Диссертации » Биологические науки » Гистология, цитология, клеточная биология

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Обогащение культуры кератиноцитов человека стволовыми клетками путем селективной адгезии к белкам внеклеточного матрикса
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Обогащение культуры кератиноцитов человека стволовыми клетками путем селективной адгезии к белкам внеклеточного матрикса"

На правах рукописи

СПИЧКИНА Ольга Георгиевна

Обогащение культуры кератиноцитов человека стволовыми клетками путем селективной адгезии к белкам внеклеточного матрикса

03 00 25 Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0031641Э7

Санкт-Петербург 2008

003164197

Работа выполнена в Отделе клеточных культур Института цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Пинаев Г П Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор Михельсон В М Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Ведущая организация - Институт биологии развития им Н К Кольцова РАН, Москва

Защита состоится «22» февраля 2008 года в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 002 230 01 Института цитологии РАН по адресу 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр , д 4

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института цитологии РАН Реферат разослан «22» января 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Шапошникова Т. Г, Биолого-почвенный факультет, Санкт-Петербургский государственный университет

Каминская Б В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Акпуалыюсть проблемы

В последние годы большой интерес вызывают исследования, связанные с изучением и применением стволовых клеток в медицине для заместительной клеточной терапии поврежденных тканей При этом до сих пор ведется много дискуссий на тему, что же понимать под термином «стволовые клетки», и можно ли их использовать в клинике Кроме клинического применения, наличие такой линии способствовало бы изучению механизмов регуляции дифференцировки клеток, а также изучению влияния на нее различных факторов Для того чтобы детально их изучать, необходимо наличие постоянной линии стволовых клеток с тем, чтобы исключить вариации каких-либо признаков, которые можно наблюдать при использовании материала от разных доноров Кроме того, такая линия являлась бы постоянным источником материала для клеточных технологий На данный момент из взрослого организма удается выделять в чистом виде только гемопоэтические мезенхимные стволовые клетки Однако линии стволовых клеток взрослого организма до сих пор не созданы

Было обнаружено, что в ряде тканей взрослого организма существуют ниши, в которых находятся стволовые клетки, например, в коже в базальном слое кератиноцитов Кожный покров человека и животных постоянно обновляется за счет пролиферации кератиноцитов и их последовательной дифференцировки по направлению от базальной мембраны к поверхности кожи Согласно существующим представлениям покоящиеся стволовые клетки эпидермиса сосредоточены у базальной мембраны и в волосяных фолликулах Они дают начало так называемым транзиторным клеткам, способным интенсивно размножаться, за счет чего эпидермис постоянно обновляется После нескольких делений они вступают на путь дифференцировки В результате образуются разные слои эпидермиса, содержащие кератиноциты, находящиеся на разных уровнях дифференцировки (Хэм, Кормак, 1983)

При переводе в культуру кератиноцитов базального слоя эпидермиса они способны размножаться и воспроизводить такой же процесс последовательной дифференцировки, как это происходит в коже Образуется многослойный пласт эпидермальных клеток, который может быгь использован в технологиях заместительной клеточной терапии (Limât, Klein, 1993, Romeroetal, 1999)

В с вязи с тем, что доказано существование стволовых клеток в коже человека, представл 1ется актуальным получить популяцию кератиноцитов, обогащенную стволовыми клетками, которые обладают большим пролиферативным потенциалом Пул таких клеток можно бьпо бы использовать как для фундаментальных исследований, так и для применения

в заместительной клеточной терапии Предполагается, что это позволит повысить эффективность технологий восстановления структурной и функциональной целостности кожного покрова

Решить задачу получения линии стволовых клеток или, по крайней мере, обогащения ими гетерогенной популяции базальных кератиноцитов, можно было бы осуществить путем выявления стволовых клеток методом проточной цитометрии с помощью специфических маркеров В литературе описан ряд подобных маркеров (Michel et al, 1996, Pellegnru et al , 2001) Однако на наш взгляд они не являются строго специфичными для этого типа клеток, так как они носят скорее количественный характер и найдены и в клетках других тканей (Fradette et al, 1998, Reis-Filho et al, 2002) Кератиноциты разной степени дифференцировки различаются лишь только по величине содержания в них маркерных белков (Moles, Watt, 1997, Yangetal, 1998)

В связи с отсутствием строго специфичных маркеров необходимо искать другие экспериментальные подходы для четкого выделения этих клеток или, по крайней мере, для обогащения ими культивируемой популяции кератиноцитов Стволовые клетки эпидермиса локализованы на базальной мембране и, следовательно, тесно взаимодействуют с входящими в ее состав белками (Spradling et al, 2001) В связи с этим представлялось перспективным для указанной цели применить метод селективной адгезии выделенных кератиноцитов к разным белкам внеклеточного матрикса (ВКМ) базальной мембраны, с которыми они взаимодействуют в неповрежденной коже Для проверки данного предположения и разработки метода селективного разделения гетерогенной популяции клеток необходимо прежде всего выяснить, какие из белков базальной мембраны могут быть использованы для этой цели Кроме того, важно установить степень взаимодействия с этими белками как свежевыделенной популяции кератиноцитов, так и после их культивирования

Таким образом, четкое определение и идентификация стволовых клеток, обладающих высоким пролиферативным потенциалом, а также возможность получения из общей популяции эпидермальных клеток фракции стволовых кератиноцитов, представляет собой насущную задачу как для решения ряда фундаментальных вопросов, так и с точки зрения применения этих клеток в медицине с целью сокращения сроков заживления ран

Цель и задачи работы

Целью данной работы являлось сравнительное исследование степени взаимодействия базальных клеток кожи с иммобилизованными белками внеклеточного матрикса для обогащения гетерогенной популяции кератиноцитов стволовыми клетками методом селективной адгезии

Для достижения указанной цели было необходимо решить следующие основные задачи

1 изучить степень взаимодействия кератиноцитов с разными белками внеклеточного матрикса и выявить из них наиболее адгезивные для недифференцированных клеток популяции,

2 сопоставить данные морфометрического анализа с окраской на существующие на сегодняшний день маркеры дифференцировки (рбЗ, Кл67, К19),

3 получить поликлональные антитела на мембранные белки дифференцированных и недифференцированных кератиноцитов с целью выявления белков, специфичных для стволовых клеток эпидермиса

Научная новизна работы

Впервые показано различное взаимодействие гетерогенной популяции кератиноцитов кожи челоиека с белками внеклеточного матрикса

Выявлены белки внеклеточного матрикса, способствующие адгезии недиффер«нцированных клеток эпидермиса

Совмещение флуоресцентного окрашивания кератиноцитов на маркерные белки, отражающие степень дифференцировки, с морфометрическим анализом, проведенное в данной работе позволяет более четко выявлять недифференцированные клетки эпидермиса

Получены поликлональные антитела на поверхностные белки дифференцированных и недиффере нцированных кератиноцитов

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты работы могут быть использованы для решения фундаментальных вопросов, касающихся механизмов дифференцировки тканей, влияния белков внеклеточного матрикса г а эти процессы, а также для создания клеточной линии стволовых клеток и более подробного их исследования

Кроме того, выявление различных субпопуляций кератиноцитов может быть использовало, в том числе, и для решения вопросов заместительной терапии при создании клеточных продуктов

Пол ожения, выносимые на защиту

1 Келки внеклеточного матрикса различаются по степени взаимодействия с первичными кератиноцитами кожи человека, что выявляется при коротких сроках взаимодеш твия (до 30 мин)

2 Совмещение селективной адгезии с анализом распределения маркеров дифференцировки и морфометрических параметров субпопуляций кератиноцитов дает возможность проведения обогащения культивируемых кератиноцитов стволовыми клетками

Апробация диссертации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 1 статья напечатана и 2 статьи приняты в печать Материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (С-Петербург, 2005 г), симпозиуме «Биология клетки в культуре» (С-Петербург, 2006 г), II Съезде Общества клеточной биологии (С-Петербург, 2007 г) Диссертационная работа апробирована на совместном научном семинаре Отдела клеточных культур, Лаборатории защитных механизмов клетки, Лаборатории радиационной цитологии, Лаборатории цитологии опухолевого роста и Межлабораторной группы биохимических основ репродукции клеток Института Цитологии РАН 24 октября 2007 г

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 216 наименований Иллюстрационный материал содержит 35 рисунков и 3 таблицы

Материалы и методы

Выделение и культивирование кератиноцитов

Первичную культуру кератиноцитов получали из кожи здоровых взрослых доноров по модифицированному методу Рейнвальда (Юдинцева и др , 1999, Rhemwald, 1980) В качестве источника эпидермапьных клеток использовали фрагменты кожи, полученные при косметологических операциях Выделенные клетки суспендировали в смеси сред DMEM/F12 (3 1, ICN, Франция) Выделенные кератиноциты культивировали в смеси сред DMEM/F12, с добавлением 10 % сыворотки, инсулина в концентрации 5 мкг/мл (Sigma, Франция), гидрокортизона 5 мкг/мл (Sigma, Франция), эпидермального фактора роста 10 нг/мл (Sigma, Франция), холерного токсина 10 10 М (ICN-FIow, США), трансферрина 5 мг/мл (Sigma, Франция), аденина 1 8*10^ М (Sigma, Франция), лиотиронина 2*10 ИМ (Koch-Light, Великобритания) Клетки культивировали в течение 10-14 сут при 37 °С в атмосфере 5 % СОг (до образования многослойного пласта)

За сутки до опыта культуральную среду заменяли средой FAD (Биолот, Россия) с

пониженным содержанием ионов Са2+ (0 1 мМ) для того, чтобы произвести дестратификацию, то есть отслоение и удаление супрабазальных слоев дифференцированных клеток (Jensen, Bolund, 1988) Клетки базального слоя обрабатывали 0 02 % раствором ЭДТА, затем смесью растворов 0 125 % трипсина и 0 02 % ЭДТА в соотношении 1 1 в течение 2- 3 мин при 37 °С Действие трипсина ингибировали добавлением культуральной среды По пученные клетки центрифугировали (при 1000 об/мин, 5 мин), суспендировали в среде DMEM/F12, 3 1, и наносили на покровные стекла, предварительно покрытые белками ВКМ

Взаимодействие клеток с белками внеклеточного матрикса

В I ачсстве субстратов для экспериментов по адгезии использовали белки ВКМ коллагены I и IV типов, ламинин 2/4 и фибронектин, а также матригель, являющийся комплексом белков внеклеточного матрикса и протеогликанов Коллаген I типа был получен из сухожипш крысиных хвостов (Chandrakasan et al, 1967), коллаген IV типа - из плаценты человека (Klemman, 1994) Коллагены были выделены и любезно предоставлены JI В Кухаревой, Институт Цитологии РАН, С-Петербург Ламинин 2/4 был выделен из плаценты человека модифицированным методом Палма и Фурча (Palm, Furcht, 1983), фибронектин был получен и: плазмы крови человека (Ruoslanti et al, 1982), матригель - из EHS саркомы мыши (Kibbey, 1994) Фибронектин, ламинин 2/4 и матригель любезно предоставлены И В Воронкиной (Институт цитологии РАН, С-Петербург) Растворы белков наносили на чашки Петри или на предварительно подготовленные покровные стекла и оставляли на ночь при 4 °С Затем чашки и стекла трижды промывали раствором PBS Для предотвращения неспецифического взаимодействия клеток с субстратом стекла дополнительно покрывали раствором 2% БСА (в течение 1 ч, при 37 "С) с последующей отмывкой PBS На приготовленные субстраты наносили суспензию клеток в среде без сыворотки В качестве контроля были использованы бычий сывороточный альбумин (БСА, Sigma, США) и полилизин-L (Sigma, США)

Схе на селективной адгезии

Свежевыделенные кератиноциты наносили на 10 мин при 37 °С в атмосфере 5% СО2 на один из выбранных субстратов в среде DMEM/F12 (3 1) без добавления сыворотки Не прикрепившиеся за это время клетки переносили в другую чашку с тем же субстратом и инкубиров ити в течение 20 мин Затем не прикрепившиеся и за это время клетки пересаживали на тот же субстрат на 30 мин и после этого срока не прикрепившиеся клетки удаляли Клетки, прикрепившиеся (через 10, 20 и 30 мин) к субстрату, культивировали в течение 1 сут при 37 °С в атмосфере 5% С02 В качестве контроля использовали те же кератиноциты, но без отбора по времени адгезии к соответствующему субстрату

Определение числа прикрепившихся к субстрату кератиноцитов

Подсчет числа клеток, прикрепившихся за определенный срок к субстрату, нанесенному на поверхность лунок, проводили с помощью метода иммуноферментного анализа (Karecla et al, 1994) В этих экспериментах использовали 96-луночные платы (Nunc, США) для иммуноферментного анализа В каждую лунку наносили 10 мкг субстрата и инкубировали при температуре 4 °С в течение ночи, затем лунки трижды промывали раствором PBS Выделенные клетки промывали трижды смесью сред DMEM и F12 (3 1) без сыворотки с последующим их осаждением при 1000 g в течение 5 мин Затем клетки суспендировали в среде без сыворотки и высевали в 96-луночные платы по 105 клеток на лунку После инкубации в течение определенного времени (в зависимости от конкретного эксперимента) неприкрепившиеся клетки удаляли, а прикрепившиеся фиксировали в течение 10 мин при 20°С 70 % раствором этилового спирта и окрашивали 0 1%-ым раствором генциан-виолета (в течение 20 мин) Краситель растворяли 10%-ой уксусной кислотой Была построена калибровочная кривая, с помощью которой по величине оптической плотности растворов в лунках при длине волны 570 нм судили о количестве клеток, адгезировавших к данному субстрату В отдельных случаях количество прикрепившихся клеток подсчитывали с помощью камеры Горяева

Получение и истощение шшуносывороток, содержащих поликлональные антитела на дифференцированные (ИСд) и недифферет^рованные (ИСс) клетки эпидермиса

Для получения иммуносывороток на белки плазматических мембран кератиноцитов базального слоя (ИСб) и дифференцированных клеток супрабазальных слоев (ИСД), кератиноциты выделяли, культивировали до получения многослойного пласта и подвергали дестратификации, как это было описано ранее Получение препаратов плазматических мембран кератиноцитов согласно методике Хеффнера (Haeffner et al, 1980), которыми иммунизировали кроликов, иммунизацию и получение иммуносывороток проводили в лаборатории цитологии опухолевого роста, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург Полученные иммуносыворотки были подвергнуты перекрестному истощению Качество истощения контролировали методом иммуноферментного анализа Илшунофлуоресцентный анализ

Содержание в клетках маркерных белков оценивали с помощью метода непрямой иммунофлуоресценции Клеточную суспензию наносили на покровные стекла с иммобилизованными на них лигандами и инкубировали в течение необходимого времени при 37 °С в атмосфере 5% СОг Затем питательную среду удаляли, клетки фиксировали 4 % формальдегидом в течение 10 мин при комнатной температуре, инкубировали с 0 1%-ым раствором Тритона Х-100 в течение 20 мин с последующей отмывкой PBS Первые антитела

наносили на 1 ч при комнатной температуре, после чего промывали PBS В качестве первых антител были использованы

- моноклональные мышиные антитела против кератинов человека К5 в разведении 1 100, К10, 1 50, К14, 1 20 (Novocastra Laboratories Ltd, Великобритания), К19, 1 100, клон ВА17 (Dako Cytomation, Дания), рбЗ, 1 1000, клон 4А4 (Sigma, США), Ю67, 1 100 (BD Transduction Laboratories™, США)

- иммуносыворотки, содержащие поликлональные кроличьи антитела, IS6 или ISfl в разведении 1 300

Затем наносили вторые антитела на 30 мин с последующей отмывкой PBS В качестве вторых антител были использованы поликлональные кроличьи IgG против IgG мыши (Sigma, США), конъюгированные с FITC (Fluorescein Isothiocynate), в разведении 1 256, козьи антитела против Ig G кролика, конъюгированные с FITC, в разведении 1 60 (Sigma, США)

Актиновый цитоскелет выявляли окраской клеток родамин-фаллоидином Для этого после обработки первыми и вторыми антителами родамин-фаллоидин добавляли на 15 мин с последующей отмывкой PBS Препараты заключали в mounting medium и анализировали их с помощью флюоресцентного микроскопа «Karl Zeiss Axioscop» (Zeiss, Германия) или конфокального микроскопа Leica TCS SL (Zeiss, Германия) Зеленую флуоресценцию (FITC) возбуждали аргоновым лазером (488 нм), красную (родамин) - He-Ne лазером (543 нм) Флуоресценцию FITC (500-530 нм) и родамин-фаллоидина (580-630 нм) сканировали раздельно : помощью компьютерной программы Leica Confocal Software

Анапа изображений клеток

Измерение таких параметров, как площадь проекции клетки на подложку (А), ее периметра (Р), а также значения усредненных интенсивностей флуоресценции клеток выполняли с помощью программы «WC1F ImageJ 1 37i» (National Institute of Health, Maryland, USA) О степени распластывания клеток судили по коэффициенту распластанности, Rp/Ra (Kuzminykh, Petrov, 2004, Petrov et al, 2007) Rp/Ra равен соотношению радиусов, вычисленных по известным периметру и площади клеток Для характеристики клеточной популяции был введен еще один коэффициент - G/R, соотношение средних интенсивностей флуоресценции в клетке маркерного белка (кератина 19, рбЗ, Ki(>7 или белков, с которыми связываются поликлональные антитела Isb или Isd) (G) и актина(В)

Аналитическую обработку полученных данных проводили на компьютере с помощью «Microsoft Excel 2003» и «Origin 6 1» Вычисление теоретических кривых распределения, значения которых с наибольшей вероятностью соответствуют экспериментальным

значениям, выполняли, исходя из предположения, что вариации параметров носят случайный характер и имеют нормальное распределение В качестве критерия отбора таких кривых для иллюстрации экспериментальных данных использовали величину коэффициента корреляции

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Взаимодействие свежевыделенных и культивируемых базальных кератиноцитов с разными белками внеклеточного матрикса

В процессе обновления эпидермиса кератиноциты последовательно изменяют степень дифференцировки при перемещении от базальной мембраны к поверхности кожи В связи с этим можно предположить, что стволовые кератиноциты должны иметь большее сродство к белкам базапьной мембраны, чем дифференцированные клетки Для того чтобы проверить данное предположение и оценить степень взаимодействия разных клеток популяции кератиноцитов, выделенные из кожи клетки были посеяны на следующие белки ВКМ -коллагены I и IV типа, ламинин 2/4, фибронектин, а также матригель на одни сутки После этого срока была подсчитана доля прикрепившихся клеток (рис 1)

Рис 1 Сравнение числа кератиноцитов, прикрепившихся к различным субстратам Здесь и далее кол I - коллаген I типа, кол IV - коллаген IV типа, фн - фибронектин, лам 2/4 -ламинин 2/4, мгель - матригель

По сравнению с БСА, который не является для этих клеток естественным субстратом, и к которому прикрепляется только около 10% клеток, белки ВКМ, а также матригель, в большей мере способствовали адгезии клеток к подложке К ним прикрепляется до 60% от исходного количества посеянных клеток При сравнении субстратов между собой обнаружены относительно незначительные различия в количестве прикрепляющихся клеток

Отсутствие существенных различий в степени адгезии посеянных клеток могло происходить и в связи с секрецией собственных белков внеклеточного матрикса

В 1.вязи с этим, для того чтобы выявить специфическое взаимодействие клеток с разными белками, время, отведенное для прикрепления клеток, было снижено Оказалось, что при сроке адгезии, равном 30 мин, клетки предпочтительнее взаимодействуют с коллагенами I и IV типов и фибронектином (рис 2, а) Естественно, что количество прикрепившихся кератиноцитов к данным субстратам было ниже и составляло 10-15 % от числа посеянных клеток К ламинину 2/4 и матригелю за такое же время прикрепилось 5-7% В качестве контроля была использована пластиковая поверхность культуральной чашки, необработанная белком (менее 1 % клеток)

Для того чтобы оценить долю недифференцированных клеток в популяции кератиноцитов, прикрепляющихся за 30 мин, было проведено выявление наличия в них маркеров дифференцировки путем окраски на различные кератины, соответствующие разным уровням дифференцировки Кератины 5 и 14 (К5 и К14, соответственно) синтезируются недифференцированными клетками базального слоя, кератин 10 (К 10) - более дифференцированными клетками супрабазальных слоев (Moll et al, 1982) При таком времени адгезии доля К5, К14- положительных клеток при взаимодействии с коллагенами или фибронектином составляла 80-90%, матригелем - 70%, ламинином 2/4 - 60% (рис 2, б) В исходной суспензии первичных кератиноцитов доля К5-положительных клеток составляла около 60%, К10-положительных - примерно 40% Таким образом, при снижении срока адгезии до 30 мин уже наблюдается отчетливое влияние нанесенных белков на состав клеток, прикрепляющихся к подложке Кроме того, из всех исследуемых белков коллагены и фибронектин при данных условиях являются наиболее оптимальными для обогащения популяции недифференцированными клетками

Для того чтобы выяснить, как скажется на содержании недифференцированных клеток в популяции дальнейшее снижение времени адгезии, клетки были посеяны на 10 мин с последующим переносом неприкрепившихся клеток на тот же субстрат на 20 и затем на 30 мин Наиболее значительное влияние на клеточную адгезию оказывают коллагены количество клеток, прикрепляющихся к данным субстратам, приблизительно в 4-11 раз больше количества клеток, прикрепляющихся к БСА Фибронектин и ламинин 2/4 усиливают адгезию примерно в 2-4 раза Все исследуемые белки способствуют прикреплению большего юличества клеток по сравнению с БСА При этом с уменьшением времени до 10 мин увеличивается доля недифференцированных, то есть К5, К14 - положительных, клеток до 85-95% Таким образом, данные эксперименты еще раз демонстрируют, что уменьшение

срока адгезии (до 10 мин) способствует обогащению популяции недифференцированными клетками.

КОЛ I кол! V фн

лам мгель контр 2/4

100 -|

90 -

80

70

8 60 И

а 50 4

га

I 40 -

О

§■30 &20 10 -

о

ИК5 В К14

ркю

кол IV фн лам 2/4 Субстрат

Рис. 2. а) Доля первичных кератиноцитов, адгезирующих за 30 мин, % от посеянных клеток, б) Соотношение К5 и К14-положительных и К10-положительных кератиноцитов среди клеток, прикрепляющихся за 30 мин.

Для того чтобы выяснить, в какой степени длительное культивирование выделенных кератиноцитов влияет на их адгезивные свойства по сравнению с первичными кератиноцитами, клетки через 10-14 дней культивирования подвергали процедуре стриппинга и наносили на те же субстраты. По сравнению с первичными культивируемые кератиноциты не дают такой же картины зависимости адгезии от времени. При посеве культивируемых кератиноцитов на те же белки внеклеточного матрикса было выявлено, что за 10 мин прикрепляется примерно такое же количество клеток, как и за 1 ч (рис. 3). При этом к коллагенам и ламинину 2/4 прикрепляется 60-90% клеток от числа посеянных, тогда как к фибронектину максимум 50%.

Рис. 3. Адгезия культивируемых кератиноцитов к белкам внеклеточного матрикса.

Было установлено также, что отселектированные по адгезии клетки растут медленнее, чем неот< електированные клетки общей популяции Вероятно, это зависит от того, что быстро адгезирующие клетки имеют более медленный клеточный цикл, что подтверждается и литературными данными (Potten et al, 1982) Кроме того, этим клеткам, по-видимому, необходимо присутствие других клеток популяции, что еще раз говорит о существовании сложного состава «ниши стволовых клеток» эпидермиса

ЗаЕ.исимость морфометрических параметров гетерогенной популяции кератииощнтов от времени адгезии к белкам внеклеточного матрикса

В связи с тем, что маркеры стволовых клеток эпидермиса не являются строго специфичными, как показали проведенные эксперименты, для того чтобы выявить разные субпопуляции клеток, необходимо привлечение дополнительных оценочных параметров Из данных литературы следует, что недифференцированные прогениторные клетки кожи обладают круглой формой и характеризуются меньшими размерами (около 10 мкм) по сравнению с дифференцированными (Barrandon, Green, 1985, Webb et al, 2004) Известно, что взаимодействие клеток с субстратом, и в том числе степень сродства к нему, выражается степенью распластывания на нем клеток IIa основании этих данных было выдвинуто предполом ение, что если клеткам дать достаточно времени для распластывания на субстрате, стволовые клетки, тем не менее, должны оставаться более мелкими и круглыми Чтобы проверить данное предположение, было проведено исследование морфометрических параметрои кератиноцитов

Рис 4 Распределение клеток по величине Л через 1 сут после посева а - на фибронектине, б -коллагене 1 типа, в - коллагене IV типа Точки - экспериментальные значения А Сплошная линия - суммарная теоретическая кривая, полученная по опытным значениям, штриховые линии - кривые, отражающие распределение клеток по отдельным субпопуляциям

Проведенный анализ показал, что в среднем площадь (А) клеток общей популяции, растущих в течение 1 сут на коллагене I типа, вдвое превосходит площадь тех же клеток, культивируемых на коллагене IV типа или на фибронектине Это может быть связано с тем, что коллаген I типа в большей степени способствует дифференцировке клеток в культуре Достоверных различий по данному параметру между клетками на фибронектине и коллагене IV типа не выявлено

Гистограммы распределения клеток в зависимости от их площади, представленные на рис 4, показывают, что в общей популяции кератиноцитов, посеянных на любой из исследуемых субстратов, достаточно сложно выявить некую субпопуляцию по такому параметру, как размер клеток

При селекции кератиноцитов по скорости адгезии к отдельным белкам ВКМ субпопуляции выявляются более четко Среди клеток, культивируемых на коллагенах, выявляются округлые мелкие клетки и клетки более крупные полигональной или вытянутой формы Из агрегатов кератиноцитов, состоящих в основном из круглых клеток, начинают формироваться колонии, чего не наблюдается в случае с фибронектином, где клетки выглядят более однородными

В целом на размер клеток, посеянных на фибронектин, практически не оказывает никакого влияние селекция клеток по времени прикрепления На рис 5-6 представлены данные по площади для клеток, отселектированных за 10, 20 и 30 мин

Рис 5 Распределение клеток по величине А на коллагене I типа через 1 сут после посева а, б - клетки, отселектированные по адгезии в течение 20 и 30 мин соответственно Здесь и на рис 6 Точки - экспериментальные значения А Сплошная линия - суммарная теоретическая кривая, полученная по опытным значениям, штриховые линии - кривые, отражающие распределение клеток по отдельным субпопуляциям

Г'ис 6 Распределение клеток по величине А на коллагене IV типа через 1 сут после посева а, б - клетки, отселектированные по адгезии в течение 10 и 20 мин соответственно

При селекции клеток, посаженных на фибронектин, не удается выделить отчетливой субпопуляции При использовании в качестве субстрата коллагена I типа четко выявляется субпопуляция клеток небольшого размера после адгезии в течение 20 мин и 30 мин В случае коллагена IV типа аналогичная картина наблюдается при 10- и 20-минутном отборе

Для сравнения был проведен анализ гетерогенности популяций длительно культивируемых кератиноцитов после пересева В отличие от первичных кератиноцитов, несмотря на относительную гомогенность по размерам, среди популяции культивируемых кератиноцитов не удается выявить отдельной субпопуляции клеток с малыми размерами, то есть, по видимому, в культуре под воздействием окружающих факторов, стволовые клетки теряют свои свойства и переходят в состояние транзиторных

Таким образом, среди первичных кератиноцитов в условиях 10-30 мин селекции, по-видимому, добавив еще один критерий, например, окраску на кератин 19 (К19), считающийся одним из более надежных маркером стволовых клеток эпидермиса, можно не только идентифицировать субпопуляцию небольших круглых клеток, которые, как предполагается, являются стволовыми клетками, но и выделить их в чистом виде

Распределение маркеров стволовых клеток кожи (рбЗ, Ki67, К19) в гетерогенной популяции кератиноцитов

Рассмотренных ранее параметров (скорости адгезии, длительности прохождения клеточного цикла, размера) недостаточно для точной идентификации покоящихся стволовых кератиноцитов Известно, что эти клетки характеризуются повышенной экспрессией определенных белков, в том числе транскрипционного фактора рбЗ (Pellegrini et al, 2001), кератина 19 (Michel et al, 1996) и отсутствием в ядре белка, связанного с пролиферацией клеток, 1Ci67 (Gerdes et al , 1983) В связи с этим было решено проверить быстро

адгезирующие кератиноциты на наличие данных белков и выявить, есть ли связь морфометрических параметров с одним из маркеров стволовых клеток, а именно К19.

Проведенные эксперименты показали, что при параллельном посеве первичных кератиноцитов на 10, 20, 30 мин доля клеток ярко окрашенных на рбЗ со временем снижается с 12-16% до 2-6% в зависимости от субстрата.

Примерно такую же долю среди быстро адгезирующих клеток составляют Неположительные кератиноциты - 9-16 %. Их легко можно идентифицировать по яркой окраске (рис. 7). При анализе интенсивности флуоресценции кератина 19 (О) можно выделить 2 кластера (на рисунке они обведены в овалы). Через сутки ярко окрашенных клеток становится меньше, и интенсивность флуоресценции кератина в них снижается.

Рис. 7. а) Первичные кератиноциты, отселектированньте за 10 мин, через 1 ч после посева, на коллагене I типа, окрашенные на актин и кератин 19. б) Взаимосвязь интенсивности флуоресценции кератина 19 (О) с интенсивностью флуоресценции актина (Я). Каждая точка соответствует отдельной клетке с соответствующими значениями О и Я.

Для того чтобы проверить, насколько совпадает распределение маркерных белков в клетках, монослой базальных кератиноцитов окрашивали на рбЗ и К19. Клетки с яркой окраской на рбЗ составляют около 90 % монослоя, тогда как окраска на кератин 19 не дает такой четкой картины. По-видимому, постепенная смена состава кератиновых филаментов в процессе дифференцировки не позволяет в данных условиях провести четкую границу между окрашенными и неокрашенными клетками.

Белок К1 67, являющийся косвенным отрицательным маркером стволовых кератиноцитов, был обнаружен в 6-10% базальных клеток, что совпадает с данными по рбЗ.

Для количественной оценки гетерогенности популяции культивируемых кератиноцитах в зависимости от содержания в клетках кератина 19 был введен параметр О/Я, отражающий соотношение средних интенсивностей флуоресценций кератина 19 и актина. Средняя интенсивность свечения пропорциональна средней концентрации данного белка в клетке.

V популяции кератиноцитов на фибронсктине не обнаруживается корреляция между морфометрическими параметрами (Л, Р, Яр/Ка) и окраской клеток на кератин, которую отражает параметр О/Я. Можно констатировать, что субпопуляции клеток с более низкими значениями й/Я имеют достоверно больший размер при культивировании на коллагене I типа или на ламинине 2/4, при этом они имеют и большую степень распластанное™, чем клетки с относительно высокими значениями О/Я (рис. 8).

11а данных субстратах более мелкие клетки ярче окрашиваются на кератин, предположительно они являются прогениторными. И наоборот, крупные распластанные клетки характеризуются менее яркой окраской на К19 и, по-видимому, являются более дифференцированными. Из полученных данных следует, что в дальнейшем с помощью коллагена 1 типа и ламинина 2/4 будет возможно разделить популяции базальных кератиноцитов на субпопуляции с определенными морфометрическими характеристиками и окраской на кератин 19.

■юооо

8000

1 6000 о

^-4000 2000

гй

фиьронектмн

-Г*1

0,58- 0,70- свыше 0,49- 0,56- 0|68-

0,64 0,74 0,9 0,53 0,60 0,74

0,8

ламинин 2/4

Рис. 8. Зависимость величины А от отношения в/Я.

Получение кроличьих антител к дифференцированным и недифференцированным кератиноцитам

Поскольку различия в содержании всех известных маркеров, используемых для идентификации прогениторных клеток кожи, носят в основном количественный характер, а также в :вязи с отчетливым различием в адгезивных способностях разных субпопуляций кератиноцитов, была предпринята попытка, выявить такие поверхностные белки, которые были бы характерны для стволовых клеток и могли бы являться их специфическими маркерами. Из предыдущих результатов следует, что клетки с определенными параметрами специфично взаимодействуют с белками ВКМ, поэтому было сделано предположение, что у этих клеток есть специфические рецепторы к данным белкам. Для того чтобы проверить,

существуют ли такие поверхностные мембранные белки, отличающие стволовые клетки от дифференцированных, были получены поликлональные антитела на мембранные белки дифференцированных и недифференцированных кератиноцитов, и сопоставлено окрашивание ими кератиноцитов с другими характеристиками клеток Была получена сыворотка кролика, содержащая антитела к мембранным белкам а) кератиноцитов базального слоя (ИСб) и б) дифференцированных кератиноцитов супрабазальных слоев (ИСД) После перекрестного истощения, чтобы исключить взаимодействие антител и с одним, и с другим типом клеток, наличие соответствующих антител в сыворотке определяли с помощью иммуноферментного анализа

При реакции базальных клеток с иммуносыворотками значимых отличий не наблюдается, что, по-видимому, говорит о неполном истощении ИСД Максимальная разница в реакции клеток дифференцированных клеток с этими же сыворотками при разведении антител 1/320 - в 4,5 раза Показано, что полученные антитела могут быть использованы в качестве дополнительных маркеров для идентификации недифференцированных клеток в популяции кератиноцитов, получаемой при выделении

Выявление субпопуляций кератиноцитов, окрашиваемых полученными антителами ИСб и ИСД

Для того чтобы проверить специфичность взаимодействия полученных антител с клетками, были выбраны первичные кератиноциты, отселектированные путем адгезии к фибронектину в течение 10 мин Было установлено, что антитела, полученные на недифференцированные кератиноциты (ИСб), окрашивают клетки более мелкие, круглой формы (рис 9, а) При сопоставлении окрашивания клеток антителами с данными морфометрического анализа выявлено, что величина параметра Р таких клеток около 150 пикселей Доля кератиноцитов, ярко окрашивающихся ИСг„ в данной популяции составляла около 40% (рис 10, а) Тогда как антитела на дифференцированные кератиноциты (ИСД) ярко окрашивают как клетки средних размеров, так и более крупные клетки, которые при данном сроке инкубации выглядят уже более вытянутыми и распластанными (рис 9, б) Величина Р таких клеток от 100 до 300 пикселей, доля их в популяции около 60% (рис 10, б) Таким образом, кератиноциты, ярко окрашивающиеся антителами ИСД, и неокрашивающиеся ИСг>, являются дифференцированными

Параллельно с антителами (ИСб или ИСД) кератиноциты окрашивали на актиновый цитоскелет, интенсивность флуоресценции которого для всех клеток исследуемой популяции составляла около 20 отн ед с незначительными отклонениями (рис 10) Субстрат при

данном сроке инкубации еще не оказывает значительного влияния на состояние кератиноцитов и в том числе на их дифференцировку.

® Ш

т

Рис. 9. Окраска первичных кератиноцитов, отселектированных за 10 мин, кроличьими поликлональными антителами полученными на мембранные белки а) базальных, б) дифференцированных кератиноцитов через I ч после посева.

Рис. 10. Зависимость интенсивностей флуоресцентных окрасок а) ИСя, б) ИСД от параметра Р. Ас - интенсивность флуоресценции актина, АТ интенсивность флуоресценции при окрашивании антителами (ИС6 или ИС„).

Таким образом, полученные нами антитела позволяют четко выявлять две субпопуляции кератиноцитов, находящихся на разных стадиях дифференцировки, что в дальнейшем может быть использовано для разделения популяции кератиноцитов уже на этапе выделения их из кожи на дифференцированные и недифференцированные клетки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предположение о том, что стволовые клетки эпидермиса, лежащие на базальной мембране кожи, имеют высокое сродство к входящим в ее состав белкам, подтверждается сопоставлением взаимодействия с ними кератиноцитов, выделенных из кожи человека. 11ри этом наибольшая специфичность взаимодействия выявляется на ранних сроках адгезии клеток к субстрату. Длительное культивирование (в течение 2 недель) нивелирует различия влияния разных субстратов на клетки, по-видимому, вследствие синтеза и секреции клетками

собственных белков ВКМ Вместе с тем, все проанализированные маркеры не позволяют выявлять отдельную субпопуляцию только стволовых клеток, а лишь клетки, находящиеся на разных стадиях подготовки к дифференцировке Так как показано, что белки ВКМ предпочтительнее взаимодействуют с недифференцированными клетками эпидермиса, было сделано предположение, что среди поверхностных белков этих клеток есть такие, которые характерны только для стволовых кератиноцитов В связи с этим были получены антитела на мембранные белки дифференцированных и недифференцированных кератиноцитов Проведенные эксперименты показали, что окраска кератиноцитов данными антителами позволяет выявлять отдельные субпопуляции клеток Кроме того, с помощью электрофореза было показано различие между составом белков мембран дифференцированных и недифференцированных клеток Предполагается, что в дальнейшем это позволит получить моноклональные антитела на отдельные специфические белки для использования их в качестве маркеров стволовых клеток эпидермиса

ВЫВОДЫ

1 Первичные кератиноциты кожи человека отличаются по способности к взаимодействию с различными белками внеклеточного матрикса Наиболее адгезивными для них являются коллагены I и IV типов, а также фибронектин

2 Недифференцированные кератиноциты, выявляемые окрашиванием антителами на кератины 5 и 14, обнаруживают наибольшую степень сродства к субстрату при коротких временах адгезии до 30 минут

3 Совмещение морфометрического анализа прикрепившихся клеток к субстрату с окрашиванием на кератин 19, считающийся маркером стволовых клеток кожи, позволило выявить субпопуляцию мелких круглых клеток, предположительно представляющих собой субпопуляцию стволовых кератиноцитов

4 Проведенные исследования с использованием таких маркеров стволовых клеток эпидермиса, как рбЗ и кератина 19, показали, что с их помощью возможно лишь выявлять и охарактеризовать группы клеток по наличию в них данных белков, однако они не могут являться строго специфичными только для стволовых клеток кожи в условиях in vitro

5 С целью выявления маркерных белков, специфичных для стволовых клеток кожи, получены антитела на поверхностные белки кератиноцитов, которые выявляют более четкие различия между дифференцированными и недифференцированными клетками

6 Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что с помощью селективной адгезии с использованием специфических маркеров возможно проводить обогащение гетерогенной популяции кератиноцитов стволовыми клетками

Публикации по теме диссертации

1 Спичкина О Г 2005 Влияние белков внеклеточного матрикса на физиологическое состояние эпидермальных клеток кожи человека в культуре Тезисы Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина», С-Петербург 114

2 Спичкина О Г Калмыкова ИВ, Воронкина ИВ, Кухарева ЛВ, Блинова МИ, Пинаев ГП 2005 Выделение популяции базальных кератиноцитов путем их селективной адгезии к белкам внеклеточного матрикса Тезисы конференции «Биология стволовых клеток фундаментальные аспекты», Москва 65-66

3 Спичкина О Г, Калмыкова Н В , Бчинова МИ, Пинаев ГП 2005 Влияние белков внеклеточного матрикса на состояние кератиноцитов кожи человека в культуре Тезисы VI Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток», Звенигород 105

4 Спичкина О Г, Калмыкова ИВ, Воронкина ИВ, Кухарева ЛВ, Блинова МИ, Пинаев ГП 2006 Выделение популяции базальных кератиноцитов для использования их в аллогениых трансплантатах при лечении глубоких ожогов Тезисы конференции «Актуальные проблемы ожоговой травмы», С -Петербург Скорая медицинская помощь 3 177-178

5 Спичкина О Г, Качмыкова НВ, Воронкина ИВ, Кухарева ЛВ, Блинова МИ, Пинаев Г П 2006 Идентификация рбЗ-положительных клеток в популяциях базальных кератиноцитов человека, отселектированных путем адгезии на белках внеклеточного матрикса Тезисы Всероссийского симпозиума «Биология клетки в культуре», С -Петербург Цитология 48(9) 802

6 Спичкина О Г, Калмыкова И В, Воронкина ИВ, Кухарева ЛВ, Блинова МИ, Пинаев ГП 2006 Выделение популяции базальных кератиноцитов человека путем их селективной адгезии к белкам внеклеточного матрикса Цитология 48(10) 841-845

7 Спичкина О Г, Блинова МИ, Пинаев ГП 2007 Исследование гетерогенной популяции первичной культуры кератиноцитов кожи человека, культивируемых на разных белках внеклеточного матрикса Тезисы II Съезда Общества клеточной биологии, С -Петербург Цитология 49(9) 795-796

8 Спичкина О Г, Пинаев Г П, Петров Ю П 2008 Анализ гетерогенности кератиноцитов человека, взаимодействующих с иммобилизованными фибронектином, коллагенами I и IV типов Цитология 50(3) 210-217

9 Спичкина О Г, Пинаев Г П, Петров Ю П 2008 Сравнительный анализ гетерогенности популяции кератиноцитов человека по степени адгезии к субстрату и по соотношению содержания кератина 19 к актину Цитология 50(3) 218-227

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Хэм А , Кормак Д 1983 Гистология Т 4, М , Мир

Юдинцева Н М, Горелик Ю В, Дьяконов И А , Калмыкова, Н В, Блинова М И, Пинаев Г П 1999 Трансплантация аллогенных эпителиальных пластов на ожоговые раны Цитология 41 (3/4) 328

Barrandon Y, Green Н 1985 Cell size as a determinant of the clone-forming ability of human keratinocytes Proc Natl Acad Sci USA 82 5390-5394

Chandrakasan G, Torchia DA , Piez К A 1967 Preparation of intact monomenc collagen from rat tail tendon and skin and the structure of the nonhelical ends in solution J Biol Chem 251 6062-6067

Gerdes J, Schwab U, Lemke H, Stem H 1983 Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation Int J Cancer 31 13-20

Haeffner E W , Kolbe К , Schroeter D , Paweletz N 1980 Plasma membrane heterogeneity in ascites tumor cells isolation of a light and a heavy membrane fraction of the glycogen-free Ehrlich-Lettre substrain Biochim Biophys Acta 603(1) 36-51

Jensen P, Bolund L 1988 Low Ca2+ stripping of differentiating cell layers in human epidermal cultures an in vitro model of epidermal regeneration Exp Cell Res 175 63-73

Karecla P L, Timpl R, Wait F 1994 Adhesion of human epidermal keratinocytes to lamimn Cell Adhesion Commun 2 309-318

Kibbey MC 1994 Maintenance of the EHS sarcoma and matngel preparation J Tissue Culture Methods 16 227-230

Klemman HК 1994 Isolation of laminin-1 and type IV collagen from the EHS sarcoma J Tissue Culture Methods 16 231-233

Kuzmmykh E V, Petrov Yu P 2004 A simple model for the study of effectsof the extracellular matrix on the cell morphology in vitro Biochem biophys acta 1671 18-25

Lavker R M, Sun T-T 1982 Heterogeneity in epidermal basal keratinocytes morphological and functional correlations Science 215 1239-1241

Limat A, Klein CE 1993 Expression of epidermal mtegrins in human organotypic keratinocyte cultures Exp Dermatol 2(5) 196-203

Michel M, Torok N, Godbout M-J, Lussier M, Gaudreau P, Royal A , Get mam L 1996 Keratin 19 as a biochemical marker of skin stem cells in vivo and m vitro keratin 19 expressing cells are differentially localized in function sites, and their number varies with donor age and culture stage J Cell Science 109 1017-1028

Moles J -P, Watt F M 1997 The epidermal stem cell compartment variation in expression levels of E-cadhenn and catenins within the basal layer of human epidermis J Histochem Cytochem 45 867-874

Moll R, Fiank IF ft', Schiller DL, Geigei B, Ktepler R 1982 The catalog of human cytokerarins patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells Cell 31(1) 11-24 Review

Palm S L, Furcht L T 1983 Production of laminin and fibronectin by Schwannoma cells cell-proti in interactions m vitro and protein localization m peripheral nerve in vivo J Cell Biol 96 1218-1226

Pellegrini G, Dellambra E Gohsano O Martmelli E, Fantozzt I, Bondanza S, Ponzm D, MtKt'on F, De Luca M 2001 p63 »identifies keratinocyte stem cells Proc Natl Acad Sci USA 98 3156-3161

Petrov Yu P, Ktylova T A , Tsupkma N V, Pershma VP 2007 Spreading as the general attribute of cell population J Biol Sciences 7 102-112

Potten C S, Wichmann H E, Loejfler M, Dobek K, Major D 1982 Evidence for discrete cell kinetic subpopulations m mouse epidermis based on mathematical analysis Cetl Tissue Kinet 15(3) 305-329

RhemwaldJG 1980 Serial cultivation of normal epidermal keratmocytes Meth Cell Biol 21A 229 254

Romero MR, Carroll J M, Watt FM 1999 Analysis of cultured keratmocytes from a transgenic mouse model of psoriasis effects of suprabasal integnn expression on keratinocyte adhesion, proliferation and terminal differentiation Exp Dermatol 8 53-67

Spradhng A , Drammond-Barbosa D, Kai T 2001 Stem cells find their niche Nature 414 98-104

Webb A , Li A , Katir P 2004 Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of thi skin Differentiation 72(8) 387-395

Yang A , Kaghad M, Wang Y, Gillett E, Fleming M D, Dotsch V, Andrews N C, Caput D, MtKeon F 1998 p63, a p53 homolog at 3q27-29, encodes multiple products with transactivating, death-inducing, and dominant-negative activities Mol Cell 2 305-316

Лицензия ЛР №020593 от 07 08 97

Подписано в печать 17 01 2008 Формат 60x84/16 Печать цифровая Уел печ л 1,0 Тираж 100 Заказ 2482Ь

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул , 29 Тел 550-40-14 Тел/факс 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Спичкина, Ольга Георгиевна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Строение кожи человека.

2.2. Дифференцировка кератиноцитов.

2.3. Маркеры стволовых клеток кожи.

2.4. Белки базальной мембраны.

2.5. Рецепторы кератиноцитов к белкам ВКМ.

2.6. Влияние белков ВКМ на культивируемые кератиноциты.

2.7. Методы выявления стволовых клеток для последующего обогащения ими культуры кератиноцитов.

Цель и задачи исследования.

Положения, выносимые на защиту.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Выделение и культивирование кератиноцитов.

3.2. Стриппинг многослойного пласта кератиноцитов и снятие клеток базального слоя.

3.3. Субстраты.

3.4. Схема селективной адгезии.

3.5. Определение числа прикрепившихся к субстрату кератиноцитов.

3.6. Получение и истощение иммуносывороток ИСб и ИСД.

3.7. Обработка стекол для приготовления препаратов.

3.8. Иммунофлуоресцентный анализ.

3.9. Анализ изображений клеток.

3.10. Разделение белков с помощью электрофореза.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4. 1. Взаимодействие свежевыделенных и культивируемых базальных кератиноцитов с разными белками внеклеточного матрикса.

4.2. Зависимость морфометрических параметров гетерогенной популяции кератиноцитов от времени адгезии к белкам внеклеточного матрикса.

4.3. Распределение маркеров стволовых клеток кожи (рбЗ, Ki67, К19) в гетерогенной популяции кератиноцитов.

4.4. Получение кроличьих антител к дифференцированным и недифференцированным кератиноцитам.

4.5. Выявление субпопуляций кератиноцитов, окрашиваемых полученными антителами ИСб и ИСД.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Обогащение культуры кератиноцитов человека стволовыми клетками путем селективной адгезии к белкам внеклеточного матрикса"

В последние годы большой интерес вызывают исследования, связанные с изучением и применением стволовых клеток в медицине для заместительной клеточной терапии поврежденных тканей. При этом до сих пор ведется много дискуссий на тему, что же понимать под термином «стволовые клетки», и можно ли их использовать в клинике. Кроме клинического применения, наличие такой линии способствовало бы изучению механизмов регуляции дифференцировки клеток, а также изучению влияния на нее различных факторов. Для того чтобы детально их изучать, необходимо наличие постоянной линии стволовых клеток с тем, чтобы исключить вариации каких-либо признаков, которые можно наблюдать при использовании материала от разных доноров. Кроме того, такая линия являлась бы постоянным источником материала для клеточных технологий. На данный момент из взрослого организма удается выделять в чистом виде только гемопоэтические мезенхимные стволовые клетки. Однако линии стволовых клеток взрослого организма до сих пор не созданы.

Было обнаружено, что в ряде тканей взрослого организма существуют ниши, в которых находятся стволовые клетки, например, в коже в базальном слое кератиноцитов. Кожный покров человека и животных постоянно обновляется за, счет пролиферации кератиноцитов и их последовательной дифференцировки по направлению от базальной мембраны к поверхности кожи. Согласно существующим представлениям покоящиеся стволовые клетки эпидермиса сосредоточены у базальной мембраны и в волосяных фолликулах. Они дают начало так называемым транзиторным клеткам, способным интенсивно размножаться, за счет чего эпидермис постоянно обновляется. После нескольких делений они вступают на путь дифференцировки. В результате образуются разные слои эпидермиса, содержащие кератиноциты, находящиеся на разных уровнях дифференцировки (Хэм, Кормак, 1983).

При переводе в культуру кератиноцитов базального слоя эпидермиса они способны размножаться и воспроизводить такой же процесс последовательной дифференцировки, как это происходит в коже. Образуется многослойный пласт эпидермальных клеток, который может быть использован в технологиях заместительной клеточной терапии (Limat, Klein, 1993; Romero et al., 1999).

В связи с тем, что доказано существование стволовых клеток в коже человека, представляется актуальным получить популяцию кератиноцитов, обогащенную стволовыми клетками, которые обладают большим пролиферативным потенциалом. Пул таких клеток можно было бы использовать как для фундаментальных исследований, так и для применения в заместительной клеточной терапии. Предполагается, что это позволит повысить эффективность технологий восстановления структурной и функциональной целостности кожного покрова.

Решить задачу получения линии стволовых клеток или, по крайней мере, обогащения ими гетерогенной популяции базальных кератиноцитов, можно было бы осуществить путем выявления стволовых клеток методом проточной цитометрии с помощью специфических маркеров. В литературе описан ряд подобных маркеров (Michel et al., 1996; Pellegrini et al., 2001). Однако на наш взгляд они не являются строго специфичными для этого типа клеток, так как они носят скорее количественный характер и найдены и в клетках других тканей (Fradette et al., 1998; Reis-Filho et al., 2002). Кератиноциты разной степени дифференцировки различаются лишь только по величине содержания в них маркерных белков (Moles, Watt, 1997; Yang et al., 1998).

В связи с отсутствием строго специфичных маркеров необходимо искать другие экспериментальные подходы для четкого выделения этих клеток или, по крайней мере, для обогащения ими культивируемой популяции кератиноцитов. Стволовые клетки эпидермиса локализованы на базальной мембране и, следовательно, тесно взаимодействуют с входящими в ее состав белками (Spradling et al., 2001). В связи с этим представлялось перспективным для указанной цели применить метод селективной адгезии выделенных кератиноцитов к разным белкам внеклеточного матрикса (ВКМ) базальной мембраны, с которыми они взаимодействуют в неповрежденной коже. Для проверки данного предположения и разработки метода селективного разделения гетерогенной популяции клеток необходимо прежде всего выяснить, какие из белков базальной мембраны могут быть использованы для этой цели. Кроме того, важно установить степень взаимодействия с этими белками как свежевыделенной популяции кератиноцитов, так и после их культивирования.

Таким образом, четкое определение и идентификация стволовых клеток, обладающих высоким пролиферативным потенциалом, а также возможность получения из общей популяции эпидермальных клеток фракции стволовых кератиноцитов, представляет собой насущную задачу как для решения ряда фундаментальных вопросов, так и с точки зрения применения этих клеток в медицине с целью сокращения сроков заживления ран.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Спичкина, Ольга Георгиевна

6. выводы

1. Первичные кератиноциты кожи человека отличаются по способности к взаимодействию с различными белками внеклеточного матрикса. Наиболее адгезивными для них являются коллагены I и IV типов, а также фибронектин.

2. Недифференцированные кератиноциты, выявляемые окрашиванием антителами на кератины 5 и 14, обнаруживают наибольшую степень сродства к субстрату при коротких временах адгезии до 30 минут.

3. Совмещение морфометрического анализа прикрепившихся клеток к субстрату с окрашиванием на кератин 19, считающийся маркером стволовых клеток кожи, позволило выявить субпопуляцию мелких круглых клеток, предположительно представляющих собой субпопуляцию стволовых кератиноцитов.

4. Проведенные исследования с использованием таких маркеров стволовых клеток эпидермиса, как рбЗ и кератина 19, показали, что с их помощью возможно лишь выявлять и охарактеризовать группы клеток по наличию в них данных белков, однако они не могут являться строго специфичными только для стволовых клеток кожи в условиях in vitro.

5. С целью выявления маркерных белков, специфичных для стволовых клеток кожи, получены антитела на поверхностные белки кератиноцитов, которые выявляют более четкие различия между дифференцированными и недифференцированными клетками.

6. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что с помощью селективной адгезии с использованием специфических маркеров возможно проводить обогащение гетерогенной популяции кератиноцитов стволовыми клетками.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Спичкина, Ольга Георгиевна, Санкт-Петербург

1. Васильев А.В. 2003. Клеточные механизмы репарации тканевых повреждений. Диссертация. М.

2. Васильев А.В., Волошин А.В., Терских В.В. 1991. Роль фидерных клеток в прикреплении и росте кератиноцитов человека и крысы. Цитология. 33 (12): 84-89.

3. Горелик Ю.В. 1996. «Влияние элементов внеклеточного матрикса на функциональную активность эпидермальных кератиноцитов в культуре и при заживлении ран». Диссертация. СПб.

4. Горелик Ю.В., Блинова М.И., Пинаев Г.П. 1994. Влияние компонентов внеклеточного матрикса на распластывание кератиноцитов крысы на субстрате при культивировании в низкокальциевой среде. Цитология. 36(12): 1209-1212.

5. Калмыкова Н.В., Черепанова О.А., Горелик Ю.В., Воронкина И.В., Блинова М.И., Пинаев Г.П. 2002. Различное влияние ламинина-1 и ламинина 2/4 на адгезию и миграцию культивируемых кератиноцитов человека. Цитология. 44 (8): 792-798.

6. Хэм А., Кормак Д. 1983. Гистология. Перевод с англ. под ред. Афанасьева Ю.И., Ченцова Ю.С. М. Мир. т. 4. 244 с.

7. Черепанова О.А., Калмыкова Н.В., Воронкина И.В., Арэ А.Ф., Горелик Ю.В., Пинаев Г.П. 2002. Различия в характере взаимодействия нормальных и трансформированных кератиноцитов человека с изоформами ламинина. Цитология. 44 (2): 151 158.

8. Юдинцева Н. М., Горелик Ю. В., Дьяконов И. А., Калмыкова, Н. В., Блинова М. И., Пинаев Г. П. 1999. Трансплантация аллогенных эпителиальных пластов на ожоговые раны. Цитология. 41 (3/4): 328.

9. Adams, J. С., Watt, F. М. 1989. Fibronectin inhibits the terminal differentiation of human keratinocytes. Nature. 340: 307-309.

10. Adams J.C., Watt F.M. 1990. Changes in keratinocyte adhesion during terminal differentiation: reduction in fibronectin binding precedes alpha 5 beta 1 integrin loss from the cell surface. Cell. 63: 425-435.

11. Adams J.C., Watt,F.M. 1991. Expression of 131, B3, 134 and 135 integrins by human epidermal keratinocytes and non-differentiating keratinocytes. J. Cell Biol. 115: 829-841.

12. Akiyama M., Smith L.T., Shimizu H. 2000. Changing patterns of localization of putative stem cells in developing human hair follicles. J. Invest. Dermatol. 114: 321-327.

13. Alitalo K., Kuismcmen E., Myllyla R., Kiistala U., Asko-Seljavaara S., Vaheri A. 1982. Extracellular matrix proteins of human epidermal keratinocytes and feeder 3T3 cells. J. Cell Biol. 94 (3): 497-505.

14. Allen T.D., Potten C.S. 1974. Fine-Structural Identification and Organization of the Epidermal Proliferative Unit. J. Cell Sci. 15: 291-319.

15. Alonso L., Fuchs E. 2003. Stem cells of the skin epithelium. PNAS. 100: 1183011835.

16. Are A., Pinaev G., Burova E., Lindberg U. 2001. Attachment of A-431 cells on immobilized antibodies to the EGF receptor promotes cell spreading and reorganization of the microfilament system. Cell Motil Cytoskeleton. 48: 24-36.

17. Aumailley M, Nurcombe V., Edgar D., Paulsson M., Timpl.R. 1987. The cellular interaction of laminin fragments. Cell adhesion correlates with two fragment-specific high affinity binding sites. J. Biol. Chem. 262:11532-11538.

18. Aumailley M., Rousselle P. 1999. Laminins of the dermo-epidermal junction. Matrix Biology. 18: 19-28.

19. Ballaun С., Weninger W., Uthman A., Weich H., Tschacler E. 1995. Human keratinocytes express the three major splice forms of vascular endothelial growth factor. J. Invest. Dermatol. 104: 7-10.

20. Balmain A., Loehren D., Fischer J., Alonso A. 1977. Protein synthesis during fetal development of mouse epidermis. I. The appearance of "histidine-rich protein". Dev Biol. 60(2): 442-452.

21. Banb-Schlegel S., Green H. 1981. Involucrin synthesis and tissue assembly by keratinocytes in natural and cultured human epithelia. J Cell Biol. 90(3): 732-737.

22. Barrandon Y. 1993. The epidermal stem cell: an overview. Seminars in DEVELOPMENTAL BIOLOGY. V. 4: 209-215.

23. Barrandon Y., Green H. 1985. Cell size as a determinant of the clone-forming ability of human keratinocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 82: 5390-5394.

24. Barrandon Y., Green H. 1987. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc Natl Acad Sci USA. 84(8): 2302-2306.

25. Bazzoni G., Hemler M.E. 1998. Are changes in integrin affinity and conformation overemphasized? Trends Biochem Sci. 23(1): 30-34. Review.

26. Beck K., Dixon T. W., Engel J., Parry D.A. 1993. Ionic interactions in the coiled-coil domain of laminin determine the specificity of chain assembly. J. Mol. Biol. 231: 311-323

27. Beck K., Hunter I., Engel J. 1990. Structure and function of laminin: anatomy of multidomain glycoprotein. FASEB J. 4: 148-160.

28. Bickenbach J.R. 1981. Identification of label-retaining cells in oral mucosa and skin. JDentRes 122C: 1611-1620.

29. Bickenbach J.R. 1998. Selection and growth of epidermal stem cells. In: Savage DM, ed. Bioengineering of Skin Substitutes. Southborough, MA: IBC Library Series. 7592.

30. Bickenbach J.R., Chism E. 1998. Selection and extended growth of murine epidermal stem cells in culture. Exp. Cell Res. 244: 184-195.

31. Bickenbach J.R., Grinnell K.L. 2004. Epidermal stem cells: interactions in developmental environments. Differentiation. 72: 371-380.

32. Bickenbach J.R., Mackenzie I.C. 1984. Identification and localization of label-retaining cells in hamster epithelia. J Invest Dermatol 82:618-622.

33. Bjornson C.R.R., Rietze R.L., Reynolds B.A., Magli M.C., Vescovi A.L. 1999. Turning brain into blood: a hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo. Science 283: 534-537.

34. Borradori L., Sonnenberg A. 1999. Structure and function of hemidesmosomes: more than simple adhesion complexes. J. Investig. Dermatol. 112: 411-418.

35. Boudreau N.J., Jones P.L. 1999. Extracellular matrix and integrin signalling: the shape of things to come. Biochem J. 339 : 481-488.

36. Braun N., Papadopoulos Т., Muller-Hermelink H.K. 1988. Cell cycle dependent distribution of the proliferation-associated Ki-67 antigen in human embryonic lung cells. Virchows Arch В Cell Pathol Incl Mol Pathol. 56(1): 25-33.

37. Burgeson R.E., Chiquet M., Deutzmann R., Ekblom P., Engel J., Kleinman H., Martin G.R., Menegiizzsi G., Paulsson M., Sanes J., TimplR., Tryggvason K, Yamada Y., Yurchenco P.D. 1994. A new nomenclature for laminins. Matrix Biol. 14: 209-211

38. Caldwell C.J., Hobbs С., McKee P.H. 1997. The relationship of Ki67 and involucrin expression in proliferative, pre-neoplastic and neoplastic skin. Clin Exp Dermatol. 1997.22(1): 11-16.

39. Carter W.G., Ryan M.C., Gahr P.J. 1991. Epiligrin, a new cell adhesion ligand for integrin a3pl in epithelial basement membranes. Cell 65: 599-610.

40. Cary L.A., Han D.C., Polte T.R., Hanks S.K., Guan J.L. 1998. Identification of pl30Cas as a mediator of focal adhesion kinase-promoted cell migration. J Cell Biol. 140:211-221.

41. Chandrakasan G., Torchia D.A., Piez K.A. 1967. Preparation of intact monomeric collagen from rat tail tendon and skin and the structure of the nonhelical ends in solution. J. Biol. Chem. 251: 6062-6067.

42. Chen J.D., Helmod M., Kim J.P. 1994. Human keratinocytes make uniquely liner phagokinetic tracks. Dermatology. 188: 6-12.

43. Cherepanova O.A., Kalmykova N., Petrov Y.P., Blinova M., Pinaev G. 2006. Contribution of a2pi, a3(31, абр4 integrins and 67kDa laminin receptor to the interaction of epidermoid carcinoma A-431 cells with laminin-2/4. Cell. Biol. Int. 30: 784-792.

44. Clark R.A.F. 1990. Fibronectin matrix deposition and fibronectin receptor expression in healing and normal skin. J.I nvest. Derm. 94:128-134.i103

45. Clark R.A.F., Folkvord J.M., Wertz R.L. 1985. Fibronectin, as well as other extracellular matrix proteins, mediate human keratinocyte adherence. J Invest Dermatol. 84(5): 378-383.

46. Clark R.A.F., Lanigan J.M., Delia Pelle P., Manseau E., Dvorak H.F., Colvin R.B. 1982. Fibronectin and fibrin provide a provisional matrix for epidermal cell migration during wound reepithelialization. J. Derm. Dermat. 79: 264-269.

47. Clausen O.P.F., Potten C.S. 1990. Heterogeneity of keratinocytes in the epidermal basal cell layer. J Cutan Pathol. 17: 129-143.

48. Concha M., Vidal M.A., Moreno I., Salem C., Figueroa C.D., Schmitt D., Peguet-Navarro J. 2003. Evidence for modulation of human epidermal differentiation and remodelling by CD40. Br J Dermatol. 148(6): 1105-1114.

49. Cotsarelis G., Sun T.T., Lavker R.M. 1990. Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cell. 61(7):1329-1337.

50. Сох E.A., Sastry S.K., Huttenl'ocher A. 2001. Integrin-mediated adhesion regulates cell polarity and membrane protrusion through the Rho family of GTPases. Mol Biol Cell. 12:265-277.

51. Dale B.A. 1977. Purification and characterization of a basic protein from the stratum comeum of mammalian epidermis. Biochim Biophys Acta. 491(1): 193-204.

52. Damsky C., Sutherland A., Fisher S. 1993. Extracellular matrix 5: adhesive interactions in early mammalian embryogenesis, implantation, and placentation. FASEB. 7: 1320-1329.

53. Dawson R.A., Coberdhan N.J., Freedlander E., MacNeil S. 1996. Influence of extracellular matrix proteins on human keratinocyte attachment, proliferation and transfer to a dermal wound model. Burns. 22(2): 93-100.

54. DiPersio C.M., Hodivala-Dilke K.M., Jaenisch R., Kreidberg J.A., Hynes R.O. 1997. a3pi integrin is required for normal development of the epidermal basement, membrane. J. Cell Biol. 137: 729-742.

55. Dunnwald M., Tomanek-Chalkley A., Alexandrunas D., Fishbaugh J., Bickenbach J.R. 2001. Isolation a pure population of epidermal stem cells for use in tissue engineering. Exp. Dermatol. 10: 45-54.

56. Ehrig K., Leivo I., Argraves W.S., Ruoslanti E., and Engvall E. 1990. Merosin, a tissue- specific basement membrane protein, is a laminin-like protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 3264-3268.

57. Elices M.J., Hemler M.E. 1989. The human integrin VLA-2 is a collagen receptor on some cells and a collagen/laminin receptor on others. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(24): 9906-9910.

58. Elices M.J., Urry L.A., Hemler M.E. 1991. Receptor functions for integrin VLA-3: fibronectin, collagen, and laminin binding are differentially influenced by Arg-Gly-Asp peptide and by divalent cations. J.Cell Biol.l 12: 169-181.

59. Fleischmajer R., PerlishJ.S., MacDonald E.D. 2nd, Schechter A., Murdoch A.D., Iozzo R. V. Yamada Y. 1988. There in binding of collagen IV to beta 1 integrin during early skin basement membrane assembly. Ann. N.Y. Acad. Sci. 857: 212-227.

60. Fradette J., Germain L., Seshaiah P., Coulombe P.A. 1998. The type I keratin 19 possesses distinct and context-dependent assembly properties. J. Biol. Chem. 273: 35176-35184.

61. Fuchs E. 1988. Keratins as biochemical markers of epithelial differentiation. Trends in Genetics. 4: 277-281.

62. Fuchs E. 1995. Keratins and the skin. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 11: 123-153.

63. Fuchs E., Dow ling J., Segre J., Lo S.H., and Yu Q.-C. 1997. Integrators of epidermal growth and differentiation: distinct functions of pi and (34 integrins. Curr. Opin. Gen. Dev. 7: 672-682.

64. Fuchs E. Green H. 1980. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocytes. Cell. 19: 1033-1042.

65. Fuchs E., Weber К. 1994. Intermediate filaments: Structure, dynamics, function, and disease. Annual. Review of Biochemistry. 63: 345-382.

66. Gaffen J.D. 1992. Interaction between the cell surface and the extracellular matrix. Br. J. Rheumatol. 31: 74-76.

67. Gehlsen K.R., Dicker son K., Argraves W.S., Engvall E., Ruoslahti E. 1989. Subunit structure of a laminin-binding integrin and localization of its binding site on laminin. J Biol Chem. 264(32): 19034-19038.

68. Geiger В., Bershadsky A., Fankov R., Yamada K.M. 2001. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix—cytoskeleton crosstalk. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2: 793-805.

69. Gerdes J., Lemke H., Baisch H., Wacker H.-H., Schwab U., Stein H. 1984. Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67. J. Immunol. 133: 1710- 1715.

70. Gerdes J., Schwab U., Lemke H., Stein H. 1983. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int. J. Cancer. 31: 13-20.

71. GianeottiF. G., Ruoslahti E. 1999. Integrin signaling. Science 285: 1028-1032.

72. Gilchrest B.A., Calhoun J.K., Maciag T. 1982. Attachment and growth of human keratinocytes in a serum-free environment. J Cell Physiol. 112(2): 197-206.

73. Goberdhan N.J., Edgecombe M., Freedlander E., MacNiel S. 1997. Extracellular matrix proteins induce changes in intracellular calcium and cyclic AMP signalling systems in cultured human keratinocytes. Burns. 23(2): 122-130.

74. Goldfinger L.E., Hopkinson S.B., deHart G. W., Collawn S., Couchman J.R., Jones J.C. 1999. The a3 laminin subunit, a6134 and a3131 integrin coordinately regulate wound healing in cultured epithelial cells and in the skin. J. Cell Sci. 112: 2615-2629.

75. Gorelik J. V., Cherepanova O.A., Voronkina I. V., Diakonov LA., Blinova M.L. and Pinaev G.P. 2001. Laminin-2/4 from human placenta is a better adhesion agent for primary keratinocytes than laminin-1 from EHS sarcoma. Cell Biol. Int. 25 (5): 395-402.

76. Graf J., Ogle R.C., Robey F.A., Sasaki M., Martin G.R., Yamada Y., Kleinman H.K. 1987. A pentapeptide from the laminin В1 chain mediates cell adhesion and binds the 67 000 laminin receptor. Biochem. 26: 6896-6900.

77. Green H. 1977. Terminal differentiation of cultured human epidermal cells. Cell. 11(2): 405-416.

78. Green H., Kehinde O., Thomas J. 1979. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 76: 5665-5668.

79. Grinnell F. 1992. Wound repair, keratinocyte activation and integrin modulation. J. Cell Sci. 101: 1-5.

80. Grose R., Hutter C., Bloch W., Thorey I., Watt F.M., Fassler R., Brakebusch C., Werner S. 2002. A crucial role of beta 1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair. Development (Cambridge, U.K.). 129 (9): 2303-2315.

81. Guillaud P., du Manoir S., Seigneurin D. 1989. Quantification and topographical description of Ki-67 antibody labelling during the cell cycle of normal, fibroblastic (MRC-5) and mammary tumour cell lines (MCF-7). Anal Cell Pathol. 1: 25-39.

82. Guo M., Toda K-I., Grinnell F. 1990. Activation of human keratinocyte migration on type I collagen and fibronectin . J. Cell Sci. 96: 197-205.

83. Haeffner E.W., Kolbe K, Schroeter D., Paweletz N. 1980. Plasma membrane heterogeneity in ascites tumor cells. Isolation of a light and a heavy membrane fraction of the glycogen-free Ehrlich-Lettre substrain. Biochim Biophys Acta. 603(1): 36-51.

84. Hakkinen L., Hildebrand H.C., Berndt A., Kosmehl H., Larjava H. 2000. Immunolocalization of tenascin-C , a9 integrin subunit and avP6 during wound healing in human oral mucosa. J. ITistochem. Cytochem. 48: 985-998.

85. Hakiknen L., Koivisto L., Larjava H. 2001. An improved method for culture of epidermal keratinocytes from newborn mouse skin. Methods Cell Sci. 23(4): 189196.

86. Hostikka L., Tryggvason K. 1987. Extensive structural differences between genes for the alpha 1 and alpha 2 chains of type IV collagen despite conservation of coding sequences. FEBS Lett. 224(2): 297-305.

87. Huelsken J., Vogel R., Erdmann В., Cotsarelis G., Birchmeier W. 2001. B-Catenin controls hair follicle morphogenesis and stem cell differentiation in the skin. Cell. 105: 533-545.

88. Hynes R. 1985. Molecular biology of fibronectin. Review. Annu Rev Cell Biol. 1:67.90.

89. Jensen P.K., Bolund L. 1988. Low Ca2+ stripping of differentiating cell layers in human epidermal cultures: an in vitro model of epidermal regeneration. Exp Cell Res. 175(1): 63-73

90. Jensen U.B., Lowell S., Watt F.M. 1999. The spatial relationship between stem cells and their progeny in the basal layer of human epidermis: a new view based on whole mount labelling and lineage analysis. Development. 126: 2409-2418.

91. Jones P.H., Harper S., Watt,F.M. 1995. Stem cell patterning and fate in human epidermis. Cell. 80: 83-93.

92. Jones P.H., Watt F.M. 1993. Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression. Cell. 73: 713-724.

93. Jones J., Watt F.M., Speight P.M. 1997. Changes in the expression of av integrins in oral squamous cell carcinomas. J. Oral Pathol. Med. 26: 63-68.

94. Karasek M.A. 1980. Effect of chemical modification of keratinocytes and collagen in keratinocyte-collagen interactions. Curr Probl Dermatol. 10: 143-158.

95. Karecla P.L., Timpl R., Watt F. 1994. Adhesion of human epidermal keratinocytes to laminin. Cell Adhesion Commun. 2: 309-318.

96. Kariniemi A.L., Lehto V.P., Vartio Т., Virtanen I. 1982. Cytoskeleton and pericellular matrix organization of pure adult human keratinocytes cultured from suction-blister roof epidermis. J Cell Sci. 58: 49-61.

97. Kaur P., Li A. 2000. Adhesive properties of human basal epidermal cells: an analysis of keratinocyte stem cells, transit amplifying cells, and postmitotic differentiating cells. J Invest Dermatol. 114(3): 413-420.

98. Kibbey M. C. 1994. Maintenance of the EHS sarcoma and matrigel preparation. J. Tissue Culture Methods. 16: 227-230.

99. Kikkawa Y., Sanzen N., Sekiguchi K. 1998. Isolation and characterization of laminin-10/11 secreted by human lung carcinoma cells. Laminin-10/11 mediates cell adhesion through integrin a3pl. J. Bio. Chem. 273: 15854-15859.

100. Kim J.P., Chen J.D., Wilke M.S. 1994. Human keratinocyte migration on type IV collagen . Role of heparin-binding site and alpha2 beta 1 integrin. Lab Invest. 74: 401408.

101. Kim D.S., Cho H.J., Choi H.R., Kwon S.B., Park K.C. 2004. Isolation of human epidermal stem cells by adherence and the reconstruction of skin equivalents. Cell Mol. Life Sci. 61:2774-2781.

102. Kim J.P. Zhang K, Chen J.D. 1992. Mechanism of human keratinocyte migration on fibronectin: unique role of RGD sites and integrins. J. Cell Physiol. 151: 443-450.

103. Kleinman H.K. 1994. Isolation of laminin-1 and type IV collagen from the EHS sarcoma. J. Tissue Culture Methods. 16: 231-233.

104. Kleinman H.K., McGarvey M.L., Hassell J.R., Star V.L., Cannon F.B., Laurie G.W., Martin G.R. 1986. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25(2): 312-318.

105. Kopan R., Traska G., Fuchs E. 1987. Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examining keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization. J. Cell Biol. 105: 427-440.

106. Kreidberg J.A. 2000. Functions of alpha3betal integrin. Review. Curr Opin Cell Biol. 12(5): 548-553.

107. Kubo M., Kan M., Isemura M., Yamane I., Tagami H. 1987. Effects of extracellular matrices on human keratinocyte adhesion and growth and on its secretion and deposition of fibronectin in culture. J Invest Dermatol. 88(5): 594-601.

108. MacKenzie I.C., Bickenbach JR. 1985. Label-retaining keratinocytes and Langerhans cells in mouse epithelia. Cell Tissue Res. 242 (3): 551-556.

109. Mackenzie I.C., Mackenzie S.L., Rittman G.A. 1989. Isolation of subpopulations of murine epidermal cells using monoclonal antibodies against differentiation-related cell surface molecules. Differentiation 41: 127-138.

110. Matoltsy A.G. 1976. Keratinization. J. Invest. Dermatol. 67: 20-25.

111. Matoltsy A.G., Huszar T. 1972. Keratinization of the reptilian epidermis: an ultrastructural study of the turtle skin. J Ultrastruct Res. 38(1): 87-101.

112. Mercurio A.M., Rabinovitz I., Shaw L.M. 2001. The абр4 integrin and epithelial cell migration. Curr. Opin. Cell Biol. 13: 541-545.

113. Moles J.-P., Watt F.M. 1997. The epidermal stem cell compartment: variation in expression levels of E-cadherin and catenins within the basal layer of human epidermis. J. Histochem. Cytochem. 45: 867-874.

114. Moll R., Frank W.W., Schiller D.L., Geiger В., Krepler R. 1982. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells. Review. Cell. 31(1): 11-24.

115. Monical P.L., Kefalides N.A. 1994. Coculture modulates laminin synthesis and mRNK levels in epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts. Exp.Cell Res. 210(2): 154-159.

116. Morita K., Urabe K., Moroi Y., Koga Т., Nagai R., Horiuchi S., Furue M. 2005. Migration of keratinocytes is impaired on glycated collagen I. Wound Repair Regen. 13(1): 93-101.

117. Morris R.J., Fischer S.M., Slaga T.J. 1985. Evidence that the centrally and peripherally located cells in the murine epidermal proliferative unit are two distinct cell populations. J Invest Dermatol. 84(4): 277-281.

118. Morris R.J., Potten C.S. 1994. Slowly cycling (label-retaining) epidermal cells behave like clonogenic stem cells in vitro. Cell Prolif. 27(5): 279-289.

119. Morris R.J., Potten C.S. 1999. Highly persistent label-retaining cells in the hair follicles of mice and their fate following induction of anagen. J Invest Dermatol. 112(4): 470-475.

120. Murray J.C., Stingl G., Kleinman H.K., Martin G.R., Katz S.I. 1979. Epidermal cells adhere preferentially to type IV (basement membrane) collagen. J Cell Biol. 80(1): 197-202.

121. Nelson W., Sun T.-T. 1983. The 50- and 58-kdalton keratin classes as molecular markers for stratified squamous epithelia : cell culture studies. J. Cell Biol. 97: 244-251.

122. Nguyen B.P., Ryan M.C., Gil S.G., Carter W.G. 2000. Deposition of laminin 5 in epidermal wounds regulates integrin signaling and adhesion. Review. Curr Opin Cell Biol. 12(5): 554-562.

123. Nishimura S.L., Sheppard D., Pytela R. 1994. Integrin avl38. Interaction with vitronectin and functional divergence of the 138 cytoplasmic domain. J. Biol. Chem. 269: 28708-28715.

124. O'Keefe E.J., Woodley D.T., Gastillo G., Russell N., Payne R.E. 1984. Production of soluble and cell-associated fibronectin in cultured keratinocytes. J. Invest. Dermatol. 82:150-155

125. Orkin R. W., Gehron P., McGoodwin E.B., Martin G.R., Valentine Т., Swarm R. 1977. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. J Exp Med 145(1): 204-220.

126. Palm S.L., Furcht L.T. 1983. Production of laminin and fibronectin by Schwannoma cells: cell-protein interactions in vitro and protein localization in peripheral nerve in vivo. J. Cell Biol. 96: 1218-1226.

127. Pellegrini G., Dellambra E., Golisano O., Martinelli E., Fantozzi I., Bondanza S., Ponzin D., McKeon F., De Luca M. 2001. p63 indentifies keratinocyte stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 3156-3161.

128. Petersen M.J., Woodley D.T., O'Keefe E.J. 1988. Cultured human keratinocytes synthesize and secrete type IV procollagen. Abstract. Clin. Res. 36: 378.

129. Petrov Yu. P., Krylova T. A., Tsupkina N. V., Pershina V.P. 2007. Spreading as the general attribute of cell population. J. Biol. Sciences. 7: 102-112.

130. Pilcher B.K., Dumin J.N., Sudbeck B.D., Krane S.M., Welgus H.J., Parks W.C. 1997. The Activity of Collagenase-1 Is Required for Keratinocyte Migration on a Type I Collagen Matrix. J.Cell.Biol. 137(6): 1445-1457.

131. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K, Douglas R., Mosca J.D., Moorman M.A., Simonetti D. W. Craig S., Marshak D.R. 1999. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284: 143-147.

132. Potten C. S. 1983. in Stem Cells: Their Identification and Characterization, ed. Potten C. S. Churchill Livingston, London. 200-232.

133. Potten С. S., Hendry J.H. 1973. Clonogenic cells and stem cells in the epidermis. Int. J. Radiat. Biol. 24: 537-540.

134. Potten C.S., Hume W.J., Reid P., Cairns J. 1978. Cell. The segregation of DNA in epithelial stem cells. 5(3): 899-906.

135. Potten C.S., Kovacs L., Hamilton E. 1974. Continuous labelling studies on mouse skin and intestine. Cell Tissue Kinet. 7(3): 271-283.

136. Potten C.S., Morris R.J. 1988. Epithelial stem cells in vivo. J Cell Sci. Suppl. 10:45.62.

137. Potten C.S., Wichmann H.E., Loeffler M, DobekK., Major D. 1982. Evidence for discrete cell kinetic subpopulations in mouse epidermis based on mathematical analysis. Cell Tissue Kinet. 15(3): 305-329.

138. Pytela R., Pirschbacher M.D., Ruoslahti E. 1985. Identification and isolation of a 140 kd cell surface glycoprotein with properties expected of a fibronectin receptor. Cell. 40: 191-198.

139. Quinlan R.A., Schiller D.L., Hatzfeld M., Achtstatter Т., Moll R., Jorcano J.L., Magin T.M., Franke W. W. 1985. Patterns of expression and organization of cytokeratin intermediate filaments. Ann. N.Y. Acad. Sci. 455: 282-306.

140. Radu E., Simionescu O., Regalia Т., Dumitrescu D., Popescu L.M. 2002. Stem cells (p63(+)) in keratinocyte cultures from human adult skin. J. Cell. Mol. Med. 6: 593598.

141. Raghow R. 1994. The role of extracellular matrix in postinflammatory wound healing and fibrosis. FASEB J. 8: 823-831.

142. Reis-Filho J.S., Torio В., Albergaria A., Schmitt F.C. 2002. p63 expression in normal skin and usual cutaneous carcinomas. J Cutan Pathol. 29(9): 517-523.

143. Rheinwald J.G. 1980. Serial cultivation of normal epidermal keratinocytes. Meth.Cell Biol. 21 A: 229-254.

144. Rice R.H., Green H. 1979. Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions. Cell. 18: 681-694.

145. Roskelley C.D., Srebrow A., Bissell M.J. 1995. A hierarchy of ECM-mediated signalling regulates tissue-specific gene expression. Curr. Opin. Cell Biol. 7:736-747.

146. Ruoslahti E., Hayman E.G., Pirschbacher M., Engvall E. 1982. Fibronectin: purification, immunochemical properties, and biological activities. Methods in Enzymology. 82: 803-830.

147. Schnapp L.M., Hatch N., Ramos D.M., Klimanskaya I. V., Sheppard D., Pytela R. 1995. The human integrin a8bl functions as a receptor fooor tenascin, fibronectin and vitronectin. J.Biol. Chem. 270: 23196-23202.

148. Sechler J.L., Corbett S.A., Wenk M.B., Schwarzbauer J.E. 1998. Modulation of cell-extracellular matrix interactions. Review. Ann N Y Acad Sci. 857:143-154.

149. Sewry C.A., Dalessandro M., Wilson L.A., Sorokin L.M., Naom I., Bruno S., Ferlini A., Dubowitz V., Muntoni F. 1996. Expression of laminin chains in skin in merosin deficient congenital muscular dystrophy. Neiropediatrics. 28: 217-222.

150. Sieg D.J., Hauck C.R., llic D., Klingbeil C.K., Schaefer E., Damsky C.H., Schlaepfer D.D. 2000. FAK integrates growth-factor and integrin signals to promote cell migration. Nat Cell Biol. 2: 249-256.

151. Simonart Т., FaytL, Noel J.C. 2002. An immunohistochemical study of abnormal \ keratinocyte proliferation in molluscum contagiosum. British Journal of Dermatology146: 609-614.

152. Skerrow D., Skerrow C.J. 1983. Tonofilament differentiation in human epidermis: isolation and polypeptide chain composition of keratinocytes subpopulation. Exp. Cell Res. 143:27-35.

153. Smola H., Stark H.J., Thiekotter G., Mirancea N., Krieg Т., Fusenig N.E. 1998. \ Dynamics of basement membrane formation by keratinocyte-fibroblast interactions inorganotypic skin culture. Exp. Cell Res. 239: 399-410.

154. Sobel S., Rosenberg M.D. 1983. Characterization of cellular attachment and spreading molecules at liquid-liquid interfaces. Anal. Biochem. 140 : 486-489.

155. Sonnenberg A., Calafat J., Janssen H., Daams H., Van der Raalj-Helmer L.M.H., Faicioni R., Kennel S.J., Aplin J. D., Baker J., Loizidou M., Garrod D. 1991. Integrins

156. Spradling A., Drummond-Barbosa D., Kai T. 2001. Stem cells find their niche. Nature. 414: 98-104.

157. Steinert P.M., Cantieri J.S., Teller D.C., Lonsdale-Eccles J.D., Dale B.A. 1981. Characterization of a class of cationic proteins that specifically interact with intermediate filaments. Proc Natl Acad Sci USA. 78(7): 4097-4101.

158. Stenn K.S., Malhotra R. 1992. Epithelialization. In: Wound healing-biochemical & clinical aspects, eds. Cohen I.K., Diegelmann R.F., Lindblad W.J. Pennsylvania: Saunders WB. pp. 115-127.

159. Stepp M.A. 1999. a9 and (38 integrin expression correlates with the merger of the developing mouse eyelids. Dev. Dyn. 214: 216-228.

160. Stepp M.A., Zhu L., Sheppard D. and Cranfill R.L. 1995. Localised distribution of a9 integrin in the cornea and changes in expression during corneal epithelial cell differentiation J. Histochem. Cytochem. 43: 353-362.

161. Stupack D. G. 2005. Integrins as a distinct subtype of dependence receptors. Cell Death Differ. 12 : 1021-1030.

162. Stupack D. G., Cheresh D.A. 2002. Get a ligand, get a life: integrins, signaling and cell survival. J. Cell Sci. 115: 3729-3738.

163. Suter M.M., Crameri F.M., Olivry Т., Mueller E., von Tscharner C., Jensen P.J. 1997. Keratinocyte biology and pathology. Veter. Dermatology. 8: 67-100.

164. Sutherland J., Denyer M., Britland S. 2005. Motogenic substrata and chemokinetic growth factors for human skin cells. J. Anat. 207: 67-78.

165. Tagami H., Parrish J.A., Ozawa T. (eds.). 1998. Skin. Interface of a living system. Amsterdam, Elsevier Science B.V. 212 p.

166. TakashimaA., Grinnell F. 1985. Fibronectin-mediated keratinocyte migration and initiation of fibronectin receptor function in vitro. J.Invest. Dermatol. 85 (4): 304-308.

167. Tani Т., Lehto V-P., Virtanen I. 1999. Expression of laminins 1 and 10 in carcinoma cells and comparison of their roles in cell adhesion. Exp.Cell Res. 248: 115121.

168. TaniH., Morris R.J., Kaur P. 2000. Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 97: 10960-10965.

169. Timpl R. 1996. Macromolecular organization of basement membranes. Curr. Opin. Cell Biol. 8:618-624.

170. Timpl R., Tisi D., Talts J.F., Andac Z., Sasaki Т., Hohenester E. 2000. Structure and function of laminin LG modules. Review. Matrix Biol. 19(4): 309-317.

171. Timpl R., Wiedemann H., Van Delden V., Furthmayr H., Kiihn K. 1981. A network model for the organization of Type IV collagen molecules in basement membrane. Eur. J. Biochem. 120: 203-211.

172. Toole B.P. 1991". Proteoglycans and hyaluronan in morfogenesis and differentiation. In: Hay E.D., ed. Cell Biology of Exracellular matrix.2nd ed. New York: Plenum Press. 305-341.

173. Tseng S.C.J., Jarvinen M.J., Nelson W.G., Huang J.-W., Woodcock-Mitchell J., Sun T.-T. 1982. Correlation of specific keratins with different types of epithelial differentiation: monoclonal antibody studies. Cell. 30: 361-372.

174. Venstrom K. A., Reichardt L. F. 1993. Extracellular matrix. 2: Role of extracellular matrix molecules and their receptors in the nervous system. FASEB. 7: 996-1003.

175. Viae J., Staquet M.J., Thivolet J., Goujon C. 1980. Experimental production of antibodies against stratum corneum keratin polypeptides. Arch. Dermatol. Res. 267: 179188.

176. Watt F.W. 1983. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. Review. J Invest Dermatol. 81(1 Suppl): 100s-103s.

177. Watt F.M. 1984. Selective migration of terminally differentiating cells from the basal layer of cultured human epidermis. J. Cell Biol. 98: 16-21.

178. Watt F. W. 1987. Influence of cell shape and adhesiveness on stratification and terminal differentiation of human keratinocytes in culture. Review. J Cell Sci Suppl. 8: 313-326.

179. WattF. M. 1998. Epidermal stem cells: markers, patterning and the control of stem cell fate. Phil.Trans. R. Soc. Lond. B. 353: 831-837.

180. Watt F.M. 2002. Role of integrins in regulating epidermal adhesion, growth and differentiation. The EMBO Journal. 21(15): 3919-3926.

181. Watt F.M., Green H. 1982. Stratification and terminal differentiation of cultured epidermal cells. Nature. 295 (5848): 434-436.

182. Watt F.M., Hertle D.M. 1994. Keratinocytes integrins. In The Keratinosytes Handbook. UK, Cambridge University Press: 153-164.

183. Watt F.M., Kubler M.-D., Hotchin N.A., Nicholson L.J., Adams J.C. 1993. Regulation of keratinocyte terminal differentiation by integrin-extracellular matrix interactions. J. Cell Sci., 106:, 175-182.

184. Wayner E.A., Carter W.G. 1987. Identification of multiple cell adhesion receptors for collagen and fibronectin in human fibrosarcoma cells possessing unique a and common b subunits. Z Cell Biol. 105: 1873-1884.

185. Webb A., Li A., Kaur P. 2004. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72(8): 387-395.

186. Wewer U.M., Engvall E. 1994. Laminins. Meth.Enzymol. 245: 85-104.

187. Woodcock-Mitchell J., Eichner R., Nelson W.G., Sun T.-T. 1982. Immunolocalization of keratin polypeptides in human epidermis using monoclonal antibodies. J. Cell Biol. 95: 580-588.

188. Woodley D.T., Stanley J.R., Reese M.J., O'Keefe E.J. 1988. Human dermal fibroblasts synthesize laminin. J. Invest. Dermatol. 90: 679-683

189. Wu Y.J., Rheinwald J.G. 1981. A new small (40 kd) keratin filament protein made by some cultured human squamous cell carcinomas. Cell. 25(3): 627-635.

190. Yamada K.M., Kennedy D.W. 1985. Amino acid sequence specificities of an adhesive recognition signal. J.Cell Biol. 28: 99-104.

191. Yoshida I., Tashiro K-I., Monji A., Nagata I., Hayashi Y., Mitsuyama Y., Tashiro N. 1999. Identification of heparin binding site and the biological activities of the laminin al chain carboxy-terminal globular domain. J.Cellular Phys. 179: 18-28.

192. Yurchenco P.D., Amenta P.S., Patton B.L. 2004. Basement membrane assembly, stability and activities observed through a developmental lens. Matrix Biology. 22: 521538.

193. Yurchenco P.D., Cheng Y.S., Colognato H. 1992. Laminin forms an independent network in basement membranes. J.Cell Biol. 117 (5): 1119-1133.

194. Yurchenko R., Furthmayr H. 1984. Self-assembly of basement membrane collagen. Biochemistry 23: 1839-1850.

195. ZhuA.J., Watt F.M. 1999. beta-catenin signalling modulates proliferative potential of human epidermal keratinocytes independently of intercellular adhesion. Development. 126(10): 2285-2298.

196. Zillikens D. 1999. Acquired skin disease of hemidesmosomes. J. Dermatol. Sci. 20: 134-154.

Информация о работе
  • Спичкина, Ольга Георгиевна
  • кандидата биологических наук
  • Санкт-Петербург, 2008
  • ВАК 03.00.25
Диссертация
Обогащение культуры кератиноцитов человека стволовыми клетками путем селективной адгезии к белкам внеклеточного матрикса - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Обогащение культуры кератиноцитов человека стволовыми клетками путем селективной адгезии к белкам внеклеточного матрикса - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы