Тропомиозин и альфа-актинин-4 в составе мультимолекулярных цитоплазматических комплексов, не связанных со структурами цитоскелета

Бобков, Данила Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Тропомиозин и альфа-актинин-4 в составе мультимолекулярных цитоплазматических комплексов, не связанных со структурами цитоскелета
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Тропомиозин и альфа-актинин-4 в составе мультимолекулярных цитоплазматических комплексов, не связанных со структурами цитоскелета"

На правах рукописи

БОБКОВ Данила Евгеньевич

ТРОПОМИОЗИН И АЛЬФА-АКТИНИ11-4 В СОСТАВЕ МУЛЬТИМОЛЕКУЛЯРНЫХ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ КОМПЛЕКСОВ, FIE СВЯЗАННЫХ СО СТРУКТУРАМИ

ЦИТОСКЕЛЕТА

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2010

004604943

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАИ, Санкт-Петербург.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Георгий Петрович Пннаев Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Владимир Иосифович Воробьев Институт цитологии РАН

доктор биологических наук, Надежда Владимировна Кулёва Санкт-Петербургский Государственный университет

Ведущее учреждение: Московский Государственный университет,

Биологический факультет

Защита диссертации состоится 18 июня 2010 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

e-mail: cellbio@mail.cytspb.ru сайт: www.cytspb.rssi.ru факс: 8 (812)297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Реферат разослан «18» мая 2010 года. Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

у/ Е.В.Каминская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

При действии на клетки в культуре различных биологически активных молекул, таких как эпидермальный фактор роста, фактор некроза опухоли - а, лизофосфатидиловая кислота и других факторов, происходит активация транскрипционных факторов, в том числе перемещение р65-субъсдиницы №-кВ из цитоплазмы в ядро, изменение экспрессии ряда генов и прочие характерные для проведения сигнала события. Одновременно с этим происходит быстрая реорганизация актинового цитоскелета. По-видимому, любые биологически активные агенты, как растворимые так и иммобилизованные на подложке, в частности белки внеклеточного матрикса, при взаимодействии с поверхностными рецепторами клетки вызывают быструю реорганизацию цитоскелета. Так, у клеток с мало развитым актиновым нитоскелетом в течение 10 мин после действия внешних факторов цитоскелет может полностью разбираться и затем снова собираться в течение часа, образуя структуры, характерные для каждого конкретного сигнального агента. При этом остаётся неясным, связаны ли между собой сигнальные события и процессы цитоскелетных перестроек, и если связаны, то каким образом такая связь может осуществляться. Так как при действии различных агентов происходят сходные перестройки у клеток разного происхождения, по-видимому, должны существовать универсальные механизмы, регулирующие этот процесс.

При наблюдении за реорганизацией цитоскелета было обнаружено, что цитоскелетные белки, которые обычно находятся в составе актин-содержаищх структур, выявляются в цитоплазме и в виде отдельных независимых частиц. К таким белкам относятся, в частности, актин-связывающие белки а-актинин-4 и тропомиозин, которые по данным иммунофлуоресценции выявляются в цитоплазме в виде крупных белковых комплексов, не связанных с актиновыми структурами. Функция таких комплексов неизвестна. В литературе высказывается предположение, о том, что эти комплексы вовлечены в процессы реорганизации цитоскелета, а может быть, участвуют и в процессе проведения сигнала. Для выяснения их функций прежде всего надо удостовериться, что такие мультимолекулярные комплексы действительно существуют, затем определить, какие белкн туда входят, а также установить, могут ли эти комплексы изменяться в процессе реорганизации цитоскелета под действием различных внешних индукторов.

Цел» и задачи работы

Цель данной работы состояла в выделении из цитоплазмы культивируемых клеток мультимолекулярных белковых комплексов, содержащих тропомиозин и а-актинин-4, определении их состава и возможного его изменения при перестройках цитоскелета под действием различных индукторов.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) Разработать метод выделения из цитозоля мультимолекулярных белковых комплексов без полного разрушения культивируемых клеток и нарушения структур актинового цитоскелета.

2) Провести анализ белкового состава мультимолекулярных комплексов, содержащих а-актинин-4 и тропомиозин.

3) Установить, изменяется ли количество и состав этих комплексов в процессе реорганизации актинового цитоскелета под действием эпидермального фактора роста и других сигнальных агентов (трихостатин А, лизофосфатидиловая кислота, фактор некроза опухоли - а).

Основные положения, выносимые па защиту

• 1. Разработан новый метод выделения цитоплазматических мультимолекулярных белковых комплексов без разрушения структур актинового цитоскелета.

• 2. Установлено, что актин-связывающие белки тропомиозин и а-актинин-4 могут существовать не только в структурах цитоскелета, но и в составе не связанных с цитоскелетом мультимолекулярных комплексов.

• 3. Показано, что в комплексы, содержащие а-актинин-4, входят также р65-субъединица транскрипционного фактора ЫР-кВ, белки теплового шока 1кр70 и ЬврЭС), а также ряд других белков - актин, миозин 9, спектрин, плектин и кератины. Состав этих комплексов изменяется при действии на клетки эпидермального фактора роста и фактора некроза опухоли- а.

• 4. В комплексах, содержащих тропомиозин, выявлены р65 субъединица ЫР-кВ, 1кр70, Ьвр90 и миозин 9.

• 5. Установлено, что при действии на клетки ростовых факторов и других внешних лигандов, вызывающих быстрые перестройки цитоскелета, происходят изменения количественного содержания и состава исследуемых белковых комплексов.

• 6. Совокупность полученных данных приводит к заключению о том, что цитоплазматические мультимолекулярные комплексы могут принимать участие в процессах реорганизации цитоскелета и передачи внутриклеточных сигналов.

Научная новизна полученных результатов

Разработан новый метод выделения белковых комплексов, содержащихся в цитозоле, без полного разрушения клеток, основанный на частичном разрушении плазматической мембраны малым объемом буфера. В работе впервые показано, что цитоплазматические мультимолекулярные белковые комплексы, содержащие актин-связывающие белки тропомиозин и альфа-актинин, включают в себя также белки теплового шока и сигнальные молекулы. Продемонстрировано изменение количества тропомиозиновых комплексов в нормальных и трансформированных фибробластах после действия на клетки сигнальных агентов, вызывающих реорганизации актинового цитоскелста.

Теоретическое н практическое значение работы

Результаты имеют фундаментальное значение для понимания функционирования системы актинового цитоскелета при активации клеток сигнальными агентами, а также процесса передачи сигнала с поверхности клетки в ядро. Результаты проведенных исследований являются основой для дальнейшего установления конкретных физиологических функций, выполняемых данными цитоплазматическими мультимолекулярнымц белковыми комплексами. Полученные данные могут быть использованы при проведении лекционно-практическнх занятий в СПбГУ и СПбГПУ.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 3 статьи в отечественных журналах и 7 тезисов. Материалы диссертации были представлены на 11-й Путинской международной школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 29 октября - 2 ноября 2007 г.), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 23-27 июня 2009 г.), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2-4 июня 2009г.).

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего № ссылки. Диссертация изложена на 130страницах. Иллюстративный материал содержит2Р рисунков и Ь таблиц.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 07-04-01190-а) и гранта Президента Российской Федерации по поддержке ведущих научных школ (№ ПШ-7852.2006.4).

Материалы и методы

Культивирование клеток. В работе использованы нормальные эмбриональные фибробласты крысы ЯЕР, иммортализованные ранним районом Е1А аденовируса 5-го типа человека и трансформированные Е1А в комплементации с онкогеном сНа-гав (Поспелова и

др., 1990), а также клетки линий Л431 и HeLa, полученные из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН). Клетки культивировали на среде Дальбекко (DMEM, Биолот) с добавлением 10% сыворотки крови эмбрионов коров (Биолот).

Иммупофлуоресцепция. Выявление распределения актина, тропомиозина и р65 субъединицы NF-кВ в препаратах распластанных клеток проводили методом непрямой иммунофлуоресценции. Клетки снимали смесью растворов 0.25% трипсина и 0.02% версена в соотношении 3:7, после чего 1.6хЮ4 клеток наносили в 100 мкл суспензии на покровные стёкла и культивировали в течение ночи при 37 °С в атмосфере 5 % СО2. Затем клетки фиксировали 3%-ным формалином на PBS в течение 10 мин при комнатной температуре, пермеабилизовали 0.1%-ным раствором Тритона Х-100 на PBS 15 мин при комнатной температуре и окрашивали первыми моноклональными антителами мыши против тропомиозина, р65-субъединицы транскрипционного фактора NF-kB (Sigma, США) или альфа-актинина-4 (ImmunoGlobe, Германия), а затем вторыми кроличьими антителами против иммуноглобулинов мыши, коньюгированными с пероксидазой хрена (Sigma, США) в течение 40 мин при комнатной температуре. Структуры актинового цитоскелета выявляли окраской родамин-фаллоидином или FITC-фаллоидином в течение 10 мин при 37°С. В качестве заключающей среды использовали Mounting medium (Pharmacia Biotech., Швеция). Препараты анализировали с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SL. Для возбуждения флуоресценции использовали аргоновый лазер с длиной волны 488 нм и HeNe-лазер с длиной волны 543 нм. Применяли раздельное сканирование для каждого сигнала. Совмещение двух сигналов проводили с помощью компьютерной программы Leica Confocal Software.

Экстракция цитоплазматических белковых комплексов.

Экстракцию белковых комплексов проводили с помощью разработанной методики быстрого лизирования клеткок SF-буфером, позволяющей выделять белки без разрушения цитоскелета. Детали разработанного метода приведены в разделе «Результаты».

Хроматография. Клетки лизировали SF-буфером, быстрый и медленый экстракты фильтровали через 0.45 мкм фильтр (Millipore, США) и наносили на колонку superóse 6HR (GE Healthcare, США) в системе высокоэффективной жидкостной хроматографии Pharmacia System (Pharmacia, Швеция). Предварительную калибровку колонки осуществляли с помощью набора белков с разной молекулярной массой (Amersham, Швеция). В процессе хроматографии выяснилось, что сахароза и Тритон Х-100 препятствуют разделению, поэтому элюцию проводили F-буфером (100 мМ NaF, 50 мМ KCl, 2 мМ MgCb, 10 мМ К-фосфатный буфер pH 7.0), который не содержал этих компонентов. Скорость элюции была 0.2 мл/мин, фракции собирали на льду по 0.4 мл. Относительное количество белка в подвижной фазе на выходе из колонки регистрировали в динамическом режиме с помощью оптического

детектора UV-1 (Pharmacia) при длине волны 280 нм. К собранным фракциям добавляли 0.05%-ный дезоксихолат натрия и 5%-ную трихлоруксусную кислоту, замораживали и осаждали белки 5-минутным центрифугированием при 15000 g.

Определение состава выделенных цитоплазматических белковых комплексов. Осажденные из фракций после хроматографического разделения белки разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях в присутствии SDS (Laemmli, 1970). Использовали 12.5%-ный гель. После электрофореза гель окрашивали Кумасси бриллиантовым голубым или переносили на мембрану Immobilon-P (Millipore, США) (Towbin, 1979). Перенос белков с геля на мембрану проводили в Трис-глициновом буфере pH 8.3, с 10%-ным метанолом и 0.1%-ным SDS. Иммуноблотинг проводили в соответствии с ECL Western blotting protocols (Amersham). Мембрану промывали 20 мин буфером TBST (25 мМ Трис-HCl pH 7.4, 150 мМ NaCl и 0.1% Твина-20) с последующим блокированием 5%-ным обезжиренным сухим молоком, разведенным на TBST, в течение 1 ч. Для усиления сигнала при иммуноблотинге использовали субстраты SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Pierce, США). Хемилюминесцентное излучение регистрировали при помощи системы ChemiDoc (Bio-Rad, США). В работе использовали моноклональные антитела мыши против высокомолекулярных изоформ тропомиозина, тубулина и бета-актина (Sigma, США), поликлональные кроличьи антитела против р65-субъединицы транскрипционного фактора NF-кВ (Abeam, Англия), а-актинина-4 и а-актинина-1 (Santa Cruz, США). В качестве вторых антител использовали кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши, и козьи антитела против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США). При проведении иммунопреципитации для удаления неспецифически связывающихся белков в полученные в результате гель-фильтрации фракции предварительно добавляли сефарозу с пришитым белком G (Amersham, Швеция) из расчета 50 мкл на 1 мл и инкубировали, аккуратно перемешивая, 1 ч при 4°С. После инкубации сефарозу осаждали центрифугированием при 2000 g, к супернатангу добавляли антитела и инкубировали, аккуратно перемешивая, в течение ночи при 4°С. Затем добавляли сефарозу с белком G и инкубировали, аккуратно перемешивая, в течение 4 ч при 4°С. Образовавшиеся комплексы с сефарозой осаждали центрифугированием при 2000 g, промывали 4 раза раствором PBS и разделяли методом электрофореза с последующим иммуноблотингом. При сравнительном анализе содержания белков в электрофоретических пробах нагрузки выравнивали по количеству общего белка в пробе, определённого методом Мэрион Брэдфорд (Bradford, 1976).

Масс-спектрометрия. Для последующей масс-спектрометрии проводили гидролиз белка трипсином в полиакриламидном геле. Для этого кусочек геля размером 1-2 мм3 для удаления красителя дважды промывали путем инкубации в 100 мкл 40%-ного раствора

ацетонитрила в 0.1 М NH4HCO3 в течение 30 мин при 37°С. После удаления раствора, для дегидратации геля добавляли по 100 мкл ацетонитрила. Удалив ацетонитрил и высушив кусочек геля, прибавляли к нему 4 мкл раствора модифицированного трипсина (Promega) в 0.05 М NH4HCO3 с концентрацией 12 мкг/мл. Гидролиз проводили в течение 12 ч при 37°С, затем к раствору добавляли 8 мкл 0.5%-ной трифторуксусной кислоты в 10%-ном растворе ацетонитрила в воде и тщательно перемешивали. Полученный раствор с пептидами использовали для получения MALDI-масс-спектров. Подготовку образцов для масс-спектрометрии проводили следующим образом: гидролизаты растворяли в 5 мкл 0.5%-ной трифторуксусной кислоты в 10%-ном растворе ацетонитрила в воде, на мишень наносили смесь 1 мкл раствора образца и 0.3 мкл раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (Aldrich, 10 мг/мл в 20%-ном ацетонитриле в воде с 0.5%-ной трифторуксусной кислотой) и высушивали на воздухе. Масс-спектры были получены на тандемном MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II BRUKER (Германия), оснащенном УФ лазером (Nd) в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона; точность измеренных моноизотопных масс в рефлекто-моде после докалибровки по пикам автолиза трипсина составляла 0.005 %. Идентификацию белков по «пептидному фингерпринту» осуществляли при помощи программы Mascot (www.matrixscience.com). Поиск проводился в базе данных NCBI среди белков млекопитающих с указанной точностью с учетом возможного окисления метионинов кислородом воздуха и возможной модификации цистеинов акриламидом.

Результаты и обсуждение

Разработка метода выделения цитоплазматических мулътимолекулярпых белковых комплексов без нарушения структуры актинового цитоскелета.

В распластанных на стекле фибробластах REF было обнаружено большое количество частиц, окрашиваемых антителами к тропомиозину (рис. 1), поэтому именно эти клетки явились основным объектом для выделения белковых комплексов, включающих актин-связывающие белки, не связанные с цитоскелетом. Для выделения этих частиц нами был разработан метод быстрой экстракции.

Рис. 1. Частицы тропомиозина в цитоплазме фибробласта REF.

А - фибробласт REF, актин окрашен красным, тропомиозин - зеленым. Жёлтый - колокализация белков. Б -отмеченная рамкой область на большем увеличении. Синяя стрелка -выявленные антителами против тропомиозина частицы в цитоплазме.

Стандартные методы выделения цитоплазматических белков включают стадию полного разрушения клеток с последующей экстракцией соответствующими буферами. Механическое воздействие и детергенты, используемые при такой процедуре, могут приводить к разрушению или изменению состава выделяемых комплексов. Для того чтобы получить их в максимально неповрежденном виде, нами был разработан новый метод выделения, позволяющий сохранить целостность выделяемых частиц без нарушения структур цитоскелета. Суть метода заключается в образовании локальнах разрушений плазматической мембраны и быстром выделении цитоплазматических белковых комплексов с применением особого лизирующего SF-буфера рП 7.0 (100 мМ NaF, 50 мМ KCl, 2 мМ MgCb, 10 мМ фосфатный буфер, 1 мМ EGTA, 1 M сахароза, 1 % Тритон Х-100, 0.1 мМ PMSF), сохраняющего соотношение между мономерными и полимерными формами актина (Blikstad and Carlsson. 1982). Чашку с монослоем клеток промывали PBS, после чего PBS тщательно отбирали, а чашку ставили на лед и на поверхность клеток каплями наносили небольшое количество SF-буфера, достаточное чтобы лизировать клеточные мембраны (из расчёта 100 мкл на одну чашку 100 мм в диаметре). В ходе анализа разных времен воздействия было установлено, что для подобной обработки клеток достаточно 1 мин после чего цитоплазматические белки выходят в окружающую среду. Для увеличения количества выделяемых комплексов быструю экстракцию проводили в течение 3 мин. Затем чашку наклоняли (схема на рис. 2) и в течение 1 мин собирали буфер с вышедшими из клеток белками цитозоля («быстрый» экстракт), который при необходимости переносили на следующую промытую PBS чашку с клетками. Процедура последовательного переноса лизирующего буфера с чашки на чашку позволила накопить достаточное для дальнейшей

Рис. 2. Быстрая

экстракция белков

лидирующим 8Г-

буфером.

А. Б, В - фотографии клеток А431 до визирования (Л), во время первого нанесения

лизирующего буфера (Б) и после сбора быстрого экстракта (В).

Лидирующий ЭР-буфср наносился первый раз на 3 мин (Г), затем чашку наклоняли и экстракт собирали в течение 1 мин (Е; «быстрый экстракт»: 1 на схеме). Масштабная линейка - 50 мкм.

хроматографии количество белка без его разбавления буфером.

Схема:

Для того чтобы убедиться в том, что высокомолекулярные комплексы вышли из клеток, на оставшиеся после получения быстрого экстракта клетки повторно наносили SF-буфер, проводили лизис 10 мин на льду и собирали разрушенные клетки скребком; затем из них центрифугированием при 12000 g в течение !0 мин осаждали тритон-нерастворимую фракцию (цитоматрикс), а супернатант отбирали («медленый» экстракт). Для стабилизации выделяемых комплексов применялся описанный в литературе метод создания формальдегидных сшивок между взаимодействующими белками, который используется обычно для выделения белковых комплексов и комплексов белков с нуклеиновыми кислотами. Для этого в клеточную среду на 10 мин добавляли формальдегид в концентрации 30 мкМ, затем реакцию останавливали добавлением 0.125 M раствора глицина в PBS на 10 мин при комнатной температуре и далее проводили экстракцию белковых комплексов.

Прежде всего необходимо было выяснить, возможно ли получить белковые комплексы, не связанные с актиновыми структурами, без разрушения клеток с помощью разработанного метода, а также установить, остаются ли частицы в клетках после быстрой экстракции. Наблюдения за клетками А43 1 в процессе обработки SF-буфером (А,Б,В на рис. 2) и данные иммунофлуоресценции показывают, что после быстрой экстракции клетки остаются распластанными и сохраняют исходную структуру цитоскелета, ядра остаются неповреждёнными.

Рис. 3. Сравнение профилей элюции «быстрого»и «медленного» экстрактов и содержания тропомиозина во фракциях.

1, 2 гель-хроматография и всстсрн-блот фракций «быстрого» (1) и «медленного» (2) экстрактов из клеток REF. ТМ - окраска моноклональными антителами против тропомиозинов, Ас -окраска моноклональными антителами против бета-актина. 800, 400 и 50 кДа -калибровочные молекулярные массы фракций.

Тропомиозиновые частицы после быстрой экстракции перестают выявляться в области цитоплазмы моноклональными антителами против

высокомолекулярных изоформ.

фракции: 15 1Û ¡5 20 25 30

MW: 800 400

фракции: ¡4 15 16

быстрый экстракт

50 кДа

m, ~ А С

медленый экстракт

фракции: is К) 15 2(1 25 30

MW: 800

400 50 кДа

•• Ч-j-Ac

Для проверки эффективности выделения мультимолекулярных белковых комплексов с помощью нового разработанного метода была проведена сравнительная оценка результатов быстрой экстракции и повторной, медленной экстракции тех же клеток с помощью гель-хроматографии на колонке Superóse 6 {профили элюции 1 и 2 на рис. 3). Проведенный электрофоретический анализ с последующим вестерн-блотом показал, что при быстрой экстракции несколько высокомолекулярных изоформ тропомиозина и актин выявляются в области 500-800 кДа. В «медленных» экстрактах из полностью разрушенных клеток после быстрой экстракции в высокомолекулярной области комплексов, содержащих тропомиозин, обнаружено не было, что свидетельствует о том, что они действительно были выделены в процессе быстрой экстракции. Актин после медленной экстракции выявлялся только в низкомолекулярной области, соответствующей мономерному белку (рис. 3).

Определение состава мультимолекулярных белковых комплексов, содержащих тропомиозин.

Для того чтобы выяснить, какие ещё белки входят в состав высокомолекулярных комплексов, содержащих тропомиозин, но не связанных с цитоскелетом, была проведена иммунопреципитация моноклональными антителами против высокомолекулярных изоформ тропомиозина из объединенных фракций 13-16, полученных после гель-хроматографии быстрого экстракта из клеток REF. В этих фракциях содержались комплексы, соответствующие молекулярным массам в пределах 500-800 кДа.

Рис. 4. Выделение из цитозоля фибробластов тропом иозиновых частиц и анализ их белкового состава. Анализировали

иммунопреципитат из выделенных рамкой фракций.

А - электрофорез после гель-фильтрации цитозоля фибробластов, полученного методом быстрой экстракции (М - маркер). Б определение с помощью всстсрн-блота фракций, содержащих тропомиозин (14-17 номера фракций,

соответствующие молекулярным массам 500-800 кДа). Г' - тропомиозин в составе выделенных с помощью моноклональных антител

высокомолекулярных комплексов, вестерн- блот. В - выявленные с помощью масс-спсктромстрии белки в составе тропомоизиновых комплексов (электрофорез). L - положительный контроль, клеточный лизат, mAb -моноклональные антитела ТМ311, IP -преципитат, sup - супсрнатант после преципитации.

При электрофоретическом разделении полученного иммунопреципитата помимо трёх белковых полос в области 35-40 кДа, соответствующих изоформам тропомиозина, были дополнительно выявлены ещё мажорные полосы в областях 70, 90 и 200 кДа. Участки геля, соответствующие мажорным полосам, были вырезаны и с помощью масс-спектрометрии было установлено, что полоса в области 200 кДа соответствует миозину-9 (немыщечная изоформа 1), а полосы 70 и 90 кДа соответствуют 1кр70 и Ьвр90 (рис. 4).

Определение состава мулычимолекулярных белковых комплексов, содержащих алъфа-актшши-4.

В процессе предыдущих исследований было установлено, что а-актинин-4 колокализуется в цитоплазме и совместно мигрирует в ядро с р65-субъединицей транскрипционного фактора КР-кВ (Бабаков и др, 2004), а полноразмерный а-актинин-4 и фрагменты а-актининов 1 и 4 выявляются во фракции белков, прочно связанных с хроматином (Большакова и др., 2008), что указывает на возможную роль а-актининов в проведении сигнала. Для того чтобы выяснить, входят ли альфа-актинин-4 и р65 в состав одного комплекса, был применён метод перекрестной иммунопреципитации антителами против этих белков из высокомолекулярных фракций, полученных после гель-хроматографнческого разделения лизата клеток линии А431. При этом методом вестерн-блот были обнаружены полосы максимальной интенсивности, соответствующие обоим белкам в области 600-700 кДа фракций (рис. 5). Для того чтобы выяснить, какие ещё белки входят в состав комплекса с а-актинином-4, были объединены фракции, соответствующие массам частиц 500-900 кДа, включающие р65 и а-актинин, и проведена иммунопрецилитация. В результате иммунопреципитации поликлональными антителами против альфа-актинина-4 и р65 из фракций были выделены комплексы, сходные по интенсивности и расположению электрофоретических полос. Иммуно-блотинг показал, что при иммунопреципитации из объединённых высокомолекулярных фракций антителами против а-актинина-4 в комплексе с ним действительно выявляется белок р65. а-Актинин-4 при этом представлен на блоте двумя полосами, соответствующими полноразмерному белку и меньшему количеству его фрагмента 75 кДа. При иммунопреципитации из фракций антителами против р65, в комплексе выявляется а-актинин-4, который в большей степени представлен фрагментом 75 кДа, но не выявляется а-актинин-1 (рис. 6). Таким образом показано, что р65 входит в комплекс только с 4 изоформой а-актинина.

М АЬ аА4 р65

' ^ Рис. 5. Элсктрофоретичсская картина разделения

11 Ш0 * . плшунопрецппитатов ю фракции 12-16. Дорожки: М - маркер; АЬ -

70 ЩШшШШ « 4 негативный контроль, поликлональные кроличьи антитела к ы-

¡ШЖ ГЛ / ^ | актинину-4; аЛ4, р65 - комплексы, осажденные антителами против

! Щщ^Щ а-акзш|Ипа-4 и р65-субьсд||ннцы М-'-кВ.

1Р: аА4 р<15 В1о1: рб.5

В1ог А4 ¥ I 1'пс. 6. Всстерн-блот анализ иммунонреципитатов, осажденных антителами

рЯЦ против и-актииина-4 (II': аЛ4) и р65-су6ъсдиницы ^-кВ (1Р: р65); в комплексе с

р65 выявлены а-актинн11-4 (аЛ4), тубулин (ТиЬ) и тропомиочин (ТМ), не выявлен «-актинин-1 (аЛ1).

В101: аА I

■.'•< '-''ЯШ МпсТиЬ <тЩ

Шй.'Ш

Так как при гель-хроматографическом разделении на колонку наносился лизат клеток Д431, полученный по обычной методике, включающей стадию полного разрушения клеток, возникло опасение, что мультимолекулярные комплексы могут разрушаться в процессе выделения или изменять свой состав в результате присоединения белков, исходно входящих в структуры цитоскелета. Поэтому комплексы были выделены из быстрого экстракта без разрушения клеток и разделения на колонке и сопоставлены электрофореграммы, полученные при разделении комплексов, содержащих а-актинин-4, выделенные из суммарной высокомолекулярной фракции после гель-хроматографии и из быстрого экстракта с применением формальдегидной сшивки близко расположенных белков. При этом оказалось, что комплексы сходны по трём полосам в области 70 и 90 кДа, содержащим белки теплового шока и а-актинин, но в выделенных из быстрых экстрактов комплексах есть дополнительные полосы как в низко-, так и в высокомолекулярной области. Это подтвердило исходное предположение о том, что в процессе разрушения клеток часть белков могут исчезать из состава комплексов. Было обнаружено 15 белковых полос с массами от 40 до 500 кДа в комплексах а-актинина-4, выделенных из быстрого экстракта с применением формальдегидной сшивки. В результате масс-спектрометрического анализа удалось идентифицировать белковый состав 11 из них. Это оказались плектин-1, спектрин, миозин-9, а-актинин-4, Р-актин, цитоскелетные изоформы кератинов I и II типов (18, 5 и 6А), тубулин, а также белки семейства белков теплового шока - 1звр70 и Ь8р90. Так как суммарная масса всех обнаруженных белков значительно превышает предполагаемую массу мультимолекулярного комплекса, то очевидно, что эти белки входят в состав разных комплексов, включающих а-актинин-4. В дальнейшем планируется выяснить, в состав каких комплексов входят обнаруженные белки.

В связи с тем, что тубулин был обнаружен в составе комплекса, содержащего альфа-актинин-4, а из литературы известно, что ингибиторная субъединица транскрипционного фактора №-кВ может взаимодействовать с микротрубочками (Сгер1еих е( а!., 1997), на тубулин было обращено особое внимание. Вестерн-блот анализ показал, что тубулин выявляется практически во всех фракциях, полученных после гель-фильтрации обычного лизата клеток А431 (рис. 7).

аА 1 аА4

рис ^ Выявленные во фракциях после шшй® гель-фильтрации белки а-актинии-1 р65 ',„ Ж1К • <»А1), а-яктииин-4 (аА4), р65-ТиЬ -•»«.*.. субъединица NF-кВ (р65), тубулин (Tub) jy — рир........' и тропомиозин (ТМ).

ГООкДа

Для того чтобы проверить, действительно ли тубулин входит в состав выделенных высокомолекулярных комплексов, был проведён вестерн-блот анализ. Тубулин выявился в комплексах, содержащих р65, но не был обнаружен в комплексах, содержащих а-актинин-4 (рис. 6). Возможно, тубулин входит в состав комплексов с а-актинином-4 только при активации клеток. Поскольку в экспериментах на фибробластах было показано, что р65 входит в состав комплексов, включающих тропомиозин, было необходимо проверить, входит ли тропомиозин в состав выделенных из клеток А431 высокомолекулярных комплексов, включающих р65. При иммунопреципитации антителами против р65 и а-актинина-4 выяснилось, что тропомиозин действительно выявляется в составе комплексов, содержащих р65, но отсутствует в комплексах, содержащих а-актинин-4. Видимо, р65 может независимо связываться с обоими актин-связывающими белками (рис. 6).

Корреляции между содержанием в цитоюле тропомиозип-содержшцих комплексов и степенью развитости системы иктиповых микрофиламептов.

Для того, чтобы представить себе, в какой мере наличие содержащих тропомиозин мультимолекулярных комплексов может зависеть от степени развитости актинового цитоскелета, было определено содержание тропомиозина в нормальных, иммортализованых и трансформированных фибробластах крысы, которые, как было показано ранее (Аре и др. 1999), существенно различаются по этому параметру. Электрофоретический анализ с последующим вестерн-блотингом демонстрирует, что в быстрых экстрактах из нормальных (REF) и иммортализованных (ElА) фибробластов содержится большое и примерно равное количество тропомиозина, а в трансформированных клетках (E-Ras) оно значительно ниже. В то же время в осадке после удаления быстрых экстрактов, содержащем структуры цитоскелета, прослеживается снижение содержания тропомиозина в иммортализованных клетках и практически полное отсутствие в трансформированных (рис. 8). Для того чтобы выяснить, в каких белковых комплексах сосредоточен обнаруженный в цитозоле тропомиозин, был проведен гель-хроматографический анализ, который показал, что в тритон-растворимой фракции лизата (соответствующей быстрому экстракту) из иммортализованных фибробластов El А тропомиозин выявляется в основном в высокомолекулярной области распределения. Кроме того, он содержится в незначительных количествах во фракциях, содержащих комплексы с меньшей молекулярной массой (рис. 9).

800 400 50 кДа

Г —

1 м.

^ < < ¡2

Щ ^ 1 Ш —< | Рис, 8. Вестерн-блот анализ содержания тропомиозииа в

СЬ Щ Ш Он Щ Щ цитозолс (слева) и цитоматриксс (справа) нормальных

Ас Щ **** ' ФШ? Ф? (К )■ Мчшф [Li.rtfшп^нт.п (1 1 А) и

ТМ1*Ж ж ■>' ~ трансформированных (Е-Ка$) фнбробластов крысы.

Рис. 9. Распределение актина (Лс(ш) и АеПп троиомиошна (ТМ) но фракциях после гель-филмрацнн гритоп-растворнмои фракнш) .ш ни и шшорталщованныл фибробласюв.

Влияние трихостатшш пи реорганизацию актинового цитоскелета и распределение тропомиотп-содержащих комплексов.

Ранее было показано, что при совместном действии на клетки ингибитора ДПК-метилтрансферазы 5-аза-2'-дезоксицитидина и ингибитора гистоновых деацетилаз трихостатина А в клетках происходит усиление синтеза некоторых цитоскелетных белков (МЫшс1а е! а!., 1999). Поэтому для того, чтобы выяснить в какой мере наблюдаемые изменения содержания в цитозоле исследуемых клеток высокомолекулярных изоформ тропомиозинов могут быть связаны с подобным явлением, было оказано совместное и раздельное действие этих агентов на клетки А431, обладающих слабо развитым цитоскелетом. Действие деметилирующего агента оказалось слабее, чем совместное действие агентов, но сильнее всего ответ был получен в случае применения только одного трихостатина А. Через сутки после его действия, уровень содержания высокомолекулярных

изоформ тропомиозинов значительно увеличился (рис. 10). <

^ Рис. 10. Увеличение содержания НМ\У тропомиозинов в цитозоле клеток

4- А431 после совместною и раздельного действия ингибитора ДНК-

мстилтраисферазы 5-аза-2'-дезокс11Цитидина (0.9 мкМ) и ингибитора <| ¡/I гистоновых деацетилаз трихостатина А (50 иг/мл). Время действия - 24 ч.

^ |л 'л Н

А431

Рис. 11. Клетки HcLa в контроле (А) и через сутки последействия 500 иг/мл трихостатина (В). Окраска на актин и тропомиозин.

' ¿1 HHBtW* | Так как трихостатин-А

& * t «f» , .4 подавляет активность деацетилаз,

^Ж^^ДМ^И ИВИИРjf то в данных условиях

"™^||М1и1|ИМ1)11НИИ ..............Ж ШШВШ эксперимента увеличение

содержания тропомиозина в клетках могло сопровождаться и его ацетилированием,

способствующим более прочному взаимодействию с фибриллярным актином. Для того чтобы проверить, приводит ли увеличение содержания тропомиозинов в клетках к изменениям в структуре актинового цитоскелета, действию трихостатина-А были подвергнуты клетки линии HeLa, обладающие, как все раковые клетки, слабо развитым цитоскелетом. Оказалось, что трихостатин-А в довольно высокой концентрации 500 нг/мл вызывает через сутки появление в клетках большого количества стресс-фибрилл, а сами клетки приобретают фибробластоподобную морфологию (рис. 1 1).

В связи с полученными результатами важно было выяснить, может ли подобная реорганизация актиновых структур сопровождаться изменениями в содержании тропомиозиновых частиц в цитозоле. Обычно при действии на клетку разнообразных внешних лигандов, индуцирующих сигнальные процессы, в ней происходят быстрые перестройки актинового цитоскелета. В данном случае в качестве действующего агента был использован трихостатин-А, который вызывает, с одной стороны, подобные перестройки, а с другой, как было показано выше, повышает содержание тропомиозина в клетке.

Следует отметить, однако, что длительное действие высоких концентраций трихостатина помимо перестроек цитоскелета вызывало также последующее открепление от субстрата и гибель значительной части популяции клеток. Поэтому для проведения планируемых экспериментов было необходимо, прежде всего, найти оптимальные концентрации трихостатина, вызывающие повышение содержания в клетках тропомиозина, но не сопровождающиеся их откреплением от субстрата. На клетках А431 и E-ras было определено влияние разных концетраций трихостатина на уровень содержания тропомиозина и на их жизнеспособность. Оказалось, что через 24 ч максимальное увеличение содержания тропомиозина при сохранении жизнеспособности клеток происходит после действия на них 50 нг/мл трихостатина (рис. 12). Поэтому в дальнейших экспериментах была использовали именно эта концентрация трихостатина.

Рис. 12. Всстсрн-блот анализ содержания трономопзина в цитозоле клеток послс стимуляции трихостатином Л в различных концентрациях.

Использовались трансформированные (E-Ras) фибробласты и клетки эпидермоидной карциномы (А431). Цифры - концентрация трихостатина А в культуральной срсдс (нг/мл), 0 - нсстимулированныс клетки. Время стимуляции - 24 ч.

Рис. 13. Вестсрн-блог анализ содержания ! IМ \\ щоформ тропомиозинов н цитозоле клеток на разных сроках после стимуляции грихостатином А (50 нг/мл).

Использовались иммортализованные (Е!А) и 1рансформированныс (Е-Иак) фибробласты, а также клетки линии эпидермоидной карциномы (А431). ТМ - окраска моноклональными антителами против НМ'Л' тропомиозинов. Цифры - время в минутах после стимуляции (0 -нсстимулированныс клетки).

О о о О

о С") CS

E-Ras f»*«**"""1**1»»-А431 ш

0 13 S 10 20 30

El А

О 5 lo 20 30

K-R;is* г г "Г

0 1 J í 10 20 J0

А431 **»"«»«*<*»**»*.

■

:::тм

"ТМ

тм

Электрофоретический анализ с последующим вестери-блотингом показал, что в иммортализованных (ElА) и трансформированных (E-ras) фнбробластах, а также в клетках А431 под действием 50 нг/мл трихостатина А в течение 30 мин, когда обычно происходят быстрые перестройки цитоскелета, наблюдается последовательное снижение содержания тропомиозина в цитоплазме (рис. 13).

Рис. }4. Тропомиозин, выявленный в цитоплазме фнбробластов до (А,а) и через 10 мин (К,б) действия трихостатина А (50 нг/мл).

В течение часа после действия трихостатина уровень тропомиозина в цнтозолс (В) снижается, а в цитоматриксс (Г) увеличивается. У.с. - условные единицы по данным дснситомсгрии.

Для сопоставления изменений в содержании мультимолекулярных комплексов, содержащих тропомиозин, с этапами реорганизации актинового цитоскелета действию трихостатина А были подвергнуты нормальные фибробласты ЯЕР, содержащие большое количество таких комплексов. Данные иммунофлуоресцеииии показывают, что через 10 мин после действия трихостатина происходит снижение количества свободных тропомиозиновых частиц в цитоплазме и появление более крупных агрегатов рядом со стресс-фибриллами (рис. 14). Наряду с этим анализ динамики распределения тропомиозина между цитоплазматической и цитоскелетной фракциями после обработки клеток трихостатином демонстрирует, что в быстром экстракте из этих клеток, содержащем не связанные с клеточными структурами цитоплазматические белки и белковые комплексы, количество тропомиозина постепенно снижается в течение часа. В то же время содержание белка в осадке увеличивается (рис. 14). Полученные результаты свидетельствуют в пользу высказанного предположения о том, что тропомиозин из мультимолекулярных комплексов может переходит в прочно связанную с цитоскелетом форму, возможно за счёт ацетилирования.

Изменение состава а-актинин-4 содержащих комплексов в процессе реорганизации цитоскелета, вызванной различными сигнальными агентами.

Из быстрых экстрактов, выделенных из контрольных и стимулированных эпидермальным фактором роста клеток А431, были получены методом иммунопрсципитации комплексы, содержащие а-актинин-4. Обнаружено, что при стимуляции клеток

эпидермальным фактором роста изменяется состав мультимолекулярных комплексов: через 10 мин появляется новая полоса, содержащая тубулин, и происходит накопление белка относительно контроля в полосах, содержащих а-актинин-4 и hsp70. Уровень hsp90, кератина I и актина заметно не изменялся. Методом вестерн-блот обнаружено наличие р65 в составе выделенных мультимолекулярных комплексов и показано, что в нестимулированных клетках содержится полноразмерный белок, а после стимуляции ЭФР в комплексе с а-актинином-4 обнаруживаются также и два его фрагмента 55 и 25 кДа. Другим сигналом, приводящим к аналогичным изменениям в составе мультимолекулярного комплекса, не связанного с цитоскелетом и содержащего а-актинин-4, оказался фактор некроза опухоли-а. При стимуляции клеток TNF-а было обнаружено, что через 10 мин появляется новая полоса, содержащая тубулин, и происходит накопление белка по сравнению с его содержанием в контроле в полосах, содержащих а-актинин-4 и hsp70. Уровень hsp90, кератина [ и актина заметно не изменялся. Таким образом, на стадии разборки цитоскелета при действии различных сигнальных агентов наблюдается сходное изменение состава свободных мультимолекулярных комплексов.

Изменение уровня активных форм кислорода в процессе реорганизации актинового цитоскелета.

Так как из литературы известно, что активные формы кислорода (АФК) оказывают влияние на процессы полимеризиции актина (Dalle-Donne et al., 2001), был проведён анализ содержания АФК в клетках при действии сигнальных факторов, вызывающих реорганизацию актинового цитоскелета. При действии LPA (20 нг/мл) на клетки А431 уже через 5 мин наблюдается разборка актинового цитоскелета и через полчаса он собирается обратно. Уровень АФК в клетке измеряли с помощью флуоресцентного зонда на сроках, соответствующих основным стадиям реорганизации цитоскелета. Обнаружено, что через 10 мин после стимуляции клеток А431 LPA в концентрации 20 нг/мл одновременно с разборкой актинового цитоскелета наблюдается увеличение уровня АФК и затем через 30 мин этот уровень снижается, когда цитоскелет снова собран. Для того чтобы установить, связаны ли между собой процессы изменения уровня АФК в клетке и цитоскелетных перестроек, мы использовали вещество, способное подавлять образование АФК. Обработка клеток А431 антиоксидантом окситиазолидином (предшественник синтеза глутатиона) ведет к снижению уровня АФК в клетках и подавлению разборки цитоскелета в ответ на стимуляцию LPA (20 нг/мл) в течение 10 минут.

Заключение

Весь комплекс проведенных в данной работе исследований доказывает, что кратковременное, локальное разрушение плазматической мембраны клеток позволяет быстро извлекать из них находящиеся в цитоплазме белки и мультимолекулярные белковые комплексы без разрушения структур цитоскелета. При этом сами клетки остаются прикрепленными к субстрату и даже практически не изменяют своей формы.

Основной целью настоящей работы, ради которой, собственно говоря, и был разработан этот новый оригинальный метод быстрой экстракции ццтоплазматических белковых комплексов, было выяснение белкового состава и возможной роли обнаруженных ранее в клетках тропомиозиновых частиц, не связанных со структурами актинового цитоскелета. С помощью гель-хроматографии и вестерн-блот анализа было показано, что после быстрой экстракции в клетках действительно больше не остается мультимолекулярных комплексов, содержащих тропомиозин. В процессе детальной разработки метода выделения тропомиозиновых частиц было обращено внимание на тенденцию снижения их содержания в цитоплазме при действии на клетки ростовых факторов (Genklo at al. 2008). Отсюда возникло предположение о том, что они могут принимать участие в регуляции реорганизации актиновых структур, а также что в состав этих же комплексов могут входить и сигнальные молекулы, вовлечённые в эти процессы. Проведенные далее исследования показали, что тропомиозиновые частицы действительно представляют собой сложные белковые комплексы с высокой молекулярной массой, включающие помимо тропомиозина и актина ряд других молекул. В качестве первого шага на пути выяснения их полного состава были идентифицированы выявленные при электрофорезе мажорные белки, которыми оказались hsp70, hsp90 и миозин-9. Обнаруженные в составе тропомиозиновых частиц белки теплового шока могут принимать участие в формировании белковых комплексов, поддержании их стабильности или в обеспечении взаимодействия с другими комплексами .В частности, оба этих белка способны связываться с микротрубочками (Liang and MaeRae, 1997).

Наибольший интерес представляет выявление в комплексах миозина-9. В отличие от мышечного миозина, работающего в виде димера из двух полипептидных цепей (шагающий механизм из двух миозиновых головок), миозин - 9 перемещается вдоль актиновой фибриллы в виде одиночной полипептидной цепи. Это было доказано путём прямого микроскопического наблюдения за передвигающимся по нанесённым на стекло фибриллам миозином, который был сшит с зелёным флуоресцирующим белком (GFP). Миозин-9 особенно интересен тем, что в хвостовом участке содержит последовательность, гомологичную белку, активирующему ГТФазы (GAP) (Post et al., 1998, Bahler, 2000). GAP

стимулируют ГТФазкую активность малых ГТФаз Rho, позволяя им работать. Белки Rho, в свою очередь, стимулируют образование стресс-фибрилл, являющихся сократимыми акто-миозиновыми филаментами (Hall, 2005), а также через Rho-киназу, которая ингибирует фосфатазу регуляторных лёгких цепей, регулируют активность самих миозинов (Воротников и др., 2009). Таким образом, миозин-9 является регулятором Rho и моторной сигнальной молекулой, принимающей активное участие в организации актинового цитоскелета. Это подтверждается также и экспериментами по прижизненной микроскопии, в которых было выявлено, что миозин-9 привлекается в клетке к местам активной полимеризации актина -ламеллоподиям, раффлам и филоподиям (van den Boom et al., 2007).

Способность тропомиозина агрегировать in vitro была показана достаточно давно. Так, выделенный из мышц кролика тропомиозин агрегирует в растворе с низкой ионной силой с образованием частиц, размеры которых уменьшаются от 135000 до 65000 Да по мере добавления солей (при рН 6.5 ионную силу изменяли от 0.1 до 1.1) (Tsao et al., 1951). В связи с этим не удивительно, что тропомиозин и в цитоплазме может образовывать агрегаты. Однако конкретная функция этих агрегатов остаётся неясной. Вполне возможно, что они принимают активное участие в перестройках актинового цитоскелета, регулируя процесс полимеризации актина и одновременно являясь и затравками для формирования актиновых микрофиламентов. Сравнение распределения тропомиозина во фракциях после гель-хроматографии экстрактов из нормальных и иммортализованных фибробластов показывает, что при изменении типа и степени развитости актинового цитоскелета изменяется также и размер тропомиозиновых частиц, содержащихся в цитоплазме. Вполне возможно, что при этом могут меняться белковый состав и свойства этих частиц. Представленные данные по фибробластам говорят о том, что действительно может иметь место изменение количества тропомиозиновых комплексов при перестройках цитоскелета.

Изменение белкового состава удалось также показать и на а-актинин-содержащих комплексах, выделенных из клеток А431. Эти клетки, обладая достаточно слабо развитыми структурами актинового цитоскелета, демонстрируют выраженные перестройки цитоскелета в ответ на действие растворимых или иммобилизованных на подложке фаетюров. При этом на сроках, соответствующих стадии разборки цитоскелета, выделенные из цитоплазмы клеток не связанные с цитоскелетом комплексы, содержащие в том числе и сигнальные белки, как оказалось, отличаются по белковому составу от комплексов, выделенных из клеток с собранным цитоскелетом. 4

Одним из механизмов, отвечающих за изменение количества и состава содержащих актин-связывающие белки комплексов, могут быть вторичные модификации белков. В частности, может изменяться степень ацетилирования молекул тропомиозина. Известно, что ацетилирование тропомиозинов приводит к повышению его способности связываться с

актином. Если трихостатин может способствовать ацетилированию тропомиозина, то последний под действием трихостатина может переходить из свободных цитоплазматических частиц в прочно связанную с цитоскелетом форму. В пользу этого предположения свидетельствуют, в частности, данные иммунофлуоресцентного анализа фибробластов, показывающие снижение под действием трихостатина содержания тропомиозина в цитозоле клеток различных линий. Несмотря на наличие ряда полученных результатов поддерживающих высказанные предположения, необходимо проведение дальнейших исследований для получения прямых доказательств изменения степени ацетилирования тропомиозина в комплексах и их непосредственного влияния на полимеризацию актина. Остаётся открытым также вопрос, в какой степени изменяется белковый состав тропомиозиновых частиц и какие ещё белки в них входят.

Перестройки цитоскелета происходят при действии любых сигнальных агентов. В соответствии с этим возникает предположение о наличии универсального механизма первоначального разрушения цитоскелета. В связи с появившимися в литературе данными о том е! а1., 2007), что свободные формы кислорода подавляют полимеризацию актина,

а также способствуют его деполимеризации, возможно, что наблюдаемые реорганизации цитоскелета зависят от уровня АФК в клетке. Проверке этого предположения была посвящена заключительная часть работы, и оказалось, что действительно существует корреляция между состоянием цитоскелета и окислительно-восстановительным статусом клетки.

Выводы

1. Разработанный новый метод позволяет быстро выделять цитоплазматические белковые комплексы путем образования локальных пор в плазматической мембране и без разрушения клеток и структур цитоскелета.

2. Выделенные из цитоплазмы разных клеток не связанные с цитоскелетом частицы, содержащие тропомиозин и альфа-актинин, являются мультимолекулярными белковыми комплексами с молекулярной массой в пределах 500-800 кДа и включают в себя ряд цитоскелетных и сигнальных белков, а также белки теплового шока.

3. При действии на фибробласты и клетки зпидермоидной карциномы А431 биологически активных молекул — трихостатина, эпидермального фактора роста и фактора некроза опухоли - а, вызывающих реорганизацию актинового цитоскелета, происходит изменение количества и состава белковых комплексов содержащих троиомиозин и а-акгинин-4.

4. Повышение уровня активных форм кислорода коррелирует с разборкой структур актинового цитоскелета в клетках А431.

5. Совокупность полученных данных об изменении содержания цитоплазматических белковых комплексов, их состава, наличии в них сигнальных молекул и прераспределении тропомиозина между цитоплазмой и цитоскелетом под влиянием внешних факторов свидетельствует в пользу их участия в процессах формирования актиновых структур и передачи внутриклеточных сигналов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи:

Бабаков В.Н., Бобков Д.Е., Петухова O.A., Туроверова Л.В., Кропачева И.В., Подольская Е.П., Пинаев Г.П.

Альфа-актинин-4 и субъединица p65/RelA транскрипционного фактора NF-kB в клетках А431 локализуются совместно и мигрируют в ядро при действии эпидермального фактора роста // Цитология. -2004,- Т.46,- №12,- С.1065-1073.

Бобков Д.Е., Кропачева И.В., Пинаев Г.П.

Мультимолекулярные комплексы, содержащие р65 субъединицу фактора NF-kB и белки цитосклета в клетках А431 // Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2-4 июня 2009 г., Сборник статей, том 2, С. 417-422.

Бобков Д.Е., Кропачева И.В., Пинаев Г.П.

Мультимолекулярные комплексы, содержащие р65 субъединицу фактора NF-kB и белки цитосклета в клетках А431 // Биологические мембраны. - 2010,- Т.27,- Xsl.- С.1-5.

Тезисы:

Бабаков В.П., Бобков Д.Е., Кропачёва II.В., Пстухова О.Л., Туроверова Л.В., Пинаев Г.П. Лльфа-актинин и р65 субъединнца транскрипционного фактора NF-kappnB солокалпзуются и совместно перераспределяются в клетках линии А431 // Цитология.- 2003.- Т.45,- №9.- с.847.

Babakov V., Smirnova I., Bobkov D., Petukhova 0., Turoverova L., Kropacheva I., Podolskaya E., Pinaev G.

NF-кВ Transcription Factor Interacts With a-Actinin Isoforms // FEBS special meeting on cytoskeletal dynamics, Helsinki, June 12-16, 2004, p.38.

Бабаков В.H. Подольская Е.П., Бобков Д.Е., Петухова O.A., Туроверова Л.В., Кропачёва И.В., Пинаев Г.П.

Альфа-актинин взаимодействует с р65-субъединицей транскрипционного фактора NF-kappaB //III Съезд биофизиков России, Воронеж, 24-29 июня 2004 г., Тезисы докладов, Т. 1, С.6- 7.

Бобков Д.Е., Айзенштадт A.A., Пинаев Г.П.

Определение белкового состава мультимолекулярных сигнальных комплексов, включающих сигнальные молекулы и элементы цитоекелета // 11-я Путинская международная школа-конференция молодых учёных «Биология - наука XXI века», Пущино, 29 октября - 2 ноября 2007 г., Сборник тезисов, с.71.

Бобков Д.Е., Кропачёва И.В., Пинаев Г.П.

Новый метод быстрого выделения из питозоля мультимолекулярных белковых комплексов, включающих цитоскелетные и сигнальные молекулы // IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», Казань, 23-27 июня 2009 г., Тезисы докладов, с.287.

Бобков Д.Е., Айзенштадт A.A., Кропачёва И.В., Пинаев Г.П.

Белки теплового шока 70 и 90 входят в состав комплексов, содержащих р65-субъединицу фактора NF-kB и белки цитоекелета в клетках А431 // Цитология.- 2010.- Т.52.- №3.- с.255.

Бобков Д.Е., Айзенштадт A.A., Кропачёва И.В., Пинаев Г.П.

Выделение и анализ белкового состава тропомиозиновых частиц, содержащихся в цитозоле эмбриональных фибробластов крысы // Цитология,- 2010.- Т.52,- №3,- С.255-256.

Список цитируемой литературы

АрэА.Ф., Поспелова Т.В., Пинаев Г.П. 1999. Цитология. 41(8) : 707-715.

Бабаков В.П.. Бобков Д.Е., Петухова O.A., Туроверова Л.В., Кропачёва И.В., Подольская Е.П.,

Пинаев Г.П. 2004. Цитология. 46(12) : 1065-1073.

Большакова A.B., Петухова O.A., Пинаев Г.П., Магнуссон К.-Е. 2009. Цитология. Т. 51 № 2. С.122-129.

Воротников A.B., Щербакова О.В., Кудряиюва Т.В., Тарасова ОС., Ширинский В.П., Пфитцер Г., Ткачук В.А. 2009. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 95(10): 1058-73.

Поспелова Т.В., Кислякова Т.В., Медведев A.B., Светликова С.Б., Поспелов В.А. 1990. Цитология. 32(1): 148-155.

BählerM. 2000. Biochim. Biophys. Acta. 1496(1): 52-9. Bharadwaj S., Prasad G.L. 2002. Cancer Lett. 183 : 205-13.

BharadwajS., ThanawalaR„ Bon G., FalcioniR., PrasadG.L. 2005. Oncogene. 24 : 8291-303. Blikstad/., Carhson L. 1982. J. Cell Biol. 93(1) : 122-128.

van den Boom F., Düssmann 11.. Uhlenbrock K., Abmthamed M., Bähler M. 2007. Mol. Biol. Cell. 18(4): 1507-18.

Bradford M.M. 1976. Annal. Biochem. 72 : 248-254.

Brown J.H.. Cohen C. 2005. Adv. In Prot. Chem. 71 : 121-159.

Cho Y.J., LiuJ., Hitchcock-DeGregori S.E. 1990. J. Biol. Chem. 265 (1): 538-45.

O'Connell C.B., Mooseker M.S. 2003. Nat. Cell. Biol. 5(2): 171-2.

Crepieux P., Kwon H„ Leclerc N.. Spencer IV., Richards., Lin R„ Hiscott J. 1997. Mol. Cell. Biol. 17(12): 7375-85.

Dalle-Donne /., Rossi R., Mihani A„ Di Simplicio P., Colombo R. 2001. Free Radic. Biol. Med. 31(12): 1624-32.

Grenklo S., Hillberg L., Rathje L.-S.Z., Pinaev G., Schutt C.E., Lindberg U. 2008. European Journal of Cell Biology. 87 : 905-920.

Gunning P., O'Neill G„ Hardeman E. 2008. Physiol. Rev. 88 : 1-35. Gunning P.. Weinberger R„ Jeffrey P. 1997. Anat. Embryol. 195:311-315. Hall A. 2005. Biochem. Soc. Trans. 5 : 891-5.

Hillberg L„ Zhao Rathje L.S., Nyäkern-Meazza M„ Helfand B„ Goldman R.D., Schutt C.E.,

Lindberg U. 2006. Eur. J. Cell BioL 85(5): 399-409.

InoueA, SaitoJ, Ikebe R, Ikebe M. 2002. Nat. Cell. Biol. 4(4): 302-6.

Laemmli U.K. 1970. Nature. 227 : 680-685.

Lassing I, Schmitzberger F, Björnstedt M, Holmgren A, Nordhmd P, Schutt CE, Lindberg U. 2007. J Mol. Biol. 370(2) : 331-348.

Lazarides E. 1975. Seminars in Cancer Biology. 65 : 549-561. Liang P., MacRae T.H. 1997 Journal ofCell Science. 110 : 1431-1440.

Lindberg U., Schutt C.E., Goldman R.D., Nvakern-Meazza M, Hillberg L„ Rathje L.S., Grenklo S. 2008. Adv. Exp. Med. Biol. 644 : 223-231. "

Mielnicki L.M., YingA.M., HeadK.L., Asch HL., Asch B.B. 1999. Exp. Cell Res. 249 : 161-67. Miyado K„ Sato M„ Taniguchi S. 1997. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 123 :331-336. O'Neill G.M., StehnJ., Gunning P.W. 2008. The Journal of Cell Biology. 18 : 35-44. Nishikawa M., Nishikawa S„ InoueA., ¡wane A.H., Yanagida T„ Ikebe M. 2006. Biochem. Biophys. Res. Commun. 343(4): 1159-64.

Post P.L., Bokoch G.M., Mooseker M.S. 1998. J. Cell. Sei. 7 : 941-50.

Prasad G.L., Masuelli L„ Raj M.H.G., Harindranath N. 1999. Oncogene. 18 : 2027-2031.

Shah V., BharadwajS., Kaibuchi K„ Prasad G.L. 2001. Oncogene. 20 : 2112-2121.

Skoumpla K., Coulton A.T., Lehman W., Geeves M.A., Mulvihill DP. 2007. Journal of Cell Science.

120 : 1635-1645.

Towbin H„ Staehelin T„ Gordon J. 1979. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 76 : 4350-4354.

Tsao T.-C.. Bailey K„ Adair G.S. 1951. Biochem. J. 49(1): 27-36.

Johnson P., Smillie L.B. 1977. Biochemistry. 16(10): 2264-9.

Urbancikova M„ Ilitchcock-DeGregori S.E. 1994. J. Biol. Chem. 269(39) : 24310-5.

Автор выражает глубокую признательность сотрудникам Отдела клеточных культур Института цитологии за помощь в работе. Особенно благодарен автор своему научному руководителю проф. Г.П. Пинаеву, И.В. Кропачёвой, Л.А. Айзенштадт и И.Б. Бильдюг.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 17.05.2010. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 6044b.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812)550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бобков, Данила Евгеньевич

1. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

2. ВВЕДЕНИЕ.

3. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ.

4.1 Организация актииового цитоскелета в культивируемых клетках.

4.1.1. Основные типы актиновых структур.

4.1.2. Роль актин-связывающих белков в формировании актиновых структур.

4.1.3 Комплексы адгезии. Связь актиновых структур и сигнальных молекул.

4.2. Регуляция процессов реорганизации актинового цитосклета.

4.2.1. Перестройки актинового цитоскелета клеток, распластанных на иммобилизованных лигандах.

4.2.2. Регуляция структуры актинового цитоскелета малыми ГТФ-азами.

4.2.3. Эффект растворимых факторов на динамику системы микрофиламентов клеток, распластанных на иммобилизованных лигандах.

4.2.4. Влияние уровня активных форм кислорода на процессы реорганизации актинового цитоскелета.

4.3. Структура и функции тропомиозина.

4.4. Альфа-актинин.

4.4.1. Структура а-актинина.

4.4.2. Изоформы актинина и их субклеточная локализация.

4.4.3. Участие а-актинина в адгезии.

4.4.4. Образование комплексов с другими белками.

4.4.5. Участие комплексов альф а-актинина в сигнальных системах.

4.5. Транскрипционный фактор NF-kB.

4.5.1. Регуляция активности транскрипционного комплекса NF-kB.

4.5.2. Сигнальные каскады, вовлеченные в активацию NF-kB.

4.5.3. Участие в адгезии и связь с цитоскелетом.

5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

5.1. Культивирование клеток.

5.2. Конфокальная иммунофлуоресцентная микроскопия.

5.3 Экстракция цитоплазматических белковых комплексов.

5.4 Разделение белковых экстрактов методом гель-хроматографии.

5.5. Предобработка клеток формальдегидом.

5.6. Определение состава выделенных цитоплазматических белковых комплексов

5.7. Идентификация белков методом масс-спектрометрии.

5.8. Обработка клеток биологически активными молекулами.

5.9. Определение внутриклеточного содержания активных форм кислорода.

6. РЕЗУЛЬТАТЫ.

6.1. Разработка метода выделения цитоплазматических мультимолекулярных белковых комплексов без нарушения структуры актинового цитоскелета.

6.2. Определение состава мультимолекулярных белковых комплексов, содержащих тропомиозин.

6.3. Определение состава мультимолекулярных белковых комплексов, содержащих альфа-актинин-4.

6.4. Изменение состава а-актинин-4 -содержащих комплексов в процессе реорганизации цитоскелета, вызванной различными сигнальными агентами.

6.5. Корреляция между содержанием в цитозоле тропомиозин-содержащих комплексов и степенью развитости системы актиновых микрофиламентов.

6.6. Влияние трихостатина на реорганизацию актинового цитоскелета и распределение тропомиозин-содержащих комплексов.:.

6.7. Изменение уровня активных форм кислорода в процессе реорганизации актинового цитоскелета.

7. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

8. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Тропомиозин и альфа-актинин-4 в составе мультимолекулярных цитоплазматических комплексов, не связанных со структурами цитоскелета"

При действии на клетки в культуре различных биологически активных молекул, таких как эпидермальпый фактор роста, фактор некроза опухоли — а, лизофосфатидиловая кислота и других биологически активных молекул, происходит активация транскрипционных факторов, в том числе перемещение р65-субъединицы NF-кВ из цитоплазмы в ядро, изменение экспрессии ряда генов и прочие характерные для проведения сигнала события. Одновременно с этим происходит быстрая реорганизация актинового цитоскелета. Опыт показывает, что практически любые биологически активные агенты при взаимодействии с поверхностными рецепторами клетки вызывают подобный эффект.

Ранее в нашей лаборатории было показано па клетках разного происхождения, что под действием внешних факторов в течение 10-15 мин происходит последовательная разборка системы актиновых структур с последующим восстановлением исходной организации актинового цитоскелета через 30-40 мин. Механизмы таких перестроек цитоскелета до настоящего времени не установлены. Специфичность же восстанавливаемых структур, по-видимому, определяется характером внеклеточного матрикса на котором распластаны клетки. Также остаётся неясным, связаны ли между собой сигнальные события и процессы цитоскелетных перестроек, и если связаны, то каким образом такая связь может осуществляться. Так как при действии различных агентов происходят аналогичные перестройки у клеток разного происхождения, по-видимому, должны существовать универсальные механизмы, регулирующие этот процесс.

При изучении процессов реорганизации цитоскелета было обнаружено, что цитоскелетные белки, которые обычно находятся в составе актин-содержащих структур, выявляются и в цитоплазме в виде отдельных независимых частиц. К таким белкам относятся, в частности, актин-связывающие белки а-актинин-4 и тропомиозин, которые по данным иммупофлуоресценции выявляются в цитоплазме в виде крупных белковых комплексов, не связанных с актиновыми структурами. Функция таких комплексов неизвестна. В литературе высказывается предположение, о том, что эти комплексы вовлечены в процессы реорганизации цитоскелета, а может быть, участвуют и в процессе проведения сигнала. Для выявления их предполагаемых функций, прежде всего надо удостовериться, что такие мультимолекулярные комплексы действительно существуют, затем определить их белковый состав, а также установить, изменяется ли их состав и распределение в клетке в процессе реорганизации цитоскелета под действием различных внешних индукторов.

3. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для достижения поставленной цели нужно было решить следующие задачи:

2) Провести анализ белкового состава мультимолекулярных комплексов, содержащих а-актинин-4 и тропомиозин.

3) Установить, изменяется ли количество и состав этих комплексов в процессе реорганизации актинового цитоскелета под действием эпидермального фактора роста и других биологически активных молекул (трихостатина А, лизофосфатидиловой кислоты, фактора некроза опухоли - а).

Основные положения, выносимые на защиту

• 2. Установлено, что актин-связывающие белки тропомиозин и а-актинин-4 могут существовать не только в структурах цитоскелета, но и в составе не связанных с ним мультимолекулярных комплексов.

3. Показано, что в комплексы, содержащие а-актинин-4, входят также р65-субъединица транскрипционного фактора NF-кВ, белки теплового шока hsp70 и hsp90, а также ряд других белков — актин, миозин 9, спектрин, плектин и кератины. Состав этих комплексов изменяется при действии на клетки эпидермального фактора роста и фактора некроза опухоли- а.

• 4. В комплексах, содержащих тропомиозин, выявлены р65 субъсдиница NF-kB, hsp70, hsp90 и миозин 9.

4. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

4.1 Организация актинового цитоскелета в культивируемых клетках

Актиновый цитоскелет - это сложная система актиновых микрофиламентов, организованных в разные структуры. В процессе многолетних исследований сложилось общепринятое представление о том, что он принимает участие и обеспечивает осуществление ряда важных клеточных процессов. К ним относят поддержание формы клетки, ее миграцию, взаимодействие с субстратом и с другими клетками, цитокинез, процессы эндоцитоза и экзоцитоза и, наконец, участие в проведении внутриклеточного сигнала и регуляции экспрессии генов (Гусев, 2001; Olson, Nordheim, 2010; Small et al., 1998, 2005). Участие в разнообразных процессах обеспечивается разнообразием структур образованных системой актиновых микрофиламентов распределенных в разных участках цитоплазвы с помощью специальных для каждого случая наборов актин-связывающих белков. Распределение этих структур в клетке и характер их организации позволяет выполнять вышепенечисленные многообразные функции. В мышечных клетках актиновые филаменты участвуют в образовании миофибрилл. В немышечных клетках актиновые филаменты образуют стресс-фибриллы, необходимые для движения клетки и поддержания клеточной архитектуры, а также плотную кортикальную сеть, участвующую в образовании филоподий и микроворсинок. Актиновые структуры клетки очень динамичны. Например, при движении клетки, в кортикальной цитоплазме происходит постоянное динамическое изменение вязкости, которое отражает постоянно происходящую деполимеризацию и полимеризацию актина под мембраной. Образование сложных надмолекулярных актиновых структур в строго определённых компартментах клетки требует наличия системы регуляции, основу которой составляют актин-связывающие белки.

Состояние цитоскелета клеток, находящихся в составе ткани многоклеточного организма, зависит от сложной комбинации биологически активных молекул, взаимодействующих с поверхностными рецепторами. В культивируемых клетках цитоскелет формируется в процессе распластывания на субстрате и может зависеть от природы субстрата, от состава питательной среды, плотности культуры и факторов сыворотки крови. Таким образом, хотя клетки в культуре представляют собой упрощенную модель их естественного состояния в животном организме, цитоскелет этих клеток также находится под воздействием сложного комплекса факторов и постоянно изменяется.

4.1.1. Основные типы актиновых структур

Актиновый цитоскелет в немышечньтх клетках имеет сложную пространственную организацию, состоящую из ряда актин-содержащих структур, характерную для каждого типа клеток. Вместе с тем, все разнообразие наблюдаемых вариантов пространственной организации системы микрофиламентов является результатом взаимодействия фибриллярного актина с разными сочетаниями определепых актин-сыязывающих белков (Small et al., 1998). К актин-содержащим структурам цитоскелета следует отнести:

1) Стресс фибриллы - пучки актиновых филаментов с противоположной полярностью. Миозин и а-актинин распределены вдоль стресс фибрилл упорядоченным образом: участки, обогащенные миозином, чередуются с участками, обогащенными а-актинином;

2) Пространственная сеть микрофиламентов. Присутствует в кортексе многих типов животных клеток. Состоит из филаментов, пересекающих друг друга под разными углами. Плотность, а так же степень упорядоченности может варьировать в различных частях одной и той же клетки;

3) Микрофиламенты филоподий и микроворсинок - пучки актиновых филаментов с одинаковой полярностью;

4) Арки - дугообразные пучки актиновых филаментов с противоположной полярностью на дорзальной поверхности клетки, формирующиеся у основания ламеллоподии и осуществляющие центростремительное перемещение поверхностных рецепторов.

В зависимости от типа клетки и условий внешней среды соотношение между разными группами структур может существенно меняться, что приводит к изменению пространственной организации цитоскелета и соответствующим различиям в форме и подвижности клетки. Все многообразие актиновых структур клетки формируется на основе полимеризации мономеров актина в одиночные филаменты с последующим формированием структур высшего порядка при участии различных актин-связывающих белков на всех этапах этого процесса (Matsudaira, 1994; Theriot, 1994; Puius et al., 1998; Schmidt and Hall, 1998).

4.1.2. Роль актин-связывающих белков в формировании актиновых структур

В немышечных клетках в состав актиновых структур помимо основных структурных элементов актина входит большое число актин-связывающих белков, определяющих их организацию (Winder and Ayscough, 2005). Многие из них существуют одновременно в двух различных взаимообращаемьтх конформациопных состояниях: свободные молекулы находятся в равновесии с другими белками, связанными с филаментами. Благодаря этому может быть достигнута быстрая и эффективная реорганизация системы актиновых филаментов в различных районах клетки на разных этапах клеточного цикла и, например, в ответ на действие внешнего сигнала (Jockusch and Hinssen, 1996). Способность к взаимодействию актин-связывающих белков может меняться под влиянием ряда регуляторных молекул, таких как Са2+ или компоненты фосфоинозитольного цикла, а также под действием протеинкиназ (Janmey, 1994).

Организация актиновых полимеров в сеть микрофиламентов осуществляется при помощи семейства белков, включающего а-актинин, филамин и фимбрин (Harlwig and Kwiatkowski, 1991). Существует несколько изоформ а-актинина, связывающих актиновые филаменты в параллельно оганизованные пучки или приводящих к образованию сети актиновых филаментов. Постоянное присутствие а-актинина в фокальных контактах, Z-дисках, стресс фибриллах и сократительных пучках, связанных с плотными фокальными контактами, указывает на его участие как в формировании актиновых структур, так и в процессах клеточной адгезии (Matsudaira, 1994). Сходными свойствами обладают также спектрин, фодрин (неэритроцитарный спектрин) и дистрофии. Спектрин является основой для формирования актиновых филаментов в кортикальной области, а также путем взаимодействия с анкирином связывает актиновые структуры с плазматической мембраной. В последнее время появились данные о наличии во всех эукариотических клетках комплекса актиноподобных белков Агр2/АгрЗ, которые вступают во взаимодействие с латеральной поверхностью актиновых филаментов и способствуют формированию новых филаментов, отходящих от основной нити под углом в 70° (Weed and Parsons, 2001).

Для осуществления актиновым цитоскелетом множественных функций необходимо, чтобы сборка филаментов происходила не беспорядочно в цитоплазме клетки, а в строго определенных местах у клеточной мембраны. Такими сайтами нуклеации преимущественно являются мультимолекулярные комплексы фокальные и межклеточные контакты, осуществляющие связь между внешней средой, плазматической мембраной и актиновым цитоскелетом. Компонентами фокальной адгезии являются рецепторы интегринового типа, взаимодействующие одним концом с внеклеточным матриксом, а другим с комплексом подмембранных белков, включая талин, винкулин, а-актинин, паксилин, тензин, зиксин и киназу фокальных контактов (FAK) (Jockusch et al., 1995, Ben-Ze'ev, 1997). Через плотные контакты осуществляются межклеточные взаимодействия. Они образованы кластерами кадеринов, взаимодействующих со стороны цитоплазмы с винкулином, а-актинином, филамином, катенинами, и ERM белками (эзрином, радиксином, моезином) (Geiger et al., 1990, Gautreau et al., 2002). Многие из этих белков содержат фосфоинозитол-связывающий участок и, по-видимому, являются мишенями сигнальных молекул.

Таким образом, характер организации системы микрофиламентов зависит от композиции вовлеченных актин-связывающих белков, что может обеспечивать специфичность изменений в этой системе в ответ па определенное лиганд-рецепторное взаимодействие. В то же время точные представления обо всех функциях актин-связывающих белков, не связанных в данный момент с цитоскелетом, и о последовательности их вовлечения в процессе формирования определенных акггиновых структур в настоящее время отсутствуют.

4.1.3 Комплексы адгезии. Связь актиновых структур и сигнальных молекул

Адгезия клетки к субстрату осуществляется через мультимолекулярные белковые комплексы трансмембранных адгезионных рецепторов, связанных со структурными цитоскелетными белками и сигнальными молекулами. Комплексы клеточной адгезии активируют внутриклеточные сигнальные пути, регулирующие морфологию клетки, миграцию, экспресссию генов, рост и дифференцировку. Сложность молекулярных взаимодействий в адгезионных комплексах стала очевидной в последние годы. Например, такие белки, как FAK и винкулин связываются с целым рядом белков и, помимо выполнения других функций, могут служить промежуточным звеном в осуществлении связи между различными белками. Для того, чтобы осуществлять такое множество взаимодействий, сложная сеть молекул должна быть динамичной и гетерогенной по составу. Контакты клетки с субстратом, включая фокальные контакты, обычно формируются при участии рецепторов иптегринового типа. Многие внутриклеточные сигнальные пути активируются клеточной адгезией к специфическим внеклеточным молекулам. Эти процессы проведения сигнала включают фосфорилирование белков по тирозину и активацию MAP киназы, выброс Са" , изменение рН и запуск инозитольного цикла. В последние годы появилось много новых данных, свидетельствующих о разнообразии этих сигнальных путей, а также о потенциальных механизмах регуляции роста, предотвращения апоптоза, кооперативного взаимодействия между интегринами и рецепторами ростовых факторов (Yamada and Geiger, 1997; Keely et al., 1998). Точные механизмы влияния интегринов на организацию цитоскелета и индукцию сигнала в деталях еще не установлены, однако существуют общие представления о путях взаимодействия интегринов с актиновыми структурами. Ряд потенциально возможных связей и тот факт, что некоторые из них могут регулироваться фосфорилированием в результате агрегации или кластеризации интегринов, позволяет предположить состав белков, включающихся в комплексы адгезии. Прямое взаимодействие с pi субъединицей интегрина было показано для талина, а-актинина и FAK, связывание с цитоплазматическим доменом 02 субъединицей - для филамина и также связывание актина с цитоплазматическим доменом а2 субъединицы (Leung-Hagesteijn et al., 1994). •

Взаимодействие интегринов с цитоскелетом осуществляется только после связывания с ним тем или иным лигандом лигандом. Недавние исследования с использованием шариков, покрытых лигандами или антиинтегриновыми антителами позволили проследить за ранними этапами формирования комплексов адгезии после контакта с внеклеточным матриксом. Была установлена последовательность в вовлечении различных молекул в зависимости от состояния интегринов: их кластеризации, взаимодействия с лигандом или того и другого вместе (Miyamoto et al., 1995). Так, тензин и FAK аккумулируются на цитоплазматической стороне мембраны уже после кластеризации интегринов в сопровождении ряда сигнальных молекул, включая Src, Ras, Raf и MAP киназы. Ряд актин-связывающих белков, а-актинин, талин и винкулин, включаются в комплексы адгезии также послс кластеризации интегринов. Вероятно, такой механизм позволяет клетке формировать длительные, стабилизированные цитоскелетом комплексы адгезии только в случае стабильного взаимодействия с внеклеточным матриксом. Для вовлечения F-актина и паксилина в комплексы адгезии необходима также тирозинкиназная активность FAK, что обеспечивает следующий уровень регуляции в этой иерархической системе. В последние годы научное сообщество приходит к пониманию того, что ранее принятое разделение на структурные белки и сигнальные молекулы в значительной мере условно. Комплексы адгезии, содержащие цитоскелетные и другие белки, являются местами кластеризации или ассоциации не только структурных элементов цитоскелета, но и компонентов многих сигнальных путей. Образование комплексов белков может способствовать сборке структур цитоскелета с одной стороны и активации сигнальных путей с другой, при участии таких мультифункциональных молекул, как FAK, которая выполняет как механическую роль в связывании ряда сигнальных и цитоскелетных белков, так и функцию киназы (Yamada and Geiger, 1997; Guan, 2010).

Роль фосфорилирования по тирозину в образовании комплексов адгезии до конца не ясна. Ключевой механизм включает связывание SH2 доменов, присутствующих во многих сигнальных и некоторых цитоскелетных молекулах, с фосфорилированными по тирозину сайтами белков (Pawson, 1997, 2007). Это обеспечивает готовый механизм регуляции связывания одного белка с другим при участии тирозинкиназ и тирозинфосфатаз. Баланс между этими двумя активностями, возможно, вовлечен в регуляцию многих важных сигнальных путей. Известно, что подавление тирозинкиназ препятствует образованию фокальных контактов (Burridge et al., 1996; Sastry et al., 2000) и что усиление фосфорилирования по тирозину путем ингибирования фосфатаз ортованадатом или стимуляцией фосфорилирования через ЭФР- рецептор приводит к резким изменениям их структуры (Geiger et al., 1995). Другие виды фосфорилирования также имеют важное значение для процесса образования фокальных контактов. Таким образом, компоненты комплексов клеточной адгезии обладают широким спектром взаимодействий и функций, которые в кооперации участвуют в формировании актиновых структур и проведении сигнала. Комплексы адгезии могут регулироваться как снаружи, так и изнутри клетки. Так, если уровень фосфорилирования специфических компонентов или агрегация и оккупация интегринов могут модулировать цитоскелетные взаимодействия, вовлеченные в адгезию, то накопление сигнальных ферментов и субстратов в непосредственной близости, по-видимиму, приводит к фосфорилированию FAK и активации сигнальных каскадов, включая ERK и JNK пути МАР-киназного каскада (Miyamoto et al., 1995).

4.2. Регуляция процессов реорганизации актинового цитосклета

Наряду с образованием ряда структур актиновый цитоскелет является высоко динамичной системой, быстро реагирующей на внешние воздействия и на процессы, происходящие в клетке, что выражается в быстрой реорганизации его пространственной организации. Эти изменения могут затрагивать или часть существующих структур, или приводить к полной разборке цитоскелета с последующим восстановлением исходного состояния. Вместе с тем, являясь основой внутриклеточного транспорта, актиновые филаменты вместе с моторными белками играют решающую роль в клеточном делении, секреции, фагоцитозе и др. (Минин, Кулик, 2004).

Подобная пространственная реорганизация структур цитоскелета происходит, в частности, при адгезии клеток к субстрату и взаимодействии с белками внеклеточного матрикса. Причем контакт с разными белками приводит к формированию специфической организации актиновых структур для каждого образующегося лиганд-рецепторного комплекса. Сходные реорганизации цитоскелетных структур происходят при взаимодействии клеток с растворимыми ростовыми факторам и другими биологически активными молекулами, индуцирующими различные сигнальные молекулы и запускающими экспрессию генов. В связи с этими данными, а также обнаруженным прекращением или изменением этих процессов при разборке цитоскелета под дейстием цитохалазина, возникло представление о том что актиновый цитоскелет принимает участие в проведении внутриклеточных сигналов.

4.2.1. Перестройки актинового цитоскелета клеток, распластанных на иммобилизованных лигандах

Результаты, полученные ранее в нашей лаборатории на клетках эпидермоидной карциномы человека А431, демонстрируют специфичность организации структур актинового цитоскелета, формирующихся в одних и тех же клетках при распластывании их на подложках, покрытых различными имобилизованными белками внеклеточного матрикса (Арэ и др., 1997). При распластывании клеток линии А431 на фибронектине в цитоплазме клеток обнаруживаются стресс-фибриллы, на ламинине 2/4 - сеть актиновых филаментов в ламелле, и на антителах к рецептору ЭФР — сеть актиновых филаментов в филоподиях и ламеллах (Are et al., 2001). Соответствующие структуры актинового цитоскелета обнаруживаются у большинства клеток, распластанных в течение 1 ч на данных лигандах, причем, различные типы организации цитоскелета предполагают участие в их организации разных малых ГТФаз (Петухова и др., 2004). Другие исследования проводились на фибробластах (Арэ и др., 1999). Система актиновых микрофиламентов фибробластов представлена главным образом классическими стресс-фибриллами, сконцентрированными в нескольких параллельных субстрату плоскостях. При распластывании на фибронектине фибробласты теряют поляризованпость, при этом стресс-фибриллы ориентированы хаотично и образуют многочисленные полигональные структуры. Фибробласты, распластанные на другом белке ВКМ - ламинине, существенно отличаются от клеток, распластанных на фибронектине и сохраняют поляризованность. При распластывании на коллагене III типа клетки принимают полигональную форму и образуют многочисленные ламеллоподии, в которых актиновый цитоскелет представлен сетью микрофиламентов (Арэ и др., 1999).

4.2.2. Регуляция структуры актинового цитоскелета малыми ГТФ-азами

До настоящего времени нет ясности в том, какие механизмы вовлечены в быстрые перестройки структур цитоскелета и каким образом цитоскелет может принимать участие в проведении сигнала. В пользу его возможного участия свидетельствуют многочисленные данные о взаимодействии с актин-связывающими белками разнообразных сигнальных молекул, а также одновременное участие регуляторных внутриклеточных факторов, как например малых ГТФ-аз, в организации цитоскелета и в сигнальных событиях. В результате серии работ из лаборатории А. Холла (Nobes, Hall, 1995; Ridley et al.,1992) стало известно, что ключевую роль в этой регуляции играют малые ГТФазы из семейства Rho: белки Racl, Cdc42 и RhoA. Эти небольшие по размеру белки (20- 30 кДа) находяться в одном из двух конформационных состояний- ассоциированными с ГТФ (активная форма), либо связанными с ГДФ (неактивная форма). В активном состоянии ГТФазы взаимодействуют с эффекторным белком до тех пор, пока связанный ГТФ не гидролизуется до ГДФ. Переключение между активным и неактивным состоянием ГТФаз находиться под контролем специальных факторов: активирующих (фактор обмена гуаниловых нуклеотидов, GEF), инактивирующих (белки активирующие ГТФазы, GAP) и ингибиторов обмена гуаниловах нуклеотидов (GDI), которые предохраняют неактивные ГТФазы от контакта с мембраной (Ertienne-Manneville, Hall, 2002). Общая схема регуляции внутриклеточных процессов такова, что высшие сигналы не влияют непосредственно на эффекторные элементы, а передаются сначала в общую интегрирующую систему, основными элементами которой являются Rho белки (Kjoller, Hall, 1999). Таким образом, каждый внешний сигнал преобразуются в сумму заданным образом локализованных и активированных ГТФаз. ГТФазы в свою очередь модулируют активность и локализацию своих эффекторов, порождая каскад сигналов, приводящих к реорганизации цитоскелета , и, в конечном счете, изменениям в поведении клеток (Bishop, Hall, 2000; Ridley, 2001; Etienne-Manneville, Hall, 2002).

Молекулярный механизм актиновых перестроек и роль филаментов в сигналинге сейчас интенсивно исследуется. В физиологических условиях поведение клеток определяется иммобилизованными постоянно представленными факторами, такими как белки внеклеточного матрикса и растворимые активные молекулы, а также факторы роста, гормоны и пептиды. Показано, что за прикреплением и распластыванием клеток А431 на иммобилизованных лигандах следует реорганизаия микрофиламентарной системы, которая определяется типом субстрата. Ранее в нашей лаборатории было показано, что у клеток с мало развитым актиновым цитоскелетом в течение 10 мин после действия внешних факторов цитоскелет может полностью разбираться и затем снова собираться в течение часа, образуя структуры, характерные для клеточной линии и каждого конкретного сигнального агента (рис. 1).

К 5 мин 15 мин 30 мин

К 5 мин 10 мин 40 мин

Рис. 1. Изменение архитектуры цитоскелета клеток А431 (вверху) и НЕК 293 (внизу) при воздействии 20 мкМ ЬРА.Актиновый цитоскелет окрашен родамин-фаллоидином.

В ЗТЗ фибробластах образование филоподий, ламелл и стресс-фибрилл зависит от действия разных малых ГТФаз cdc42, гас и rho соответственно

Machesky and Hall, 1996). Интегрин-зависимая адгезия приводит к активации р21 киназы, с последующей индукцией деятельности гас и cdc42 (Price et al., 1998). Cdc42 и гас также необходимы для формирования сайтов прикрепления к внеклеточному матриксу в макрофагах (Allen et al., 1997).

Таким образом, клеточная адгезия на различных иммобилизованных лигандах может включать активацию различных типов rho семейств малых ГТФаз с последующей специфической реорганизацией системы микрофиламентов. EGF, LPA и брадикинин активируют малые ГТФазы гас, rho, cdc42 соответственно. (Ridley et al.,1992; Ridley and HoII, 1992; Kozma et al., 1995; Bretsher and Aquado-Velasco, 1998.) Известны клеточные ответы на эти факторы посредством специфических рецепторов. Клетки А431 имеют много рецепторов к EGF (Haigler et al., 1978) , а также поверхностных рецепторов к LP А и брадикинину (Van der Bend et al., 1992).

Лизофосфатидиловая кислота (LPA) имеет широкий спектр биологических эффектов. Она продуцируется тромбоцитами и высвобождается при их активации в процессе коагуляции (Gerrard and Robinson, 1989). Действие LPA является специфичным для каждого типа клеток и зависит от ее концентрации (Moolenaar, 1995). LPA активирует специфический тип рецепторов, связанных с G-белками, вызывает опосредованное фосфолипазой С мобилизацию ионов Са (Tigyi and Miledi, 1992), а также включает, таким образом, различные сигнальные пути. Существует как минимум 5 серпентиновых рецепторов, связанных с G-белками (GPCRs - G-protein coupled receptors) активируемых LPA. Данные рецепторы относятся к особому суперсемейству Edg (endothelial differentiation gene) или LP (lysophospholipid). G-белки лизофосфолипидных рецепторов регулируют широкий спектр внутриклеточных процессов, от быстрых морфологических изменений, до долгосрочной стимуляции пролиферации. Например, под их контролем находится поддержание Са2+ гомеостаза и соответственно Са2+-зависимые процессы, перестройки цитоскелета, пролиферация, миграция и адгезия. Эффектом сигнальных путей, активируемых LPA, являются: усиление образования стресс-фибрилл и фокальных контактов; повышение уровня цАМФ и Са2+ в клетке. Лизофосфатидиловая кислота активирует малую ГТФ-азу Ras и RhoA, отвечающие за инициацию сигнала деления и регуляцию актинового цитоскелета, соответственно. Особенный интерес для нас представляет способность LPA активировать RhoA - ассоциированный сигнальный путь и вызывать фосфорилирование белков по тирозину одновременно с запуском перестроек цитоскелета: LPA индуцирует быстрое образование актиновых стресс-фибрилл и фокальных контактов (Ridley and Hall, 1992).

Таким образом, лизофосфатидиловая кислота является сигнальной молекулой, оказывающей подобное ростовым факторам и гормонам действие на широкий спектр жизненно важных процессов, одним из основных эффекторов, для которой является актиновый цитоскелет, его архитектура и динамическое равновесие. Кроме того, накопленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что характер и сроки перестроек актиновых структур под влиянием разнообразных биологически активных молекул однотипны, и следовательно должен быть универсальный механизм приводящий к разборке цитоскелета. Имеющиеся данные о влиянии на полимеризацию актина свободных форм кислорода дают основу возможного вовлечения подобного механизма на начальных этапах перестройки актиновых структур. В то же время должны существовать и механизмы их быстрого восстановления до исходного или измененного состояния. В настоящее время отсутствуют даже предположения по этому поводу.

4.2.4. Влияние уровня активных форм кислорода на процессы реорганизации актинового цитоскелета.

Одним из возможных универсальных механизмов регуляции процессов реорганизации актинового цитоскелета может быть изменение уровня активных форм кислорода. В пользу такого предположения служат накопленные к настоящему времени данные об их регулирующем действии на различные внутриклеточные системы, а также первые исследования, результаты которых позволяют связать рассмотренные процессы реорганизации цитоскелета с этими механизмами (Sue Goo Rhee et al., 2003).

Основная масса молекулярного кислорода, потребляемого клетками, восстанавливается в митохондриях до воды, окисляя органические субстраты в цепях переноса электронов. Меньшая часть кислорода расходуется на неполное окисление органических соединений. Наконец, заметная часть кислорода в ходе окислительно-восстановительных реакций превращается в так называемые активные формы кислорода (АФК) - свободно-радикальные частицы и молекулы, которые возникают на пути одноэлектронного восстановления кислорода. В частности, к активным формам кислорода относится перекись водорода, которая постоянно образуется в живой клетке как продукт нормального метаболизма кислорода. В клетках млекопитающих нет ферментов, которые бы восстанавливали кислород до перекиси водорода. Однако несколько ферментативных систем (ксантиноксидаза, NADPH-оксидаза, циклоксигеназа и др.) продуцируют супероксид (ион молекулы кислорода с неспаренным электроном), который спонтанно или под действием фермента супероксиддисмутазы превращается в перекись водорода. При повышенном образовании в клетке перекись водорода вызывает оксидативный стресс, тогда как в субтоксических концентрациях Н202 может служить внутриклеточным мессенджером. Показано, что во многих клеточных линиях Н202 образуется в ответ на различные внеклеточные сигналы, включая цитокины (TGF-b, TNF-a, IL), пептидные ростовые факторы (PDGF, EGF, VEGF, bFGF и инсулин) и агонисты рецепторов, связанных с гримерными G-белками (GPCR) - ангиотензин II, тромбин, LPA, гистамин, брадикинин. При этом избирательное подавление образования Н202 в клетках приводит к блокаде сигнальных путей от PDGF, EGF и ангиотеизииа И. Участие Н202 во внутриклеточном сигналинге неоднократно подтверждено различными исследователями. Однако пути синтеза Н202 в клетке и механизмы, лежащие в основе передачи сигнала с помощью Н202, остаются неизученными.

Рецептор-опосредованная продукция Н202 в основном изучена на некоторых специализированных клетках, обладающих фагоцитарной активностью. Показано, что в фагоцитах под действием различных факторов активируется многокомпонентный NADPH -оксидазный комплекс, ответственный за перенос электронов с NADPH на 02 с последующей генерацией супероксиданиона, который спонтанно или ферментативно дисмутирует в Н202. В иейтрофилах активность NADPH -оксидазного комплекса регулируется малой GTP-азой Rac2, а в макрофагах - Racl. Таким образом, Rac белки контролируют уровень активных форм кислорода (Engers et al., 2005). Обмен GDP, связанного с Rac, на GTP катализируется фактором GEF, который в свою очередь активируется инозитол-3-фосфатом, являющмся продуктом активности Р13-киназы. Клетки, не обладающих фагоцитарной активностью, продуцируют АФК в значительно меньших концентрациях по сравнению с фагоцитирующими. Прямые аналоги NADPH -оксидазного комплекса фагоцитов в клетках, не обладающих фагоцитарной активностью, не известны. Однако, не так давно было выявлено несколько новых типов NADPH- оксидаз нефагоцитирующих клеток, некоторые из которых стимулируют продукцию Н202 в ответ на GPCR лиганды и пептидные факторы роста.

Рядом исследователей в последние годы показано, что Н2О2 может контролировать динамику актиновых микрофиламентов в клетке, влияя тем самым на такие важные клеточные функции, как миграция, деление, межклеточные взаимодействия и др. (Fiaschi et al, 2006). О молекулярных механизмах, ведущих к этим изменениям в системе актинововых микрофиламентов клетки, известно мало. Показано, что in vitro актин может служить непосредственной мишенью для Н202 (Theriot, 1998). Кроме того, обнаружено, что актин является одним из белков, наиболее подверженных окислительной модификации in vivo в ответ на предоставление клетке оксидантов. (Dalle-Donne, 2001). Эксперименты, направленные на изучение эффекта окисления мышечного альфа-актина in vitro (Jockusch et al. 1995), не выявили каких-либо значимых изменений, тогда как эксерименты, проведенные на немышечных бета/гамма-изоформах актина, являются более показательными. Это связано с тем, что одним из важнейших отличий между альфа-актином и бета/гамма- актином является число цистеиновых остатков, тиоловые группы которых чувствительны к Н202. Молекула мышечного актина содержит 5 остатков цистеина (Cys-10, -217, - 257, -285 и -374). Немышечные бета/гамма-актины содержат два дополнительных цистеиновых остатка - Cys-17 и Cys-272. Однако Cys-10 в этих актинах заменен на Val-Ю, и общее количество цистеиновых остатков равно 6. Кроме того, показано, что цистеин в положении 272 немышечного бета-гамма-актина является наиболее реактивным цистеином, при этом у мышечного альфа-актина и немышечных изоформ беспозвоночных в позиции 272 находится другая аминокислота (Lassing et al., 2007).

Эксперименты, проведенные на немышечном бета/гамма-актине, показали, что окислительные модификации актина могут приводить к абсолютной потере его способности к полимеризации, а также блокировать взаимодействие актина с профилином, приводя тем самым к деполимеризации актиновых филаментов (Kabsch et al., 1990). Эффект окисления актина зависит от концентрации.ионов кальция (Theriot, 1998). Таким образом, в условиях in vitro были воспроизведены процессы, которые могут происходить в клетках при передаче внеклеточного сигнала при участии перекиси водорода.

Перекись водорода должна действовать как высоко эффективный вторичный мессенджер, так как время ее действия сильно ограничено: восстановительные системы (каталазы, глутатион пероксидазы и др.), активно работающие в клетке, быстро элиминируют АФК. По той же причине место продукции Н202 должно совпадать с местами преобразования актиновых микрофиламентов. Прямое взаимодействие основных источников АФК в клетке - NADPH-оксидазных комплексов и липоксигеназ — с актином подтверждено рядом исследователей (Weisinger et al., 2007; Moldovan et al., 2006). Показано также, что появление АФК во времени и пространстве коррелирует с изменениями системы микрофиламентов (Fechheimer et al., 1993).

Все имеющиеся на сегодняшний день данные говорят о том, что АФК могут являться одним из важнейших регуляторов динамики актинового цитоскелета, а следовательно и многих клеточных процессов, так или иначе связанных с системой микрофиламентов. Объяснение молекулярных основ перестроек актинового цитоскелета в ответ на появление АФК требует не только понимания механизмов сборки-разборки микрофиламентов при окислительно-восстановительных реакциях in vitro, но также объяснения роли многочисленных регуляторпых белков, взаимодействующих с актином in vivo.

Антиоксидантная система включает низкомолекулярные антиоксиданты и антиоксидантные ферменты. К первым относятся гидрофильный восстановленный глутатион (GSH) и аскорбиновая кислота, которые находятся в водной фазе клетки и защищают вещества гиалоплазмы и матрикса митохондрий, а гидрофобные антиоксиданты защищают мембраны. К антиоксидантным ферментам относяться супероксиддисмутаза, селеновая глутатионпероксидаза и каталаза, глутатионтрансферазы , а также фосфолипидгидропероксид.

Глутатион, (2-амино-5- {[2-[(карбоксиметил)амино]- 1 -(меркаптометил)-2-оксоэтил]амино}-5-оксопентаноевая кислота у-глутаминил-цистсинил-глицин, трипептид, образованный остатками трёх аминокислот — глутаминовой кислоты, цисгеина и глицина. Глутатион содержится во всех живых организмах и имеет важное значение для окислительно-восстановительных реакций в связи со способностью сульфгидрильной группы (SH—) цистеина вступать в обратимую реакцию:

-2 Я 2 GSH 7* GS-SG + 2 Н

В клетке тиоловые группы находятся в восстановленном состоянии (SH). Присутствие глутатиона в клетке приводит к тому, что он восстанавливает любую дисульфидную связь (S-S), образующуюся между цистеинами цитозольных белков. При этом восстановленная форма глутатиона GSH превращается в окисленную GSSG. Восстанавливается окисленный глутатион под действием фермента глутатионредуктаза, которая постоянно находится в клетке в активном состоянии и индуцируется при оксидативном стрессе. Отношение восстановленный/окисленный глутатион внутри клетки является одним из важнейших параметров, который показывает уровень оксидативного стресса. Соотношение оксидантов и антиоксидантов в клетке осуществляет редокс-регуляцию, очень важную во всех биологических процессах. Один из агентов, способных влиять на внутриклеточный синтез глютатиона- 2-оксо-4-тиазолидинкарбоксильная кислота (OTZ). OTZ увеличивает уровень глутатиона внутри клетки за счет образования L-цистеина. Изменение уровня АФК и параллельное изменение содержания в клетке глутатиона показана в ряде работ (Lord-Fontaine, Averil, 1999; Chung et al., 1990).

Для выяснения механизмов однотипных преобразований актинового цитоскелета под влиянием разнообразны лигандов представляется важным установить, вовлечена ли в регуляцию этих процессов система активных форм кислорода.

Помимо поиска универсального механизма преобразований актинового цитоскелета перед исследователями в последнее время возникает и другой немаловажный вопрос. Каким образом обеспечиваются чрезвычайно быстрое восстановление структур разобранных под действием разнообразных агентов? При адгезии культивируемых клеток к субстрату их распластывание и формирование структур актинового цитоскелета занимает в лучшем случае несколько (4-5) часов, а при действии перечисленных факторов разобранный цитоскелет восстанавливается уже через 30 минут. Следовательно, есть основание предположить, что в этом процессе могут участвовать уже подготовленные к такой функции белковые комплексы. Однако до настоящего времени никаких прямых литературных данных поддерживающих или опровергающих подобное предположение не существует.

В процессе изучения структуры и функции цитоскелета было обнаружено, что некоторые актин-связывающие белки помимо выполнения своих ортодоксальных функций организации актиновых структур и участия в их деятельности, выявляются кроме того в цитоплазме в несвязанном с цитоскелетом состоянии. К ним, в частности, относится тропомиозин, обнаруженный в виде независимых частиц. Кроме того, в результате проводимых в лаборатории исследований взаимодействия транскрипционного фактора NF-kB с цитоскелетом обнаружено, что он взаимодействует с альфа-актинином и может транслоцироваться в ядро и, следовательно, покидать актин-со держащие структуры или существовать в этом комплексе независимо от них. Также было известно, что альфа-актинин может выявляться в фокальных контактах и других прямо не связанных с актином комплексах. Знакомство с литературой, посвященной свойствам этих белков, показывает в случае тропомиозина, что он присутствует в клетках в виде целого набора изоформ разного молекулярного веса и разной степени взаимодействия с актином. Более того, при злокачественной трансформации клеток происходит смена изоформ, влияющих на стабильность и динамику актиновых структур. Альфа-актинин образует комплексы с рядом белков, осуществляющих взаимодействие с адгезивными рецепторами и молекулами, выполняющими сигнальные функции. Таким образом, можно предположить, что тропомиозин и альфа-актинин могут входить в состав независимых от цитоскелета комплексов, принимающих участие в реорганизациях актинового цитоскелета.

4.4. Структура и функции тропомиозина

Тропомиозин - это эволюционно консервативный альфа-спиральный актин-связывающий белок, он димеризуется с образованием палочковидных суперспиралей, которые укладываются вдоль центральной канавки F-актиновых микрофиламентов и участвуют в поддержании их структуры. В мышечных и немышечных клетках тропомиозин контролирует взаимодействие актиновых фибрилл с миозином, регулируя сокращение (Brown and Cohen, 2005).

Поскольку тропомиозины регулируют набор актин-связывающих белков, вовлечённых в работу цитоскелета, то смена разных изоформ в клетке неразрывно связана с характером организации актинового цитоскелета, определяя его динамические свойства и стабильность (Lindberg et al., 2008, O'Neill et al., 2008). Так, менее развитую организацию актинового цитоскелета, характерную для трансформированных и раковых клеток, связывают с заменой высокомолекулярных изоформ тропомиозина низкомолекулярными (Miyado et al., 1997; Gunning et al., 2008). Эти данные дают основания предполагать, что характер пространственной организации и стабильность актинового цитоскелета может зависеть от типа синтезируемых в данных условиях конкретных изоформ тропомиозина. При этом восстановление экспрессии высокомолекулярных тропомиозинов приводит к ингибированию онкогенных проявлений и восстановлению нормального клеточного фенотипа (Gunning et al., 1997). Так, например, тропомиозин-1 считается онкосупрессором: показано, что его экспрессия приводит к нормализации фенотипа src- и ras-трансформированных фибробластов и в этом процессе принимает участие сигнальный путь Rho (Prasad et al., 1999; Shah et al., 2001). При помощи совместного действия ингибитора ДНК-метилтрансферазы 5-аза-2'-дезоксицитидина и ингибитора деацетилаз трихостатина А удалось увеличить экспрессию тропомиозина-1 в клетках карциномы лёгкого и ras-трансформированных фибробластах. Экспрессия тропомиозина-1 в клетках карциномы лёгкого приводит к Rho-зависимому восстановлению нормального цитоскелета и чувствительности к аноикизу (Bharadwaj et al., 2002, 2005). В дрожжах Schizosaccharomyces pombe экспрессируется единственная изоформа тропомиозина — Cdc8, и на протяжении всего клеточного цикла 80% белка ацетилировано, что значительно увеличивает его сродство с актином. Ацетилированный Cdc8 ингибирует связывание миозина с актином (Skoumpla et al., 2007). Отдельная молекула тропомиозина слабо взаимодействует с F-актином. Стабильное связывание обеспечивается за счёт полимеризации тропомиозинов голова-к-концу в спираль на поверхности актиновой фибриллы. Тропомиозины без N-концевых ацетильных остатков или с делегированными концами не способны к полимеризации и взаимодействию с актином (Johnson and Smillie, 1977; Urbancikova and Hitchcock-DeGregori, 1994).

Обычно тропомиозин находится в клетке в связанном с актиновыми структурами виде, в немышечных клетках в основном в составе стресс-фибрилл (Lazarides, 1975). Вместе с тем, при иммунофлуоресцентном анализе цитоскелета с помощью антител к тропомиозину, его обнаружили не только в составе актиновых структур, но и в виде независимых от них крупных частиц, распределенных в цитозоле, в том числе в ламеллах и филоподиях, где обычно интенсивно полимеризуется актин (Hillberg et al., 2006; Grenklo et al., 2008).

Молекулярная организация и функциональная роль этих частиц в настоящее время неизвестны. Вполне возможно, что они вовлечены в процесс реорганизации цитоскелета под влиянием внешних лигандов и являются предшественниками будущих актиновых структур, а также могут принимать участие в проведении внутриклеточных сигналов. Для того, чтобы выяснить, в какой мере тропомиозиновые частицы связаны с осуществлением этих процессов необходимо, прежде всего, определить их белковый состав и проследить за динамикой тропомиозиновых комплексов в процессе перестроек актинового цитоскелета.

В данной работе были использованы нормальные и трансформированные клетки с разной степенью развитости актинового цитоскелета (Арэ и др., 1999) для оценки количества и размера содержащихся в них тропомиозиновых частиц.

Так как из литературы известно, что характер взаимодействия тропомиозина с актином может изменяться в зависимости от степени его ацетилирования (Cho et al., 1990), то от этого может зависеть образование тропомиозиновых частиц, изменение их количества и состава.

Формирование подобных независимых частиц или белковых комплексов может также происходить в процессе различных перестоек актинового цитоскелета и являться одним из этапов передачи сигнала или транспортировки сигнальных молекул от мембраны клетки в ядро. В связи с проводимыми в нашей лаборатории исследованиями, впервые продемонстрировавшими взаимодействие транскрипционного фактора NF-kB с альфа-актинином и транслокацией этих молекул в ядро, возникло предположение, что они могут образовывать также независимые от цитоскелета комплексы. Многофункциональность альфа-актинина и его способность вступать в контакты с разнообразными молекулами может быть результатом его мобильности.

4.3. Альфа-актинин

4.3.1. Структура а-актинина а-Актинин - широко распространённый акгин-связывающий белок. Он содержит четыре спектриновых повтора и считается наиболее примитивным белком в спектриновом суперсемействе, к которому относятся также а- и (3-спектрины, дистрофии и утрофин. Известны его изоформы скелетных и гладких мышц и немышечные изоформы а-актинина. Различные изоформы были выявлены методом пептидных карт (Bretcher et al., 1979), а полная последовательность а-актинина, состоящая из 897 аминокислот была определена клонированием и секвенированием кДНК. Молекулярная масса мономера составляет 94-103 кДа. В состав белка входит три высококонсервативных домена: (1) наиболее консервативный амино-терминальный участок, содержащий два кальпонин-подобных актин-связывающих домена: СН1 и СН2, (2) центральный регион, состоящий из четырех спектрин-подобных а-спиральных повторов (SHR - spectrin homology repeats), которые участвуют во взаимодействии мономеров между собой, но также могут осуществлять связь с другими молекулами (Djinovic-Carugo et al., 2002), (3) карбокси-терминальный домен, содержащий один или два кальцийсвязывающих мотива (EF-hands), в зависимости от изоформы (Arimura et al., 1988, Miillake et al., 1989). а-Актинии формирует гомодимеры из двух антипараллельно направленных субъединиц, и по крайней мере две изоформы, а-актинин 2 и 3, могут образовывать гетеродимеры (Dixson et al., 2003). Структура димера, в котором два актин-связывающих участка разделены жестким стержнем из спектриновых повторов, обуславливает способность а-актинина к формированию упорядоченных сетей, пучков или разветвлённых пучков из актиновых микрофиламентов (Djanovic-Carugo et al., 1999, Pelletier et al., 2003).

4.3.2. Изоформы актинина и их субклеточная локализация

В настоящее время у высших позвоночных известно четыре гена, кодирующие альфа-актинины 1, 2, 3 и 4 (Critchley and Flood, 1999). Считается, что первым в результате генной дупликации появился а-актинин-2, а затем в результате дивергенции - альфа-актинины 1,3 и 4. (Dixson et al., 2003). Ген ACTN1 дает три изоформы альфа-актинина путем тканеспецифичного альтернативного сплайсинга. Немышечная/цитоскелетная изоформа содержит два EF мотива. В транскрипте оказывается немышечный экзон, кодирующий 27 аминокислот, которые образуют С-конец первого EF мотива. Гладкомышечная изоформа содержит единственный EF мотив. Гладкомышечный экзон кодирует 22 отличные от немышечной изоформы аминокислоты. Описана также изоформа из мозга взрослых крыс, при транскрипции которой оба экзона комбинируются, образуя последовательность специфичную для мозга (Kremerskothen et al., 2002). Эта изоформа экспрессируется в мозге взрослых животных, особенно в гиппокампе и кортикальных нейронах и не обнаружена в эмбриональном мозге. Связывание немышечной изоформы с актином ингибируется кальцием, а связывание гладкомышечной изоформы не зависит от кальция, особенности изоформы из мозга пока неизвестны. Изоформа немышечного альфа-актинина-4 (ACTN4) была клонирована из различных онкогенных клеточных линий и имеет 80% гомологию к продуктам гена ACTN1 (Honda et al., 1998). Высокий уровень экспрессии альфа-актинина 4 наблюдается в подоцитах. Гены ACTN2 и ACTN3 кодируют две скелетно-мышечные изоформы. Ген ACTN2 экспрессируется в скелетных и сердечной мышцах, тогда как ген ACTN3 экспрессируется только в скелетных мышцах. Мышечные изоформы формируют часть сократительного аппарата, заякоривая актиновые тонкие филаменты в Z-линиях и плотных телах в поперечнополосатых и гладких мышцах соответственно.

Отмечены различия в субклеточной локализации немышечных изоформ альфа-актинина. Актинин-1 локализуется вдоль стресс-фибрилл и участвует в связывании микрофиламентов, он обнаружен в фокальных и межклеточных контактах. Актинин-4 значительно меньше концентрируется вдоль стресс-фибрилл и не был обнаружен в фокальных и межклеточных контактах; белок локализуется в основном в цитоплазме и может мигрировать в ядро при воздействии вортмапнина или цитохалазина, а в некоторых клеточных линиях он постоянно локализуется в ядре (Honda et al., 1998). В целом если актинин-1 ассоциирован с более стабильными клеточными структурами, то актинин-4 — с более динамичными, например, с областями активного раффлинга (Araki et al., 2000), также он был обнаружен в экзосомах, секретируемых мезотелиомными клетками (Hegmans et al., 2004). Альфа-актинин-4 участвует в фаго-, эндо- и макропиноцитозе в макрофагах, стимулированных колоний-стимулирующим фактором (Araki et al., 2000).

Имеются различные данные о ядерной локализации этого белка. Так, удаление 71 аминокислоты на С-конце а-актинина-4, кодируемого плазмидой, содержащей GFP, приводит к постоянной ядерной локализации этого белка (Gonzalez et al., 2001). В отличие от а-актинина-1, экспрессия а-актинина-4 вызывает миграцию клеток. Мутации в гене ACTN4 (К/Е в положении 228, Т/1 - 232, S/P - 235), который локализован на 19ql3 хромосоме человека, могут приводить к неспецифическому поражению почек. Уровень экспрессии а-актинина-4 и его субклеточная локализация в подоцитах зависит от уровня глюкозы и гликозилированных конечных продуктов в среде, что связывают с цитоскелетными перестройками в подоцитах в условиях диабета (На, 2006). Мутантный а-актинин-4 имеет большее сродство к актину in vitro, чем белок дикого типа. Известно, что мутация в гене альфа-актинина-4, приводящая к повышенному сродству к фибриллярному актину, приводит к серьезным почечным дисфункциям (Kaplan et al., 2000). Актинин-4 открыт недавно (Honda et al., 1998), и его функциональная роль и структурные особенности ещё достаточно мало изучены.

Протеолитическое расщепление мышечного а-актинина трипсином или термолизином приводит к появлению устойчивого к расщеплению фрагмента с мол. массой 53 кДа и термолизин-устойчивого полипептида с мол. массой приблизительно 27 кДа (Bretcher et al., 1979). Фрагмент 27 кДа является актин-связывающим доменом актинина. В клетке альфа-актинин, вероятно, находится под строгим контролем протеаз, но протеолитическое расщепление этого белка изучено плохо. Имеются данные, что фрагменты альфа-актинина обладают биологической активностью. Так, 31 кДа амино-терминальный фрагмент альфа-актинина, получивший название мактинин, выявленный в культуральной среде клеток миелоидной лейкемии HL-60 после добавления очищенного альфа-актинина (Mane et al., 1991), стимулирует созревание моноцитов в макрофаги. Интакгный а-актинин не обладал подобной активностью (Masri et al., 1999, Luicart et al., 1999). Дальнейшие исследования этой группы показали, что мактинин образуется только под действием урокиназы, и не образуется под действием других сериновых, цистеиновых и металлопротеаз (Luikart et al., 2002). Недавно при помощи двухгибридного анализа была выявлена изоформа а-актинина-4 с вырезанным участком 89-478 аминокислотных остатков, который содержит часть домена СН-1, все домены СН-2 и SHR домены 1 и 2. Такие короткие изоформы а-актинина-4 локализуются в клетках HeLa преимущественно в ядре (Chakraborty et al., 2006). Имеются данные о том, что микроинъекция флуоресцентно меченных фрагментов а-актинина 27 кДа и 53 кДа приводит к накоплению их в ядре, но авторы считали это артефактом (Pavalko and Burridge, 1991). На возможную функциональную роль фрагментов а-актинина в ядре может указывать тот факт, что 31 кДа фрагмент гладкомышечного а-актинина, полученный под действием урокиназы, вызывает созревание моноцитов в макрофаги (Luikart et al., 2002).

Для исследования динамики а-актинина в стресс-фибрилах и фокальных контактах использовались микроиньекции флюоресцентно-меченного белка. Полное восстановление флюоресценции после фотовысвечивания участка в участках фокальной адгезии происходило примерно за 20 минут, а в стресс-фибрилах за 30-60 минут. Фотовысвеченные участки осуществляли центростремительное движение вдоль стресс-фибрилл со скоростью 0,24±0,12 нм/мин (McKenna et al., 1985, McKenna et al., 1986). Ha Swiss ЗТЗ клетках, экспрессирующих GFP-плазмиду с альфа-актинином (aAGFP), были продемонстрированы более высокие темпы обмена: порядка 15 минут для обеих структур (Edlund et al., 2001). Стимуляция эпителиальных клеток (BSC-1) форболовым эфиром после микроиньекции а-актинина приводила к быстрой реорганизации актиновых структур. После стимуляции появлялись раффлы, содержащие большое количество иньецированного актинина. а-Акгинин при этом исчезал из фокальных контактов быстрее, чем из стресс-фибрил и раньше, чем фокальные контакты разбирались (Meigs et al., 1986). Во многих трансформированных клетках после разборки стресс-фибрил и фокальных контактов а-актинин выявляется в составе агрегатов. Динамика белка в таких агрегатах была исследована на почечных клетках крысы методом фотовысвечивания после микроиньекции флюоресцентно-меченого актинина: структуры оказались высокодинамичными, способными очень быстро изменять размер и положение. Темпы обмена актинина в агрегатах также оказались необычно высоки: восстановление после высвечивания происходило за 11 секунд (Stickel et al., 1987).

4.3.5. Участие а-актинина в адгезии а-Актипин участвует в формировании различных комплексов клеточной адгезии, включая фокальные контакты, поясковые десмосомы, полудесмосомы, участки адгезии лимфоцитов и такие специализированные клеточные структуры, как синапсы и структуры в подошве подоцитов. Снижение уровня экспрессии а-актинина-4 в подоцитах приводит к ухудшению адгезии клеток к базальной мембране в нефронах и к субстратам (коллаген IV и ламинин 10/11) в культуре, также снижается сила связи между интегринами и цитоскелетом (Dandapani et al., 2006). Альфа-актинин специфично и прямо взаимодействует с цитоплазматическими доменами pi и рз интегринов (Otey et al., 1990, Cattelino et al., 1999). Эти данные позволяют предположить, что комплекс а-акгинин-р-интегрин может осуществлять взаимодействие актиновых филаментов с плазматической мембраной и фокальными контактами. Это подтверждается, в частности, тем что при микроинъекции фрагментов a-акгинина 27 кДа и 53 кДа происходит разрушение актиновых. структур, вероятно потому, что фрагменты препятствуют эндогенному а-актинину взаимодействовать и с актином и с интегринами (Pavalko et al., 1991). Показано и взаимодействие а-актинина с пептидом, соответствующим части цитоплазматического домена р2-интегрина (CD 18) in vitro. CD 18 также соосаждается с а-актинином из активированных хемотоксическим пептидом FMLP и ФНО-а нейтрофилов. Это взаимодействие временно, наблюдается через 5-10 мин после активации и снижается до остаточного уровня к 20 мин (Pavalko and LaRoche, 1993). В покоящихся лейкоцитах р2-интегрины постоянно связаны с актиновыми структурами через талин. Активация клеток индуцирует протеолиз талина и открепление актиновых структур от р2-имтегрина. Это временное явление, вслед за которым следует новое прикрепление микрофиламентов к интегринам через а-актинин. Эксперименты по мутагенезу цитоплазматического домена р2-интегрина показали, что это связывание регулируется конформационными изменениями интегрина (Sampath et al., 1998).

В межклеточных контактах фибробластов а-актинин взаимодействует с комплексом Е-кадгерин/катенин. С этим комплексом в эпителиальных клетках кроме а-актинина взаимодействует и винкулин. В N- и Е-кадгерин экспрессирующих клетках а-актинин образует иммунопреципитаты с а- и р-катенинами только в присутствии а-катенина. Это взаимодействие не зависит от присутствия актина (Lewis et al., 1995). Интересно, что а-катенин имеет гомологию с винкулином, который взаимодействует и с актином и с а-актинином (Knudsen et al., 1995, Herrenknecht et al., 1991). а-Актинин-4 образует комплексы с [3-катенином в клетках линии SW480, перекрывая при этом сайт связывания Е-кадгерина, а уровень такого связывания зависит от уровня экспрессии Е-кадгерина: а-актинин начиниет коиммунопреципитировать с [3-катенином в тех клетках эпителиальных опухолей, которые перестают экспрессировать Е-кадгерин и начинают инфильтрировать строму (Hayashida ct al., 2005). Пептид из 25 аминокислот, соответствующий цитоплазматическому домену молекулы межклеточной адгезии-2 (ICAM-2), связывает а-актинин из плацентарного лизага. При этом не наблюдалось взаимодействие с винкулином, галином и спектрином. Очищенный а-актинин прямо взаимодействует с этим пептидом. Результаты иммунофлюоресценции показали, что а-актинин и ICAM-2 солокализуются в эндотелиальных клетках (Nafaguehi et al., 1991). Для поиска цитоскелетных белков, взаимодействующих с ICAM-1, использовался такой же метод. Синтезированный пептид из 28 аминокислот, соответствующий цитоплазматическому домену ICAM-1, взаимодействовал с а-актинипом, но не с талином, винкулином и тензином. Очищенный а-акгинин солокализуется с белком ICAM-1 в лимфоидных клеточных линиях (Сафеп et al., 1992). Методом двухгибридного анализа было показано, что обе немышечные изоформы а-актинина - первый и четвёртый - взаимодействуют с цитоплазматическим доменом ICAM-1, и это взаимодействие играет значительную роль в адгезивных свойствах лейкоцитов, оно совершенно необходимо для того, чтобы лейкоциты могли выходить сквозь стенки кровеносных сосудов в ткани (Celli et al., 2006). L-селектин прямо взаимодействует с а-актинином, но не с талином или винкулином. Интересно, что талин способствует взаимодействию а-актинина и L-селектина, но сам этот белок с ними не связывается. Винкулин связывается с этим комплексом только в присутствии а-актинина (Heiska et al., 1996). В фокальных контактах а-актинин взаимодействует с трансмембранным протеогликаном синдеканом-4, связывая его с системой микрофиламентов клетки. Белки взаимодействуют независимо от |3-интегринов. а-Актинин и синдекан-4 имеют сходную локализацию, коиммунопреципитируют и связываются в опытах in vitro (Greene et al., 2003).

4.3.6. Образование комплексов с другими белками

Винкулин связывается с а-актинином в области спектрин-подобных повторов, но не с актин-связывающим доменом. С использованием серий GST конструкций был определен связывающий участок на С-конце (аминокислотные остатки 713749), который перекрывает первый из двух кальций-связывающих EF-мотива (McGregor et al., 1994). а-Актинин взаимодействует с белками, содержащими LIM домен: зиксином и белками семейства CRP. Зиксин - актин-связывающий белок, обнаруживается в фокальных контактах. При удалении а-актинин-связывающего сайта ассоциация зиксина с фокальными контактами значительно снижается, и этот факт проясняет физиологическую роль взаимодействия а-актинин-зиксин. Двугибридный анализ показал, что N-концевой домен зиксина (аминокислотные остатки 1-42) взаимодействует с центральными спектрин-подобными доменами а-актинина (Li and Trueb, 2001). Интересен и тот факт, что как зиксин, так и а-актинин-4 при определенных условиях обнаруживаются в ядре, но неизвестно, взаимодействуют ли они там,. С а-актинином специфично и прямо взаимодействует цистеин-богатый белок, имеющий LIM домен (CRP). За взаимодействие отвечает последовательность из 18 аминокислотных остатков в N-концевом глицин-богатом домене (Pomies et al., 1997, Harper et al., 2000). а-Актинин способен связываться с белками семейства Enigma/Cypher, которые характеризуются наличием N-концевого PDZ-домена, связывающегося с другими цитоскелетными белками, и С-концевого LIM мотива, который может связываться с киназами. Так, новый актинин-связывающий белок ALP с мол. массой 39 кДа был обнаружен в скелетных мышцах. Высокий уровень экспрессии этого белка наблюдается только в Z-линии, где он взаимодействует с а-актинином-2. Двугибридный анализ показал, что PDZ домен ALP связывается со спектрин-подобными повторами а-актинина-2 (Xia et al., 1997). Другой PDZ-LIM белок CLP-36 локализуется вдоль стресс-фибрилл в немышечных клетках. Этому способствует взаимодействие PDZ домена CLP-36 со спектрин-подобными повторами а-, актинина. Показано взаимодействие обеих немышечных изоформ с CLP-36 (Vallenius et al., 2000).

Масс-спектрометрическими методами недавно было показано взаимодействие а-актинина-4 с PDZ-содержащим белком семейства MAGUK (membrane-associated guanylate kinase scaffolding proteins) - ZO-1 (zonula occludens-1). Кроме того, эти два белка коиммунопреципитируют как из культивируемых клеток, так и из тканей мозга, печени и сердца. ZO-1 является компонентом различных межклеточных контактов, где он взаимодействует с широким спектром трансмембранных и примембранных белков, включая окклюдины, различные изоформы катенинов и коннексинов, белки синаптических контактов. Множественные PDZ-домены, входящие в структуру ZO-1, позволяют ему выступать скаффолдом для сигнальных и структурных молекул, но особенно примечательно то, что ZO-1 содержит и NLS-последовательности, посещает челночным образом ядро и может там связываться с Y-box транскрипционным фактором ZONAB (Chen et al., 2006).

Было идентифицировано новое семейство актинин-связывающих белков: миотилин, миопалладин и палладии сходны по структуре и каждый обладает несколькими копиями IgC2 домена. Миотилин и миопалладин локализованы в Z-дисках поперечно-полосатой мускулатуры и играют важную роль в организации саркомеров (Otey and Carpen, 2004). Белок палладии с мол. массой 90-92 кДа, экспрессирующийся в фибробластах, солокализуется с а-актинином в стресс-фибрилах, фокальных контактах, межклеточных контактах и эмбриональных Z-линиях. Этот белок также образует иммунопреципитаты с а-актинином. Антисмысловые РНК-конструкции к РНК этого белка вызывают разборку цитоскелета (Parast et al., 2000).

Актинин-2 связывается также с дистрофином (Hance et al., 1999) и CapZ (Papa et al., 1999). BERP белок, экспрессирующийся в мозге, и способный связываться с хвостовым доменом миозина V, прямо взаимодействует с а-актинином-4 (Е1-Husseini et al:, 2000). На клетках HeLa было показано, что а-актинин-4 вместе с ассоциированным с эндосомами белком hrs, белком BERP и миозином V образуют белковый комплекс CART [cytoskeleton-associated recycling or transport], который предположительно осуществляет связь эндосом, содержащих трансферриновый рецептор, с актиновым цитоскелетом и играет таким образом важную роль в рециклировании этих эндосом (Yan et al., 2005).

С а-актинином-4 взаимодействуют также белок межклеточных контактов ВР180 (Gonzalez et al., 2001) и белок MAGI-1 в подоцитах (Patrie et al., 2002). Недавно было показано, что а-актинин ассоциирован с белком теплового шока

БТШ) 20 (Tessier et al., 2003). Кроме того, а-актинин-4 формирует тройной

2+ комплекс с Са /кальмодулин-зависимой протеинкиназой 2 и денсином-180, постсинаптическим белком нейронов центральной нервной системы (Walikonis et al., 2001). Са -зависимое взаимодействие а-актинина-4 с PDZ-белком E3KARP требуется для Са2+-зависимового ингибирования Na+/H+ насоса 3 типа (NHE3), ответственного за абсорбцию NaCl и NaHCC>3 в кишечнике и проксимальных почечных канальцах. (Kim et al., 2002).

Иммунопреципитация и масс-спектрический анализ позволили выявить целый ряд белков, с которыми взаимодействует а-актинин-4 в клетках линии 22RV1 — это р/у актин, кальмодулин, тяжёлая цепь клатрина, тяжёлая цепь немышечного миозина, гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин (hnRNP) Al и 8НЗ-домен-евязывающий белок G3BP. Также было обнаружено взаимодействие с а-актинином-4 динамина, адаптина-5, 0-NAP и р47А. Показано, что а-актинин-4 принимает участие в регуляции пузырькового транспорта (Нага et al., 2006). Было обнаружено, что а-актинин-4 выявляется в ядрах клеток линии НЕК293 в числе белков, взаимодействующих с андрогеновым рецептором, и в комплексе с ним обнаруживаются тяжёлая цепь клатрина и протеинкиназа С5. При этом а-актинин-4 и протеинкиназа С5 могут играть роль регуляторов транскрипции, опосредованной андрогеновым рецептором. Авторы говорят о мультимолекулярном комплексе («специфическом белковом модуле»), с которым связывается андрогеновый рецептор и который обуславливает его надлежащую активность и регуляцию (Jasavala et al., 2006).

Интересную роль а-актинин играет в патогенных процессах, вызываемых E.coli. Бактерия встраивает в плазматическую мембрану эпителиальной клетки хозяина белок Tir, являющийся рецептором для мембранного белка E.coli интимина. Tir же связывается с а-актинином, осуществляя непосредственную связь с актиновым цитоскелетом и обеспечивая его перестройку для нужд патогена (Goosney et al., 2000).

4.3.7. Участие комплексов альфа-актинина в сигнальных системах

Очевидно, что являясь элементом таких динамичных структур в клетке, как фокальные контакты, или же осуществляя связь между трансмембранными белками и актиновыми микрофиламентами, актинин должен обладать соответствующими системами регуляции. Можно выделить четыре основных механизма регуляции а-актинина: связывание фосфатидилинозитоловых интермедиатов, воздействие протеаз, фоефорилирование тирозинкиназой FAK и связывание кальция. а-Актинин из исчерченной мускулатуры содержит большое количество эндогенного фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата, в то время как белок из гладкой мускулатуры связывает только небольшое его количество. PIP2 регулирует связывание а-актинина и F-актина (Fukami et al., 1992). Регуляторная субъединица Р13-киназы 85 кДа (р85) образует иммунопреципитаты с a-акгинином из лизатов клеток NIH/3T3. В отсутствии PIP2 а-актинип связывает всю молекулу р85, тогда как в присутствии PIP2 - только пролин-богатый регион р85 (Shibasaki et al., 1994). В клетках линии Balb/c ЗТЗ а-актинин, связаный с цитоскелетом, содержит PIP2, тогда как белок, находящийся в цитозоле, не содержит PIP2. Уровень связанного с а-актинином PIP2 снижается после стимуляции клеток PDGF и восстанавливается в течение часа после стимуляции. Активация Р13-киназы приводит к разборке фокальных контактов и перераспределение а-актинина и винкулина в Triton Х-100 - растворимую фракцию. Фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат, продукт PI3-киназы, связывается с а-актинином в PDGF — обработанных клетках, при этом снижается сродство а-актинина к pi и рЗ-интегринам (Greenwood et al., 2000). а-Актинин фосфорилируется по тирозину в ответ на стимуляцию Т-клеточного рецептора (Egerton et al., 1996). В дальнейшем фосфорилированный а-актинин был обнаружен в активированных тромбоцитах, где цитоскелетная изоформа фосфорилируется киназой фокальных контактов FAK в положении Туг12. Фосфорилирование по Туг 12, остаток которого находится в EF1 домене, приводит к снижению сродства а-актипина и F-актина, также как и замена на глутаминовую кислоту в этом положении (Izaguirre et al., 1999, Izaguirre et al., 2001). Физиологический смысл, как и в случае с PIP3, состоит, вероятно, в значительных перестройках при адгезии клеток, которая сопровождается активацией FAK и, вполне возможно, в модуляции а-актинина как скаффолд-белка в этом важном в жизни клетки процессе. Путь утилизации фосфорилированного а-актинина неизвестен; возможны дефосфорилирование с помощью фосфотирозинпротеинфосфатаз или деградация.

Серин/треонин протеинкиназа МЕКК1, которая является активатором MAP киназ и транскрипционного фактора NF-kB, взаимодействует с а-актинином, что было показано двух-гибридным анализом. МЕКК1 коиммунопреципитирует с а-актинином из лизатов клеток 293. Показана и солокализация МЕКК1 и а-актинина вдоль стресс-фибрилл и в фокальных контактах. Для связывания не требуется киназная активность МЕКК1, белок с мутациями в каталитическом домене также локализован на стресс-фибриллах. (Christerson et al., 1999). МЕКК1 может модулировать активность протеазы кальпаина, которая помимо протеолиза таких белков, как талин или винкулин, может влиять на включение а-актинина в фокальные контакты (Otey and Carpen, 2004).

PKN - серин/треониновая протеинкиназа, имеющая каталитический домен, гомологичный протеинкиназе С, взаимодействует с а-актинином Это было обнаружено при помощи двугибридного анализа. За связывание с а-актинином отвечает N-концевой район PKN, пе пересекающийся с RhoA-связывающим доменом. PKN связывает третий спектрин-подобный домен в мышечной и немышечной изоформе а-актинина. PKN также способна Са2+-зависимо связываться с EF-мотивом немышечной изоформы а-актинина и Са2+-независимо -с мышечной изоформой. PKN фосфорилировала N-терминальную область а-актинина в присутствии 40 мкМ арахидоновой кислоты, но более предпочтительные субстраты для этой киназы G-актин и кальдесмоп (Mukai et al., 1997). а-Актинин-4 физически и функционально взаимодействует с серин/треониновой протеинкиназой АКТ1, регулируя критическим образом её локализацию и работу. Так, сайленсинг гена ACTN4 при помощи миРНК приводит к снижению уровня фосфорилирования АКТ1, блокирует перемещения АКТ1 к мембране и ингибирует пролиферацию клеток (Ding et al., 2006).

Было установлено, что а-актинин является потенциальным ингибитором всех членов семейства GRK (киназы рецепторов, связанных с G-белками). В присутствии кальмодулина и а-актинина GRK5 фосфорилирует растворимые, но не связанные с мембранами субстраты. Напротив, в присутствии PIP2 и а-актинина GRK5 фосфорилирует связанные с мембранами, но нерастворимые в цитоплазме субстраты. Таким образом, PIP2 и кальмодулин регулируют взаимодействие а-актинина и GRK in vivo (Freeman et al., 2000).

Кальмодулин имеет эффект обратный а-актинипу и в случае с нейротрансмштерным NMDA (N-метил-О-аспартат) рецептором. Кальций-связанный кальмодулин замещает а-актинин, связанный с NMDA рецептором, что вызывает перераспределение рецептора. Двугибридный анализ показал, что центральный домен а-актинина связывается с цитоплазматическими доменами обеих NR1 и NR2B субъединиц NMDA рецептора (Wyszynski et al., 1997).

Двугибридным методом было показано взаимодействие а-актинина и белка рабфилина-ЗА, который является мишенью Rab3A малого GTP-связывающего у, белка. Рабфилин-ЗА участвует в Са -зависимом экзоцитозе. За связывание ответственны спектриновые повторы а-актинина. Комплекс а-актинин/рабфилин-ЗА способствует связыванию микрофиламентов в пучки, a Rab3A препятствует образованию этого комплекса (Kato et al., 1996).

Было обнаружено совместное перераспределение а-актинина и протеинкиназ С pi и pil. Однако, не было показано прямого взаимодействия а-актинина и протеинкиназы CP (Niggli et al., 1999). Другая изоформа протеинкиназы С -эпсилон - после стимуляции арахидоновой кислотой кардиомиоцитов мигрирует в область Z-линии, одним из главных компонентов которой является а-актинин. Но прямого взаимодействия также не показано.

Наконец, совсем недавно Chakraborty et al. обнаружили, что 1 и 4 изоформы а-актинина взаимодействуют с гистоновыми деацетилазами класса На. Были картированы взаимодействующие участки на С-конце а-актинииа-4 и 72-172 аминокислотные остатки на гистоновой деацетилазе 7 (HDAC7). Область связывания а-актинина-4 на HDAC7 при этом значительно перекрывается с областью связывания транскрипционного фактора MEF2A Таким образом, а-актинин-4 конкурирует с MEF2A за связывание FIDAC7 и регулирует его транскрипционную активность: например, при увеличении экспрессии а-актинина-4 больше экспрессируется и TAF55 - одна из мишеней для MEF2. Таким образом, доказанным является тот факт, что а-актинин-4 может работать в ядре как корегулятор транскрипции (Chakraborty et al., 2006).

Таким образом, большое количество работ в последние несколько лет, в которых обнаруживаются всё новые а-актинин-связывающие белки (таблица 3.1.), позволяют предполагать, что а-актинин функционирует не только как белок, способствующий стабилизации актиновых филаментов, но и как важный молекулярный скаффолд, обеспечивающий взаимодействие ряда ключевых сигнальных белков с актиновым цитоскелетом, а также может принимать участие в регуляции транскрипции. Известные вторичные мессенджеры, такие как I внутриклеточный Са , PIP2 и PIP3, регулируют межбелковые взаимодействия а-актинина, сигнальных белков и актинового цитоскелета.

Помимо своей главной функции латерального связывания актиновых филаментов, немышечный а-актинин взаимодействует с трансмембранными рецепторными молекулами и может действовать как адапторный белок, организуя белки, содержащие LIM-, PDZ-, Ig С2 (Ig-подобные)- домены. Наличие собственных доменов (кальпонин-гомологичного домена и спектриновых повторов) позволяет а-актинину взаимодействовать с целым рядом белков. Со спектриновыми повторами альфа-актинина могут связываться цитоплазматические домены интегринов, ICAM, L-селектин, Ер-САМ (epithelium-specific cell-cell adhesion molecule) (Balzar et al., 1998), металлопротеазы ADAM12 (Cao et al., 2001) » и NMDA рецептора. Во всех этих взаимодействиях связывающий сайт на цитоплазматическом домене этих белков был картирован до относительно короткого основного пептида. Кристаллическая структура стержневого домена а-акгинина, основой которой являются спектриновые повторы, выявила представленные на поверхности кислые аминокислоты (Ylanne et al., 2001), с которыми могут взаимодействовать эти основные пептиды.

Внутриклеточная локализация двух немышечных изоформ альфа-актинина различна. а-Актинин-1 преимущественно локализуется в областях фокальных и межклеточных контактов и вдоль стресс фибрилл. а-Актинин-4 локализуется в активно движущихся структурах клетки, в областях интенсивного раффлинга, кортикального актина, может взаимодействовать со стресс фибриллами; участвует в процессах макропиноцитоза и фагоцитоза; и только эта изоформа обнаруживается в ядре. Между изоформами наблюдается высокая гомология, особенно в областях спектриновых и актин-связывающих доменов, и обе изоформы I имеют общую регуляцию Са и фосфоинозитидами. Вопрос о различной локализации изоформ остается открытым. Участие актинина-4 в активно движущихся структурах и белковых комплексах, а также его роль в регуляции различных клеточных процессов позволяет предполагать, что этот белок более быстро регулируется основными сигнальными механизмами клетки, чем актинип-1, представленный, в основном, в стабильных клеточных структурах. Будучи одним из основных регуляторов клеточной адгезии, а-актинин-4 может играть ключевую роль в канцерогенезе и метастазировании, от него же зависит надлежащее функционирование белкового фильтра, которых образуют в почках подоциты.

Всё вышесказанное свидетельствует о том, что а-актинин может представлять собой один из ключевых элементов актинового цитоскелета, принимающих участие в передаче сигнала с поверхности клетки в ядро. а-Актинин-4 образует комплексы с большим количеством различных белков, и его конкретная функция во многом может зависеть от партнёров, с которыми он в данный момент взаимодействует. При этом, несмотря на большое количество взаимодействий а-актипина с различными сигнальными молекулами, остаётся неясной та роль, которую он выполняет в сигнальных процессах, и каким образом она осуществляется.

Таблица 3.1

Белки, связывающиеся с немышечными изоформами а-актшшна

Белок Комментарии Ссылки актин-связывающие белки винкулин белок фокальных контактов, может связываться с плазматической мембраной Belkin and Koteliansky, 1987 зиксин белок фокальных контактов, обнаружен в ядре Li and Trueb, 2001 палладии белок фокальных контактов Parast and Otey, 2000 титин структурный компонент саркомеров Young et al., 1998 белки клеточной адгезии

Р1-,Рз- субъединицы интегринов участие в адгезии Otey et al., 1990, Cattelino et al., 1999

Рг-субъединица интегрина участие в адгезии Pavalko and LaRoche, 1993

ICAM-1 участие в адгезии Carpen et al., 1992

ICAM-2 участие в адгезии Heiska et al., 1996

L-селектин участие в адгезии Pavalko et al., 1995 синдекан 4 трансмембранный гликопротеин, взаимодействует с интегринами Greene et al., 2003 сигнальные белки

FAK этой киназой актинин фосфорилируется по тирозину Izaguirre et al., 2001

Р13-киназа 85 кДа субъеденица соосаждается с а-актинином Shibasaki et al., 1994

PKN серин/треониновая протеинкиназа Mukai et al., 1997

МЕКК1 Серин/треонин протеинкиназа, активатор MAP киназ и транскрипционного фактора NF-kB Christerson et al., 1999

NF-kB фактор транскрипции, солокализуется и совместно перераспределяется в ядро с а-актинином Бабаков и др., 2004

ERK Leinweber et al., 1999

CRP1 цистеин-богатый белок, имеющий LIM домен Pomies et al., 1997

GRK а-акгинин является потенциальным ингибитором всех членов семейства GRK Freeman et al., 2000

Рабфилин ЗА мишень Rab3A малого GTP-связывающего белка Kato et al., 1996

АКТ1 серин/треониновая протеинкиназа, связывается с а-актинином-4 — критический регулятор локализации и функционирования киназы Ding et al., 2006 прочие белки

ADAM 12 металлопротеаза Cao et al., 2001

CLP-36 PDZ-LIM белок Vallenius et al., 2000 а-катенин Knudsen et al., 1995

Р-катенин связывается с а-актинином-4, сайт связывания перекрывается с Е-кадгенином Hayashida et al., 2005

ZASP/Cypher Faulkner et.al., 1999

MAGI-1 белок в подоцитах Patrie et al., 2002

E3KARP PDZ-белок Kim et al., 2002

Tir белок E.Coli, участвует в инвазии патогена Goosney et al., 2000 денсин комплекс в синапсах Walikonis et al., 2001

ВР180 Gonzalez et al., 2001

ADIP Asada et al., 2003

А2А Rc комплекс в синапсах Burgueno et al., 2003

БТШ20 Tessier et al., 2003

BERP белок, экспрессирующийся в мозге, и способный связываться с миозином V El-Husseini et al., 2000

СаМКП комплекс в синапсах Walikonis et al., 2001 iNOS регуляция активности N0 синтазы при гипоксии в макрофагах Daniliuc et al., 2003

Gplb-IX гликопротеин кровяных пластинок Feng et al., 2002 hrs белок, ассоциированный с эндосомами Yan et al., 2005

ZO-1 PDZ-содержащий белок, ходит в ядро Chen et al., 2006 p/y актин Hara et al., 2006 кальмодулин Hara et al., 2006 клатрин, динамин, адаптин-8, P-NAP, р47А Hara et al., 2006 миозин Hara et al., 2006 lmRNP Al Hara et al., 2006

G3BP Hara et al., 2006 андрогеновый рецептор Jasavala et al., 2006

Поскольку из литературы известно, что МЕКК1, являясь одним из активаторов транскрипционного фактора NF-kappaB, взаимодействует с альфа-актинином (Christerson et al., 1999), то возникло предположение, что NF-kappaB также может являться участником альфа-актинин —содержащих комплексов, связывая воедино процессы цитоскелетных перестроек и изменения экспрессии генов.

4.5. Транскрипционный фактор NF-кВ

Транскрипционный фактор NF-кВ индуцирует экспрессию ряда генов в клеточных линиях в ответ на большое число внешних и внутренних стимулов. Впервые NF-кВ был описан в 1986 году как ядерный фактор В-лимфоцитов, связывающийся с участком энхансера каппа-цепей иммуноглобулина. В дальнейшем участки связывания NF-кВ были обнаружены в промоторах многих генов. Выяснилось, что круг стимуляторов NF-кВ необычайно широк и включает форболовые эфиры, ростовые факторы, цитокины, активированные формы клеточных и вирусных онкогенов, УФ-облучение, бактериальные продукты и вирусные инфекции (Baldwin, 1996).

В настоящее время охарактеризованы члены семейства NF-KB/Rel и 1кВ. Для членов семейства NF-KB/Rel характерно наличие Rel- гомологичного домена (RHD, примерно 300 аминокислот) на N-конце, который участвует в ДНК связывании, димеризации и взаимодействии с 1кВ. Семейство 1кВ объединяет наличие множественных копий анкиринового повтора (около 30 аминокислот) на С-конце, которые взаимодействуют с Rel участком NF-кВ (Baldwin, 1996).

Активный ДНК-связывающий NF-кВ - это димер. Наиболее изучен классический NF-кВ - гетеродимер р50 и р65, хотя описано много других гомо- и гетеродимеров. Разные димеры имеют свои особенности, включая сайты узнавания ДНК, специфичость клеточного типа, субклеточную локализацию, взаимодействие с разными формами 1кВ, различные пути активации. Все это увеличивает возможности NF-кВ в регуляции экспрессии разных генов.

Ингибиторный белок 1кВ удерживает NF-кВ в цитоплазме в неактивной форме, маскируя при этом NLS (nuclear localization signal) - последовательность ядерной локализации (Baeuerle and Baltimore, 1988, Liou and Baltimor, 1993). При активации происходит фосфорилирование и убиквитинизация IkB с последующей деградацией на протеосомах, а освобожденный NF-кВ выходит из комплекса с ингибиторной субъединицей и перемещается в ядро, где активирует соответствующие гены (Palombella et al., 1994). Такой механизм регуляции позволяет получить чрезвычайно быстрый ответ клетки на действие стимула. В экспериментах с использованием GFP и YFP конструкций было показано, что при действии на клетки линии HeLa ингибитором ядерного экспорта лептомицином В даже в неетимулированных клетках как NF-кВ, так и 1кВа накапливаются в ядре, что может говорить о возможности постоянного «челночного» перемещения этих молекул между ядром и цитоплазмой. Авторы предлагают модель, в которой комплекс NF-kB-IkB диссоциирует в цитоплазме, затем субъеденицы по-отдельности импортируются в ядро и там реассоциируют, причём диссоциация является лимитирующей стадией во всём процессе (Birbach et al., 2002).

4.5.1. Регуляция активности транскрипционного комплекса NF-kB

Круг стимуляторов NF-кВ необычайно широк и включает форболовые эфиры, ростовые факторы, цитокины, активированные формы клеточных и вирусных онкогенов, УФ-облучение, бактериальные продукты и вирусные инфекции (Tarn et al., 2001). Подробный обзор данных об индукторах NF-кВ и генах, активируемых этим транскрипционным фактором, представлен на интернет-сайте лаборатории Т. Гилмора (www.nf-kb.org). Такое разнообразие индукторов, способных активировать NF-кВ, в принципе говорит о способности совершенно различных путей передачи сигнала в клетке конвергировать на единой мишени - цитозольном комплексе NF-kB/IkB. Исследование молекулярных механизмов этого явления поможет ответить на ряд фундаментальных вопросов, касающихся "перекреста" между многочисленными путями внутриклеточной передачи сигналов.

Механизм активации NF-кВ можно в общем виде представить следующим образом: (1) стимуляция клеток индукторами NF-кВ приводит к фосфорилированию ингибиторного белка семейства 1кВ (для 1кВ-а - по остаткам серина 32 и 36), (2) фосфорилированный 1кВ подвергается убиквитинизации (1кВ-а - по остаткам лизина 21 и 22), и (3) эти события вызывают быструю деградацию ингибитора протеосомой 26S и активируют NF-кВ (Ни, 2003). Потенциальные активаторы NF-кВ способны индуцировать почти полную деградацию молекул 1кВ (особенно 1кВ-а) в течение нескольких минут.

Ферменты, убиквитинизирующие фосфорилированный по N-терминальному концу 1кВ-а,. конститутивно активны и, следовательно, специфическая регуляция деградации ингибиторного белка и активации NF-кВ происходит на уровне фосфорилирования. Поиски 1кВ-специфичной киназы привели к обнаружению высокомолекулярного 1кВ/1КК киназного комплекса (IKK - 1кВ Kinase). Этот комплекс был выделен из TNF-a-индуцированных клеток и оказался чувствителен к большинству индукторов NF-кВ. Уровень активности IKK определяет кинетику прогеолитической деградации 1кВ-а, а в его составе обнаружено большое число разных полипептидов. Идентифицировано три субъединицы IKK, непосредственно связанные с его киназной активностью: каталитические полипептиды IKKa и 1КК|3, и регуляторная - IKKy/NEMO. Нативные комплексы IKK, выделенные из клеток млекопитающих, состоят из IKK-a и IKK-P- гомо- или гетеродимеров и неопределенного количества IKK-y (Zandi and Karin, 1999, Karin and Ben-Neriah, 2000).

Активность транскрипционного фактора NF-кВ регулируется составом гомо-или гетеродимеров IKK комплексов, имеющих различающиеся мишени и активирующихся через разные сигнальные каскады. Возможно, в качестве мишеней разные димеры используют различные ингибиторные молекулы семейства 1кВ. Члены семейства 1кВ обладают разным сродством к разным Rel/NF-кВ димерам, и таким образом, опосредованно участвуют в регуляции транскрипции генов - мишеней через комплексы Rel/NF-кВ. Наконец, сам ядерный фактор Rel/NF-кВ может быть представлен разными участниками димерных транскрипционных комплексов, имеющих различное сродство к элементам различных групп генов. Таким образом, активность всех белков, которые участвуют в сигнальном пути NF-кВ, сложна, многокаскадна и зависит от специфичности и интенсивности работы большого числа регуляторов.

4.5.2. Сигнальные каскады, вовлеченные в активацию NF-kB

В активации NF-кВ могут участвовать почти все известные сигнальные пути, причем их специфичность зависит от типа клеток и стимула. Наиболее изучен специфический сигнальный каскад, индуцированный в клетках при воздействии TNF-a. Важным компонентом этого каскада является NF-кВ-индуцирующая киназа МАРЗК - NIK. Эта киназа способна прямо взаимодействовать с адапторным белком TRAF2 (TNF receptor associated factor), связанным с рецептором TNF-a и через активацию IKK участвовать в регуляции NF-кВ. С помощью двугибридного анализа NIK-киназа была обнаружена в комплексе с субъединицей IKK-p (Regnier et al., 1997). Было показано, что эта киназа способна фосфорилировать IKK-P по остатку серина в положении 176 (каталитический домен) и активировать комплекс IKK (Nakano et al., 1998).

Другой киназой, выявленной в ассоциации с комплексом IKK, является МЕКК1 (Yin et al., 1998). Обе субъединицы IKK киназы содержат в каталитических доменах последовательность Ser-X-X-X-Ser (X - любой аминокислотный остаток), которая является канонической для активации киназой МЕКК1. Сверхэкспрессия NIK или МЕКК1 усиливает способность IKK-комплекса фосфорилировать молекулы 1кВ и активировать NF-кВ (Ling et al., 1998).

Недавно была обнаружена ещё одна IKK-ассоциированная киназа. Было показано, что в клетках линии 293, HeLa и карциноме ME-180 в активации NF-kB фактором TNF-a также может участвовать Р13-киназа (PI3K), действующая через Akt-киназу, которая способна напрямую фосфорилировать IKK-a(Ozes et al., 1999). В этих клетках оба каскада, TRAF2-NIK и PI3K-Akt, кооперируются в процессе фосфорилирования IKK субъединиц. С другой стороны, в фибробластах кожи человека PI3K-Akt путь не влияет на TNF-a-индуцированную активацию NF-kB. Показано, что ростовые факторы сыворотки, в частности фактор роста тромбоцитов, активируя пролиферацию одновременно супрессируют апопгоз. Стимуляция пролиферации фибробластов фактором PDGF индуцирует экспрессию протоонкогена с-шус и может одновременно приводить к активации двух процессов - пролиферации и апоптоза. Однако, апоптоз блокируется активацией антиапоптотического каскада Ras-PI3K-Akt-IKK-NF-KB (Romashkova and Makarov, 1999). Таким образом, пролиферативный сигнал от фактора роста тромбоцитов, включающий проапоптотический ген с-шус, и антиапоптотический сигнал, расходятся, по-видимому, в точке NF-kB. Эти данные в определенной мерс помогают понять, почему трансформация клеток так зависит от активации NF-kB -фактора, который одновременно может работать и как пролиферативный посредник, и как антиапоптотический (Kucharczak et al., 2003).

Стрессорные воздействия на клетку (ультрафиолетовое облучение, оксидативный стресс) активируют JNK и р38-киназные пути, которые также являются активаторами NF-kB. Универсальными регуляторами активности транскрипционных факторов семейства Rel служат активные формы кислорода. В большинстве клеточных линий активность NF-кВ, индуцированная различными стимулами, блокируются с помощью различных антиоксидантов (Meyer et al., 1993).

4.5.3. Участие в адгезии и связь с цитоскелетом

Существует ряд работ, указывающих на то, что NF-kB, с одной стороны, активируется белками внеклеточного матрикса и малыми ГТФазами, принимающими участие в регуляции структуры актинового цитоскелета (Qwarnstrom et al., 1994; Perona et al., 1997; Xu et al., 1998), а с другой, стимулирует адгезию и миграцию клеток (Yebra et al., 1995; Benoliel et al., 1997). Было показано, что процессы адгезии регулируют активность NF-kB, и что изменения его активности коррелируют с перестройками актинового цитоскелета (Zhu et al., 1998). Эти данные дают основание предполагать возможность непосредственного участия NF-kB в процессах адгезии и формирования структуры актинового цитоскелета.

Относительно взаимодействия NF-kB со структурами цитоскелета имеются только немногочисленные косвенные данные. Так, например, было показано, что разрушение системы микротрубочек различными агентами (нокодазолом, колхицином и др.) приводит к активации NF-kB, а таксол (агент, стабилизирующий микротрубочки) блокирует индукцию NF-kB в тех же условиях. В то же время разрушение актинового цитоскелета цитохалазином D не вызывает сходного результата. Авторы делают вывод о специфическом участии системы микротрубочек в регуляции активности транскрипционного фактора (Rosette and Karin, 1995). С другой стороны, в нашей лаборатории было показано, что транскрипционный фактор NF-kB солокализуется с актиновыми структурами: стресс-фибриллами и фокальными контактами. Кроме того, NF-kB взаимодействует с фибриллярным актином in vitro (Are et al., 2000).

Ранее в нашей лаборатории было показано, что а-актинина-4 и р65 субъединица NF-kappaB солокализуются в цитоплазме клеток А431 и совместно мигрируют в ядро под действием ЭФР (Бабаков и др., 2003). Предобработка клеток А431 цитохалазином перед действием ЭФР, усиливает накопление р65 в ядерных экстрактах этих клеток, что позволяет говорить о роли актинового цитоскелета как скаффолда для сигнальиых молекул, входящих в состав комплекса NF-kB.

Транспорт в ядро а-актинина-4 под действием цитохалазина был отмечен не для всех типов клеток. Механизм транспорта а-актинина-4 в ядро под действием этих агентов совершенно не изучен. Можно предполагать, что снижение сродства к актиновым филаментам за счёт разрушения актинового цитоскелета цитохалазином или изменения уровня фосфатидилинозитолфосфатов в результате действия вортманнина приводит к перераспределению а-актинина-4 в цитоплазму и затем в ядро. С другой стороны, не исключен ограниченный протеолиз а-актинина и транспорт его фрагментов.

Ряд авторов на основании того, что действие цитохалазина не препятствует транспорту NF-кВ в ядро, делают вывод о неучастии актинового цитоскелета в этом процессе (Garcia-Garcia et al., 2001, Chen et al., 2003). По нашему мнению, действие цитохалазина на актиновый цитоскелет неоднозначно. Разборка актиновых филаментов цитохалазином одновременно освобождает большое количество актин-связывающих белков и сигнальных комплексов. В таком случае наши данные о совместном перераспределении а-актинина-4 и р65 в ядро под действием цитохалазина могут говорить в пользу существования сигнального комплекса, содержащего эти белки, который перемещается в ядро при откреплении от актинового цитоскелета. С другой стороны, имеются данные о важной роли внутриклеточного Са2+ для транспорта NF-кВ в ядро. Введение внутриклеточных хелаторов Са2+ полностью блокирует транспорт NF-кВ в ядро (Chen et al., 2003). Но хорошо известно, что взаимодействие клеточных изоформ а-актинина с актином как раз регулируется Са2+ , что тоже говорит в пользу а-актинина как белка, опосредующего взаимодействие NF-кВ и акггина.

Таким образом, несмотря на большое число работ, появившихся в последнее время, и посвященных транскрипционному фактору NF-kappaB, ответственные за его регуляцию специфические компоненты сигнальных каскадов в большей степени неизвестны. Также мало известно о его цитоплазматической локализации, путях транспорта в ядро и взаимодействии с цитоскелетом. Так как NF-kB участвует в регуляции жизненно важных клеточных процессов, изучение регуляции его активности может быть важно для понимания процессов клеточной пролиферации, трансформации, дифференцировки и апоптоза.

Совокупность имеющихся в литературе фактов приводит к предположению о том что существующие в цитоплазме независимые от цитоскелета актин-связывающие белки могут принимать участие в процессах реорганизации цитоскелета под влиянием внешних лигандов и являться предшественниками возникающих новых структур, а также являться посредниками в процессах передачи внутриклеточныъх сигналов. Для того чтобы приблизится к пониманию функций подобных независимых белковых комплексов необходимо установить их состав и поведение во время перестройки актиновых стуктур и при проведении сигналов в клетках под влиянием внешних агентов.

5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

5.1. Культивирование клеток

В работе использованы нормальные эмбриональные фибробласты крысы REF, иммортализованные ранним районом Е1А аденовируса 5-го типа человека и трансформированные Е1А в комплементации с онкогеном cHa-ras (Поспелова и др., 1990), а также клетки линий А431 и HeLa, полученные из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН). Клетки культивировали в среде Дальбекко (DMEM, Биолот) с добавлением 10% сыворотки крови эмбрионов коров (Биолот) при 37°С в атмосфере 5% СО2.

5.2. Конфокальная иммунофлуоресцентная микроскопия

Выявление распределения актина, тропомиозина и р65 субъединицы NF-kB в препаратах распластанных клеток проводили методом непрямой иммунофлуоресценции. Клетки снимали с поверхности культуральных сосудов смесью растворов 0.25% трипсина и 0.02% версена в соотношении 3:7, после чего 1.6х104 клеток наносили в 100 мкл суспензии на покровные стёкла и культивировали в течение ночи при 37°С в атмосфере 5 % СОг- Затем клетки фиксировали 3%-ным формалином на PBS в течение 10 мин при комнатной температуре, пермеабилизовали 0.1%-ным раствором Тритона Х-100 на PBS 15 мин при комнатной температуре и наносили первые моноклональные антитела мыши против тропомиозина, р65-субъединицы транскрипционного фактора NF-kB (Sigma, США) или альфа-актинина-4 (ImmunoGlobe, Германия), а затем окрашивали вторыми кроличьими антителами против иммуноглобулинов мыши, коньюгированными с F1TC или TRITC (Sigma, США), в течение 40 мин при комнатной температуре. Структуры актинового цитоскелета выявляли окраской родамин-фаллоидином или FlTC-фаллоидином в течение 10 мин при 37°С. В качестве заключающей среды использовали Mounting medium (Pharmacia Biotech., Швеция). Препараты анализировали с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SL. Для возбуждения флуоресценции использовали аргоновый лазер с длиной волны 488 нм и HeNe-лазер с длиной волны 543 нм. Применяли раздельное сканирование для каждого сигнала. Совмещение двух сигналов проводили с помощью компьютерной программы Leica Confocal Software.

5.3. Экстракция цитоплазматических белковых комплексов

Экстракцию белковых комплексов проводили с помощью разработанной методики быстрого локального лизирования мембраны клеток SF-буфером, позволяющей выделять белки без разрушения цитоскелета. Детали разработанного метода приведены в разделе «Результаты».

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Бобков, Данила Евгеньевич

8. ВЫВОДЫ

3. При действии на фибробласты и клетки эпидермоидной карциномы А431 биологически активных молекул — трихостатина, эпидермального фактора роста и фактора некроза опухоли - а, вызывающих реорганизацию актинового цитоскелета, происходит изменение количества и состава белковых комплексов содержащих троиомиозин и а-актинин-4.

9. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

Бабаков В.Н., Бобков Д.Е., Петухова О.А., Туроверова JI.B., Кропачева И.В., Подольская Е.П., Пинаев Т.П.

Бобков Д.Е., Кропачёва И.В., Пинаев Г.П:

Мультимолекулярные комплексы, содержащие р65 субъединицу фактора NF-кВ и белки цитосклета в клетках А431 // Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2-4 июня 2009 г., Сборник статей, том 2, С. 417-422.

Бобков Д.Е., Кропачёва И.В., Пинаев Г.П.

Мультимолекулярные комплексы, содержащие р65 субъединицу фактора NF-кВ и белки цитосклета в клетках А431 // Биологические мембраны. - 2010.- Т.27.- №1.-С.1-5.

Тезисы:

Бабаков В.Н., Бобков Д.Е., Кропачёва И.В., Петухова О.А., Туроверова JI.B., Пинаев Г.П. Альфа-актинин и р65 субъединица транскрипционного фактора NF-kappaB солокализуются и совместно перераспределяются в клетках линии А431 // Цитология.- 2003.- Т.45.- №9.- с.847.

Babakov V., Smirnova I., Bobkov D., Petukhova O., Turoverova L., Kropacheva I., Podolskaya E., Pinaev G.

NF-кВ Transcription Factor Interacts With a-Actinin Isoforms // FEBS special meeting on cytoskeletal dynamics, Helsinki, June 12-16, 2004, p.38.

Бабаков B.H. Подольская Е.П., Бобков Д.Е., Петухова О.А., Туроверова JI.B., Кропачёва И.В., Пинаев Г.П.

Альфа-актинин взаимодействует с р65-субъединицей транскрипционного фактора NF-kappaB // III Съезд биофизиков России, Воронеж, 24-29 июня 2004 г., Тезисы докладов, Т.1, С.6-7.

Бобков Д.Е., Айзенштадт А.А., Пинаев Г.П.

Определение белкового состава мультимолекулярных сигнальных комплексов, включающих сигнальные молекулы и элементы цитоскелета // 11-я Пущинская международная школа-конференция молодых учёных «Биология - наука XXI века», Пущино, 29 октября - 2 ноября 2007 г., Сборник тезисов, с.71.

Бобков Д.Е., Кропачёва И.В., Пинаев Г.П.

Новый метод быстрого выделения из цитозоля мультимолекулярных белковых комплексов, включающих цитоскелетные и сигнальные молекулы // IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», Казань, 23-27 июня 2009 г., Тезисы докладов, с.287.

Бобков Д.Е., Айзенштадт А.А., Кропачёва И.В., Пинаев Г.П. Белки теплового шока 70 и 90 входят в состав комплексов, содержащих р65-субъединицу фактора NF-kB и белки цитоскелета в клетках А431 // Цитология.-2010,- Т.52,- №3.- с.255.

Бобков Д.Е., Айзенштадт А.А., Кропачёва И.В., Пинаев Г.П.

Выделение и анализ белкового состава тропомиозиновых частиц, содержащихся в цитозоле эмбриональных фибробластов крысы // Цитология.- 2010.- Т.52.- №3,

С.255-256.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бобков, Данила Евгеньевич, Санкт-Петербург

1. Арнаутов A.M., Никольский Н.Н. Транспорт в ядро изоформ р42 и р44 MAP киназы, вызванный фактором роста, требует наличия интактного цитоскелета // Цитология.- 1998.- Т.40,- С.639-647.

2. Большакова А.В., Петухова О.А., Пинаев Т.П., Магнуссон К.-Е. Сравнительный анализ способов субклеточного фракционирования для выявления альфа-актинииа 1 и альфа-актинина 4 в клетках А431 // Цитология.- 2009.- Т. 51.- № 2.- С.122-129.

3. Воротников А.В., Щербакова О.В., Кудряшова Т.В., Тарасова О.С., Ширинский В.П., Пфитцер Г., Ткачук В.А. 2009. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 95(10) : 1058-73.

4. Галкин В.Э., Туроверова Л.В., Константинова И.М., Пинаев Г.П. 26S-рибонуклеопротеиновый комплекс (268-протеасома) непосредственно взаимодействует с фибриллярным актином // Цитология.- 1998.- Т.40.- С.618-626.

5. Гусев Н.Б. Движение немышечных клеток и реорганизация актиновых микрофиламентов // Соросовский образовательный журналю- 2001.- №7.- С. 9-16.

6. Минин А.А., Кулик А.В. Внутриклеточный транспорт. Принципы регуляции // Успехи биологической химии. 2004.- Т.44. - С.225-262.

7. Петухова О. А., Туроверова Л. В., Кропачёва И. В., Пинаев Г. П. Анализ морфологических особенностей популяции клеток эпидермоидной карциномы А431, распластанных на иммобилизованных лигандах// Цитология.- 2004.- Т.46(1).-с.5-15.

8. Поспелова Т.В., Кислякова Т.В., Медведев А.В., Светликова С.Б., Поспелов В.А. 1990. Цитология. 32 (1) : 148-155.

9. Allen W.E., Jones G.E., Pollard J.W., Ridley A.J. Rho, Rac and Cdc42 regulate actin organization and cell adhesion in macrophages // J. Cell Sci.- 1997.- Vol.110 ( Pt 6).-P.707-720.

10. Andra K., Nikolic В., Stocher M., Drenckhahn D., Wiche G. Not just scaffolding: plectin regulates actin dynamics in cultured cells // Genes Dev.- 1998.- No. 12.- P.3442-3451.

11. Araki N., Hatae Т., Yamada Т., Hirohashi S. Actinin-4 is preferentially involved in circular ruffling and macropinocytosis in mouse macrophages: analysis by fluorescence ratio imaging //

12. Journal of Cell Science.-2000.- V.l 13.- P.3329-3340.

13. Are A.F., Galkin V.E., Pospelova T.V., Pinaev G.P. The p65/RelA subunit of NF-кВ interacts with actin-containing structures // Exp. Cell Res.- 2000.- Vol.256.- P.533-544.

14. Are A., Pinaev G., Burova E., Lindberg U. Attachment of A431 cells on immobilized antibodies to the EGF receptor promotes cell spreading and reorganization of the microfilament system // Cell Motility and Cytoskelet.- 2001.- Vol.48.- P.24-36.

15. Arimura C., Suzuki Т., Ynagisawa M., Hanada Y., Masaki T. Primary structure of chicken skeletal muscle and fibroblast a-actinin deduced from cDNA secuences // Eur. J. Biochem.- 1988.- Vol.177.- P.649-655.

16. Asada M., Irie K., Morimoto K., Yamada A., Ikeda W., Takeuchi M., Takai Y.

17. ADIP, a novel Afadin- and alpha-actinin-binding protein localized at cell-cell adherens junctions //J. Biol. Chem.- 2003.- Vol.278(6).- P.4103-4111.

18. Baldwin A.S. The NF-кВ and IkB proteins: new discoveries and insights // Annu. Rev. Immunol.- 1996.- Vol.14.- P. 649-683.

19. Balzar M., Bakker H.A., Briaire-de-Bruijn I.H., Fleuren G.J., Warnaar S.O., Litvinov S.V. Cytoplasmic tail regulates the intercellular adhesion function of the epithelial cell adhesion molecule//Mol .Cell. Biol.- 1998.- Vol.18.- P.4833-4843.

20. Baeuerle P.A., Baltimore D. IkB: a specific inhibitor of the NF-кВ transcription factor // Science.- 1988,- Vol.242.- P.540-546.

21. Bahler M. Are class III and class IX myosins motorized signalling molecules?2000. Biochim. Biophys. Acta. 1496(1) : 52-9.

22. Baschong W., Baschong-Prescianotto C., Kellenberger E. Reversible fixation for the study of morphology and macromolecular composition of fragile biological structures // Eur J Cell Biol.- 1983.- V.32(l).- P.l-6.

23. Benoliel A.-M., Kahn-Perles В., Imbert J., Verrando P. Insulin stimulates haptotactic migration of human epidermal keratinocytes through activation of NF-kappa В transcription factor // J. Cell Sci.- 1997.- Vol.110.- P.2089-2097.

24. Ben-Ze'ev A. Cytoskeletal and adhesion proteins as tumor suppressors // Curr Opin Cell Biol.- 1997.- V.9.- P.99-108.

25. Bershadsky A., Chausovsky A., Becker E., Lyubimova A., Geiger B. Involvement of microtubules in the control of adhesion-depended signal transduction // Current Biology.-1996.- Vol.6.- N. 10.- P1279-1289.

26. Bharadwaj S., Prasad G.L. Tropomyosin-1, a novel suppressor of cellular transformation is downregulated by promoter methylation in cancer cells. 2002. Cancer Lett. 183 : 205-13.

27. Bharadwaj S., Thanawala R., Bon G., Falcioni R., Prasad G.L. Resensitization of breast cancer cells to anoikis by tropomyosin-1: role of Rho kinase-dependent cytoskeleton and adhesion. 2005. Oncogene. 24 : 8291-303.

28. Birbach A., Gold P., Binder B.R., Hofer E., de Martin R., Schmid J.A. Signaling molecules of the NF-кВ pathway shuttle constitutively between cytoplasm and nucleus // The Journal of Biological Chemistry.- 2002.- Vol.277.- N.13.- P. 10842-10851.

29. Bishop L., Hall A. Rho GTFases and their effectjr proteins // Biochem. J.- 2000.-Vol.348- P.241-255.

30. Blikstad I., Carlsson L. On the dynamics of the microfilament system in HeLa cells. 1982. J. Cell Biol. 93(1) : 122-128.van den Boom F., Dussmann H., Uhlenbrock K., Abouhamed M., Bahler M. The

31. Myosin IXb motor activity targets the myosin IXb RhoGAP domain as cargo to sites of actin polymerization. 2007. Mol. Biol. Cell. 18(4) : 1507-18.

32. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of mocrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Annal Biochem. -1976.- Vol.72.- P. 248-254.

33. Bretscher M.S., Aguado-Velasco C. EGF induces recycling membrane to form ruffles // Curr Biol.- 1998.- Vol.8(12).-P.721-724.

34. Bretcher A., Vandekerckhove J., Weber K. a-actinin from chicken skeletal muscle and smooth muscle show considerable chemical and immunological differences // Eur. J. Biochem.- 1979.- Vol.100.- P.237-243.

35. Broderick M.J.F. and Winder S.J. Towards a complete atomic structure of spectrin family proteins // Journal of Structural Biology.-2002.- Vol.137.- P.184-193.

36. Brown J.H., Cohen C. Regulation of muscle contraction by tropomyosin and troponin: how structure illuminates function. 2005. Adv. In Prot. Chem. 71 : 121-159.

37. Burack R.W. and Shaw A.S. Signal transduction: hanging on scaffold // Curr. Op. Cell Biol.- 2000.- Vol.12.- P.211-216.

38. Burridge K., Chrzanowska-Wodnicka M. Focal adhesions, contractility, and signaling // Annu. Rev. Cell Dev. Biol.- 1996.- Vol.12.- P.463-518.

39. Caamano J. and Hunter C.A. NF-кВ family of transcription factors: central regulators of innate and adaptive immune functions // Clinical Microbiology Reviews.- 2002.-Vol.15.- N.3.- P.414-429.

40. Cao Y., Kang Q., Zolkiewska A. Metalloprotease-disintegrin ADAM 12 interacts with alpha-actinin-1 //Biochem. J.- 2001.- Vol.357.- P.353-361.

41. Carpen O., Pallai P., Staunton D.E., Springer T.A. Association of intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) with actin containing cytoskeleton and a-actinin // J. Cell Biol.- 1992.- Vol.118.- P.1223-1234.

42. Cattelino A., Albertinazzi C., Bossi M., Critchley D.R., de Curtis I. A cell-free system to study regulation of focal adhesions and the connected actin cytoskeleton // Mol. Biol. Cell.- 1999.- Vol.10.-P.373-391.

43. Celli L., Ryckewaert J.-J., Delachanal E. and Duperray A. Evidence of a functional role for interaction between ICAM-land nonmuscle a-actinins in leukocyte diapedesis // The Journal of Immunology.- 2006.- V.177.- P.4113-4121.

44. Chakraborty S., Reineke E.L., Lam M., Li X., Liu Y., Gao C., Khurana S., Kao H.

45. Actinin 4 potentiates MEF2 transcription activity by antagonizing histone deacetylase 7 // JBC Papers in Press.- 2006,- Manuscript M602474200

46. Chen N.X., Geist D.J., Genetos D.C., Pavalko F.M., Duncan R.L. Fluid shear-induced NFkappaB translocation in osteoblasts is mediated by intracellular calcium release // Bone.-2003.- Vol.33.- P.399-410.

47. Chen V.C., Li X., Perreault H., Nagy J.I. Interaction of zonula occludens-1 (ZO-1) with a-actinin-4: application of functional proteomics for identification of PDZ domain-associated proteins // Journal of Proteome Research.- 2006.- V.5.- P.2123- 2134.

48. Chinkers M., McKanna J.A., Cohen S. Rapid induction of morphological changes in human carcinoma cells A-431 by epidermal growth factor // J. Cell Biol.- 1979.- Vol.83.-P.260-265.

49. Cho Y.J., Liu J., Hitchcock-DeGregori S.E. The amino terminus of muscle tropomyosin is a major determinant for function. 1990. J. Biol. Chem. 265 (1) : 538-45.

50. Christerson L.B., Vanderbilt C.A., Cobb M.H. MEKK1 interacts with alpha-actinin and localizes to stress fibers and focal adhesions // Cell Motil. Cytoskeleton.- 1999.-Vol.43.- P.186-198.

51. Chung Т.К., Funk M.A., Baker D.H. L-2-Oxothiazolidine-4-carboxylate as a cysteine precursor: efficacy for growth and hepatic glutathione synthesis in chicks and rats. // J. Nutr.-1990.- Vol.120.- P.158-160.

52. O'Connell C.B., Mooseker M.S. Native Myosin-IXb is a plus-, not a minus-end-directed motor. 2003. Nat. Cell. Biol. 5(2) : 171-2.

53. Crepieux P., Kwon H., Leclerc N., Spencer W., Richard S., Lin R., Hiscott J. IkappaB alpha physically interacts with a cytoskeleton-associated protein through its signal response domain. 1997. Mol. Cell. Biol. 17(12) : 7375-85.

54. Critchley D. R., G. Flood. Guidebook to the cytoskeletal and motor proteins. 2nd ed., ed. by Thomas Kreis and Ronald Vale. Oxford.: Oxford University Press.- 1999.- P.24-27.

55. Dandapani S.V., Sugimoto H., Matthews B.D., Kolb R.G., Sinha S., Gerszten R.E., Zhou J., Ingber D.E., Kalluri R., Pollak M.R. a-Actinin-4 is required for normal podocyte adhesion // JBC Papers in Press.- 2006,- Manuscript M605024200

56. Daniliuc S., Bitterman H., Rahat M.A., Kinarty A., Rosenzweig D., Nitza L. Hypoxia inactivates inducible nitric oxide synthase in mouse macrophages by disrupting its interaction with alpha-actinin-4 // J. Immunol.- 2003.- Vol.171.- P.3225-3232.

57. Djinovic-Carugo K., Gautel M., Ylanne J., Young P. The spectrin repeat: a structural platform for cytoskeletal protein assemblies // FEBS Letters.- 2002.- Vol.513.- P. 119123.

58. Djinovic-Carugo К., Young P., Gautel M., Saraste M. Structure of a-actinin rod: molecular basis for cross-linking of actin filaments // Cell.- 1999.- Vol.98.- P.537-546.

59. Ding Z., Liang J., Lu Y., Yu Q., Songyang Z., Lin S.-Y. and Mills G.B. A retrovirus-based protein complementation assayscreen reveals functional АКТ 1-binding partners // PNAS.- 2006,- vol. 103 no. 41.- P. 15014-15019

60. Dixson J.D., Forstner M.R., Garcia D.M. The a-actinin gene family: a revised classification // J.Mol.Evol.- 2003.- Vol.56.- P.l-10.

61. Edlund M., Lotano M.A., Otey C.A. Dynamics of a -actinin in focal adhesions and stress fibers visualized with a -actinin Green Fluorescent Protein // Cell Motil. Cytosk.-2001.- Vol.48.-P. 190-200.

62. El-Husseini A.E-D., Kwasnicka D. Yamada Т., Hirohashi S., Vincent S.R. BERP, a novel ring finger protein, binds to a-actinin 4 // Biochem. Biophys. Res. Com.- 2000.-Vol.267.- P.906-911.

63. Etienne-Manneville S., Hall A. Rho GTPases in cell biology // Nature.- 2002.-Vol.420(6916).- P.629-635.

64. Fechheimer M., Zigmond S.H. Focusing on unpolymerized actin // J Cell Biol.- 1993,-Vol.l23(l).- P.1-5.

65. Fiaschi Т., Cozzi G., Raugei G., Formigli L., Ramponi G., Chiarugi P. Redox regulation of beta-actin during integrin-mediated cell adhesion // J. Biol. Chem. 2006.-Vol.281(32).~ P.22983-91.

66. Freeman J.L.R., Pitcher J.A., Li X., Bennett V., Lefkowitz R.J. a-actinin is potent regulator of G protein-coupled receptor kinase activity and substrate specificity in vivo // FEBS Lett.- 2000.- Vol.473.- P.280-284.

67. Fukami K., Fuuruhashi K., Inagaki M., Endo., Hatano., Takenava T. Requirement of phosphatidyl 4,5-biphosphate for a-actinin function // Nature.- 1992.- Vol.359.- P. 150152.

68. Garcia-Garcia E., Sanchez-Mejorada G., Rosales C. Phosphatidylinositol 3-kinase and ERK are required for NF-kappaB activation but not for phagocytosis // J. Leukoc.Biol.2001.- Vol.70.- P.649-658.

69. Gautreau A, Louvard D, Arpin M. ERM proteins and NF2 tumor suppressor: the Yin and Yang of cortical actin organization and cell growth signaling // Curr Opin Cell Biol.2002.- V.14.- P. 104-9.

70. Geiger В., Ginsberg D., Solomon D., VoLberg T. The molecular basis for the assembly and modulation of adherens-type junction // Cell Differ. Dev.- 1990.- Vol.32.- P.343-353.

71. Geiger В., Yehuda-Levenberg S., Bershadsky A.D. Molecular interactions in the submembrane plaque of cell-cell and cell-matrix adhesions // Acta Anat. (Basel).- 1995.-Vol.l54.-No.l.- P.46-62.

72. Gerrard J.M, Robinson P. Identification of the molecular species of lysophosphatidic acid produced when platelets are stimulated by thrombin.// Biochim Biophys Acta.-1989.- Vol.1001(3) P.282-285.

73. Goosney D.L., DeVinney R., Pfuetzner R.A., Frey E.A., Strynadka N.C., Finlay B.B.

74. Enteropathogenic E. coli translocated intimin receptor, Tir, interacts directly with alpha-actinin // Curr. Biol.- 2000.- Vol. 10(12).- P.735-738.

75. Gonzalez A.M., Otey C., Edlund M., J.C. Jones. Interactions of a hemidesmosome component and actinin family members // J. Cell. Sci.- 2001.- Vol.114.- P.4197-4206.

76. Greene D.K., Tumova S., Couchman J., Woods A. Syndecan-4 accociates with a-actinin //J. Biol. Chem.- 2003.- Vol.278.- P.7617-7623.

77. Greenwood J.A., Theibert A.B., Prestwich G.D. Murthy-Uirich J.E. Restructuring of focal adhesion plaques by PI 3-kinase: regulation by Ptdlns (3,4,5)-P3 binding to a-actinin//J. Cell. Biol.- 2000.- Vol.150.- P.627-641.

78. Grenklo S., Hiilberg L., Rathje L.-S.Z., Pinaev G., Schutt C.E., Lindberg U.

79. Tropomyosin assembly intermediates in the control of microfilament system turnover. 2008. European Journal of Cell Biology. 87 : 905-920.

80. Guan J.L. Integrin signaling through FAK in the regulation of mammary stem cells and breast cancer // IUBMB Life.- 2010.- Vol.62.- No.4.- P. 268-276.

81. Gunning P., O'Neill G., Hardeman E. Tropomyosin-based regulation of the actin cytoskeleton in time and space. 2008. Physiol. Rev. 88 : 1-35.

82. Gunning P., Weinberger R., Jeffrey P. Actin and tropomyosin isoforms in morphogenesis. 1997. Anat. Embryol. 195 : 311-315.

83. Ha T.-S. High glucose and advanced glycosylated end-products affect the expression of a-actinin-4 in glomerular epithelial cells //NEPHROLOGY.- 2006.- V.ll.- P.435-^41.

84. Haigler H., Ash J.F., Singer S. J., Cohen S. Visualization by fluorescence of the binding and internalization of epidermal growth factor in human carcinoma cells A-431 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1978.-Vol.75.-P.3317-3321.

85. Hall A. 2005. Biochem. Soc. Trans. 5 : 891-5.

86. Hance J. E., Fu S.Y., Watkins S.C., Beggs A.H. and Michalak M. Alpha-actinin-2 is a new component of the dystrophin-glycoprotein complex // Arch. Biochem. Biophys.-1999.- Vol.365.- P.216-222.

87. Нага Т., Honda K., Shitashige M., Ono M., Matsuyama H., Naito K., Hirohashi S., Yamada T. Mass spectrometry analysis of the native protein complex containing actinin-4 in prostate cancer cells // MCP Papers in Press.- 2006,- Manuscript M600129-MCP200.

88. Harper B.D., Beckerle M.C., Pomies P. Fine mapping of the a-actinin binding site within cystein-rich protein // Biochem. J.- 2000.- Vol.350.- P.269-274.

89. Hartwig J.H., Kwiatkowski D.J. Actin-binding proteins // Curr Opin Cell Biol.- 1991.-V.3.- P.87-97.

90. Hayashida Y., Honda K., Idogawa M., Ino Y., Ono M., Tsuchida A., Aoki Т., Hirohashi S. and Yamada T. E-Cadherin regulates the association between beta-catenin and actinin-4 // Cancer Res.- 2005.- V.65(19).- P.8836-8845

91. Heiska L., Kantor C., Parr Т., Critchley D.R., Vilija P., Gahmberg C. G., Carpen O.

92. Binding of cytoplasmic domain of intercellular adhesion molecule-2 to a-actinin // J Biol. Chem.- 1996.- Vol.271.- P.26214-26219.

93. Herrenknecht K., Ozawa M., Eckerskorn C., Lottspeich F., Lenter M., Kemler M.

94. The uvomorulin-anchorage protein a-catenin is a vinculin homologue // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1991.- Vol.88.- P.9156-9160.

95. Hillberg L., Zhao Rathje L.S., Nyakern-Meazza M., Helfand В., Goldman R.D., Schutt C.E., Lindberg U. Tropomyosins are present in lamellipodia of motile cells. 2006. Eur. J. Cell Biol. 85(5): 399-409.

96. Honda K., Yamada Т., Endo R., Ino Y., Gotoh M., Tsuda H., Yamada Y., Chiba H., Hirohashi S. Actinin-4, a novel actin-bundling protein associated with cell motility and cancer invasion // J. Cell Biol.- 1998,- Vol.140.- P. 1383-1393.

97. Jackson V. Formaldehyde cross-linking for studying nucleosomal dynamics // Methods.-1999.- V.17(2).- P.125-39.

98. Janmey P.A. Phosphoinositides and calcium as regulators of cellular actin assembly and disassembly//Annu. Rev. Physiol.- 1994.-Vol.56.-P.169-191.

99. Jockusch B.M., Bubeck P., Giehl K., Kroemker M., Moshner J., Rothkegel M., Rudiger M., Schluter K., Stanke G., and Winkler J. The molecular architecture of focal adhesions //Annu. Rev. Cell Dev. Biol.- 1995.- Vol.11.- P.379-416.

100. Jockusch B.M., Hinssen H. Nonmuscle motility and the actin-based cytoskeleton // Comprehensive Human Physiology.- 1996.- Vol.1.- P.225-243.

101. Johnson P., Smillie L.B. Polymerizability of rabbit skeletal tropomyosin: effects of enzymic and chemical modifications // Biochemistry. 1977. 16(10): 2264-9.

102. Kabsch W., Mannherz H.G., Suck D. Atomic Structure of the Actin: Dnase I Complex //Nature. 1990. Vol. 347.- P. 126.

103. Kaplan J.M., Kim S.H., North K.N., Rennke H., Correia L.A., Tong H.Q. Mutations in ACTN4, encoding a-actinin-4, cause familial focal segmental glomerulosclerosis // Nat Genet.- 2000.- Vol.-24.- P.251-256.

104. Karin M., Ben-Neriah Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-кВ activity // Annual Review of Immunology.- 2000.- Vol.18.- P.621-663.

105. Kato M., Sasaki Т., Ohya Т., Nakanishi H., Nishioka H., Iraamura M., Takai Y.

106. Physical and functional interaction of rabfphilin-3A with a-actinin // J. Biol. Chem.-1996.-Vol.271.- P.31775-31778.

107. Keely P., Parise L., Juliano R. Integrins and GTPases in tumour cell growth, motility and invasion // Trends Cell Biol.- 1998.- V.8.- P. 101-106.

108. Kjoiler L., Hall A. Signaling to Rho GTPases // Exp. Cell Res.- 1999.- Vol.253(l).-P.166-179.

109. Knudsen K.A., Peralta Soler A., Johnson K.R., Wheelock M. Interaction of a-actinin with the cadherin/catenin cell-cell adhesion complex via a-catenin // J. Cell Biol.- 1995.-Vol.130.- P.67-77.

110. Kozma R., Ahmed S., Best A., Lim L. The Ras-related protein Cdc42Hs and bradykinin promote formation of peripheral actin microspikes and filopodia in Swiss 3T3 fibroblasts // Mol. Cell. Biol.- 1995.- Vol. 15(4).- P. 1942-52.

111. Kremerskothen J., 1. Teber, D. Wendholt, T. Liedtke, Т. M. Bockers, A. Barnekow.

112. Brain-specific splicing of a-actinin 1 mRNA // Biochem and Biophys Res. Comm.-2002.- Vol.295.- P.678-681.

113. Machesky L.M., Hall A. Rho: a connection between membrane receptor signalling and the cytoskeleton // Trends Cell Biol.- 1996,- Vol.6(8).- P.304-310.

114. Mane S., Winkelman J.C., Luikart S.D. Bone marrow extracellular matrix induces FIL-60 cells to produce an autonomous differetiation factor // Cell Growth Differ.- 1991.-Vol.2.- P.637-643.

115. Masri M., Wahl D., Oegema Т., Luikart S. HL-60 cells degrade a-actinin to produce a fragment that promotes monocyte/macrophage maturation // Exp. Hematol.- 1999.-Vol.27.- P.345-352.

116. Matsudaira P. Actin crosslinking proteins at the leading edge // Semin. Cell Biol.-1994.- Vol.5.-P.165-174.

117. McGregor A., Blanchard A.D., Rowe A.J., Critchley D.R. Identification of the vinculin-binding site in the cytoskeletal protein a-actinin // Biochem. J.- 1994.-Vol.301.- P.225-233.

118. McKenna N.M., Meigs J.B., Wang Y-L. Exchangeability of alpha-actinin in living cardiac fibroblasts and muscle cells // J. Cell. Biol.- 1985.- Vol.101.- P.2223-2232.

119. McKenna N.M and Wang Y-L. Possible translocation of actin and alpha-actinin along stress fibers //Exp. Cell Res.- 1986.- Vol.167.- P.95-105.

120. Meigs J.B. and Wang Y-L. Reorganization of alpha-actinin and vinculin induced by phorbol ester in living cells // J. Cell Biol.- 1986.- Vol.102.- P.1430-1438.

121. Meyer C.F., Wang X., Chang C., Templeton D., Tan Т.Н. Interaction between c-Rel and the mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1 signaling cascade in mediating kappaB enhancer activation // J. Biol. Chem.- 1996,- Vol.271.- P.8971-8976.

122. Meyer M., Schreck R., Baeuerle P.A. H202 and antioxidants have opposite effects on activation of NF-kappa В and AP-1 in intact cells: AP-1 as secondary antioxidant-responsive factor //EMBO J.- 1993.- Vol.5.- P.2005-2015.

123. Mielnicki L.M., Ying A.M., Head K.L., Asch H.L., Asch B.B. Epigenetic regulation of gelsolin expression in human breast cancer cells. // 1999. Exp. Cell Res. 249 : 161-67.

124. Miillake D.B., Blanchard A.D., Patel В., Critchley D.R. The cDNA sequence of human placental a-actinin // Nucleic Acids Res.- 1989.- Vol.17.- P.6725.

125. Miyado K., Sato M., Taniguchi S. Transformation-related expression of a low-molecular-mass tropomyosin isoform TM5/TM30nm in transformed rat fibroblastic cell lines. // 1997. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 123 :331-336.

126. Miyamoto S., Teramoto H., Coso O.A., Gutkind J.S., Burbelo P.D., Akiyama S.K., Yamada K.M. Inegrin function: molecular hierarchies of cytoskeletal and signaling molecules// J. Cell Biol.- 1995,-V.131.-P.791-805.

127. Moldovan L., Mythreye K., Goldschmidt-Clermont P.J., Satterwhite L.L. Reactive oxygen species in vascular endothelial cell motility. Roles of NAD(P)H oxidase and Racl // Cardiovasc. Res.- 2006.- Vol.71(2).- P.236-246.

128. Moolenaar W.H. Lysophosphatidic acid signalling // Curr. Opin. Cell Biol. 1995.-Vol.7(2).- P.203-210.

129. Mukai H., Toshimori M., Shibata H., Takanaga H., Kitagawa M., Miyahara M., Shimakawa M., Ono Y. Interaction of PKN with a-actinin // J. Biol. Chem.- 1997.-Vol.272.- P.4740-4746.

130. Nafaguchi A., Tekeichi M., Tsukita S. The 102kd cadherin-associated protein: Similarity to vinculin and posttranscriptional regulation of expression // Cell.- 1991,-Vol.65.- P.849-857.

131. Nakano H., Shindo M., Sakon S., Nishinaka S., Mihara M., Yagita H., Okumura K.

132. Differential regulation of IkappaB kinase alpha and beta by two upstream kinases, NF-kappaB-inducing kinase and mitogen-activated protein kinase/ERK kinase kinase-1 // Proc. Natl. Acad. Sci. (USA).- 1998.- Vol.95(7).- P.3537-3542.

133. O'Neill G.M., Stehn J., Gunning P.W. Tropomyosins as interpreters of the signalling environment to regulate the local cytoskeleton // 2008. The Journal of Cell Biology. 18 : 35-44.

134. Niggli V., Djafarzadeh S., Keller H. Stimulus-induced selective association of actin-associated proteins (a-actinin) and protein kinase С isoforms with the cytoskeleton of human neutrophils //Exp. Cell Res.- 1999.- Vol.250.- P.558-568.

135. Nishikawa M., Nishikawa S., Inoue A., Iwane A.H., Yanagida Т., Ikebe M. A unique mechanism for the processive movement of single-headed myosin-IX. // 2006. Biochem. Biophys. Res. Commun. 343(4) : 1159-64.

136. Nobes C.D., Hall A. Rho, rac and cdc42 GTPases: regulators of actin structures, cell adhesion and motility // Biochem. Soc. Trans.- 1995.- Vol.23(3).- P.456-9.

137. Ohtsubo M., Takayanagi A., Gamou S., Shimizu N. Interruption ofNFkappaB-STATl signaling mediates EGF-induced cell-cycle arrest // J. Cell Physiol.- 2000.- Vol. 184,-P.131-137.

138. Olson E.N., Nordheim A. Linking actin dynamics and gene transcription to drive cellular motile functions // Nat. Rev. Mol. Cell Biol.- 2010.- Vol.11.- No.5.- P. 353-365.

139. Orlando V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation // Trends Biochem Sci.- 2000.- V.25(3).- P.99-104.

140. Otey C. A., Carpen O. a-Actinin revisited: a fresh look at an old player // Cell Motil. Cytoskel.- 2004.- Vol.58.- P.104-111.

141. Otey C. A., Pavalko F. M. and Burridge K. An interaction between alpha actinin and the bl integrin subunit in vitro // J. Cell Biol.- 1990.- Vol.111.- P.721-729.

142. Ozes O.N., Mayo L.D., Gustin J.A., Pfeffer S.R., Pfeffer L.M., Donner D.B. NFkappaB activation by tumour necrosis factor requires the Akt serine-threonine kinase // Nature.- 1999.- Vol.401(6748).- P.82-85.

143. Palombella V.J., Rando O.J., Goldberg A.L., Maniatis T. The ubiquitin-proteasome pathway is required for processing the NF-kappa Bl precursor protein and the activation of NF-kappa В // Cell.- 1994.- Vol.78.- P.773-785.

144. Papa I., Astier C., Kwiatek O., Raynaud F., Bonnal C., Lebart M.C., Roustan C. and Benyamin Y. Alpha-actinin-CapZ, an anchoring complex for thin filaments in Z-line // J.Musle Res. Cell. Motil.- 1999.- Vol.20.- P.187-197.

145. Parast M.M. and Otey C.A. Characterization of palladin, a novel protein localized to stress fibers and cell adhesion // J.Cell Biol.- 2000.- Vol.150.- P.643-655.

146. Patrie K.M., Drescher A.J., Welihinda A., Mundel P., Margolis B. Interaction of two actin-binding proteins, synaptopodin and aactinin-4, with the tight junction protein MAGI-1 // J. Biol. Chem.- 2002.- Vol.277.- P.30183-30190.

147. Pavalko F. M. and Burridge K. Disruption of the actin cytoskeleton after microinjection of proteolytic fragments of a-actinin // J. Cell Biol.- 1991.- Vol.114.- P. 481-491.

148. Pavalko F.M. and LaRoche S.M. Activation of human neutrophils induces an interaction between the integrin (32-subunit (CD 18) and the actin-binding protein a-actinin // J.Immun.- 1993.- Vol.151.- P.3795-3807.

149. Pavalko F.M., Walker D.M., Graham L., Goheen M., Doerschuk C.M., Kansas G.S.

150. The cytoplasmic domain of L-selectin interacts with cytoskeletal proteins via alpha-actinin: receptor positioning in microvilli does not require interaction with alpha-actinin // J. Cell Biol.- 1995.- Vol.129.- P.l 155-1164.

151. Pawson T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins // Curr. Opin. Cell Biol.- 2007.- Vol.19.- No.2.- P.l 12-116.

152. Pawson T. and Scott J.D. Signaling through scaffold, anchoring, and adaptor proteins // Science.- 1997.- Vol.278.- P.2075-2080.

153. Pelletier O., Pokidysheva E., Hirst L.S., Bouxsein N., Li Y., Safinya C.R. Structure of actin cross-linked with a-actinin: a network of bundles // Physical Review Letters.-2003.- Vol.91.- P. 148102-(1-4).

154. Perona R., Montaner S., Saniger L., Sanchez-Perez I., Bravo R., Lacal J.C.

155. Activation of the nuclear factor-kappa В by Rho, Cdc42, and Rac-1 proteins // Genes Dev.- 1997,- Vol.11.-P.463-475.

156. Pomies P., Louis H.A., Beckerle M.C. CRP1, a LIM domain protein implicated in muscle differentiation, interacts with a-actinin // J. Cell Biol.- 1997,- Vol.139.- P.l57-168.

157. Post P.L., Bokoch G.M., Mooseker M.S. Human myosin-IXb is a mechanochemically active motor and a GAP for rho. // 1998. J. Cell. Sci. 7 : 941-50.

158. Prasad G.L., Masuelli L., Raj M.H.G., Harindranath N. Suppression of src-induced transformed phenotype by expression of tropomyosin-1. // 1999. Oncogene. 18 : 20272031.

159. Pratt W.B., Toft D.O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery // Exp Biol Med (Maywood).- 2003.- Vol. 228.-No.2.- P.l 11-133.

160. Price L.S., Leng J., Schwartz M.A., Bokoch G.M. Activation of Rac and Cdc42 by integrins mediates cell spreading // Mol. Biol. Cell. 1998.- Vol.9(7).- P. 1863-1871.

161. Puius Y.A., Mahoney N.M., Almo S.C. The modular structure of actin-regulatory proteins // Curr. Opin. Cell Biol.- 1998.- Vol.10.- P.23-34.

162. Qwarnstroin E.E., Ostberg C.O., Turk G.L., Richardson C.A., Bomsztyk K.

163. Fibronectin attachment activates the NF-kappa В p50/p65 heterodimer in fibroblasts and smooth muscle cells // J. Biol. Chem.- 1994.- Vol.269.- P.30765-30768.

164. Regnier C.H., Song H.Y., Gao X., Goeddel D.V., Cao Z., Rothe M. Identification and characterization of an IkappaB kinase // Cell.- 1997.- Vol.90(2).- P.373-83.

165. Ridley A. Rho GTPases and cell migration. // J. Cell Sci. -2001.-114, -P.2713-2722.

166. Ridley A. J., Hall A. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors // Cell.- 1992.- Vol.70(3)-P. 389-399.

167. Ridley A., Paterson H., Johnston C., Diekmann D., Hall A. The small GTP-binding protein rac regulates growth factor-induced membrane ruffling // Cell. 1992.- Vol.7.-P.401-410.

168. Romashkova J.A., Makarov S.S. NF-kappaB is a target of АКТ in anti-apoptotic PDGF signaling //Nature.- 1999.- Vol.401(6748).- P.86-90.

169. Romijn H.J., van Uum J.F., Breedijk I., Emmering J., Radu I., Pool C.W. Double immunolabeling of neuropeptides in the human hypothalamus as analyzed by confocal laser scanning fluorescence microscopy // J. Histochem. Cytochem.- 1999.- Vol.47.-P.229-236.

170. Rosette C., Karin M. Cytoskeletal control of gene expression: depolymerization of microtubules activates NF-кВ // The Journal of Cell Biology.- 1995.- Vol.128.- P.l 1111119.

171. Sakamuro D., Furukawa Т., Takegami T. Hepatitis С virus nonstructural protein NS3 transforms NIH 3T3 cells // J. Virol.- 1995,- Vol.69.- P.3893-3896.

172. Sampath R., Gallagher P.G., Pavalko F. Cytoskeletal interactions with the leukocyte integrin pi cytoplasmic domain // J Biol. Chem.- 1998.- Vol.273.- P.33588-33594.

173. Sastry S.K., Burridge K. Focal adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics // Exp. Cell Res.- 2000.- Vol. 261(1).- P.25-36.

174. Schmidt A., Hall M.N. Signaling to the actin cytoskeleton // Annu. Rev. Cell Dev. Biol.-1998.- Vol.14.-P.305-338.

175. Shah V., Bharadwaj S., Kaibuchi K., Prasad G.L. Cytoskeletal organization in tropomyosin-mediated reversion of ras-transformation: Evidence for Rho kinase pathway. //2001. Oncogene. 20 : 2112-2121.

176. Shibasaki F., Fukami K., Fukui Y., Takenawa T. Phosphatidylinositol 3-kinase binds to a-actinin through the P85 subunit // Biochem. J.- 1994,- Vol.302.- P.551-557.

177. Skoumpla K., Coulton A.T., Lehman W., Geeves M.A., Mulvihill D.P. Acetylation regulates tropomyosin function in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. // 2007. Journal of Cell Science. 120 : 1635-1645.

178. Small J.V., Resch G.P. The comings and goings of actin: coupling protrusion and retraction in cell motility // Curr. Opin. Cell Biol.- 2005.- Vol.17.- No.5- P.517-523.

179. Small J.V., Rottner K., Kaverina I., Anderson K.I. Assembling an actin cytoskeleton for cell attachment and movement // Biochim. Biophys. Acta.- 1998.- Vol.1404.- P.271-281.

180. Solomon MJ, Varshavsky A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures // Proc Natl Acad Sci U S A.- 1985,- V.82(19).-P.6470-4.

181. Speit G., Schutz P., Merk O. Induction and repair of formaldehyde:induced DNA-protein crosslinks in repair-deficient human cell lines. // Mutagenesis.- 2000.- V.15(l).-P.85-90.

182. Stickel S.K. and Wang Y-L. Alpha-actinin-containing aggregates in transformed cells are highly dynamic structures // J. Cell Biol.- 1987.- Vol.104.- P. 1521-1526.

183. Sue Goo Rhee, Tong-Shin Chang, Yun Soo Bae, Seung-Rock Lee, Sang Won Kang.

184. Cellular Regulation by Hydrogen Peroxide // J. Am. Soc. Nephrol.- 2003.- Vol. 14.-P.211-215.

185. Tam W.F., Sen J., Sen R. NF-kappa В in cell life and death. In books: Transcription factors: normal and malignant development in blood cells / 2001.- P.551-570. Wiley-Liss, Inc.

186. Tessier D.J., Komalavilas P., Panitch A., Joshi L., Brophy C.M. The small heat shock protein (HSP) 20 is dynamically associated with the actin cross-linking protein actinin // J. Surg. Res.- 2003.- Vol.111.- P.152-157.

187. Theriot J. A. Regulation of the actin cytoskeleton in living cells // Sem. Cell Biol.- 1994.-Vol.5.- P.193-199.

188. Tigyi G., Miledi R. Lysophosphatidates bound to serum albumin activate membrane currents in Xenopus oocytes and neurite retraction in PC 12 pheochromocytoma cells // J. Biol. Chem.- 1992.- Vol.267(30)- P.21360-21367.

189. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1979.- Vol.76.- P.4350-4354.

190. Tsao T.-C., Bailey K., Adair G.S. The size, shape and aggregation of tropomyosin particles. // 1951. Biochem. J. 49(1) : 27-36.

191. Urbancikova M., Hitchcock-DeGregori S.E. Requirement of amino-terminal modification for striated muscle alpha-tropomyosin function // J. Biol. Chem.- 1994.-Vol.269(39).- P.24310-5.

192. Vallenius Т., Luukko K., Makela T.P. CLP-36 PDZ-LIM protein associates with nonmuscle a-actinin -1 and a-actinin -4 // J.Biol. Chem.- 2000.- Vol.275.- P.11100-11105.

193. Vanhaesebroeck В., Leevers S.J, Panayotou G., Waterfield M.D. Phosphoinositide 3-kinases: a conserved family of signal transducers // Trends Biochem Sci.- 1997.-Vol.22.- P.267-272.

194. Vasilescu J., Guo X., Kast J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry // Proteomics.- 2004.- V.4(12).- P.3845-54.

195. Walikonis R.S., Oguni A., Khorosheva E.M., Jeng C.J., Asuncion F.J.,Kennedy

196. M.B. Densin-180 forms a ternary complex with the a-subunit of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and a-actinin // J. Neurosci.- 2001.- Vol.21.- P.423-433.

197. Weed S.A., Parsons J.T. Cortactin: coupling membrane dynamics to cortical actin assembly // Oncogene.- 2001.- V.20.- P.6418-34.

198. Winder S.J. and Ayscough K.R. Actin-binding proteins // Journal of Cell Science.-2005.-V. 118.-P. 651-654

199. Wyszynski M., Lin J., Rao A., Nigh E., Beggs A.H., Craig A.M. Sheng M.

200. Competitive binding of a-actinin and calmodulin to the NMDA receptor // Nature.-1997.- Vol.385.- P.439-442.

201. Xia H., Winokur S.T., Kuo W-L., Altherr M.R., Bredt D.S. Actinin-associated LIM protein: identification of domain interaction between PDZ and spectrin-like motifs // J. Cell Biol.- 1997.- Vol.139.- P.507-515.

202. Xu J., Zutter M.M., Santoro S.A., Clark R.A.F. A three-dimensional collagen lattice activates NF-kappa В in human fibroblasts: role in integrin alpha2 gene expression and tissue remodeling // J. Cell Biol.-1998.- Vol.140.- P.709-719.

203. Yamada K.M. and Geiger B. Molecular interactions in cell adhesion complexes // Curr. Opin. Cell Biol.- 1997.- V.9.- P.76-85.

204. Yan Q., Sun W., Kujala P., Lotfi Y., Vida T.A. and Bean A.J. CART: An Hrs/Actinin-4/BERP/Myosin V protein complex required for efficient receptor recycling // Molecular Biology of the Cell.- 2005.- Vol. 16.- P. 2470-2482

205. Yebra M., Filardo E.J., Bayna E.M., Kawahara E., Becker J.C., Cheresh D.A.1.duction of carcinoma cell migration on vitronectin by NF-kappa B-dependent gene expression //Mol. Biol. Cell.- 1995.- Vol.6.- P.841-850.

206. Yin M.J., Christerson L.B., Yamamoto Y., Kwak Y.T., Xu S., Mercurio F., Barbosa M., Cobb M.H., Gaynor R.B. HTLV-I Tax protein binds to MEKK1 to stimulate IkappaB kinase activity and NF-kappaB activation // Cell.- 1998.- Vol.93(5).- P.875-84.

207. Ylanne J., Scheffzek K., Young P., Saraste M. Crystal structure of the alpha-actinin rod reveals an extensive torsional twist // Structure (Camb).- 2001.- Vol.9.- P.597-604

208. Zandi E., Karin M. Bridging the gap: composition, regulation, and physiological function of the IkB kinase complex // Mol. Cell. Biol.- 1999.- Vol.19.- P.4547-4551.

209. Zhu P., Xiong "W., Rodgers G., Qwarnstrom E.E. Regulation of interleukin 1 signalling through integrin binding and actin reorganization: disparate effects on NF-kB and stress kinase pathways // Biochem. J.- 1998.- Vol.330.- P.975-981.

Информация о работе

Бобков, Данила Евгеньевич
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2010
ВАК 03.03.04

Диссертация

Тропомиозин и альфа-актинин-4 в составе мультимолекулярных цитоплазматических комплексов, не связанных со структурами цитоскелета - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Тропомиозин и альфа-актинин-4 в составе мультимолекулярных цитоплазматических комплексов, не связанных со структурами цитоскелета - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы