

16. Bochkov V.N., Rozhkova T.A., Matchin Yu.G., Lyakishev A.A., Bochkova N.A., Borisova2+

17. Yu.L., Kukharchuk V.V., Tkachuk V.A. (1991) LDL-and agonist-induced Ca "mobilization in platelets of healthy subjects and in patients with familial hyperlipoproteinemia type II. Thromb Res. 61 (4): 403-409.

18. Bochkov V.N., Tkachuk V.A. (2005) The effect of lipoproteins on signal transduction in thrombocytes and vascular wall cells. Ross. Fiziol. Zh. Im. I.M. Sechenova. 91 (1): 12-30.

19. Bochkov V.N., Tkachuk V.A., Hahn A.W., Bernhardt J., Buhler F.R., Resink T.J. (1993) Concerted effects of lipoproteins and angiotensin II on signal transduction processes in vascular smooth muscle cells. Arterioscler. Thromb. 13 (9): 1261-1269.

20. Bochkov V.N., Tkachuk V.A., Philippova M.P., Stambolsky D.V., Buhler F.R., Resink T.J. (1996) Ligand selectivity of 105 kDa and 130 kDa lipoprotein-binding proteins in vascular-smooth-muscle-cell membranes is unique. Biochem. J. 317: 297-304.

21. Boggon Т.J., Murray J., Chappuis-Flamcnt S., Wong E., Gumbiner B.M., Shapiro L. (2002) C-cadherin structure and implications for the cell adhesion mechanisms. Science. 296: ИОВ-ИВ.

22. Bora P., Kaliappana S., Lyzogubova V., Tytarenkoa R., Thotakurab S., Viswanathanb Т., Boraa N. (2007) Expression of adiponectin in choroidal tissue and inhibition of laser induced choroidal neovascularization by adiponectin. FEBS Lett. 581: 1977-1982.

23. Bradford M. (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72: 248254.

24. Braga V.M. (1999) Small GTPases and regulation of cadherin dependent cell-cell adhesion. J. Clin. Pathol: Mol. Pathol. 52: 197-202.

25. Braga V.M. (2000) Cell-cell adhesion and signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 14: 546-556.

26. Brakenhielm E., Veitonmaki N., Cao R., Kihara S., Matsuzawa Y., Zhivotovsky В., Funahashi Cao Y. (2004) Adiponectin-induced antiangiogenesis and antitumor activity involve caspase-mediated endothelial cell apoptosis. PNAS. 101 (8): 2476-2481.

27. Breier G. (2000) Angiogenesis in embryonic development review. Placenta. 14: 11-15.

28. Brieher W.M., Gumbiner B.M. (1994) Regulation of C-cadherin functions during active induced morphogenesis ofXenopus animal caps. J.C.B. 126: 519-527.

29. Briggs M.W., Sacks D.B. (2003) IQGAP1 as a signal integrater: Ca2+, calmodulin, Cdc42 and the cytoskeleton. FEBS Lett. 542: 7-11.

30. Brown M.S., Goldstein J.L. (1986) A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232: 34-47.

31. Bruses J.L. (2000) Cadherin-mediated adhesion at the interneuronal synapse. Curr. Opin.Cell Biol. 12: 593-597.

32. Buhler F.R., Tkachuk V.A., Hahn A.W., Resink T.J. (1991) Low and high density lipoproteins as hormonal regulators of platelet, vascular endothelial and smooth muscle cells interactions: relevance to hypertension. J. Hypertension. 9: 28-36.

33. Calkins C.C., Hoepner B.L., Law C.M., Novak M.R., Setzer S.V., Hatzfeld M., Kowalczyk A.P. (2003) The Armadillo family protein p0071 is a VE-cadherin- and desmoplakin-binding protein. J. Celt. Chem. 278: 1774-1783.

34. Cattan C.E., Oberg K.C. (1999) Vinorelbine tartrate-induced pulmonary edema confirmed on rechallenge. Pharmacotherapy. 19: 992-994.

35. Cavallaro U., Leibner S., Dejana E. (2006) Endothelial cadherins and tumor angiogenesis. Exp. Cell. Res. 312(5): 659-667.

36. Chappuis-Flament S., Wong E., Hicks L.D., Kay C.M., Gumbiner B.M. (2001) Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion. J.C.B. 154: 231-243.

37. Chatterjee S., Mayor S., (2001) The GPI-anchor and the protein sorting. CMLS, Cell. Mol. LifcSci. 58: 1969-1987.

38. Cheng H., Wei S., Wei L., Verkhatky A. (2006) Calcium signaling in physiology and pathophysiology. Acta Pharma. Sinica. 27 (7): 767-772.

39. Chiesa A., Rapizzi E., Tosello V., Pinton P., Virgillo M., Fogarty K., Rizzuto R. (2001) Recombinant aquorin and green fluorescent protein as valuable tools inthe study of cell signaling. Biochem. J. 355: 1-12.

40. Christofori G., Semb H. (1999) The role of the cell-adhesion molecule E-cadherin as a tumorsupressor gene. Trends Biochem. Sci. 24: 73-76.

41. Clark D.J., Lin L., Kriz R.W., Ramesha C.S., Sultsman L.A. (1991) A novel arachidonic acid-selective cytosolic PLA2 contains a Ca-dependent translocation domain with homology to PKC and GAP. Cell. 65: 1043-1051.

42. Clowes A.W. Reidy M.A., Clowes M.M. (1983) Kinetics of cellular proliferation after arterial injury smooth muscle growth in the absence of endothelium. Lab. Invest. 49: 327-333.

43. Clowes A.W., Schwartz S.M. (1985) Significance of quiescent smooth muscle migration in the injured rat carotid artery. Circ. Res. 56: 139-145.

44. Colangelo S., Langille B.L., Steiner G., Gotlieb A.I. (1998) Alterations in endothelial F-actin microfilaments in rabbit aorta in hypercholesterolemia. Arter. Thromb. Vase. Biol. 18: 52-56.

45. Cowan C.A., Henkemeyer M. (2002) Ephrins in reverse, park and drive. Trends Cell Biol. 12: 339-346.

46. Danowski B.A. (1989) Microtubule dynamics in serum-starved and serum-stimulated Swiss 3T3 mouse fibroblasts: Implications for the relationship between serum-induced contractility and microtubules. Cell Mot. Cytosceleton. 40 (1): 1-12.

47. Davy A., Soriano P. (2005) Ephrins in vivo: look both ways. Dev. Dynamics.232: 1-10.

48. Dejana E. (1996) Endothelial adherens junctions: implication in the control of vascular permeability and angiogenesis. J. Clin. Invest. 98: 1949-1953.

49. Dejana E., Corada M., Lampugnani M.G. (1995) Endothelial cell-to-cell junctions. Faseb J. 9: 910-918.

50. Dejana E., Lampugnani M.G., Martinez-Estrada O., Bazzoni G. (2000) The molecular organization of endothelial junctions and their functional role in vascular morphogenesis and permeability. Int. J. Dev. Biol. 44: 743-748.

51. Desmouliere A., Geinoz A., Gabbiani F., Gabbiani G. (1993) Transforming growth factor B1 induces a-smooth muscle actin expression in granulation tissue myofibroblasts and inquiescent and growing cultured fibroblasts. J.C.B. 122: 103-111.

52. Doyle D.D., Goins G.E., Upshaw-Earley J., Page E., Ranscht В., Palfrey H.C. (1998) T-cadherin is a major glycophosphoinositol-anchored protein associated with noncaveolar detergent-insoluble domains of the cardiac sarcolemma. J.B.C. 273: 6937-6943.

53. Drees F., Pokutta S., Yamada S., Nelson W.J., Weis W.I. (2005) ff-Catenin is a molecular switch that binds E-cadherin-P-catenin and regulates actin-filament assembly. Cell. 123: 903915.

54. Drescher U. (1997) The Eph family in the patterning of neural development. Curr. Biol. 7: 799-807.

55. Dudek S.M., Garcia J.C. (2001) Cytoskeletal regulation of pulmonary vascular permeability. J. Appl. Physiol. 91: 1487-1500.

56. Dunn R.C., Schachter M., Miles C.M.M., Feher M.D., Tranter P.R., Bruckdorfer K.R., Sever P.S. (1988) Low-density lipoproteins increase intracellular calcium in aequorin-loaded platelets. FEBS Lett. 238 (2): 357-360.

57. Eliceiri B.P., Paul R., Schwartzberg P.L., Hood J.D., Leng J., Cheresh D.A. (1999) Selective requirement for Src kinases during VEGF-induced angiogenesis and vascular permeability. Mol Cell. 4:915-924.

58. Erez N., Zamir E., Gour B.J., Blaschuk O.W., Geiger B. (2004) Induction of apoptosis in cultured endothelial cells by a cadherin antagonist peptide: involvement of fibroblast growth factor receptor-mediated signaling. Exp. Cell. Res. 294: 366-378.

59. Esser S., Lampugnani M.G, Corada M., Dejana E., Risau W. (1998) Vascular endothelial growth factor induces VE-cadherin tyrosine phosphorylation in endothelial cells. J Cell Sci. Ill (13): 1853-1865.

60. Etienne-Manneville S., Hall A. (2002) Rho GTPases in cell biology. Nature. 420: 629-635.

61. Evers E.E., Zondag C.M., Malliri A., Price L.S., Klooster J., Kammen R.A., Collard J.G.2000) Rho family proteins in cell adhesion and cell migration. Eur. J. Cancer. 36: 1269-1274.

62. Feldser D., Agani F., IyerN.V., Рак В., Ferreira G., Semenza G.L. (1999) Reciprocal positive regulation of hypoxia-inducible factor lalpha and insulin-like growth factor 2. Cancer Res. 59:3915-3918.

63. Ferrara N., Gerber H.P., Le Couter J. (2003) The biology of VEGF and its receptors. Nat. Med. 9(6): 669-76.

64. Flaumenhaft R., Rifkin D.B. (1992) The extracellular regulation of growth factor action. Mol. Biol. Cell. 3:1057-1065.

65. Fleming T.P., Papenbrock Т., Fesenko I., Hausen P., Sheth B. (2000) Assembly of tight junctions during early vertebrate development. Cell. Dev. Biol. 11: 291-299.

66. Foty R.A., Steinberg M.S. (2004) Cadherin-mediated cell-cell adhesion and tissue segregation in relation to malignancy. Int. J. Dev. Biol. 48: 397-409.

67. Frank M., Kemler R. (2002) Protocadherins. Curr. Opin. Cell Biol. 14: 557-562.

68. Fredette B.J., Miller J., Ranscht B. (1996) Inhibition of motor axon growth by T-cadherin substrata. Development. 122 (10): 3163-3171.

69. Fredette B.J., Ranscht B. (1994) T-cadherin expression delineates specific regions of the developing motoraxon-hindlimb projection pathway. JNeurosci. 14 (12): 7331-7346.

70. Frenzel E.V., Johnson R.G. (1996) Gap junction formation between cultured embryonic lens cells is inhibited by antibody to N-cadherin. Developmental Biology. 179: 1 -16.

71. Fukuhra S., Sakurai A., Yamagishi A., Sako A., Mochizuki N. (2006) Vascular Endothelial Cadherin-mediated Cell-cell Adhesion Regulated by a Small GTPase, Rapl. J Biochem. Mol. Biol. 39(2): 132-139.

72. Gallicano G., Kouklis P., Bauer C., Yin M., Vasioukhin V., Degenstein L., Fuchs E. (1998) Desmoplakin is required early in development for assembly of desmosomes and cytoskeletal linkage. J.C.B. 143 (7): 2009-2022.

73. Gates J., Peifer M. (2005) Can 1000 reviews be wrong? Actin, a-catenin, and adherent junctions. Cell. 123: 769-771.

74. George S.J., Beeching C.A. (2006) Cadherin: catenin complex: A novel regulator of vascular smooth muscle cells behaviour. Atherosclerosis. 188: 1-11.

75. Gerhardt H., Wolburg H., Redies C. (2000) N-cadherin mediates pericytic-endothelial interaction during brain angiogenesis in the chicken. Dev. Dyn. 218: 472-479.

76. Gliemann J. (1998) Receptors of the low density lipoprotein (LDL) receptor family in man. Multiple functions of the large family members via interaction with complex ligands. Biol. Chem. 379 (8-9): 951-964.

77. Godt D., Tepass U. (1998) Drosophila oocyte localization is mediated by differential cadherin-based adhesion. Nature. 395: 387-391.

78. Goeger D.E., Riley R.T., Dorner J.W., Cole R.J. (1988) Cyclopiazonic acid inhibition of the Ca2+-transport ATPase in rat skeletal muscle sarcoplasmic reticulum vesicles. Biochem. Pharmacol. 37 (5): 987-981.

79. Goldstein J.L., Brown M.S., Anderson G.W., Russel D.W., Schneider W.J. (1985) Receptor-mediated endocytosis: concept emerging from the LDL receptor system. Ann. Rev. Cell. Biol. 1: 1-39.

80. Gorovoy M., Niu J., Bernard O., Profirovich J., Minshall J., Neamu R., Voyno-Yasenetskaya T. (2005) LIM kinase 1 coordinates microtubule stability and actin polymerization in human endothelial cells. J. В. C. 280 (28): 26533-26542.

81. Gory-Faure S., Pradini M.H., Pointu H., Roullot V., Pignot-Paintrad I., Vernet M., Huber P. (1999) Role of vascular endothelial-cadherin in vascular morphogenesis. Development. 126: 2093-2102.

82. Gotlieb A., Subrahmanyan L., Kalnins V. (1983) Microtubule-organizing centers and cell migration: effect of inhibition of migration and microtubule disruption in endothelial cells. J. С. B. 96: 1266-1272.

83. Gottardi C.J., Wong E., Gumbiner B.M. (2001) E-cadherin suppresses cellular transformation by inhibiting P-catenin signaling in an adhesion-dependent manner. J. С. B. 153: 1049-1060.

84. Goubaeva F., Giardina S., Yiu K., Parfyonova Ye., Tkachuk V.A. (2005) T-cadherin GPI-anchor is insufficient for apical targeting in MDCK cell. Biochem. Biophys. Res. Comm. 329 (2): 624-631.

85. Grynkewicz G., Poenie M., Tsien RY. (1985) A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol. Chem. 260 (6): 3440-3450.

86. Gumbiner B.M. (2000) Regulation of cadherin adhesive activity. J. С. B. 148: 399-404.

87. Gumbiner B.M. (2005) Regulation of cadherin-mediated adhesion in morphogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6: 622-634.

88. Guthrie S. (2002) Neuronal development: sorting out motor neurons. Curr. Biol. 12: 488-490.

89. Hall A., Nobes C.D. (2000) Rho GTPases: molecular switches that control the organization and dynamics of the actin cytoskeleton. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 355: 965970.

90. Harder Т., Simons К. (1999) Clusters of glycolipid and glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins in lymphoid cells: accumulation of actin regulated by local tyrosine phosphorylation. Eur. J. Immunol. 29 (2): 556-562.

91. Hatzfeld M. (1999) The armadillo family of structural proteins. Int. Rev. Cytol. 186: 179-224.

92. Havel R.J., Bragdon J.H. (1955) The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J. Clin. Invest. 34 (9): 1345-1353.

93. Helish A. (2003) Arteriogenesis: the development and growth of collateral arteries. Microcirculation. 10(1): 83-97.

94. Hibi K., Nakayama IT, Kodera K., Ito K., Akiyama S., Nakao A. (2004) CDH13 promoter region is specifically methylated in poorly differentiated colorectal cancer. Brit. J. Cancer. 90: 1030-1033.

95. Hill C.S., Wynne J., Treisman R. (1995) The Rho family GTPases RhoA, Racl, and Cdc42Hs regulate transcriptional activation by SRF. Cell. 81: 1159-1170.

96. Honda H.M., Wakamatsu B.K., Goldhaber J.I., Berliner J.A., Navab M., Weiss J.N. (1999) High-density lipoprotein increase calcium levels by releasing calcium from internal stores in human endothelial cells. Atherosclerosis. 143: 299-306.

97. Hordijk P.L., Anthony E., Mul E.P., Rienstma R., Oomen L.C., Roos D. (1999) Vascular-endothelial-cadherin modulates endothelial monolayer permeability. J. Cell Sci. 112: 1915-1923.

98. Hu G„ Place T.A., Minshall R.D (2007) Regulation of endothelial permeability by Src kinase signaling: Vascular leakage versus transcellular transport of drugs and macromolecules. Chemico-Biological Interactions, 171 (2): 177-189.

99. Huang Z., Wu Y.L., Hedrick N., Gutmann D.H. (2003) T-cadherin-mediated cell growth regulation involves G2 phase arrest and requires p21GlPAVAF1 expression. 23: 566-578.

100. Hug С., Wang J., Ahmad N.S., Bogan J.S., Tsao T.-S. (2004) T-cadherin is a receptor for hexameric and high-molecular weight forms of Acrp30/adiponectin. PNAS. 101 (28): 10308- 10313.

101. Huot J. (2004) Ephrin signaling in axon guidance. Prog. Neuro-Psycho. And Biol. Psych. 28:813-818.

102. Ilan N, Mahooti S., Rimm D.L., Madri J.A. (1999): PECAM-1 (CD3I) functions as a reservoir for and a modulator of tyrosine-phosphorylated beta-catenin. J. Cell Sci. 18: 30053014.

103. Ivanov D., Philippova M., Antropova J., Gubaeva F., Iljinskaya O., Tararak E., Bochkov V., Erne P., Resink Т., Tkachuk V. (2001) Expression of cell adhesion molecule T-cadherin in the human vasculature. Histochem. Cell. Biol. 115: 231-242.

104. Ivanov D., Philippova M., Tkachuk V., Erne P., Resink T. (2004) Cell adhesion molecule T-cadherin regulates vascular cell adhesion, phenotype and motility. Exp. Cell Res. 293:207-218.

105. Ivanov D.B., Philippova M.P., Tkachuk V.A. (2001) Structure and functions of classical cadherins. Biochemistry (Mosc). 66 (10): 1174-86.

106. Joshi M., Ivanov D., Philippova M., Erne P., Resink T. (2007) Integrin-linked kinase is an essential mediator for T-cadherin-dependent signaling via Akt and GSK3 in endothelial cells. FASEB. 21: 3083-3095.

107. Joshi M.B., Philippova M., Ivanov D., Allenspach R., Erne P., Resink T.J. (2005) T-cadherin protects endothelial cells from oxidative stress-induced apoptosis. The FASEB J. 19 (2): 1737-1739.

108. Kaplan D.D., Meigs Т.Е., Casey P.J. (2001) Distinct regions of the cadherin cytoplasmic domain are essential for functional interaction with Gai2 and p-catenin. J. В. C. 47: 44037-44043.

109. Kawakami M., Staub J., Clibi W., Hartmann L., Smith D.I., Shridhar V. (1999) Involvement of H-cadherin (CDH13) on 16q in the region of frequent deletion in ovarian cancer. Int. J. Oncol. 15: 715-720.

110. Kelley J.L., Rozek S., Seuenram C.A., Schwartz C.J. (1988) Activation of human peripheral monocytes by lipoproteins. Am. J. Pathol. 130: 223-231.

111. Kim J.S., Han J., Shim Y.M., Park J., Kim D.I I. (2005) Abberant methylation of H-cadherin (CDHI3) promoter is associated with tumor progression in primary nonsmall cell lung carcinoma. Cancer. 104(9): 1825-1833.

112. Knorr M., Locher R., Vogt E., Vetter W., Block L.H., Ferracin F., Lefkovits H., Pletscher A. (1988) Rapid activation of human platelets by low concentrations of low-density lipoprotein via phosphatidylinositol cycle. Eur. J. Biochem. 172: 753-759.

113. Kobayashi K., Inoguchi Т., Sonoda N., Seiguchi N., Nawata H. (2005) Adiponectin inhibits the binding of low-density lipoprotein to biglycan, a vascular proteoglycan. Biochem. Biophys. Res. Commun. 335 (1): 66-70.

114. Kobielak A., Pasolli H.A., Fuchs E. (2001) Mammalian formin-1 participates in adherens junctions and polymerization of linear actin cables. Natl. Cell Biol. 6: 21-30.

115. Koch A.W., Bozic D., Pert O., Engel J. (1999) Homophilic adhesion by cadherins. Curr. Opin. Struct. Biol. 9: 275-281.

116. Koller E., Ranscht B. (1996) Differential targeting of T- and N-cadherin in polarized epithelial cells. J. В. C. 271: 30061-30067.

117. Kouklis P., Konstantoulaki M., Malik A.B. (2003) VE-cadherin-induced Cdc42 signaling regulates formation of membrane protrusions in endothelial cells. J. В. C. 278: 16230-16236.

118. Koutsouki E., Beeching C.A., Slater S.C., Blaschuk G.B., Sala-Newby G.B., George S.J. (2005) N-cadherin-dependent cell-cell contacts promote human saphenous vein smooth muscle cell survival. Atheroscler. Thromb. Vase. Biol. 25: 982-988.

119. Kovacs E.M., Ali R.G., Cormack A.J., Yap A.S. (2002) E-cadherin homophilic ligation directly signals through Rac and phjsphatidylinositol 3-kinase to regulate adhesive contacts. J. В. C. 277: 6708-6718.

120. Kovacs E.M., Goodwin M., Ali R.G., Paterson A.D., Yap A.S. (2002) Cadherin-directed assembly: E-cadherin physically associates with the Arp2/3 complex to direct actin assembly in nascent adhesive contacts. Curr. Biol. 12: 397-382.

121. Krebs A., Goldie K., Hoenger A. (2005) Structural rearrangements in tubulin following microtubule formation. EMBO Rep. 6 (30): 227-232.

122. Kurokawa K„ Itoh R.E., Yoshizaki H., Ohba Y., Nakamura Т., Matsuda M. (2004) Coactivation of Racl and Cdc42 at Lamellipodia and Membrane Ruffles Induced by

123. Epidermal Growth Factor. Mol. Biol. Cell. 15 (3): 1003-1010.

124. Kuzmenko Y.S, Bochkov V.N., Philippova M.P., Tkachuk V.A., Resink T.J. (1994) Characterization of an atypical lipoprotein-binding protein in human aortic media membranes by ligand blotting. Biochem. J. 303: 281-287.

125. Larue L., Antos C., Butz S., Huber O., Delmas V., Dominis M., Kemler R. (1996) A role for cadherins in tissue formation. Development. 122: 3185-3194.

126. Lee S.W. (1996) H-cadherin, a novel cadherin with growth inhibitory functions and diminished expression in human breast cancer. Nat. Med. 2: 29-235.

127. Lee S.W., Reimer C.L., Campbell B.D., Cheresh P., Duda B.D., Kocher O. (1998) H-cadherin expression inhibits in vitro invasiveness and tumor formation in vivo. Carcinogenesis. 19: 1157-1159.

128. Lilien J., Balsamo J., Arregui C., Xu G. (2002) Turn-off, drop-out: function state switching of cadherins. Developmental Dynamics. 224: 18-29.

129. Lindgren F.T, Adamson G.L, Jenson L.C, Wood P.D. (1975) Lipid and lipoproteinmeasurements in a normal adult American population. Lipids. 10(12): 750-756.

130. Liu В., Sidiropoulos A., Zhao В., Dierichs R. (1998) Oxidized LDL damages cell monolayer and promotes thrombocyte adhesion. Am. J. Hemat. 57: 341-343.

131. Liu K., Pierce G. (1993) The effects of low density lipoprotein on calcium transients in isolated rabbit cardiomyocytes. J. В. C. 268 (5): 3767-3775.

132. Lum H., Malik A.B. (1996) Mechanisms of endothelial permeability. Can. J. Physiol. Pharmacol. 74: 787-800.

133. Luo Y., Ferreira-Cornwell M., Baldwin H., Kostetskii I., Lenox J., Lieberman M., Radice G. (2001) Rescuing the N-cadherin knockout by cardiac-specific expression of N- or E-cadherin. Development. 128: 459-469.

134. Luo Y., Radice G.L. (2005) N-cadherin acts upstream of VE-cadherin in controlling vascular morphogenesis. J. С. B. 169: 20-34.

135. Magic C., Pinto-Santini D., Parkhurst S. (2002) Rhol interacts with pl20ctn and alpha-catenin, and regulates cadherin-based adherens junction components in Drosophila. Development. 129 (16): 3771-3782.

136. Maniotis A.J., Folberg R., Hess A., Seftor E.A., Gardner G., Peier J., Meltzer Т., Hendrix C. (1999) Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry. Am. J. Pathol. 155: 739- 749.

137. Massaeli H., Hurtado C., Austria J.A., Pierce G.N. (1999) Oxidized low-density lipoprotein induses cytosceletal disorganization in smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 277: 2017-2025.

138. Mehta D., Rahman A., Malik AB. (2001) Protein kinase C-alpha signals rho-guanine nucleotide dissociation inhibitor phosphorylation and rho activation and regulates the endothelial cell barrier function. J. В. C. 276(25): 22614-22620.

139. Misra U.K., Deedwania R., Pizzo. (2005) Binding of activated a2-macroglobulin to its cell surface receptor GRP78 in 1-LN prostate cancer cells regulates РАК-2-dependent activation of LIMK. J. В. C. 280: 26278-26286.

140. Motulsky H. (1995) The GraphPad Guide to Analyzing Radioligand Binding Data. GraphPad Software Copyright.

141. Mukoyama Y., Utani U., Matsui S., Zhou S., Miyachi Y., Matsuyoshi N. (2007) T-cadherin enhances cell-matrix adhesiveness by regulating (3 1 integrin trafficking in cutaneous squamous carcinoma cells. Genes to Cells. 12: 787-796.

142. Mukoyama Y., Zhou S., Miyachi Y., Matsuyoshi N. (2005) T-cadherin negatively regulates the proliferation of cutaneous squamous carcinoma cells. J. Invest. Dermatol. 124: 833-838.

143. Navarro P., Ruco L., Dejana E. (1998) Differential localization of VE- and N-cadherins in human endothelial cells: VE-cadherin completes with N-cadherin for junctional localization. J. С. B. 140: 1475-1484.

144. Niermann Т., Kern F., Erne P., Resink T. (2000) The glycosyl phosphatidylinositol anchor of human T-cadherin binds lipoproteins. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276: 1240-1247.

145. Niessen C.M., Gumbiner B.V. (2002) Cadherin-mediated cell sorting not determined by binding or adhesion specificity. J. С. B. 156: 389-399.

146. Nogales E. (1999) A structural view of microtubule dynamics. Cell. Mol. Life Sci. 56: 133-142.

147. Nollet F., Kools P., Van Roy F. (2000) Phylogenetic analysis of the cadherin superfamily allows identification of six major subfamilies besides several solitary members. J. Mol. Biol. 299: 551-571.

148. Nong C-Z., Pan L.L., He W.S., Zha X.L., Ye H.H., Huang H.Y. (2006) P120ctn overexpression enhances b-catenin-E-cadherin binding and down regulates expression of surviving and cycling D1 in BEL-7404 hepatoma cells. Liver Cancer. 12 (8): 1187-1191.

149. Nose A., Nagafuchi A., Tacheichi M. (1988) Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems. Cell. 54: 993-1001.

150. Nosjean O., Briolay A., Roux B. (1997) Mammalian GPI proteins: sorting, membrane residence and function. Biochem. Biophys. Acta. 1331: 153-186.

151. Ogita H., Kunimoto S., Kamioka Y., Sawa H., Masuda M., Mochizuki N. (2003) EphA4-mediated Rho activation via Vsm-RhoGEF expressed specifically in vascular smooth muscle cells. Circ Res. 93 (1):23-31.

152. Peifer M., Wieschaus E. (1990) The segment polarity gene armadillo encodes a functionally modular protein that is the Drosophila homolog of human plakoglobin. Cell. 63: 1167-1176.

153. Perez-Moreno M., Jamora C., Fuchs E. (2003) Sticky business: orchestrating cellular signals at adherens junctions. Cell. 112: 535-48.

154. Pertz O., Bozic D., Koch A.W., Fauser C., Brancaccio A., Engel J. (1999) A new crystal structure, Ca2+ dependence and mutational analysis reveal molecular details of E-cadherin homoassociation. EMBO J. 18: 1738-1747.

155. Philippova M., Banfi A., Ivanov D., Gianni-Barrera R., Allenspach R., Erne P., Resink T. (2006). Atypical GPI-Anchored T-cadherin stimulates angiogenesis in vitro and in vivo. Arterioscl. Thromb. Vase. Biol. 26: 2222-2230.

156. Philippova M., Inavov D., Tkachuk V., Erne P., Resink T. (2003) Cell adhesion molecule T-cadherin polarizes to the leading edge of migrating vascular cells. Histochem. Cell Biol. 120: 353-360.

157. Philippova M., Ivanov D., Allenspach R., Takuwa, Y., Erne P., Resink T. (2005) RhoA and Rac mediate endothelial cell polarization and detachment induced by T-cadherin. FASEB J. 19: 588-590.

158. Philippova M.P., Bochkov V.N., Stambolsky D.V., Tkachuk V.A., Resink T. (1998) T-cadherin and signal-transducing molecules co-localize in caveolin-rich membrane domain of vascular smooth muscle cells. FEBS Lett. 129: 201-210.

159. Ponimashkin E.G., Profirovich J., Vaskunaite R., Ritcher D.W., Voyno-Yasenetskaya T. (2002) 5-Hydroxytryptamine 4(a) receptor is coupled to the Galpha subunit of heterotrimeric G13 protein. J. В. C. 277 (23): 20812-20819.

160. Ranscht В., Bronner-Fraser M. (1991) T-cadherin expression alternates with migrating neural crest cells in the trunk of the avian embryo. Development. Ill: 15-22.

161. Ranscht В., Dours-Zimmermann M.T. (1991) T-cadherin, a novel cadherin cell adhesion molecule in the nervous system lacks the conserved cytoplasmic region. Neuron. 7 (3): 391-402.

162. Renaud-Young M., Gallin W.J. (2002) In the first extracellular domain of E-cadherin, heterophilic interactions, but not the conserved His-Ala-Val motif, are required for adhesion. J. Cell Chem. 277: 39609-39616.

163. Ridley A.J. (2001) Rho GTPases and cell migration. J. Cell Sci.l 14 (15): 2713-2722.

164. Rigotti A., Miettinen H.E., Krieger M. (2003) The Role of the High-Density Lipoprotein Receptor SR-BI in the Lipid Metabolism of Endocrine and Other Tissues. Endocrine Reviews. 24 (3): 357-387.

165. Rubina K., Kalinina N., Potekhina A., Efimenko A., Semina E., Poliakov A., Wilkinson D.G., Parfyonova Y., Tkachuk V. (2007) T-cadherin suppresses angiogenesis by inhibiting migration of endothelial cells. Angiogenesis. 10 (3): 183-195.

166. Saburi S., McNeill H. (2005) Oganizing cells into tissues: new roles for cell adhesion molecules in planar cell polarity. Curr. Opin. Cell Biol. 17: 482-488.

167. Sachinidis A., Mengden Т., Locher R., Brunner C., Vetter W. (1990) Novel cellular activities for low density lipoprotein in vascular smooth muscle cells. Hypertension. 15: 704711.

168. Sakai M., Hibi K., Koshikawa K., Inoue S., Takeda S., Kaneko Т., Nakao A. (2004) Frequent promoter methylation and gene silencing of CDH13 in pancreatic cancer. Cancer Sci. 95 (7): 588-591.

169. Sakamoto M., Ino Y., Fuji Т., Hirohashi S. (1993) Phenotype changes in tumor vessels associated with the progression of hepatocellular carcinoma. Jpn. J. Clin. Oncol. 23: 98-104.

170. Sallee J.L., Wittchen E.S., Burridge K. (2006) Regulation of cell adhesion by protein tyrosine phosphatases cell-cell adhesion. J. В. C. 281 (24): 16189-16192.

171. Sander E., Klooster J., Delft S., Kammen R., Collard J. (1999) Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior. J. С. B. 147 (5): 1009-1021.

172. Sato M., Mori Y., Sakurada A., Fujimura S., Horii A. (1998) The H-cadherin (CDH13) gene is inactivated in human lung cancer. Hum. Genet. 103: 96-101.

173. Segrest J.P., Jones M.K., De Loof H., Dashti N. (2001) Struetire of apolipoprotein B-100 in low density lipoproteins. J. of Lipid Res. 42: 1346-1367.

174. SeidlerN.W., Jona I., Veng M., Mailonosi A. (1989) Cyclopiazonic acid is a specific inhibitor of the Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum. J. В. C. 264 (30): 17816-17823.

175. Shan W.S., Tanaka H., Phillips G.R., Arndt K„ Yoshida D.R., Colman D.R. Shapiro L.2000) Functional cis-heterodimers of N- and R-cadherins. J. Cell Biol. 148: 579-590.

176. Shapiro L., Colman D.R. (1998) Structural biology of cadherins in the nervous system. Curr. Op. Neurobiol. 8: 593-599.

177. Shapiro L., Fannon A.M., Kwong P.D., Thompson A., Lehman M.S., Grubel G., Legrand J.F., Als-Nelsen J., Cjlman D.R., Hendrickson W.A. (1995) Structural basis of cell-adhesion by cadherins. Nature. 374: 327-337.

178. Shay-Salit A., Shushy M., Wolfovitz E., Yahav H., Breviario F., Dejana E., Resnick N. (2002) VEGF reccptor 2 and the adherent junctions as a mechanical transducer in vascular endothelial cells. PNAS. 99: 9462-9467.

179. Shimoyama Y., Tsujimo G., Kitajima M., Natori M. (2000) Identification of three human type-II classic cadherins and frequent heterophilic interactions between different subclasses oftype-11 classic cadherins. Biochem. J. 349: 159-167.

180. Six 1., Kureishi Y., Luo Z., Walsh K. (2002) Akt signaling mediates VEGF/VPF vascular permeability in vivo. FEBS Lett. 532: 67-69.

181. Slater S., Sala-Newby G.B., Newby A.C., George S.J. (2004) p-catenin levels play a critical role in the modulation of smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc. Pathol. 13: 39-45.

182. Steinberg M.S., McNutt P.M. (1999) Cadherins and their connections: adhesion junctions have broader functions. Curr. Opin. Cell Biol. 11: 554-560.

183. Steinberg M.S., Takeichi M. (1994) Experimental specification of cell sorting, tissue spreading, and specific spatial patterning by quantitative differences in cadherin expression. Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 206-209.

184. Stevens V.L. (1995) Biosynthesis of glycosylphosphatidylinositol membrane anchors. Biochem. J. 310: 361-370.

185. Streb H., Heslop J.P., Irvine R.F., Schultz I., Berridge M.J. (1985) Relationship between secretagogue-induced Ca release and inositol polyphosphate production in permeabilized pancreatic acinar cells. J. В. C. 260: 7309-7315.

186. Suzuki K., Sanematsu F., Fujiwara Т., Ritchie K., Edidin M., Kusumi A. (2003) Crosslinking of a GPI-anchored protein creates signaling rafts from smaller, transient, lipid rafts. Biophys J. Abstract of 47th Annual Meeting.

187. Suzuki S.T. (1996) Structural and functional diversity of cadherin superfamily: are new members of cadherinsuperfamily involved in signal transduction pathway. J. С. B. 61: 531-542.

188. Takaishi K., Sasaki Т., Kotani H., Nishioka H., Takai Y. (1997) Regulation of cell-cell adhesion by Rac and Rho small G proteins in MDCK cells. J. С. B. 139 (4): 1047-1059.

189. Takeichi M. (1993) Cadherins in cancer: implications for invasion and metastasis. Curr. Opin. Cell. Biol. 5: 806-811.

190. Takeichi M., Nakagawa S„ Aoyno S., Usui Т., Uemura T. (2000) Patterning of cell assemblies regulated by adhesion receptors of the cadherin superfamily. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 355: 885-890.

191. Takeuchi Т., Liang S.B., Matsuyoshi N., Zhou S., Miyachi Y., Sonobe H., Ohtsuki Y. (2002) Loss of T-cadherin CDH13 (H-cadherin), expression in cutaneous squamous cell carcinoma. Lab. Invest. 82 (8): 1023-1029.

192. Takeuchi Т., Liang S.-B., Ohtsuki Y. (2002) Downregulation of expression of a novel cadherin molecule, T-cadherin, in basal cell carcinoma of the skin. Mol. Cancerogen. 35: 173179.

193. Takeuchi Т., Ohtsuki Y. (2001) Recent progress in T-cadherin (CDH13, H-cadherin) research. Histol. Histopathol. 16: 1287-1293.

194. Tan W., Barnett J.V., Pietrobon D., Hehn G., Greiser C., Marsh J.D., Galper B. (1993) Effect of low-density lipoproteins, mevinolin, and G proteins on Ca2+ response in cultured chick atrial cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 265: 191-197.

195. Tepass U., Godt D., Winklbauer R. (2002) Cell sorting in animal development: signalling and adhesive mechanisms in the formation of tissue boundaries. Curr. Opin. Genetics Dev. 12: 572-582.

196. Thomas A.P., Renard D.C., Rooney T.A. (1991) Spatial and temporal organization of calcium signalling in hepatocytes. Cell calcium. 12: 111-126.

197. Tiruppathi С., Minshall R.D., Paria B.C., Vogel S.M., Malik A.B. (2003) Role of Ca2+ signaling in the regulation of endothelial permeability. Vase. Pharmacol. 39: 173-185.

198. Tkachuk V.A., Kuzmenko E.S., Resink TJ. Bochkov V.N., Stambolsky D.V. (1994) Atypical low density lipoprotein binding site that may mediate lipoprotein-induced signal transduction. Mol. Pharmacol. 46: 1129-1137.

199. Toyooka K.O., Toyooka S., Virmani A.K., Sathyanarayana U.G., Euhus D.M., Gilcrease M., Minna J.D., Gazdar A.F. (2001) Loss of expression and aberrant methylation of CDH13 (H-cadherin) gene in breast and lung carcinomas. Cancer Res. 61: 4556-4560.

200. Van Nieuw Amerongen G.P., van Delft S., Vermeer M.A., Collard J.G., van Hinsberg V.W. (2000) Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases. Circ. Res. 87: 565-574.

201. Vasioukhin V., Bauer C., Degenstein L., Wise В., Fuchs E. (2001) Hyperprolifcration and defects in epithelial polarity upon conditional ablation of a-catenin in skin. Cell. 104: 605617.

202. Venkiteswaran K., Xiao K., Summers S., Calkins C.C., Vincent P.A., Pumiglia K., Kowalczyk A.P. (2002) Regulation of endothelial barrier function and growth by VE-cadherin, plakoglobin, and P-catenin. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283: 811-821.

203. Verin A., Birukova A., Wang P., Liu F., Becker P., Birukov K., Garcia J. (2001) Microtubule disassembly increases endothelial cell barrier dysfunction: role of MLC phosphorylation. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281: 565-574.

204. Vestal D.J., Ranscht В. (1992) Glycosyl phosphatidylinositol-anchored T-cadherin mediates calcium-dependent, homophilic cell adhesion. J. С. B. 119: 451-461.

205. Vincent P.A., Xiao K., Buckley K.M., Kowalczyk A.P. (2004) VE-cadherin: adhesion at arm's length. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 286: 987-997.

206. Voyno-Yasenetskaya T.A., Dobbs L.A., Erickson S.K. (1993) Low density lipoprotein- and high density lipoprotein-mediated signal transduction and exocytosis in alveolar type II cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 4256-4260.

207. Wang Y., Lam K.S.L. Xu J.Y.X., Lu G., Xu L.Y., Cooper G.J.S., Xu A. (2005) Adiponectin inhibits cell proliferation by interacting with several growth factors in an oligomerization-dependent manner. J. В. C. 280 (18): 18341-18347.

208. Weisser В., Locher R., Mengden Т., Vetter W. (1991) Oxidation of low density lipoprotein enhances its potentional to increase intracellular free calcium concentration in vascular smooth muscle cells. Art., Thromb. And Vase. Biol. 12: 231-236.

209. Wheelock M.J., Johnson K.R. (2003) Cadherin-mediated cellular signaling. Curr. Opin. Cell. Biol. 15:509-514.

210. Wilson L., Anderson K., Chin D. (1976) Nonstoichiometric poisoning of microtubule polymerisation: a model for the mechanism of action of the vinca alkaloids, podophyllotoxin and colchichine. Cell Motility. 3: 1051-1964.

211. Wittmann Т., Waterman-Storer CM. (2001) Cell motility: can Rho GTPases and microtubules point the way? J. Cell Sci. 114: 3795-3803.

212. Wojciak-Stothard В., Potema S., Eichholtz Т., Rodley A. (2001) Rho and Rac but not Cdc42 regulate endothelial cell permeability. J. Cell Sci. 114: 1343-1355.

213. Woods N.M., Cuthbertson K.S.R., Cobbold P.H. (1987) Agonist-induced oscillations in cytoplasmic free calcium concentrations in single rat hepatocytes. Cell Caclium. 8: 79-100.

214. Wu X., Tu X., Joeng K.S., Hilton M.J., Williams D.A., Long F. (2008) Racl activation controls nuclear localization of b-catenin during canonical Wnt signaling. Cell. 133: 340-353.

215. Wyder L., Vitaliti A., Schneider H., Hebbrand L.W., Moritz D.R., Wittmer M., Ajmo M., Klemenz R. (2000) Increased expression of H/T-cadherin in tumor-penetrating vessels. Cancer Res. 60: 4682-4688.

216. Yamada S., Pokutta S., Drees F., Weis W.I., Nelson W.J. (2005) Deconstructing the cadherin-catenin-actin complex. Cell. 123 (5): 889-901.

217. Yamamoto Т., Davis C.G., Brown M.S., Schneider W.J., Casey M.L., Goldstein J.L., Russell D.W. (1984) The human LDL receptor: a cysteine-rich protein with multiple Alu sequences in its mRNA. Cell. 39 (1): 27-38.

218. Yap A.S., Goodwin M. (2004) Cell adhesion by cadherin receptors: a brief primer. Austr. Biochem. 35 (2): 13-16.

219. Yap A.S., Kovacs. E.M. (2003) Direct cadherin-activated cell signaling: a view from the plasma membrane. J. С. B. 160: 11-16.

220. Yuan S.Y. (2003) Protein kinase signaling in the modulation of microvascular permeability. Vase. Pharmac. 39: 213-223.

221. Zhao В., Ehringer W.D., Dierisch R., Miller F.N. (1997) Oxidized low-density lipoprotein increases endothelial intracellular calcium and alters cytoskeletal f-actin distribution. Eur. J. Clin. Inv. 27: 48-54.

222. Zhao Z., Manser E. (2005) РАК and other Rho-associated kinases-effectors with surprisingly diverse mechanisms of regulation. Biochem. J. 386: 201-214.

223. Zhi-Yong H., Wu Y., Hedrick N., Gutmann D. (2003) T-cadherin mediated cell growth regulation involves G2 phase arrest and requires p2 iCIP1/WAF1 expression. Mol. Cell. Biol. 23 (2): 566-578.

224. Zhong Y., Lopez Barcons L., Haigentz M., Ling Y.H., Perez-Soler R. (2004) Exogenous expression of H-cadherin in CHO cells regulates contact inhibition of cell growth by inducing p21 expression. Int. J. Oncol. 24: 1573-1579.

225. Zhou S., Matsuyoshi N., Takeuchi Т., Ohtsuki Y., Miyachi Y. (2003) Reciprocal altered expression of T-cadherin and P-cadherin in psoriasis vulgaris. British J. Dermatol. 149: 268-273.

226. Zhou X., Stuart A., Dettin L., Rodriguez G., Hoel В., Gallicano GI. (2004) Desmoplakin is required for microvascular tube formation in culture. J. Cell Sci. 117: 31293140.

227. Zhu Y., Liao H., Wang N., Ma S., Verna L.K., Shyy J., Chien S., Stemerman B. (2001) LDL-activated p38 endothelial cells is mediated by Ras. Arter. Thromb. Vase. Biol. 21: 11591164.

228. Zhu Y., Liao H., Wang N., Yuan Y., Ma K.S., Verna L.K., Stemerman B. (2000) Lipoprotein promotes caveolin-1 and Ras translocation to caveolae. Role of Cholesterol in endothelial signaling. Arter. Thromb. Vase. Biol. 20: 2465-2470.