Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная и иммуноцитохимическая характеристики кожи ампутированной нижней конечности при синдроме диабетической стопы

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Структурная и иммуноцитохимическая характеристики кожи ампутированной нижней конечности при синдроме диабетической стопы"

На правах рукописи

Горшунова Галина Николаевна

Структурная и иммуноцитохимическая характеристики кожи ампутированной нижней конечности при синдроме диабетической стопы

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

13 НОЯ 2014

Казань-2014

005554781

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Валиуллин Виктор Владимирович

Официальные оппоненты: Зайцев Валерий Борисович,

доктор медицинских наук, профессор кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии ГБОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Шумихина Галина Васильевна,

доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой гистологии, эмбриологии и цитологии ГБОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится 28 ноября 2014 г. в 10 часов на заседании Совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Д 208.034.01 по специальности 03.03.04. - «Клеточная биология, цитология, гистология» при ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздрава России по адресу: 420012, Казань, ул. Бутлерова, 49.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Казанского ГМУ Минздрава России: 420012, Казань, ул. Бутлерова, 49., корпус Б; и на официальном сайте www.kgmu.kcn.ru

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного Зубаирова Ляйли Диляверовна

совета, доктор медицинских наук, профессор

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Лечение сахарного диабета (СД) является одной из социально значимых задач, и она остается актуальной как для медицинской науки, так и для здравоохранения в целом (Старкова Н.Т., 2002; Gregg Е. Et al., 2004; Porepa L. et al„ 2010). Осложнения этого грозного заболевания приводят к ранней инвалидизации в результате вынужденных оперативных вмешательств, таких как ампутация пораженной диабетической гангреной конечности, при этом прогноз заживления послеоперационной раны зачастую бывает затруднителен, причем повсеместно наблюдается тенденция роста количества больных с синдромом диабетической стопы (СДС), доля которых составляет в России 4-10% от больных СД (Аметов A.C. и др., 2014; Бахарев В.А., Редькин Ю.А., 2003; Грекова Н.М., Бордуновский В.Н., 2009; Оболенскнй В.Н. и др., 2012; Хлебникова А.Н., Марычева Н.В., 2011).

Тяжелые метаболические нарушения, сопровождаемые многократным увеличением содержания глюкозы и поражением сосудов, лежащие в основе патогенеза СД, приводят к негативным изменениям почти всех органов и тканей организма, в том числе и кожи, однако, до настоящего времени недостаточно изучены процессы регенерации кожи в условиях нарушенной трофики у диабетических больных (Лыкова С.Г., Немчанинова О.Б., 1997). Накопление конечных продуктов гликозилирования в тканях сосудов, окислительный стресс, нарушение реологических характеристик крови приводит к разнообразным патологическим поражениям кожи и нижележащих тканей (Ефимов Е.В., 2013; Севергина Э.С., 2002; Sargen М. et al., 2013). Известно, что основными фундаментальными процессами, определяющими постоянство структурно-функциональной организации ткани вообще и кожи в частности, являются клеточное обновление, цитодифференцировка и клеточная гибель (Мяделец О.Д., Адаскевич В.П., 1997). Вместе с тем пока мало что известно о механизмах апоптоза в эпидермисе в условиях СД, кроме того, практически не исследованы процессы дифференци-ровки различных клеточных типов эпидермиса при диабетической ангиопатии.

Применительно к хирургии очень важным вопросом является выявление визуальных границ повреждения тканей нижней конечности при СД, так как они, как правило, не соответствуют истинному распространению патологического процесса. Достаточно часто существует скрытый участок некроза, поэтому неадекватно выбранный объем оперативного вмешательства часто не дает ожидаемого результата, что

приводит к необходимости повторных оперативных вмешательств - высокие ампутации и, как следствие, значительная летальность (Светухин A.M., Земляной А.Б., 2002).

Несмотря на очевидность связи между сосудистыми нарушениями и состоянием кожи диабетических больных, а также наличие многочисленных данных о корреляции между ними, способность таких сосудистых нарушений самостоятельно приводить к некрозу тканей стопы не является доказанной, несмотря на то, что факт нарушения функционирования тонуса микрососудов при СД не вызывает сомнений (Shami S., Chittenden S„ 1991).

В связи с тем, что морфология кожи при СД может отражать деструктивные изменения и в других нижележащих тканях, а также ввиду относительной простоты биопсии кожи, перспективно ее использование в качестве выявления маркера осложнений СД, угрожающих внутренним органам (Удовиченко О.В., Токмакова А.Ю., 2001). Классические морфологические методы не подходят для этих целей в условиях ангиопатии при диабете, в виду их низкой информативности. Еще одним фактором, имеющим большое значение для регенерации кожи, является уровень ее васкуляриза-ции. Все эти морфологические компоненты тканей легко выявляются в иммуногисто-химических реакциях, и они отражают фундаментальные процессы и несут информацию о функциональном состоянии клеток кожи и ее структур.

Исходя из этого, целью нашего исследования стало изучение особенностей структурной организации кожи ампутированной нижней конечности больных СД II типа.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Определить уровень экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток PCNA в эпидермисе нижней конечности больных с СДС на различных уровнях отдаленности от линии ампутации.

2. Сравнить интенсивность экспрессии антиапоптотического маркера Вс1-2 в эпидермисе на разных участках ампутированной нижней конечности диабетических больных.

3. Определить морфометрические характеристики эпидермиса ампутированной нижней конечности больных СД.

4. Выявить изменения экспрессии маркеров терминальной клеточной диффе-ренцировки цитокератинов 1 и 10 в коже диабетических больных в зоне ампутации нижней конечности и на участках, расположенных дистальнее выбранного уровня ампутации.

5. На основании изучения экспрессии: 1) белка базальной мембраны коллагена IV типа измерить толщину сосудистой стенки и диаметр просвета сосудов в коже на участках, локализованных на различной удаленности от места ампутации нижней конечности диабетических больных; 2) белка межклеточных контактов эндотелиальных клеток РЕСАМ-1 (С 0-31) оценить изменения сосудистой плотности в коже на участках, локализованных на различной удаленности от места ампутации нижней конечности при СДС.

6. Сравнить выраженность экспрессии рецепторов к сосудистому эндотелиаль-ному фактору роста УЕСИ в коже на уровне ампутации нижней конечности больных СДС и дистально удаленных от зоны операционного поля участках.

Научная новизна. Впервые методами иммуногистохимии показаны изменения пролиферативной активности различных клеток эпидермиса кожи в условиях анпго-патии при СД на разных уровнях удаленности от места ампутации нижней конечности больных диабетом. Новыми следует признать данные о снижении пролиферативной активности клеток эпидермиса по мере приближения к пораженному гангреной участку нижней конечности.

Приоритетными являются данные о том, что в коже зоны ампутации конечности антиапоптотическая активность клеток эпидермиса не отличается от таковой у здоровых людей. Однако показано, что этот показатель резко увеличен в промежуточной области между зоной ампутации и гангренозно-измененной частью нижней конечности. В то время как в зоне, расположенной в непосредственной близости от гангренозно-измененной части нижней конечности установлено резкое снижение экспрессии антиапоптотического маркера в эпидермоцитах.

Впервые при выявлении экспрессии цитокератинов 1 и 10 показано, что клетки супрабазальных слоев эпидермиса кожи области, расположенной в непосредственной близости к гангренозно-измененному очагу менее дифференцированы по сравнению с теми же клетками эпидермиса кожи контрольной группы. При этом отмечается резкое снижение экспрессии цитокератнна 1 в коже области рядом с очагом гангрены, и

постепенное снижение экспрессии цитокератина 10 по мере приближения к гангренозно-измененному очагу.

Новыми являются данные о том, что в коже диабетических больных происходит увеличение сосудистой плотности в сосочковом и сетчатом слоях дермы в образцах кожи на всех изученных участках ампутированной нижней конечности, что стало возможным при выявлении экспрессии мембранного белка ..эндотелиальных клеток сосудов СО-31.

В работе впервые было проведено сравнение толщины базальной мембраны сосудов кожи больных СДС и кожи здоровых людей. Согласно полученным результатам, иммуногистохимическим методом с применением антител к основному белку базальной мембраны, коллагену IV типа, выявлено утолщение базальной мембраны в коже на всех исследованных в работе уровнях ампутированных нижних конечностей диабетических больных.

Проведенное иммуногистохимическое исследование кожи ампутированных нижних конечностей больных СДС с выявлением рецепторов сосудистого эндотели-ального фактора роста (УЕОРЯ-1) впервые показало, что в коже ампутированной конечности их экспрессия становится более выраженной по мере приближения к гангренозно-измененному очагу.

Научно-практическая значимость. Одной из сложностей изучения различных клеток в патологических условиях является выбор надежных маркеров для их идентификации и оценки состояния. Классические морфологические подходы в этих условиях малоинформативны. Применение методов иммуногистохимии может позволить решить эти задачи. Полученные результаты, свидетельствующие о специфических изменениях, происходящих в эпидермисе и дерме в условиях ангиопатии при СД, позволяют корректно оценить морфофункциональное состояние различных клеточных типов эпидермиса и дермы, а также разработать способы фармакологической коррекции.

Имеющиеся данные предполагают применение иммуногистохимических методик с использованием антител к маркерам: а) пролиферации, б) апоптоза, в) диффе-ренцнровки клеток кожи у больных диабетическими ангиопатиями.

Использование современных иммуногистохимических подходов позволяет получить принципиально новые сведения о поведении различных клеток кожи в уело-

виях диабетической ангиопатии. Применение иммуногистохимического подхода может стать необходимым для запросов практической медицины, в частности, для решения проблемы регенерации кожи и других тканей у больных СД в постоперационный период.

Также проведенное исследование имеет несомненный теоретический интерес, поскольку раскрывает процессы межтканевых и межклеточных взаимодействий, лежащих в основе регенераторной способности кожи в условиях ангиопатии при СД.

Основные положения, выносимые на защиту

В коже ампутированной конечности диабетических больных: 1) нарушается дифференцировка кератиноцитов; 2) происходит увеличение относительного содержания кровеносных сосудов микроциркуляторного русла с одновременным уменьшением их просвета за счет утолщения базальной мембраны; 3) усиливается экспрессия рецепторов к эндотелиальному сосудистому фактору роста в клетках эпидермиса и дермы.

Внедрение результатов исследования

В ходе проведенного данного исследования были модифицированы методы иммуногистохимического выявления антигенов и эти модификации внедрены в практическую работу кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО Казанского государственного медицинского университета.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на III Межрегиональной заочной научно-практической конференции «Фундаментальные науки — практике» (Ижевск, 2011); XI Конгрессе международной ассоциации морфологов (Самара, 2012); Научной конференции с международным участием, посвященная памяти профессора Р.И. Асфандиярова (Астрахань, 2012); 88 Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых, посвященной 200-летию Казанского государственного медицинского университета (Казань. 2014); Научно-практической конференции с международным участием, посвященной 85-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки Республики Беларусь, лауреата Государственной премии Республики Беларусь, профессора П.ИЛобко (Минск, 2014).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 121 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов, списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 24 рисунками, которые включают 38 микрофотографий световой микроскопии, диаграммы. Библиографический список содержит 250 источников, из них 189 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В соответствии с поставленными целями и задачами работы были изучены особенности структурной организации кожи нижних конечностей больных СД II типа при изменениях, индуцированных диабетической ангиопатией.

При выполнении работы были использованы гистологические и иммуногисто-химические методы. Проведение исследований одобрено Локальным Этическим Комитетом государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (протокол № 4 от 9.10.2012).

Для исследования определена группа, состоящая из 14 больных с СДС в возрасте от 70 до 77 лет. Все пациенты страдали СД II типа, длительность заболевания варьировала от 10 до 17 лет. Очаги поражения локализовались на дистальных участках нижних конечностей, в области стопы с переходом на нижнюю треть голени. Все пациенты были проконсультированы сосудистым хирургом. Проведена ультразвуковая доплерография сосудов нижних конечностей в 100% случаях. С добровольного информированного согласия пациентов у них был произведен забор образцов кожи с ампутированной нижней конечности размером 0,5 см. Забор материала осуществлялся с соблюдением этики и деонтологии - после операции в отсутствии пациентов.

Контрольную группу составили 6 здоровых (из них 3 женщин и 3 мужчин) в возрасте от 67 до 75 лет, у которых образцы кожи были получены при хирургических операциях с области голени в травматологических отделениях. Полученные от этой группы препараты кожи были приняты за образцы сравнения, которые отличались и от срезов кожи, полученных с линии ампутации больных с СДС.

Изучение морфологических особенностей кожи больных с СДС проведено на образцах кожи ампутированной конечности после операции по поводу диабетической гангрены нижних конечностей. Образцы ткани брали из кожи ампутированной нижней конечности с трех областей: 1) из верхней трети голени (непосредственно в этом месте проводилась ампутация); 2) дистальнее ампутации - на 10 см ниже ампутации; 3) на 2 см проксимальнее видимой границы гангренозно - измененной области.

Гистологический и иммуногистохимпческий методы

Гистологическое исследование проводили на парафиновых срезах, приготовленных по стандартной методике (Коржевский Д.Э., Гиляров A.B., 2010; Лили Р., 1969).

Парафиновые срезы окрашивали гематоксилин-эозином и иммуногистохими-чески с использованием антител к ядерному антигену пролиферирующих клеток (proliferating cell nuclear antigen, PCNA) (FL-261, Santa Cruz Biotechnology, USA), Bcl-2 (C 21, Santa Cruz Biotechnology, USA), цитокератину 1 (Клон 34ßB4, Novocastra, UK), цитокератину 10 (Клон LHP1 Novocastra, UK), коллагену IV типа (Клон PHM-12, Novocastra, UK), CD-31 (2F7B2, Santa Cruz Biotechnology, USA; Клон 1A10, Novocastra, UK), рецептору сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR-1) (С-17, Santa Cruz Biotechnology, USA). Исследование проведено с применением непрямого имму-нопероксидазного метода (Javois L., 1999; Киясов А.П. 2001). Далее гистологические срезы изучались под микроскопом (Leica, Германия) с последующим фотографированием через фотопреобразователь на фотокамеру.

Нами также было проведено морфометрическое исследование. Для оценки пролиферативной активности клеток эпидермиса на срезах кожи, окрашенных имму-ногистохимически с антителами к PCNA, производили подсчет позитивно окрашенных на 100 клеток в эпидермисе не менее чем в трех полях зрения под увеличением х200. Результат выражали в виде доли позитивно окрашенных ядер от общего числа ядер.

Для оценки степени дифференцировки клеток эпидермиса на срезах кожи, окрашенных иммуногистохимически с антителами к цитокератинам I и 10 (маркеры эпителиальной дифференцировки) производили подсчет позитивно окрашенных клеток на 100 клеток в эпидермисе не менее чем в двух полях зрения под увеличением х200.

Измерение толщины эпидермиса производили по описанной ранее методике (Robertson К., Rees J., 2010) с помощью программного пакета AxioVision Reí. 4.8 (Zeiss). Измерение толщины базального слоя эпидермиса (в мкм) производили с помощью программного пакета AxioVision Reí. 4.8 (Zeiss) на срезах кожи, докрашенных гематоксиллином, на препаратах под увеличением х400 не менее чем в трех полях зрения.

Сосудистую плотность кожи определяли на препаратах, исследуя по три случайных поля зрения срезов кожи, окрашенных иммуногистохимически с антителами к CD31, маркеру эндотелия, под увеличением хЮО. С помощью программного пакета AxioVision Reí. 4.8 (Zeiss) определяли площадь сосочкового и сетчатого слоев дермы (в мкм"), затем производили подсчет позитивно окрашенных сосудов.

Измерение диаметра сосудов проводили на препаратах, исследуя по 3 случайных поля зрения срезов кожи, окрашенных иммуногистохимически антителами к коллагену IV, под увеличением х200. На микрофотографиях с помощью программного пакета AxioVision Reí. 4.8 (Zeiss) у не менее чем 10-ти позитивно окрашенных сосудов округлой формы определяли внутренний и внешний диаметр (в мкм), затем вычисляли толщину стенки сосудов. Для стандартизации исследования статистическая обработка проводилась с данными, полученными при измерении сосудов, чей внешний диаметр находился в диапазоне от 19 до 19,4 мкм. Для статистической обработки принимались результаты измерений 3-х сосудов заданного калибра в одном срезе.

Изображения срезов кожи, окрашенных с антителами к Вс1-2, подвергались анализу с помощью плагина "Colour Deconvolution" графического пакета ImageJ по методике, описанной Ruifrok и Johnston (Ruifrok A., Johnston D., 2001).

Статистическую обработку результатов тестирования и морфометрии проводили с использованием пакета программ Origin 50. Статистическую достоверность разницы определяли с помощью t-критерия Стьюдента (Гланц С., 1998). Во всех статистических данных уровень достоверности был принят меньше 0,05 (р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе нашего исследования в эпидермисе кожи нижних конечностей больных СД обнаружены клетки, дающие выраженную иммунопозитивную реакцию с антителами к PCNA. Морфометрический анализ полученных данных показал, что экспрес-

сия РСЫА кератииоцитов имеет тенденцию к падению пролиферативного потенциала в эпидермисе кожи больных диабетом в участках с выраженным нарушением трофики (таблица 1).

Таким образом, по всем основным критериям, которые были использованы в работе для оценки изменений, происходящих в коже в условиях диабетической ан-гиопатии, показано снижение пролиферативной активности кератиноцитов при данном патологическом состоянии.

Таблица 1 — Экспрессия РСЫА в клетках эпидермиса

Зона забора материала Кожа здоровых контролей Кожа зоны ампутации Кожа области на 10 см дистальнее зоны ампутации Кожа зоны на 2 см прокси-мальнее пораженной гангреной области

Количество иммуно-позитивных клеток на 100 клеток 71,4±2,4% 64,01±2,3%* 44,98±0,8%* 26,5±1,4%'

( ) - Р<0,05

При этом отмечается утолщение эпидермиса и его базального слоя по сравне-

нию с контрольной группой (таблица 2).

Таблица 2 - Толщина базального слоя эпидермиса кожи нижних конечностей

Зона забора материала Кожа здоровых контролен Кожа зоны ампутации Кожа области на 10 см дистальнее зоны ампутации Кожа зоны на 2 см проксималь-нее пораженной гангреной области

Толщина базального слоя эпидермиса, мкм 15±1 13,7±0,69 16,2 ±0,6 21,2±Г

( ) - Р<0,05

Вместе с тем применительно к коже одним из недостатков этого маркера является то, что он не в полной мере отражает ее состояния, ибо помимо пролиферации для функционирования кожи чрезвычайно важны процессы дифференцировки, о которых, как уже было сказано выше, можно судить по экспрессии цитокератинов 1 и 10. В связи с этим, для получения дополнительной информации о морфофункцио-нальном состоянии клеток эпидермиса, представляется целесообразным применить

еще и маркеры терминальной дифференцировки кератиноцитов (цитокератины 1 и 10) (Moles J.. Watt F., 1997). В итоге два этих показателя будут интегрально отражать базисный комплекс изменений основных элементов эпидермиса и более полно характеризовать ее морфофункциональное состояние (Bodey В., Siegel S., 2004; Moll R. et al., 1982). Так, результаты проведенного исследования продемонстрировали, что им-муногистохимический метод с использованием антител к цитокератинам 1 и 10 выявляет равномерное окрашивание клеток супрабазальных слоев эпидермиса. Характерной особенностью иммунореактивности супрабазальных кератиноцитов была аккумуляция иммунопозитивного материала в их цитоплазме. Полученные результаты согласуются с имеющимися в литературе данными об экспрессии различных цитокера-тинов в клетках эпидермиса (Bodey В., Siegel S., 2004) и позволяют утверждать, что различия субпопуляций высоко - и умеренно дифференцированных клеток не ограничиваются их морфологическими особенностями, а имеют также и функциональные различия, как в норме, так и при патологии.

Таким образом, проведенное нами иммуногистохимическое исследование обнаружило, что экспрессия маркеров терминальной дифференцировки кератиноцитов щгтокератинов 1 и 10 в коже здорового выражена во всех супрабазальных слоях эпидермиса, в то время как в условиях СД наблюдается негативная иммуногистохимиче-ская реакция не только в базальном слое кератиноцитов, но и в вышележащих слоях эпидермиса, что свидетельствует о возможном нарушении процессов дифференцировки кератиноцитов.

Сопоставление результатов морфометрической оценки в обеих группах исследуемых образцов указывает на тенденцию к снижению экспрессии маркеров терминальной дифференцировки в зависимости от степени выраженности сосудистых изменений нижней конечности в части, максимально приближенной к гангренозно-измененному участку (таблицы 3, 4). В то время как в коже зоны ампутации отклонения этого показателя не выявилось.

Таблица 3 - Экспрессия цитокератина-1 в клетках эпидермиса

Зона забора материала Кожа здоровых контролей Кожа зоны ампутации Кожа области на 10 см ди-стальнее зоны ампутации Кожа зоны на 2 см проксимальнее пораженной гангреной области

Количество иммуно-позитивных клеток на 100 клеток 58,5±1,0% 59,3±1,7% 58,0±1,7% 41,6±2,9%"

( ) - Р<0,05

Проведенное нами исследование помогло выяснить, как соотносятся процессы

пролиферации, апоптоза и дифференцировки клеток эпидермиса в коже в условиях диабета. Как уже отмечалось выше, одним из маркеров возможности вступления клетки в апоптоз является белок Вс1-2, экспрессия которого свидетельствует о малой вероятности для нее этого процесса.

Таблица 4 - Экспрессия цитокератина-10 в клетках эпидермиса

Зона забора материала Кожа здоровых контролей Кожа зоны ампутащш Кожа области на 10 см дистальнее зоны ампутации Кожа зоны на 2 см проксимальнее пораженной гангреной области

Количество нммуно-позитивных клеток на 100 клеток 59,6±1,3% 58,6±1,6% 49,7±1,8%* 36,9±2,6%'

( ) - Р<0,05

При оценке экспрессии белка Вс1-2 в коже области ампутированной конечности

установлено, что иммунопознтивная реакция кератиноцитов к антителам белка определяется чаще в клетках кожи, в которой поражения микрососудов менее выражены.

Однако в кератиноцитах максимально пораженной области ампутированной конечности экспрессия Вс1-2 снижена. Возможно, протеин Вс1-2, препятствуя развитию апоптоза, может играть ключевую роль в выживании кератиноцитов при повреждениях, индуцированных гипоксией и избытком глюкозы в этих условиях. Проведенное нами исследование позволило обнаружить, что в коже здорового человека иммунопознтивная реакция кератиноцитов с антителами к Вс1-2 выявлена как в клетках базального слоя, так и в дифференцированных кератиноцитах вышележащих слоев, что очень важно для регуляции численности клеток здоровой кожи. Наше иссле-

дование продемонстрировало, что происходит снижение экспрессии антиапоптотиче-ского белка Вс1-2 кератиноцитами в коже на участке, расположенном на 2 см прок-симальнее от пораженной гангреной области ампутированной нижней конечности (таблица 5), что может указывать на повышение возможности развития апоптоза в эпидермоцитах в условиях диабетической ангиопатии. При этом в зоне, находящейся на 10 см дистальнее линии ампутации, зафиксирован уровень экспрессии Вс1-2 выше уровня экспрессии Вс1-2 в коже, как области линии ампутации, так и в коже здоровых людей. Наше исследование продемонстрировало несущественную разницу этого показателя в клетках эпидермиса в коже здоровых людей и в коже линии ампутации нижних конечностей больных СДС.

Таблица 5 - Экспрессия Вс1-2 в клетках эпидермиса

Зона забора материала Кожа здоровых контролей Кожа зоны а мутации Кожа области на 10 см дистальнее зоны ампутации Кожа зоны на 2 см проксималь-нее пораженной гангреной области

Средняя интенсивность серого пикселя 83,7±3,3 84,9±1,5 95,5±1,9" 47,3±2,2"

(") - Р<0,05

В контрольной группе при иммуногистохимическом исследовании сосудов микроциркуляторного русла кожи в реакции с СО 31 выявлялась равномерная экспрессия антигена в эндотелии сосудов, что свидетельствует об их нормальном физиологическом состоянии. Однако аналогичное окрашивание кожи больного диабетом выявила, что экспрессия Сй 31 носит очаговый характер и наряду с высокой интенсивностью, обнаруживается ее отсутствие в некоторых зонах, возможно, нарушения целостности эндотелия, что является наиболее характерным признаком повреждения микрососудов при СД. Все эти данные свидетельствует о токсическом действии гипергликемии на сосудистую стенку кожи (Салтыков Б.Б., Пауков В.С, 2002). При этом результаты нашего исследования показали, что сосудистая плотность в дерме на всех уровнях, изученных в нашем исследовании, нижних конечностей больных диабетической ангиопатией выше по сравнению с аналогичными показателями нижних конечностей здоровых людей (таблицы 6, 7).

Таблица 6 - Сосудистая плотность сосочкового слоя дермы нижних конечностей

Зона забора материала Кожа здоровых контролей Кожа зоны ампутации Кожа области на 10 см дистальнее зоны ампутации Кожа зоны на 2 см проксималь-нее пораженной гангреной области

Количество сосудов на 1 мм" 162±4 204,9±б" 205,9±7" 215±5'

(") - Р<0,05 Таблица 7 - Сосудистая плотность сетчатого слоя дермы нижних конечностей

Зона забора материала Кожа здоровых контролей Кожа зоны ампутации Кожа области на 10 см дистальнее зоны ампутации Кожа зоны на 2 см прокси-мальнее пораженной гангреной области

Количество сосудов на 1 мм" 20,8±0,9 27±1,7" 25,9±1,2* 32,8±1,2"

( ) - Р<0,05

Однако степень васкуляризации кожи еще не определяет эффективность кровоснабжения. Известно, что при СД увеличивается содержание коллагена IV типа в сосудах кожи, который является основным структурным компонентом базальной мембраны, обусловливая стабильность данной структуры, объем фильтрации и селективную проницаемость мембраны. Показано, что иммуногистохимическое исследование с применением антител к коллагену IV типа, при диабете уменьшается суммарный просвет сосудов в коже ампутированных нижних конечностей больных СДС, что, по-видимому, является одним из факторов трофических нарушений (таблицы 8, 9). Так, при выявлении экспрессии коллагена IV типа нами обнаружено утолщение базальной мембраны сосудов, приводящее к уменьшению их просвета. В изучаемых препаратах у диабетических больных выявляется разрыхленность диффузно утолщенной стенки сосудов кожи, что не может не сказаться на проницаемости таких сосудов дермы, что приводит к гибели тканей и развитию гангрены. В то же время иммуногистохимическое изучение экспрессии коллагена IV типа в коже здоровых людей показало целостность базальной мембраны сосудов кожи без признаков утолщения и расслоения.

Таблица 8 - Толщина базальной мембраны сосудов кожи нижних конечностей

Зона забора материала Кожа здоровых контролей Кожа зоны ампутации Кожа области на 10 см дистальнее зоны ампутации Кожа зоны на 2 см проксималь-нее пораженной гангреной области

Толщина базальной мембраны сосудов, мкм 4,5±0,07 6,08±0,07* 6,05±0,07' 6,08±0,07'

(") - Р<0,05 Таблица 9 - Диаметр просвета сосудов кожи нижних конечностей

Зона забора материала Кожа здоровых контролей Кожа зоны ампутации Кожа области на 10 см дистальнее зоны ампутации Кожа зоны на 2 см прокси-мальнее пораженной гангреной области

Диаметр просвета сосудов, мкм 10,02±0,1 7,03±0,Г 7,04±0,Г 6,99±0,Г

(*) - Р<0,05

Нормальное функционирование сосудов не возможно без эффективного ангио-генеза, регулируемого различными гуморальными факторами. Одним из них является сосудистый эндотелиальный фактор роста УЕСР. Не известно, как в условиях диабета изменяется чувствительность различных клеток эпидермиса и дермы к нему. Мы попытались исследовать это при помощи антител к рецепторам к УЕвР (УЕОРЯ-1).

Уровень экспрессии УЕСРЯ-1 в дерме ампутированной нижней конечности больных с СДС прогрессивно увеличивается по мере приближения к гангренозно-измененной области конечности, коррелируя с другими признаками диабетической ангиопатии, таким как, например, утолщение базальной мембраны сосудов кожи. В то время как в коже здоровых людей уровень экспрессии УЕСРЯ-1 в ткани минимален. Это дает возможность высказать предположение о том, что экспрессия УЕОРЙ.-1 в организме усиливается во время патологического ангиогенеза. Поскольку УЕвР признают ключевым проангиогенным фактором, ответственным за образование новых кровеносных сосудов при диабетической ангиопатии, то становится очевидным, что и экспрессия рецепторов также увеличивается. Вероятно, что УЕОП1-1- опосредуемая активация сосудистого эндотелия играет важную роль в патогенезе диабетической ан-

гиопатии. Утолщение базальной мембраны сосудистой стенки и слущивание эндоте-лиоцитов приводит к уменьшению просвета сосудов, затруднению адекватной перфузии и, как следствие, гипоксии тканей. Это в свою очередь является пусковым механизмом для усиления ангиогенеза. Однако, по-видимому, новообразованные сосуды достаточно быстро претерпевают те же патологические изменения, которые характерны для диабетической ангиопатии. Вкупе это приводит лишь к увеличению сосудистой плотности в дерме, без возможности осуществлять трофическую функцию в полном объеме. Значительное увеличение экспрессии VHGFR-1 отмечено в дерме ди-стальных участков ампутированной конечности и, вероятно, связано с компенсаторным повышением активности ангиогенеза в пораженной коже.

Диабетическая микроангиопатия, как показывают многие исследования, носит генерализованный характер и поражает мелкие сосуды различных органов: глаз, почек, головного мозга, печени, легких и т.д. (Михалева Л.М. и др., 2009; Lobroscino G. et al., 2004). По данным ряда исследований наиболее перспективным для диагностики диабетической микроангиопатии является изучение биоптатов кожи как наиболее доступных для морфологического исследования (Салтыков Б.Б., Пауков B.C., 2002).

Анализируя полученные данные о влиянии диабетической ангиопатии на пролиферацию, дифференцировку и устойчивость к апоптозу клеток эпидермиса нижней конечности при СДС, возникают предположения о возможных нарушениях в процессах регенерации кожи диабетических больных.

Известно, что основным патофизиологическим механизмом, снижающим резистентные свойства кожи при СД, является нарушение ее трофики, которое может возникнуть в результате нарушения микроциркуляции в коже (Светухин A.M., Земляной А.Б., 2002; Anand P. et al., 1996). Также общепризнано, что гипергликемия является причиной патологических изменений, приводящих к различным проявлениям микро-ангиопатий. У больного диабетом глюкоза, содержание которой в крови превышает биологически нормальные значения, вступает в химическую связь с различными протеинами, например, такими как коллаген, образуя промежуточные соединения. Данное промежуточное соединение переструктурируется, приводя к образованию конечных продуктов повышенного гликозилирования. Эти продукты накапливаются в соединительной ткани кровеносных сосудов, приводя к их повышенной проницаемости и потере эластичности, а также в составе утолщенных базальных мембран (Севергина

Э.С., 2002). Таким образом, одним из главных факторов в развитии ангиопатий при диабете является гипергликемия (Удовиченко О.В., Токмакова А.Ю., 2001).

Возможно, что нарушения в микроциркуляторном русле при диабетической ан-гиопатии в виде утолщения базальной мембраны сосудов кожи и слущивания клеток эндотелия в просвет сосудов ведет к компенсаторному повышению экспрессии УЕОПЫ и, как следствие, увеличению сосудистой плотности в дерме. Однако, судя по показателям снижения экспрессии маркера пролиферации РСЫА в клетках эпидермиса, снижения экспрессии маркеров терминальной дифференцировки цитокера-тинов 1 и 10, а также снижения экспрессии антиапоптотического белка Вс1-2 в кера-тиноцитах можно предположить, что компенсаторных механизмов ангиогенеза не достаточно для обеспечения нативности кожи как ткани в этих условиях.

Таким образом, полученные данные демонстрируют, что в условиях диабетической ангиопатии в коже происходят разнообразные изменения, свидетельствующие о нарушениях в процессах регенерации, дифференцировки, при этом нарушения затрагивают как эпидермис, дерму, так и сосуды кожи. Суммарным эффектом всех этих изменений является гибель кожи как органа.

ВЫВОДЫ

1. В коже ампутированной нижней конечности диабетических больных, при выявлении экспрессии PCNA обнаруживается снижение пролиферативного потенциала клеток эпидермиса в направлении от места линии ампутации к гангренозно-измененной области.

2. В коже ампутированной нижней конечности диабетических больных при выявлении экспрессии маркера апоптоза Вс1-2 обнаружено:

а) повышение экспрессии этого маркера в кератиноцитах в зоне на 10 см ди-стальнее линии ампутации;

б) снижение этого показателя в зоне, расположенной на 2 см проксимальнее гангренозно-измененной области;

в) в коже по линии ампутации этот показатель практически не отличается от показателя здоровых людей.

3. В коже ампутированной нижней конечности диабетических больных при выявлении экспрессии цитокератинов 1 и 10 и окрашивании гематоксилином и эозином показано:

а) снижение экспрессии цитокератина 1 в зоне близкой к гангренозно-измененному участку;

б) постепенное снижение экспрессии цитокератина 10 происходит от места линии ампутации к гангренозно-измененной области;

в) увеличение толщины эпидермиса в образцах с выраженным поражением микрососудов.

4. В коже ампутированной нижней конечности диабетических больных при выявлении коллагена IV типа во всех изученных образцах ампутированной конечности выявляется диффузное утолщение базальной мембраны сосудов кожи, сопровождаемого уменьшением их просвета.

5. В коже ампутированной нижней конечности диабетических больных при изучении экспрессии СВ31 обнаружено увеличение сосудистой плотности в дерме и повреждение эндотелия сосудов на всех исследованных уровнях забора материала.

6. В коже ампутированной нижней конечности диабетических больных при выявлении рецепторов к эндотелиальному сосудистому фактору роста УЕСРЯ-1 наблюдается:

а) умеренное увеличение экспрессии УЕСРК-1, отмеченное в дерме области линии ампутации;

б) более выраженная экспрессия УЕОРЯ-1 в зоне на 10 см дистальнее линии ампутации;

в) ярко выраженная экспрессия УЕОИМ в зоне на 2 см проксимальнее гангренозно-измененной области.

Практические рекомендации

Рекомендовать внедрение в практику отделений гнойной хирургии комплексную иммуногистохимическую оценку структурных изменений кожи при выборе места ампутации больных с синдромом диабетической стопы с учетом возможности регенерации кожи. Установленные особенности кожи в условиях диабетической ангио-патии следует учитывать при моделировании исследовательских работ, посвященных проблемам регенерации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Горшунова Г.Н. Оценка морфологического состояния кожи у больных диабетической ангиопатией / Г.Н. Горшунова, В.В. Валиуллин // III Межрегиональная заочная научно-практическая конференция «Фундаментальные науки — практике». Сборник тезисов. - Ижевск. - 2011. - С. 20-21.

2. Горшунова Г.Н. Иммуногистохимическое изучение кожи больных диабетом / Г.Н. Горшунова, В.В. Валиуллин // Морфология. - 2012. - Т. 141, №3. - С. 47-48.

3. Горшунова Г.Н. Морфологические изменения кожи при диабетической ан-гиопатш! / Г.Н. Горшунова, В.В. Валиуллин // Журнал анатомии и гистопатологии. -2012. -Т.1,№3. - С. 44-46.

4. Горшунова Г.Н. Иммуногистохимическая характеристика кожи больных диабетом / Г.Н. Горшунова, В.В. Валиуллин // Астраханский медицинский журнал. -2012.-Т. 7, №4. -С. 87-89.

5. Горшунова Г.Н. Морфологические аспекты изучения кожи больных сахарным диабетом / Г.Н. Горшунова, В.В. Валиуллин // Морфологические ведомости. - 2013. - №4. - С. 15-23.

6. Горшунова Г.Н. Диабетические изменения сосудистого русла кожи: им-муногистохимическое исследование / Г.Н. Горшунова, А.М. Девятаев, В.В. Вали-уллин // Астраханский медицинский журнал. - 2013. - Т. 8, №4. - С. 57-62.

7. Горшунова Г.Н. Иммуногистохимическое изучение эпидермиса ампутированной конечности больных сахарным диабетом / Г.Н. Горшунова, P.A. Дза-муков, В.В. Валиуллин // Казанский медицинский журнал. - 2014. - Т. XCV, №2. -С. 244-249.

8. Горшунова Г.Н. Иммуногистохимическое исследование морфофункциональ-ного состояния кожи больных диабетом / Г.Н. Горшунова, В.В. Валиуллин // 88-я Всероссийская научно-практическая конференция студентов и молодых ученых, посвященная 200-летию Казанского государственного медицинского университета. Сборник тезисов. - Казань. - 2014. - С. 259.

сд сдс

Bcl-2

CD PCNA

PEC AM-1

(CD31)

VEGF

VEGFR (flt-1)

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

сахарный диабет

синдром диабетической стопы

B-cell lymphoma/leukemia protein-2, белок В-клеточной

лимфомы-антиапоптотический белок

Cluster of Differentiation, кластер дифференцировки

Proliferating cell nuclear antigen (ядерный антиген пролифериру-

ющих клеток)

Platelet/endothelial cell adhesion molecule 1 (молекула клеточной адгезии)

Vascular Endothelial Growth Factor (сосудистый эндотелиальный фактор роста)

Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (рецептор сосудистого эндотелиального фактора роста)

1 <0 / л' •

Формат 60x84/16 Гарнитура Тайме. Бумага офсетная №1 Печать RISO. Уч.-изд.л.1,2 Подписано в печать 25.09.2014 Тираж 100 экз. ЦЕНТР ПЕЧАТИ "Линк" Казань, ул. Карла Маркса, 51