Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние элементов внеклеточного матрикса на функциональную активность эпидермальных кератиноцитов в культуре и при заживлении кожных ран

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние элементов внеклеточного матрикса на функциональную активность эпидермальных кератиноцитов в культуре и при заживлении кожных ран"

На правах рукописи УДК 577.2.03 : 577.2.04 : 576.312.6 :576.3

ВЛИЯНИЕ ЭЛЕМЕНТОВ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ЭПИДЕРМАЛЬНЫХ КЕРАТИНОЦИТОВ В КУЛЬТУРЕ И ПРИ ЗАЖИВЛЕНИИ КОЖНЫХ РАН

03.00.25 — клеточная биология

А ВТОРЕФ ЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена в Отделе клеточных культур Института цитологии РАН, Санкт-Петербург.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор, Пинаев Георгий Петрович.

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Михельсон Виктор Михайлович,

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

кандидат медицинских наук Галибин Олег Всеволодович,

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова, Санкт-Петербург

Ведущее учреждение: Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского государственного университета, Санкт-Петербург.

Защита состоится » --/ 1996 г. в Л-* часов

на заседании Специализированного с(«шета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, С.-Петербург, Тихорецкий пр., дом 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан « . 1996 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета, ¿71 /

доктор биологических наук г ¡1 (/ССсе-й.^ л Писарева

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблеш. Одной; из актуальных проблем современной клеточной биологии является проблема взаимодействия клеток о внеклеточным матриксом. Внеклеточный матрикс -г это обобщающие название для высокомолекулярных биополимеров, которые находятся в межклеточном пространстве. Внеклеточный матрико выполняет две основные функции: опорную и регул'яторную. Он принимает участие в осуществлении межклеточных взаимодействий и в регуляции пролиферации и дифференцировки клеток In vivo и in vitro. Внеклеточный матрикс играет важную роль в самых разнообразных процессах! эмбриогенезе, регенерации, канцерогенезе и многих других.

Ярким примером того, как внеклеточный матрикс влияет на поведение клеток, является его взаимодействие о епидермальными клетками или кератиноцитами. Влияние елементов внеклеточного матрикса на кератиноциты интенсивно изучается в последние десятилетия. Хотя показано, что от внеклеточного матрикса могут зависеть как степень дифференцировки и пролиферации, так и миграционная способность кервтиноцитов (Bissel et al., 1993; Woodley et al., 1988), недостаточно полно исследована роль конкретных влементов матрикса в этих клеточных процессах. Кератиноциты принимают участие в таком важном процессе как регенерация кожной ткани, повтому вксперементальное исследование • влияния внеклеточного матрикса на поведение кератиноцитов необходимо для • понимания . сущности данного процесса, следовательно для решения связанных с ним практических задач, таких как заживление различных раЯ. Изучение механизмов действия отдельных элементов внеклеточного Матрикса на функционирование кератиноцитов необходимо для решения задач медицины, особенно при применении технологии клеточной инженерии для восстановления структурной и функциональной целостности кожного покрова. Несмотря на то, что в настоящее время продемонстрировано успешное применение выращенных в культуре клеточных пластов кератиноцитов для лечения обширных ожогов (Rheinwald, Oreen, 1977), этот метод требует дальнейшей оптимизации. Существует ряд ограничений в использовании культивируемых кератиноцитов для этой цели. Во-первых, как правило, пласт кератюющтор не успевает вырасти в культуре к тому сроку, когда нужно его

пересаживать. Во-вторых, клеточный плаох не всегда . приживается на ране из-за того, что клетки слабо прикрепляются к раневой поверхности. Процесс их приживления поэтому вдет слишком медленно, и в результате происходит отторжение трансплантата. В-третьих, после пересадки пласта очень долго вдет процесс регенерации кожи, в частности восстановление ее базальной мембраны. При заживлении трансплантируемые клетки должны обладать достаточным потенциалом для прикрепления к ране, размножения и- миграции по- ее поверхности и кроме того быть способными к дифференцировке и формированию полноценной ткани. В создании оптимальных условий, способствующих проявлению этих свойств, принимают участие факторы, которые влияют на микроокружение клеток при их трансплантации на раны. Важнейшим из них является внеклеточный матрикс.

Хотя ранее было исследовано участие различных элементов матрикса на разных этапах раневого . заживления (Gailit, Clark, 1994), не удалось обнаружить, как именно ^ вти влементы взаимодействуют с трансплантируемыми клетками и как влияют на их поведение. Более того, до настоящего времени не было предпринято даже' попыток одновременного внесения в рану культивируемых клеток и влементов внеклеточного матрикса. Исключением является использование отдельных белков в составе разнообразных "кожных эквивалентов" (Bell et al., 1981). К сожалению, На основе многолетних эмпирических попыток использовать разнообразные кожные эквиваленты, не сформировалось общего представления о том, какие именно элементы внеклеточного матрикса оказывают влияние на процесс восстановления поврежденной кожи.

В связи с втим в данной работе было предпринято систематическое исследование''' влияния ряда влементов внеклеточного матрикса на поведение кератиноцитов как при регенерации кожи in vivo, гак и при культивировании кератиноцитов in vitro. Подобные сравнительные исследования допустимо проводить только на лабораторных животных. Поэтому эксперименты выполняли на крысах, и, Соответственно, использовали культуру кератиноцитов крысы. / Культивируемые кератиноциты крысы являются удобной моделью для изучения влияния елементов внеклеточного матрикса на поседение клеток, так как все перечисленные выше ключевые клеточные функции, а именно: пролиферация, дифференцировка и миграционная активность клеток

моделируются in vitro.

Цель н задачи работы. Целью данной работы являлось изучение

влияния элементов внеклеточного матрикса на свойства

кератиноцитов, существенные для заживления ран.

Исходя из поставленной цели были сформулированы следующие

задачи:

I. Изучить влияние различных елементов внеклеточного матрикса, а

t

именно: коллагена I типа; матрикса, синтезированного фибробластами; матригеля и его фракций на поведение кератиноцитов новорожденных крыс в культуре. Для етого било необходимо» I. Изучить динамику культуры кератиноцитов новорожденных крыс. 2 Исследовать взаимодействие фидерных клеток и кератиноцитов в совместной культуре in vitro. 3. Исследовать в культуре влияние елементов внеклеточного матрикса на прикрепление и распластывание, псевдоподиальную активность и пролиферацию. А. Изучить влияние • различных елементов внеклеточного матрикса, а именно, коллагена I типа, матригеля и его фракций, а также фибробластов на заживление ран различных типов.

Научная.новизна я практическая значимость работы. Впервые при исследовании поведения . кератиноцитов новорожденных крыс в качестве подложки был йспользовай препарат матригеля, полученный из EHS-саркома мыши. Установлено, что скорость роста кератиноцитов пропорциональна концентрации матригеля.

Впервые выявлено, 4 что именно внеклеточный матрикс, наработанный фидерными клетками, положительно влияет на прикрепление, распластывание и пролиферацию культивируемых кератиноцитов новорожденных крыс.

Модифицирована методика стриппинга, которая широко используется на человеческих кератиноцитах (Васильев и др., 1993). Стришпшг кератиноцитов крыс можно использовать для тестирования пролиферативкой активности различных биологических' препаратов. В отличие от человеческих кератиноцитов сроки тестирования сокращаются.

Впервые установлено, что при использовании в качестве добавки в расщепленную рану матригель ускоряет ее впителизациго.

Впервые матригель был использован яри трансплантации суспензии аллогенных кератиноцитов на полнослойную рану. Установлено, что матригель способствует приживлению суспензии

адлогенных кератиноцитов на полнослойной райе. Повышение концентрации магригеля ускоряет приживление.

Данные, полученные в работе, имеют большое практическое значение для лечения различных типов поражения кожи. Полученные результаты позволят планировать применение елементов пнеклеточного матрикса в качестве лечебных средств для улучшения заживления ран. Использование элементов внеклеточного матрикса в качество доОапок irpw трансплантации кератиноцитов будет способствовать приживлению клеток на раневом ложе. Апробация работы. Результаты, изложенные в диссертационной работе, докладывались на симпозиуме " Epitheltal oeil biology" (Оксфорд, 1994), 4 конгрессе Европейского общества клеточной биологии (Прага, 1994), 8 конференции Международного общества дифференцировки (Хиросима, 19Э4), Конференции "Биология клетки в культуре" (С-Петербург, 1995), 4 Конгрессе Международного общества по ранениям (Тель-Авив, 1996).

Публикации. По теме диссертации имеется 14 публикаций, в .том числе 3 статьи. , ///¡г

Структура И обЬеи диссертации. Диссертация изложена на ' %-У страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, експериментальной части, обсуждения результатов я выводов. Список литературы содержит / J>(/ источников.

Материалы и метода.

I. Получение первичных культур кератиноцитов новорожденных крыс.

Эпидермалыше кератиноциты выделяли из кожи новорожденных крысят в возрасте 2-4 суток по методу РеЙнвальда (Reinwald, 1980). Кожу нарезали на мелкие <.,, фрагменты размером 5-10 мм, которые помещали в 0,5$ раствор диспазы (Boehringer Hanheim GraBH) и инкубировали при 37°С в течение I часа.' Затем кусочки переносили в солевой фосфатно-буфервдй раствор PBS по Дульбекко и эпидермис отделяли пинцетом от дермы по линии бвзальной мембраны. Выделенный эпидермис инкубировали в 0,125$ растворе трипсина в течение 10-15 мин при перемешивании со/ скоростью 50 об/мин. После окончания трипсинизацки фермент / инактивировали добавлением 5Я5 эмбриональной сыворот1си. Полученную в результате шшетирования суспензию клеток фильтровали через нейлоновый газ. Затем клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин и

культивировали в ростовой среде ФАД, включающей в себя смесь сред DMEM И F12 в соотношении 3:1, с добавлением 10% ембриональной сыворотки теленка, 5 мкг/мл бычьего инсулина (Sigma), 0,6 ыкг/мл гидрокортизона гемисукцината (Sigma), Ю нг/мл впидермального фактора роста (Институт цитологии РАН).

В качестве фидерных клеток использовали вмбриональные фиброблаоты кожи человека, которые выделяли из абортивного материала. Кусочки кожи переносили в 0,25* раствор трипсина на 16 часов в холодильник при температуре +-4°С, затем вти же кусочки кожи-в свежем 0,25% растворе трипсина помещали на магнитную мешалку при +37°С на 30 минут. После этого полученную смесь Пилотировали 10 раз й пропускали через нейлоновый газ. Клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин и культивировали в ростовой среде DMEM о 1056 сыворотки крупного рогатого скота.

2, Получение элементов внеклеточного ыатрякса.

В работе были использованы следующие элементы внеклеточного матрикса: коллаген I типа; внеклеточный матрикс, наработанный фидерный клетками, и матригель - препарат, содержащий олемонты впителиальной базальной мембраны. Коллаген I типа из хвостов крыс получали по методу Вутковского (Butkoweky et al., 1902).

Внеклеточный матрикс, наработанный фидерными клетками, получали следующим образом: монослой фибробластов, образовавшийся после 15 суток культивирования, удаляли обработкой в течение 40 мин прй 37°С 0,5 ММ раствором ЭГТА Полное очищение поверхности от клеток контролировали на светооптическом уровне.

Препарат Матригель получали из EHS-саркомы мыши по стандартной методике (Kleinmann et al., 1986). Кроме матригеля полного состава получали его. фракции путем осаждения 20% раствором сульфата аммоййя (Taub et al., 1990). Осадок белкоп представлял собой фракцию I» а суяернатант - фракцию 2. Электрофорез белков матрйгеля проводили в Ь% тшгякриамидном геле (Laemli, 1970). Содержание уроновнх кислот в препаратах матригеля определяли при помощи цветной реакции о карбазолом по методу Вйттера и Мшр (Bitter, Muir, 1962). Содержание коллагена в пробах матригеля и его фракций определяли по • реакции ия оксипролин (Bergman, Loxley, 19f>3).

3. Исследование кератиновдтов в культуре.

Клетки с плотностью 2x10'* ' кл . высевали и?» помещенные п

культурольную чашку Петри диаметром 40 мм чистые покровные стекла, или на стекла, обработанные елементами внеклеточного матрикса: 0,1% раствором коллагена I типа из крысиных xboctobj матригелем в концентрации 200 мкг/мл ; фракциями матригеля I и 2 в концентрации 200 мкг/мл;, внеклеточным матриксом, синтезированным фибробластами.

Анализ псевдоподиалыюй ■ активности проводили по модифицированному нами методу Albrecht-Buehler (Albreoht-Buehler, 1977). Вместо коллоидного золота использовали латексные шарики диаметром 0.8 мкм (Sigma). Покровные стекла обрабатывали исследуемыми элементами внеклеточного матрикса, затем на стекла наносили густую суспензию латексных шариков, предварительно гомогенизированную ультразвуком в точение 10 сек. Посла аккуратной промывки избытком воды стекла помещали в чашки, к на них высевали кератнноциты в полной среде PAD с 10% сыворотки. В ряде опытов через d часа после посева среду с сывороткой заменяли на среду без сыворотки. Спустя 17 часов культивирования стекла с клетками промывали, фиксировали i.% растйором формалина и фотографагровали в темном поле.

Анализ прикрепления и роста кератиноцитов проводили по методике Джиллеса (Gillea et al., 19в6). После окраски клеток 0,1% раствором кристалл-виолега и солюбилизацин краски оптическую плотность раствора измеряли на приборе Sumal (Karl Zeif?B Jena) при длине волны 590 нм.

Стршшинг йультур кератиноцитов проводили по методу Енсена и Болувда (Jensen, Bolund, 1988).

4. Анализ влияния элементов внеклеточного матрикса на закивленяе глубоких ран при пересадке на них аллогеннйх кератиноцитов.

Все эксперименты по анализу заживления кожных ран проводились совместно с к.м.н. Б.А. Парамоновым (Кафедра термических поражений Военно- Медицинской Академии, Санкт-Петербург). Анестезию осуществляли посредством внутримышечного введения смеси каллипсола и дроперидола. Животное фиксировали к станку, после чего сбривали шерсть на спине. Обработку операционного поля производили Ь% спирт-иодным раствором и спиртом, после чего закрывали стерильными марлевыми салфетками. Циркулярно иссекали кожу и фасцию, покрывающую мышцу, в области нижней трети спины. К дну раны пришивали пластиковое кольцо диаметром 1,5 см. Второе кольцо пришивали к

краям раны для предотвращения контракции кожи.

В контрольной серии опытов на подготовленную рану производили трансплантацию первичной суспензии кератиноцитов,

5

полученной как описано в п.1, с плотностью 4x10 клеток в 0,3 мл буфера IBS на рану. В опытных вариантах смешивали клетки в 0,1 мл РВЗ с коллагеном I типа (0,2 мл 0,1% раствора), матригелем (0^3 мл раствора в концентрации 200 мкг/мл), фракциями матригеля I и 2 (0,2 мл раствора в концентрации 200 мкг/мл) и с суспензией аллогенных фиброблвстов (I05 клеток на рану) и полученные смеси клеток с элементами внеклеточного матрикса наносили на раны, которые покрывали тремя слоями парафинизированного раневого покрытия "Paranet" и накладывали стерильный марлевый шарик, фиксированный посредством завязывания над ним концов лигатур. Для профилактики загрязнения раны поверх марлевого шарика пришивали 6-8 слойную марлевую салфетку. Внутримышечно вводили 50'ООО единиц бициллина-5. Забор биоптатов производили на 4,7 и 14-е сутки после трансплантации. Для изучения методами световой й электронной микроскопа бяоптаты фиксировали в 0,25$ растворе глютарового альдегида (ВВП). 5. Анализ загзюдеяай раацеплешшх рем.

Эксперименты с расщепленными кожными ранами проводили на крысах с анестезией. После депиляция с помощью дерматома ДПЭ-30 срезали расщепленные кожные лоскуты толщиной 0,2 мм. Глубина срезания кожи в различных участках раны была неодинаковой, более поверхностной по краям. Площадь ран составляла 2-Зсм'. Испытуемые препараты наносили только на раны, в которых глубина срезания в центральной части была равномерной. - На раневые поверхности в опытных вариантах наносили суспензию аллогетгах фибробластов в культуральной среде (3 мл среда, содержащей в различных грушах наблюдения oí 0,72 до 4,2 млн. клеток), кондиционированную среду без клеток, коллаген I типа (О.ЦЕраствор) и матрйгелЬ (200 мкг/мл), и покрывали их повязками.

Результаты.

I. Исследование динааики культур« кератиноцитов новорожденных крыс.

Для определения влияния элементов внеклеточного матрикса но поведение клеток было необходимо выяснить, как и в кякио времешгае интервалы происходит пролиферация и • дифференцировка

керотииоцитов крыс в культуре. Поскольку при ферментативной обработке эпидермиса в суспензию переходят не только баэалыше клетки, но и кератиноциты, находящиеся на разных етапах дм$ференцировки, только часть выделенных клеток давала начало последующей культуре. С помощью методов электронной микроскопии было обнаружено, что одиночные клетки имеют характеристики поврежденных клеток, тогда как в агрегатах клетки имели нормальную морфологию.

При помещении клеток в среду с нормальным содержанием кальция (1,8 мМ) они прикрепляются' и распластываются в виде агрегатов. По мере культивирования происходит образование супрзбазальных слоев дифференцирующихся клеток. Прикрепление агрегатов происходит сравнительно медленно и зависит от плотности суспензии. При плотности 100 тысяч клеток на чашку около ЗОЯ агрегатов прикрепляется за первые 24 часа, а за следующие 24 часа прикрепляется до Ъ0% от исходного количества агрегатов в суспензии керагиноцитов. В процессе культивирования происходит образование пласта дифференцированных клеток. На поперечном срезе пласта видны по крайней мере' три слоя клеток: базальный, промежуточный и верхний. Слои клеток не примыкают плотно друг к другу, между ними остается просвет. Клетки контактируют между собой микроворскнками, как внутри слоя, так и между слоями.

В бессывороточной среде с пониженным содержанием кальция (0,1 мМ) межклеточные контакты кератиноцитов нарушаются, и колонии распадаются на отдельные клетки. По мере культивирования количество клеток увеличивается, и образуется монослой кератиноцитов, подобный тому, который характерен для большинства постоянных клеточных линий.

Для сравнения характеристик пролиферации клеток На фоне слабой дифференцкровки и в условиях сильно выраженной дифференцировки культивирование клеток проводили также в среде с сывороткой и высоким содержанием кальция. Для; обеспечения стандартных условий эксперимента многослойную культуру подвергали стриппингу, в результате чего происходило отделение дифференцированных клеток, и на субстрате оставался только слой базалыш! клеток. После последующего перевода клеток на полную среду происходила вторичная стратификация культуры и внешний ее вид был такой же, как до стрипгпшга.

2. Характеристика элементов внеклеточного матрикса, использованных в работе.

Данные электрофореза в полиакриламидном геле показали (Рис.

1, а), что препарат матригеля, полученный нами, состоит из 6 мажорных белковых полоо. Наиболее высокомолекулярная полоса, расположенная в концентрирующем геле, судя по литературным данным, соответствует протеогликанаи. Ниже, на уровне 440 кД и жд кД, расположены две полосы, предположительно большой и малой цепей ламинина. Полосы, расположенные на уровне 158 кД и 80 кД, совпадают по молекулярным массам с ентактином и нидогеном. Матригель содержит, помимо элементов базальпой мембраны, еще и низкомолекулярные факторы. Для того, чтобы отделить результаты действия высокомолекулярных влементов от дополнительного эффекта низкомолекулярных факторов на рост и дифференцировку клеток в культуре, матригель фракционировали, удалив из пего ннэкомолекулярные составляющие. На електрофореграмме дорожка, соответствующая фракции I, т.е. осадку после осаждения матригеля 20% раствором сульфата аммония, содержит практически весь набор полос, характерный для матригеля. В то же время дорожка фраго^ии

2, супернатанта после высаживания матригеля, лишена полос 158 кД и 80 кД, соответствущих предположительно внтактопгу и нидогену.

. Ввиду того, что выявить коллаген ГУ типа яа электрофореграммах оказалось невозможным, его содержание в препаратах разных фракций матригеля определяли' по сравнительному .анализу количества окештролша. Важной составляющей протеогликанов, которые содержатся в матригеле, являются гтолисахаридные цепи (гликозаминогликанн). Выявить их на електорофореграммах было также невозможно. Поэтому содержание гликозбаминогликанов определяли по количеству уронолых кислот как их маркера. На основании данных, приведенных в тяг!лице I, можно сделать вывод о том, что Фракция I отличается от полного матригеля более высоким содержанием коллагена IV типа и низким содержанием полисахаридной составляющей ттротеоглшеанол. Фракция 3 содержит наибольшее количество уроногшх кислот . " пэ1"мпщ.тог> - коллагена IV типа.

Табл.1. Биохимический анализ матригеля и его фракций.

наименование препарата коллаген IV уроновые кислоты (мкг /мг белка)

матригель 25-1,5 8,3^0,8

фракция I 57-6,0 2,4-0,2

фракция 2 14-1,1 90,5-9,0

266 255

133« 122«

205« 115 <

85 » 4П

Рис.1. Схематическое изображение данных електорофоретического анализа элементов внеклеточного матрикса, использованных в работе.

а) лолный матригель - дорожка 2; фракция I - дорога I; фракция 2 - дорожка 3. Гель - 5Я ПААГ.

б) матрикс, синтезированный фибробластами. Гель - &% ПААГ.

На електрофореграыме препарата влемонтов внеклеточного матрикса фибробластов можно различить шесть мажорных полос (Рис. I, б). Используя маркеры молекулярного веоа, мы установили, что полосы предположительно соответствуют белкам с молекулярными массами: 210, 120, 93, 78, 63 и 47 кД. Вероятно, верхняя полоса может соответствовать либо фибронектину, либо ламинину. По литературным данным известно, что фибронектина они синтезируют больше, чем ламинина, и вероятнее всего вта полоса принадлежит именно фибронектину. Сравнивая електрофореграммы матригеля и матрикса фибробластов, можно сделать вывод, что оба матрикса различаются по белковому составу, и могут оказывать различное действие на поведение кератиноцитов.

3.Исследование влияния элеиентов внеклеточного ыатриксэ на поведение кератиноцитов 1Л vitro.

• Степень прикрепления клеток к ' различным субстратам оценивали по количеству клеток, оставшихся на субстрате после перевода культуры из среды о высоким содержанием кальция в низкокальциевую среду. Число прикрепившихся клеток, которое Подсчитывали после окрашивания их кристаллическим фиолетовым, зависит от состава элементов внеклеточного матрикса на субстрате, При условии, что они нанесены в равной концентраций. К фйбробласТНому матриксу прикрепляется клеток в 2 раза больше, чем к «ластику в контрольном варианте. Коллагей также усиливает .адгезии кератйноЦйТоН почти в 2 раза по сравнению с контролем, в то время, Как фракций 2 Матригеля ослабляет ее примерно в 1,4 раза. Полный некойцеятрировашшй матригель й фракция I матригеля не йлйяют На адгезию кератиноцитов. На Матригеле с самой высокой концентрацией число прикреййййгйХся клеток в 1,33 раза больше, чем на матригеле с концентрацией 200 мкг/мл я в 1,26 раз больше, чем на матрйгеле с концентрацией 4 мг/мл. Таким образом, к самым адгезивным относятся! Матрикс, синтезированный фйбробластами, и коллаген.

При наблюдений за процессом распластывания кератиноцитов можно было вйДеть, что круглые прикрепившиеся, клетки вначале образуют Нитевидные выросты мембраны - фйлоподии. Далее, если процесс распластывания прогрессировал, происходило образование широкой плоской ■ ламеллы по краю клетки. Соответственно происходило и преобразование актитгового цитоокелета. Изучал

процесс распластывания кератиноцитов на субстратах, покрытых рлементами внеклеточного матрикса, мы оценивали -■ степень распластывания по характеру образующихся выростов. Фнлоподиальный тип, по нашему мнению, характеризовал низкую степень распластывания, а формирование ламеллоподий свидетельствовало о более плотном контакте клетки с подложкой.

При культивировашм в среде с низким содержанием кальция было обнаружено, что на субстрате, содержащем коллаген I тина, сти шштелиалыше клетки не образовывали компактных колоний, характерных для них при распластывании на стекле. Клетки, растущие на коллагене I типа, имели большие" радиальные филоподии, интенсивно окрашиваемые родамин-фаллоидяном, а у клеток на стекле наблюдались кортикальные пучки актина и небольшие филоподют. При культивировании в высококальциевой сроде практически все клетки на коллагене I типа тоже содержат филоподии. Это говорит о том, что характер распластывания кератиноцитов на коллагене сохраняется независимо от содержания, кальция в среде.

У кератиноцитов, растущих в среде с высокой концентрацией кальция на субстрате о фидерными клетками, через 17-18 часов после посева происходит образование ламеллоподий, фибриллярный актин распределяется по краю ламеллоподии. При отсутствии фидерных клеток у кератиноцитов образуются филоподии, видны актиновые пучки, которые составляют основу, филоподии, а краевого распределения актина не наблюдается. Дополнительные эксперименты показали, что именно внеклеточный матрикс, наработанный фидерными клетками, а не кондиционированная ими среда был необходим керагшгоцитам для более полного распластывания. В дальнейших экспериментах по исследованию роли фидерных клеток в регуляции клеточных процессов кератиноцитов был использован матрикс, наработанный втими клетками.

Окраска родамин-фаллоидином показала, что па полном матригеле также, как и на фибробластиом матриксе, актин у краевых клеток колоний кератиноцитов распределяется по краю ламеллоподии. В отличие от полного матригеля фракция 2 , использованная в качестве подложки, не вызывает образование ламеллоподий у краевых клеток колоний. У 50% краевых кератиноцитов образуются филоподии, остальные клетки на . данном етягге не образуют ни ламеллоподий, ни филоподий.

Подводя итог результатам по прикреплению и распластыванию клеток, мы пришли к заключению, что наибольшей адгезивностью обладают коллаген I типа, матригель в концентрации 8 мг/мл и метрике, синтезированный фибробластами. При етом, однако, клетки, хорошо прикрепившиеся к коллагеновому субстрату, тем не менее довольно плохо распластываются. Напротив, распластывание идет быстро и наиболее эффективно на субстратах, покрытых матригелем н матрикссм, синтезированным фибробластами.

Представляло интерес сопоставить данные по распластыванию с миграционной способностью кератиноцитов, культивируемых на разных субстратах. Оценку псевдоподиальной активности кератиноцитоп проводили о использованием латексных шариков. Клетки, активно формирующие выросты мембраны, способны поглощать шарики, очищая определенную площадь поверхности вокруг себя. Подсчитав площадь, очищаемую от шариков, можно оценить псевдоподиальную активность клеток. Независимо от количества кальция в среде площадь поверхности, очищенной клетками на коллагене I типа, в два раза больше, чем на других субстратах, а именно: на стекле, матриксе, наработанном фибробластами, матригеле (Рис. 2). Клетки на фракции 2 матригеля очищают в 2-3 раза меньше поверхности по сравнению с клетками на стекле. Таким образом, на субстратах, где образуется более плотный контакт с подложкой, миграция кератиноцитов минимальна. Напротив, при слабом характере взаимодействия филоподиального типа, как, например, на коллагене I типа, клетки демонстрируют повышенную способность к миграции. В том случае, когда субстрат вообще не способствует ни' прикреплению, ни распластыванию клеток, миграционной активности практически не обнаруживается.

Влияние элементов внеклеточного матрикса на пролиферацию

3

клеток оценивали по включению Н-тимидина, которое измеряли через сутки после перевода клеток на низкокальциевую среду. Как видно на рис. 3, в данных условиях только фракция 2 матригеля

•а

резко снижает включение Н-тимидина в клетки по сравнению с контролем. Включение метки на полном матригеле в низкой концентрации остается на уровне контроля, а на фракции I

16 14 12 10 8 6 4 2 0

усл. ед.

колл! к м.ф. матр фр 2

Н 1.8 тМ Са Ш 0.1 тМ Са

Рио. 2. Площадь« очищенная от шариков кератиноцитами, распластанными на различных субстратах при различны* концентрациях кальция в среде. КОЛЛ1 - коллаген I типа; К -субстрат без покрытия матриксом; М.ф. - матрйкс от фибробластов; матр - матригель; Фр2 - фракция 2 матригеля.

включение 3Н-тимидина немного ' превышает контрольное. В присутствии На субстрате коллагена X типа н Матрикса от фиброблаотой наблюдается сильная стимуляция включения %-тимидийа.. Включение радиоактивной метки в кератиноциты пропорционально концентрации матригеля В диапазоне 0,2-8 мг/л. Можно сделать- вывод, что Коллаген I типа, матрико, синтезированный фибробластами, и матригель в концентрации 8 мг/мл сильно стимулируют включение кератиноцитами радиоактивной метки. В то ке время фракция 2 матригеля сильно ингибирует етот процесс.

При сравнении етих результатов с данными, полученными на модели стриппинга, когда одновременно с пролиферацией происходит дифференцировка клеток, оказалось,что, в клетки, растущие на фракции 2 матригеля, на протяжение всего сроки исследования (1-3 суток) включалось Меньше тимидина, чем в контроле. Различие было Наибольшим.через двое суток после перевода клеток на среду с кальцием. В клетках, растущих на ; других матриксах, этот показатель оставался все время на уровне контроля. Понижение

Учетная карточка диссертация

Фамилия, имя, отчество Горелик Юлия Владиславовна

Название диссертации Влияние элементов внеклеточного матрикса на функциональную активность эпинет)-мальных кератиноцитов в" кул! туре и при заживлении коташ ран. 1 Дата защиты д^ IX , 15

Язык диссертации Русский

Ученая степень, отрасль науки Шифр специальной, ''й)

Кандидат наук Вмплппля 03.00.25 Ктгрфпт7НЯЯ ^тлп тсп-пма

! V-- V-. А Л'-' » ^ » * и / • А I 1 1 ^ ^^ Д'..^ к 1 *

шя элементов внеклеточного .матрикса на свойства, сератиноцитов, существенные для заживления.кожных )ан В работе "установлено, что коллаген I типа стимулирует прикрепление, псевдоподиальную активность кератиноцитов, а синтезируемый фибробластами мат-шкс и матригель - также и их.распластывание. Мат->игель оказался при этом наиболее эффективным сти-!улятором заживления.. Препарат матригель, получений из мышиной саркомы и содержащий элементы базарной мембраны, был впервые использован в настоящей )аботе в качестве подложки для культивирования ке-)атиноцитов. Показано, что скорость роста кератиноцитов пропорциональна концентрации матригеля, Моди-ииирована методика стриппинга. Стриппинг кератино-итов крыс можно исполь овать ля тестирования про-иферативной а,ктивности различных биологических репаратов Научная.новизна играктичаовая значимост аботы состоит в том, что она содержит новую инфор-а.ци'з о влиянии элементов внеклеточного матрикса ак на пове-ение кератиноцитов в культуре, так и х а. загивление кожных ран

350 200 150 100 50 0

2.5 2

1.6 1

0.5 0

3

кол! м.ф- матр фр1 фр2 к

П Кпр

вкл. тимидина

Рис. 3. Включение меченого тимидина {% от контроля) и коэффициент прироста клеток (Кпр) Кератиноцитов на различных субстратах в низкокальциевой среде: КОЯ1 - коллаген I типа; М.ф. - матрикс, наработанный фибробластамй; Матр - матригель; фр1 -фракция I матригеля} фр2 - фракция 2 матригеля; К - субстрат без покрытия матриксом.

включения метки в кератиноциты, растущие на субстрате с фракцией 2 матригеля, возможно объясняется тем, что клетки с наиболее высоким проляферативннм потенциалом , являются наименее адгезивными и удаляются из культуры в результате стриппинга. В пользу етого свидетельствует тот факт, Что прикрепление клеток к данному субстрату понижено. . С другой стороны» можно предположить^ что какие-то факторы, присутствующие в втой фракции матригеля, подавляют пролиферацию кератийоЦитов. Результаты, полученные на двух моделях, совпадают в значительной степени. Различия могут зависеть от того, что в стрйппинговой Модели одновременно с пролиферацией в высококальциевой среде может идти и дифференцировка.

Так как включение Н-тимидина клетками отражает только наличие синтеза ДНК и не дает полную информацию о процессе пролиферации, мы оценивали прирост клеток на разных субстратах как производное от деления числа клеток, выросших за двое суток на данном субстрате, на число клеток в начальной точке. За начальную точку приняли срок через 17 часов после перевода

мг/мл

йй Кпр ШШ вкл. тимидина

Рис. 4. Зависимость включения меченого тимидина (имп/мйн) и коэффициента прироста клеток (Кпр) от концентрации матригеля (мг/мл).

культур на среду с низким содержанием кальция. Самый высокий коэффициент прироста оказался у клеток, росши* на коллагене I типа, несмотря на то, что в начальной точке на данном субстрате было в 2 раза больше кератиноцитов, чем в контроле. На матриксе, наработанном фибробластами, коэффициент прироста клеток повышался незначительно. ' Прирост клеток на матригеле пропорционален его концентрации в диапазоне 0,3 - 8 мг/мл. Коэффициент прироста у клеток, которые росли на фракции 2 матригеля, существенно ниже контроля. Интересно, что фракция I, практически не влияющая на прикрепление клеток, имеет ростовой коэффициент, который превышает контрольный почти в 1,2 раза, что говорит о стимулиругапем влиянии етой фракции на рост кератиноцитов, однако »та стимуляция меньше, чем у коллагена.

Из полученных результатов можно сделать вывод, что наиболее положительное влияние на рост кератиноцитов оказывают коллаген I типа, мятрикс, синтезированный фибробластами, матригель в внсоко'й концентрации и ого фракция I. Фракция 2 матригеля ингябирует етот процесс, Хотя коллаген и матреткс, иарпботашшй

фиброблаотами, стимулируют рост кератиноцитов в низкоквльциевой среде, вта стимуляция ниже, чем стимуляция ими включения радиоактивной метки. Вероятно, в этом случав определенная часть клеток вошла в Б фазу, но еще не успела поделиться. Поэтому у клеток на данных субстратах ростовой коэффициент увеличен не так сильно, как включение метки.

4. Анализ влияния элементов внеклеточного натрихса на заживление ран.

Результаты исследований, полученных на культуре клеток, приводят к предположению, что элементы внеклеточного матрикса могут оказывать существенное стимулирующее действие на процесс заживления кожных ран. Для того, чтобы проверить это и определить прогностическую ценность полученных данных, было изучено действие тех же элементов внеклеточного матрикса при внесении их в неглубокие расщепленные и глубокие полнослойные раны.

Полнослойная рана является аналогом глубокой раны большой площади, которая обраэутся при тяжелых ожогах и травмах. При этом собственные краевые клетки неповрежденной кожи не способны принять участие в восстановлении кожного покрова. Поэтому в случаях глубоких ран необходимо использовать трансплантацию клеток для восстановления кожного покрова. Чтобы приблизить условия в моделированной полнослойной ране к ' условиям глубокой раны большой площади, влияние собственных клеток раны на процесс раневого заживления было исключено ограничением краев раны пластиковыми кольцами. Модель полнослойной раны, разработанная нами, является промежуточной ступенью при переходе от культуры клеток к расщепленной ране. Если в культуре кератиноцитов оценивалось влияние элементов внеклеточного Матрикса в виде подложки для культивирования, то в полнослойной ране оценивался совместный эффект внесенных элементов внеклеточного Матрикса и трансплантируемых кератиноцитов.

В отличие от человеческих крысиные кератиноциты образуют очень непрочный пласт клеток, который разрушается при снятии его с подложки после обработки диспазой. Поэтому в наших экспериментах для трансплантации на полнослойную рану использовали не пласт кератиноцитов, а их суспензию. Успех заживления полнослойных ран определяется прежде всего тем, насколько хорошо прикрепляются к мышечному ложу, распластываются

на нем и размножаются трансплантируемые кератиноциты._ На основании данных, полученных в експериментах in vitro, можно было ожидать, что наибольший аффект окажут матригель в высокой концентрации, фракция матригеля I и метрике, наработанный фибробластами. Наоборот, фракция матригеля 2 будет замедлять приживление трансплантируемых кератиноцитов ко дну раны. Что касается коллагена I типа и неконцентрированного матригеля, то прогноз затруднен. Это связано о тем, что хотя коллаген I типа положительно влияет на прикрепление клеток in vitro к на их рост, распластываются кератиноциты на коллагеновом субстрате не так быстро, как на других исследованных подложках. Матригель в низкой концентрации, наоборот, положительно влияет на (распластывание клеток, но не оказывает эффекта на прикрепление в рост.

Табл. 3. Влияние элементов внеклеточного метрикеа на приживление аллогеюшх кератиноцитов на полнослойные раны.

условия опыта число животных число животных у которых зафиксировано приживление на 14-е сутки

без матрикса (контроль) 18 3

матригель полный 24 22

матригель фракция I 10 8

матригель фракция 2 II I

фибробласты 8 8

коллаген I типа 9 0

Элементы внеклеточного матрикса и суспензию фибробластов вместо используемого в экспериментах in vitro наработанного ими йатрикса добавляли на райу вместе с суспензией кератиноцитов. В случае приживления суспензии на ране образуется тонкий слой эпидермиса, - тогда как при отсутствии приживления раневое ложе остается непокрытым. Результаты проведенных экспериментов (Табл.3) показали, что полный матригель, фибробласты и фракция I

матригеля действительно способствуют приживлению, тогда как при отсутствии олементов внеклеточного матрикса приживление краййе низкое. При внесении в рану фракции 2 матригеля приживление клеток было обнаружено лишь в одном случае из II. В случае использования коллагена I типа приживление не происходило.

Позитйзное действие матригеля на приживление аллогенных кератиноцитов зависит от количества внесенного в рану матригеля. Увеличение концентрации добавленного матригеля ускоряет процесс прижявлешя клеток. Повышение концентрации матригеля от 200 мкг/мл до 8 Fir/мл приводило к двукратному сокращению срока приживления клеток {от 7 до 4 суток).

На гистологических препаратах биопсийного материала, взятого зз контрольных ран, было обнаружено два различных слоя: нижний является мышечным ложем, верхний - грануляционной тканью. Грануляционная ткань сформирована фибробластами и инфильтрована макрофагами. Кератиноциты в ране отсутствуют. На препаратах биопсий из ран, в которых произошло приживление кератиноцитов, над мышечной тканью наблюдается масса клеток, по своему виду напоминающих кератиноциты. У них округлая форма, большое ядро и светлая цитоплазма. Однако, характерной гистологической структуры многослойного эпителия не наблюдается, встречаются только образования, напоминающие сфероиды или трубки. При исследовании Сиоптатов посредством просвечиващей электронной микроскопии установлено, что в состав неоепидермиса входят клетки, схожие по своей структуре с кератиноцитами в суспензии. Эти клетки имеют сильно развитый ендоплазматический ретикулум, вакуоли и тонофиламенты.

Как и предполагалось, данные, полученные in vivo, коррелировали с результатами опытов на культурах кератиноцитов. Так, фракция 2 матригеля, которая ингибирует прикрепление, распластывание и рост кератиноцитов in vitro, не способствует ' приживлению кератиноцитов. Напротив, фракция I матригеля, положительно действующая на ети процессы в культуре, положительно влияет и на приживление суспензии клеток ко дну раны. Повышение концентрации матригеля, которое способствует прикреплению и росту клеток в культуре, также ускоряет процесс . приживления кератиноцитов на полнослойной ране. Такая же корреляция наблюдалась и при использования фидерных клеток. Однако, коллаген I типа не способствовал приживлению.

Следующая серия ексиериментов была поставлена на расщепленных ранах. Расщепленная рана является аналогом неглубокой раны небольшой площади. В такой ране остаются неповрежденными сосочки епидермиса. Из них и о краев раны могут мигрировать собственные клетки раны, которые будут участвовать в заживлении. Элементы внеклеточного матрикса могут только ускорять или замедлять данный процесс. Вероятно, что помимо вышеописанных клеточных процессов, для такого типа раны будет иметь значение подвижность клеток, которая в культуре оценивалась по псевдоподиальной активности. Поэтому ожидалось, что кроме концентрированного матригеля, и фибробластов, коллаген I типа также должен ускорять заживление расщепленной раны.

На неглубокие расщепленные раны кератиноциты ие пересаживали, а в качестве добавок для улучшения заживления наносили коллаген I типа, матригель, суспензию фибробластов,

Табл. 4. Влияние елементов внеклеточного матрикса на' сроки епителизации расщепленных ран.

Условия опыта число животных сроки епителизации

(сут)

V

I.Контроль 46 ; 8-10

2.Культуральная среда

ЮМЕМ 10

.3.Кондиционированная.

фибробластами ростовая

среда ВМЕМ 33

4.Суспензия фибробластов 40

5.Коллаген I типа 13

6.Матригель 24

7-9

7-9 3=4 5=7

культуральную среду ДМЕМ и кондиционированную фибробластами среду ДМЕМ. Установили, что трансплантация взвеси фибробластов, и аппликация матригеля существенно ускоряют эпителизацию ран. При гистологическом исследовании биоптатов показано, что впидермис на ранах, где пересаживали суспензию фибробластов, имел большее количество слоев клеток и выглядел более 'зрелым по сравнению с ранами, где не было никаких добавок. Скорость епителизации ран

не зависела от количества пересаженных на раневые поверхности фибробластов. В наших экспериментах количество пересаженных фибробластов колебалось от .0,72 до 4,2 млн клеток на рану, и какой-либо разницы в заживлении не было отмечено. Ускорения эпителизации ран при аппликации кондиционированной в процессе культивирования фибробластов среда не происходило (Табл. i).

В опытах с расщепленными ранами показано, что матригель ускоряет эпителизацию раны. В группе животных, которым не вносили в рану матригель, заживление шло 7-10 суток, тогда как в группе животных, которым производили аппликация метрителя в раны, эпителизация наступала на 3-4 сутки (Табл. 4).

Ускоренное по сравнению с контролем восстановление впидермиса происходило также и в результате применения коллагена I типа, однако с меньшей скоростью, чем в случае с полным матригелем и фибробластами (табл. 4). Коллаген I типа, который стимулирует пеевдоподиальную активность кератиноцитов и ростовые процессы In vitro, также ускоряет эпителизацию расщепленных ран. Матригель в использованной нами концентрации стимулирует размножение кератиноцитов в культуре и ускоряет восстановление кожного покрова в неглубоких ранах. Фибробласты, матрикс от которых усиливает пролиферацию кератиноцитов в культуре, также значительно ускоряют заживление расщепленных ран.

Таким образом, видна строгая корреляция результатов, полученных in vitro и in vivo, что позволяет данные, полученные в культуре, использовать для прогнозирования действия различных элементов внеклеточного матрикса в процессе заживления расщепленных ран. '

Подводя итог, можно сделать следующее заключение. Культура кератиноцитов может использоваться для Прогнозирования поведения клеток в ране в процессе регенераций кожи. Из всех исследованных в настоящей работе элементов внеклеточного матрикса наиболее перспективным является матригель, который продемонстрировал наибольшее стимулирующее действие на рост клеток в культуре и на заживление ран. Вместе с тем, в случае неглубоких поражений кожи, в частности ожогов легких степеней, когда заживление идет за счет краевой миграции, в качестве добавок для ускорения эпителизации можно использовать и другие элементы, которые способствуют миграции и пролиферации клеток, например, коллаген I типа. Однако, в случае глубоких поражений

кожи, даже при добавлении внеклеточного матрикса одновременно о трансплантацией ' в рану суспензии кератиноцитов полной дифференцировки клеток и образования полноценного пласта не происходит. Процесс дифференцировки клеток занимает длительное время после завершения впителизации раны. Скорее всего после начального этапа прикрепления клеток и их пролиферации необходимо дополнительно вносить в рану другие элементы внеклеточного матрикса, способствующие дифференцкровке кератиноцитов. Сейчао трудно сказать, какие именно элементы окажутся перспективными о втой точки зрения и в какой последовательностя их нужно вносить. Возможно, что вто будут вещества, синтезируемые фибробластами, поскольку в присутствии фидерных клеток кератиноциты крыс успешно дифференцируются и образуют многослойную культуру. Однако, получение большого количества матрикса, синтезированного фибробластами, представляется трудной задачей. Кроме того, элементы матригеля и матрикса фибробластов можно включать в состав кожного эквивалента или в качестве покрытая аллодермы. Не исключено, и предварительное культивирование фибробластов на матригелв с целью наработки ийи достаточного количества матрикса. Такой матригель вместе с матриксом после-удаления фибробластов может быть перенесен на раневую поверхность. Руководствуясь уже установленным эффектом воздействия сложных композиций элементов внеклеточного матрикса, мы предполагаем в дальнейшем перейти к более детальным исследованиям влияния отдельных элементов на процесс восстановления кожи. Необходимость подобного рода исследований связана также и с тем, что матригель - это препарат опухолевого происхождения и его клиническое использование затруднено. Следовательно, развитие работы, вероятно, пойдет в направлении создания реконструированного матригеля или другого аналога базальной мембраны.

Выводы.

Л. Сравнительное исследование действия элементов внеклеточного матрикса на поведение кератиноцитов в культуре показало, что:

а) наибольшее прикрепление клеток наблюдается .на коллагене I тина, матриксе, синтезированном фибробластами, и на матригеле в концентрации 8 мг/мл;

б) максимальное распластывание- кератиноцитов отмечается на

матриксе, синтезированном фибробластами, и матригеле ;

в) псевдоподиальная активность кератиноцитов усилена' на коллагене I типа;

г) повышение прироста клеток наблюдается у кератиноцитов на коллагене I типа и матриксе, наработанном фибробластами; стимулирующий еффект матригеля на пролиферацию кератиноцитов прямо пропорционален его концентрации в диапазоне 0,2-8 мг/мл.

2. При преципитации матригеля из 20* раствора сульфата аммония значительная часть гликозаминогликанов не прецилитирует и остается в растворе. Сравнительный анализ фракций после преципитации матригеля 20* раствором сульфата аммония показал,

ЧТО!

а) фракция осадка мало отличается от полного матригеля по своему воздействию на клетки в культуре и в ранах;

б) фракция супернатанта ингибирует все изученные в данной работе характеристики поведения клеток в культуре, а именно прикрепление, распластывание, псевдоподиальную активность и пролиферацию; кроме того, данная фракция,; не способствует приживлению пересаженных кератиноцитов на раневом ложе полнослойных ран.

3. Сравнительное исследование действия елементов внеклеточного матрикса на заживление ран показало, что:

а) коллаген I типа, матригель, а также суспензия фибробластов ускоряют эпителизацию расщепленных ран;

б) матригель и суспензия фибробластов способствуют приживлению суспензии аллогенных кератиноцитов на раневом ложе полнослойных ран, ускорение приживления Прямо пропорционально концентрации добавленного матригеля в диапазоне концентраций 0,2-8 мг/мл.

4. Культура кератиноцитов может иметь прогностическую ценность при выборе елементов внеклеточного матрикса для их использования в качестве добавок при заживлении различных типов ран.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Ю.В.Горелик, М.И.Блинова, Г.П.Пинаев.' Влияние подложки на распластывание кератиноцитов новорожденных крыс. // Цитология. 1994.T.34.N9.C. 62-63.

2. Ю.В.Горелик, М.И.Блинова, Г.П.Пийаев. Влияние субстрата на распластывание, пролиферацию И дифференцировку кератиноцитов новорожденных крыс. //Цитология. 1994. Т.36. N6. С.520.

3. Ю.В.Горелик, M.И.Блинова, Г.П.Шшаев. Влияние влементов" внеклеточного матрикса на распластывание кератиноцитов крыс при культивировании в низкокальциевой среде. // Цитология. 1894. ' Т.36. N12. С. I209-I2I2.

4. Ю.В.Горелик, Л.В.Кухарева, М.И.Блинова. Стриппинг культур кератиноцитов крыс. // Цитология. 1994. Т.36. N12. С. I205-I2Q8.

5. Н.В.Цупкина, Н.С.Николаенко, Э.И.Конду, Р.Я.Подчерняева, А.В.Полюшкин, А.Г.Васильев, Ю.М.Никитина, Ю.В.Горелик, Г.П.Пинаев. визико-химические свойства питательных сред, составленных из компонентов отечественного производства. // Цитология. 1994.Т.36. N6.С.541.

6. J.V.Gorelik, M.I.Blinova, a.P.Pinaev. Culture substrate Influences rat keratinooyte differentiation and oytoakeletal aotin distribution. // Cell Biol.Internatl., 1994, v.10, N5, TU-7

7. J.V.Gorelik, b.V.Kukhareva, M.I.Blinova. Matrigel free of low moleoular weight fraction oan decrease keratinooyte growth.// Proo.' 8th Int. Conf. of the Int. Soo. Differentiation, 1994, P044

8. М.И.Блинова, В.А.Парамонов, Ю.В.Горелик, И.В.Воронкина, Л.В.Кухарева, Ю.М.Никитина. Использование элементов внеклеточного матрикса для заживления ран и восстановление кожного покрова. В сб.i Избранные вопросы хирургии и военно-полевой хирургии. Изд-во Саратовского университета, 1995, с.30-31.

9. J.V.Gorelik, M.I.Blinova, I.A.Diakonov, b.V.Kukhareva.-(J.P.Pinaev. Hole of feeder cells in spreading and oytoskaleton organization of newborn rat keratinooytes. Cell Biol. Intern., 1995, v.19, p.59-64

10. J.V.Gorelik, B.V.Pararaonov, M.I.Blinova, b.V.Kukhareva. Matrigel increases keratinooyte suspension "take" in split-thiokness wound in rats. Proo. 4th Int. Congress. Int. Wound. Association. Tel-Aviv, 1996, p.88.

• II. Ы.И*Влинова, Б.А.Парамонов, Ю.В.Горелик, Й.В.Воронкина, Л.В.Кухарева, Ю.М.Никитина. Влияние элементов внеклеточного матрикса на процесс заживления ран. Билл. Эксп. Виол. Мед. 1996. (в печати)

12. И.А.Дьяконов, Ю.В.Горелик, М.И.Блинова. Влияние элементов внеклеточного матрикса на псевдоподиальную активность кератиноцитов крыс.// Цитология. 1996. Т.38. N 2. С Л98-199.

13. Н.С.Николаенко, Л.А.Садофьев, Л.В.Кухарева, Ю.М.Никитина, А.Ю;Молодых, Н.В.Цупкина, Ю.В.Горелик, Г.П.Пинаев.

Сравнительное исследование соотава белков внеклеточного матрккса культивируемых фябробластов крыса.// Цитология. 1996. Т.38. Н 8.

с.гяэ-ззо.

14. М.И.Блинова, В.А.Парамонов, О.В.Горелик, Ю.И.Никитина, И.В.Воронкшт, Л.В.Кухарева. Влияние олементов внеклеточного мэтряксп па процесс заживления рал.// Цитология. 1996. Т.38. 112. СЛОГ-103.