Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ роли дистальных доменов десмоглеина 3 человека в нарушении адгезии между кератиноцитами при пузырчатке

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ роли дистальных доменов десмоглеина 3 человека в нарушении адгезии между кератиноцитами при пузырчатке"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.В.ОВЧИННИКОВА

09-4 :-—-

3866

fia правах рукописи

ЛЫСЕНКО Андрей Александрович

АНАЛИЗ РОЛИ ДИСТАЛЬНЫХ ДОМЕНОВ ДЕСМОГЛЕИНА 3 / В НАРУШЕНИИ АДГЕЗИИ МЕЖДУ КЕРАТИНОЦИТАМИ ПРИ ПУЗЫРЧАТКЕ

специальность - 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008 г.

Работа выполнена в лаборатории клеточных взаимодействий Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской Академии Наук

Научный руководитель:

Свирщевская Елена Викторовна, кандидат биологических наук Официальные оппоненты:

Taxa Татьяна Владимировна, кандидат медицинских наук; Лебедев Юрий Борисович, доктор биологических наук

Ведущая организация:

Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова Российской академии медицинских наук (ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН).

Защита состоится « 2009 года в часов на заседании

диссертационного совета''при^ Институте биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук по адресу: 117997, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор физико-математических наук

В.А.Олейников

________^oosi''^' I

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Пузырчатка является аутоиммунным заболеванием, при котором наблюдается расслоение эпидермиса с образованием язв на коже и слизистых оболочках. Аутоантигеном при пузырчатке являются белки десмосом десмоглеины (ДСГ). Связывание аутоантител с белками-мишенями приводит к нарушению межклеточной адгезии - акантолизу. Существует две основные формы пузырчатки: при вульгарной пузырчатке (ВП) аутоантитела распознают ДСГЗ, а при листовидной пузырчатка (ЛИ) - ДСП, В результате на коже и слизистых образуются многочисленные эрозийные бляшки или пузыри, заполненные жидкостью. Заболевание осложняется тем, что образующиеся пузыри часто вскрываются, что служит причиной сопутствующих инфекций. До появления кортикостероидных препаратов пузырчатка часто закапчивалась летальным исходам. IIa настоящий момент заболевание контролируется практически пожизненным приемом преднизолона; случаи излечения исключительно редки.

В России ВП составляет более 90% всех случаев пузырчатки, что делает изучение этой формы пузырчатки наиболее актуальным для нашей страны. В ряде стран (Бразилия, Колумбия) существует разновидность эндемичной ЛГ1. При ВП аутоантитала направлены к ДСГЗ почти у 100% больных и к ДСП - примерно у 50-80%% больных. При листовидной пузырчатке-у всех больных выявляются антитела к ДСП и редко - к ДСГЗ. Характер повреждения кожи - акаптолиз - различается при этих формах: при ВП наблюдают формирование пузырей в основном на слизистых оболочках и в падбазальном слое кожи. При ЛГ1 пузыри формируются в поверхностных слоях эпидермиса кожи, что вызывает отслаивание ороговевающих слоев, откуда и возникло название - листовидная пузырчатка. При ЛП слизистые оболочки не повреждаются.

Десмоглеины входят в состав десмосом, которые формируют межклеточные адгезионные контакты в эпителии, подвергающемуся механической нагрузке, например, в эпителии кожи, слизистой оболочки полости рта и др. Внеклеточная часть десмосом формируется только двумя белками: десмоглеииами и деемоколлипами, которые относятся к кадгеришшому семейству. Механизм нарушения межклеточной адгезии при пузырчатке до сих пор остается непонятным и дискуссионным. Для его

понимания требуется детальное изучение механизма сборки и функционирования десмосом.

В настоящее время ген десмоглеина 3 клонирован и полностью охарактеризован. Определена аминокислотная последовательность белка. Получены рекомбинантные белки, содержащие различные участки молекулы десмоглеина в различных экспрессионпых системах.

Хотя достоверно показана роль аутоантител в развитии пемфигуса, истинная этиологическая причина по-прежнему остается неясной. Показано, что определенную роль в развитии данного заболевания играют наследственные факторы, поскольку частота встречаемости ВГ1, в отличие от ЛП, коррелирует с частотой некоторых аллелей главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) II класса. Данная работа является продолжением исследований по механизмам патогенеза пузырчатки и анализу роли аутоантител к дистальпым доменам п нарушении адгезии между кератиноцитами.

Цель работы: изучить механизмы патогенное™ аутоантител к различным доменам десмоглеина 3 в моделях ш укго.

В рамках данной работы были поставлены следующие задачи:

1. 11олучить в бакуловирусной системе фрагменты десмоглеина 3 человека, соответствующие доменам 1,2, 1-2 и 1-5 внеклеточной части молекулы ДСГЗ.

2. С помощью рекомбинантных белков изучить доменную специфичность аутоантител больных пузырчаткой.

3. Теоретически определить локализацию эпитопов ДСГЗ, распознаваемых аутоантителами болыI ых.

4. Разработать и охарактеризовать модели ¡п \>'иго для анализа механизмов патогенеза пузырчатки.

5. Получить антитела к различным доменам десмоглеина 3 и охарактеризовать их патогеиность с использованием эксплантатов кожи и культур кератнноцитов человека.

6. Определить механизмы нарушения адгезии патогенными антителами к ДСГЗ.

Научная новизна

1. Впервые в России было осуществлено клонирование в бакуловирусиой системе генных фрагментов десмоглеина 3, кодирующих внеклеточную часть молекулы и ее первые два домена.

2. Впервые проведена попытка идентифицировать патогенные эпитопы ДСГЗ методами молекулярного моделирования, Анализ литературных данных позволил подтвердить, что антитела 50% больных ВП распознают один из двух предсказанных патогенных эпитопов.

3. В моделях эксплантатов кожи in vitro впервые показано, что антитела к ДЗ-5 ДСГЗ могут быть патогенными.

4. Впервые показано, что состояние гиперадгезии клеток линии кератиноцитов человека НаСаТ вызвано увеличением числа десмосом на их поверхности.

5. Также впервые показано, что снижение количества десмосом при понижении концентрации кальция или блокаде синтеза десмосом cie novo приводит к нарушению адгезии между клетками НаСаТ патогенными антителами к ДСГЗ.

Практическая значимость. Картированы патогенные и непатогенные эпитопы ДСГЗ, что позволяет в дальнейшем разработать протокол иммунизации пептидами, соответствующими непатогенным участкам, с целью конкурентного ингибирования связывания патогенных аутоантител с аутоаитигеном. Полученные в данной работе фрагменты генов, кодирующие домены 1, 2 и 1-5 молекулы ДСГЗ, ранее были клонированы в дрожжевой системе экспрессии и получены соответствующие белки. На основе дрожжевого белка, содержащего 1-2 домены ДСГЗ, разработан диагиостикум для анализа циркулирующих аутоантител к десмоглеину человека.

Внедрение в практику. Результаты настоящего исследования внедрены в практику Отдела иммунологии ИБХ РАН и кафедры кожных и венерических болезней лечебного факультета РГМУ.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Отдела иммунологии ИБХ РАН, на 7-й летней школе по иммунологии им. Джона Хамфри (ИБХ РАН, Москва, Россия, 2005), на XXII Конгрессе Европейской Академии аллергологии и клинической иммунологии (Франция, Париж 2003), на 16-ом Европейском Конгрессе по иммунологии (Франция,

Париж, 2006), на Всероссийской конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 2004, 2006, 2007, 2008.

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ в центральной печати и материалах российских и зарубежных научно-практических конференций и съездов. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, основных выводов, списка литературы. Работа изложена на страницах, содержит ¿¡О рисунков и /С таблиц. Список литературы включает/^ссылок на литературные источники.

Материалы и методы

Получение рекомбинантных белков. Белки Д1, Д2, Д1-2 и Д1 -5, соответствующие различным доменам белка ДСГЗ человека, были получены в бакуловирусиой системе. Полученную ранее кДНК (получена О.Д. Коцаревой) использовали для проведения полимеразной цепной реакции с праймерами, специфичными для получения соответствующих генных фрагментов. Специфические пары праймеров использованы для клонирования соответствующих фрагментов в рРаз1Вас НТЬ вектор (1пуйго§еп), используемый в бакуловирусиой системе ■экспрессии ВасЧо-Вас. Рекомбинантные вектора были сиквенированы, чтобы проверить правильность вставки кДНК и наличие мутаций. Были отобраны вектора, имеющие правильную рамку считывания и не имеющие мутаций. Хроматографическое выделение рекомбинантных белков осуществляли с использованием сорбента №->ГГА агарозы согласно рекомендации производителей.

Клеточные линии. Клетки насекомых ЭЮ наращивали в среде ТС 100 с 10% фетальиой сыворотки (ФС) и 300 мкг/мл Ь-глютамина и использовали для получения рекомбинантных белков. Клетки линии кератиноцитов человека НаСаТ и А431 культивировали в среде ОМЕМ и ЯРМ1-1640, соответственно, дополненных 10% ФС, глютамином, антибиотиками и 50 цМ 2-меркаптоэтанола. Для анализа с помощью конфокальной микроскопии клетки наращивали на покровных стеклах. Сыворотки больных ВП. Сыворотки от 25 больных ВП были получены в НИИ ЦКВИ. Донорскую кровь брали у студентов РГМУ и сотрудников лаборатории.

Получение кроличьих антител к Фрагментам ДСГЗ. Кроликов иммунизировали внутримышечно рекомбинантными белками Д1-2 и Д1-5. Первичная иммунизация проводилась с использованием полного адыоваита Фрейнда. Первичная доза составляла 1мг/ кролика для белка Д1-2 и 0,5 мг/ кролика для белка Д1-5. При последующих иммунизациях использовался неполный адыовант Фрейнда. Иммунизация проводилась 6 раз с интервалами 1-2 недели до получения высоких титров антител. Сыворотку собирали из ушной вены через неделю после б иммунизации.

Антитела. В работе использовали немеченые моноклональные мышиные антитела к ДСГЗ, ДСП и десмоколлину 2/3 (ДСК2/3) человека (Zymed Laboratories, USA); биотинилированные антитела к IgG человека (Sigma); антитела к IgG мыши, меченные Alexa Fluor 488 (Pharmingen, США); стрептавидин-FITC; антитела к IgG кролика, меченные FITC (Sigma).

Твердофазный иммуно-Ферментный анализ (ИФА). Белки наносили на 96-луночные планшеты для ИФА в концентрации 10 мкг/мл. В качестве проявляющих использовали антитела против IgG человека или кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена. В качестве субстрата использовали ортофенилендиамин (Sigma).

Анализ участия антител к ДСГЗ в акантолизе кожи. Образцы кожи человека, полученные хирургическим путем, или образцы кожи мышат инкубировали в полной среде RPMI 1640 с различными антителами (60 мкг/мл) в течение двух суток. После этого образцы отмывали три раза в PBS и фиксировали в 3 % растворе формальдегида, затем образцы отмывали, иикубированы в течение ночи в 15% растворе сахарозы, помещали в среду для приготовлеиия криосрезов Killik (Bio-Optica, Милан, Италия) и замороживали при -135°С. Криосрезы были приготовлены с помощью криотома. Толщина криосрезов - 8 и 10 мкм.

Иммунофлуоресиентное окрашивание. Клетки линий НаСаТ и А431 выращивались на покровных стеклах до образования плотного монослоя. Клетки инкубировались с соответствующими первыми антителами при +37°С, отмывались и фиксировались 2030 мим. в 1% растворе формальдегида, затем клетки отмывались и инкубировались со вторыми антителами, конъюгироваииыми с флюорохромом, отмывались и заливались полимеризующейся средой Mowiol 4.88 (Calbiochem). Образцы анализировались с помощью конфокального сканирующего микроскопа Nikon ТЕ 2000 Eclipse (Япония),

снабженного синим и зеленым лазерами. Для визуализации ядер клетки инкубировали 15 мин при 37°С с 5 мкг/мл 4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI). Статистический анализ. Статистический анализ проводили с использованием пакета MS Office Excell по t-критерию Стыодента.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Результаты исследований

Получение рекомбинантных белков Д1. Д2, Д1-2 и Д1-5. Для получения рекомбинантных белков была использована система Bac-to-Bac (Invitrogen, USA). При отборе рекомбинантных вирусных векторов были использованы два метода оценки -метод бело-голубой селекции и ПЦР. Полученные вирусные вектора были использованы для трансфекции клеток S© и получения первого поколения вирусов. Первое поколение использовали для заражения клеток и получения второго поколения вирусов. Для третьего поколения вирусов определяли количество вирусных частиц с помощью модифицированного метода конечных разведений. После определения титра вирусы были использованы для получения рекомбинантных белков. Предварительно была проведена время- и дозо-зависимая оценка экспрессии рекомбинантных белков. Пример такой оценки показан на рисунке 1, где исследовался уровень экспрессии для рекомбинантного белка Д1-5 (Mr = 72 кДа). Так как рекомбинантные белки не секретировались в среду, то время экспрессии белков ограничивалась жизнеспособностью клеток (не более 96 часов с момента заражения вирусом).

1 .Неинфицированные клетки Sf9

2. MOI = 1,49 часов инкубации

3. MOI = 7,49 часов инкубации

4. MOI = 1, 73 часов инкубации

5. MOI = 7, 73 часов инкубации

6. MOI = 1, 96 часов инкубации

7. MOI = 7, 96 часов инкубации

Рис.1. Зависимость продукции белка от множественности инфекции (MOI, количество вирусных частиц/клетку) и времени инкубации. Гель-электрофорез в денатурирующих условиях, 15% гель. М- маркер молекулярной массы, кДа.

Для клонирования нами были выбраны 4 фрагмента кДНК внеклеточной части ДСГЗ: кодирующий первый, второй, 1 и 2, а также все пять внеклеточных доменов

белка ДСГЗ. Для наработки и получения рекомбинантных белков, соответствующих различным фрагментам десмоглеина 3 человека, использовали суспензионную культура клеток Sf9. Выделение рекомбинантных белков проводилось с использованием Ni-NTA аффинной хроматографии из лизатов клеток насекомых. Для определения молекулярных масс полученных белков использовали неградиентный электрофорез в 15% ПААГе. Белки были охарактеризованы с помощью антител к N-концевому бх His эпитопу. Молекулярная масса белков оказалась в пределах ожидаемой для всех четырех белков (рис.2, дорожки 1-5). Идентификация полученного белка была проведена также с использованием коммерческих моноклональных антител к ДСГЗ (рис.2, дорожка 6). Полученные данные подтвердили идентичность полученных рекомбинантных белков ДСГЗ человека.

1 - Лизат клеток Sf9 без вирусной инфекции

2, б - Белок, соответствующий внеклеточной части десмоглеина 3 человека (Д1-5)

3 - Белок, соответствующий двум первым десмоглеина 3 человека (Д1-2)

4 - Белок, соответствующий первому домену десмоглеина 3 человека (Д1)

5 - Белок, соответствующий второму домену десмоглеина 3 человека (Д2)

Рис.2. Иммуноблот анализ. Рекомбинантные белки, полученные в бакуловирусной системе экспрессии. Дорожки 1-5 - антитела к 6xHis на N-конце, коиъюгироваииые с пероксидазой хрена (1:2100). Дорожка б -моноклональные антитела мыши к ДСГЗ человека.

Распознавание различных доменов ДСГЗ сыворотками больных пузырчаткой

Идентификацию эпитопов, распознаваемых сыворотками больных пузырчаткой, проводили с помощью блотинга и иммуно-фермеитного анализа с использованием рекомбинантных белков для чего использовали 25 сывороток больных вульгарной пузырчаткой и 10 сывороток доноров. Показали, что все сыворотки распознавали полиоразмерный белок Д1-5, 24 сыворотки распознавали белок Д1-2 (рис.3).

I3'

3 2 ■

й 4-

а 5

8

7 "

6 -

Рис. 3. Распознавание белка Д1-2 сыворотками больных ВП. Серая зона соответствует индексу 1,1. Серым цветом обозначены отрицательные сыворотки.

о

Полученные данные показали, что 80% сывороток больных преимущественно распознают два дистальных домена ДСГЗ. Соответственно, по крайней мере, в 20% случаев аутоантитела направлены не к дистальным доменам, принимающим участие в формировании адгезивного контакта между молекулами десмоглеина 3. Эти данные хорошо согласуются с данными других авторов, где показано, что сыворотки больных ВП распознают 1 и 2 домены ДСГЗ в 60-89% (Мп е1 а1„ 1997, Зек^исЫ Щ а1., 2001; ТвипосЗа е1 а!., 2003). Механизмы действия антител, направленных как к дистальным, так и проксимальным доменам на настоящий момент являются дискуссионными.

Идентификация В-эпитопов ДСГЗ

Сыворотки больных ВП и ЛП распознают только специфичные для данной формы заболевания белки. ДСП и ДСГЗ, являющиеся аутоантигенами при ЛП и ВП, соответственно, имеют высокую степень гомологии между собой. Поэтому с помощью анализа аминокислотной последовательности можно выявить негомологичные участки ДСП и ДСГЗ и попытаться идентифицировать эпитопы именно в этих участках. По литературным данным также известно, что в адгезионных взаимодействиях основную роль играет первый домен, что позволяет говорить о важности эпитопов патогенных антител именно в первом домене. На рисунке 4 приведено сравнение аминокислотных последовательностей первого домена ДСП и ДСГЗ, где черным шрифтом отмечены различающиеся аминокислоты, а зеленым фоном выделены близкие по свойствам аминокислот замены, например, положительно заряженные аргинин Я90 на положительно заряженный лизин К50.

1 50

десмоглвин 1 еуАсгаааск ваЕгжгакныр хакшзрсаа нооШтгахва уоторрйа! Десмоглвин 3 ЕИрдаККРСК ЕвЕШВКЫЮ 1АКХ|Т8РУ0А ТОКДТУМВО 'УОХОДРРдОХ

51 юо

десмоглвин 1 гуДноктоИх щтвгтонву тепгШгуснА г.мЬюогДе| рьеьяуИьр Десмоглвин 3 ГУДРКНтД! ЩТАГУРМф ТРВгДи^ИА ЬыДооыДе! РЫИуЦд

Рис.4. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей первого домена ДСП и ДСГЗ человека. Нумерация здесь и далее - для зрелой формы белка. Замены отмечены черным шрифтом, гомологичные аминокислоты - красным. Зеленым фоном выделены близкие по свойствам замены. Рамками отмечены участки, соответствующие возможным линейным В-эпитопам.

Из рисунка 4 видно, что замен достаточно много. Однако не все негомологичные участки могут формировать В-клеточные эпитопы, что следует из структуры иммуноглобулинов. Так, в составе имеется три гипервариабельных участка определенной протяженности, которые принимают участие в связывании антигена. Соответственно, БаЬ фрагмент распознает три участка в антигене, что является необходимым и достаточным условием для обеспечения жесткого связывания между антителом и молекулой белка. Ранее было показано, что чаще всего В-клеточные эпитопы формируются тремя аминокислотами, разделенными в пространстве 1-3 аминокислотами (РасПап е1 а1., 1989; Вау1еэ й а1., 1996). Эти данные получены для линейных эпитопов. В первую очередь были отобраны линейные участки ДСП и ДСГЗ, в состав которых входит хотя бы 2 негомологичных и разных по свойствам аминокислоты, разделенных 1-3 гомологичными или близкими по свойствам. Таких участков в первом домене выявили четыре (рис.4, таблица 1).

Таблица 1. Потенциальные линейные эпитопы, локализованные в первом домене ДСП и ДСГЗ.

Эпитопы ДСП ДСГЗ

линейный №1 (25-34)" НХХСАХЖ<ЭУ6 тххудхтхк!

линейный №2 (53-59) Ш<}КХХЕ \DKNTGn

линейный №3 (70-77) УХХГХ!Х¥ ЕХХвХЬХТ

линейный №4 (83-98) вМХОХЬХНХХЕХЯХКУ А(}ХЬХУХКХХ1ХТХК1

" В скобках указаны положения пептидов в аминокислотной последовательности

соответствующих белков.

"Гомологичные аминокислоты обозначены «X».

Пространственная локализация эпитопов ДСГЗ

Картирование эпитопов ДСГЗ можно провести, посмотрев локализацию данных негомологичных участков на поверхности молекулы ДСГЗ, для чего необходима трехмерная структура этой молекулы. К сожалению, на настоящий момент кристаллы ДСП и 3 не получены. Однако десмоглеины относятся к семейству кадгеринов, для многих представителей которого имеются кристаллографические данные. Большим количеством работ показано, что структура «якоря» и гидрофобного кармана (ключевые позиции аминокислот), принимающих участие в формировании гомодимеров между молекулами кадгеринов и десмоглеинов, идентичны. Так, якорь у всех кадгеринов формируется 1-7 аминокислотами, а карман - бета-цепями В (121, К23, 124), С (У36), Б (С78, А80) и петлей между цепями Г и О (Е89, К90 и М92). Трехмерная модель первого и второго доменов ДСГЗ была сделана на основе данных кристаллографического анализа Е-кадгерина человека. Для изучения локализации потенциальных В-клеточных эпитопов ДСГЗ, распознающихся аутоантителами больных ВП, требуется построение модели димера ДСГЗ, поскольку в составе десмосом эти молекулы находятся всегда в виде либо цис- либо транс-димеров. Известно, что аутоантитела больных ВП распознают не линейные, а конформациоииые эпитопы (А1шща1 е1 а1., 1995; Ыш е! а1., 1997). Однако в состав этих конформационных эпитопов обязательно должны входить линейные негомологичные участки белка ДСГЗ.

В работе группы М. Агшща1 (Эек^исЫ е1 а1., 2001) было исследовано связывание антител из сывороток больных ЛП и ВП с химерными белками, состоящими из слитых фрагментов белков ДСГЗ и ДСП. Мы провели более детальный анализ этих данных и оценили возможность связывания антител с предполагаемыми нами эпитопами.

Для каждой сыворотки мы определили число возможных эпитопов (или их комбинаций). Для анализа отобрали сыворотки, распознающие только уиикальиый эпитоп, так как при распознавании нескольких эпитопов нельзя сказать какой из них является патогенным. В результате мы определили (таблица 2), что 53% сывороток распознают конформационный эпитоп (25-34 + 83-98), а 80% распознают линейный эпитоп 25-34, входящий в состав конформационных эпитопов 5, б и 7. Самый часто распознаваемый конформационный эпитоп 7 содержит в своем составе линейный эпитоп (83-98), который также входит в состав коиформациониого эпитопа 8. Из этих данных мы сделали вывод, что основными участками, связывание с которыми антител приводит к патогенному эффекту, являются участки (25-34) и (83-98).

Далее мы провели картирование этих эпитопов на поверхности димера ДСГЗ.

Оказалось, что эпитоп (25-34) находится на верхушке димера и входит в состав альфа-

спирали, а эпитоп (83-98) формирует протяженный участок, часть из которого также

экспонирована на верхушке димера в петле между бета- тяжами, а второй участок

занимает боковое положение и находится в самом бета-тяже (Рис.5).

Таблица 2. Распознавание возможных конформационнмх эпитопов ДСГЗ сыворотками больных ВП на основе данных ве^исЫ, 2001.

Конформационные Эпитопы Последовательности N" %

К5 №1 25-34 +8 4 27

Кб №1+№2 25-34 + 53-59 0 0

К7 №1+№4 25-34 + 83-98 8 53

К8 №3+№4 70-77 + 83-98 3 20

Всего 15 100

а - Каждая сыворотка распознавала только один эпитоп. Из 30 обследованных 15 (50%) сывороток распознавали один эпитоп.

6 - Знаком «+» обозначен факт наличия еще одной или более аминокислоты в составе конформационного эпитопа, располагающейся вне указанных линейных эпитопов, но принимающей участие в формировании связывания с антителом. Такими аминокислотами были, например, К7 или Р8; К90.

Рис.5. Структура участка межклеточной адгезии и расположение эпитопов 25-34 (А и В) и 83-98 (Б и Г) в димере ДСГЗ. Модель двух первых доменов димера ДСГЗ построена на основе трехмерной структуры димера Е-кадгерина человека. Синим цветом отмечены аминокислоты, формирующие участок связывания («якорь» и карман). Голубым цветом отмечены катионы кальция (А и Б). Эпитоп 25-34 (красный) находится в альфа-спирали (А и В). Эпитоп 83-96 (фиолетовый) имеет два разных участка: петлевой (Г, белый кружок) и бета-тяж (Г, черный овал).

Исходя из имеющихся литературных данных по механизмам формирования димеров ДСГЗ можно предположить, что связывание аутоантител с эпитопом 25-34 (рис.5, В, выделено белым кругом) препятствует переходу цис-димера в транс-димер. В составе эпитопа 83-98 с очевидностью можно выявить два потенциальных и различающихся по свойствам эпитопа: петлевой участок на верхушке первого домена, в состав которого входят аминокислоты 83-90 (Рис.5 Г, выделено белым кругом) и протяженный участок, идущий вдоль всего домена (ак 91-98, соответственно) (Рис.5 Г, выделено черным овалом). Связывание антител с участком (83-90) аналогично по действию с участком (25-34). Связывание антител с участком (91-98), с нашей точки зрения, может нарушать формирование латерального взаимодействия, что приводит к изменению структуры упаковки ДСГЗ в десмосомах.

Получение и характеристика антител к ДСГЗ

Для изучения механизмов патогенеза пузырчатки необходимо было получить антитела с известными свойствами. Мы получили антитела к Д1-2 и Д1-5 в кроликах. В результате 6-ти кратной иммунизации титры антител к Д1-2 достигали 1:100000, а к Д1-5 - примерно 1:20000, что определяли с помощью ИФА. Кроме кроличьих антител в работе также использовали коммерческие моноклональные мышиные антитела к внеклеточной части ДСГЗ человека. Для идентификации распознаваемого ими эпитопа использовали рекомбинантные белки. Показали, что эти антитела распознают эпитоп в 3-5 доменах ДСГЗ. В итоге для работы были получены и охарактеризованы антитела к Д1-2, ДЗ-5 и Д1-5 белка ДСГЗ, а также сыворотки больных ВП, распознающие внеклеточную часть ДСГЗ.

Характеристика клеточных линий кератиноцитов человека

Для изучения патогенеза пузырчатки нам необходимы были модели эпидермиса

человека. В качестве моделей мы использовали эксплантаты кожи мыши и человека, а

также линии кератиноцитов человека НаСаТ и А431.

Анализ литературных данных показал, что существует определенная

вариабельность между сублиниями клеточных линий НаСаТ и А431 по экспрессии

белков адгезии. Поэтому нам необходимо было определить, какие из белков адгезии

экспрессируют данные клетки. Клетки А431 не экспрессировали ДСП и ДСГЗ, но

12

экспрессировали на низком уровне ДСК2/3. В клетках НаСаТ ДСП локализовался в цитоплазме и не входил в состав десмосом. И, напротив, НаСаТ хорошо экспрессировали ДСГЗ и ДСКЗ (рис.6), что делает данную сублинию хорошей моделью для изучения механизмов патогенеза ВП, при которой антитела к ДСГЗ.

ДСГЗ I ДСКЗ

Рис.6, Экспрессия ДСГЗ и ДСКЗ на кератииоцитах линии НаСаТ. Ядра окрашены БАР1, использованы антимышиные ^С-А1еха 488. Увеличение ЗОООх.

Роль антител к различным доменам ДСГЗ в нарушении адгезии между кератиноцитами

На настоящий момент нет однозначного мнения, каков механизм нарушения адгезии при вульгарной пузырчатке. Поскольку большинство аутоантител больных направлены к первому домену ДСГЗ, то есть основания предполагать, что связывание антител с определенными участками молекулы ДСГЗ вызывает акантолиз, и такие антитела являются патогенными. Соответственно, антитела, направленные к другим участкам, могут быть как патогенными, так и нет. Для проверки патогенности антител к различным доменам ДСГЗ использовали эксплантаты кожи мышей или человека. Показали, что сыворотки больных ВП, а также кроличьи поликлональные антитела к Д1-2, но не к Д1-5, вызывают акантолиз кожи мышей (рис.7). Мышиные моиоклональные антитела к проксимальным доменам ДЗ-5 ДСГЗ человека оказались патогенными и также вызывали акантолиз (рис.8), характерный для ВП. Новым является демонстрация факта акантолиза, вызванного антитела не к дистальиым доменам 1-2, а к проксимальным ДЗ-5, что означает наличие, по крайней мере, двух механизмов действия патогенных аутоантител.

Рис. 7. Гистологические срезы кожи неонатальных мышей линии ВАЬВ/с после инкубации с антителами к Д1-2, Д1-5, ВП и сывороткой донора. Рамками выделены зоны акантолиза. Окрашивание гематоксилин-эозином. Увеличение 200х.

Контроль

_____ .V-^_

ДСГЗ

шшшщшял

■ЧвМм

¡¡вШИИ

Рис.8. Индукция акантолиза антителами к ДЗ-5 в эксплантатах неонатальной кожи человека. Верхний ряд: окраска гематоксилин-эозином, увеличение ЮОх. Нижний ряд: окраска антителами к цитокератииам и БАР1, увеличение ЮООх. Зона акантолиза отмечена рамкой.

Так, антитела, распознающие Д1-2, могут вмешиваться в формирование адгезивного

контакта, а антитела к ДЗ-5 - в формирование латерального взаимодействия между

димерами ДСГЗ. Полученные нами результаты также подтверждаются литературными

14

данными, где показано существование как патогенных, так и непатогенных антител к ДСГЗ. При этом, непатогенные антитела могут быть направлены, в том числе, и к 1-2 доменам.

Устойчивость линии НаСаТ к действию патогенных антител

Более детально анализ процесса акантолиза изучали на клетках НаСаТ. Оказалось, что НаСаТ значительно более устойчивы к действию антител к ДСГЗ, чем эпителий кожи. Так, инкубация в течение 1-24ч клеток НаСаТ с патогенными антителами (сыворотки больных ВП, кроличьи анти-Д1-2, моноклональные мышиные анти-ДСГЗ) приводила только к снижению прочности монослоя, но не диссоциации клеток (рис.9). Увеличение концентрации антител также не оказывало влияния на адгезию.

Рис.9. Нарушение монослоя НаСаТ при добавлении антител к ДСГЗ. Клетки инкубировали 14 ч в присутствии 10 мкг/мл антител. Окраска БАР1, увеличение 80х. Кружками отмечены зоны нарушения монослоя.

Отсутствие нарушения адгезии при добавлении антител к ДСГЗ говорит об ограниченном патогенном действии этих антител. Поскольку различия между культивируемыми кератиноцитами, устойчивыми к действию антител, и кератиноцитами кожи, чувствительными к их действию, не качественные, а количественные, то именно в этом различии и следует искать механизмы действия аутоаитител.

Роль кальция в нарушении адгезии

Кальций имеет ключевое значение в формировании транс-димеров кадгеринов (Pasdar

et al., 1989; Burdett et al., 2002; Klingelhofer et al, 2002). Удаление кальция из среды уже

через час приводит к расслоению пласта клеток НаСаТ (рис.10).

Рис.10. Удаление кальция приводит к расслоению монослоя НаСаТ. Клетки, окрашенные CFSE, инкубировали без Са2+ в течение указанного времени. Увеличение ЮООх.

В эпидермисе кожи наблюдается градиент кальция с самой низкой концентрацией именно в базальном слое (Mention et al., 1985), что предрасполагает к нарушению адгезии именно в этом слое.

Роль синтеза десмосом de novo в нарушении адгезии

Вторым фактором, влияющим на количество десмосом на поверхности клеток,

является образование десмосом de novo, поскольку известно, что происходит довольно

быстрый обмен между пулом свободных и включенных в десмосому десмоглеинов.

Известно, что связывание патогенных антител с ДСГЗ приводит к резкому снижению

количества свободных кадгеринов (Sato, 2000; Calkins et al., 2006), что связано с

интернализацией вновь синтезированных молекул с поверхности клетки.

Рис.11. Блокада транспорта десмосомальных кадгеринов приводит к снижению числа десмосом. Клетки НаСаТ инкубировали с брефелдином А при 37"С 4 ч или в среде при 22 °С 15 ч. Число десмосом подсчитывали па линейных участках: а -контроль 4ч; б - брефелдин А 4ч; в - контроль 15 ч; г - 22 "С 15ч. Приведено несколько участков мембран равного размера. Усреднение данных а-г позволяет определить время полужизни десмосом (Д).

Оценку роли синтеза десмосом de novo провели при инкубации клеток с брефелдином А, ингибитором транспорта вновь синтезируемых белков на поверхность, а также инкубируя клетки при комнатной температуре, что тоже блокирует транспорт белков. В обоих случаях наблюдали снижение экспрессии десмосомальных кадгеринов и уменьшение числа десмосом на поверхности клетки (рис.11). Полученные данные показывают, что количество десмосом зависит от эффективности включения синтезированных de novo десмосомальных кадгеринов. При этом концентрация кальция и синтез кадгеринов de novo играют независимую роль и суммируются при добавлении антител больных ВП (рис.12).

Рис.12. Влияние концентрации Cai+, синтеза кадгеринов de novo и антител к ДСГЗ на адгезию между клетками. Клетки инкубировали 15 ч при 0,3 мМ Са2+ при 37°С (А и Б) или 22°С (В и Г) без (А и В) и в присутствии (Б и Г) антител больного ВП. Клетки окрашивали антителамик ДСКЗ (А и Б) или к цитокератинам (В и Г). Ядра окрашены DAPI. Увеличение 2500х. Максимальная степень диссоциации клеток наблюдается при инкубации с антителами при пониженной температуре (Г)

Количество десмосом на клетках эпидермиса кожи

Полученные нами данные показали, что в культуре эксплантатов кожи человека или мыши добавление патогенных антител приводит к нарушению адгезии, потере рядности эпидермиса, формированию внутриэпидермальных пузырей, характерных для пузырчатки. При этом инкубация эксплантатов проводилась в присутствии 1,5 мМ кальция при 37°С в отсутствии брефелдина А, что обеспечивало полноценную адгезию между кератиноцитами и репарацию десмосом за счет вновь синтезируемых белков десмосомальных кадгеринов. С другой стороны, вызвать нарушение адгезии между метками кератиноцитов НаСаТ при добавлении антител к ДСГЗ значительно сложнее. Поскольку расслоение монослоя НаСаТ достигалось только при снижении

концентрации кальция, что вело к снижению числа десмосом на поверхности клеток, то мы предположили, что на кератиноцитах в эпидермисе должно быть меньше десмосом, чем на культивируемых in vitro клетках НаСаТ. Для анализа числа десмосом на кератиноцитах эпидермиса получали криосрезы нормальной неонатальной кожи человека и инкубировали их с антителами к ДСП, ДСГЗ и ДСКЗ в течение ночи при +4°С. Число десмосом оценивали аналогично данным, приведенным на рис.11. С помощью данного метода удается провести полуколичественный подсчет, который показал, что на клетках нижнего, прилегающего к базальному слою кератиноцитов, на поперечном оптическом срезе клетки находится примерно 25-40 десмосом (рис.13). Данные хорошо согласуются при определении числа десмосом с помощью антител к разным десмосомальным кадгеринам. На поверхности клеток НаСаТ примерно в 5 раз больше десмосом (170-240) матом же поперечном слое, что, по-видимому, и объясняет их устойчивость к действию антител к ДСГЗ. Количество десмосом на клетках НаСаТ зависит от времени инкубирования.

0О°°

ПДСГ1

пдстз пдскз

■ НаСаТ

Рис.13. Плотность десмосом на кератиноцитах кожи (А) и клетках линии НаСаТ (Б). В. По оси ординат приведено число десмосом для поперечного среза одной клетки. Для клеток эпидермиса число десмосом определяли антителами к ДСП, 3 и ДСКЗ; для клеток НаСаТ - антителами к ДСКЗ.

Поскольку известно, что в эпидермисе кожи существует градиент концентрации кальция, то возможен также и градиент плотности десмосом в различных слоях. Анализ числа десмосом на клетках различных слоев эпидермиса кожи показал, что, действительно, на клетках супрабазального слоя экспрессируется меньше десмосом, чем на клетках вышележащего слоя (рис.14).

Рис.14.Экспрессия десмосомальных кадгерииов на клетках эпидермиса кожи человека.А. Кружками показаны участки разных слоев. Увеличение 2000х. Б и В-участки надбазального и базального ьный слоев Увеличение 4000х. Клетки окрашены антителами к ДСГЗ, Базальный ядра - DAPI. слой

Известно, что аутоантитела при ВП нарушают адгезию именно в слое, находящемся непосредственно над базальным слоем, то есть именно там, где концентрация десмосом, по нашим данным, самая низкая. Соответственно, можно предположить, что именно это и объясняет, почему здесь нарушается адгезия.

Патогенные антитела к десмоглеину 3 снижают число десмосом в супрабазальном слое кератиноцитов кожи

Связывание патогенных аутоантител с ДСГЗ приводит к интернализации не включенных в десмосому белковых молекул. Длительная инкубация (более 24 часов) образцов кожи с патогенными антителами приводит к потере межклеточной адгезии и акантолизу. При инкубации с антителами образование новых десмосом на поверхности клетки затруднено из-за интернализации свободных молекул кадгеринов, в то же время поведение оставшихся десмосом является слабо изученным. С помощью подхода, описанного выше, мы оценили количество десмосом на поперечном срезе кератиноцитов кожи, инкубированной с антителами к рецептору TNF а, сывороткой больных ВП и моноклональными антителами к ДЗ-5 ДСГЗ в течение двух суток. Мы показали, что количество десмосом видимых на поперечном срезе кератиноцитов надбазального слоя достоверно уменьшается при инкубации с патогенными антителами (Рис. 15, Ж). Уменьшение числа десмосом выявлено при окрашиваиии антителами как к ДСГЗ, так и к ДСКЗ. При этом наблюдаются морфологические изменения самих десмосом - они сливаются в большие «супердесмосомы» (Рис.15, Б, В, Д, Е, стрелки). В образцах инкубированных с антителами к ДСГЗ и сывороткой ВП, наблюдается расслоение десмосом на две полудесмосомы (Рис.15 3, И).

Контроль PVIfG ДСГЗДО-S

Кмггра/В. BII If«

Рис. 15. Уменьшение числа дссмосом в кератиноцитах надбазального слоя кожи при инкубации с патогенными антителами. А, Б, В, 3 - вторые антитела к ДСКЗ; Г, Д, Е, И - вторые антитела к ДСГЗ. Следует отметить различия в размерах и количестве десмосом на кератиноцитах из контрольных образцов (А, Г, открытые стрелки) и инкубированных с патогенными антителами (Б, В, Д, Е - закрытые стрелки). Ж-снижение количества десмомом при инкубации спатогениыми антителами. 3,И -инкубация с патогенными антителами приводит к расслоению десмосом на две полудесмомосмы, остающихся в местах контакта соседних клеток (сдвоенные стрелки).

Возможно также, что происходит полная интернализация десмосом без предварительной разборки десмосомального контакта (Рис. 15 Д .большие десмосомы и их околоядерная локализация, отмечено стрелками). В таком случае патогенное действие антител связано не с прямым нарушением десмосомального контакта за счет стерического фактора, а по причине блокирования патогенными аутоантителами процесса сборки десмосом с!е novo.

Выводы:

1. В бакуловирусной системе получены и охарактеризованы 4 фрагмента, соответствующие доменам 1,2, 1-2 и 1-5 внеклеточной части ДСГЗ человека.

2. С помощью рекомбинантных белков показано, что аутоантитела больных ВП преимущественно распознают дистальные домены ДСГЗ.

3. Идентифицировано два потенциальных патогенных эпитопа ДСГЗ. Вероятно, что антитела к эпитопу (25-34) нарушают переход дссмоглеина 3 из цис- в транс-димеры, а к эпитопу (83-98) - латеральные взаимодействия между десмоглеинами.

4. Получены и охарактеризованы антитела к Д1-2, Д1-5, ДЗ-5 ДСГЗ и показано, что патогенными могут быть антитела как к дистальным, так и проксимальным доменам ДСГЗ. Показано, что антитела к ДСГЗ могут быть также и не патогенным и.

5. Показано, что патогенные антитела к ДСГЗ вызывают акантолиз кератиноцитов в эксплантатах кожи, но не нарушают монослой клеток линии кератиноцитов человека НаСа'Г, что прямо связано с числом десмосом на поверхности клеток.

6. Показано, что патогенные антитела к ДСГЗ снижают количество десмосом на поверхности кератиноцитов кожи с одновременным увеличением их размеров, что приводит к расслоению десмосом и потере межклеточной адгезии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи

1. Матушевская Б.В., Коцарева О.Д., Багаева Л.В., Дзуцева И,Р., Лысенко A.A. Блокада акантолиза эпидермиса при вульгарной пузырчатке протективными антителами. Вестник дерматологии и венерологии, 2003, т.4, с.4-7.

2. Лысенко A.A., Коцарева О.Д., Мушенкова Н.В., Дзуцева И.Р., Матушевская Е.В., Свирщевская Е.В. Создание модели пузырчатки на мышах. Медицинская иммунология. 2004, т. 6, 3-5,с.238.

3. Свирщевская Е.В., Лысенко A.A., Коцарева О.Д., Матушевская Е.В. Роль эндотелиальмых клеток в патогенезе пузырчатки: экспериментальная модель. Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии, 2006, т. 1, с. 10-17.

4. Лысенко A.A., Коцарева О.Д., Матушевская Е.В., Свирщевская Е.В. Роль эндотелиалыюго барьера в патогенезе pemphigus vulgaris, Медицинская иммунология. 2006, т.8, №2-3, с. 154.

5. Лысенко А.А., Свирщевская Е.В. Моноклональные антитела к 3-5 доменам десмоглеипа 3 человека вызывают акантолиз in vitro. Российский иммунологический журнал. 2008, т.2, 2-3, с.235.

Тезисы докладов на конференциях

1. Kotsareva O.D, Viskova N.J., Svirshchevskaya E.V., Matushevskaya E.V, Dzutseva I.R, Lysenko A.A. High affinity antibodies to proximal domains of extracellular desmoglein 3 protect from acantolysis induced by pemphigus autoantibodies. Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology, 2003. 7-11 June, Paris, Abs. p. 148.

2. Lysenko A.A., Kotsareva O.D., Svirshchevskaya E.V. Seventh John Humphrey advanced summer programme in immunology "The interface between immunology and medicine", 2005, September 5-9, г. Москва, Тезисы "Activation of endothelium plays a crucial role in pemphigus", p. 29,

3. Лысенко А. А., Дементьева Д.В., Косинский Ю.А., Некрасов A.M., Свирщевская Е.В. Международный междисциплинарный симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и иитегративной медицине», 2008, 19-30 сентября, г.Судагс, Крым, Украина. Труды Симпозиума, «Идентификация патогенных «информационных эпитопов десмоглеипа 3 человека с помощью методов молекулярного моделирования», стр.88.

Заказ № 42/12/2008 Подписано в почать 29.12.2008 Тирах 100 экз. Уол.пл. 1.5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; в-тай: lnfo@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лысенко, Андрей Александрович

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Аутоиммунное заболевание - пузырчатка.

Роль аутоантител в патогенезе пузырчатки.

Внутриклеточные сигнальные пути и их роль при пузырчатке.

Изменение качественного и количественного состава десмосом вследствие действия ВП-lgG. j Экспериментальные модели для исследования патогенности аутоантител ,,

IgG антитела к десмоглеинам - основной класс антител, обнаруживаемых в сыворотке больных пузырчаткой.

Генетические предпосылки, обуславливающие развитие пузырчатки.

Структура и функции десмосом.

Молекулярная архитектура десмосом.

Десмосомальные кадгерины.

Адгезионные взаимодействия между десмосомальными кадгеринами.

Механизм образования димеров по типу «якорь-карман».

Cis- и trans- димеры - функциональная роль и механизм формирования.

Специфичность адгезии, опосредованной кадгеринами.

Адгезионные взаимодействия в десмосоме.

Динамика формирования десмосом.

Роль Са2+ в формировании и функционировании десмоомальных контактов.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА1. Материалы и методы исследований.

Система Bac-to-Bac для получния рекомбинантных белков в бакуловирусной системе экспрессии.

Получение генетических конструкций, кодирующих разные домены десмоглеина 3 человека.

Праймеры.

Приготовление компетентных клеток для трансформации рекомбинантными векторами.

Трансформация клеток Е. coli штамма DH10 Вас1М векторами, кодирующими разные фрагменты десмоглеина 3 человека.

Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli.

Трансфекция клеток насекомых линии Sf9 рекомбинантной вирусной бакмидой.

Реамплификация вирусного стока.

Определение титра рекомбинантных вирусов.

Выделение белков с исползованием метода №2+-аффиной хроматографии.

Электрофорез в полиакриламидном геле.

Иммуноблоттинг.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА).

Выделение Ig из сыворотки иммунных кроликов и больных вульгарной пузырчаткой.

Выделение фракции IgG из раствора эуглобулинов.

Анализ участия IgG из сывороток иммунных кроликов в акантолизе кожи

Антитела, использованные в работе.

Приготовление криосрезов из образцов человеческой кожи.

Иммунофлуоресцентное окрашивание образцов кожи и клеток линий А431 и НаСаТ.

ГЛАВА 2. Получение в бакуловирусной системе экспрессии рекомбинантных белков, соответствующих разным доменам десмоглеина 3 человека.

2.1. Экспрессия генов Д1, Д2, Д1-2 и Д1-5 доменов ДСГЗ в бакуловирусной

2.2. Получение рекомбинантных белков, соответствующих разным доменам ДСГ 3 человека.

2.3. Распознавание различных доменов ДСГЗ сыворотками больных пузырчаткой.

2.4. Идентифиекация В-эпитопов ДСГЗ, распознаваемых сыворотками больных вульгарной пузырчаткой.

2.5. Моделирование конформационных эпитопов ДСГЗ, распознаваемых сыворотками больных вульгарной пузырчаткой.

ГЛАВА 3. Индукция акантолиза антителами к доменам 1-2 и 3-5 ДСГЗ человека.

3.1. Получение кроличьих антител к ДСГЗ.

3.2. Идентификация эпитопа ДСГЗ, распознаваемого коммерческими моноклональными антителами.

3.3. Характеристика клеточных линий кератиноцитов человека.

3.4. Характеристика экспрессии молекул адгезии в неонатальном эпидермисе человека.

3.5. Роль антител к различным доменам ДСГЗ в нарушении адгезии между кератиноцитами.

3.5.1. Нарушение адгезии между клетками эпидермиса антителами к дистальным доменам Д 1-2 ДСГЗ.

3.5.2. Нарушение адгезии между клетками эпидермиса антителами к проксимальным доменам Д 3-5 ДСГЗ.

3.6. Связывание антител к ДСГЗ с монослоем кератиноцитов человека линии НаСаТ.

ГЛАВА 4. Роль ионов кальция в межклеточной адгезии и ее нарушениях.

4.1. Зависимость адгезии в клетках НаСаТ разной степени плотности от ионов кальция.

4.1.1. Плотность десмосом на мембранах гиперадгезивных и адгезивных кератиноцитов.

4.1.2. Зависимость адгезии в гиперадгезионных клетках НаСаТ от концентрации ионов кальция.

4.1.3. Зависимость адгезии в монослое клеток НаСаТ от концентрации

4.2. Роль синтеза десмосомальных кадгеринов de novo в сохранении гиперадгезии клеток НаСаТ.

4.3. Роль температуры в сохранении адгезии клеток НаСаТ.

4.4. Влияние антител к ДСГЗ на адгезию между клетками НаСаТ при низкой концентрации кальция.

4.5. Влияние антител к ДСГЗ на адгезию между клетками НаСаТ при низкой концентрации кальция и комнатной температуре.

4.6. Механизм нарушения адгезии между кератиноцитами.

4.7. Различия механизмов действия антител к Д1-2 и ДЗ-5.

4.8. Плотность десмосом на кератиноцитах кожи человека.

4.9. Патогенные антитела к десмоглеину 3 уменьшают число десмосом в супрабазальном слое кератиноцитов кожи.

ОБСУЖДЕНИЕ.

Выводы.

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ роли дистальных доменов десмоглеина 3 человека в нарушении адгезии между кератиноцитами при пузырчатке"

Пузырчатка (pemphigus) является аутоиммунным заболеванием, при котором наблюдается расслоение эпидермиса с образованием пузырей на коже и слизистых оболочках (Lever, 1953). Аутоантигеном при пузырчатке являются белки десмосом десмоглеины (ДСГ). Связывание аутоантител с белками-мишенями приводит к нарушению межклеточной адгезии - акантолизу (Stanley, 1989). Существует две основные формы пузырчатки: при вульгарной пузырчатке (ВП) аутоантитела распознают ДСГЗ, а при листовидной пузырчатка (ЛП) - ДСП (Stanley et al., 1984). В результате на коже и слизистых образуются многочисленные эрозийные бляшки или пузыри, заполненные жидкостью. Заболевание осложняется тем, что образующиеся пузыри часто вскрываются, что служит причиной сопутствующих инфекций (Ahmed, 1982). До появления кортикостероидных препаратов пузырчатка часто заканчивалась летальным исходом. На настоящий момент заболевание контролируется практически пожизненным приемом преднизолона; случаи излечения исключительно редки. В России ВП составляет более 90% всех случаев пузырчатки, что делает изучение этой формы пузырчатки наиболее актуальным для нашей страны. В ряде стран (Бразилия, Колумбия) существует разновидность эндемичной ЛП. При ВП аутоантитела направлены к ДСГЗ почти у 100% больных и к ДСП - примерно у 50-80%% больных. При листовидной пузырчатке - у всех больных выявляются антитела к ДСП и редко - к ДСГЗ (Hashimoto et al., 2005; Amagai et al., 1999). Характер повреждения кожи — акантолиз — различается при этих формах: при ВП наблюдают формирование пузырей в основном на слизистых оболочках и в надбазальном слое кожи. При ЛП пузыри формируются в поверхностных слоях эпидермиса кожи, что вызывает отслаивание ороговевающих слоев, откуда и возникло название -листовидная пузырчатка. При ЛП слизистые оболочки не повреждаются. Десмоглеины входят в состав десмосом, которые формируют межклеточные адгезионные контакты в эпителии, подвергающемуся механической нагрузке, например, в эпителии кожи, слизистой оболочки полости рта и др. Внеклеточная часть десмосом формируется только двумя белками: десмоглеинами и десмоколлинами, которые относятся к кадгериновому семейству. Механизм нарушения межклеточной адгезии при пузырчатке до сих пор остается непонятным и дискуссионным. Для его понимания требуется детальное изучение механизма сборки и функционирования десмосом.

В настоящее время ген десмоглеина 3 клонирован и полностью охарактеризован. Определена аминокислотная последовательность белка. Получены рекомбинантные белки, содержащие различные участки молекулы десмоглеина в различных экспрессионных системах.

Хотя достоверно показана роль аутоантител в развитии пемфигуса, истинная этиологическая причина по-прежнему остается неясной. Показано, что определенную роль в развитии данного заболевания играют наследственные факторы, поскольку частота встречаемости ВП, в отличие от ЛП, коррелирует с частотой некоторых аллелей главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) II класса. Данная работа является продолжением исследований по механизмам патогенеза пузырчатки и анализу роли аутоантител к дистальным доменам в нарушении адгезии между кератиноцитами.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ:

Цель работы; изучить механизмы патогенности аутоантител к различным доменам десмоглеина 3 в моделях in vitro.

В рамках данной работы были поставлены следующие задачи:

1. Получить в бакуловирусной системе фрагменты десмоглеина 3 человека, соответствующие доменам 1, 2, 1-2 и 1-5 внеклеточной части молекулы ДСГЗ.

2. С помощью рекомбинантных белков изучить доменную специфичность аутоантител больных пузырчаткой.

3. Теоретически определить локализацию эпитопов ДСГЗ, распознаваемых аутоантителами больных.

4. Разработать и охарактеризовать модели in vitro для анализа механизмов патогенеза пузырчатки.

5. Получить антитела к различным доменам десмоглеина 3 и охарактеризовать их патогенность с использованием эксплантатов кожи и культур кератиноцитов человека.

6. Определить механизмы нарушения адгезии патогенными антителами к ДСГЗ.

Научная новизна

1. Впервые в России было осуществлено клонирование в бакуловирусной системе генных фрагментов десмоглеина 3, кодирующих внеклеточную часть молекулы и ее первые два домена.

2. Впервые проведена попытка идентифицировать патогенные эпитопы ДСГЗ методами молекулярного моделирования. Анализ литературных данных позволил подтвердить, что антитела 50% больных ВП распознают один из двух предсказанных патогенных эпитопов.

3. В моделях эксплантатов кожи in vitro впервые показано, что антитела к ДЗ-5 ДСГЗ могут быть патогенными.

4. Впервые показано, что состояние гиперадгезии клеток линии кератиноцитов человека НаСаТ вызвано увеличением числа десмосом на их поверхности.

5. Также впервые показано, что снижение количества десмосом при понижении концентрации кальция или блокаде синтеза десмосом de novo приводит к нарушению адгезии между клетками НаСаТ патогенными антителами к ДСГЗ.

Практическая значимость. Картированы патогенные и непатогенные эпитопы ДСГЗ, что позволяет в дальнейшем разработать протокол иммунизации пептидами, соответствующими непатогенным участкам, с целью конкурентного ингибирования связывания патогенных аутоантител с аутоантигеном. Полученные в данной работе фрагменты генов, кодирующие домены 1, 2 и 1-5 молекулы ДСГЗ, ранее были клонированы в дрожжевой системе экспрессии и получены дрожжевые белки. На основе дрожжевого белка, содержащего 1-2 домены ДСГЗ, разработан диагностикум для анализа циркулирующих аутоантител к десмоглеину человека.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Отдела иммунологии ИБХ РАН; на 7-й летней школе по иммунологии им. Джона Хамфри (ИБХ РАН, Москва, Россия, 2005), на XXII Конгрессе Европейской Академии аллергологии и клинической иммунологии в (Франция, Париж, 2003), на 16-ом Европейском Конгрессе по иммунологии в Париже, 2006; на Всероссийской конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 2004, 2006, 2007, 2008;

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ в печати и материалах российских и зарубежных научно-практических конференций и съездов. Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов, списка литературы. Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 42 рисунка, 10 таблиц. Список литературы включает 200 ссылок на литературные источники.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Аутоиммуное заболевание - пузырчатка

Пузырчатка - аутоиммунное заболевание, сопровождающееся потерей межклеточной адгезии, расслоением эпителиальных пластов и формированием пузырей в толще эпителия (Lever, 1953). В основе патогенеза пузырчатки лежит нарушение адгезии между клетками эпидермиса - кератиноцитами, вызванное связыванием аутоантител IgG класса с белками десмосом. Такое нарушение адгезии, называемое акантолизом, приводит к расслоению эпидермиса, образованию лакун, которые заполняются внеклеточной жидкостью и формируют пузыри. Выделяют два основных типа пузырчатки: вульгарную пузырчатку (ВП), протекающую более тяжело и составляющую 80-90 % всех случаев, и листовидную пузырчатку (ЛП). Существуют и другие варианты пузырчатки, определяемые клиническими проявлениями, глубиной акантолиза и типом аугоантигенов (Kitajima, 2003). Пузырчатка - довольно редкое заболевание, частота заболевания составляет 0,75-5 случаев в год на 1 миллион человек, за исключением ряда областей и групп населения, где частота заболевания может доходить до 16-18 случаев на миллион (евреи Ашкепази, популяции в Бразилии, Колумбии и Японии). Это заболевание встречается не только у людей, но и у лошадей, собак и кошек. В отличие от ряда других аутоиммунных заболеваний, поражающих преимущественно женщин, пузырчатка наблюдается у обоих полов равномерно и чаще всего диагностируется между сорока и шестидесятью годами. При ВП выделяют две основные формы -мукозальную, при которой поражаются только эпителий слизистых оболочек, и кожно-мукозальную, где поражаются также кожные покровы. Акантолиз при ВП наблюдается в базальном и шиповатом слое эпидермиса. В обоих случаях заболевание обычно начинается с образования болезненных, не заживающих язв не только на слизистых, но и в гортани, носу. Позже могут появиться водянистые пузыри на коже головы, в паху, подмышечных впадинах, которые легко вскрываются, оставляя резко очерченные эрозии, заживающие без образования рубцов. При ЛП акантолиз наблюдается преимущественно в верхних слоях эпидермиса, на уровне зернистого слоя, и поражается только эпителий кожи, что приводит к образованию язв, покрытых корочками. Характерной особенностью этой формы является отсутствие регенерации под корками и образование нового пузыря на месте заживления. Поэтому образование слоистых чешуек и корок считается характерным для ЛП. Одной из причин развития пузырчатки может быть употребление лекарств, таких как пенициламин, пенициллин, каптоприл и ß-блокаторы, а также как заболевание сопровождающее или предшествующее лимфоме или карциноме легкого. В Южной Америке существует эндемичная форма ЛП, называемая Fogo seivagem. Считается, что в ее распространении определенную роль играют насекомые-переносчики (Waschke, 2008).

В настоящее время терапия пузырчатки основана на иммуносупрессии и уменьшении количества аутоантител в крови. Традиционная терапия включает в себя -высокие дозы кортикостероидов, внутривенное введение иммуноглобулинов и цитотоксических лекарств. До применения подобной терапии 75% больных ВП умирали в течение года. Однако, такая терапия связана с рядом осложнений от побочного действия высоких доз кортикостероидов. Для устойчивых форм пузырчатки применяют rituximab, моноклональное антитело, направленное против рецептора CD20 B-клеток, что приводит к уменьшению антитело-продуцирующих В-клеток (Ahmed et al., 2006). Для непосредственного удаления антител используют плазмафорез.

Роль аутоантител в патогенезе пузырчатки

Пузырчатка давно известна, как аутоиммунное заболевание. Еще в 70-х было показано, что антитела и сыворотки больных пузырчаткой способны вызывать расслоение эпидермиса, формирование пузырей в коже человека in vivo и in vitro (Schiltz and Michel, 1978; Anhalt et al., 1982). К концу 80-х удалось идентифицировать аутоантпгсны пузырчатки массой 160 кДа для ЛП и 130 кДа для ВП, экспрессирующиеся в коже и слизистых оболочках в составе десмосом (Stanley et al., 1984, 1986; Eyre et al., 1988). В начале 1990-х годов выдсленеие и клонирование кДНК позволило охарактеризовать эти белки как десмоглеии 1 (Mr =160 кДа) и десмоглеин 3 (Mr =130 кДа), относящиеся к семейству белков межклеточной адгезии кадгеринам (Koch et al., 1990; Amagai et al., 1991). Эти белки были экспрессированы в различных системах экспрессии (Stanley et al., 1992; Amagai et al., 1994a; Amagai 1996).

В настоящее время считается общепринятым, что ВП и ЛП характеризуются разным профилем антител, который коррелирует с тяжестью заболевания (Stanley et al. 1984; Ishii et al., 1997; Harman et al., 2001; Bystryn and Rudolph 2005a). Пациенты, имеющие мукозальный тип ВП, имеют антитела только к ДСГ 3, но не к ДСГ 1. В то время как у пациентов с кожно-мукозальной формой заболевания имеются антитела к обоим типам белков (Amagai et al., 1999; Ding et al., 1997; Miyagawa et al., 1999). Напротив, при ЛП выявляются антитела только к ДСП, но не к ДСГЗ (Amagai et al., 1999). Однако, известно, что в ряде случаев не обнаружено никакой корреляции между клиническим фенотипом заболевания и профилем аутоантител (Jamora et al., 2003; Yoshida et al., 2005).

В последнее десятилетие возникла серьезная дискуссия о роли антител при пузырчатке (Amagai et al., 2006а). С одной стороны, многочисленными исследованиями показано, что:

1. Анти-ДСГ1 и ДСГЗ IgG антитела обнаруживаются у пациентов с ЛП или ВП, но не у здоровых людей (Stanley et al., 1986; Eyre et al., 1987; Amagai et al., 1991; Amagai et al., 1994a; Ishii etal., 1997) .

2. При наблюдениях за пациентами титры анти-ДСГ1 или анти-ДСГЗ антител, измеренные с помощью непрямой иммунофлуоресценции или ИФА, как правило, коррелируют с тяжестью заболевания (Ishii et al., 1997; Harman et al., 2001; Cheng et al., 2002).

3. Пациенты с мукозальным типом пузырчатки имеют только анти-ДСГЗ антитела. В то же время пациенты с кожно-мукозальным типом имеют антитела как к ДСГЗ, так и к ДСП (Ding et al., 1997; Amagai et al., 1999; Miyagawa et al., 1999).

4. У ряда пациентов наблюдается переход от одного типа ВП к другому. Этот переход сопровождается изменением в антигенной специфичности аутоантител. Например, при переходе от ВП к ЛП к анти-ДСГЗ антителам добавляются анти-ДСГ1 антитела (Miyagawa et al., 1999; Komai et al., 2001).

5. Антитела, выделенные у больных ЛП или ВП, при инъекции в неопатальных мышей могут вызвать акантолиз с гистологической картиной, характерной именно для ЛП или ВП соответственно (Anhalt et al., 1982; Rock et al., 1989). Удаление апти-ДСГ1 IgG антител с помощью иммуноадсорбции на рекомбинантных ДСП, экспрессированных в бакуловирусной системе, устраняет способность сывороток к формированию акантолиза in vitro и при пассивном переносе в неонагальных мышей. То же самое показано для анти-ДСГЗ антител и больных ВП (Amagai et al.,

1994a; Amagai et al., 1995b; Sekiguchi et al., 2001). Поражения эпидермиса кожи у неонатальных мышей формируются только при совместном введении анти-ДСГ1 и анти-ДСГЗ антител (Mahoney et al., 1999).

6. Нокаутные по гену dsg3 мыши имеют фенотип очень похожий на мукозальную форму ВП (Koch et al., 1997). При иммунизации таких мышей ДСГЗ и последующем переносе спленоцитов в иммунодефицитных Rag2-/- мышей, у последних также появляются эрозии на поверхности слизистых (Amagai et al., 2000).

7. Моноклональные мышиные анти-ДСГЗ антитела (в частности АК23) способны вызывать акантолиз in vitro с гистологией, характерной для мукозального типа ВП. Было показано, что эпитоп АК23 расположен на N-конце в первом домене ДСГЗ и входит в функционально важный для адгезии участок (Amagai ct al., 2000; Tsunoda et al., 2003). В целом можно сказать, что аутоантитела при ВП н ЛП направлены преимущественно к первому домену, который функционально важен для адгезии (Futei et al. 2000; Sekiguchi et al., 2001; Muller et al., 2008). Было также показано, что наряду с патогенными антителами существуют и непатогенные антитела, не способные вызывать акантолиз in vitro (Bhol et al., 2002; Tsunoda et al., 2003). Таким образом, антитела только к специфическим эпитопам могут вызывать акантолиз.

8. Одноцепочечные моноклональные анти-ДСГЗ антитела, выделенные при помощи фагового дисплея из сыворотки больного ВП способны вызывать акантолиз, гистологически характерный для ВП (Payne et al., 2005).

Все эти факты позволили M.Amagai и J. Stanley предложить теорию патогенеза пузырчатки, связанную с антителами. Согласно этой концепции, акантолиз характерный для ВП и ЛП, можно объяснить возникновением стерических препятствий для взаимодействия ДСП или ДСГЗ при связывании с ними аутоантител. Однако, к настоящему времени получен ряд фактов, не укладывающихся в данную теорию. Несмотря на то, что связывание антител может препятствовать образованию ДСГЗ/ДСГЗ или ДСГЗ/ДСКЗ димеров, не очевидно, что это напрямую приводит к разрушению десмосомального контакта. Так, ДСГЗ-/- мыши демонстрируют способность к формированию морфологически нормальных, хотя функционально неполноценных десмосом в слизистых, и нормальную межклеточную адгезию в эпидермисе (Koch et al., 1997; Mahoney et al., 1999). Более того, было показано, что связывание ВП-IgG с поверхностными аутоантигенами не нарушает формирование десмосомальных контактов при повышении концентрации ионов Са2+ (Kitajima et al., 1987). Электронная микроскопия образцов ткани пациентов с пузырчаткой, показала, что первоначально потеря адгезии происходит в междесмосомальных участках контакта соседних клеток. Разрушение десмосом происходит значительно позже и десмосомальные контакты сохраняются довольно долгое время (Bystryn et al., 2006). В последнее время появились работы, в которых обсуждаются механизмы патогенеза, не связанные с антителами. Было показано, что сыворотки больных ВП способны вызывать изменения в морфологии клеток и разрушение межклеточных контактов при удалении патогенных антител из сыворотки (Cirillo et al., 2007). Интересно, что антитела к Дсг1 и ДсгЗ не уникальны для пузырчатки. Специфический ИФА анализ показывает наличие антител к Дсг1 в 83% случаев онхоцеркоза (гельминтное заболевание), 58% болезни Чагаса, 43% лейшманиоза, 25% бластомикоза, 17% случаев лепры (Diaz et al., 2004). Частота встречаемости антител к Дсг1 и ДсгЗ у здоровых родственников пациентов с BIT или ЛП, доходит до 20% (Torzecka et al., 2003). Важно также, что антитела к Дсг1 и ДсгЗ выявлены у 36% и 32% здоровых людей, соответственно, в районах с эндемичной формой ЛП - Fogo selvagem (Hilario-Vargas et al., 2006; Ortega Loyaza et al., 2006). Все эти факты требуют своего объяснения и показывают, что концепция «стерического препятствия» не полностью объясняет механизм патогенезва при пузырчатке и нуждается в дополнениях и новых исследованиях. Допуская, что эта концепция верна в целом, мы, тем не менее, не можем сказать, происходит ли прямое блокирование аутоантителами ¿raws-взаимодействий десмоглеинов или же имеет место аллостерическое действие антител, т.е их влияние на конформационные перестройки в первом домене десмоглеинов. В последнем случае патогенными могут быть не только антитела к первому, но и к другим доменам десмоглеинов.

Внутриклеточные сигнальные пути и их роль при пузырчатке

Одной из альтернативных, или, скорее, дополняющих гипотез к концепции «стерического препятствия» является гипотеза внутриклеточных сигнальных путей, запускаемых при связывании аутоантител с демоглеинами или другими молекулами, что ведет в конечном итоге к потере межклеточной адгезии. С тех пор как в 1995 году было показано, что связывание ВП-IgG с кератиноцитами приводит к резкому повышению внутриклеточной концентрации ионов кальция (Seishima et al., 1995), было обнаружно несколько внутриклеточных сигнальных путей, активируемых аутоантителами к Дсг1 или ДсгЗ. Так было показано, что инкубирование кератиноцигов и клеток линии DJM-1 с IgG фракцией антител из сывороток больных в течение 20 минут приводит к фосфорилированию ДсгЗ, не входящего в состав десмосом, и диссоциации плакоглобина от ДсгЗ (Aoyama et al., 1999а). Это приводит к быстрому (20 мин) исчезновению молекул ДсгЗ с поверхности и, очевидно, способствует формированию ДсгЗ-истощенных десмосом (Aoyama ct al., 1999b). Маловероятно, что аутоантитела выступают в качестве единственно возможного стимула для фосфорилирования ДсгЗ. Скорее всего, связывание антител с ДсгЗ влияет на сигнальный путь(и), регулирующий в норме гомеостаз десмосомальных контактов.

Одним из важных компонентов такого пути является р38МАРК киназа. Было показано, что уровень фосфорилирования этой киназы, а также белка HSP27 резко увеличивается при инкубации первичных кератиноцигов человека с ВП-IgG (Berkowitz et al., 2005а). Ингибирование данной киназы предотвращало разборку промежуточных (кератиновых) филаментов и реорганизацию цитоскелета, характерную для акантолитических кератиноцитов. Фосфорилирование р38МАРК, индуцированное ВП-IgG, было дозозависимым и кратковременным. Уровень фосфорилирования достигал пика к 30 минутам после стимулирования ВП-IgG, и снижался до нормального к 60 минутам. В дальнейшем было показано, что ингибирование р38МАРК, предотвращает акантолиз в неонатальных мышах при пассивном переносе ВП-IgG (Berkowitz et al., 2005b). Это говорит о существенном вкладе р38МАРК сигнального пути в патогенез пузырчтаки. Хотя киназы семейства р38МАРК участвуют в регулировании синтеза провоспалигельных цитокинов, транскрипционные механизмы вряд ли прямо задействованы в индукции акантолиза, так как появление пузырей у неонатальных мышей и разрушение кератиновых филаментов в кератиноцитах происходит в течение 2-6 часов после действия ВП-IgG (Berkowitz et al., 2005а). Следует иметь в виду, что активация р38МАРК может быть следствием, а не причиной потери межклеточной адгезии. В частности, было показано, что в клетках кишечного эпителия крысы потеря межклеточной адгезии сопровождается активацией р38МАРК (Rosen et al., 2002).

Еще одним потенциальным звеном в патогенезе пузырчатки может быть плакоглобин - белок, непосредственно принимающий участие в формировании десмосом и отвечающий за взаимосвязь между десмосомальными и простыми контактами (Lewis et al., 1997). Важная роль плакоглобина в патогенезе пузырчатки была предложена после изучения нокаутных по плакоглобину (ПГ-/-) мышей. Было показано, что число десмосом в кератиноцитах таких мышей было ~ в 20 раз меньше, чем в норме, однако стимулирование ВП-IgG не приводило к разрушению цитоскелета и потере межклеточной адгезии (Caldelari et al., 2001). В настоящее время неясно почему ВП-IgG не вызывают акантолиз в ПГ-/- мышах, возможно, что определенную роль в этом играет транскрипционный фактор с-тус. Недавно было показано, что инкубирование кератиноцитов с ВП-IgG приводит к истощению пула плакоголобина, находящегося в ядре, что влечет за собой сверхэкспрессию с-тус (Williamson et al., 2006).

В ряде работ было показано, что при инкубации кератиноцитов с ВП-IgG происходит активация сигнальных путей, связанных с фосфолипазой С, инозитол-1,4,5-трифосфат (И-ЗФ)-зависимой мобилизацией ионов Са~ , активацией протеинкиназы С (Seishima et al., 1995; Osada et al., 1997; Kitajima et al., 1999). Однако, не было показано, что этот сигнальный путь может привести к фосфорилированию ДсгЗ или Дсг1. Косвенно о роли этого пути говорит то, что хелатирование свободного внутриклеточного кальция, а также использование ингибиторов кальмодулина, фософлипазы С, протеинкиназы С блокирует ВП-IgG-индуцированный акантолиз in vivo (Sanchez-Carpintero et al., 2004).

Большую дискуссию о роли апоптоза в акантолизе и патогенезе пузырчатки вызвало обнаружение в образцах биопсии кожи пациентов с ВП и ЛП апоптотических клеток (Gniadecki et al., 1998; Puviani et al., 2003; Wang et al., 2004). При инкубации кератиноцитов с ВП-IgG или сыворотками больных был обнаружен ряд признаков апоптоза — фрагментация ДНК, увеличенная экспрессия проапоптотических молекул: Fas, FasL, Вах, р53, истощение анти-апоптотических Вс1-2 и FLIPl, активация каспаз 1, 3 и 8 (Puviani et al., 2003; Wang et al., 2004; Frusic-Zlotkin et al., 2005; Chernyavsky et al., 2007). Таким образом, имеются серьезные доказательства апоптоза кератиноцитов при пузырчатке, хотя фенотип акантолитических клеток отличается от фенотипа клеток, проходящих апоптоз (Arredondo et al., 2005). С одной стороны показано, что апоптотические клетки присутствуют у пациентов в эпидермисе, где еще нет видимого нарушения межклеточных контактов (Wang et al., 2004; Chernyavsky et al., 2007), что говорит о том, что апоптоз предшествует акантолизу. С другой стороны, в большинстве экспериментов показано, что акантолиз четко виден спустя 18-24 часа инкубации (Mahoney et al., 1999; Nguyen et al., 2000; Tsunoda et al., 2003; Caldelari et al., 2001; Berkowitz et al., 2006). В экспериментах, где исследовался апоптоз, он наблюдался при пролонгированной до 48-72 часов инкубации ВП-lgG с клетками (Arredondo et al., 2005; Frusic-Zlotkin et al., 2005; Wang et al., 2004). Следовательно, можно считать, что апоптоз — процесс параллельный или следующий за акантолнзом. Интересно, однако, что активированная каспаза-3 способна разрезать ДсгЗ (Weiske et al., 2001), а ингибиторы этой каспазы и кальпаипа блокируют акантолиз, индуцируемый ВП-lgG в монослое кератиноцитов и образцах кожи (Weiske et al., 2001; Wang et al., 2004; Arredondo et al., 2005). В целом можно сказать, что на сегодняшний день непонятно, как взаимосвязаны акантолиз, индуцируемый ВП-lgG, и апоптоз, наблюдаемый в эпидермисе больных ВП.

В настоящее время обсуждаются и другие возможные механизмы индуцирования акантолиза. В частности, показапо, что система никотиновых и мускариновых рецепторов ацетилхолина принимает участие в регуляции клеточных и субстрат-клеточных взаимодействий и миграции клеток (Grando, 2006). В ряде исследований показано пересечение сигнальных путей от холинергических рецепторов с Bn-IgG-индуцированными эффектами (Chernyavsky et al., 2007). Обсуждается также сигнальные пути, связанные с активностью Rho-ГТФаз, транскрипционного фактора с-шус, рецептора EGF и ряд других (Sharma et al., 2007; Waschke 2008). На рис.1 приведены возможные внутриклеточные сигнальные пути, способные влиять на межклеточную адгезию, перестройку межклеточных контактов и, в конечном итоге, способные объяснить механизмы развития акантолиза, лежащего в основе патогенеза пузырчатки. Следует отметить, что вышеприведенные взгляды на механизмы акантолиза и потери межклеточной адгезии не противоречат, а скорее дополняют друг друга. Об этом говорит ряд работ, в которых исследовался метаболический путь ДсгЗ и ряда других десмосомальных белков после связывания ВП-lgG с поверхностным ДсгЗ, как входящих в состав десмосом, так и расположенных вне мест десмосомального контакта.

Сборка/ря 1б»рк* кгмосам кератнновые фнламепты

11 aun ii.ilo.ihh к uní II

Mjikttp peitAnx и Ацх

AltX CIIM1C1 рАпх экспрессия uPA/uPAR сити и -жпрессии

Ядро

Экспрессия генов

Рис.1. Возможные внутриклеточные сигнальные пути, активируемые аутоантителами при пузырчатке. Связывание аутоантител с десмоглеинами 1 и/или 3 может приводить к; (1) прямому иигибированию адгезионных взаимодействий за счет стерических препятствий и/или (2) переключать внутриклеточные сигнальные пути, что ведет к активации протеинкиназы С (РКС), регулируемое фосфолипазой С и ее продуктом -диацилглицеролом (DAG). Активированная РКС изменяет уровень фосфорилирования регуляторных белков в клетке, что запускет процесс перестройки десмосом, в котором важную роль играют внутриклеточные ионы Са2+. Активированная РКС также индуцирует секрецию урокиназы активатора плазминогена (иРА) и экспрессию ее рецептора (uPAR). uPA активна только при связывании с ее рецептором, и поэтому плазмин может образовываться только вблизи поверхности клетки, что ведет к плазмин-опосредованному разрезанию белков в десмосоме. Даже если этот процесс не важен в начале, он может играть большую роль на поздних стадиях акантолиза. (3) Связывание аунтител с Дсг индуцирует его фосфорилирование, диссоциацию плакоглобина (ПГ), что в конечном итоге приводит к неспособности молекул Дсг поддерживать адгезию. Более вероятно, что после диссоциации от ДсгЗ, ПГ фосфорилируется (фПГ) и накапливается в цитоплазме. Действуя как транскрипционный фактор, он индуцирует экспрессию uPAR, что ведет к образованию ДсгЗ истощенных десмосом. Возможно, что антитела связываются также с ацетилхолиновыми рецепторами (рАцх). Связывание ВП-IgG с рАцха9 может (I) блокировать приток Ca2t ионов, регулирующих сборку/разборку десмосом и активацию протеинкиназа С, которая меняет уровень экспрессии белков в клетке через фосфорилирование транскрипционных факторов. (2) связывание ВП-IgG с рАцха9 может запускать активацию цАМФ или активацию прогеин-киназы С, что в конечном итоге влияет на транскрипцию генов. В норме этот путь ведет к синтезу ацетилхолина (Ацх) и экспрессии рАцх. ВП-IgG ослабляют межклеточную адгезию между кератиноцитами, инактивируя рАцх опосредованный сигнальный путь контроля за экспрессией и активностью молекул Дсг. Это в итоге приводит к нарушению образования межклеточных контактов и акантолизу. Дсг-десмоглеин, Дск-десмоколлин, 1РЗ-инозитол-1,4,5-трифосфат, ПМ-плазматическая мембрана (По данным Lanza et al., 2006, с изменениями).

Изменение качественного и количественного состава десмосом вследствие действия ВП-IgG

Эксперименты, проведенные с нормальными кератиноцитами человека и клетками линии DJM-1 показали, что свзязывание аутоантител с ДсгЗ приводит к интернализации и деградации молекул ДсгЗ. Это, в свою очередь, приводит к у образованию ДсгЗ-истощенных десмосом (Aoyama et al., 1999a,b). Иммуноблоттинг и иммунофлуоресцентная микроскопия с использованием антител к Дсг1, ДсгЗ, ПГ, десмоплакину 1 и цитокератинам показали, что при инкубировании с ВП-IgG ДсгЗ довольно быстро, в течение 20 минут, исчезает с поверхности мембран (Triton Х-100 растворимая фракция ДсгЗ). В то же время, в цитоскелет-ассоцпированной (Triton X-100 нерастворимая) фракции падение количества ДсгЗ не наблюдается (Aoyama et al., 1999b). Однако, при более длительной инкубации с ВП-IgG - от 24 до 30 часов -приводит к заметному падению количества ДсгЗ, но не других белков, в цитоскелет-ассоцироваипой и десмосомальной фракциях. Двойное иммунофлуоресцентпое окрашивание показало, что ВП-IgG и патогенные моноклональные антитела к ДсгЗ уменьшают количество молекул ДсгЗ в десмосомах. В то время как в имеющихся через 30 часов инкубации межклеточных контактах сохраняются Дсг1, ПГ, десмоплакин1, кератиновые филаменты, в них почти отсутствует ДсгЗ. Эти данные подтверждаются иммуноэлектронным микроскопическим исследованием. Кластеры ДсгЗ, находящиеся на поверхности и не включенные в десмосомальный контакт интернализуются в эндосомы пустя 60 минут после начала инкубации с ВП-IgG (Sato et al., 2000). После 30 минут инкубации соотношение мембранных молекул ДсгЗ/ДскЗ, не включенных в состав десмосом резко падает (~ в 10 раз) (Shu et al., 2005). Данные об интернализации и деградации внедесмосомального мембранного пула ДсгЗ и образовании ДсгЗ-истощеппых десмосом также подтверждаются тем, что ВП-IgG индуцирют интернализацию ДсгЗ в комплексе с плакоглобином, по не с десмоплакином (Calkins et al., 2006). Также показано, что инкубация клеток с ВП-IgG приводит к уменьшению времени полужизни ДсгЗ и нарушает сборку десмосом de novo в местах межклеточных контактов (Cirillo et al., 2006а). Такое же действие на внедесмосомальный пул ДсгЗ оказывают и моноклональные анти-ДсгЗ антитела (Yamamoto et al., 2007). Важно, что подобное действие ВП-IgG наблюдается не только на клеточных линиях in vitro, но и в модели пассивного переноса ВП-IgG в неонатальных мышей (Shu et al., 2007). У таких мышей в течение 24 часов развивается акантолиз, а количество ДсгЗ, связанного с катенином снижено на 30% по сравнению с контролем. В той же работе показано, что в образцах кожи пациентов с ВП, также отмечается снижение уровня ДсгЗ/ катенин. Все эти данные говорят о том, что интернализация и деградация ДсгЗ и образование ДсгЗ-истощенных десмосом вносит важнейший вклад в акантолиз. Ослабление адгезии в десмосомальных контактах может усугубляться внутриклеточными процессами. Интернализованные молекулы ДсгЗ в комплексе с ПГ или без него как раз и могут запускать ряд таких внутриклеточных процессов, что в конечном итоге приводит к акантолизу.

Исходя из вышеизложенного, можно сказать, что в развитии акантолиза, как ключевого события патогенеза пузырчатки, задействованы как прямые, так и непрямые механизмы действия антител. В настоящее время, получены надежные доказательства того, что потеря межклеточной адгезии и акантолиз при ВП и ЛП запускается скорее внутриклеточными сигнальными путями, чем прямым блокированием адгезионных взаимодействий молекул Дсг. Работы (Caldelari et al., 2001; Berkowitz et al., 2005a,b; Waschke et al., 2006), в которых было показано, что ингибирование или полное удаление важных компонентов внутриклеточных сигналов (плакоглобин, р38МАРК, RhoA) сильно влияет на акантолитическую активность аутоантител. Отсутствие нарушения адгезии в кератиноцитах, инкубируемых при низкой температуре в присутствии аутоантител, показывает, что прямого нарушения адгезионных взаимодействий между молекулами Дсг не достаточно для развития акантолиза (Calkins et al., 2006). Если бы такое ингибирование было бы первичной причиной акантолиза, то трудно объяснить почему акантолиз может быть заблокирован при модификации внутриклеточных сигнальных путей или низкой температурой. Возможно, что блокирование аутоантителами Дсг взаимодействий вносит дополнительный вклад во внутриклеточные сигнальные процессы (Tsunoda et al., 2003; Sharma et al., 2007). Однако в ряде работ показано, что ЛП-IgG способны запускать внутриклеточные процессы без существенного влияния на взаимодействия между молекулами Дсг (Waschke et al., 2005; Heupel et al., 2007), что прямое ингибирование взаимодействий между молекулами не существенно для нарушения процессов, контролирующих межклеточную адгезию. Интересно предположить, что при ВП и ЛП разные механизмы играют разную роль, так как клинические проявления при ВП более тяжелые, чем при ЛП. Действительно, некоторые механизмы потери межклеточной адгезии обнаружены только для ВП. Например, антитела, вызывающие акантолиз при ВП, напрямую ингибируюг взаимодействия между молекулами ДсгЗ, но при ЛП такого действия антител пока не обнаружено (Waschke et al., 2005; Heupel et al., 2007). Во-вторых, при ВП убедительно показана интернализация и деградация ДсгЗ, но при ЛП таких данных для Дсг1 пока не имеется (Yamamoto et al., 2007). Следовательно, прямое действие антител при ВП может играть существенно большую роль, чем при ЛП. В целом ВП является более изученным типом пузырчатки, чем ЛП, поэтому ряд фактов, полученных только на основе сывороток или ВП- IgG, могут оказаться важными и для ЛП. Дальнейшие исследования необходимы, чтобы оценить вклад в акантолиз таких факторов, как внеклеточный протеолиз Дсг и Дек, изменения внеклеточной концентрации ионов Ca , полиморфизм генов десмосомальпьтх кадгеринов, и структурные исследования самих молекул Дсг и Дек.

Экспериментальные модели для исследования патогенности аутоантител.

Для изучения механизмов взаимодействия аутоантител с десмоглеинами и анализа роли антител к различным доменам в патогенности сывороток необходимо было создание модели акантолиза in vitro и in vivo. У мышей спонтанно не развиваются заболевания, напоминающие пузырчатку. Введение антител, полученных от больных, взрослым мышам, также пе вызывает акантолиза. Первыми удачными модельными системами для исследования патогенности антител пузырчатки бьтли культуры клеток кератиноцитов мыши (Färb et al., 1978) и эксплантаты кожи человека (Jeffes et al., 1984). Использование клеточных линий имеет ряд преимуществ, однако, имеет также и некоторые недостатки. Так, клеточная линия кератиноцитов человека не дает возможность наблюдать акантолиз, так как клетки формируют только монослой клеток. Использование эксплантатов кожи человека также имеет ограничения, связанные с необходимостью получения образцов кожи от доноров. Обычно такими донорами являются больные, проходящие косметические операции. Дальнейшие попытки улучшить модельную систему привели к созданию модели акантолиза на неонатальных мышах (Anhalt et al., 1982). При введении больших доз антител неопатальным мышатам (20-30 мг) удалось вызвать акантолиз, который виден невооруженным глазом. Развивается так называемый знак Никольского. Добавление таких же доз антител к эксплантатам кожи неонатальных мышей in vitro также вызывает акантолиз, однако в этом случае требуется проведение гистологических исследований. На основе этих двух последних моделей in vivo и in vitro изучаются все основные характеристики взаимодействий между антителами и белком десмоглеином 3. В последнее время для исследований используют различные линии кератиноцитов человека. Однако, в монослойных культурах даже патогенные in vivo аутоантитела имеют значительно более слабый эффект, поэтому используют разнообразные методы для оценки патогенности антител (Ishii et al., 2005).

В 1997 была получена линия трансгенных мышей, не имеющих ДсгЗ (Koch et al., 1997). С их помощью было убедительно показано, что ДсгЗ играет важную роль в межклеточной адгезии. Такие мыши рождались нормальными, но позже у них наблюдалось образование пузырей и эрозий на слизистых оболочках рта, а также отставание в росте и развитии, что объясняется затруднениями при поглощении пищи. Пузыри на коже появлялись только после механических воздействий.

В 2000 году группа М. Amagai, используя нокаутных по ДСГ-3 гену мышей, разработала модель активного развития заболевания in vivo (Amagai et al., 2000). ДСГ 3 -/- мыши были иммунизированы рекомбинантным ДСГ-3 для получения анти-ДСГ-3 антител, взаимодействующих с нативным аутоантигеном. Пересадка спленоцитов от иммунных мышей к иммунодефицитным Rag2-/- мышам, имевших ДСГ-3, приводила к развитию заболевания у последних.

IgG антитела к десмоглеинам - основной класс антител, обнаруживаемых в сыворотке больных пузырчаткой.

При всех формах пузырчатки аутоантитела IgG класса обнаруживаются в связанном виде на клеточной поверхности кератиноцитов по всей толщине эпидермиса (Amagai et al, 1991). Как было изложено выше к настоящему времени получено большое число данных, свидетельствующих о непосредственном участии аутоантител пузырчатки в патогенезе заболевания. Причины появления аутоантител при ВП и ЛП на сегодняшний день малоизучены. Показано, чго существует генетическая предрасположенность к возникновению ВП, связанная с определенными аллелями главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) II класса (Ahmed et al.,

1990; Niizeki et al., 1991; Hammer et al., 1995). Для ЛП генетическая предрасположенность достоверно не обнаружена, хотя в ряде районов Бразилии и Колумбии у здоровых родственников больных ЛП имеются антитела к Дсг1 (Hilario-Vargas et al., 2006; Ortega Loyaza et al., 2006). У пациентов с активной формой заболевания ВП основными аутоантителами являются иммуноглобулины IgGi и IgG4 класса. Они распознают эпитопы ЭД1 и ЭД2 доменов, а антитела lgG4 класса, направленные против ЭД2 и, в меньшей степени, против ЭД1, способны непосредственно вызывать акантолиз (Bhol et al., 1995). Данные о ключевой роли IgG4 при развитии акантолиза подтверждаются и рядом других наблюдений. У пациентов в стадии ремиссии доминирующими являются антитела IgGj класса, но и антитела IgG4 класса также выявляются, хотя их титр значительно меньше, чем при острой стадии болезни. У здоровых родственников обнаруживаются антитела только IgGi класса к домену ЭД1 (Brandsen et al., 1997). Таким образом, переход болезни из предклинической стадии в клиническую и из фазы ремиссии в острую фазу коррелирует с изменением качественного и количественного состава антител, что дает возможность различать патогенные и непатогенные аутоантитела. Под воздействием неизвестных стимулов у здоровых родственников и у людей, имеющих определенную генетическую предрасположенность к развитию пузырчатки, происходит стимуляция синтеза антител IgGj класса, которые остаются у индивидуума на всю жизнь. Дополнительные стимулы вызывают появление высоких титров аутоантител, как IgGb так и IgG4 класса, направленных не только к домену ЭД1, но и к домену ЭД2. Эти антитела, в отличие от непатогеппых, могут вызывать акантолиз (Bhol et al., 1995). При лечении, когда болезнь переходит в стадию ремиссии, титры патогенных антител, как правило, значительно снижаются.

Следует отметить, что сыворотки крови здоровых людей, не входящих в группу риска, также содержат антитела к антигенам пузырчатки, но в очень небольших количествах. Это может объясняться тем, что существует большое сходство между некоторыми эгштопами аутоантигепов и эпитопами белков наиболее часто встречающихся вирусов или же других широко распространённых антигенов, к которым многие люди имеют иизкие титры антител, постоянно циркулирующих в крови (Bhol et al., 1995).

Исследования профиля аутоантител при листовидной пузырчатке показало аналогичную зависимость между стадией заболевания и наличием антител определённого класса и специфичности (Warren et al., 2003). IgG - не единственный класс антител, ассоциированных с пузырчаткой. Недавние исследования Spaeth et al., 2001 показали, что антитела IgA класса могут присутствовать в сыворотке больных как в стадии ремиссии, так и в острой фазе. Эти данные, а также ряд других (Wallach, 1992; Ongenae et al., 1999) позволили выделить IgA-зависимый вариант пузырчатки, хотя и в нем главными патогенными антителами являются антитела IgG класса. Также Spaeth с коллегами показали наличие антител IgE класса у некоторых больных. Важно, что у таких больных отмечалось сильное поражение эпителия слизистой рта, и возможно наличие антител IgE класса влияет на тяжесть протекания заболевания. Новые исследования необходимы для подтверждения этих данных.

Генетические предпосылки, обуславливающие развитие пузырчатки

Продукция антител G класса, как в норме, так и при патологии, зависит от участия Т-лимфоцитов. Опознавание эпитопов ДСП и ДСГЗ аутореактивными Т-клетками является решающим для инициации и сохранения специфичного Т-клеточного ответа, осуществляющего активацию B-клеток, которые синтезируют аутоантитела. Участие CD4+ Т-лимфоцитов в патогенезе пузырчатки подтверждается целым рядом данных о четкой корреляции между развитием заболевания и присутствием на поверхности клеток больных специфических фенотипов МНС II комплекса: HLA DRßj 4 и HLA DRßj 14. Кроме того, у здоровых родственников пациентов с разными формами пузырчатки, имеющих гаплотипы HLA DRßi 4/ DQ 8 или же HLA DRßi 4/ DQ 5, тоже обнаруживаются низкие титры антител к десмоглеину-3. Исследования Hertl et al., 1998, подтвердили высокую частоту встречаемости аллелей HLA DRßi 4 и HLA DRßi 14 у больных пузырчаткой. Однако згой же группой было показано наличие дополнительных аллелей HLADRßi 11, ассоциированных с развитием заболевания. Фенотип этих аллелей по структуре очень похож на фенотип HLA DRßj 14.

Четкая корреляция между определенными типами аллелей и риском развития пузырчатки прослеживается при изучении определенных этнических групп таких, как евреи Ашкенази (Ahmed et al, 1990) или японских рыбаков (Niizeki et al., 1991). В таких популяциях частота встречаемости пузырчатки, как правило, гораздо более высокая (до 20%), чем в среднем по миру (0.5- 1 случай па 105 человек). Аутоантитела IgG класса обнаруживаются не только у больных, но и у ближайших родственников. В патогенезе пузырчатки определенную роль играют факторы окружающей среды, диета (Brenner et al., 1998), а также, возможно, вирусы (Ruocco et al., 1996).

Таблица 1. Аллели, ассоциированные с развитием пузырчатки.

По данным Hertl et al., 1998; Hammer et al., 1995)

Аллели, ассоциирование с ВП Характеристика отдельных аллелей

HLA DRß, 0402 Уникальный аллель, имеющая отрицательно заряженную аминокислоту-Glu в позиции 71 Рг цепи. Более распространенными являются аллели, имеющие в этом положении положительно заряженную аминокислоту Arg

HLADQß,0301, DQßi 0503 Имеют замену Val на Asp в положении 57, которая, по-видимому, не играет решающей роли для активации Т-клеток

HLA DRßi 11 Аллели этого типа отличаются друг от друга аминокислотными заменами в положениях 67, 71, 86.

Интересно, что некоторые НЬА DR.pi аллели, запускающие продукцию аутореактивных Т-лимфоцитов, включая ВЯР]0402, ОКР]0401, 0яр!1101 имеют С1и71 (табл.1). Это говорит о том, что эта позиция является важнейшим сайтом связывания иммунодоминантных пептидов ДСГЗ и играет важную роль для развития болезни.

Роль Т-клеток при пузырчатке в свете обнаружения новой популяции С04+СЭ25+ регуляторных Т-лимфоцитов (8ака§исЫ е1 а1., 2005), предстоит переосмыслить. Т-регуляторные клетки осуществляют контроль за активацией других типов иммунокомпетентных клеток и играют важную роль в поддержании периферической толерантности. В настоящее время роль Т-регуляторных клеток при пузырчатке мало исследована. В недавнем исследовании было показано, что у большинства здоровых носителей ВП-ассоциированных аллелей ГКГС II класса, и не менее, чем 20% обследованных больных с ВП имеется пул ДсгЗ-реактивных Т-клеток, секретирующих 1Ь-10 (УеМшап е1 а1., 2004). Этот пул Т-клеток может быть одним из типов регуляторных клеток и подавлять пролиферативную активность Дсг-3 аутореактивных Т-хелперов, секретируя 1Ь-10 и ТСГ-Р в качестве эндокринных факторов. Е. БтЬа с коллегами обнаружили группу С08+С028- Т-клеток с потенциально регуляторной функцией, которые присутствую только у пациентов в стадии начальной ремиссии, но не у больных ВП (БиЛа е1 а1., 2005). Эти исследования говорят о том, что различные группы регуляторных Т-клеток могут поддерживать и регулировать периферическую иммунную толерантность к ДсгЗ в здоровых индивидуумах и у пациентов в стадии ремиссии. Эти данные говорят о том, что регуляторные Т-клетки играют важную, если не ключевую роль в контроле продукции аутоантител при пузырчатке. Новые исследования необходимы, чтобы выяснить взаимосвязи между Т-хелперами-2, функция которых нарушается при пузырчатки и Т-регуляторпыми клетками (НегИ е1 а1., 2006). Возможно, что развитие ВП может быть следствием появления дисбаланса между ДсгЗ реактивными Тх2 и Т-регуляторпыми клетками, количественно регулирующими Т-клеточный аутоиммунный ответ. В таком случае Т-регуляторные клетки могут быть хорошей мишенью для специфического и стойкого восстановления иммунной толерантности к ДсгЗ и лечению пузырчатки.

Структура и функции десмосом

Пузырчатка — заболевание, свзязанное с нарушением межклеточной адгезии. Одной из мишеней аутоантител являются десмоглеины, входящие в состав десмосом. При пузырчатке происходит нарушение десмосомальных контактов. Чтобы более четко представлять процессы, сопровождающие потерю межклеточной адгезии при пузырчатке, нужно представлять, как устроены, функционируют и регулируются десмосомальные контакты в норме. Важны также механизмы адгезионных взаимодействий десмоглеинов и десмоколлинов на молекулярном уровне. Поэтому ниже приведен обзор литературы по структуре и регулированию функций десмосом и десмосомальных кадгеринов.

Десмосомы вносят важный вклад в обеспечение адгезии соседних клеток наряду с другими типами межклеточных контактов. Высокая прочность десмосомальных контактов основана на многочисленных и сильных нековале! 1тных взаимодействиях между белковыми молекулами в десмосоме. Сложная архитектура десмосом обеспечивается высоко координированным механизмом сборки, детали которого и сегодня не вполне ясны. Существует комплекс регуляторных процессов, ослабляющих, если нужно, адгезионные взаимодействия в десмосоме. Это достигается путем поддержания нужного баланса между сборкой и разборкой десмосом, а также контролем синтеза, транспорта и деградации белковых компонентов. Десмосомы широко распространены в тех типах тканей, которые подвержены большим механическим усилиям, например в эпителиальных и мышечных тканях, включая миокард. Механическая прочность десмосомального контакта во многом зависит от плотного взаимодействия компонентов десмосом с промежуточными филаментами цитоскелета клетки.

Термин «десмосома» (пятно сцепления, macula adherens) применяют исключительно к четко обособленным сайтам адгезии, имеющих вид узелков, к которым присоединяются промежуточные филаменты. Эти филаменты состоят преимущественно из кератинов, виментина и десмина. Белки адгезии, входящие в состав десмосом, относятся к группе десмосомальных кадгеринов и представлены двумя типами белков - десмоглеинами и десмоколлинами. В то же время, другие, морфологически схожие адгезионные соединения, носят название опоясывающих десмосом (поясок сцепления, zonulae adhaerentes). Общее их название — адгезионные или промежуточные контакты. Их ключевое отличие от десмосом в том, что они связаны с тонкими филаментами цитоскелета клетки, которые состоят из актина. В качестве белков адгезии в опоясывающих десмосомах выступают классические (или по-другому -1 тип, Nollet et al., 2000) E-, P-, N-, С-кадгерины (Holthöfer В. et al., 2007).

Все десмосомы имеют ряд общих морфологических признаков (рис.2). Прилегающие друг к другу плазматические мембраны разделены четко видимой щелью шириной от 22 до 50 нм (позвоночные). Это межклеточное пространство, проницаемое для воды и ионов, заполнено электронно-плотным материалом, десмоглеей. В зрелых десмосомах в межмембранном пространстве можно различить отдельные слои, так называемую срединную линию (midline), что является структурой, характерной только для десмосомы. Часто между срединной линией и плазматической мембраной различимы перекрестные связи, между которыми видны уплотнения, отстоящие друг от друга на 7-8 нм. Это особенно видно после инфильтрации в десмосомы ионов тяжелых металлов, например лантана (Kelly, 1966; Rayns et al., 1969).

Десмоплакин шлакоглобин 6 iii.iik.ai^ilLiiiiiii*^«^

-Промежуточные филаменты "]- Внутренняя компактная бляшка

П- Внешняя компактная бляшка Плазматическая мембрана

Десмоглеин Десмоколлин аат"! |*Ж/]еточная зона

ШШ1Я

Рис.2. Схематическое строение десмосомы. Показаны основные морфологические структуры, выделяемые на электронных микрофото1 рафиях, и основные белки, которые их образуют (По данным North et al., 1999).

Очевидно, что межклеточный контакт обеспечивается взаимодействием внеклеточных участков адгезионных белков. Электронная томография высокого разрешения показала переплетенные и преимущественно изогнутые перекрестные структуры (Не et al., 2003). В то же время микрофотографии прижизненно зафиксированных десмосом показывают прямые зигзагообразные нитевидные структуры с периодом в 5 нм (Al-Amoudi et al., 2004. 2005). На электронных микрофотографиях можно выделить также такие структуры, как наружную компактную бляшку (ODP - outer dense plaque), прилегающую непосредственно к мембране, и внутреннюю компактную бляшку (1DP - inner dense plaque), менее плотную и переходящую без резких границ в цитоплазму (рис.1). Форма бляшек, так же как и десмосом - овальная или дискообразная. Диаметр бляшек варьирует в среднем от 0,2 мкм до 0,5 мкм, но может быть и больше - до нескольких микрометров. Ширина каждой бляшки 15-20 нм, а расстояние между ними варьирует от 10 до 20 нм. От внутренней бляшки отходят промежуточные филаменты, которые заходят вглубь электронно-плотного материала в виде петлеобразных структур.

Размер и морфология десмосом могут изменяться в зависимости or типа ткани и определенной ситуации. Маленькие десмосомы и те. которые не имеют срединной линии и четко выраженной морфологии бляшек, обычно называют незрелыми, формирующимися, десмосомами. В частности, такие десмосомы обнаружены на ранних стадиях эмбриогенеза и in vitro при наблюдениях за сборкой десмосом. Рост десмосом может происходить за счет слияние таких предшественников (Gloushankova et al., 2003; Windoffer et al., 2002). Большие десмосомы обычно присутствуют в тех тканях, которые подвержены большим механическим нагрузкам — миокард, эпителий.

В эпидермисе, при дифференциации клеток, происходит изменение морфологии десмосом с образованием так называемых переходных десмосом, которые в дальнейшем образуют корнеодесмосомы в ороговевших слоях эпидермиса (А1-АтоисИ е1 а1., 2005). В ряде случаев (ранения, опухолевые клетки, редко — здоровые клетки) в цитоплазме кератиноцитов можно выявить целые части десмосом. Физиологическое значение этих фрагментов не понятно, однако такие данные говорят о том, что эпителиальные клетки способны осуществлять эндоцитоз больших участков межклеточных контактов, включая нефрагментированные половинки десмосом. Также в эпителии имеются адгезионные структуры, называемые полудесмосомами. С их помощью осуществляется контакт кератиноцитов базального слоя с внеклеточным матриксом базальной мембраны. Полудесмосомы морфологически и функционально сходны с обычными десмосомами, однако имеют другой тип организации и образованы другими белками, несмотря на то, что заякоривание происходит с помощью промежуточных (кератиновых) филаментов.

Молекулярная архитектура десмосом

Десмосомы образуются за счет тесного взаимодействия ряда белков. Это трапемембранные десмосомальные кадгерины и компоненты цитоплазматических бляшек. К трансмембранным белкам относятся десмоглеины и десмоколлины. Они выполняют двойную функцию - непосредственно принимают участие в адгезии и, в то же время, являются важной частью цитоплазматических бляшек. Цитоплазматические белки обеспечивают взаимодействие десмосом с промежуточными филаментами, а также помогают в кластеризации десмосомальных кадгеринов. Различают два типа белков -компонентов бляшек. Один тип молекул имеет в своем составе часто повторяющийся элемент, так называемый я7*т-мотив, и выполняет различные функции во многих клеточных компартментах. В эту группу входят плакоглобин и несколько изоформ плакофиллина (плакофиллин 1-3). Другой тип молекул представлен плакинами - белками, которые непосредственно связаны с цитоскелетом клетки (промежуточными филаментами). Главный представитель этого типа белков в десмосомах - десмоплакин. Основные белковые компоненты десмосом и их взаимное расположение представлены на рис.3. Для понимания всей сложности адгезионных взаимодействий необходимо принимать во внимание, что эти белки

Места связывания ионов кальция организованы в трехмерном пространстве, они постоянно замещаются друг другом, что существует конкуренция между различными белками за одни и те же участки посадки, и, наконец, все эти взаимодействия могут по-разному регулироваться.

Компактные бляшки Внутренняя мемирана

I Л Ж т т ят|

Десмоплзкин Плакоглобин Плакофилииы филаменты

Адгезионные участки кадгеринов

Десмоглеин Десмоколлин

Рис.3. Молекулярное строение десмосомы. Локализация компонентов бляшек по данным иммуноэлектронной микроскопии North et al., 1999. Расположение десмосомальных кадгеринов (десмоглеин и десмоколлин) показано в соответствии с данными о гетерофильном взаимодействии этих белков, которое зависит от концентрации ионов Са2+. Внеклеточная часть белков образована пятью доменами (ЭД1-5). В адгезии принимает участие первый домен (N-концевой), к плазматической мембране примыкает пятый домен.

Десмосомальные кадгерины

Непосредственньш контакт в десмосомах происходит за счет взаимодействия двух типов белков кадгеринового семейства - десмоглеинов (Дсг) и десмоколлинов (Дек) (рис.2). В соответствии с общепринятой номенклатурой (Buxton et al., 1993) гены, кодирующие изоформы десмоглеина (Дсг) имеют название dsgj, dsg2, dsg3, dsg4, a для десмоколлинов (Дек) - dscl, dsc2, dsc3. Последние присутствуют в виде белков двух форм «а» и «б», возникающих в результате альтернативного сплайсинга мРНК в районе цитоплазматического участка белка (Collins et al., 1996). Синтез и соотношение различных форм десмосомальных кадгеринов определяется типом ткани, а также стадией дифференцировки клеток (King et al., 1997). Различные изоформы белка могут присутствовать в одной десмосоме (North et al., 1996, Nuber et al., 1996), что говорит о том, что десмосомы являются динамическими структурами.

Гены десмосомальных кадгеринов расположены друг за другом и локализуются в длинном плече 18 хромосомы человека. Гены десмоглеинов и десмоколлинов транскрибируются в противоположных направлениях. Очень похожая организация этих генов наблюдается и у мыши, также находящихся в 18 хромосоме (рис.4). У мыши имеются два дополнительных гена десмоглеина, которые произошли, очевидно, в результате дупликации гена dsgJ, но, тем не менее, отличаются от него (Whittock and Bower, 2003). В целом можно сказать, что разные изоформы десмосомальных кадгеринов произошли в результате дупликации и последующей дивергентной эволюции генов-предшественников.

Центромера go Теломер

Человек 18q 12.1 dsc3 dsc2 dscl dsgl dsg4 dsg3 dsg2

Рис.4. Схема организации генов десмосомальных кадгеринов мыши и человека.

Следует отметить сходство в локализации генов у двух организмов, противоположные направления транскрипции генов и два дополнительных гена, родственно связанных с dsgl у мыши. Dsg]fi иногда называют а dsgly - как dsg6.

По данным филогенетического анализа в суперсемействе кадгеринов выделяют 6 групп генов. Это - классические, или иначе, тип I кадгерины. Их представителями являются Е-, Р-, С-кадгерины. Вторая группа это - не классические, или тип II кадгерины (М-са(Шегш, Вг-саЙЬеггп, Т2-са(Шегш, ОВ-сасИгепп). Есть также большое число генов, которые относят к протокадгеринам, а также группа так называемых флшшнго-кадгеринов (N01161 е! а1., 2000). Десмоглеины и десмоколлины образуют еще две группы, при этом они довольно сильно отличаются друг от друга. Анализ аминокислотных последовательностей десмосомальных кадгеринов между различными видами млекопитающих, показывает консервативность каждой из групп. Они обособлены как от классических кадгеринов, так и от кадгеринов II типа. У разных видов млекопитающих гомология изоформ десмоколлина составляет 73-83%, сходная идентичность в аминокислотной последовательности наблюдается и для десмогленнов. Особенно консервативными являются первые два Ы-концевых домена, что хорошо согласуется с данными об их роли в адгезионных взаимодействиях. В то же время, для одного вида гомология между изоформами десмоглеина и десмоколлина составляет лишь 51-55%. Интересно также, что если сравнивать только первые два ТМ-концевых домена, то десмосомальные кадгерины (особенно десмоколлины) более близки к классическим кадгеринам, чем кадгерины второго типа (Nollet et al., 2000).

В структуре десмосомальных кадгеринов можно выделить внеклеточную часть, состоящую из пяти доменов (ЭД1-5), рис.2. Подобную организацию удалось выявить благодаря нескольким работам по кристаллизации классических кадгеринов (Shapiro ct al., 1995; Overduin et al., 1995; Boggon et al., 2002) и трех кадгеринов II типа (Patel et al., 2006). В результате было показано, что, несмотря на довольно большие различия в аминокислотной последовательности, эти белки имеют несколько доменов во внеклеточной части, и эти домены имеют одинаковый тип строения. Каждый домен образован 7 р-тяжами, формирующими бочкообразную структуру. Домены разделены неструктурированными линкерными участками, которые принимают участие в связывании трех ионов Са2+ каждый. Также имеются данные ЯМР анализа первого домена десмоглеина 2 человека, которые подтверждают такое же строение внеклеточных доменов и у десмосомальных кадгеринов (Sano et al., 2007).

Адгезионные взаимодействия между десмосомальными кадгеринами

Несмотря на большой интерес и соответствующее число работ в этой области, механизм установления, поддержания и регулирования адгезии в десмосоме во многих деталях остается неясным. К настоящему времени известно, что в десмосомах, в отличие от других адгезионных контактов, принимают участие только два типа белков - десмоглеины и десмоколлины. Механизм адгезионных взаимодействий этих белков является неясным и противоречивым. Проблема усложняется тем, что н десмоглеины, и десмоколлины представлены в виде нескольких генетических изоформ, для каждой из которых имеется отдельный ген и есть различия в аминокислотной последовательности. Гораздо более изученным является адгезионные контакты, в которых принимают участие классические кадгерины (Е-, N-, С-, Р-кадгерины). В частности, имеется много данных кристаллографического анализа и предложены способы образования адгезионных структур для этих белков. С учетом большой степени гомологии (до 60%) между классическими и десмосомальными кадгеринами, а также одинаковым строением внеклеточной части, вполне вероятно, что образование адгезионных структур с участием десмоглеинов и десмоколлинов происходит по тем же механизмам.

Механизм образования днмеров по типу «якорь-карман»

Первые работы по кристаллизации различных фрагментов классических кадгеринов были выполнены в 1995-1996. Shapiro L. с коллегами получили кристаллы N-концсвого домена мышиного N-кадгерина, продуцированного в виде слитого белка с глутатион-8-трансферазой в E.coli. У этого белка были два дополнительных аминокислотных остатка на N-конце - Glnl-Ser2, а также использовались ионы Yb3+ в качестве заменителей ионов Са2+. Участок связывания ионов Са2+ был неполным. В 1996 году Nagar В. с коллегами получили кристаллы двух дистальных доменов мышиного Е-кадгерина, продуцированного в E.coli. По результатам этих исследований было окончательно установлено топологическое строение внеклеточной части классических кадгеринов, которое оказалась общим для всех белков этого семейства. Одновременно, были сделаны попытки определить участки и аминокислоты, вовлеченные в адгезионные взаимодействия. Однако, данные для двух белков, несмотря на общность строения, оказались весьма отличающимися. Тем не менее, одна из предложенных Shapiro L. с коллегами модель для описания взаимодействия между двумя N-концевыми доменами N-кадгерина, получившая название «якорь-карман», получила подтверждение в других работах (Haussinger et al., 2002; Boggon et al., 2002). В настоящее время этот механизм считается одним из основных при образовании адгезионных структур между молекулами кадгеринов. Эта модель заключается в следующем. У большого числа белков, входящих в семейство кадгеринов, в том числе у десмоглеинов и десмоколлинов, имеется очень консервативный остаток Тгр2 во втором положении (Nollet at al., 2000). Замена или удаление этого триптофана приводит к полной потере адгезии между клетками (Chitaev and Troyanovsky, 1998; Tamura et al., 1998; Laur et al., 2002). Образование димера происходит при взаимном обмене N-концевой части (1-7 ак) двух молекул и встраивании остатков триптофана в гидрофобный карман первого домена соседней молекулы. Интересно, что такой обмен наблюдается во многих структурах и разных исследованиях (Haussinger et al., 2002; Boggon et al., 2002). При этом возможно образование димеров как в с is положении (in vivo соответствует ситуации, когда димер образуют соседние молекулы на поверхности одной клетки, неадгезионные взаимодействия), так и в trans положении (ш vivo соответствует ситуации, когда димер образуют молекулы, отходящие от соседних клеток, образуется адгезионная единица). По данным Shapiro et al., 1995, размер первого домена составляют 45x25x25 Л. Гидрофобный «карман», куда встраивается индольная группа Тгр2, образован алифатическими группами 11е92,11е24, А1а78, А1а80, Туг36, Glu89. Одна из последних работ в этой области (Parisini et ai., 2007) позволила уточнить механизм образования димера. Так, при сравнении структуры двух доменов Е-кадгерина человека с ранее полученными структурами N-кадгерина и С-кадгерина было показано, что имеются ряд консервативных взаимодействий между консервативными аминокислотами, которые и обеспечивают образование димера путем обмена и заякорнвания N-концевой части двух молекул. Дополнения, которые внесла группа Emilio Parisini, заключаются в следующем: (а) имеется солевой мостик между ЫН3+-группой N-концевого остатка AsplA одной молекулы и карбоксильной группой Glu89r' другой молекулы; (б) имеется водородная связь между NH-группой основной цепи остатка Val3A и СО-группой Lys25b другой молекулы; (в) есть водородная связь между NeH в индольном кольце Тгр2А и карбонильной группой Asp90B другой молекулы, (рис. 5а).

Рис.5, (А) Подробная структура взаимодействия между 1Ч-концевой частью молекулы А (фиолетовая) с гидрофобным карманом молекулы Б (зеленая) Е-кадгерина человека. Прерывистыми линиями показаны солевой мостик между атомом азота Аэр1 молекулы А и карбоксильной группой в1и89 молекулы Б, и водородная связь между №Н Тгр2д и карбоксильной группой Азр90Е. В левом верхнем углу показаны стэкинг ориентация алифатических участков остатков Тгр2д, Азр90Б, Ме192Б, которая также стабилизирует эти взаимодействия. (Б) Образование адгезионного «якоря» в димере Е-кадгерина. Показаны две молекулы воды, стабилизирующие положение остатка Пе4 за счет образования Н-связей с аминокислотами С1и93 и Ьеи95 той же молекулы. Два остатка пролина Р5 и Р6, способствуют переходу Тгр2 из «закрытого» в «открытое», адгезионное положение. Показана одна из молекул димера. (По данным Ранв^т е1 а!., 2007).

В работе Haussinger D. и коллег 2004 года детально исследован механизм образования димера мышиного Е-кадгерина в растворе при протеолитическом процессннге незрелой формы Е-кадгерина. У десмоглеинов и десмоколлинов также есть N-концевая последовательность, которая отрезается в аппарате /гаш-Гольджи. Эта последовательность отличается по длине у разных белков, однако сайт, распознаваемый эндопептидазой, консервативный и представляет собой последовательность R-Xi-K-R—X2-W-. Зрелый белок (X2-W-) загем транспортируется к плазматической мембране (Ozawa and Kemler, 1990а). Примечательно, что если на N-конец молекулы добавить даже один лишний аминокислотный отстаток, то кадгерины полностью утрачивают адгезионные свойства (Ozawa and Kemler, 1990; Ozawa, 2002). При процессипге в первом домене происходят некоторые конформационные перестройки. В случае низкой концентрации молекул белка (0,5 мМ), происходит переход N-концевых аминокислотных остатков из высокоподвижного состояния в фиксированное, в котором Тгр2 погружен в гидрофобный карман первого домена той же молекулы. Таким образом, при низкой концентрации белка образуется «закрытая» форма молекулы кадгерина. Этот процесс не зависит от концентрации ионов кальция, и более того наблюдается при рефолдинге белка после удаления из раствора мочевины. При увеличении концентрации белка наблюдается хорошо заметный по данным ЯМР переход от мономерной формы к гомодимерам молекулы Е-кадгерина (Haussinger et al., 2004). Реакция образования димеров сильно затруднена наличием активационного барьера порядка 7ккал/моль. Наличие активационного барьера объясняется тем, что во время обмена N-концевыми участками происходит образование и разрыв многих водородных связей, в том числе между молекулами воды и гидрофобной поверхностью «кармана». Образование димеров сильно зависит от концентрации

О! П I ионов Са . В присутствии ионов Са KD димерпзации составляет 0,72 мМ, а если ионов нет, то аффинность мономерных форм резко снижается, наблюдается ряд переходных форм мономеров, а значение KD достигает 10 мМ. Таким образом, ионы Са сильно сдвигают равновесие в сторону образования димеров и обеспечивают стабилизацию мономерных форм в определенной конформацип. Стабилизация связана с тем, что при связывании ионов Са фиксируется положение остатка Glul 1, который, в свою очередь, фиксирует определенное положение РА-тяжа в пространственной структуре первого домена, что, очевидно, способствует процессу димеризации двух молекул (Haussinger et al., 2004). Следует отметить, что кальций критически необходим для установления адгезии между клетками (Ozawa et al., 1990b; Chitaev et al., 1998). При мутациях в участках связывания или отсутствии ионов кальция в среде, клетки теряют способность к адгезии.

При высокой концентрации молекул белка и в присутствии ионов Са2+ наблюдается динамическое равновесие между мономерами и димерами кадгерина. Это было показано не только в исследованиях ЯМР спектров при образовании зрелой формы Е-кадгерина, но и в работе по изучению роли солевого мостика между AsplA-NH3 одной молекулы и карбоксильной группы Glu89B другой молекулы (рис.5а) (Harrison et al., 2005). Замена Glu89Ala или добавление на N-конец двух остатков глицина приводит к нарушению образования солевого мостика и ослабляет адгезию в клетках. В то же время, когда эти замены присутствуют в разных молекулах, то адгезия увеличивается по сравнению с природными молекулами. Этот факт авторы объясняют тем, что в каждой из мутантных молекул затруднено встраивание Тгр2 в собственный гидрофобный «карман», так как нарушено образование солевого мостика. В результате снижается активационный барьер перехода из «закрытого» в «открытое» состояние, что приводит к предпочтительному образованию димеров и усилению адгезии. Схожий механизм, облегчающий выход остатка триптофана из «кармана» собственной молекулы, есть, очевидно, и у кадгеринов с нативной последовательностью. Показано, что первые семь аминокислотных остатков (Asp-Trp-Val-Ile-Pro-Pro-Ile), образующих «якорь» являются консервативными в кадгеринах I типа (Nollet et al., 2000). При образовании димеров Е-кадгерина, как это показано в работе ,Parisini и коллег (2007), полноценный Р~слой за счет водородных связей между атомами рА и PG тяжей заканчивается на карбоксильной группе 11е7. Примыкающий к N-концу Ile7, Рго5-Рго6 консервативный мотив, выводит шесть N-концевых остатков из плоскости первого домена (рис.5б). При сравнении «закрытой» и «открытой» конформации N-концевого участка в мономерной и димерной формах Е-кадгерина, заметно, что в обоих случаях Рго5-Рго6 мотив выступает из плоскости первого домена (Parisini et al., 2007). Однако, в случае «закрытой» конформации Рго5 угол поворота Ф равен - 86°, что выходит за границы энергетически выгодных -55°.-75° (Morris et al., 1992). Очевидно, что в данном случае пролин находится в напряженном» состоянии. В то же время, в димерной форме, угол поворота Ф для Рго5 равен - 58°, что находится в энергетически выгодной области значений. Кроме того, в «закрытой» форме остаток Тгр2 также находится в энергетически невыгодной конформации (Ф= -124° и 1Р=2°). Таким образом, наличие мотива, состоящего из двух остатков пролина, вносит конформацпонные напряжения в «закрытой» форме молекулы Е-кадгерина. Снятие конформационных напряжений происходит при выпячивании адгезионного «якоря» из плоскости молекулы, что, в свою очередь, облегчает образование димеров (РапБин е! а1., 2007). Следует отметить, что пролин-индуцированнын обмен участками полипептидной цепи между субъединицами играет ключевую роль при образовании четвертичной структуры белка (Ве^с1о11 е1 а1., 1997).

Таким образом, образование димеров в случае классических кадгеринов скорее всего происходит по следующему механизму. При удалении Ы-концевого пропептида в аппарате /г<ту-Гольджи, молекула кадгерина переходит в метастабильное состояние. В этом состоянии существует равновесие между «закрытой» и «открытой» конформацией Ы-концевого участка молекулы. При сближении двух молекул в какой-то момент происходит взаимный обмен Ы-концевыми участками, во время которого происходит замена водородных связей, характерных для «закрытой» конформации, на водородные связи, стабилизирующие димерную (адгезионную) конформацию. При образовании димера снимается напряженность, вызванная наличием Рго5-Рго6 мотива. Важно отметить, что в обоих случаях в образовании связей принимают участие одинаковые аминокислотные остатки. Так, очень важный солевой мостик между А8р1->Ш3+ и карбоксилом 01и89, Н-связи между Уа13 и Ьуз25, а также Тгр2 и АБр90, присутствуют и в «закрытой» и в «адгезионной» конформации. Однако, при образовании димера могут возникать и ряд дополнительных связей. Количество и тип аминокислотных остатков, формирующих связи, зависит от взаимной ориентации двух молекул, расстояния, на которое они сближаются и ряда других факторов. Следует отметить, что при образовании димера, появляются две молекулы воды, стабилизирующие положение остатка 11е4 за счет образования Н-связей с аминокислотами 01и93 и Ьеи95 той же молекулы (рис.5 б). В целом же можно сказать, что образование димеров является более энергетически выгодным процессом, чем существование мономера в «закрытой» конформации (РапзЫ е1 а1., 2007).

Cis- и trans- димеры - функциональная роль и механизм формирования

Как было сказано выше, молекулы кадгеринов способны к образованию днмеров. Однако, только trans-димеры (т.е. димеры, образованные молекулами двух соседних клеток) будут обеспечивать межклеточную адгезию. В то же время, димеры могут образовать и молекулы одной клетки, расположенные по соседству (cis-димеры). В этом случае они не обеспечивают адгезию. В ряде работ были детально исследованы оба типа димеров, и показано, что в процессе установления межклеточных контактов они играют одинаково важную роль. Впервые данные об образовании димеров были получены в 1995 году (Shapiro et al.,1995), при кристаллизации первого домена N-кадгерина мыши. Несмотря на присутствие двух лишних аминокислотных остатков на N-конце (Glyl-Ser2), было показано, что остаток триптофана встраивается в гидрофобный карман соседней молекулы (PDB код: INCH). Этот факт можно объяснить отсутствием полноценных участков для связывания ионов кальция, так как был закристаллизован только первый домен N-кадгерина. В последующих работах (Nagar et al.,1996; Pertz et al., 1999) no кристаллизации двух доменов Е-кадгерина, сайты связывания кальция присутствовали, что приводило к димеризации молекул только в области этих участков. В то же время на N-конце были «лишние» аминокислотные остатки, и в этом случае боковая группа триптофана не участвовала в образовании димера. Тем не менее, на основании этих данных, а также ряда других работ (Brieher et al.,1996; Koch et al.,1997; Yap et al., 1997), был сделан вывод о важности функционирования кадгеринов при адгезии в виде димеров или даже мультимерпых комплексов. В 1998 году Сергей Трояновский с коллегами показали, что при установлении межклеточной адгезии (линия А431, Е-кадгерин) существуют два типа димеров -латеральные (см-димеры) и адгезионные (/raw-димеры), которые представляют собой разные этапы образования адгезионных контактов между клетками (Chitaev and Troyanovsky, 1998). Два типа димеров обладают рядом характерных особенностей. Так, образование латеральных димеров не зависит от взаимодействия молекул Е-кадгерина с цитоплазматическими белками (а-,(3-, у- катенинами, белком р120 и актиновыми филаментами) и происходит даже в отсутствии ионов кальция. Латеральные димеры образуются также при отсутствии любых межклеточных контактов. Таким образом, цитоплазматические факторы, очевидно, не регулируют образование димеров, и этот процесс обусловлен только структурой внеклеточной части молекул кадгеринов. В то же время, для образования адгезионных димеров необходимо определенная концентрация Са (не менее 0,15мМ) и взаимодействие с цитоплазматическими белками. Мутации аминокислот, участвующих в связывании ионов кальция (мотивы DXND/E в DXAA или XDRE в XARA), приводят к полной потере межклеточной адгезии и исчезновению адгезионных димеров, в то же время латеральные димеры образуются нормально (Klingelhofer et al., 2002). Адгезионные димеры довольно стабильны в растворе, они не разрушаются при уменьшении

04концентрации Са , однако инкубация клеток при +37°С в среде с EGTA (ЮмМ) в течение 15 минут приводит к потере адгезии между клетками и полному исчезновению trans-димеров. При этом увеличивается количество латеральных димеров. И, наоборот, при увеличении концентрации ионов кальция до нормальной (1-1,5 мМ) происходит восстановление адгезионных димеров примерно за то же время — 15 минут. Очевидно, что в данном случае происходит переход одного типа димеров в другой и этот переход зависит от ионов кальция. В норме количество адгезионных димеров превосходит количество латеральных димеров. При этом время жизни вновь образованного димера очень небольшое, так как имеются данные по очень быстрому обмену мономерных и димерных форм Е-кадгерина. Так метка [35S]Met/Cys детектируется в адгезионных димерах спустя 20 минут после добавления в среду, где выращиваются клетки (Klingelhofer et al., 2002). Важно, что образование обоих типов димеров зависит от остатков триптофана и валина (Trp2, Val3), которые принимают участие в образовании димера по механизму «якорь-карман». При замене Trp2Ala/Val3Gly hii один из типов димеров не образуется, что говорит о схожести механизма, по которому происходит димеризация двух молекул. Следует отметить, что по данным С. Трояновского и Н. Читаева, относительно небольшое число молекул кадгерина принимает участие в образовании димеров (Chitaev and Troyanovsky, 1998). Это может быть связано с особенностями методики выделения димеров, в частности их нестабильностью при экстракции неионными детергентами. В то же время, это может быть одним из механизмов, с помощью которого клетка контролирует количество и силу адгезионных контактов. Несмотря на то, что образование латеральных димеров может происходить и без участия цитоплазматических белков, в интактных клетках эти взаимодействия сеть, следовательно, есть возможность для регуляции количества латеральных и адгезионных димеров.

В другой работе (Ozawa, 2002) эти данные были подтверждены. В то же время было показано, что число латеральных димеров может быть значительным и большая часть белковых молекул может находиться в виде латеральных димеров. Также было показано, что в случае коэкспрессии обычных молекул белка Е-кадгерина и имеющих замену Тгр2А1а, не образуется димеров, состоящих из этих молекул. Таким образом, при образовании димеров необходимо, чтобы встраивание остатков триптофана произошло взаимодновременно у двух молекул. В противном случае, димер или не образуется, или возникающая связь не обеспечивает стабильного контакта. Присутствие в среде ионов кальция не способствовало образованию димеров из мутантых Тгр2А1а молекул, что противоречит данным Nagar et al., 1996 и Pertz et al.,1999. Они показали, что образование димеров возможно также за счет сайтов, связываю щих

Са . В то же время в работе (Corps et al., 2001) было показано, что внеклеточный домен Е-кадгерина, имеющий дополнительные аминокислоты Metl/Asp2/Leu3 и слитый с Fc фрагментом IgG, образует димеры в растворе только в присутствии ионов кальция. Добавление трех аминокислот на N-конец молекул препятствует образованию димера за счет заякоривания триптофана. Позднее, в работе С. Трояновского и соавторов (Troyanovsky et al., 2003) с помощью нового подхода было непосредственно показано образование обоих типов димеров по механизму «якорь-карман». В этой работе использовалось сшивающие соединение длиной 15А. Образование сшивки между двумя молекулами происходит тогда, когда расстояние между боковыми группами определенных аминокислот около 15А. Образование ковалентно соединенных молекул Е-кадгерииа происходило в тех случаях, когда сшивались аминокислоты, чья взаимная ориентация соответствовала образованию димера по механизму «якорь-карман». Были также проверены альтернативные гипотезы образования димеров. Было показано, в частности, что остатки Thr45, Thr75, Phe77 не участвуют во взаимодействие друг с другом, как это следует из данных группы Shapiro et al., 1995. Также была проверена возможность образования димеров за счет участков связывания ионов Са2+, как это следует из работ Nagar et al., 1996 и Pertz et al., 1999. При таком способе образования димеров ряд аминокислотных остатков (Gin 192, Glul99) приближены друг к другу на расстояние около 15 Á, что достаточно для образования ковалентной сшивки между ними. Однако, в данной работе не удалось показать сшивание этих аминокислот друг с другом.

Таким образом, димеризация молекул кадгеринов при их экспрессии в клетках происходит по механизму «якорь-карман». Взаимодействие двух молекул в области связывания Са2+, является, очевидно, промежуточным этапом при образовании димеров, и не может обеспечивать образование стабильных адгезионных димеров. В то же время ионы кальция критически важны для образования адгезионных димеров и поддержания межклеточной адгезии. Определенную роль в димеризацпн молекул кадгерина in vivo могут играть трансмембранные домены, обогащенные остатками лейцина. В работе Huber et al., 1999 было показано, что трансмембранпые домены Е-кадгерина способны к ассоциации по типу «лейциновых молний». Мутации в ключевых позициях в трансмембранном домене нарушают ассоциацию трансмембранных доменов, что уменьшает адгезию клеток по сравнению с контрольной линией. В то же время Ozawa М. (Ozawa et al., 2002) с коллегами показали, что замена трансмембранного домена Е-кадгерина на похожий трансмембранный домен молекулы CD45 не влияет на образование димеров. Очевидно, важно наличие самого трансмембранного домена определенной структуры. Стабильность димеров после обработки детергентами, разрушающими мембрану, говорит о том, что, очевидно, трансмембранные участки участвуют только при образовании димеров, но не влияют па их стабильность после образования.

Специфичность адгезии, опосредованной кадгерннами

Как было сказано выше, в суперссмейсгво кадгеринов входит более 50 известных белков, которые можно разделить на шесть групп (Nollet et al., 2000). В пределах одной группы белки обладают высокой степенью гомологии и сходством в строении. Вместе с тем давно и во многих работах было показано, что адгезия опосредованная кадгеринами и, в частности, классическими кадгерннами. является селективной и высокоспецифичной. Специфичность межклеточной адгезии является фундаментальным механизмом для разделения разных типов клеток при морфогенезе разных тканей (Townes and Holtfreter, 1955). В настоящее время мы знаем многое про механизмы такой специфичности у классических кадгеринов, однако некоторые подробности остаются все еще неизвестными. Данных по механизмам специфичности адгезии опосредованной десмосомальными кадгеринами еще меньше и они часто противоречат друг другу. Поэтому объяснить механизмы адгезии и их нарушение в случае с десмосомальными кадгеринами, невозможно без данных, полученных для классических кадгеринов.

Одной из важных работ по определению механизмов специфичности адгезии, были работы Akiano Nose и коллег (Nose et al.,1988, 1990). Они показали, что клетки линии L, не синтезирующие ни один из типов кадгеринов, могут экспрессировагь функциональные молекулы кадгеринов при трансфекции кДНК соответствующего белка. При этом трансфецированные клетки обладали способностью селективно устанавливать адгезию с клетками, экспрессирующими тот же самый тип кадгерина. Клетки исходной линии L без кадгеринов не обладали способностью к адгезии ни с одной из трансфецированнных клеточных линий (Nose et al.,1988). Экспрессия химерных молекул Е- и Р-кадгеринов показала, что за специфичность а/ц^езии отвечает первый внеклеточный домен и, в частности, участок 78-83 аминокислоты. Замена аминокислот 78 и 83 влияла на специфичность адгезии (Nose et al., 1990), хотя и не изменяла ее полностью. Авторы сделали вывод, что участок 78-83 важен для специфичности адгезии, но полностью ее определяют несколько участков в первом домене. В том же 1990 году появилась работа другой группы авторов, которые показали, что декапептид LRAHAVDVNG (76-85 ак) из первого домена N-кадгерина способен ингибировать компактизацию эмбриона мыши и рост аксона поверх клеток астроцитов (Blaschuk et al., 1990а). Важно, что такой способностью не обладал другой пептид VI1PPINLPEN (3-12 ак) также из N-кадгерина. Ранее той же группой авторов было показано, что участок HAV (79-81 ак), консервативный для всех классических кадгеринов, имеет выраженную гомологию с N-концевым участком цепи НА1 гемагглютинина вируса гриппа A (Blaschuk et al., 1990b). В гемагглютинине HAV-содержащие участки обеспечивают стабилизацию между НА1 и НА2 гемагглютинина. Мутации в этих участках приводят к изменению конформации белка и снижению способности связываться с клетками. Участок, содержащий HAV, получил название «участка, определяющего адгезию клеток» (CAR-site, cell adhesion recognition site). Спустя некоторое время появились работы, которые подтвердили способность пептидов, содержащих HAV-мотив (Doherty et al., 1991; Mcge et al.,

1992), и антител к этому участку (Alexander et al., 1993; Newton et al., 1993) ингибировать кадгерин-зависимые биологические процессы. В 1995 году была получена трехмерная структура первого домена N-кадгерина (Shapiro et al., 1995), из которой следовало, что CAR-сайт, содержащий HAV, входит в область взаимодействия первого домена N-кадгерина с соседней молекулой. Однако, кристаллографические исследования других кадгеринов не подтвердили наличия данной области контакта (Pertz et al., 1999; Boggon et al., 2002; Parisini et al., 2007). Более того, все попытки непосредственно показать адгезионный контакт в области HAV-мотива в нативных условиях не увенчались успехом. Так, в 2002 Oscar Laur с коллегами показали, что замена всех четырех аминокислот в участке H79V81S83N84 на аланин не влияет ни на локализацию, ни на адгезионную способность Е-кадгернпа (Laur et al., 2002). Также они показали, что эпитоп моноклонального антитела SHE78

70

7, блокирующего адгезию за счет Е-кадгерина, включает в себя His - одну из аминокислот HAV-мотива. При этом антитела способны были связываться с молекулами Е-кадгерина как на поверхности клеток, так и с адгезионными димерами при иммунопреципитации. Эти данные говорят о том, что при образовании адгезионных взаимодействий, опосредованных классическими кадгеринами, HAV-мотив не принимает непосредственной участии в белок-белковых взаимодействиях, так как в противном случае он был бы экранирован от взаимодействий с антителом SHE78-7. В 2003 году та же группа исследователей, используя совершенно другой подход, не смогла показать белок-белковых взаимодействии в области HAV-мотива (Troyanovsky et al., 2003). На сегодняшний день механизм действия пептидов, происходящих из CAR-сайтов, остается непонятным. Можно лишь сказать, что за специфичность адгезии отвечает этот участок в целом, и особенно аминокислоты, фланкирующие HAV-могив с обеих сторон. Интересно, что кольцевые структуры на основе HAV-мотива оказываются в целом более эффективны по своим биологическим эффектам, чем линейные пептиды (Williams et al., 2000). Однако, никаких закономерностей, позволяющих понять, каков механизм действия этих пептидов выявлено не было.

Классические кадгерины осуществляют взаимодействия почти всегда по типу гомоадгезии, то есть в местах межклеточных контактов находится только один тип кадгеринов, и в этом заключается возможность сортировки клеток разных типов в ходе образования различных тканей. Однако, некоторые виды кадгеринов способны к образованию гетеродимеров. Так, например, показано, что R- и N-кадгерины формируют функциональные гетеро- и гомодимеры (Shan et al., 2000). В нейронах

ЦНС наблюдается колокализация этих кадгеринов в местах адгезии, однако биологичекая роль такой колокализация неясна (Redies, 1997). В то же время Екадгерин не может образовывать гетеродимеры ни с N-, ни с R-кадгерином.

Интересно, что CAR-сайты R- и N-кадгеринов очень похожи, отличается всего одна аминокислота из 12, входящих в состав CAR-сайта (Рис.6).

75 HLRAHAVDING 85 - N- кадгерин человека 75 HLRAHAVDMNG 85 - R- кадгерин человека 75 TLFSHAVSSNG 85 - Е-кадгерин человека

75 ALYGYATTADG 85 - десмоколлин 1 человека 75 DLIAYASTADG 85 - десмоколлин 3 человека 75 IIYCRALNSMG 85 - десмоглеин 1 человека 75 LITCRALNAQG 85 - десмоглеин 3 человека

Рнс.б. Участок первого домена кадгеринов, определяющий специфичность адгезии. Большая консервативность данного участка у R- и N-кадгеринов определет возможность образования гетеродимеров молекул. Вместе с тем CAR- сайты десмоглеинов и десмоколлинов сильно отличаются друг от друга

В то же время, для Е-кадгерина различий значительно больше, что, очевидно, и влияет на образование гетеродимеров. Итак, возможность образования гетеродимеров, по всей вероятнояти, определяется консервативностью CAR-сайта, и в частности, аминокислотами, фланкирующими HAV-мотив. Десмоглеин и десмоколлин также имеют консервативный остаток Ala 80, однако аминокислоты вокруг этого остатка очень различаются в Дсг и Дек (рис.6), что позволяет предположить, что данные белки взаимодействует по типу гомоадгезии. Функциональная важность участка 75-85 ак в Дек и Дсг была продемонстрирована в ряде работ. В 1998 году было показано, что неадгезионные клетки линии L929 при котрансфекции Дек 1а, Дек 16, Дсг1 и плакоглобином приобретают способность к адгезии, но не формируют полноценные десмосомы. Инкубация таких клеток с пептидами, соответствующими CAR-сайтам Дсг1 и Дск1 приводила к потере адгезии. Каждый пептид по отдельности блокировал адгезию, добавление двух пептидов одновременно усиливало дезагрегацию клеток. Действие пептидов было специфичным, так как пептид из CAR-сайта Е-кадгерина или измененные пептиды

Дсг1 и Дск1 не влиял на способность к адгезии (Tselepis et al., 1998). Интересные данные о роли CAR-сайтов и различных нзоформ Дсг и Дек были получены в 2001 году. Группой Дэвида Гэррода был исследован морфогенез мышиных клеток молочной железы линии Fsk-7 in vitro (Runswick et al., 2001). Данные клетки экспрессируют Дсг2 и Дск2, формируют десмосомы, и при добавлении соответствующих гормонов образуют сферические структуры с полостью внутри. При добавлении пептидов из CAR-сайтов Дсг2 или Дск2 по отдельности, нарушения морфогенеза не отмечалось. При совместном добавлении пептидов морфогенез полностью нарушался, и клетки теряли способность к образованию межклеточных контактов. Действие пептидов было специфичным и дозозависимым. Также было показано, что различия в изоформах Дсг и Дек может определять морфогенез и пространственную организацию клеток. При совместной инкубации люменальные клетки, экспрессирующие только Дсг2 и Дск2, и миоэпителиальные клетки, экспресспрующие дополнительно ДсгЗ и ДскЗ, образовывали поляризованные кластеры клеток. Миоэпителиальные клетки располагались только снаружи кластера, а люменальные только внутри, что соответствует пространственной организации клеток in vivo. Добавление пептидов из CAR-сайтов ДсгЗ и ДскЗ по отдельности, не влияло на размер агрегатов и позицию клеток. При совместном добавлении пептидов приводило к увеличению числа клеток в агрегате и нарушению пространственного положения миоэпителиальных клеток - 50% из них находились внутри кластера клеток. Исходя из выше изложенного, можно сделать вывод, что существуют некая связь между типом десмосомальных кадгеринов, входящих в состав десмосом и положением клетки в многослойных тканевых структурах, к которым относится и эпидермис кожи. Доминирующую роль в этой специфичности, как и в случае с классическими кадгеринами, играет первый внеклеточный домен и CAR-сайты, локализованные в этом домене.

Адгезионные взаимодействия в десмосоме

В состав десмосом всегда входят два типа белков — десмоглеин и десмоколлин. До сих пор нет точных и убедительных данных о том. как взаимодействуют эти два белка в десмосоме. Способны ли они к образованию гегеродимеров или же образуют только гомодимеры? Какова роль в этих взаимодействиях внутри- и внеклеточной части белков? Следует учитывать, что десмосома - сложная структура и данные по взаимодействию белков, полученные in vitro, могут отличаться от реальных процессов in vivo.

В 1994 группа М. Amagai сравнила адгезионные способности линии клеток L929, трансфецированных Е-кадгерином и ДСГЗ человека (Amagai et al., 1994b). Внутриклеточная часть ДСГЗ была взята от Е-кадгерина. Оказалось, что в отличие от клеток, экспрессировавших Е-кадгерин, клетки с ДСГЗ показали существенно меньшую способность к адгезии. Однако, агрегация клеток была видоспецифичной. Таким образом, внеклеточная часть ДСГЗ обладает способностью к образованию гомодимеров. Правда, неясно по какому механизму происходило образование гомодимеров и зависела ли адгезия от остатка Тгр2. Похожая работа была сделана в 1996 году для ДСК1 (Chidgey et al., 1996). Было показано, что клетки L929, трансфецированнные химерной молекулой ДСЮ/Ecad проявляли адгезионную активность, но значительно более слабую, чем клетки, трансфецированные полноразмерной молекулой Е-кадгерина. Таким образом, можно сделать вывод, что внеклеточные фрагменты десмосомальных кадгеринов могут взаимодействовать по типу гомоадгезии, хотя эти взаимодействия намного слабее, чем у классических кадгеринов. Имеются противоречивые данные по реконструкции адгезии при помощи коэкспрессии молекул Дсг, Дек и плакоглобина в клетках линии L929. В одной из работ было показано, что совместная коэкспрессия молекул Дсг1, Дск2а и плакоглобина не способна обеспечить адгезию между клетками L929 (Koxvalczyk et al., 1996). Однако, в 1998 году появились работы сразу двух групп, в которых сообщалось, что при трансфекции клеток L929 Дсг1, Дск2а и плакоглобина клетки получали способность к слабой Са2+- зависимой адгезии. Было показано, что плакоглобин играет ключевую роль для обеспечения адгезии за счет Дсг и Дек, так как даже совместная экспрессия Дсг и Дек не обеспечивала адгезии в тесте (Marcozzi et al., 1998; Tselepis et al., 1998). Таким образом, можно сделать вывод, что для адгезии в десмосомальном контакте необходимо как минимум три белка — десмоглеин, десмоколлин и плакоглобин, так как только их совместная экспрессия обеспечивает агрегацию клеток в адгезионном тесте. В 2002 году появились данные о взаимодействии двух первых доменов ДСГ2 и ДСК2 в растворе (Syed et al., 2002). Белки были экспрессированы в E.coli, поэтому фолдипг и посттрансляционные модификации могли быть не вполне корректными, хотя N- конец белков не имел лишних аминокислот и был правильным. Авторы показали, что ДСК2 может образовывать как гомо-, так и гетеродимеры. ДСГ2 образовывал только гетеродимеры с ДСК2. При этом гетерофильные взаимодействия зависели от наличия ионов кальция в среде. В целом гетерофильные взаимодействия были слабее (KD= 23,4 рМ), чем гомофильные (KD= 4,2 рМ). Интересно, что были отмечены различия в элементах вторичных структур у ДСК2 и ДСГ2. Так, в растворе у десмоколлина около 15% остатков образуют a-спиральные структуры, в то время как у десмоглеина таких элементов не обнаружено. Также было показано различие в константах диссоциации при связывании ионов кальция. Для ДСК2 Kd ~ 1 тМ, а для ДСГ2 Kd ~ 4,5 тМ.

В работе Chitaev and Troyanovsky, 1997 было показано, что клетки линии НТ-1080 (фибросаркома человека), экспрессирующие только один дсг 2 не имеют десмосом, но имеют плотные контакты опосредованные N-кадгерином. При трансфекции этих клеток плазмидой, несущей бычий дек 1а, наблюдалось существенное изменение в локализации эндогенного дсг 2. Оба типа белков кластеризовались в области плотных контактов, в то время как в исходной линии клеток только малая часть поверхностного дсг 2 располагалась в области плотных контактов. Важно, что в линии НТ-1080 отсутствовали плакоглобин и десмоплакин. Также было показано, что необходимо наличие N-концевого домена у дек la (Argl-Thrl70), чтобы подобная транслокация десмоглеина 2 произошла. Напротив, удаление С-концевой, цитоплазматической части Дек 1а, отвечающей за взаимодействие с плакоглобином, или CSI-участка, необходимого для связывания с десмоплакином, не влияло на переход Дсг 2 в область' плотных контактов. Коиммунопреципитационный анализ лизатов клеток, экспрессирующих дек 1а показал, что дсг2 и дск1а взаимодействуют друг с другом напрямую и это взаимодействие зависит от наличия ионов Са . Часть гетеродимеров не разрушалась при удалении ионов Са" . Замена N-концевой части Дск1а на последовательность бычьего Дсг1 (Дск1а(1-170 Дсг1)- мутант) полностью предотвращало взаимодействие Дсг2/Дск1а(1-170 Дсг1)- мутант. Эти результаты были также подтверждены данными по связыванию первых двух доменов Дск1 с подложкой из белка Дсг2, имевшего два или три первых домена. При этом, взаимодействие форм дек и дсг с двумя доменами было очень слабым и только в присутствии ионов Са . Три домена дсг2 гораздо лучше взаимодействовали с двумя доменами дск1, и были частично независимы от

9+ наличия ионов Са . Данные этой работы (Chitaev and Troyanovsky, 1997) говорят о возможности образования гетеродимеров между Дсг и Дек, несмотря на существенные различия в структуре CAR-участков. Тем не менее, этих данных недостаточно, чтобы определить какова структура таких димеров - «голова к голове» или «бок к боку». Ранее было показано, что латеральные димеры внеклеточных

Л I ф фрагментов С-кадгерина относительно стабильны при удалении ионов Са (Brieher et al., 1996), что говорит в пользу латерального взаимодействия в некоторой части димеров Дсг2/Дск1а. Зависимость димеров от ионов Са говорит о том. что это либо специфичное взаимодействие по механизму «карман - якорь», либо что эти димеры образуются за счет участков связывания ионов кальция, что ранее наблюдалось для кристаллических структур Е-кадгерина (Nagar et al., 1996, PDB-код 1EDH).

Таким образом, в настоящее время известно, что для формирования функциональных десмосом необходимо наличие ряда внутриклеточных белков (плакоглобин, десмоплакип), Дсг и Дек одновременно. Важную роль при этом играет первый и, частично, второй домены белков десмосомальных кадгеринов. По всей видимости, и Дсг, и Дек способны к гомоадгезионным взаимодействиям, значительно более слабым, чем гомоадгезия в классических кадгеринах. В этом случае адгезия может происходить по механизму «якорь-карман», характерному для классических кадгеринов, но слабость адгезионных взаимодействий объяснить в этом случае трудно. Механизм гетероадгезионных взаимодействий не вполне понятен, так как имеются существенные отличия в аминокислотной последовательности первого домена Дсг и Дек, что затрудняет объяснение механизма взаимодействия общего для двух белков. Возможно, что Дек и Дсг имеют разное функциональное значение в составе десмосомы. В пользу такого предположения говорят данные, полученные на мышах нокаутных по тому или иному гену Дсг или Дек. Так, Дсг2-/-, ДскЗ-/- фенотип является летальным на ранних стадиях эмбриогенеза. В то же время мыши с фенотипом ДсгЗ-/-, Дсг2-/-, Дск1-/- имеют существенные дефекты эпидермиса, однако рождаются и живут несколько месяцев после рождения (Waschke, 2008). В целом механизмы взаимодействия различных изоформ Дек и Дсг в десмосоме остаются малопонятными. В свете этого важны работы, которые позволяют хотя бы частично реконструировать трехмерное строение десмосомы, особенно ее внеклеточной части, на молекулярном уровне.

В работе Al-Amoudi и коллег (2007) было показано, что в среднем 17500 молекул кадгеринов располагаются на 1 мкм2 площади десмосомы. Им удалось показать, что в срединной линии части молекул кадгеринов стабилизированы и малоподвижны. В то же время вблизи мембраны молекулы обладают некоторой подвижностью. Толщина срединной линии оказалась около 70 А, что хорошо согласуется с данными о размерах контактного адгезионного участка полученного при кристаллографическом анализе полноразмерной внеклеточной части С-кадгерина (Boggon et al., 2002). Таким образом, показано, что адгезионная поверхность в десмосомальных кадгеринах расположена исключительно в первом домене (ЭД1). Также были показаны возможные типы взаимодействия десмосомальных кадгеринов в области первого домена. Выявлены два основных типа взаимодействий. Первый — trans W-образная форма, что соответствует взаимодействию между молекулами соседних клеток. Такая форма хорошо коррелирует с данными об trans-взаимодействиях двух молекул С-кадгерина по данным Boggon et al., 2002. Второй тип взаимодействий — V-образная форма, соответствующая, очевидно, cis (латеральным) взаимодействиям между соседними молекулами одной клетки, которые играют важную роль при межклеточной адгезии (Brieher et al., 1996; Yap et al., 1997; Pertz et al., 1999). При таком взаимодействии молекулы ориентированы параллельно, так что они изогнуты по направлению друг к другу. Это может быть важно для поддержания межклеточной адгезии и специфических взаимодействий в ЭД1, когда клетки сдвигаются горизонтально под действием внешних сил. Другие, не менее интересные данные, касаются электронно-плотных областей в районе локализации доменов ЭД4-5 кадгеринов. Хотя недостаточная разрешающая способность мешает точным выводам, можно предположить с большей долей вероятности, что это - области cis (латеральных) контактов между соседними молекулами. Как было показано ранее, такие взаимодействия играют важную роль при адгезии, как при удалении ЭД5 из молекулы десмоглеина 1 (Nollet et al., 2000), так и при использовании антител, направленных к ЭД4-5 (Vestweber and Kemler, 1985).

Большинство десмосомальных кадгеринов выходят из плазматической мембраны в виде прямых столбиков и располагаются некоторым упорядоченным образом. Однако, также было показано, что часть молекул изогнута под углом 20 ° к поверхности мембраны. Было показано, что такая изогнутость частично ассоциирована с вариациями в размере десмосом. Также это говорит о том, что смещение адгезионных поверхностей двух молекул относительно оси молекулы может изменяться от 54° до 88°. Высокая подвижность первого домена может обеспечивать противодействие поперечным силам деформации десмосомы и сохранять при этом специфичность адгезионного контакта. Таким образом, в десмосоме наблюдается плотная, регулярная упаковка молекул десмосомальных кадгеринов, в которой можно выделить два типа взаимодействия — cis и trans контактирующие молекулы. Наличие cis- димеров подтверждает гипотезу о том, что на поверхности клетки десмосомальные кадгерины в начале образуют небольшие группы, состоящие из молекул в cis- форме (Chen et al., 2005). При сближении мембран соседних клеток возникает возможность для образования trans димеров и установлению специфичного адгезионнго контакта. Последовательность событий при формировании десмосомального контакта и дальнейшая его динамика имеет большое значение для понимания механизмов блокирования десмосом с помощью антител к Дсг или Дек, что наблюдается при пузырчатке.

Динамика формирования десмосом

Сборка десмосомального контакта довольно сложный процесс. Ему предшествует формирование адгезионных контактов, опосредованных классическими кадгеринами. Блокирование образования адгезионных контактов антителами к Е-кадегерину предотвращало формирование десмосом (Gumbiner et al., 1998). Было также показано, что существует перекрестная связь между образованием адгезионных контактов и формированием десмосом (Lewis et al., 1997). Важную роль играют также ионы Са , которые сильно влияют на образование как адгезионных, так и десмосомальных контактов. При концентрации в среде ионов Са <0,1 мМ, человеческие и мышиные кератиноциты растут без дифференцировки и формирования десмосом. Повышение концентрации выше 0,1 мМ индуцирует образование адгезионных контактов (в течение 5 минут), а затем и десмосом в течение 2 часов (Hennings and Holbrook, 1983). Таким образом, при переносе клеток из среды с низкой (< 0,1 мМ) концентрацией кальция в среду с высокой концентрацией кальция (> 0,5 мМ) можно наблюдать последовательные стадии формирования десмосом. Согласно данным группы британских ученых (Burdett and Sullivan, 2002), изучавшим формирование десмосом в клетках MDCK при резком повышении концентрации ионов кальция (т.н. «кальциевый сдвиг»), формирование десмосом происходит в два этапа. На первом этапе (30 мин после сдвига) от сети аппарата Гольджи к мембране направляются пузырьки диаметром до 60 нм, в которых содержится преимущественно десмоколлин 2, а десмоглеин и Е-кадгерин присутствуют в меньшем количестве. Транспорт пузырьков происходит во всех направлениях одинаково. Вероятно, что в везикулах, при повышении концентрации ионов происходит протеолитический процессииг и конформационные перестройки в экстраклеточиых доменах кадгеринов. При слиянии этих везикул с мембраной, вероятно, образуются протяженные участки из способных к адгезии молекул. Если эту способность к адгезии заблокировать, например, антителами к Е-кадгерину или Дск2 (Gumbiner et al., 1988; Cowin et al., 1984), то формирование десмосом будет блокировано. Поэтому, Е-кадгерин, а также, очевидно, Дск2 играют важную роль на ранних стадиях межклеточной адгезии. На возможное сходство в функциях этих двух белков указывает и сходство в аминокислотных последовательностях десмоколлинов типа «а» и классических кадгеринов (Buxton. 1992; Collins, 1996). И, напротив, десмоглеины сильнее отличаются по последовательности от классических кадгеринов и принимают участие в формировании десмосом на более поздних стадиях, что все вместе говорит о различных ролях, которые играют Дек и Дсг в формировании десмосом. На потенциальную важность Дек на ранних стадиях образования десмосомального контакта указывают эксперименты, выполненные на клетках линии НаСаТ с ДскЗ и ДсгЗ. Десмоколлин 3, имеющий делецию нескольких экстраклеточных доменов (ДскЗАЭД), нарушал процесс образования, как плотных контактов, так и десмосом. В то же время, экспрессия делетированного по N- концу ДсгЗ влияла только на образование десмосом. Также было показано, что ДскЗАЭД взаимодействует как с ß-катенином, так и с плакоглобином в НаСаТ (Hanakawa et al., 2000).

На втором этапе формирования межклеточных контактов (60 мин после сдвига) наблюдается транспорт больших и более сложноорганизованных пузырьков до 200 нм в диаметре. Они содержат относительно большее количество десмоглеина, Е-кадгерина, плакоглобина и меньше десмоколлина. Эти пузырьки сливаются с латеральной мембраной и, очевидно, образуют участки сборки будущих десмосом. Места слияния пузырьков с мембраной могут определяться уже находящимися на поверхности Дск2, ассоциированного с (3-катенином. Присутствуют также простые пузырьки, содержащие десмоглеин и плакоглобин. Однако пх происхождение может быть связано с интернализацией и эпдосомальным транспортом. Последующая кластеризация молекул Дск2 и Дсг, ассоциированногос плакоглобином, приводит к формированию десмосомального контакта, lía поверхности клеточной мембраны в это время (90 мин) присутствуют Е-кадгерип, связанный с (3-катенином. Однако почти не отмечается колокализация везикул, содержащих Дек 2 или плакоглобин с (3-катеннном, который также присутствует в 100 нм везикулах в цитоплазме. Спустя 4 часа после начала транспорта белков из транс-Гольджи сети к мембране наблюдается колокализация Дек 2 и электронно-плотных бляшек и образование морфологически различимых десмосом. Таким образом, сборка десмосом происходит за счет постоянного притока синтезированных de novo кадгеринов и встраивания их в десмосомальныи контакт, а не за счет предварительной сборки полудесмосом в цитоплазме. Ранее такие полудесмосомы были обнаружены в клетках, инкубируемых при низкой концентрации кальция (Demlehner et al., 1995).

Ряд экспериментов, в которых использовались слитые с GFP белки, входящие в состав десмосом, позволили наблюдать динамику уже сформированных десмосомальных контактов. Наблюдение за Дсг2-вРР или ПГ-GFP показало, что десмосомы изменяют свое местоположение на поверхности клетки. Десмосомальиые контакты постоянно обновляются за счет притока и слияния в более крупные структуры небольших «незрелых» десмосомоподобных образований. Наблюдалось также разделение одной большой структуры на две и более (Gloushankova et al., 2003) Подобная динамика означает, что происходит постоянная перестройка, перераспределение и изменение числа и размера десмосом, что, очевидно, может являться механизмом, регулирующим стабильность и силу десмосомальных контактов, в том числе локально. Другой аспект динамики десмосомальных контактов касается скорости обмена десмосомальных белков. Наблюдения за Дск2-GFP химерным белком в клетках линий MDCK и PLC показали, что, несмотря на большую стабильность во времени отдельно взятых десмосом (несколько часов), в них постоянно и очень интенсивно происходит обмен компонентов. Появление новых молекул flcK2a-GFP в предварительно засвеченном участке мембраны с десмосомами происходит в течение 30 минут, что позволяет предположить, что время жизни отдельных молекул в составе десмосомального комплекса немногим отличается от получаса (Windoffer et al., 2002). Это также может быть одним из механизмов, локально регулирующих силу десмосомального контакта без его полного разрушения. Возможно, что в регуляции обмена между разными пулами (десмосомального и синтезированного de novó) белков различные внутриклеточные регуляторные механизмы, в том числе концентрация ионов Са24.

Роль Са2+ в формировании и функционировании десмосомальных контактов

Как было показано, увелечение внеклеточной концентрации ионов Са2+ до порогового значения 0,5 мМ и выше, приводит к быстрому образованию межклеточных контактов in vitro. Вероятно, что в этом процессе большую роль играет и цитоплазматическая концентрация кальция. Метод резкого увеличения концентрации Са2+ является классическим при исследовании динамики десмосом. Уменьшение концетрации Са2+ приводит к разбору десмосомальных и других межклеточных контактов и эндоцитозу десмосомальных белков в цитоплазму (Mattey and Garrod, 1986 a,b). В цитоплазме обнаруживаются везикулы, содержащие большие десмосомальныс стурктуры, с присоединенными кератиновыми филаментамп. Показано, что транспорт таких везикул в околоядерное пространство зависит от актиновых филаментов и микротрубочек (Holm et al., 1993; Windoffer et al., 2002), но не зависит от клатрина (Holm et al., 1993). Эти везикулы потенциально могут транспортироваться обратно к клеточной мембране (Plolm et al., 1993), более вероятным является их слияние с лизосомами и последующая деградация внутреннего содержимого (Mattey and Garrod, 1986 b) и/или разбор полудесмосом па отдельные фрагменты и белки (Windoffer et al., 2002). Недавние исследования влияния сыворотки от пациентов с ВП, показало, что десмосомальные компоненты, в частности Дсг, попадают в эндосомальные везикулы с последующей деградацией в лизосомах (Calkins et al., 2006). Однако, в последнем случае ДсгЗ-ПГ перед интернализацией отсоединялись от десмоплакина и кератиновых филаментов.

2+

Интернализация десмосомальных компонентов при низкой концентрации Ca зависит от различных параметров, таких как тип клеток, количесвто пассажей, время инкубации монослоя (Mattey and Garrod, 1986 b; Wallis et al., 2000; Windoffer et al., 2002). Интересно, что интернализация десмосомальных компонентов может передаваться на соседние клетки с помощью прогеинкиназы С-зависимого сигнального пути (Wallis et al., 2000). При длительной инкубации (несколько суток) клеток в конфлюэнтном слое при нормальной концентрации иоиов Са2+, десмосомы каким-то образом перестраиваются и переходят в состояние гиперадгезии (Garrod et al., 2005). В этом состоянии десмосомы малочувствительны к внеклеточной концентрации ионов кальция. В гиперадгезивном состоянии десмосомы обладают более сильной адгезией, а клетки более устойчивы к механическим воздействиям (Kimura et al., 2007). Это состояние обратимо, и при ранении кожи или нарушении целостности эпителиального пласта клетки довольно быстро (в течение 1 часа) теряют состояние гиперадгезии и становятся чувствительными к концентрации кальция. Вероятно, что такие изменения также регулируются РКСа- зависимыми сигнальными путями (Wallis et al., 2000; Garrod et al., 2005).

Важность кальция, как регулятора десмосомальной адгезии in vivo, также как и гиперадгезионное состояние десмосом в клетках эпителия на сегодняшний день малопонятно. В эпидермисе имеется градиент внеклеточной концентрации ионов кальция (Menon et al., 1985), причем самые низкие относительные зпаченпя наблюдаются в надбазальном и шиповатом слоях. Однако точные значения концентраций неизвестны, что не позволяет сделать вывод о влиянии внеклеточых ионов кальция на образование десмосомальных контактов. Вместе с тем, в эпидермисе мыши согласно электронномикроскопическим исследованиям все или почти все десмосомы находятся в состоянии гиперадгезии (Garrod et al., 2005), что говорит о достаточной внеклеточной концентрации ионов кальция в эпидермисе. Кроме того, клетки могут менять концентрацию кальция вблизи своей мембраны, что может регулировать прочность и стабильность десмосомальных контактов.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Лысенко, Андрей Александрович

Выводы:

1. В бакуловирусной системе получены и охарактеризованы 4 фрагмента, соответствующие доменам 1, 2, 1-2 и 1-5 внеклеточной части ДСГЗ человека.

2. С помощью рекомбинантных белков показано, что аутоантитела больных ВП преимущественно распознают дистальные домены ДСГЗ.

3. Идентифицировано два потенциальных патогенных эпитопа ДСГЗ. Вероятно, что антитела к эпитопу (25-34) нарушают переход ДСГЗ из цис- в транс-димеры, а к эпитопу (83-98) - латеральные взаимодействия между десмоглеинами.

4. Получены и охарактеризованы антитела к Д1-2, Д1-5, ДЗ-5 ДСГЗ и показано, что патогенными могут быть антитела, как к дистальным, так и к проксимальным доменам ДСГЗ. Показано, что антитела к ДСГЗ могут быть также и непатогенными.

5. Показано, что патогенные антитела к ДСГЗ вызывают акаитолиз кератиноцнтов в эксплантатах кожи, но не нарушают монослой клеток линии кератиноцнтов человека НаСаТ, что прямо связано с числом десмосом на поверхности клеток.

6. Показано, что патогенные антитела к ДСГЗ снижают количество десмосом на поверхности кератиноцитов кожи с одновременным увеличением их размеров, что приводит к расслоению десмосом и потере межклеточной адгезии.

Благодарности

Выражаем благодарность Л.Г. Багаевой и И.И. Кузину за помощь в клонировании гена десмоглеина 3; Н.И. Шаровой и С.Б. Акопову за помощь в работе с культурами клеток; Е.В. Снежкову за помощь в работе по экспрессии белков в бакуловирусной системе; В.Мельниковой за помощь с подготовкой криосрезов кожи; Ю.А. Косинскому и А.Н. Некрасову за помощь в молекулярном моделировании; Л.Вартиковской за предоставленные антитела.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лысенко, Андрей Александрович, Москва

1. Ahmed A.R. (1982). Immunology of human dermatophyte infections. Arch. Dermatol., 118,521.525.

2. Ahmed A.R., Yunis E. J., Khatri K. (1990). MHC haplotype studies in Ashkenazi Jewishpatients with pemphigus vulgaris. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 7658- 7662.

3. Ahmed A.R., Spigelman Z., Cavacini L.A., Posner M.R. (2006). Treatment of pemphigusvulgaris with rituximab and intravenous immuneglobulin. New Engl. J. Med., 355, 17721779.

4. Akerman L., Mimouni D., David M. (2005). Intravenous immunoglobulin for treatment ofpemphigus. Clin. Rev. Allergy Immunol., 29,289-294.

5. Al-Amoudi A., Dicz D.C., Betts M.J., Frangakis A.S. (2007). The molecular architecture ofcadherins in native epidermal desmosomes. Nature, 450, 832 — 839.

6. Al-Amoudi A., Dubochet J., Norlen L. P. (2005). Nanostructure of the epidermalextracellular space as observed by cryo-electron microscopy of vitreous sections of human skin. J. Invest. Dermatol., 124, 764-777.

7. Al-Amoudi A., Norlen L. P., Dubochet J. (2004). Cryo-electron microscopy of vitreoussections of native biological cells and tissues. J. Struct. Biol., 148, 131-135.

8. Alexander J. S., Blaschuk O. W., Haselton F. R. (1993). An N-cadherin-like proteincontributes to solute barrier maintenance in cultured endothelium. J. Cell. Physiol., 156, 610-618.

9. Amagai M., Klaus-Kovtun V., Stanley J.R. (1991). Autoantibodies against a novel epithelialcadherin in pemphigus vulgaris, a disease of cell adhesion. Cell, 67, 869-877.

10. Amagai M., Hashimoto Т., Shimizu N., Nishikawa T. (1994a). Absorption of pathogenicautoantibodies by the extracellular domain of pemphigus vulgaris antigen (Dsg3) produced by baculovirus. J. Clin. Invest., 94, 59-67.

11. Amagai M., Karpati S., Klaus-Kovtun V., Udey M.C., Stanley J.R. (1994b). Extracellulardomain of pemphigus vulgaris antigen (desmoglein 3) mediates weak homophilic adhesion. J. Invest. Dermatol., 103, 609-615.

12. Amagai M., Ishii K., Hashimoto Т., Gamou S., Shimizu N., Nishikawa T. (1995a).

13. Conformational epitopes of pemphigus antigens (Dsgl and Dsg3) are calcium dependent and glycosylation independent. J. Invest. Dermatol., 105,243-247.

14. Amagai M., Hashimoto Т., Green K.J., Shimizu N., Nishikawa T. (1995b). Antigen-specificimmunoadsorption of pathogenic autoantibodies in pemphigus foliaceus. J. Invest. Dermatol, 104, 895-901.

15. Amagai M., Tsunoda K., Zillikens D., Nagai Т., Nishikawa T. (1999). The clinicalphenotype of pemphigus is defined by the anti-desmoglein autoantibody profile. J. Am. Acad. Dermatol., 40, 167-170.

16. Amagai M., Tsunoda K., Suzuki H., Nishifuji K., Koyasu S., Nishikawa T. (2000). Use ofautoantigen-knockout mice in developing an active autoimmune disease model for pemphigus. J. Clin. Invest., 105, 625-631.

17. Amagai M., Ahmed A.R., Kitajima Y., Bystryn J.C., Milner Y., Gniadecki R., Hertl M., etal. (2006a). Are desmoglein autoantibodies essential for the immunopathogenesis of pemphigus vulgaris, or just 'witnesses of disease'? Exp. Dermatol, 15, 815-831.

18. Amagai M. (2006). Non-pathogenic anti-desmoglein 3 IgG autoantibodies in Fogo

19. Selvagem. J. Invest. Dermatol., 126, 1931-1932.

20. Anhalt G.J., Labib R.S., Voorhees J.J., Beals T.F., Diaz L.A. (1982). Induction ofpemphigus in neonatal mice by passive transfer of IgG from patients with the disease. New Engl. J. Med., 306, 1189-1196.

21. Aoyama Y., Owada M.K., Kitajima Y. (1999a). A pathogenic autoantibody, Pemphigus

22. G, induces phosphorylation of desmoglein 3, and its dissociation from plakoglobin in cultured keratinocytes. Eur. J. Immunol., 29, 2233-2240.

23. Arredondo J., Chernyavsky A.I., Karaouni A., Grando S.A. (2005). Novel mechanisms oftarget cell death and survival and of therapeutic action of IVIg in Pemphigus. Am. J. Pathol., 167, 1531-1544.

24. Bergdoll M., Remy M. H., Cagnon C., Masson J. M., Dumas P. (1997). Proline dependent oligomerization with arm exchange. Structure, 5, 391 —401.

25. Berkowitz P., Hu P., Liu Z., Diaz L.A., Enghild J.J., Chua M.P. (2005a). Desmosomesignalling. Inhibition of p38MAPK prevents pemphigus vulgaris IgG-induced cytoskeleton reorganization. J. Biol. Chem., 280, 23778—23784.

26. Berkowitz P., Hu P., Warren S., Liu Z., Diaz L.A., Rubenstein D.S. (2005b). p38MAPKinhibition prevents disease in pemphigus vulgaris mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 12855—12860.

27. Bhol K., Natarajan K., Nagarwalla N. (1995). Correlation of peptide specificity and IgGsubclass with pathogenic and nonpathogenic autoantibodies in pemphigus vulgaris: a model for autoimmunity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 5239-5243.

28. Bhol K.C. and Ahmed A.R. (2002). Production of non-pathogenic human monoclonalantibodies to desmoglein 3 from pemphigus vulgaris patient. Autoimmunity, 35, 87-91.

29. Boggon T. J., Murray J., Chappuis-Flament S.,Wong E., Gumbiner B. M. and Shapiro L.2002). C-cadherin ectodomain structure and implications for cell adhesion mechanisms. Science, 296, 1308-1313.

30. Brandsen R., Frusic- Zlotkin M., Lyubimov M. (1997). Circulating pemphigus IgG infamilies of patients with pemphigus: comparison of indirect immunofluorescence, direct immunofluorescence, and immunoblotting. J. Am. Acad. Dermatol., 36, 44-52.

31. Brenner S., Tur E. (2001). Pemphigus vulgaris: environmental factors. Occupational,behavioral, medical and qualitative food frequency questionnaire. Int. J. Dermatol., 40, 562-569.

32. Brieher W. M., Yap A. S., Gumbiner B. M. (1996). Lateral dimerization is required for thehomophilic binding activity of C-cadherin. J. Cell Biol., 135,487-496.

33. Buxton R. S., and Magee A. I. (1992). Structure and interactions of desmosomal and othercadherins. Semin. Cell Biol. 3, 157-167.

34. Buxton R. S., Cowin P., Franke W. W., Garrod D. R., Green K. J., King I. A., Chitaev N.

35. A., Troyanovsky S. M. (1997). Direct Ca2+ dependent heterophilic interaction between desmosomal cadherins, desmoglein and desmocollins, contributes to cell — cell adhesion. J. Cell Biol., 138, 193-201.

36. Bystryn J.C. and Rudolph J.L. (2005a). Pemphigus. Lancet, 366, 61-73.

37. Bystryn J.C. and Rudolph J.L. (2005b). IV Ig treatment of pemphigus: how it works andhow to use it. J. Invest. Dermatol, 125, 1093-1098.

38. Bystryn J.-C., Grando S.A. (2006). A novel explanation for acantholysis in pemphigusvulgaris: The basal cell shrinkage hypothesis. J. Am. Acad. Dermatol., 54, 513-516.

39. Caldelari R., de Bruin A., Baumann D., Suter M.M., Bierkamp C., Balmer V. (2001). Acentral role for the armadillo protein plakoglobin in the autoimmune disease Pemphigus vulgaris. J. Cell Biol, 153, 823—834.

40. Calkins C.C., Setzer S.V., Jennings J.M., Summers S., Tsunoda K., Amagai M., Kowalczyk

41. A.P. (2006) Desmoglein endocytosis and desmosome disassembly are coordinated responses to pemphigus autoantibodies. J. Biol. Chem., 281, 7623-7634.

42. Chen C.P., Posy S., Ben-Shaul A., Shapiro L., Honig B. H. (2005). Specificity of cell-celladhesion by classical cadherins: critical role for low-affinity dimerization through b-strand swapping. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 102, 8531-8536.

43. Cheng S.W., Kobayashi M., Kinoshita-Kuroda K., Tanikawa A. Amagai M., Nishikawa T.2002). Monitoring disease activity in pemphigus with enzyme-linked immunosorbent assay using recombinant desmogleins 1 and 3. Br. J. Dermatol., 147, 261-265.

44. Chernyavsky A.I., Arredondo J., Kitajima Y., Sato-Nagai M., Grando S.A. (2007).

45. Desmoglein versus non-desmoglein signaling in pemphigus acantholysis: characterization of novel signaling pathways downstream of pemphigus vulgaris antigens. J. Biol. Chem., 282,13804-13812.

46. Chidgey M. A., Clarke J. P., and Garrod D. R. (1996). Expression of full-lengthdesmosomal glycoproteins (desmocollins) is not sufficient to confer strong adhesion on transfected L929 cells. J. Invest. Dermatol., 106, 689-695.

47. Chitaev N. A., and Troyanovsky S. M. (1998). Adhesive but not lateral E-cadherincomplexes require calcium and catenins for their formation./. Cell Biol., 142, 837-846.

48. Chitaev, N. A., and Troyanovsky, S. M. (1997). Direct Ca2+-dependent heterophilicinteraction between desmosomal cadherins, desmoglein and desmocollin, contributes to cell-cell adhesion. J. Cell Biol, 138, 193-201.

49. Cirillo N., Femiano F., Combos F., and Lanza A. (2006 a). Serum from pemphigus vulgarisreduces desmoglein 3 half-life and perturbs its de novo assembly to desmosomal sites in cultured keratinocytes. FEBS Lett., 580, 3276-81.

50. Cirillo N., Gombos F., and Lanza A. (2006 b). Changes in desmoglein 1 expression andsubcellular localization in cultured keratinocytes subjected to anti-desmoglein 1 pemphigus autoimmunity. J Cell Physiol., 210, 411-416.

51. Cirillo N., Lanza M., Femiano F., Gaeta G.M., De Rosa A., Gombos F., Lanza A. (2007). Ifpemphigus vulgaris IgG are the cause of acantholysis, new IgG-independent mechanisms are the concause. J. Cell Physiol., 212, 563—567.

52. Coligan J.E. Current protocols in immunology. (1998), Vol. 1: John Wiley & Sons, Inc.,8.1-8.10.

53. Collins J. E. (1996). Classical and desmosomal cadherins. Adv. Struct. Biol., 4, 75-107.

54. Corps E., Carter C., Karecla P., Ahrens T., Evans P. and Kilshaw P. (2001). Recognition of

55. E-cadherin by integrin alpha(E)beta(7): requirement for cadherin dimerization and implications for cadherin and integrin function. J Biol Chem., 276, 30862-30870.

56. Cowin P., Mattey D. L. and Garrod D. R. (1984). Identification of desmosomal surfacecomponents (desmocollins) and inhibition of desmosome formation by specific Fab'. J. Cell Sci., 70, 41-60.

57. Davies D.R. and Cohen G.H. (1996). Interactions of protein antigens with antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7-12.

58. Demlehner M. P., Schafer S., Grund C., and Franke W. W. (1995). Continual assembly ofhalf-desmosomal structures in the absence of cell contacts and their frustrated endocytosis; a coordinated Sisyphus cycle. J. Cell Biol. 131, 745-760.

59. Denning M.F., Guy S.G., Ellerbroek S.M., Norvell S.M., Kowalczyk A.P., and Kathleen J.

60. Green K.J. (1998). The expression of desmoglein isoforms in cultured human keratinocytes is regulated by calcium, serum, and protein kinase C. Exp. Cell Res., 239, 50-59.

61. Diaz L.A., Arteaga L.A., Hilario-Vargas J., Valenzuela J.G., Li N., Warren S., Aoki V.,

62. Ding X., Aoki V., Mascaro J.M Jr., Lopez-Swiderski A., Diaz L.A., Fairley J.A. (1997).

63. Mucosal and mucocutaneous (generalized) pemphigus vulgaris show distinct autoantibody profiles. J. Invest. Dermatol., 109, 592-596.

64. Doherty P., Rowett L. H., Moore S. E., Mann S. E., and Walsh F. S. (1991). Neuriteoutgrowth in response to transfected N-CAM and N-cadherin reveals fundamental differences in neuronal responsiveness to CAMs. Neuron, 6,247-258.

65. Dolman N.J., Tepikin A.V. (2006). Calcium gradients and the Golgi. Cell Calcium., 40,505.512.

66. Evangelista F., Dasher D.A., Diaz L.A., Prisayanh P.S., and Li N. (2008). E-cadherin is anadditional immunological target for pemphigus autoantibodies. J. Invest. Dermatol., 128, 1710-1718.

67. Farb R.M., Dykes R., Lazarus G.S. (1978). Anti-epidermal-cell-surface pemphigus antibodydetaches viable epidermal cells from culture plates by activation of proteinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 459-63.

68. Eyre R.W., and Stanley J.R. (1988). Identification of pemphigus vulgaris antigen extractedfrom normal human epidermis and comparison with pemphigus foliaceus antigen. J. Clin. Invest., 81, 807-812.

69. Frusic-Zlotkin M., Pergamentz R., Michel B., David M., Mimouni D., Bregegere F., Milner

70. Y. (2005). The interaction of pemphigus autoimmunoglobulins with epidermal cells: activation of the fas apoptotic pathway and the use of caspase activity for pathogenicity tests of pemphigus patients. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1050, 371-379.

71. Futei Y., Amagai M., Sckiguchi M., Nishifuji K., Fujii Y., and Nishikawa T. (2000). Use ofdomain-swapped molecules for conformational epitope mapping of desmoglein 3 in pemphigus vulgaris. J. Invest. Dermatol., 115, 829-834.

72. GaiTod D.R., Merritt A., and Nie Z. (2002). Desmosomal cadherins. Curr. Opin. Cell Biol.,14, 537-545.

73. Garrod D.R., Berika M.Y., Bardsley W.F., Holmes D., and Tabernero L. (2005). Hyperadhesion in desmosomes: its regulation in wound healing and possible relationship to cadherin crystal structure. J. CellSci., 118, 5743-5754.

74. Garrod D.R., Kimura T.E. (2008). Hyper-adhesion: a new concept in cell-cell adhesion.

75. Biochem. Soc. Trans., 36 (p.2), 195-201.

76. Gloushankova N. A., Wakatsuki T., Troyanovsky R. B., Elson E., and Troyanovsky S. M.2003). Continual assembly of desmosomes within stable intercellular contacts of epithelial A-431 cells. Cell Tissue Res., 314, 399—410.

77. Gniadecki R., Jemec G.B., Thomsen B.M., Hansen M. (1998). Relationship betweenkeratinocyte adhesion and death: anoikis in acantholytic diseases. Arch. Dermatol. Res., 290, 528-532.

78. Grando S.A. (2006). Cholinergic control of epidermal cohesion. Exp. Dermatol., 15, 265282.

79. Guedes A.C., Rotta O., Leite H.V., Leite V.H. (2002). Ultrastructural aspects of mucosas inendemic pemphigus foliaceus. Arch. Dermatol., 138, 949-954.

80. Gumbiner B., Stevenson B. and Grimaldi A. (1988). The role of the cell adhesion moleculeuvomorulin in the formation and maintenance of the epithelial junctional complex. J. Cell Biol., 107, 1575-1587.

81. Hammer J., Gallazzi F., Bono C.P. (1995). Peptide binding specificity of HLA-DR 4molecules: correlation with rheumatoid arthritis association. J. Exp. Med., 181, 18471855.

82. Hanakawa Y., Amagai M., Shirakata Y., Sayama K., and Hashimoto K. (2000). Differenteffects of dominant negative mutants of desmocollin and desmoglein on the cell-cell adhesion ofkeratinocytes. J. CellSci., 113,1803-11.

83. Harman K.E., Seed P.T., Gratian M.J., Bhogal B.S, Challacombe S.J., Black M.M. (2001). The severity of cutaneous and oral pemphigus is related to desmoglein 1 and 3 antibody levels. Br. J. Dermatol., 144, 775-780.

84. Harrison O. J., Corps E. M. and Kilshaw P. J. (2005). Cadherin adhesion depends on a saltbridge at the N-terminus. J. Cell Sci., 118,4123-4130.

85. Hashimoto K., Lever W.F. (1967). An electron microscopic study on pemphigus vulgaris ofthe mouth and the skin with special reference to the intercellular cement. J.Invest. Dermatol, 48, 540-52.

86. Hashimoto T., Amagai M., Garrod D.R. (1995) Immunofluorescence and immunoblotstudies on the reactivity of pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus sera with desmoglein 3 and desmoglein 1. Epithelial. Cell Biol. 4, 63-69.

87. Haussinger D., Ahrens T., Aberle T., Engel J., Stetefeld J., Grzesiek, S. (2004). Proteolytic

88. E-cadherin activation followed by solution NMR and X-ray crystallography. EMBOJ., 23, 1699-1708.

89. Haussinger D., Ahrens T., Sass H. J., Pertz O., Engel J. and Grzesiek S. (2002). Calciumdcpendent homoassociation of E-cadherin by NMR spectroscopy: changes in mobility, conformation and mapping of contact regions. J. Mol. Biol., 324, 823-839.

90. He W., Cowin P. and Stokes D. L. (2003). Untangling desmosomal knots with electrontomography. Science, 302, 109-113.

91. Hennings PL, and Holbrook K. A. (1983). Calcium regulation of cell-cell contact and differentiation of epidermal cells in culture: an ultrastructural study. Exp. Cell Res., 143, 127-142.

92. Hertl M., Karr R.W., Amagai M. (1998). Heterogeneous MHC II restriction pattern ofautoreactive desmoglein 3 specific T cell responses in Pemphigus vulgaris patients and normals. J. Invest. Dermatol, 110, 388-392.

93. Hcrtl M. Eming R., Veldman C. (2006). T cell control in autoimmune bullous skindisorders. J. Clin. Invest., 116, 1159-1166.

94. Hcupel W., Drenckhahn D., Zillikens D., Waschke J. (2007). Steric hindrance of desmoglein 3 transinteraction by pemphigus vulgaris IgG. J. Invest. Dermatol., 127, (Suppl 1):5 (abstract 29).

95. Hilario-Vargas J., Dasher D.A., Li N., Aoki V., Hans-Filho G., dos Santos V., Qaqish B.F.,

96. Rivitti E.A., Diaz L.A. Cooperative Group on Fogo Selvagem Research. (2006). Prevalence of anti-desmoglein-3 antibodies in endemic regions of Fogo selvagem in Brazil. J. Invest. Dermatol., 126, 2044-2048.

97. Holm P. K., Hansen S. H., Sandvig K., and van Deurs B. (1993). Endocytosis ofdesmosomal plaques depends on intact actin filaments and leads to a nondegradaiive compartment. Eur. J. Cell Biol., 62, 362-371.

98. Holthofer B., Windoffer R., Troyanovsky S.M., Leube R. E. (2007). Structure and functionof desmosomes. Int. Rev. Cyt., 264, 65—163.

99. Huber O., Kemler R. and Langosch D. (1999). Mutations affecting transmembrane segmentinteractions impair adhesiveness of E-cadherin. J Cell Sci., 112, 4415-4423.

100. Ishii K., Amagai M., Hall R.P., Hashimoto T., Takayanagi A., Gamou S., Shimizu N., and

101. Nishikawa T. (1997). Characterization of autoantibodies in pemphigus using antigen-specific enzyme-linked immunosorbent assays with baculovirus-expressed recombinant desmogleins. J. Immunol., 159, 2010-2017.

102. Ishii K., Harada R., Matsuo I., Shirakata Y., Hashimoto K., Amagai M. (2005). In vitrokeratinocyte dissociation assay for evaluation of the pathogenicity of anti-desmoglein 3 IgG autoantibodies in pemphigus vulgaris. J. Invest. Dermatol., 124, 939-946.

103. Ishii K., Norvell S.M., Bannon L.J., Amargo E.V., Pascoe L.T., and Green KJ. (2001).

104. Assembly of desmosomal cadherins into desmosomes is isoform dependent. J. Invest. Dermatol., 117,26-35.

105. Jamora M.J., Jiao D., Bystryn J.C. (2003). Antibodies to desmoglein 1 and 3, and theclinical phenotype of pemphigus vulgaris. J. Am. Acad. Dermatol., 48, 976-977.

106. Jeffes E.B., Kaplan R.P. (1984). Use a human skin explants as a model of pemphigusvulgaris disease in vitro. J Clin Immunol. 4, 359-363.

107. Kawasaki H., Tsunoda K., Hata T., Ishii K., Yamada T., and Amagai M. (2006). Synergisticpathogenic effect of combined mouse monoclonal anti-desmoglein 3 IgG antibodies on Pemphigus vulgaris blister formation. J. Invest. Dermatol., 126, 2621-2630.

108. Kelly D. E. (1966). Fine structure of desmosomes, hemidesmosomes, and an epidermalglobular layer in developing newt epidermis. J. Cell Biol, 28, 51-72.

109. Kimura T.E., Merritt A .J., and Garrod D.R. (2007). Calcium-independent desmosomes ofkeratinocytes are hyper-adhesive. J. Invest. Dermatol., 127, 775-781.

110. King I. A., Angst B. D., Hunt D. M., Kruger M., Arnemann J. and Buxton R. S. (1997).

111. Heirarchical expression of desmosomal cadherins during stratified epithelial morphogenesis in the mouse. Differentiation, 62, 83-96

112. Kitajima Y., Inoue I., Yaoita H. (1987). Effects of pemphigus antibody on the regenerationof cell-cell contact in keratinocyte cultures grown in low to normal Ca2+ concentration. J. Invest. Dermatol., 89. 167-171.

113. Kitajima Y. (2003). Current and prospective understanding of clinical classification,pathomechanisms and therapy in pemphigus Arch. Dermatol. Res., 295,17—23.

114. Klingelhofer J., Laur O. Y., Troyanovsky R. B., and Troyanovsky S. M. (2002). Dynamicinterplay between adhesive and lateral E-cadherin dimers. Mol. Cell. Biol., 22, 74497458.

115. Koch A. W., Pokutta S., Lustig A. and Engel J. (1997) Calcium binding andhomoassociation of E-cadherin domains. Biochemistry, 36, 7697—7705.

116. Koch P.J., Walsh M.J., Schmelz M., Goldschmidt M.D., Zimbelmann R., Franke W.W.1990). Identification of desmoglein, a constitutive desmosomal glycoprotein, as a member of the cadherin family of cell adhesion molecules. Eur. J. Cell Biol.,53, 1-12.

117. Koch P.J., Magee A.I., Rees D.A., Stanley J.R. and Steinberg M.S. (1993). Nomenclatureof the desmosomal cadherins. J. Cell Biol., 121, 481-483.

118. Koch P.J., Mahoney M.G., Ishikawa H., Pulkkinen L., Uitto J., Shultz L., Murphy G.F.,

119. Whitaker-Menezes D., Stanley J.R. (1997). Targeted disruption of the pemphigus vulgaris antigen (desmoglein 3) gene in mice causes loss of keratinocyte cell adhesion with a phenotype similar to pemphigus vulgaris. J. Cell Biol., 137, 1091-1102.

120. Kowalczyk A.P., Borgwardt J.E., Green K.J. (1996). Analysis of desmosomal cadherinadhesive function and stoichiometry of desmosomal cadherin-plakoglobin complexes. J. Invest. Dermatol., 107, 293-300.

121. Lanza A., Cirillo N., Femiano F., Gombos F. (2006). How does acantholysis occur inpemphigus vulgaris: a critical review. J. Cutan. Pathol., 33, 401-412.

122. Laur 0. Y., Klingelhofer J., Troyanovsky R. B. and Troyanovsky S. M. (2002). Both thedimerization and immunochemical properties of E-cadherin EC1 domain depend on Trpl56 residue. Arch. Biochem. Biophys., 400,141- 147.

123. Lever W.F. (1953). Pemphigus. Medicine 32, 2-132.

124. Lewis J. E., Wahl III J.K., Sass K.M., Jensen P.J., Johnson K.R. and Wheelock M.J.1997). Cross-talk between adherens junctions and desmosomes depends on plakoglobin. J. Cell Biol, 136, 919-934.

125. Mahoney M.G., Wang Z., Rothenberger K., Koch PJ., Amagai M., Stanley J.R. (1999).

126. Explanations for the clinical and microscopic localization ,of lesions in pemphigus foliaceus and vulgaris. J. Clin. Invest., 103, 461-468.

127. Marcozzi C., Burdett I. D., Buxton R. S. and Magee A. I. (1998). Coexpression of bothtypes of desmosomal cadherin and plakoglobin confers strong intercellular adhesion. J. Cell Sci., Ill, 495-509.

128. Mattey D. L. and Garrod D. R. (1985). Mutual desmosome formation between all binarycombinations of human, bovine, canine, avian and amphibian cells: desmosome formation is not tissue- or species-specific. J. Cell Sci., 75, 377 — 399.

129. Mattey D. L. and Garrod, D. R. (1986a). Calcium-induced desmosome formation incultured kidney epithelial cells. J. Cell Sci., 85, 95-111.

130. Mattey D. L. and Garrod D. R. (1986b). Splitting and internalization of the desmosomesof cultured epithelial cells by reduction of calcium concentration. J. Cell Sci., 85, 113124.

131. Mattey D. L., Burdge G. and Garrod D. R. (1990). Development of desmosomal adhesionbetween MDCK cells following calcium switching. J. Cell Sei., 97, 689-1063.

132. Mege R. M., Goudou D., Diaz C., Nicolet M., Garcia L., Geraud G., and Rieger, F.1992). N-cadherin and N-CAM in myoblast fusion: compared localisation and effect of blockade by peptides and antibodies. J. Cell Sei., 103, 897-906.

133. Menon G.K., Grayson S., and Ellias P.M. (1985). Ionic calcium reservoirs in mammalianepidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry. J. Invest. Derm., 84, 508-512.

134. Miyagawa S., Amagai M., Iida T., Yamamoto Y., Nishikawa T., Shirai T. (1999). Latedevelopment of antidesmoglein 1 antibodies in pemphigus vulgaris: correlation with disease progression. Br. J. Dermatol., 141,1084-1087.

135. Moll R., Franke W.W., Schiller D.L., Geiger B., and Krepier R. (1982). The catalog ofhuman cytokeratins: patterns of expression in normal cpithelia, tumors, and cultured cells. Cell, 31, 11-24.

136. Morris A. L., MacArthur M. W., Hutchinson E. G. and Thornton J. M. (1992).

137. Stereochemical quality of protein structure coordinates. Proteins: Struct. Funct. Genet., 12, 345-364.

138. Muller R., Svoboda V., Wenzel E., Muller H.H., Hertl M. (2008). IgG againstextracellular subdomains of desmoglein 3 relates to clinical phenotype of pemphigus vulgaris. Exp. Dermatol., 17, 35-43.

139. Nagar B., Overduin M., Ikura M., Rini J.M. (1996). Structural basis of calcium induced Ecadherin rigidification and dimerization. Nature, 380, 360—364.

140. Newton S. C., Blaschuk O. W., and Millette, C. F. (1993). N-cadherin mediates Sertolicell-spermatogenic cell adhesion. Dev. Dyn., 197, 1-13.

141. Nguyen V.T., Ndoye A., Shultz L.D., Pittelkow M.R., Grando S.A. (2000). Antibodiesagainst keratinocyte antigens other than desmogleins 1 and 3 can induce pemphigus vulgaris-like lesions. J. Clin. Invest., 106, 1467-1479.

142. Niizeki H., Inoko H. (1991). HLAII class antigens are associated with Japanesepemphigus patients. Hum. Immunol., 31, 246-250.

143. Nollet F., Kools P., and van Roy F. (2000). Phylogenetic analysis of the Cadherinsuperfamily allows identification of six major subfamilies besides several solitary members. J. Mol. Biol., 299, 551-572.

144. North A. J., Bardsley W. G., Hyam J. Bornslaeger E. A., Cordingley H. C., Trinnaman B.,

145. Hatzfeld M., Green K. J., Magee A. I. and Garrod D. R. (1999). Molecular map of the desmosomal plaque. J. Cell Sci., 112, 4325-4336.

146. North A. J., Chidgey M. A. J., Clarke J. P., Bardsley W. G. and Garrod D. R. (1996).

147. Distinct desmocollin isoforms occur in the same desmosomes and show reciprocally graded distributions in bovine nasal epidermis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 77017705.

148. Nuber U. A., Schafer S., Stehr S., Rackwitz H.-R. and Franke, W. W. (1996). Patterns ofdesmocollin synthesis in human epithelia: Immunolocalization of desmocollins 1 and 3 in special epithelia and in cultured cells. Eur. J. Cell Biol., 71, 1-13.

149. Ongenae T.C., Temmerman LJ. (1999). Intercellular IgA dermatosis. Eur. J. Dermatol.,9, 85-94.

150. Ortega Loayza A.G., Ramos W., Elgart G., Bouman P., Jiménez G., Avila J., Rojas I.,

151. Vilcarromero M., Hurtado J., Lindo G., Galarza C. (2006). Antibodies against desmoglein 1 in healthy subjects in endemic and nonendemic areas of pemphigus foliaceus (fogo selvagem) in Peru. Int. J. Dermatol., 45, 538-542.

152. Osada K., Seishima M., Kitajima Y. (1997). Pemphigus IgG activates and translocatesprotein kinase C from the cytosol to the particulate/cytoskeleton fractions in human keratinocyles. J. Invest. Dermatol., 108, 482-487.

153. Osborn M. and Weber K. (1985). A monoclonal antibody recognizing desmosomes: use inhuman pathology. J. Invest. Dermatol., 85, 385-388.

154. Overduin M., Harvey T. S., Bagby S., Tong K. I., Yau P., Takeichi M. and Ikura M.1995). Solution structure of the epithelial cadherin domain responsible for selective cell adhesion. Science, 267, 386-389.

155. Overton J. (1973). Experimental manipulation of desmosome formation. J. Cell Biol., 56,636.646.

156. Ozawa M. (2002). Lateral dimerization of the E-cadherin extracellular domain isnecessary but not sufficient for adhesive activity. J. Biol. Chem., 277, 19600-19608.

157. Ozawa M., Kemler R. (1990a). Correct proteolytic cleavage is required for the celladhesive function of uvomorulin. J. Cell Biol., Ill, 1645-1650.

158. Ozawa, M., J. Engel, and R. Kemler. (1990b). Single amino acid substitutions in one Ca2+binding site of uvomorulin abolish the adhesive function. Cell, 63, 1033-1038.

159. Padlan E.A.,Silverton E.W., Sherrif S., Cohen G.H., Smith-Gill S.J., and Davies D.R.1989). Structure of an antibody-antigen complex: Crystal structure of the HyHEL-10 Fab lysozyme complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5938-5942.

160. Parisini E., Higgins J. M.G., Liu Jin., Brenner M.B. and Wang Jia. (2007). The crystalstructure of human E-cadherin domains 1 and 2, and comparison with other cadherins in the context of adhesion mechanism. J. Mol. Biol., 373, 401-411.

161. Payne A.S., Ishii K., Kacir S., Lin C., Li H., Hanakawa Y., Tsunoda K., Amagai M.,

162. Stanley J.R., Siegel D.L (2005). Genetic and functional characterization of human pemphigus vulgaris monoclonal autoantibodies isolated by phage display. J. Clin. Invest., 115, 888-899.

163. Patel S. D., Ciatto C., Chen C. P., Bahna F. et al. (2006). Type II cadherin ectodomainstructures: Implications for classical cadherin specificity. Cell, 124, 1255 1268.

164. Pelacho B., Natal C., España A., Sánchez-Carpintero I., Iraburu M.J., López-Zabalza M.J.2004). Pemphigus vulgaris autoantibodies induce apoptosis in HaCaT keratinocytes.

165. Penn, E. J., Hobson, C., Rees, D. A., and Magee, A. I. (1989). The assembly of the majordesmosome glycoproteins of Madin- Darby canine kidney cells. FEBS Lett., 247, 1316.

166. Pertz O., Bozic D., Koch A. W., Fauser C., Brancaccio A. and Engel J. (1999). A newcrystal structure, Ca2+ dependence and mutational analysis reveal molecular details of E-cadherin homoassociation. EMBO J., 18, 1738-1747.

167. Puviani M., Marconi A., Cozzani E., Pincelli C. (2003). Fas ligand in pemphigus serainduces keratinocyte apoptosis through the activation of caspase-8. J. Invest. Dermatol, 120, 164-167.

168. Rayns D. G., Simpson F. O., and Ledingham J. M. (1969). Ultrastructure of desmosomesin mammalian intercalated disc; appearances after lanthanum treatment. J. Cell Biol., 42, 322-326.

169. Redies C. (1997). Cadherins and the formation of neural circuitry in the vertebrate CNS.

170. Cell Tissue Res., 290,405-413.

171. Rock B., Martins C.R., Theofílopoulos A.N., Balderas R.S., Anhalt G.J. Labib R.S.,

172. Futamura S., Rivitti E.A., Diaz L.A. (1989). The pathogenic effect of IgG4 autoantibodies in endemic pemphigus foliaceus (fogo selvagem). N. Engl. J. Med., 320, 1463-1469.

173. Rosen K., Shi W, Calabretta B., Filmus J. (2002). Cell detachment triggers p38 Mitogenactivated protein kinase-dependent overexpression of Fas ligand. A novel mechanism of anoikis of intestinal epithelial cells. J. Biol Chem., 277,46123—46130.

174. Ruocco V., Wolf R., Ruocco E. (1996). Viruses in pemphigus: A casual or casualrelationship? Int. J. Dermatol., 35, 782-784.

175. Sanchez-Carpintero I., Espana A., Pelacho B., Lopez-Moratalla N., Rubenstein D.S., Diaz

176. A., Lopez-Zabalza M.J. (2004). In vivo blockade of pemphigus vulgaris acantholysis by inhibition of intracellular signal transduction cascades. Br. J. Dermatol., 151, 565570.

177. Sano R., Hayashi F., Yoshida M. Yokoyama S. (2007). Solution structure of the firstcadherin domain from human Desmoglein-2. RIKEN Structural Genomics/ Proteomics Initiative (RSGI). PDB code: 2yqg.

178. Schafer S., Koch P.J., Franke W.W. (1994). Identification of the ubiquitous humandesmoglein, dsg2, and the expression catalogue of the desmoglein subfamily of dcsmosomal cadherins. Exp. Cell Res., 211, 391-399.

179. Schiltz J.R. and Michel B. (1976). Production of epidermal acantholysis in normal humanskin in vitro by the IgG fraction from pemphigus serum. J. Invest. Dermatol., 67, 254260.

180. Seishima M., Esaki C., Osada K., Mori S., Hashimoto T., Kitajima Y. (1995) Pemphigus

181. G, but not bullous pemphigoid IgG, causes a transient increase in intracellular calcium and inositol 1,4,5-triphosphate in DJM-1 cells, a squamous cell carcinoma line. J. Invest. Dermatol., 104, 33—37.

182. Sekiguchi M., Futei Y., Fujii Y., Iwasaki T., Nishikawa T., and Amagai M. (2001).

183. Dominant autoimmune epitopes recognized by pemphigus antibodies map to the N-terminal adhesive region of desmogleins. J. Immunol., 167, 5439-5448.

184. Shan W.S., Tanaka H., Phillips G.R., Arndt K., Yoshida M., Colman D.R., and Shapiro L.2000). Functional cis-heterodimers of N- and R-cadherins. J. Cell Biol., 148, 579-590.

185. Shapiro L., Fannon A.M., Kwong P.D., Thompson A., Lehmann M.S., Grubel G. et al.1995). Structural basis of cell-cell adhesion by cadherins. Nature, 374, 327-337.

186. Sharma P.M., Mao X., Payne A.S. (2007). Beyond steric hindrance: The role of adhesionsignaling pathways in the pathogenesis of pemphigus. J. Dermatol. Sci., 48, 1—14.

187. Shimizu A., Ishiko A., Ota T., Tsunoda K., Amagai M., Nishikawa T. (2004). IgG binds todesmoglein 3 in desmosomes and causes a desmosomal split without keratin retraction in a pemphigus mouse model. J. Invest. Dermatol122, 1145-1153.

188. Shu E., Yamamoto Y., Aoyama Y., Kitajima Y. (2007). Intraperitoneal injection ofpemphigus vulgaris-IgG into mouse depletes epidermal keratinocytes of desmoglein 3 associated with generation of acantholysis. Arch. Dermatol. Res., 299,165-167.

189. Sinha E. (2005). Elevation of antigen specific CD8+ CD28- cells in newly remittentpatients with pemphigus vulgaris. J. Invest. Dermatol., 125,1084A.

190. Spaeth S., Riechers R., Borradori L., Zillikens D., Budinger L., Hertl M. (2001). IgG, IgAand IgE autoantibodies against the ectodomain of desmoglein 3 in active pemphigus vulgaris. Br. J. Dermatol., 144,1183-1188.

191. Stanley J. R. (1989). Pemphigus and pemphigoid as paradigms of organspecific,autoantibody-mediated diseases. J. Clin. Invest., 83, 1443-1448.

192. Stanley J. R., Koulu L., and Thivolet C. (1984). Distinction between epidermal antigensbinding pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus autoantibodies. J. Clin. Invest. 74,313-320.

193. Stanley J.R., Koulu L., Klaus-Kovtun V., Steinberg M.S. (1986). A monoclonal antibodyto the desmosomal glycoprotein desmoglein I binds the same polypeptide as human autoantibodies in pemphigus foliaceus. J. Immunol., 136, 1227-1230.

194. Syed S.E., Trinnaman B., Martin S., Major S., Hutchinson J., and Magee A.I. (2002).

195. Molecular interactions between desmosomal cadherins. Biochem. J., 362, 317-327.

196. Tamura K., Shan W.S., Hendrickson W.A., Colman D.R., Shapiro L. (1998). Structurefunction analysis of cell adhesion by neural (N-) cadherin. Neuron, 20. 1153-1163.

197. Torzecka J.D., Narbutt J., Sysa-Jedrzejowska A., Waszczykowska E., Lukamowicz J., Pas

198. H.H. (2003). Detection of pemphigus autoantibodies by IIF and ELISA tests in patients with pemphigus vulgaris and foliaceus and in healthy relatives. Med. Sci. Monit., 9, 528-533.

199. Troyanovsky R.B., Sokolov E. and Troyanovsky S.M. (2003). Adhesive and lateral Ecadherin dimers are mediated by the same interface. Mol. Cell Biol., 23, 7965-7972.

200. Tselepis C., Chidgey M., North A. and Garrod D. (1998). Desmosomal adhesion inhibitsinvasive behaviour. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 95, 8064-8069.

201. Tsunoda K., Ota T., Aoki M., Yamada T., Nagai T., Nakagawa T., Koyasu S., Nishikawa

202. T., Amagai M. (2003). Induction of pemphigus phenotype by a mouse monoclonal antibody against the amino-terminal adhesive interface of desmoglein 3. J. Immunol., 170,2170-2178.

203. Veldman C., Hohne A., Dieckmann D., Schuler G., and Hertl M. (2004). Type I regulatory

204. T cells specific for desmoglein 3 are more frequently detected in healthy individuals than in patients with pemphigus vulgaris. J. Immunol., 172, 6468-6475.

205. Vestweber D. and Kemler R. (1985). Identification of a putative cell adhesion domain ofuvomorulin. EMBOJ., 4, 3393-3398.

206. Wallach D. (1992). Intraepidermal IgA pustulosis. J. Am. Acad. Dermatol., 27, 993-1000.

207. Wallis S., Lloyd S., Wise I., Ireland G., Fleming T.P. and Garrod D.R. (2000). The aisoform of protein kinase C is involved in signaling the response of desmosomes to wounding in cultured epithelial cells. Mol. Biol. Cell, 11, 1077-1092.

208. Wang X., Bregegere F., Frusic-Zlotkin M., Feinmesser M., Michel B., Milner Y. (2004).

209. Possible apoptotic mechanism in epidermal cell acantholysis induced by pemphigus vulgaris autoimmunoglobulins. Apoptosis, 9, 131-143.

210. Warren S.J.R., Arteaga L.A., Rivitti E.A. (2003). The role of subclass switching in thepathogenic of endemic pemphigus foliaceus. J. Invest. Dermatol., 120, 1-5.

211. Waschke J., Bruggeman P., Baumgartner W., Zillikens D., Drenckhahn D. (2005).

212. Pemphigus foliaceus IgG causes dissociation of desmoglein 1-containing junctions without blocking desmoglein 1 transinteraction. J. Clin. Invest., 115,3157-3165.

213. Waschke J., Spindler V., Bruggeman P., Zillikens D., Schmidt G., Drenckhahn D. (2006).1.hibition of Rho A activity causes pemphigusskin blistering. J. Cell Biol., 175,721727.

214. Waschke J. (2008). The desmosome and pemphigus. Histochem Cell Biol., 130, 21-54.

215. Weiske J., Schoneberg T., Schroder W., HatzfeldM., Tauber R., Huber O. (2001) The fateof desmosomal proteins in apoptotic cells. J. Biol. Chem., 276, 41175—4118.

216. Whittock N. V. and Bower C. (2003). Genetic evidence for a novel human desmosomalcadherin desmoglein 4. J. Invest. Dermatol., 120, 523-530.

217. Williams E., Williams G., Gour B.J., Blaschuk O.W., and Doherty P. (2000). A novelfamily of cyclic peptide antagonists suggests that N-cadherin specificity is determined by amino acids that flank the HAV motif. J. Biol. Chem., 275, 4007-4012.

218. Williamson L., Raess N.A., Caldelari R., Zakher A., de Bruin A., Posthaus H. (2006).

219. Pemphigus vulgaris identifies plakoglobin as key suppressor of c-Myc in the skin. EMBOJ., 25, 3298—309.

220. Windoffer R., Borchert-Stuhltrager M., and Leube R. E. (2002). Desmosomes:interconnected calcium-dependent structures of remarkable stability with significant integral membrane protein turnover. J. Cell ScL, 115, 1717-1732.

221. Yamamoto Y., Aoyama Y., Shu E., Tsunoda K., Amagai M., and Kitajima Y. (2007).

222. Anti-desmoglein 3 (Dsg3) monoclonal antibodies deplete desmosomes of Dsg3 and differ in their Dsg3-depleting activities related to pathogenicity. J. Biol. Chem., 282, 17866-17876.

223. Yap A. S., Brieher W. M., Pruschy M., Gumbiner B. M. (1997). Lateral clustering of theadhesive ectodomain: a fundamental determinant of cadherin function. Cur. Biol., 1, 308-315.

224. Yeh S.W., Cavacini L.A., Bhol K.C., Lin M.S., Kumar M., Duval M., Posner M.R., and

225. Ahmed A.R. (2006). Pathogenic human monoclonal antibody against desmoglein 3. Clin. Immunol., 120, 68-75.

226. Yoshida K., Takae Y., Saito H., Oka H., Tanikawa A., Amagai M., Nishikawa T. (2005).

227. Cutaneous type pemphigus vulgaris: a rare clinical phenotype of pemphigus. J. Am. Acad. Dermatol. 52, 839-845.