Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие изоформ α-актинина с транскрипционным фактором ReiA/NF-kB

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие изоформ α-актинина с транскрипционным фактором ReiA/NF-kB"

На правах рукописи

БАБАКОВ Владимир Николаевич

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ИЗОФОРМ а-АКГИНИНА С ТРАНСКРИПЦИОННЫМ ФАКТОРОМ RelA/NF-кВ

03.00.25

гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ.

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в Отделе клеточных культур Института цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Г.П. Пинаев, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Е.С. Корнилова,

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор А.Д. Харазова,

Биолого-почвенный факультет, Санкт-Петербургского государственного университета

Ведущая организация:

Институт канцерогенеза ОНЦ РАМН, Москва

Защита состоится 17 декабря 2004 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Автореферат разослан 17 ноября 2004 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

И.И. Марахова

Обшая характеристика работы Актуальность проблемы

Одной из важных и активно развивающихся областей клеточной биологии является изучение актинового цитоскелета и его участия в регуляторных процессах. Цитоскелет играет значительную роль в поддержании формы клетки и в осуществлении многих её двигательных реакций, обеспечивающих такие клеточные функции, как деление, эндо- и экзоцитоз, перемещение клеток в пространстве, контакт их с субстратом и с другими клетками (Beishadsky, Vasiliev, 1988). В последнее время появилось много работ, свидетельствующих об участии цитоскелета в регуляции экспрессии генов и проведении сигнала с поверхности клетки на ядро.

Ряд сигнальных молекул непосредственно связывается с цитоскелетом (Yamada, Geiger, 1997). Белки цитоскелета и сигнальные молекулы имеют общие домены, обеспечивающие белок-белковые взаимодействия (Mayer, Baltimore, 1993). Можно предполагать, что реорганизация является специфической реакцией цитоскелета на сигналы, поступающие в клетку от разных лиганд-рецепторных комплексов. До настоящего времени остается неясным, какую роль цитоскелет играет в сложной системе биохимических каскадов сигнальных молекул и в активации генома. Является ли цитоскелет непосредственным передатчиком сигнала или матрицей, на которой формируются сложные сигнальные комплексы или, направляющими, по которым происходит перемещение белковых комплексов в ядро? На этот очень важный вопрос еще только предстоит ответить. Трудности изучения данной проблемы обусловлены высокой динамичностью актинового цитоскелета, выражающейся в способности перестраиваться в ответ на разнообразные внешние воздействия (Schmidt, Hall, 1998).

В данной работе было предпринято исследование механизмов взаимодействия транскрипционного фактора NF-кВ С актиновым цитоскелетом. В нашей лаборатории было показано, что транскрипционный фактор NF-кВ может ассоциироваться с актином in vitro и in .vivo (Are et al., 2000). Кроме того, было установлено, что важный элемент деградации ингибиторной субъединицы 1кВ-а и активации NF-кВ - протеасомы - способен прямо вчаимрпе^утровать с F-актином

(Галкин и др., 1998а, 19986, 2000). В связи с т NF-kB

НИНММЙММГ

cn« о»

обнаружена в числе других белков, взаимодействующих с актином, оставался неясным следующий вопрос: взаимодействует ли NF-кВ С актиновым цитоскелетом прямо или его взаимодействие опосредуется какими-либо актин-связывающими белками? Несмотря на большое число работ, посвященных транскрипционному фактору NF-кВ, мало известно о его цитоплазматической локализации и путях транспорта его в ядро. Кроме того, специфические компоненты сигнальных каскадов, ответственные за регуляцию NF-кВ, В большой степени неизвестны. Мы предположили, что взаимодействие NF-кВ С актиновым цитоскелетом может осуществляться через а-актинин - актин-связывающий белок, найденный в фокальных и межклеточных контактах и вдоль актиновых филаментов. Кроме того, протеинкиназа МЕКК1, которая является одним из активаторов NF-кВ, прямо взаимодействует с а-актинином (Christerson et al., 1999). В немышечных клетках присутствуют две изоформы d-актинина (Otey, Carpen, 2004): а-актинин-1 и недавно открытая изоформа а-актинин-4 (Honda et al., 1998), и вполне вероятно, что NF-кВ может взаимодействовать только с одной из этих изоформ. Поэтому в данной работе предпринята попытка определить роль различных изоформ а-актинина в процессе формирования фокальных контактов и в процессах активации транскрипционного фактора NF-KB. Цели и задачи работы

Основной целью данной работы являлось проверка гипотезы о взаимодействии актин-связывающего белка а-актинина с комплексом транскрипционного фактора NF-кВ in vivo и in vitro в клетках линий А431 и НЕК293 и характеристика этого взаимодействия.

Для достижения указанной цели было необходимо решить ряд задач.

1. Изучить эффект фосфорилирования по тирозину а-актинина при адгезии клеток А431 на фибронектине, ламинине 2/4 и на антителах к рецептору ЭФР на взаимодействие с транскрипционным фактором NF-KB.

2. Сопоставить характер распределения транскрипционного фактора NF-кВ И немышечных изоформ а-актинина в клетках линий А431 и НЕК293.

3. Используя набор биохимических методов, исследовать способность к взаимодействию,цзоформ И-актинина с активированным и неактивным комплексом NF-KB.

4. Установить характер распределения изоформ а-актинина при активации NF-кВ, используя клеточные линии, стабильно трансфецированные плазмидами, кодирующими изоформы а-актинина, слитыми с зеленым флуоресцентным белком.

5. Исследовать ДНК-связывающую активность NF-кВ В клетках с различным состоянием актинового цитоскелета.

Положения, выносимые на защиту

1. а-Актинин-4 взаимодействует с комплексом транскрипционного фактора RelA/NF-кВ в клетках А431 и НЕК293. Активация NF-кВ приводит к совместной транслокации а-актинина-4 и NF-кВ В ядро.

2. Разрушение актинового цитоскелета цитохалазином приводит к транслокации о> актинина-4 и NF-кВ В ядро и увеличивает ДНК-связывающую активность NF-KB. а-Актинин-4 может входить в состав транскрипционного комплекса NF-KB.

3. Актиновый цитоскелет и актин-связывающие белки являются скаффолд-системой для транскрипционного фактора NF-кВ И элементов его активации. Научная новизна полученных результатов

В работе впервые установлена способность изоформ актин-связывающего белка а-актинина к ассоциации с транскрипционным фактором NF-кВ В условиях in vivo и in vitro. Стимуляция клеток А431 эпидермальным фактором роста и клеток НЕК293 фактором некроза опухолей и форболовым эфиром приводит к транслокации NF-кВ И а-актинина-4 в ядро. Впервые получены данные об участии а-актинина-4 в формировании транскрипционного комплекса NF-кВ на специфичной последовательности ДНК. Теоретическое и практическое значение работы

Полученные результаты свидетельствуют о возможности участия а-актинина-4 в регуляции экспрессии генов на уровне активации транскрипции. Эти результаты позволяют предполагать новые механизмы участия актинового цитоскелета в процессах проведения внутриклеточных сигналов.

Результаты работы имеют фундаментальное значение для дальнейшего углубленного изучения механизмов контроля экспрессии генов на уровне активации транскрипции в клетках эукариотических организмов и установления роли актинового цитоскелета и актин-связывающих белков в этих процессах.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на 3 съезде биохимиков России (С.Петербург, 2002), на Всероссийских симпозиумах «Биология клетки в культуре» (С.-Петербург, 2001, 2003), на 3 съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), на международной конференции FEBS Special Meeting on Signal Transduction (Брюссель, 2003), на международной конференции FEBS Special Meeting «Cytoskeletal Dynamics: from cell biology to development and disease» (Хельсинки, 2004). Диссертационная работа апробирована на научном семинаре Отдела клеточных культур Института цитологии РАН 12 мая 2004 г. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из «Введения», глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты» и «Обсуждение результатов», выводов и списка цитируемой литературы, содержащего MS наименования. Иллюстративный материал содержит и рисунка и 1 таблицу. Материалы и методы

Культивирование клеток: В работе использовали клетки эпидермоидной карциномы человека линии А431, эмбриональные клетки почки человека линии НЕК293, полученные из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН). Клетки культивировали в среде ДМЕМ, с добавлением 10% эмбриональной сыворотки при 37 °С в атмосфере 5% СО2.

Трансфекция клеток: А431 и НЕК293 клетки трансфецировали плазмидами, содержащими разные клеточные изоформы а-актинина, слитые с зеленым флюоресцентным белком. Плазмиды были любезно предоставлены Dr. Carol Otey (Университет штата Северной Каролины, США). Для трансфекции использовали 6 мкл LipofectAMINE и 1 мкг плазмидной ДНК. Для получения постоянных линий использовали селекцию на антибиотике G418.

Иммунофлуоресценция: 100 мкл суспензии клеток (1.6хЮ5 клеток/мл) наносили на силиконизированные покровные стекла, покрытые фибронектином, и культивировали в течение 1 ч при 37 °С в атмосфере 5 % СО2. Затем меняли среду на другую, содержащую 100 нг/мл ЭФР, 100 нМ вортманнина или 2 мкг/мл цитохалазина D. После фиксации и пермеабилизации, клетки инкубировали с

моноклональными антителами к субъединице р65 (Santa Cruz, США) и вторыми антителами, конъюгированными с FITC. Затем клетки инкубировали кроличьими поликлональными антителами к а-актинину-4 (ImmunoGlobe, Германия) и вторыми антителами, конъюгированными с СуЗ. Препараты исследовали с помощью конфокального микроскопа Leica (Германия). Для возбуждения флуоресценции использовали аргоновый лазер с длиной волны 488 нм для FITC и HeNe лазер с длиной волны 543 нм для СуЗ.

Получение клеточных экстрактов для аффинной хроматографии: Клетки А431 и НЕК293, выросшие на пластике до субконфлюэнтного состояния, промывали PBS и замораживали при - 70 °С. После разморозки клетки инкубировали 5 мин в буфере, содержащем 5 мМ Трис-HCl рН 7.5,1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 1 мМ PMSF и набор протеазных ингибиторов Complete™. Снятые с пластика клетки гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса. Лизат центрифугировали 10 мин 2500 g для удаления ядер и для дальнейшей очистки центрифугировали 30 мин 12000 g. К супернатанту добавляли Трис-HCl рН 7,5 до конечной концентрации 50 мМ и NaCl до конечной концентрации 100 мМ.

Аффинная хроматография на колонке с иммобилизованным а-актинином:

Гладкомышечный а-актинин из куриных желудков был получен набором описанных методов (Feramisco, Burridge, 1980). Чистоту полученного белка контролировали электрофоретически. Полученный белковый раствор диализовали против буфера, содержащего 0.1 М NaHCCb и 0.3 М NaCl, затем 2 мл белкового раствора с концентрацией 2 мг/мл связывали с 3 мл CNBr-активированной сефарозой. Связывание проводили в течение ночи при 4 °С. Дальнейшие процедуры проводили при 4 °С. Для остановки реакции был добавлен 3 М моноэтаноламин (рН 8.0), до конечной концентрации 50 мМ на 2 ч. После упаковки колонку промывали трижды. В каждый цикл промывки входили отличающиеся по рН буферные растворы: сначала 0,1 М ацетатный буфер рН 4.0, затем Трис-HCl рН 8.0. Все буферные растворы содержали 0.3 М NaCl. Затем колонку уравновешивали буфером для хроматографии (50 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF, 1 мМ ДТТ, 0.05% Nonidet-P40). После нанесения клеточного экстракта колонку промывали буфером для хроматографии до тех пор, пока концентрация белка на выходе колонки не стала меньше 5 мкг/мл. Элюцию белков,

связавшихся с колонкой, проводили буфером для хроматографии, содержащим 4 М мочевину. Концентрацию белка измеряли методом Бредфорд (Bradford, 1976). Пиковые фракции, содержащие основное количество белка, объединяли и белок высаживали добавлением трихлоруксусной кислоты до конечной концентрации 10 %, осадок ресуспендировали в буфере для электрофореза и нейтрализовали кислоту добавлением 1.5 M Трис-HCl, рН 8.8. Белки, связавшиеся с аффинной колонкой, выявляли иммуноблотингом.

Блот-оверлей: Очищенный гладкомышечный а-актинин и его фрагменты подвергали электрофорезу и переносили на PVDF мембрану (Cao et al., 2001). Протеолитические фрагменты а-актинина получали инкубацией с термолизином (в соотношении протеаза/субстрат 1:20) в 25 мМ Трис-HCl буфере рН 7.5 и 150 мМ NaCl. Мембрану с иммобилизованными а-акгинином и его фрагментами инкубировали в блокирующем буфере (50 мМ Трис-HCl рН 7.5 и 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1%-ный Тритон Х100, 2%-ный BSA) в течение 5 ч при 4 °С. Затем мембрану инкубировали с лизатом клеток А431 (концентрация белка 1 мг/мл) в буферном растворе 25 мМ Трис-HCl рН 7.5 и 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1%-ный Тритон XI00, 2%-ный BSA и 1 мМ PMSF в течение ночи при 4 °С. Мембрану промывали дважды по 15 мин TBST и проводили на ней иммуноблотинг с использованием антител к р50 и р65 субъединицам NF-кВ И IKBOL Иммунопреципитация: Клетки промывали буфером PBS и лизировали в буфере RIPA (50 мМ Tris-HCl, рН 7.4; 150 мМ NaCl; 1%-ный ТритонХЮО; 1мМ ЭДТА; 1 мМ PMSF; 1мМ Na3VO4; набор протеазпых ингибиторов). Лизаты очищали центрифугированием в течение 10 мин при 12000 g. После предварительной очистки сефарозой с пришитым белком А в лизаты добавляли первые антитела против р65, р50, а-актинина и инкубировали на льду в течение 2 ч. Для адсорбции комплекса антиген-антитело в пробы добавляли сефарозу с ковалентно пришитым белком A (Protein A Sepharose, "Pharmacia") и инкубировали еще 1 ч. Все инкубации проводили при плавном перемешивании на качалке. Концентрацию белка в пробах определяли по методу Брэдфорд. Затем пробы центрифугировали 5 мин при 1000g и полученный осадок трижды промывали, ресуспендируя его в 1 мл буфера для иммунопреципитации с последующим центрифугированием. Осадок ресуспендировали в буфере для электрофорезных проб. Наличие в преципитатах

белков выявляли с помощью метода иммуноблотинга. Для иммунопреципитации из ядерных экстрактов, использовали 100 мкг белка экстрактов и проводили такую же процедуру. Электрофорез (Laemmli, 1970) и иммуноблотинг (Towbin et al., 1979) с использованием системы усиленной хемилюминесценции проводили по стандартным методикам.

Выделение ядерных экстрактов: Клетки, культивируемые во флаконах, инкубировали при 37 °С в атмосфере 5% СО2 в присутствии вортманнина, ингибитора PI3 киназ 1 и 3-го типа, цитохалазина D и ЭФР, промывали тёплым PBS и лизировали в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl, рН 7.9,0.32 М сахарозу, 20 мМ MgCl2, 0.1 мМ EDTA, 0.1%-ный Тритон Х-100,1.0 мМ DTT и 0.5 мМ PMSF. Ядра осаждали центрифугированием при 2000 g в течение 5 мин, осадок ядер ресуспендировали и очищали центрифугированием в 0.5 М сахарозе (Марзлав, Хуан, 1987). Фракции, содержащие транскрипционные факторы, экстрагировали при 0 °С в течение 30 мин буфером, содержащим 20 мМ HEPES, рН 7.9, 400 мМ NaCl, 25 % глицерина, 15 мМ MgCl2, 0.4 мМ EDTA, 0.4 мМ PMSF, 1 мМ DTT, 2 мМ ЫазУО^ и набор протеазных ингибиторов Complete™ (Roche, Германия), и центрифугировали при 12000g в течение 30 мин. Концентрацию белка в ядерных экстрактах определяли по методу Брэдфорд (Bradford, 1976). Белки хранили при -70 °С в аликвотах.

Анализ ДНК-связывающей активности NF-кВ В ядерных экстрактах: Для

EMSA (electromobility shift assay) анализа в реакции связывания использовали равные количества белка (7 мкг). Экстракты инкубировали в буфере (20 мМ HEPES, рН7.9, 50 мМ КС1, 10 мМ MgCl2, 0.5 мМ DTT, 12%-ный глицерин), содержащем nonn(dl-dC) и олигонуклеотидную пробу, меченную по 5'-концу (50000 срт). Двуцепочечный олигонуклеотад NF-кВ 5'-agttgaggggactttcccaggc-3'метили с использованием в полинуклеотидкиназной реакции. Реакцию

связывания проводили 20 мин при комнатной температуре. В реакции конкуренции ядерные экстракты преинкубировали с избытком специфического конкурента 15 мин при комнатной температуре. Антитела, специфичные к а-актинину-4, добавляли к экстракту за 30 мин до смешивания с меченным олигонуклеотидом. По окончании реакции пробы разделяли в нативном 4%-ном ПААГ при постоянном

напряжении (10 В/см) в ТАЕ-буфере. Гели высушивали и экспонировали с плёнкой Kodak X-Omat при -80 ° С. Результаты и обсуждение

В состав комплекса транскрипционного фактора NF-кВ ВХОДЯТ димер, состоящий из белков Rel/NF-кВ семейства, способный связывать ДНК, и ингибиторный белок, принадлежащий I-кВ семейству. Наиболее изучен классический NF-кВ - гетеродимер р50 и р65, хотя описаны и другие гомо- и гетеродимеры. Разные димеры имеют свои особенности, включая сайты узнавания ДНК, специфичость клеточного типа, субклеточную локализацию, взаимодействие с разными формами 1кВ, различные пути активации. Все это увеличивает возможности NF-кВ В регуляции экспрессии разных генов. Ингибиторный белок 1кВ-а удерживает NF-кВ В цитоплазме в неактивной форме, маскируя при этом NLS (nuclear localization signal) - последовательность ядерной локализации (Liou and Baltimor, 1993). При активации происходит фосфорилирование 1кВ-а (по остаткам серина 32 и 36) и убиквитинирование (в положениях Arg21/Arg22) с последующей деградацией на протеосомах, а освобожденный NF-кВ перемещается в ядро, где активирует соответствующие гены (Palombella et al., 1994). 26S-протеасомы, состоящие из 198-регуляторного комплекса и 208-протеасомы, способны прямо взаимодействовать с F-актином (Галкин и др., 1998а). 20S-протеасомы прямо не взаимодействуют с F-актином, однако, при диссоциации 20S-комплекса, все субъединицы, кроме белка с мол. массой 27 кДа, способны образовывать макромолекулярный комплекс с F-актином (Галкин и др., 2000). Эти данные позволяют предполагать организующую роль актинового цитоскелета при активации N F - KB.

В последнее время появился ряд работ, указывающих на то, что NF-кВ, С одной стороны, активируется белками внеклеточного матрикса и малыми ГТФазами, принимающими участие в регуляции структуры актинового цитоскелета (Qwarnstrom et al., 1994; Xu et al., 1998), а с другой, стимулирует адгезию и миграцию клеток (Eck et al., 1993; Yebra et al., 1995; Benoliel et al., 1997). Все эти данные дают основание предполагать возможность непосредственного участия NF-кВ В процессах адгезии и формирования структуры актинового цитоскелета, возможно, через активацию транскрипции соответствующих генов, а-

Актинин - важный элемент фокальных контактов (Otey, Carpen, 2004), способен фосфорилироваться по тирозину киназой фокальных контактов FAK (Igazzuirre et al., 2001). В настоящей работе было установлено, что а-актинин формирует иммунный комплекс с FAK и фосфорилируется по тирозину при активации FAK при адгезии клеток А431 на элементах внеклеточного матрикса фибронектине, ламинине 2/4 и на антителах к рецептору ЭФР. Фосфорилированный а-актинин перераспределяется в Тритон Х100-растворимую субклеточную фракцию, что предполагает снижение сродства а-актинина к F-актину. При этом фосфорилированный а-актинин сохраняет иммунный комплекс с р65 субъединицей NF-кВ (Бабаков и др., 2002).

Субъединица p65/RelA NF-кВ и а-актинин, как показано методом иммунофлуоресценции, совместно локализуются в цитоплазме в областях фокальных контактов, вдоль актиновых филаментов и в кортикальной области в клетках А431 и НЕК293. Для того, чтобы проверить, является ли взаимодействие временным, и не нарушается ли совместная локализация р65 и а-актинина при активации NF-кВ, был проведен анализ перераспределения этих двух белков в условиях активации NF-кВ. ДЛЯ ЭТОГО на клетках линий А431 и НЕК293 исследовали локализацию р65 субъединицы NF-кВ И а-актинина при активации NF-кВ на различных сроках стимуляции клеток. Использовали ЭФР в концентрации 100 нг/мл для клеток А431 (Ohtsubo et al., 2000), при которой происходит активация NF-кВ. Через 5 мин после введения в среду ЭФР оба белка перераспределяются в область пучков F-актина, расположенных по всему периметру клеток. При этом совместная локализация NF-кВ И а-актинина сохраняется. По-видимому, эти структуры концентрируются в областях дорзального раффлинга. Через 10 мин инкубации актин-содержащие структуры располагаются в околоядерной области, а через 20-30 мин оба белка обнаруживаются в ядре (рис. 1).

Другие имеющиеся у нас моноклональные антитела к а-актинину, (ВМ-75.2, Sigma, США), взаимодействующие только с а-актинином-1 (Araki et al., 2000), дают другую картину распределения белка в клетке и не окрашивают ядро.

а-Актинин-4 p65/RelA

0 мин ЭФР

5 мин ЭФР

10 мин ЭФР

30 мин ЭФР

Рис.1 Иммунофлуоресцентный анализ внутриклеточной

локализации а-актинина-4 и р65 субъединицы ОТ-кВ В клетках А431 распластанных на фибронектине и затем обработанных эпидермальным фактором роста (100 нг/мл) в течение 5,10 и 30 мин.

В клетках линии НЕК293 эти белки совместно локализуются в микроворсинках и в подмембранной области. Стимуляция клеток форболовым эфиром или фактором некроза опухолей приводит к транслокации р65 и а-актинина-4 в ядро. Чтобы подтвердить, что в указанных условиях в ядро мигрирует только одна изоформа а-актинина, использовали постоянно трансфецированные плазмидами GFP-а-актинин-! и ОРР-а-актинин-4 клетки А431 и НЕК293. В клетках А431 только изоформа а-актинин-4 перераспределяется в ядро при действии ЭФР. В клетках НЕК293 изоформа а-актинин-4 способна мигрировать в ядро при действии на клетки ФНО-а (TNF- а), форболового эфира (РМА) и липополисахарида (LPS). а-Актинин-1 не обнаружен в ядрах во всех случаях.

Известно, что обработка клеток цитохалазином приводит к разборке актинового цитоскелета. С целью проверки достоверности совместной локализации р65 с актиновыми структурами были подобраны условия, при которых происходила разборка микрофиламентов. В клетках, обработанных 0.2 мМ цитохалазином D в течение 40 мин, р65 и а-актинин выявлялись вдоль сохранившихся стресс фибрилл и в актин-содержащих агрегатах в цитоплазме.

Кроме того, оба белка обнаруживались в ядре. Этот эффект был обнаружен в клетках обеих линий.

GFP-a-aKTHHHH-4 GFP-a-актинин-!

Нестимулированные клетки НЕК293

30мин LPS

30 мин РМА

30 мин TNF-a

Рис.2. Накопление

а-акгинина-4 в ядре при действии активаторов NF-кВ.

Клетки НЕК293, стабильно трансфецированные плазмидами, кодирующие а-актииии-1 и а-актииии-4, слитых с зеленым флуоресцентным белком обрабатывали активаторами NF-кВ. LPS -липополисахарид (10

нг/мл), РМА - форболовый эфир (10 нг/мл), TNF-a -фактор некроза опухолей -а (10 нг/мл)

При действии вортманнина, известного ингибитора Р13-киназ 1 и 3-го типа, который не вызывал драматичной разборки цитоскелета, также часть клеточного пула а-актинина и р65 обнаруживались в ядре. Эти данные говорят о существенной роли фосфотидилинозитидов и подмембранного цитоскелета в регуляции КР-КБ. При стимуляции клеток ЭФР в течение 30 мин уменьшается содержание обеих субъединиц в цитоскелетной Тритон ХЮО-нерастворимой фракции и происходит их накопление в ядерном экстракте. Если предварительно обработать клетки цитохалазином или вортманином перед действием ЭФР, то накопление р65 и а-актинина-4 в ядре усиливается относительно стимулированных, но не предобработанных клеток (рис. 3). Сходную картину накопления в ядре демонстрирует р50 субъединица КР-кВ. р-Актин значительно накапливается в ядре

Рис.3 Накопление р65 субъединицы №-кВ и а-актинина-4 в ядерных экстрактах клеток А431 под действием 100 нг/мл ЭФР в течение 5,30 мин, 2 мкг/мл цитохалазина О (Цит Б) и 100 нМ вортманнина (Вортм). Иммуноблотинг с использованием соответствующих антител. Плюсом отмечены дорожки с ядерным экстрактом из клеток, получивших соответствующий сигнал или их комбинацию.

только при действии на клетки цитохалазина Б. Киназа МЕКК1 накапливается в ядре при действии ЭФР, но цитохалазин Б и вортманнин ингибируют ее накопление.

Возможность прямой связи межу а-актинином и белками комплекса ОТ-КВ исследовали методом иммунопреципитации. Для этой цели лизаты клеток А431 и НЕК293 инкубировали с антителами против р65/Ке1А и образовавшиеся белковые комплексы преципитировали сефарозой с ковалентно пришитым белком А. Полученные преципитаты подвергали электрофорезу и анализировали методом иммуноблотинга. С клетками А431 в суспензионном состоянии и в клетках, распластанных на белках ВКМ и антителах к рецептору ЭФР, взаимодействие о> актинин и р65/Яе1А субъединицы транскрипционного фактора ОТ-КВ действительно происходит и эти белки способны к совместной иммунопреципитации. Кроме того, иммунный комплекс остается стабильным вне зависимости от стимуляции клеток ЭФР или обработки цитохалазином (рис. 4) Для того, чтобы подтвердить данные иммунофлуоресценции о взаимодействии р65 и а-актинина-4 в ядре, использовали метод иммунопреципитации из ядерных экстрактов. На рис. 46 представлены результаты иммуноблотинга с использованием антител к а-актинину-4 иммунных комплексов, полученных антителами к р65 из ядерных экстрактов контрольных клеток; клеток, стимулированных ЭФР и клеток предварительно обработанных цитохалазином Б. Результаты иммуноблотинга демонстрируют, что комплекс р65 и а-актинина-4 сохраняется в клеточном ядре. Кроме того, сохраняется кинетика накопления а-актинина-4 в ядре, что позволяет говорить о специфичном взаимодействии.

Рис. 4. (А) Определение взаимодействия КР-кВ И а-актинина методом иммунопреципитации из лизатов клеток А431. Клетки А431 стимулировали 100 нг/мл ЭФР 5 и 30 мин, и предварительно обрабатывали цитохалазином Б. Клеточные экстракты преципитировали поликлоыальными антителами к о> актинину и р65 с последующим иммуцоблотингом антителами к р65 и а-актинину-4. (Б) Иммунопреципитация антителами к р65 из ядерных экстрактов клеток А431. Иммуноблотинг с использованием антител к а-актинину-4. Первая дорожка на всех иммуноблотах - контрольная, с лизатом клеток А431.

В составе комплекса а-актинин определяется только поликлональными антителами к а-актинину и антителами к а-актинину-4 и не выявляется антителами к а-актинину-1. В комплексе также выявляется субъединица р50, но не выявляются 1кВи -актин.

Для того чтобы выяснить, является ли совместная локализация р65 с актиновыми структурами и а-актинином следствием их взаимодействия, была проведена аффинная хроматография клеточных экстрактов на а-актининовой колонке. Для иммобилизации с носителем использовали очищенный гладкомышечный а-актинин. Гладкомышечная изоформа а-актинина из всех мышечных изоформ является наиболее близкой к клеточным изоформам. Клеточные экстракты клеток А431 и НЕК293 наносили на колонку с иммобилизованным а-актинином, после чего исходные экстракты и связавшиеся с колонкой белки анализировали на электрофорезе с последующим иммуноблотингом с использованием антител к р65, р50 и 1кВ-а, как описано в разделе «Материалы и методы». Профиль элюции белков, связавшихся с а-актинином, представлен на рис 5. Результаты иммуноблотинга показали, что р65 и р50 субъединицы КР-кВ, НО не ингибиторная субъединица 1кВ-а из экстрактов

клеток А431 и НЕК293, присутствуют среди белков, связавшихся с иммобилизованным а-актинином (рис 5).

Чтобы определить домен а-актинина, взаимодействующий с NF-KB использовали ограниченный протеолиз гладкомышечного а-актинина термолизином. Белок и его фрагменты подвергали электрофорезу и электропереносу. Затем мембрану инкубировали с лизатом клеток А431 и подвергали иммуноблотингу с использованием антител к разным субъединицам комплекса ОТ-О. Все субъединицы комплекса ОТ-КВ могут взаимодействовать с полноразмерным а-актинином, но только р65 субъединица взаимодействует с 53 кДа фрагментом а-актинина (рис. 6).

Рис.5 Иммуноблотинг с использованием антител к р65 и р50 субъединицам N F- KB И IK B -а, белков, связавшихся с иммобилизованным гладкомышечным а-актинином. Профиль злющи лизатов клеток А431 и НЕК 293 с а-актининовой колонки. BSA column - профиль элюции с контрольной колонки с иммобилизованным бычьим сывороточным альбумином.

Одним из показателей активности транскрипционного фактора NF-KB является его способность связываться с регуляторными кВ-элементами, имеющими последовательность 5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3\ ДНК-связывающую активность NF-KB исследовали методом торможения в геле - изменения электрофоретической подвижности Р32-меченного кВ-элемента после взаимодействия с белками (рис. 7а). Белки ядерных экстрактов клеток А431 при взаимодействии с NF-KB консенсусной последовательностью образуют

специфичные ДНК-белковые комплексы, различающиеся по электрофоретической подвижности. Инкубация клеток в присутствии ЭФР приводила к формированию четырех специфичных новых ДНК-белковых комплексов (Петухова и др. 2005).

ТерМОЛИЗИН

- +

+ - +

а-Актинин

(Кумасси) о65 р50 1кВ-а

г 7 \ '4

Г-** I, ' 1

Щ*1 <

»4

Г ~

Рис. 6. Блот-оверлей на очищенном а-актинине и его фрагментах. Гладкоомышечный а-актинин и его фрагменты, полученные с помощью термолизина, подвергали

электрофорезу (Кумасси) и переносили на РУОР мембрану. Мембрану инкубировали в лизате клеток А431, отмывали и подвергали процедуре

иммуноблотинга с

использованием антител к р65, р50 и 1кВ-а.

+

Обработка клеток цитохалазином Б приводит к аналогичному изменению. Совместное действие цитохалазина Б и ЭФР усиливает ДНК-связывающую активность КР-кВ. Активация КР-кВ цитохалазином Б была независимо подтверждена в недавно опубликованной работе (Кете& е! а1., 2004). Обработка клеток вортманнином, по-видимому, не вызывает изменений по сравнению с контролем. В результате реакции конкуренции в присутствии специфических антител к а-актинину-4 высокомолекулярные ДНК-белковые комплексы исчезали (рис. 76). Эти антитела не взаимодействовали с ДНК. Антитела к а-актинину-1 не вызывали изменений в составе ДНК-белковых комплексов. Эти результаты позволяют предполагать участие а-актинина-4 в формировании транскрипционного комплекса КР-КВ.

Таким образом, в работе впервые было установлено, что транскрипционный фактор КР-кВ способен взаимодействовать с актин-связывающим белком а-актинином-4 в клетках линий А431 и НЕК293.

Цитахалазин D Вортманнин

ЭФР 5 мин ЭФР 30 мин

А

+

+

+ +

+ +

+

Рис. 7. (А) ДНК-связывающая активность факторов, узнающих последовательность NF-кВ, В клетках А431, обработанных 5, 30 мин ЭФР (100 нг/мл) или предварительно обработанных цитохалазином D (2 мкг/мл) или вортманнином (100 нМ) в течение 40 мин. (Б) ДНК-связывающая активность факторов, узнающих последовательность NF-кВ, В клетках А431 в присутствии антител к а-актинину-1 (а-актинин-1 AT) и антител к а-актинину-4 (ос-актинин-4 AT) в реакционной смеси. Плюсом отмечены дорожки с ядерным экстрактом из клеток, получивших соответствующий сигнал или их комбинацию.

Факты, полученные в данной работе указывают на новую ранее неизвестную ядерную функцию а-актинина-4 и его роль во взаимодействии транскрипционного фактора NF-кВ С актиновым цитоскелетом. К сожалению, данных о роли актина и актин-связывающих белках в ядерных событиях еще слишком мало. Это объясняется, в частности, большой экспериментальной трудоемкостью в получении новых данных и необходимостью перепроверки результатов разными методами для того, чтобы избежать артефактов. Кроме того, имеется еще слишком мало представлений об участии актин-связывающих белков, обнаруженных в ядре, в процессах регуляции транскрипции. В последнее время появились первые работы о ядерной локализации и поиске новых связывающих партнеров для целого ряда актин-связывающих белков: зиксина (Nix et al., 2001), паксиллина (Woods et al., 2002), эзрина (Batchelor et al., 2004), миозина 1 (Pestic-Dragovich et al., 2000), белка

полосы 4.1 (De Career et al., 1995), спектрина (Bachs et al., 1990) и белков Агр семейства (Cairns et al., 1998). Можно предположить, что реорганизация акгинового цитоскелета одновременно приводит к освобождению и транслокации в ядро целого ряда актин-связывающих белков. Подобный механизм позволяет говорить о сигнальных функциях актин-связывающих белков на уровне регуляции транскрипции и процессинга РНК. Возможно, подобная прямая передача сигнала в ядро способна обходить или дополнять широко распространенные внутриклеточные сигнальные каскады с их множеством интермедиатов, что позволяет ускорять клеточный ответ. Кроме того, имеются данные о том, что при злокачественной трансформации клетки происходит нарушение ядерно-цитоплазматической локализации таких белков (Honda et al., 1998).

В настоящей работе не удалось однозначно установить, происходит ли взаимодействие NF-кВ С внутриклеточным а-актинином-1. NF-кВ И а-актинин-1 не формируют комплекс при иммунопреципитации в условиях, когда NF-кВ И а-актинин-4 взаимодействуют. Однако NF-кВ взаимодействует с гладкомышечным а-актинином, который кодируется тем же геном, что и немышечная изоформа а-актинин-1. Вполне вероятно, что сродство NF-кВ К а-актинину-1 меньше, чем к а-актингагу-4. Подтверждение этого предположения требует дополнительных исследований. Не исключено, что во взаимодействии актина и NF-кВ принимают участие обе клеточные изоформы а-актинина, но только а-актинин-4 способен накапливаться в ядре.

Таким образом, результаты настоящей работы показали, что актиновый цитоскелет и актин-связывающий белок а-актинин-4 принимают участие в обеспечении проведения сигнала транскрипционного фактора NF-кВ И его транспорта в ядро. Предварительная обработка клеток А431 цитохалазином D или вортманнином перед действием ЭФР усиливает накопление р65 в ядерных экстрактах этих клеток, что позволяет говорить о роли акгинового цитоскелета как скаффолда для сигнальных молекул, входящих в состав комплекса NF-KB.

Так как появились первые работы, в которых а-актинин-4 рассматривается как онкомаркер (Nikolopoulos et al., 2000; Honda et al., 2004), дальнейшие исследования позволят, основываясь на полученных результатах, понять механизмы канцерогенеза и анти-апоптотической активности при злокачественной

трансформации. Кроме того, КР-кВ участвует в регуляции жизненно-важных клеточных процессов и изучение регуляции его активности может быть важно для понимания процессов клеточной пролиферации, трансформации, дифференцировки и апоптоза.

Выводы:

1. Немышечный а-актинин способен фосфорилироваться по тирозину киназой фокальных контактов при адгезии клеток А431 на фибронектине, ламинине 2/4 и антителах к рецептору ЭФР. Фосфорилирование а-актинина не влияет на связывание с КР-КВ.

2. В клетках эпидермоидной карциномы человека линии А431 и в эмбриональных клетках почки человека линии НЕК293 р65/Яе1А субъединица транскрипционного фактора КР-кВ локализуется совместно с а-актинином-4. При действии на клетки цитохалазина Б или вортманнина часть клеточного пула этих белков накапливается в ядре. При действии на клетки активаторов КР-кВ, а-актинин-4 и р65/Яе1А совместно мигрируют в ядро. а-Актинин-4, но не а-актинин-1, способен накапливаться в ядре при действии на клетки активаторов КР-КВ.

3. а-Актинин-4, но не а-актигаш-1, способен формировать иммунные комплексы с субъединицами р65/Яе1А и р50 КР-кВ И не формирует с их ингибиторной субъединицей1кВ-а.

4. р65 и р50 субъединицы КР-кВ, НО не ингибиторная субъединица 1кВ-а способны связываться с иммобилизованным на колонке гладкомышечным а-актинином. Все субъединицы комплекса КР-кВ могут взаимодействовать с полноразмерным а-актинином, но только р65 субъединица взаимодействует с 53 кДа фрагментом а-актинина.

5. Комплекс КР-кВ И а-актинина-4, выявляемый реакцией иммунопрещшитации, сохраняется в ядерных экстрактах. Антитела к а-актинину-4 препятствуют формированию ряда ДНК-белковых комплексов при взаимодействии белков ядерных экстрактов с олигонуклеотидом, специфичным для КР-КВ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

В.Э. Галкин, В.Н. Бабаков, Л.В. Туроверова, И.М. Константинова, Г.П. Пинаев. Фибриллярный актин способствует сборке диссоциированного комплекса 20S-протеасомы. Цитология, 2000,42(9): 875-883.

В.Н. Бабаков, А.Ф. Арэ, Г.П. Пинаев Альфа-актинин принимает участие во взаимодействии транскрипционного фактора NF-кВ С актиновым цитоскелетом. Цитология, 2001,43(9): 839.

Бабаков В.Н., Кропачева И.В., Пинаев Г.П. Альфа-актинин фосфорилируется по тирозину при адгезии клеток А431 к элементам внеклеточного матрикса. Тезисы 3 съезда биохимического общества. С.-Петербург, 2002. с. 63.

V.Babakov I.Kropacheva G. Pinaev Alpha-actinin takes part in interaction of NF-kappaB transcription factor with actin cytoskeleton 2003. Eur. J. Biochem. Suppl. 1, p. 80. В.Н.Бабаков Д.Е.Бобков И.В.Кропачева О.А.Петухова Л.В.Туроверова Г.П.Пинаев Альфа-актишш и р65 субъединица транскрипционного фактора NF-kappa В солокализуются и совместно перераспределяются в клетках линии А431. 2003 Цитология, 45(9): 847.

V. Babakov, I. Smirnova, D. Bobkov, О. Petukhova, L. Turovcrova, I. Kropacheva, E. Podolskaya, G. Pinaev. NF-кВ transcription factor interacts with alpha-actinin isoforms. FEBS special meeting on Cytoskeletal Dynamics: From Cell Biology to Development and Disease. June 12-16 2004. Helsinki, Finland. Abstract book. p. 38.

В.Н. Бабаков, Е.П. Подольская, Д.Е. Бобков, О.А. Петухова, Л.В. Туроверова, И.В. Кропачева, Г.П. Пинаев. Альфа-актинин взаимодействует с р65 субъединицей транскрипционного фактора NF-kappa В. 3 съезд биофизиков России. 24-29 июня 2004 г. Воронеж. Тезисы докладов. Т. 1. с. 6-7.

В.Н. Бабаков, Д.Е. Бобков, ОА. Петухова, Л.В. Туроверова, И.В. Кропачева, Е.П. Подольская, Г.П. Пинаев. Альфа-актинин-4 и субъединица p65/RelA транскрипционного фактора NF-kB в клетках А431 локализуются совместно и мигрируют в ядро при действии эпидермального фактора роста. 2004. Цитология. 46(12): 1065-1073.

В.Н. Бабаков, И.В. Кропачева, О.А. Петухова, Л.В. Туроверова, Г.П. Пинаев. Внутриклеточное распределение актин-связывающих белков, фосфорилированных по тирозину, при распластывании клеток А431 на разных лигандах. 2004. Цитология. 46(12): 1056-1064. Список, цитируемой литературы:

Галкин В.Э., Туроверова Л.В., Константинова ИМ, Пинаев Г.П. 1998а. Взаимодействие просом с фибршшярныи актином. Цитология. 40:161-166.

Галкин В.Э., Туроверова Л.В., Константинова ИМ., Пинаев Г.П. 19986. 263-рибонухлеопротеиновый комплекс (265-протеасома) непосредственно взаимодействует с фибриллярным актином. Цитология, 40: 618-626.

OA. Петухова, Л.В. Туроверова, Емельянов АН., И.В. Кропачева, Г.П. Птаев 2005. ДНК-связывающая активность транскрипционных факторов, взаимодействующих с последовательностями SRE, NF-кВ и АР-1, индуцированная адгезией клеткок А431, коррелирует с перестройками актинового цитосхелета. Цитология (в печати). '

Марзлаф У., Хуан Р. 1987. Транскрипция РНК в изолированных ядрах. В кн.: Транскрипция и трансляция. «Мир». 111-159.

Arakl N.. Наше Т. Yamada Т., Hirohashi S. 2000. Actinin-4 is preferentially involved in circular ruffling and roacropinocytosis in mouse macrophages: analysis by fluorescence ratio imaging. J Cell Sci. 113:3329-3340. Are A F„ Galkin V.E., Pospelova T.V., Pinaev G.P. 2000. The RelA/p65 submit of NF-кВ interacts with actin-containing structures. Exp. Cell Res. 256:533-544.

Backs 0., Lanini L, Serralosa J., Coll M.J., Bastos A, Aligue A, Rius E., Carafoli E. 1990. Calmodulin-binding proteins in the nuclei of quiescent and proliferatively activated rat liver cells. ] Biol Chem. 265:18595-18600. Batchelor C.L., Woodward AM., Crouch DH. 2004. Nuclear ERM (ezrin, radixin, moesin) proteins: regulation by cell density and nuclear import Exp Cell Res. 296:208-222.

Benohel A -M, Kahn-Perles, В, Imbert, J, Verrando P 1997 Insulin stimulates haptotactic migration of human epidermal keratinocytes through activation ofNF-kappa В transcription factor J CellSci 110 2089-2097 Bmhadsky, A D, Vasihev JM 1988 Cytoskeleton New York Plenum Press pp 298 Bradford MM 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding Anal Biochem 72 248-254

Cairns BR, Erdjument-Bromage H, Tempsl P, Winston F, Kornberg R.D 1998 Two actin-related proteins are shared fractional components of the chromatm-remodelmg complexes RSC and SWI/SNF Mol Cell 2 639-651 Cao Y, Rang Q, Zolkiewska A 2001 Metalloprotease-disintegnn ADAM 12 interacts with alpha actinin-1 Biochem ! 357 353-361

Christerson LВ, Vanderbitt CA, Cobb MH 1999 MEKK1 interacts with alpha-actinm and localizes to stress fibers and focal adhesions CellMotil Cytoskeleton 43 186-198

De Career G, Lallena MJ, Correas 1 1995 Protein 4 1 is a component of the nuclear matrix of mammalian cells Biochem J 312 871-877

Eck SL, Perhm ND, Carr, DP. Nabel GJ 1993 Inhibition of phorbol ester-mduced cellular adhesion by copetitive binding ofNF-kappa В m vivo Mol Cell Biol 13 6530-6536

FeramiscoJR, BurndgeK 1980 A rapid purification of alpha-actmm, filamin, and a 130,000-dalton protein from smooth muscle JBiolChem 255 1194-1199

HondaK, Yamada T, Endo R, Ino Y, GotohM, Tsuda H, Yamada Y, Chba H, lUrohashi S 1998 Actmm-4, a novel actm bundling protein associated with cell motility and car.cer invasion J Cell Biol 140 1383-1393 Honda K, Yamada T, Seike M, Hayashida Y, Idogawa M, Kondo T, Ino Y, Hirohashi S 2004 Alternative splice variant of acfinin-4 in small cell lung cancer Oncogene 23 5257-5262

Igazzuirre G, Aguirre L, Ни Га P, Lee H Y, Schlaepfer D D, Aneskievich В J, Haimovich В 2001 The cytoskeletal/non-musle isoform of alpha-actmm is phosphoiylated on its actin binding domain by the focal adhesion kmase J Biol Chem 276 28676-28685

Laemmh UK. 1970 Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 227 680-685

Mayer В J, Baltimore D 1993 Signalling through SH2 and SH3 domains Trends Cell Biol 3 8-13 Nemelh ZH, Deitch EA, Davidson MT, Szabo C, Vm ES, Hasko G 2004 Disruption of the actm cytoskeleton results in nuclear factor-kappaB activation and inflammatory mediator production in cultured human intestinal epithelial cells J Cell Physiol 200 71-81

Nikolopovlos SN, Spengler В A, Kisselbach K, Evans A E, Biedler JL, Ross R.A 2000 The human non-muscle alpha actinm protein encoded by the ACTN4 gene suppresses tumongemcity of human neuroblastoma cells Oncogene 19 380-386

NixDA, FradelmJ, BockholtS, Memchi В, LovvardD, FriedenchE, BeckerleMC 2001 Targeting of zyxin to sites of actm membrane interaction and to the nucleus J Biol Chem 276 34759-34767 Ohtsubo M, Takayanagt A, Gamou S, Shimizu N 2000 Interruption of NFkappaB-STATl signaling mediates EGF-induced cell-cycle arrest J Cell Physiol 184131-137

Otey С A, Carpen О 2004 Alpha-actinm revisited A fresh look at an old player Cell Motil Cytoskeleton 58 104-111

Palombella VJ, Rondo О J, Goldberg A L, Maniatis T 1994 The ubiquitm-proteasome pathway is required for

processing the NF-kappa В1 precursor protein and the activation ofNF-kappa В Cell 78 773-785

Pestic-Dragovich L, Stojiljkimc L, Philimonenko A A, Nowak G.KeY, Settlage RE, Shabanowitz J, Hunt D F,

Hozak P, de Lanerolle P 2000 A myosin I isoform in the nucleus Science 290 337-341

Qwarnstrom, EE, Ostberg, CO, Turk, GL, Richardson, CA, Bomsztyk, K. 1994 Fibronectin attachment

activates the NF-kappa В p50/p65 heteroduner in fibroblasts and smooth muscle cells i Biol Chem 269 30765-

30768

Schmidt A, HallM H 1998 Signalling to the actm cytoskeleton Annu Rev CellDev Biol 14 305-338

Towbm H, Staehelm T, Gordon J 1979 Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to

nitrocellulose sheets procedure and some applications Proc Natl Acad. Set USA 76 4350-4354

Woods A J, RobertsMS, ChoudharyJ, BarryST, Mazakt Y, SdbeH, MorleySJ CritchleyDR, Norman JC

2002 Prnllin associates with poly(A)-binding protein 1 at the dense endoplasmic reticulum and the leading edge of

migrating cells J Biol Chem 277 6428-6437

Xu J, Zutter, MM, Santoro, S A, Clark, RAF 1998 A three-dimensional collagen lattice activates NF-kappa В in human fibroblasts role m integnn alpha2 gene expression and tissue remodeling I Cell Biol 140 709-719 Yamada K.M,Geiger,B 1997 Molecular interactions in cell adhesion complexes Curr Opm Cell Biol 9 76-85 Yebra M, Ftlardo EJ, Bayna, EM, Kawahara, E, Becker, JC, Cheresh, DA 199} Induction of carcinoma cell migration on vitronectin by NF-kappa B-dependent gene expression Mol Biol Cell 6 841-850

Автор выражает глубокую признательность сотрудникам ОКК за помощь в работе О А Петуховой, Л В Туроверовой, И В Кропачевой, И. С. Смирновой, Д Е. Бобкову, В И. Морозову и научному руководителю Г.П Панаеву. Особенно благодарен автор Е П Подольской, Л П. Горшковой и В Н Бабаковой

Подписано в печать /5Г //¿>У, Формат 60x84/16. Печать офсетная.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая, 29.

1238 6 5

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бабаков, Владимир Николаевич

1. Введение

2. Обзор литературы В

2.1. Актиновый цитоскелет в культивируемых клетках В

2.1.1. Роль актин-связывающих белков в формировании актиновых структур

2.1.2. Регуляция взаимодействия актина и актин-связывающих белков.

2.1.3. Реорганизация актинового цитоскелета под действием внешних фактороЕ

2.2. Комплексы адгезии. Связь актиновых структур и сигнальных молекул

2.3. Участие актина и белков адгезионных контактов в ядерных событиях

2.4. Ядерно-цитоплазматический транспорт

2.5. Альфа-актинин

2.5.1. Фрагменты актинина

2.5.2. Роль а-актинина в формировании адгезионных контактов

2.5.3. Взаимодействие а-актинина с другими белками

2.5.4. Взаимодействие с Р1Р2/Р1Рз и Р13-киназой

2.5.5. Участие а-актинина в сигнальных системах

2.6. Транскрипционный фактор NF-kB. Участие в процессах адгезии

2.6.1. Регуляция активности транскрипционного комплекса NF-kB

2.6.2. Сигнальные каскады, вовлеченные в активацию NF-kB

2.7. Цели и задачи работы

3. Материалы и методы

3.1. Культивирование клеток

3.2. Трансфекция клеток

3.3. Получение субстратов

3.4. Иммунофлуоресценция

3.5. Электронная микроскопия

3.6. Субклеточное фракционирование

3.7. Иммунопреципитация

3.8. Электрофорез и иммуноблотинг

3.9. Получение клеточных экстрактов для аффинной хроматографии

3.10. Аффинная хроматография на колонке с иммобилизованным а-актинином

3.11. Блот-оверлей

3.12. Выделение ядерных экстрактов

1 3.12. Анализ ДНК-связывающей активности NF-кВ в ядерных экстрактах

4. Результаты

4.1. Распределение белков, фосфорилированных по тирозину npi 46 взаимодействии клеток А-431 с иммобилизованными лигандами

4.2. а-Актинин способен фосфорилироваться по тирозину и взаимодействует < 50 FAK

4.3. Распределение изоформ а-актинина и р65 субъединицы NF-кВ в клетка? 55 А-431 и НЕК

4.3.1. Действие цитохалазина D и вортманнина на клетки сопровождается 61 перераспределением p65/RelA и а-актинина

4.3.2. Распределение а-актинина-1 и а-актинина-4, слитых с GFP

4.4. Электронная микроскопия клеток А431, распластанных на фибронектине i 64 обработанных ЭФР

4.5. Субклеточное распределение р65 и р50 в клетках А

4.6. Взаимодействие p65/RelA с актинином in vitro

4.6.1. а-Актинин формирует комплексы с NF-кВ при иммунопреципитации

4.6.2. Аффинная хроматография на колонке с иммобилизованным а-актинином

4.6.3. Определение фрагмента а-актинина, ответственного за связывание с NF 72 кВ

4.7. Взаимодействие а-актинина-4 и NF-кВ в ядре

4.7.1. Иммунопреципитация из ядерных экстрактов

4.7.2. Исследование ДНК-связывающей активности NF-kB

5. Обсуждение

6. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие изоформ α-актинина с транскрипционным фактором ReiA/NF-kB"

Одной из важных и активно развивающихся областей клеточной биологии является изучение актинового цитоскелета и его участия в регуляторных процессах. Цитоскелет играет значительную роль в поддержании формы клетки и в осуществлении многих её двигательных реакций, обеспечивающих такие клеточные функции, как деление, эндо- и экзоцитоз, перемещение клеток в пространстве, контакт их с субстратом и с другими клетками (Bershadsky, Vasiliev, 1988). В последнее время появилось много работ свидетельствующих об участии цитоскелета в регуляции экспрессии генов и проведении сигнала с поверхности клетки на ядро (Schmidt and Hall, 1998). Малые ГТФ-азы активируемые при взаимодействии лиганда с рецептором могут изменять пространственную организацию актинового цитоскелета (Ridley et al., 1992) через актин-связывающие белки, что может являться способом передачи сигнала в ядро, так как способность цитоскелета принимать различные формы пространственной организации может обеспечивать специфичность передаваемой информации (Puck et al., 1992). Однако, несмотря на большое число работ, посвященных роли цитоскелета в процессе передачи сигнала, роль самого цитоскелета до сих пор неясна. Большинство работ опираются на эксперименты, полученные при разрушении цитоскелета цитохалазином или нокодазолом (Арнаутов и Никольский, 1998), что по нашему мнению дает не всегда дает адекватные результаты. В литературе имеется мало работ, доказывающих непосредственное участие актинового цитоскелета и актин-связывающих белков в этих процессах.

Ряд сигнальных молекул непосредственно связывается с цитоскелетом (Yamada, Geiger, 1997). Белки цитоскелета и сигнальные молекулы имеют общие домены, предназначенные для белок-белковых взаимодействий (Mayer, Baltimore, 1993). Эти взаимодействия могут изменять конформацию белков цитоскелета и приводить к его пространственной реорганизации. Можно предполагать, что реорганизация является специфической реакцией цитоскелета на сигналы, поступающие в клетку от разных лиганд/рецепторных комплексов. К настоящему времени в литературе накоплено много данных, свидетельствующих о том, что действие разных лигандов на клетку вызывает перестройку актинового цитоскелета.

Однако, все эти данные были получены на разных клеточных линиях и в разных условиях, что не позволяет выявить какие-либо закономерности в реакции актинового цитоскелета. До настоящего времени остается неясным, какую роль цитоскелет играет в сложной системе биохимических каскадов сигнальных молекул и в активации генома. Является ли цитоскелет непосредственным передатчиком сигнала или матрицей, на которой формируются сложные сигнальные комплексы или, наконец, направляющими, по которым происходит перемещение белковых комплексов в ядро. На этот очень важный вопрос еще только предстоит ответить.

Трудности изучения данной проблемы обусловлены высокой естественной динамичностью актинового цитоскелета, присущей ему способностью перестраиваться в ответ на разнообразные воздействия. В частности, неопластическая трансформация приводит к значительным изменениям в состоянии актиновых филаментов (Bershadsky, Vasiliev, 1988). В последние годы важную роль в регуляции структуры актинового цитоскелета отводят членам Rho-семейства малых ГТФаз (Hall, 1994; Machesky and Hall, 1996), которые сами являются онкогенами или критическими участниками Ras-зависимых сигнальных путей, ведущих к трансформации (Zohn, 1998). Кроме того, поскольку на клетки, как в составе ткани, так и в условиях культуры, одновременно действует множество разнообразных лигандов, трудно вычленить результат действия только одного из них. В связи с этим возникает необходимость использования упрощенной и, в то же время, приближенной к естественным условиям животного организма модели, позволяющей вести наблюдение за результатом конкретного лиганд/рецепторного взаимодействия. В качестве такой модели может быть предложен естественный процесс адгезии клетки на субстрате, но в условиях, когда клетка прикрепляется и распластывается только на определенном иммобилизованном лиганде (Арэ, 2000). Этот подход дает возможность изучать реакцию системы микрофиламентов на активацию конкретных поверхностных рецепторов клетки, в том числе рецепторов, в норме не участвующих в адгезии. К таковым следует отнести рецепторы инсулина, тромбина, эпидермального, тромбоцитарного, фибробластного и других факторов роста, для которых показано взаимодействие с системой микрофиламентов (Carlsson et al., 1979, Mellstrom et al., 1983, Bochus and Stiles, 1984, Paves et al., 1990, Vouret-Craviari et al., 1998). С помощью такого подхода представлялось возможным установить степень зависимости организации актинового цитоскелета от действия на клетку различных иммобилизованных и свободных лигандов и выяснить, в какой степени распределение в клетке некоторых сигнальных молекул может быть связано с преобразованием актиновых структур.

В связи с этим в данной работе было предпринято исследование влияния элементов внеклеточного матрикса (ВКМ) фибронектина, ламинина 2/4 и антител к рецептору ЭФР при адгезии к ним клеток А431 на процессы фосфорилирования по тирозину ряда актин-связывающих белков, участвующих в формировании фокальных контактов. Особый интерес представляло выяснение роли взаимодействия транскрипционного фактора NF-кВ с актиновым цитоскелетом (Are et al., 2000). В данной работе было предпринято исследование механизмов взаимодействия транскрипционного фактора NF-кВ с актиновым цитоскелетом. В нашей лаборатории было показано, что транскрипционный фактор NF-кВ может ассоциироваться с актином in vitro и in vivo (Are et al., 2000). Кроме того, было установлено, что важный элемент деградации ингибиторной субъединицы 1кВ-а и активации NF-кВ - протеасомы - способен прямо взаимодействовать с F-актином (Галкин и др., 1998а, 19986, 1999, 2000). В связи с тем, что р65-субъединица NF-кВ обнаружена в числе других белков, взаимодействующих с актином, оставался неясным следующий вопрос: взаимодействует ли NF-кВ с актиновым цитоскелетом прямо или его взаимодействие опосредуется какими-либо актин-связывающими белками? Несмотря на большое число работ, посвященных транскрипционному фактору NF-кВ, мало известно о его цитоплазматической локализации и путях транспорта его в ядро. Кроме того, специфические компоненты сигнальных каскадов, ответственные за регуляцию NF-кВ, в большой степени неизвестны. Мы предположили, что взаимодействие NF-кВ с актиновым цитоскелетом может осуществляться через а-актинин - актин-связывающий белок, найденный в фокальных и межклеточных контактах и вдоль актиновых филаментов. Кроме того, протеинкиназа МЕКК1, которая является одним из активаторов NF-кВ, прямо взаимодействует с а-актинином (Christerson et al., 1999). В немышечных клетках присутствуют две изоформы а-актинина (Otey, Carpen, 2004): а-актинин-1 и недавно открытая изоформа а-актинин-4 (Honda et al., 1998), и вполне вероятно, что NF-кВ может взаимодействовать только с одной из этих изоформ. Поэтому в данной работе предпринята попытка определить роль фосфорилирования по тирозину ряда актин-связывающих белков в процессе формирования фокальных контактов и в процессах активации транскрипционного фактора NF-kB.

2. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Бабаков, Владимир Николаевич

6. Выводы:

1. Немышечный а-актинин способен фосфорилироваться по тирозину киназой фокальных контактов при адгезии клеток А431 на фибронектине, ламинине 2/4 и антителах к рецептору ЭФР. Фосфорилирование а-актинина не влияет на связывание с NF-kB.

2. В клетках эпидермоидной карциномы человека линии А431 и в эмбриональных клетках почки человека линии НЕК293 p65/RelA субъединица транскрипционного фактора NF-кВ локализуется совместно с а-актинином-4. При действии на клетки цитохалазина D или вортманнина часть клеточного пула этих белков накапливается в ядре. При действии на клетки активаторов NF-кВ, а-актинин-4 и p65/RelA совместно мигрируют в ядро. а-Актинин-4, но не а-актинин-1, способен накапливаться в ядре при действии на клетки активаторов NF-kB.

3. а-Актинин-4, но не а-актинин-1, способен формировать иммунные комплексы с субъединицами p65/RelA и р50 NF-кВ и не формирует с их ингибиторной субъединицей 1кВ-а.

4. р65 и р50 субъединицы NF-кВ, но не ингибиторная субъединица 1кВ-а способны связываться с иммобилизованным на колонке гладкомышечным а-актинином. Все субъединицы комплекса NF-кВ могут взаимодействовать с полноразмерным а-актинином, но только р65 субъединица взаимодействует с 53 кДа фрагментом а-актинина.

5. Комплекс NF-кВ и а-актинина-4, выявляемый реакцией иммунопреципитации, сохраняется в ядерных экстрактах. Антитела к а-актинину-4 препятствуют формированию ряда ДНК-белковых комплексов при взаимодействии белков ядерных экстрактов с олигонуклеотидом, специфичным для NF-kB.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бабаков, Владимир Николаевич, Санкт-Петербург

1. Арнаутов A.M., Никольский Н.Н. 1998. Транспорт в ядро изоформ р42 и р44 MAP киназы, вызванный фактором роста, требует наличия интактного актинового цитоскелета. Цитология. 40 (7): 639-647.

2. Арэ А.Ф. 2000. Взаимодействие поверхностных рецепторов клетки с различными иммобилизованными и свободными лигандами определяет структуру актинового цитоскелета. Диссертация на соискание ученой степени канд. биол. наук. С.-Петербург.

3. Галкин В. Э. 1999. Взаимодействие протеасом и а-РНП частиц с фибриллярным актином. Диссертация на соискание ученой степени канд. биол. наук. С.-Петербург.

4. Галкин В.Э., Туроверова Л.В., Константинова И.М., Пинаев Г.П. 1998а. Взаимодействие просом с фибриллярныи актином. Цитология. 40: 161-166.

5. Галкин В.Э., Туроверова Л.В., Константинова И.М., Пинаев Г.П. 19986. 26S-рибонуклеопротеиновый комплекс (268-протеасома) непосредственно взаимодействует с фибриллярным актином. Цитология. 40: 618-626.

6. Железнова Н.Н., Меликова М.С., Харченко М.В., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С. 2003. Роль фосфатидилинозитол-3-киназ p85/pl 10 и hVPS34 в эндоцитозе ЭФР-рецепторных комплексов. Цитология 45: 574-581.

7. Марзлаф У., Хуан Р. 1987. Транскрипция РНК в изолированных ядрах. В кн.: Транскрипция и трансляция. «Мир». 111-159.

8. Сорокин А.Б., Нестеров A.M., Соркин А.Д., Игнатова Т.Н., Галактионов К.И., Кудрявцева Н.В. 1989. Получение и характеристика моноклональных антител к наружному домену рецептора ЭФР эпидермоидной карциномы человека А431. Цитология. 31: 549-555.

9. Are A.F., Galkin V.E., Pospelova T.V., Pinaev G.P. 2000. The RelA/p65 subunit of NF-кВ interacts with actin-containing structures. Exp. Cell Res. 256: 533-544.

10. Are A., Pinaev G., Burova E., Lindberg U. 2001. Attachment of A431 cells on immobilized antibodies to the EGF receptor promotes cell spreading and reorganization of the microfilament system. Cell Motil. Cytoskelet. 48: 24-36.

11. A.Asada M, Irie K, Morimoto K, Yamada A, Ikeda W, Takeuchi M, Takai Y. 2003. ADIP, a novel Afadin- and alpha-actinin-binding protein localized at cell-cell adherens junctions. 3 Biol Chem 278:4103- 4111.

12. Ash, J.F., Louvard, D., Singer, S.J. 1977. Antibody-induced linkages of plasma membrane proteins to intracellular actomyosin-containing filaments in cultured fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74: 5584-5588.

13. Batchelor C.L., Woodward A.M., Crouch D.H. 2004. Nuclear ERM (ezrin, radixin, moesin) proteins: regulation by cell density and nuclear import. Exp Cell Res. 296:208-222.

14. Benoliel, A.-M., Kahn-Perles, В., Imbert, J., Verrando, P. 1997. Insulin stimulates haptotactic migration of human epidermal keratinocytes through activation of NF-kappaB transcription factor. J. Cell Sci. 110: 2089-2097.

15. Ben-Ze'ev A. 1997. Cytoskeletal and adhesion proteins as tumor suppressors. Curr Opin Cell Biol. 9:99-108.

16. Beraud C, Henzel WJ, Baeuerle PA. 1999. Involvement of regulatory and catalytic subunits of phosphoinositide 3-kinase in NF-kappaB activation. Proc Natl Acad Sci USA. 96:429-434.

17. Bershadsky, A.D., Vasiliev, J.M. 1988. Cytoskeleton. New York: Plenum Press, pp. 298.

18. Bockus, B.J., Stiles, C.D. 1984. Regulation of cytoskeletal architecture by platelet-derived growth factor, insulin and epidermal growth factor. Exp. Cell Res. 153: 186-197.

19. Bourguignon, L.Y.W., Bourguignon, G.J. 1984. Capping and the cytoskeleton. Int. Rev. Cyt. 87: 195-224.

20. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.

21. Cao Y., Kang Q., Zolkiewska A. 2001. Metalloprotease-disintegrin ADAM 12 interacts with alpha-actinin-1. Biochem J. 357 : 353-361.

22. Carlsson L, Nystrom LE, Lindberg U, Kannan KK, Cid-Dresdner H, Lovgren S. 1976. Crystallization of a non-muscle actin. J Mol Biol. 105:353-66.

23. Chan, А.Г., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J.B., Segall, J.E., Condeelis, J.S. 1998. EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells. J. Cell Sci. Ill: 199211.

24. Chen N.X., Geist D.J., Genetos D.C., Pavalko F.M., Duncan R.L. 2003. Fluid shear-induced NFkappaB translocation in osteoblasts is mediated by intracellular calcium release. Bone. 33:399-410.

25. Christerson L.B., Vanderbilt C.A., Cobb M.H. 1999. MEKK1 interacts with alpha-actinin and localizes to stress fibers and focal adhesions. Cell Motil Cytoskeleton. 43:186-198.

26. Clark T.G., Merriam R.W. 1977. Diffusible and bound actin nuclei of Xenopus laevis oocytes. Cell. 12:883-991.

27. Corgan A.M., Singleton C„ Santoso C.B., Greenwood J. A. 2004. Phosphoinositides differentially regulate alpha-actinin flexibility and function. Biochem J. 378 -.1067-1072.

28. Crawford A.W., Michelsen J.W., Beckerle M.C. 1992. An interaction between zyxin and alpha-actinin. J Cell Biol 116:1381-1393.

29. AA.Danilinc S., Bitterman H., Rahat M.A., Kinarty A., Rosenzweig D., Nitza L. 2003. Hypoxia inactivates inducible nitric oxide synthase in mouse macrophages by disrupting its interaction with alpha-actinin 4. J Immunol 171:3225-3232.

30. M.Deng J., Miller S.A., WangH.Y., Xia W., Wen Y., ZhouB.P., Li Y., Lin S.Y., Hung M. C. 2002. beta-catenin interacts with and inhibits NF-kappa В in human colon and breast cancer. Cancer Cell. 2:323-334.

31. DiDonato, J.A., Hayakawa M., Rothwarf D.M., Zandi E., and Karin M. 1997. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature.388:548-554.

32. Eck, S.L., Perkins, N.D., Carr, D.P., Nabel, G.J. 1993. Inhibition ofphorbol ester-induced cellular adhesion by competitive binding of NF-kappa В in vivo. Mol. Cell Biol. 13:6530-6536.

33. El-Husseini A.E., Kwasnicka D., Yamada Т., Hirohashi S., Vincent S.R. 2000. BERP, a novel ring finger protein, binds to alpha-actinin-4. Biochem Biophys Res Commun. 267:906-911.

34. Feng S., Resendiz J.C., Christodoulides N., Lu X., Arboleda D., Berndt M.C., Kroll M.H. 2002. Pathological shear stress stimulates the tyrosine phosphorylation of alpha-actinin associated with the glycoprotein Ib-IX complex. Biochemistry 41:1100-1108.

35. Feramisco J.R., Burridge K. 1980. A rapid purification of alpha-actinin, filamin, and a 130,000-dalton protein from smooth muscle. J Biol Chem. 255 :1194-1199.

36. Garcia-Garcia E., Sanchez-Mejorada G., Rosales C. 2001. Phosphatidylinositol 3-kinase and ERK are required for NF-kappaB activation but not for phagocytosis. J Leukoc Biol. 70:649-658.

37. Gautreau A, Louvard D, Arpin M. 2002 ERM proteins and NF2 tumor suppressor: the Yin and Yang of cortical actin organization and cell growth signaling. Curr Opin Cell Biol. 14:104-9.

38. Geiger, В., Yehuda-Levenberg, S., Bershadsky, A.D. 1995 Molecular interactions in the submembrane plaque of cell-cell and cell-matrix adhesions. Acta Anat. 154: 46-62.

39. Gonzalez A.M., Otey C„ Edlund M., Jones J.C. 2001. Interactions of a hemidesmosome component and actinin family members. J Cell Sci. 114: 4197-4206.

40. Gorlich D, Kutay U. 1999. Transport between the cell nucleus and the cytoplasm. Annu Rev Cell Dev Biol 15:607-660.

41. Gounon P., Karsenti E. 1981. Involvement of contractile proteins in the changes in consistency of oocyte nucleoplasm of the newt Pleurodeles waltlii. J Cell Biol. 88:410-421.

42. Greene D.K., Tumova S., Couchman J.R., Woods A. 2003. Syndecan-4 associates with alpha-actinin. J Biol Chem 278:7617-7623.

43. Greenwood J.A., Theibert А.В., Prestwich G.D., Murphy-Ullrich J.E. 2000. Restructuring of focal adhesion plaques by PI 3-kinase. Regulation by Ptdlns (3,4,5)-p(3) binding to alpha-actinin. J Cell Biol 150:627- 642.

44. Greenwood J.A. 2003. Phosphoinositide binding inhibits alpha-actinin bundling activity. J Biol Chem 278:24039 -24045.

45. Hall, A. 1994. Small GTP-binding proteins and the regulation of the actin cytoskeleton. Annu. Rev. Cell Biol. 10: 31-54.

46. Hartwig J.H., Kwiatkowski D.J. 1991 Actin-binding proteins. Curr Opin Cell Biol. 3:87-97.bA.Hayden M.S., Ghosh S. 2004. Signaling to NF-kappaB. Genes Dev. 18:2195-2224.

47. Hedberg, K.M., Bengtsson, Т., Safiejko-Mroczka, В., Bell, P.B., Lindroth, M. 1993. PDGF and neomycin induce similar changes in the actin cytoskeleton in human fibroblasts. Cell Motil. Cytoskelet. 24: 139-149.

48. Heiska L., Kantor C., Parr Т., Critchley D.R., Vilja P., Gahmberg C.G., Carpen O. 1996. Binding of the cytoplasmic domain of intercellular adhesion molecule-2 (ICAM-2) to alpha-actinin. J Biol Chem 271:26214 -26219.

49. Herrenknecht К., Ozawa M, Eckerskorn С., Lottspeich F., Lenter M., Kemler R. 1991. The uvomorulin-anchorage protein alpha catenin is a vinculin homologue. Proc Natl Acad Sci USA. 88:9156-9160.

50. Honda K., Yamada Т., Endo R., Ino Y., Gotoh M., Tsuda H., Yamada Y., Chiba H., Hirohashi S. 1998. Actinin-4, a novel actin-bundling protein associated with cell motility and cancer invasion. J Cell Biol. 140: 1383-1393.

51. Is las S., Vega J., Ponce L., Gonzalez-Mariscal L. 2002. Nuclear localization of the tight junction protein ZO-2 in epithelial cells. Exp Cell Res. 274 :138-148.

52. Kim J.H., Lee-Kwon W., Park J.B., Ryu S.H., Yun C.H., Donowitz M. 2002. Ca(2)-dependent inhibition of Na/H exchanger 3 (NHE3) requires an NHE3-E3KARP-alpha-actinin-4 complex for oligomerization and endocytosis. J Biol Chem 277:23714-23724.

53. Kimura Т., Hashimoto /., Yamamoto A., Nishikawa M., Fujisawa J.I. 2000. Rev-dependent association of the intron-containing HIV-1 gag mRNA with the nuclear actin bundles and the inhibition of its nucleocytoplasmic transport by latrunculin

54. B. Genes Cells. 5:289-307.

55. Knudsen K.A., Soler A.P. Johnson K.R., Wheelock M.J. 1995. Interaction of alpha-actinin with the cadherin/catenin cell-cell adhesion complex via alpha-catenin. J Cell Biol 130:67-77.

56. Krappmann, D., F. Emmerich, U. Kordes, E. Scharschmidt, B. Dorken, and

57. C.Scheidereit. 1999. Molecular mechanisms of constitutive NF-kappaB/Rel activation in Hodgkin/Reed-Sternberg cells.Oncogene. 18:943-953.

58. Ze.Krauss S. W., Chasis J.A, Rogers C, Mohandas N, Krockmalnic G, Penman S.1997. Structural protein 4.1 is located in mammalian centrosomes. Proc Natl Acad Sci USA. 94:7297-7302.

59. Kremerskothen J., Teber I., Wendholt D., Liedtke Т., Bockers T.M., Barnekow A. < 2002. Brain-specific splicing of alpha-actinin 1 (ACTN1) mRNA. Biochem

60. Biophys Res Commun. 295:678-681.

61. Kwiatkovska, K., Khrebtukova, I.A., Gudkova, D.A., Pinaev, G.P., Sobota, A. 1991. Actin-binding proteins involved in the capping of epidermal growth factor receptors in A-431 cells. Exp. Cell Res. 196: 255-263.

62. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.

63. Lallena M.J., Martinez C., Valcarcel J., Correas I. 1998. Functional association of nuclear protein 4.1 with pre-mRNA splicing factors. J Cell Sci. 111:1963-1971.

64. Las sing I., Lindberg U. 1985. Specific interaction between phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate and profilactin. Nature. 314 : 604-606.

65. Lazarides E., Lindberg U. 1974. Actin is the naturally occurring inhibitor of deoxyribonuclease I. Proc Natl Acad Sci USA. 71:4742-6.

66. Ling, L., Z. Cao, D.V. Goeddel. 1998. NF-kB-inducing kinase activates IKKa by phosphorylation of Ser 176. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 3792-3797.

67. Luikart S., Masri M., Wahl D., Hinkel Т., Beck J.M., Gyetko M.R., Gupta P., Oegema T. 2002. Urokinase is required for the formation of mactinin, an alpha-actinin fragment that promotes monocyte/macrophage maturation. Biochim Biophys Acta. 1591: 99-107.

68. LuikartS., WahlD., MasriM., Oegema T. 1999. A fragment of a-actinin promotes• monocyte/macrophage in vitro. Exp. Hematol. 27 : 337-344.

69. Lundblad, JR., R.P. Kwok, M. E. Laurance, M.L. Harter, and R. H. Goodman.1995. Adenoviral ElA-assoeiated protein p300 as a functional homologue of thetranscriptional co-activator СВР. Nature (London) 374: 85-88.

70. Machesky, L.M., Hall, A. 1996. Rho: a connection between membrane receptor signalling and the cytoskeleton. Trends Cell. Biol. 6: 304-310.

71. Matsudaira P, Janmey P. 1988. Pieces in the actin-severing protein puzzle. Cell. 54:139-40.

72. Matsudaira P. 1994 The fimbrin and alpha-actinin footprint on actin. J Cell Biol. 126:285-7.

73. Mattaj IW, Englmeier L. 1998. Nucleocytoplasmic transport: the soluble phase. Annu Rev Biochem. 67:265-306.

74. Mayer, B.J., Baltimore, D. 1993. Signalling through SH2 and SH3 domains. Trends Cell Biol. 3: 8-13.

75. G. Pascual, A. Motiwala, H. Zhu, M. Mann and A.M. Manning. 1999. IkappaB * kinase (IKK)-associated protein 1, a common component of the heterogeneous

76. K complex. Mol. Cell. Biol. 19:1526-1538.

77. Mercurio, F., H. Zhu, B.W. Murray, A. Shevchenko, B. L. Bennet, J. Li, D.B. Young, M. Barbosa, M. Mann, A. Manning and A. Rao. 1997. IKK-1 and IKK-2: cytokine-activated IkappaB kinases essential for NF-kappaB activation. Science 278:860-866.

78. Miller B.S., Zandi E. 2001. Complete reconstitution of human IkappaB kinase (IKK) complex in yeast. Assessment of its stoichiometry and the role of IKKgamma on the complex activity in the absence of stimulation. J Biol Chem. 276:36320-36326.

79. Miyamoto, S., Teramoto, H., Coso, O.A., Gutkind, J.S., Burbelo, P.D., Akiyama, S.K., Yamada, K.M. 1995. Inegrin function: molecular hierarchies of cytoskeletal and signaling molecules. J. Cell Biol. 131: 791-805.

80. Mukai H, Toshimori M, Shibata H, Takanaga H, Kitagawa Mr Miyahara M, Shimakawa M, Ono Y. 1997. Interaction of PKN with alpha-actinin. J Biol Chem 272:4740—4746.

81. Mykkanen O.M., Gronholm M., Ronty M, Lalowski M., Salmikangas P., Suila H., Carpen O. 2001. Characterization of human palladin, a microfilament-associated protein. Mol Biol Cell 12:3060-3073.

82. Nakano, #., M. Shindo, S. Sakon, S. Nishinaka, M. Mishara, H.Yagita, K. Okumura. Differential regulation of IkB kinase a and b by two upstream kinases and mitogen-activated protein kinase/ERK kinase-kinase 1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3537-3542.

83. Narayanan R., Higgins K.A., Perez J.R., Coleman T.A., Rosen C.A. 1993. Evidence for differential functions of the p50 and p65 subunits of NF-kappa В

84. Niggli V., Djafarzadeh S., Keller H. 1999. Stimulus-induced selective association of actin-associated proteins (alpha-actinin) and protein kinase С isoforms with the cytoskeleton of human neutrophils. Exp Cell Res. 250:558-568.

85. Nikolopoulos S.N., Spengler B.A., Kisselbach K., Evans A.E., Biedler J.L., Ross R.A. 2000. The human non-muscle alpha-actinin protein encoded by the ACTN4 gene suppresses tumorigenicity of human neuroblastoma cells. Oncogene. 19 : 380-386.

86. Nix D.A., Beckerle M.C. 1997. Nuclear-cytoplasmic shuttling of the focal contact protein, zyxin: a potential mechanism for communication between sites of cell adhesion and the nucleus. J Cell Biol. 138:1139-1147.

87. Nix D.A., Fradelizi J., Bockholt S., Menichi В., Louvard D., Friederich E., Beckerle M. C. 2001. Targeting of zyxin to sites of actin membrane interaction and to the nucleus. J Biol Chem. 276:34759-34767.

88. Ohtsubo M., Takayanagi A., Gamou S., Shimizu N. 2000. Interruption of NFkappaB-STATl signaling mediates EGF-induced cell-cycle arrest. J Cell Physiol. 184:131-137.

89. Olave I.A., Reek-Peterson S.L., Crabtree G.R 2002. Nuclear actin and actin-related proteins in chromatin remodeling. Annu Rev Biochem.71:755-781

90. Olsnes S, Klingenberg O, Wiedlocha A. 2003. Transport of exogenous growth factors and cytokines to the cytosol and to the nucleus. Physiol Rev 83:163-182.

91. Otey C.A., Carpen O. 2004. Alpha-actinin revisited: A fresh look at an old player. Cell Motil Cytoskeleton. 58: 104-111.

92. Otey C.A., Pavalko F.M., Burridge K. 1990. An interaction between alpha-actinin and the beta 1 integrin subunit in vitro. J Cell Biol 111 :721-729.

93. Ozes, O.N., L.D. Mayo, J. A. Gustin, S.R. Pfeffer, L.M. Pfeffer, and D.B. Donner. 1999. NF-kappaB activation by tumour necrosis factor requires the Akt serine-threonine kinase. Nature. 401:82-85.

94. Palm S.L., Furcht L.T. 1983 Production of laminin and fibronectin by Schwannoma cells: cell protein interactions in vitro and protein localization in peripheral nerve in vivo. J. Cell Biol. 96: 1218-1226.

95. Palombella V.J., Rando O.J., Goldberg A.L., Maniatis T. 1994. The ubiquitin-proteasome pathway is required for processing the NF-kappa B1 precursor protein and the activation of NF-kappa B. Cell. 78: 773-785.

96. Parast M.M., Otey C.A. 2000. Characterization of palladin, a novel protein localized to stress fibers and cell adhesions. J Cell Biol 150:643- 656.

97. Patrie K.M., Drescher A.J., Welihinda A., Mundel P., Margolis B. 2002. Interaction of two actin-binding proteins, synaptopodin and alpha-actinin-4, with the tight junction protein MAGI-1. J Biol Chem277:30183-30190.

98. Pavalko F.M., LaRoche S.M. 1993. Activation of human neutrophils induces an interaction between the integrin beta 2-subunit (CD 18) and the actin binding protein alpha-actinin. J Immunol 151:3795-3807.

99. Paves, H„ Neuman, Т., Metsis, M., Saarma, M. 1990. Nerve growth factor-induced rapid reorganization of microfilaments in PC 12 cells: Possible roles of different second messenger systems. Exp. Cell Res. 186. 218-226.

100. Pawson, T. 1995. Protein modules and signalling networks. Nature. 373: 573-580.

101. Pederson T, Aebi U. 2003. Actin in the nucleus, what form and what for? J Struct Biol; 140:3-9.

102. Percipalle P, Zhao J, Pope B, Weeds A, Lindberg U, Daneholt B. 2001 Actin bound to the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein hrp36 is associated with Balbiani ring mRNA from the gene to polysomes. J Cell Biol. 153:229-36.

103. Perona, R., Montaner, S., Saniger, L., Sanchez-Perez, /., Bravo, R., Lacal, J.C. 1997. Activation of the nuclear factor-kappa В by Rho, Cdc42, and Rac-1 proteins. Genes Dev. 11: 463-475.

104. Pestic-Dragovich L., Stojiljkovic L., Philimonenko A.A., Nowak G., Ke Y., Settlage R.E., Shabanowitz J., Hunt D.F., Hozak P., de Lanerolle P. 2000. A myosin I isoform in the nucleus. Science. 290 :337-341.

105. Petit V., Thiery J.P. 2000. Focal adhesions: structure and dynamics. Biol Cell. 92:477-494.

106. Pollard T.D., Cooper J.A. 1986. Actin and actin-binding proteins. A critical evaluation of mechanisms and functions. Annu Rev Biochem.55:987-1035.

107. Pomies P, Louis HA, Beckerle MC. 1997. CRP1, a LIM domain protein implicated in muscle differentiation, interacts with alpha-actinin. J Cell Biol 139:157-168.

108. Риск, T.T., Krystosek, A. 1992. Role of the cytoskeleton in genome regulation and cancer. Int. Rev. Cyt. 132: 75-108.

109. Qwarnstrom, E.E., Ostberg, C.O., Turk, G.L., Richardson, C.A., Bomsztyk, K. 1994. Fibronectin attachment activates the NF-kappa В p50/p65 heterodimer in fibroblasts and smooth muscle cells. J. Biol. Chem. 269: 30765-30768.

110. Rando О J, Zhao K, JanmeyP, Crabtree GR. 2002. Phosphatidylinositol-dependent actin filament binding by the SWI/SNF-like BAF chromatin remodeling complex. Proc Natl Acad Sci USA. 99:2824-2829.

111. Regnier, C.H., H.Y. Song, X. Gao, D. V. Goeddel, Z. Cao, and M. Rothe. 1997. Identification and characterization of an IkappaB kinase. Cell. 90:373-383.

112. Resendiz J.C., Feng S., Ji G., Kroll M.H. 2004. von Willebrand factor binding to platelet glycoprotein Ib-IX-V stimulates the assembly of an alpha-actinin-based signaling complex. J Thromb Haemost 2:161-169.

113. Ridley, A.J., Hall, A. 1992. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in responce to growth factors. Cell. 70: 389-399.

114. Romashkova, J.A. and S. S. Makarov. 1999. NF-kappaB is a target of АКТ in anti-apoptotic PDGF signalling. Nature. 401:86-90.

115. Ruoslahti E, Vuento M, Engvall E. 1978. Interaction of fibronectin with antibodies and collagen in radioimmunoassay. Biochim Biophys Acta 534: 210218.

116. Rustom A., Sqffrich R., Markovic I., Walther P., Gerdes H.H. 2004. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303:10071010.

117. Schmidt A., Hall M. H. 1998. Signalling to the actin cytoskeleton. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14: 305-338

118. Sen R., Baltimore D. 1986. Inducibility of к immunoglobulin enhancer-binding protein NF-kB by a post-translational mechanism. Cell. 47:921-928.

119. Shibasaki F., Fukami K., Fukui Y., Takenawa T. 1994. Phosphatidylinositol 3-kinase binds to alpha-actinin through the p85 subunit. Biochem J 302:551-557.

120. Singer /./., Kawka, D.W., Scott, S., Mumford, R.A., Lark, M.W. 1987. The fibronectin cell attachment sequence Arg-Gly-Asp-Ser promotes focal contact formation during early fibroblast attachment and spreading. J. Cell Biol. 104: 573-584.

121. Sobue K., Fugio, Y., Kanda, K. 1988. Tumor promoter induces reorganization of actin filaments and calspectin (fodrin or nonerythroid spectrin) in 3T3 cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 482-486.

122. Tarn W.F., Sen J., Sen R. 2001. NF-kappa В in cell life and death. In books: Transcription factors: normal and malignant development in blood cells. 551-570. Wiley-Liss, Inc.

123. Tanaka M., Fuentes M.E., Yamaguchi K, Durnin M.H., Dalrymple S.A., Hardy K.L., Goeddel D.V. 1999. Embryonic lethality, liver degeneration, and impaired NF-kappa В activation in IKK-beta-deficient mice. Immunity. 10 : 421429.

124. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 4350-4354.

125. Vallenius Т., Luukko K, Makela T.P. 2000. CLP-36 PDZ-LIM protein associates with nonmuscle alpha-actinin-1 and alpha-actinin-4. J Biol Chem 275:11100-11105.

126. VanhaesebroeckB, Leevers S.J, Panayotou G., Waterfield M.D. 1997. Phosphoinositide 3-kinases: a conserved family of signal transducers. Trends Biochem Sci. 22:267-272.

127. Vouret-Craviari, V., Boquet, P., Pouyssegur, J., Van Obberghen-Schilling, E. 1998. Regulation of the actin cytoskeleton by thrombin in human endothelial cells: role of Rho proteins in endothelial barrier function. Mol. Biol. Cell. 9: 2639-2653.

128. Wachsstock D.H., Wilkins J.A., Lin S. 1987. Specific interaction of vinculin with alpha-actinin. Biochem Biophys Res Commun 146:554 -560.

129. Wada A., Fukuda M, Mishima M., Nishida E. 1998. Nuclear export of actin: a novel mechanism regulating the subcellular localization of a major cytoskeletal protein. EMBO J 17:1635-1641.

130. Walikonis R.S., Oguni A., Khorosheva E.M., Jeng C.J., Asuncion F.J., Kennedy M.B. 2001. Densin-180 forms a ternary complex with the (alpha)-subunit of Ca2/calmodulin-dependent protein kinase II and (alpha)-actinin. J Neurosci 21:423-433.

131. Wang, D„ A.S. Baldwin. 1998. Activation of NF-kB ^dependent transcription factor by tumor-necrosis factor-alpha is mediated through phosphorylation of RelA/p65 on serine 529. J. Biol. Chem. 273: 29411-29416.

132. Weed S.A., Parsons J.Т. 2001 Cortactin: coupling membrane dynamics to cortical actin assembly. Oncogene. 20:6418-34.

133. Wei Y, Renard C.A., Labalette C„ Wu Y, Levy L„ Neuveut C., Prieur X, Flajolet M., Prigent S., Buendia M.A. 2003. Identification of the LIM protein FHL2 as a coactivator of beta-catenin. J Biol Chem. 278:5188-5194.

134. Westermark, В., Magnusson, A., Heldin, C.-H. 1982. Effect of epidermal growth factor on membrane motility and cell locomotion in cultures of human clonal glioma cells. J. Neurosci. Res. 8: 491-507.

135. Woronicz, J.D., X. Gao, Z. Cao, M. Rothe, and D.V.Goeddel. 1997. IkappaB kinase-beta: NF-kappaB activation and complex formation with IkappaB kinase-alpha and NIK. Science. 278:866-869.

136. Wyszynski M, Lin J, Rao A, Nigh E, Beggs AH, Craig AM, Sheng M. 1997. Competitive binding of alpha-actinin and calmodulin to the NMDA receptor. Nature 385:439^142.

137. Xu, J., Zutter, M.M., Santoro, S.A., Clark, R.A.F. 1998. A three-dimensional collagen lattice activates NF-kappa В in human fibroblasts: role in integrin alpha2 gene expression and tissue remodeling. J. Cell Biol. 140: 709-719

138. Yamada, K.M., Geiger, B. 1997. Molecular interactions in cell adhesion complexes. Curr. Opin. Cell Biol. 9: 76-85.

139. Yang F, Tang E, Guan K, Wang CY. 2003. IKK beta plays an essential role in the phosphorylation of RelA/p65 on serine 536 induced by lipopolysaccharide. J Immunol. 170:5630-5635.

140. Ye bra, M., Filardo, E.J., Ваупа, E.M., Kawahara, E., Becker, J.C., Cheresh, D.A. 1995. Induction of carcinoma cell migration on vitronectin by NF-kappa B-dependent gene expression. Mol. Biol. Cell. 6: 841-850.

141. Zhang S, Buder K, Burkhardt C, Schlott B, Gorlach M, Grosse F. 2002 Nuclear DNA helicase II/RNA helicase A binds to filamentous actin. J Biol Chem. 277:843-53

142. Zohn, I.M., Campbell, S.I., Khosravi-Far, R., Rossman, K.I., Der, C.J. 1998. Rho family proteins and Ras transformation: the RHOad less traveled gets congested. Oncogene. 17: 1415-1438.