Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие α-актинина 4 с ядерными белковыми комплексами, регулирующими экспрессию генов

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие α-актинина 4 с ядерными белковыми комплексами, регулирующими экспрессию генов"

На правах рукописи

-Хс-

хотин

Михаил Георгиевич

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ а-АКТИНИНА 4 С ЯДЕРНЫМИ БЕЛКОВЫМИ КОМПЛЕКСАМИ, РЕГУЛИРУЮЩИМИ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

804604961

Санкт-Петербург 2010

004604961

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Пинаев Георгий Петрович

Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Воробьев Владимир Иосифович Институт цитологии РАН

кандидат биологических наук Голубкова Елена Валерьевна Санкт-Петербургский государственный университет, Биолого-почвенный факультет

Ведущая организация:

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

Защита диссертации состоится «18» июня 2010 года в 14 часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу:

194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

Адрес электронной почты Института: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru

Сайт: http://www.cvtspb.rssi.ru

Факс: 8(812)297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН. Автореферат разослан «18» мая 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность проблемы

Изучение роли цитоскелета в регуляции экспрессии генов с каждым голом приобретает все большую актуальность по мере того, как открываются новые факты о его регуляторных функциях,

Цитоскелет состоит in акткмовых филаментов, микротрубочек и промежуточных фнламептов. Он образует мобильную сеть в цитоплазме клетки, организует внутриклеточное пространство, определяя форму клетки, участвует в клеточной адгезии и клеточной миграции. Его перестройки являются первичной реакцией клеток на различные внеклеточные сигналы, такие, как изменение состава внеклеточного матрикса или воздействие ростовых факторов, и могут приводить к изменению экспрессии генов (Are et al., 2000; Fazal et al., 2007; Lelievre, 2009). Известно, что некоторые сигнальные молекулы, включая и транскрипционные факторы, взаимодействуют с белками актинового цитоскелета и перераспределяются в клетке при индуцированных перестройках цитоскелета (Бабаков и др., 2004; Kustennans et al., 2008).

Гипотезы об участии цитоскелета в регуляции экспрессии генов нашли косвенное подтверждение, когда актин и ряд актин-связывающих белков, таких, как винкулин, пакенлнн, гельзолип, а-актииип 4 и др., были обнаружены в ядре (Gettcmans et al., 2005). Поскольку в ядре реализуется генетическая информация, можно предположить, что функцией белков актинового цитоскелета, перераспределяющихся в ядро, является участие в регуляции экспрессии генов и, возможно, координация ядерно-цитоплазматических процессов. Так, существует ряд работ, в которых показано участие ядерного актина в регуляции активности всех трех РНК-полимераз (Hofman et al., 2004; Ни et al., 2004; Philimonenko et al., 2004). Известно о его включении в белковые комплексы, регулирующие сплайсинг мРНК (Percipalle et al., 2002), и о его участии в ремодслнровании хроматина (Farrants, 2008). В отличие от актина, ядерные функции актин-связывающих белков, в большинстве своем, не известны.

Исследование механизмов участия актин-связывающих белков в ядерных процессах необходимо для понимания их роли в клетке и открывает возможность получения дополнительной информации о путях передачи сигнала с поверхности клетки в ядро и реализации сигналов в виде изменения уровня экспрессии определенных генов.

Одним из актин-связывающих белков, имеющих ядерную локализацию, является а-актинин 4. Он принадлежит к спектриновому суперсемейству и, наряду с а-актинипом 1, относится к группе немышечных актипинов (Honda et al., 1998). Основными функциями

а-актинина 4 в цитоплазме считаются сшивка нитей F-актина и формирование актиновых фибрилл, их стабилизация, а также образование фокальных контактов. Перераспределение а-актинина 4 в ядро наблюдали при ингибированнн Р1РЗ-кнназы, при деполимеризации актина и при распластывании клеток на белках внеклеточного матрикса (Honda et al., 1998; Бабаков и др., 2004).

Существует ряд литературных данных, свидетельствующих о том, что а-актинин 4 может взаимодействовать с белками, непосредственно участвующими в экспрессии генов. а-Актинин 4 входит в состав белкового комплекса, образованного транскрипционным фактором NF-Y при активации процесса транскрипции (Poch et al., 2004), и может совместно со сплайсинговым фактором BATI связываться с промотором гена Cyt с (Goffart et al., 2006). Ранее в Лаборатории биологии клетки в культуре ИНЦ РАН было показано, что в цитоплазме а-актинин 4 солокализован с р65 субъединицей транскрипционного фактора NF-кВ, а при воздействии на клетки TNF-a и цитохалазина происходит совместная транслокация р65 и а-актинина 4 в ядро (Бабаков и др., 2004; Babakov et al., 2008). Кроме того, эти два белка содержатся в одном ядерном белковом комплексе во фракции транскрипционных факторов (Bolshakova et al., 2007). Такнм образом, предварительные данные позволили предположить участие а-актинина 4 в регуляции активности NF-kB,

Транскрипционный фактор NF-кВ является регулятором активности большого числа генов, вовлеченных в различные клеточные процессы, такие как пролиферация, апоптоз, клеточный цикл и др. Исследование роли а-актинина 4 в регуляции активности NF-кВ имеет особое значение в изучении неканонических путей активации этого транскрипционного фактора и участия а-актииипа 4 в регуляции пролиферации, апоптоза и трансформации клетки.

Литературные данные о ядерной локализации а-актинина 4 и результаты исследований, взаимодействия а-актинина 4 с транскрипционным фактором NF-кВ, проводимых в Лаборатории биологии клетки в культуре ИНЦ РАН, привели к необходимости изучения функций этого актин-связывающего белка в ядре и его роли в регуляции активности NT-к В.

1.2 Цели и задачи работы

Цель данной работы заключалась в выявлении ядерных процессов, в которых принимает участие а-актинин 4.

Достижение поставленной цели предполагает решение следующих задач. 1. Исследовать взаимодействие а-актинина 4 с ядерными белковыми комплексами р65 субъединицы NF-кВ при распластывании клеток на различных белках внеклеточного матрикса.

2. Провести анализ возможности участия а-актмшша 4 в регуляции активности транскрипционного фактора ОТ-кВ в отношении ряда р65-завнснмых генов.

3. Определить состав ядерных белковых комплексов, в которые входит а-актииип 4.

4. Сравнить включение изоформ а-актинипа 4 в ядерные белковые комплексы, выполняющие различные функции.

1.3 Основные положения, выносимые па защиту

1. Содержание а-актиппна 4 в ядерных белковых комплексах р65 субъединицы транскрипционного фактора ОТ-кВ зависит от типа белка внеклеточного матрнкса, на котором распластаны клетки, п влияет на активность этого транскрипционного фактора в отношении ряда генов.

2. В ядрах клеток А431 а-актпнин 4 ассоциирован приблизительно с пятьюдесятью различными белками. Среди них основными являются белки, участвующие в созревании мРГЖ, п традиционные цитоскелетные белки.

3. В клетках А431 экспрессируется как полиоразмерная, так и ранее не описанная укороченная изоформы а-актшшпа 4. Обе изоформы имеют как цитоплазматическую, так и ядерную локализации.

4. Изоформы а-актнннна 4 входят в состав различных ядерных белковых комплексов, которые выполняют разные функции.

5. Гиперэкспрессия а-актинина 4 не влияет на ядерную транслокацпю и активацию транскрипционного фактора №-кВ.

1.4 Научная новизна полученных результатов

В данной работе впервые показано включение а-актинина 4 в ядерные белковые комплексы, регулирующие экспрессию генов на уровнях активации транскрипционных факторов и созревания мРПК. Анализ результатов исследований позволил выдвинуть гипотезу об участии а-актинина 4 в регуляции процессинга, сплайсинга и транспорта мРНК. Показано, что а-актинин 4 может регулировать активность транскрипционного фактора ОТ-кВ в отношении ряда генов, но не влияет на его перераспределение в ядро и активацию. Впервые описана новая изоформа а-актинпна 4, образованная путем альтернативного сплайсинга. Обнаружено, что изоформы а-актинина 4 входят в различные ядерные белковые комплексы и, следовательно, могут выполнять разные функции.

1.5 Теоретическое и практическое значение работы

Полученные результаты имеют фундаментальное значение для понимания роли белков

цитоскелета в ядерных процессах и регуляции экспрессии генов. Определение ядерных функций а-актинииа 4 способствует пониманию механизмов его участия в процессах клеточной трансформации и развития заболеваний, связанных с мутациями гена а-актинина 4. Описание его роли в регуляции активности NF-кВ актуально для разработки терапевтических методов коррекции патологических состояний, связанных с активностью определенных транскрипционных факторов. Полученные данные могут быть использованы при чтении лекций в Санкт-Петербургском Государственном Политехническом Университете, Санкт-Петербургском Государственном Университете и па биологических факультетах других ВУЗов.

1.6 Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из которых 2 статьи в рецензируемых журналах и 7 тезисов.

Материалы диссертации были представлены на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2007), Международной конференции American Society for Cell Biology (Вашингтон, 2007), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), XIII Санкт-Петербургской ассамблее молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2008), I и II Конференциях молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2008, 2010), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), Школе-семинаре по проблемам организации внутриклеточного транспорта, цитоскелета и путей передачи сигнала (Санкт-Петербург, 2009).

1.7 Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего //У источников. Диссертация изложена на //^страницах машинописного текста. Иллюстративный материал содержит £_ схем, ^/рисунков и таблиц.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», РФФИ (07-04-01190) и фонда Visby Шведского института.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Клеточные культуры

Клетки эпидермоидной карциномы человека линии А431 и эмбриональные клетки почки человека линии НЕК293 были получены из Российской коллекции клеточных культур

Института цитологии РАН (Саикт-Петсрбург). Клетки культивировали в среде DMEM (Биолот) с добавлением 10 % эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco) н 0.1% гептамишша в атмосфере 5 % ССЬ при температуре 37 °С.

2.2 Расилас1ыванис ic.il'hi к на белках внеклеточного магрнкса

Растворы коллагенов I или IV (Fluka) в 0.1 %-ной уксусной кислоте, ламинииа 2/4 или фибропектипа (Sigma) в PBS наносили на гидрофобные пластиковые чашки Петри в концентрации 10 мкг/мл на 12 ч при 14 °С. Затем чашки отмывали PBS и, для исключения неспецифического связывания с субстратом, обрабатывали 2 %-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (BSA) в течение I ч при 37 "С.

Клетки снимали смесыо 0.25 %-пого трипсина и 0.02 %-ной ЭДТА в соотношении 3:7. Суспензию клеток в среде ДМЕМ наносили на гидрофобные чашки Петри (5х10л клеток/чашку), покрытые одним из лигандов, и инкубировали при 37 °С в течение 1 ч в атмосфере 5 % СОг.

Коллаген I типа и ламишит 2/4 были любезно предоставлены JI.B. Кухаревой, И.В. Воронкиной и Д.В. Гамазиным.

2.3 Выделение клеточных ядер

Для получения ядер использовали метод, описанный ранее (Бабаков н др., 2004), с небольшими модификациями. Клетки снимали с чашек при помощи резинового скребка и отмывали в буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl pH 8.0, 0.32 M сахарозы, 20 мМ MgClj, 0.1 мМ ЭДТА, 10 мМ ДТТ, 0.05 мМ PMSF и ингибиторы протсаз (Roche). После центрифугирования клетки ресуспендировали в том же буфере и инкубировали 20-40 мин (до момента лизиса) во льду. Для выделения и очистки ядер клеточный лизат 20 раз пропускали через иглу 21G. Ядра осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 2500 g и 4 °С, ресуспендировали и осаждали в 0.5 M сахарозе при тех же условиях. Сохранность и чистоту ядер контролировали иод микроскопом. Выделение ядерной белковой фракции, содержащей транскрипционные факторы, проводили в течение 30 мин при температуре 4 °С в буфере, содержащем 400 мМ NaCl, 20 мМ H ЕРЕ S pH 7.9, 25 % глицерина, 1.5 мМ MgCI, 0.4 мМ ЭДТА, 0.4 мМ PMSF, 1мМ дитиотрентол (ДТТ) и ингибиторы протеаз (Roche). Остатки ядер осаждали центрифугированием (2500 g, 10 mihi), сунернатапт использовали для иммунопрешшитации.

2.4 Иммунонрецшштация

К полученным ядерным лизагам добавляли два объема PBS для уменьшения концентрации соли и инкубировали с протенн-G сефарозой (GE Healthcare) при постоянном перемешивании в течение 1 ч при 4 °С с целью удаления из пробы белков, неспецифическн

связывающихся с сефарозой. Затем сефарозу осаждали (10000 g, 10 мин, 4 °С), а супернатант переносили в новые пробирки и инкубировали с соответствующими антителами в течение 12 ч при 4 °С. После этого в пробы добавляли свежую порцию сефарозы и инкубировали в течение 4 ч на ротаторе при 4 °С. Иммунопрешшитаты отмывали 4 раза раствором PBS с ингибиторами протеаз (Roche).

2.5 SDS-электрофорез и нммуноблот анализ

Белки разделяли в градиентном (8-18 %) полиакриамидном геле в присутствии SDS (Laemmli, 1970) и переносили на мембрану PVDF (Millipore) по стандартной методике (Towbin et al., 1979). Антитела к а-актинину 4, р65, а-тубулину, hnRNP Al, hnRNP K/J, hnRNP F/H, hnRNP L, hnRNP C1/C2, hnRNP M1-4 разводили в соотношении 1:500; c-myc, hnRNP A2/B1, DDX5 - 1:2000; вторые антитела против IgG мыши, кролика и козы - 1:10000. Хемилюминесценцию регистрировали с применением установки ChemiDoc XRS (BioRad).

2.6 Двумерный электрофорез белков

Двумерный электрофорез белков проводили на оборудовании фирмы Amersham в соответствии с рекомендациями производителя. После электрофореза гели инкубировали в течение ночи в фиксирующем буфере (10 %-ная уксусная кислота, 20 %-ный метанол) и окрашивали кумасси (PageBlue Protein Stain, Fermentas) или серебром (Silver stain, Fermentas).

2.7 Масс-спектрометрический анализ

Окрашенные пятна вырезали и собирали в отдельные микропробирки. Трипсинолиз белков в геле проводили по описанному ранее методу (Shevchenko et al., 2006) с некоторыми изменениями. Кусочки геля промывали раствором А (50 % ацетонитрила, 25 мМ NHJICOj) дважды по 15 мин. Затем к образцам добавляли ацетонитрил и инкубировали 5 мин для удаления из геля избытка воды. После удаления ацетонитрила пробы сушили в вакуумной центрифуге в течение 15 мин. Карбамидометилирование белков в геле осуществляли по следующей схеме: инкубация в 10 мМ ДТТ, 50 мМ NH4HCO3 45 мин при 56 °С; сушка проб раствором ацетонитрила в течение 3 мин с его последующим удалением; инкубация в смеси 55 мМ раствора йодоцетамида и 50 мМ NH4HCO3 в течение 45 мин в темноте. Далее пробы последовательно промывали по 10 мин раствором А и ацетонитрилом и сушили в вакуумной центрифуге в течение 15 мин. Затем к образцам добавляли раствор, содержащий 0.005 мг/мкл трипсина (Trypsin Gold, Promega) в 50 мМ NH4HCO3 и 10 % ацетопитриле, и оставляли при 4 °С до полного впитывания раствора в гель, после чего смесь термостатировали в течение 3 ч мри 37 °С. По прошествии указанного времени к образцам добавляли еще одну порцию раствора

трипсина и оставляли еще на 3 ч при той же температуре. По окончании трипснполиза пептиды экстрагировали из гелей. Для этого в каждую пробирку добавляли буфер для экстракции (5 % трифторуксусной кислоты (TFA) и 50 % ацетонитрила), перемешивали при помощи вортскса в течение 10 мин и переносили жидкую фазу в чистые микропробпрки. Процедуру повторяли трижды. Полученные экстракты сушили в вакуумной центрифуге до полного испарения жидкой фазы и затем растворяли в 10 мкл 0.1 %-ной TFA. При помощи колонок ZipTips (Millipore), но протоколу производителя, полученные пробы очищали от избытка солей. С колонок пептиды элюпровалп 1.5 мкл смеси 70 %-ного раствора ацетонитрила, 5 %-ной TFA, содержащей матрицу CIICA (а-цнано-гпдрокси-коричную кислоту) в концентрации 9 мг/мл, непосредственно на мишень масс-снектрометра.

Масс-спектрометрический анализ MALDI-TOF (матричной лазерной десорбционно-ионизационной времяпролетпой масс-спектрометрии) осуществляли с помощью прибора «Voyager» фирмы Applied Biosystems. Попы детектировали в диапазоне отношения молекулярной массы к заряду (m/z) от 700 до 3500. Полученные данные анализировали с использованием программного обеспечения Data Explorer фирмы производителя, белки идентифицировали при помощи программы Mascot с использованием белковой базы данных SwissProt, методом PMF (peptide mass fingerprint).

2.8 Анализ экспрессии генов-мншеней р65 cyöi,единицы NF-kB

Для анализа экспрессии генов использовали метод обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

Из чашек Петрн с клетками удаляли культуральную среду, а из клеток выделяли тотальную РНК реагентом TriZol (Invitrogene) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Эффективность выделения мРНК определяли с использованием спектрофотометра NanoDrop.

По матрице РНК синтезировали кДПК при помощи набора для обратной транскрипции RevertAid (Fermentas), руководствуясь рекомендациями производителя. Качество и количество полученной кДНК анализировали методом ПЦР с нраймерами к 18S рибосомиой РНК. ПЦР проводили по стандартной схеме (Bell, 1989) с использованием Taq полимеразы (Fermentas). Продукты ОТ-ПЦР оценивали методом горизонтального агарозного гель-электрофореза. Результаты электрофореза визуализировали с применением комплекса ChemiDoc XRS(BioRad).

2.9 Анализ пзоформ ACTN4 в клетках А431

Из клеток линии А431 была выделена тотальная РНК, которую использовали для реакции обратной транскрипции (см. п.2.8). Полученную кДНК амплифицировали методом ПЦР с

праймерами к концевым последовательностям гена ACTN4: 5' CAGGTCGCTCTCGCCATACA 3' и 5' GCGGCGGAATGGTGGACTA 3'. Продукты ПЦР разделяли в агарозном геле. Различные варианты транскриптов ACTN4 секвенировали при помощи набора для секвенирования DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech) на приборе GE Amersham MegaBace 1000 DNA Sequencer. Результаты анализировали с помощью программного обеспечения MegaBACE Sequence Analyzer.

2.10 Экспрессионные плазмиды

Фрагменты ACTN4 размерами 2732 п.н. и 2077 п.п. были встроены в вектор pJETl\blunt с помощью набора GeneJETTM PCR Cloning Kit (Fermentas), согласно протоколу изготовителя. Полученные генетические конструкции были использованы для клонирования гена ACTN4 в вектор pCS2MT.

Трансфекцию клеток IIEK293 проводили методом кальций-фосфатной преципитации в фосфатно-солевом буфере.

2.11 Статистическая обработка данных и количественный анализ электрофореграмм

Результаты иммуноблотинга и электрофореграмм после ПЦР подвергали денситометрическому анализу. Для этого использовали универсальный анализатор ChemoDock (BioRad) и специализированные программные продукты QuantityOne и Scion Image. Подсчет средних значений, 95 %-ных доверительных интервалов, а также парный корреляционный анализ и вычисление рангового коэффициента Спирмена проводили при помощи программных продуктов Origin и Excel. В работе представлены данные трех и более независимых экспериментов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Взаимодействие клетки с белками внеклеточного матрикса влияет на формирование ядерных белковых комплексов а-актннипа 4 и р65 субъедипицы транскрипционного фактора IVF-кВ в клетках линии А431

IIa предварительном этапе был разработан метод получения препаратов внеклеточного матрикса. С его помощью обнаружено, что фибробласты из нормальной и поврежденной ткани синтезируют различное количество коллагенов, ламининов и фибронектипа. Известно, что состав внеклеточного матрикса определяет функционирование клетки (Benecke et al., 1978). По этой причине на последующих этапах исследования была выбрана модель клеточной адгезии на этих белках внеклеточного матрикса.

Из клеток A43I, распластанных на пластике, коллагенах I и IV типов, фибронектине и ламииине 2/4. были выделены ядра и экстрагированы белки фракции транскрипционных факторов. Во всех экспериментальных точках для экстракции белков брали одинаковое количество ядер. Анализ экстрактов показал, что содержание в них р65 и а-актинина 4 изменяется при распластывании клеток на различных белках внеклеточного матрнкса (рис. 1). Так, содержание р65 в клетках на коллагенах и ламинине было одинаковым, но больше чем в клетках на пластике и фибронектине. Содержание а-актинина 4 в ядрах: минимально при распластывании на пластике, больше и приблизительно одинаково - на коллагенах и фибронектине. максимально - при адгезии на ламинине.

Ядерные нее рзкгш II1 р65 sc-,) 72

ACTN4 » • • я muä j *. £ • » Л '

р65 )л К 1 К 4 Фн * Лм IPPG Пл Kl K-l Фн Ли

Рис. 1. Содержание а-актинина 4 и р65 в ядрах клеток А431 (ядерные экстракты) и в ядерных белковых комплексах, содержащих р65 {IГ* р65 5С-372), при адгезии к пластику (Пл), коллагену I (К 1), коллагену IV (К 4), фибронектину (Фн) и ламинину 2/4 (Лм). 1Р РО - контрольная проба без добавления антител в реакцию иммунопрецнпитации.

Далее методом иммунопрецнпитации были получены ядерные белковые комплексы, содержащие р65 субъединицу транскрипционного фактора ОТ-кВ. Методом иммуноблоттинга определено наличие а-актинина 4 в этих комплексах (рис. 1). Показано, что а-актинин 4 входит в состав ядерных белковых комплексов, содержащих р65 субъединицу №-кВ, в клетках А431, распластанных на всех исследуемых субстратах. Количество комплексов р65 и включение а-актинина 4 в них зависело от типа белка внеклеточного матрнкса, с которым взаимодействовали клетки. На основании полученных данных можно утверждать, что изменение микроокружепия клетки влияет на содержание а-актинина 4 в комплексы р65.

Сравнение наличия а-актинина 4 и р65 в ядерных экстрактах и в полученных белковых комплексах р65 позволило установить, что не весь ядерный р65 ассоциирован с этими комплексами. Это объясняется специфичностью антител, используемых для иммунопрецнпитации к С-концу р65 (8С-372). Вероятно, у части ядерного р65 С-конец конформационпо недоступен для связывания антител. Выбор указанного типа антител

обусловлен данными об отсутствии а-актинина 4 в белковых комплексах р65, полученных иммунопреципитацией N-конна р65 (антитела SC-8008) (Bolshakova et al., 2007). Отмечено, что не весь ядерный а-актинин 4 ассоциирован с р65. Это свидетельствует об участии а-актинина 4 в различных ядерных белковых комплексах, которые, вероятно, выполняют разные функции.

3.2 Зависимость активности транскрипционного фактора NF-кВ от содержания а-актинина 4 в ядерных белковых комплексах р65

Обнаружение ассоциации а-актинина 4 и р65 субъединицы NF-кВ в клетках, находящихся в различных условиях, привело к необходимости перейти к проверке функциональности такого взаимодействия, то есть к определению возможности участия а-актинина 4 в регуляции активности этого транскрипционного фактора. Для этого исследовали уровень экспрессии р65-зависимых генов и сравнивали его с содержанием а-актинина 4 в ядрах и в ядерных комплексах р65 субъединицы в клетках А431, культивируемых на пластике, коллагенах I и IV, фибронектине и ламинине 2/4. Методом ОТ-ПЦР проведен анализ уровня экспрессии восьми различных генов-мишеней р65 субъединины транскрипционного фактора NF-кВ (рис. 2). Эти гены кодируют белки, принимающие участие в различных клеточных процессах: интерлейкин 2 (¡12), фибронектин (Fn), тенасцин-С (TNC), BCL2-ассоциированный X белок (ВАХ), SNAIL (SNAtl), циклооксигеназа 2 (PTGS2), фактор роста фибробластов 8 (FGF8), матриксная металлопротеиназа 9 (ММР9).

Рис. 2. Экспрессия генов-мишеней р65 субъединины NF-кВ в клетках А431 при адгезии к пластику (Пл), коллагену I (К 1), коллагену IV (К 4), ламинину 2/4 (Лм) и фибронектину (Фн)

Обнаружено, что экспрессия почти всех исследуемых генов зависит от микроокружения клетки. Корреляционный анализ между активностью экспрессии исследуемых генов и содержанием а-актинина 4 в комплексе с р65 субъединицей (определяли как количественное отношение а-актинина 4 к р65) показал наличие такой связи для генов B/iA'(p<0.1) и TNC (р<0.01) у клеток, культивируемых на всех исследуемых субстратах кроме коллагена IV. Кроме того, только для генов ВАЛ' (р<0.05) и TNC (р<0.01) обнаружена корреляция между их экспрессией и общим содержанием а-актинина 4 в ядре. Полученные результаты позволяют предполагать участие га-

ICAM1 ММР9 FGF8 PTGS2 TNC Fn SNAI ВАХ 18S

актинина 4 в регуляции активности транскрипционного фактора №-кВ в отношении указанных генов. Отсутствие подобных связей для других исследуемых генов объясняется возможностью регуляции их активности а-актинин-4-независимыми сигнальными путями. Можно допустить, что адгезия к коллагену IV включает дополнительные сигнальные пути, регулирующие экспрессию генов. Следует отметить, что для гена ВАХ коэффициент корреляции был отрицательным, то есть связь была обратной: увеличение содержания а-актинин 4 в ядерных комплексах р65 приводило к снижению экспрессии этого гена. Для гена Т!ЧС коэффициент корреляции был положительным, и, следовательно, связь прямой. Эти данные свидетельствуют о возможности участия а-актинина 4 как в активации, так и в супрессии активности транскрипционного фактора №-кВ.

3.3 Состав ядерных белковых комплексов а-актинина 4

Одним из методических подходов для определения функций а-актинина 4 в ядре является идентификация белков, образующих с ним комплексы, и экстраполяция известных функций этих белков на а-актинин 4.

Из клеток линии А431 были выделены ядра и экстрагированы ядерные белки фракции транскрипционных факторов. Методом иммунопреципитации были получены белковые

комплексы, содержащие а-актинин 4. Состав этих комплексов

проанализирован двумерным

электрофорезом. Анализ гелей, окрашенных методом серебрения (рис. 3 А), позволил установить, что с ядерным а-актинином 4 ассоциировано около 50 различных бе

Рис. 3. Двумерный электрофорез ядерных белковых комплексов, содержащих а-актинин 4

Представлены окраски методами серебрения (А) и кумасси (Б). На рисунке Б стрелками отмечены пятна (пробы), которые вырезали для масс-спектрометрического анализа.

Следующим этапом данного исследования была идентификация белков, ассоциированных с а-актинином 4 в ядре. Для этого разделенные двумерным электрофорезом белки исследуемых комплексов окрашивали кумаееи (рис. 3 Б). Данный способ окраски наиболее совместим с последующим масс-спектрометрическим анализом, но менее чувствителен, чем метод серебрения. Поэтому при окрашивание кумасси визуализируются белки, содержание которых в комплексе с а-актинином 4 максимально. Окрашенные пятна были вырезаны, а белки, содержащиеся в них, идентифицированы посредством масс-сиектрометрии. Результаты анализа методом PMF представлены в таблице I.

Идентифицированные белки можно разделить на три условные группы: 1) традиционные белки цитоскелета, с которыми а-актинин 4 взаимодействует в цитоплазме; 2) белки, чьи функции связаны с метаболизмом мРНК и 3) белки с неизвестными ядерными функциями. К первой группе относится актин, ядерные функции которого наиболее активно исследуются в последние годы. Однако уже сейчас известно об его участии в белковых комплексах, регулирующих активность всех РНК-полимераз, вовлечении актина в процессы сплайсинга и транспорта пре-мРНК и роли актина в организации ядерной архитектуры (Vartainen, 2008; Percipalle, 2009). Несмотря на то, что тубулин, обнаруженный в комплексе с а-актинином 4, традиционно не считается ядерным белком, упоминания об обнаружении его в ядре неоднократно встречалось в литературе (Bergquist et al„ 2001). Следует отметить, что каждый год появляются новые данные о ядерной локализации типично цитоскелетных белков. Вероятно, тубулин тоже может принимать непосредственное участие в ядерных процессах.

Наиболее многочисленной была вторая группа белков, большая часть которых относится к гетерогенному рибонуклеопротеиновому семейству (hnRNP). Среди них были основные комплексообразующие белки рибопуклеопротеиповых субъединиц. Белки, входящие в эту группу, принимают участие во всех этапах созревания пре-мРНК и ее ядерио-цитоплазматическом транспорте. Показано участие некоторых из них в процессе транскрипции.

Помимо этих двух групп были идентифицированы белки с неясными ядерными функциями. Среди них пероксиредоксин 1 - фермент с пероксидазной активностью, защищающий клетку от окислительного стресса, который имеет также и ядерную локализацию. При воздействии па клетку Н2О2 пероксиредоксин 1 в цитоплазме регулирует перераспределите NF-кВ в ядро и участвует в регуляции образования комплекса ДНК-NF-kB (Hansen et al., 2007).

Таблица 1.

Результаты MALDI-TOF анализа ядерных белковых комплексов а-актишша 4

№ Молекулярная Молску -лярпая Название белка и номер в базе Swiss Plot Счет Коли- %

пяти масса, масса честв Перек-

а соогвст-ствующа я пятну, кДА белка, кДа о цент и -дов рытия

1 40 42 Р-актин, у-актин1; Р60709, Р63261 119"' 11 29

2 55 51 Гетерогенный ядерный рнбонуктеопротеин Я" (hnRNP К); Р61978 156"' 15 34

3 65 60 Гетерогенный ядерный рибонумеопротеин L (hnRNP L); PI4866 121'" 9 19

4 55 50 а-тубу.иты-IA, /В, /С(tubulin alpha-IA, tubulin alpha-IB, tubulin alpha-lC chains)'; Q7IU36, P68363. Q9BQE3 59' 3 11

5 55 50 ¡i-туоулин (tubulin beta chain); P07437 216*" 22 38

6 55 57 О-З-фосфоглицериндегидрогеназа (D-3-phosphoglyccratc dehydrogenase); 043175 85'" 9 20

7 35 38 Поли(С)-се,язывающчй белок I (Poly(rC)-binding protein 1); Q15365 69" 4 17

8 20 22 Пероксиредоксин-/ (Pcroxi redox in-1); 006830 66" 3 20

9 45 45 TAP ДПК-связывающий белок 4i (TAR DNA-biiidmg protein 43); QI3148 68" 4 15

10 35 37 Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин A2/BI (hnRNP A2/BI); P22626 178'" 11 43

II 40 37 Гетерогенный ядерный рибонуклеопротепн A2/BI (hnRNP А2/В1); Р22626 72" 5 20

12 40 39 Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин A1 (hnRNP AI); Р09651 212*" 13 47

13 40 40 Гетерогенный ядерный рибонуклеопротепн A3 (hnRNP A3); P5199I 72" 7 26

14 115 - Не идентифицирован - - -

15 65 - Не идентифицирован - - -

16 105 - Не илешифпиирован - - -

17 35 - Не мдешифинмрокам - - -

В пробах № 1 и 4 с одинаковой вероятностью идентифицированы два и три белка соошезствеппо. Это объясняемся высокой еюненыо гомологии этих белков. Вероятность ошибки (р) при идентификации белков: р<0.05; р<0.005; р<0.001.

Данные маес-спектрометрического анализа были подтверждены методами иммунохимии. Для этого проведен иммуноблот-апализ ядерных белковых комплексов а-актинина 4 с

15

антителами против белков гетерогенного рибонуклеопротеипового комплекса Ьп1ШР А2/В1, А1, К, Ь (рис. 4 А) и иммунопреципитация ядерных белков с антителами к а-тубулину и ЬпЯКР А2/В1 (рис. 4 Б). Было обнаружено, что в ядре присутствуют не только полноразмерная (105 кДа), но и две укороченные (75 и 65 кДа) изоформы а-актинина4 (рис. 4 Б). При этом в ядерном иммунопреципитате а-тубулина обнаружены только укороченные варианты а-актинина 4 (рис. 4 Б). В ядерном иммунопреципитате ЬпКЫР А2/В! присутствует только полноразмерный а-актинин 4. Это свидетельствует о том, что а-актинин 4 содержится в различных ядерных белковых комплексах, которые, вероятно, выполняют отличные друг от друга функции.

Яд.

■жстр.

ГР

-ГР 1РРО

ЬпЯЫРА!

НпКЫР А2/ВI

МШ> К .1

1ш!ШР I .

ИщШ

кДа

100 -70-

Яд. Иммунонроциштшия

" 1У° А2/В1 Лчшя 1

Рис. 4 Подтверждение результатов масс-спектрометрического анализа методами иммунохимии

(А) Иммуноблот-анализ содержания белков семейства ЬпГШР в ядерном экстракте клеток А431 (яд. экстр.) и в ядерных белковых комплексах а-актинина 4 (иммунопреципитация - 1Р); (Б) Анализ включения а-актинина 4 в ядерные белковые комплексы а-тубулина и ЬпГШР А2/В1 методом иммуноблоттинга с антителами против а-актинина 4. 1Р РО и РО - контроль без добавления в реакцию иммунопреципитации специфических антител.

Рис. 5 В ядерные комплексы а-актинина 4 входят белки, участвующие в регуляции сплайсинга пре-мРНК

Яд. экстр. - белки, экстрагированные из ядер клеток А431; 1Р — иммунопреципитация ядерных белковых экстрактов с антителами против а-актинина 4; -ТР - белки, не связавшиеся с антителами в реакции имунопреципитации; !Р РО - контроль без добавления в реакцию иммунопреципитации специфических антител.

Я экс Д' № -1!> 1РРО яр.

1)0X5 ^ • -

МОТ М1-4 , Я- " -Ф

1ш1Ш> 1 М ^

Выявление в комплексе с а-актинином 4 большого количества белков, вовлеченных в метаболизм РНК. позволило предположить его участие в этих процессах. Для дополнительного подтверждения этой гипотезы методом иммуноблоттинга было проверено участие в ядерных комплексах а-актинина 4 ряда белков, не идентифицированных при масс-спектрометрическом анализе, но принимающих участие в сплайсинге мРЛК (рис. 5). Установлено, что а-актинин 4 ассоциирован с hnRNP MI-4, DDX5, но не с hnRNP F/Il. Стоит обратить внимание на то, что часть белков, идентифицированных в этих комплексах, остается в несвязанном с а-акгинином 4 состоянии (дорожки -IP на рис. 4 Б и 5).

Таким образом, результаты масс-сиектрометрического и биохимического анализов ядерных белковых комплексов а-актинина 4 указывают на его участие в процессах транскрипции и созревания мРНК.

3.4 Анализ включении различных изоформ а-актинина 4 в ядерные белковые комплексы, регулирующие транскрипцию и созревание мРНК

При изучении ядерных комплексов а-актинина 4 методами иммунохимии было установлено, что в ядрах клеток линии А43 1 существуют несколько изоформ а-актинина 4. Для ответа на вопрос о природе возникновения этих изоформ и для их дальнейшего анализа было проведено исследование набора мРНК а-актинина 4 (рис. 6). Установлено, что в клетках А431 существует несколько мРПК а-актинина 4. отличающихся по размеру. Большая из них и одна из укороченных (2077 н.) мРПК были выделены, клонированы и секвенированы. Нуклеотидпая последовательность мРНК большего размера полностью соответствует последовательности мРНК, кодирующей полноразмерный а-актинин 4, в то время как у укороченной последовательности отсутствуют экзоны со второго по восьмой. Этот делетированный участок

соответствует аминокислотной последовательности двух кальпониновых доменов а-актинина 4, отвечающих за связывание с актином. Таким образом, в клетках А431 обнаружена укороченная изоформа а-актинина 4 (ACTN4iso), образованная путем альтернативного сплайсинга и отличающаяся отсутствием двух кальпониновых доменов.

Рис. 6 Анализ изоформ ACTN4 в клетках А43). Электрофорез продуктов амплификации кДНК с нраймерами к концевым последовательностям ACTN4

1 - маркер молекулярных весов; 2 - продукт амплификации. 17

Для определения специфических ядерных функций этих изоформ а-актинина 4 клетки линии НЕК293 были трансфицированы экспрессионными плазмидами, несущими полноразмерный или укороченный (без калыюшшовых доменов - ACTN4iso) варианты п-актинина 4, слитые с сигнальным пептидом Мус. Из этих клеток были выделены ядра п экстрагированы ядерные белки фракции гранскрипнионпых факторов. Пммуиопрепиншациен с антителами к сигнальному пептиду Мус получены ядерные белковые комплексы, содержащие экзогенные варианты а-актинина 4. С использованием пммуноблотппн а обнаружено, что белки гетерогенного рибонуклеопротеинового семейства А2/В 1 и AI связываются с полноразмерной формой а-актинина 4 и не связываются с ACTN4iso (рис.7).

Рис. 7 Включение ИпВГСР А2/В1 п |1п1УЧР Л1 в ядерные белковые комплексы полноразмерной и укороченной изоформ АСТМ

Гиперэксперессия полноразмерной или укороченной изоформ а-актинина 4 не влияет на перераспределение р65 в ядро (А). Белки семейства гетерогенных рибонуклеопротеинов ЬпГШР А1 и ЬпЯОТ А2/В1 связываются с полноразмерной и не связываются с укороченной изоформами а-актинина 4 (Б). Дорожки 1, 5 - не трансфицированные клетки; 2, 6 - клетки, трансфицированные плазмидой рС82МТ без вставки; 3. 7 - клетки, гиперэкспрессируюшие полноразмерный АСТМ; 4, 8 - гиперэкспрессируюшие АСТЫ41яо; 9 -контроль без добавления в реакцию иммунопреципитации специфических антител.

Полученные результаты позволяют предполагать, что полноразмерная изоформа а-актинина 4 участвует в процессинге и транспорте мРНК. Функции изоформы а-актинина 4 с делецией калыюниновых доменов (АСТЫ41зо) могут быть связаны с регуляцией транскрипции. Таким образом, различные изоформы а-актинина 4 могут выполнять отличные ядерные функции.

3.5 Влияние гиперэкспрессии изоформ а-акгинина 4 на активность транскрипционного фактора №-кВ

Для проверки гипотезы о возможной способности а-актинина 4 непосредственно активировать или ингибировагь активность транскрипционного фактора №-кВ проверено влияние гиперэкспрессии а-актинина 4 на активность и распределение р65. Для этого

А l|iiiim.-!;i!\!a Ядро

Р65 12 3 4 5 6 7 8

taiKNP А2/В1 У''* ^¡SmI

Иммунопрейишшншя iinfi-cMyc В —----- 9 5 6 7 8

—. hnRNIWI

hnRM' — Л2-И1

исследования были выбраны клетки линии НЕК293, у которых ОТ-кВ находится конститутивно в неактивном состоянии в цитоплазме, в отличие от линии А431, для которой характерна постоянная активность р65. Клетки были трансфицировапы экспрессноиными плазмидамн, содержащими полноразмерный а-актиппн 4 п АСТШ^о. Анализ содержания р65 в цитоплазме и ядре показал, что гнперэкспрессия а-актинина 4 не привела к перераспределению р65 в ядро (рис. 7). Методом ОТ-ПЦР проведен анализ экспрессии генов-мишеней р65 субъединнцы №-кВ у этих клеток. Не обнаружено каких-либо различий в экспрессии этих генов между контрольными клетками и гиперэкспрессирующпми полноразмернын а-а;*тппнн 4 или АСТТ^бо. Таким образом, установлено, что гиперэкспрессия а-актинина 4 не влияет на активность транскрипционного фактора КГ-'-кВ и его ядерную траислокацию, что свидетельствует об отсутствии прямого пути активации р65 через изменение содержания а-актинина 4 в клетке.

4. ВЫВОДЫ

1. Количество а-актпнина 4 в ядерных белковых комплексах, содержащих р65 субъединицу транскрипционного фактора ОТ-кВ отличается при распластывании клетки па различных белках внеклеточного матрикса. Изменение содержания а-актшшна 4 коррелирует с уровнем экспрессини генов-мишеней р65 - В АХ и ТМС, что свидетельствует о возможном участии а-актиннна-4 в регуляции активности транскрипционного фактора ЫЯ-кВ.

2. Помимо ассоциации с р65 субъединицей КР-кВ а-актинип 4 входит в состав ряда других ядерных комплексов, содержащих около 50 различных белков. Идентификация этих белков методом масс-спектрометрии показала, что в их число входят белки, регулирующие экспрессию генов на уровнях транскрипции и процессипга мРИК.

3. Полноразмерный а-актинин 4 и его укороченная нзоформа с делецней кальпониновых доменов входят в состав разных белковых комплексов. Полноразмерная нзоформа связана с белками гетерогенного рибонуклеопротеинового комплекса, а укороченная - с а-тубулином.

4. В клетках НЕК-293, в которых №-кВ находится в неактивном состоянии, гиперэкспрсссня полноразмерной и укороченной нзоформ а-актинина 4 не приводит к изменению активности ОТ-кВ.

5. а-Актинпн 4 входит в состав ядерных белковых комплексов, регулирующих экспрессию генов на уровнях транскрипции, процессипга и транспорта мРНК. Вероятно, его ядерные функции связаны с участием в этих процессах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хотнн М.Г., Туроверова Л.В., Подольская Е.П., Краснов И.А., Соловьева А.В., Аксенова В.Ю., Магнуссон К.-Э., Пинаев Г.П., Теитлер Д.Г. 2009. Исследование ядерных белковых комплексов а-актинина 4 методами двумерного электрофореза и масс-спектрометрии. Цитология, 51 (8): 684-690.

2. Туроверова Л.В., Хотин М.Г., Юдинцева П.М., Магнуссон К-Э., Блинова М.И., Пинаев Г.П., Тентлер Д.Г. 2009. Метод анализа белков внеклеточного матрикса, синтезируемого клетками в культуре. Цитология, 51 (8): 691-697.

3. Хотии М.Г., Туроверова Л.В., Соловьева А.В., Пинаев Т.П., Тентлер Д.Г. 2010. Содержание альфа-актинина-4 в ядерных белковых комплексах р65 субъединицы NF-kB коррелирует с активностью этого транскрипционного фактора. Цитология, 52 (6): 517.

4. Хотии М.Г., Туроверова Л.В., Аксенова В.Ю., Соловьева А.В., Пинаев Г.П., Тентлер Д.Г. 2010. а-Актинин 4 участвует в ядерных белковых комплексах, регулирующих экспрессию генов. Цитология, 52 (3): 267.

5. Аксенова В.Ю., Хотин М.Г., Туроверова Л.В., Пинаев Г.П., Тентлер Д.Г. Исследование ядерных функций актин-связывающего белка альфа-актинина 4 и его участия в регуляции экспрессии генов. Материалы съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Ч.Дарвина, и V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. 21 -27 июня 2009 г., Москва. С.41.

6. Хотии М. Г., Соловьева А. В., Тентлер Д. Г., Туроверова Л. В., Magnusson К. Е„ Пинаев Г. П. Экспрессия генов-мишеней р65 субъединицы NF-кВ у кератиноцитов человека при культивировании на различных белках ВКМ. Материалы IV съезда Общества биохимиков и молекулярных биологов. 10-16 мая 2008 г. Новосибирск. С. 184.

7. Хотии М.Г. Анализ состава мультимолекулярных белковых комплексов, содержащих а-актинин-4 в клеточном ядре, методами масс-спектрометрии. XIII Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов. 15 декабря 2008, Санкт-Петербург. С.50

8. Сгтичкина О.С., Хотин М.Г., Соловьева А.В., Тентлер Д.Г., Туроверова Л.В., Блинова М.И., Пинаев Г.П. 2007. Влияние белков внеклеточного матрикса на распределение р65 субъединицы транскрипционного фактора NF-кВ и а-актинина 4 в ядре кератиноцитов человека. Цитология, 49 (9): 796.

9. Tentler D., Turoverova L„ Khotin M., Solovyeva A„ Petukhova O., Bolshakova A„ Magnusson K., Pinaev G. P. 2007. Extracellular matrix proteins define the composition of nuclear protein complexes with alpha-actinin 4 and NF-kappaB in human keratinocytes. The American society for cell biology abstracts. Mol. Biol. Cell 18(supl. 1): 431.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Биваков В.H., Бобков Д.Е., Пету.хова О.А., Туроверова Л.В., Кропачева И.В.. Подольская Е.П., Пинаса Г.П. 2004. а Актинин-4 и р65-субъединица транскрипционного фактора NF-кВ солокаличуются и совместно мигрируют в ядро в клетках А431 под действием ЭФР. Цитология 46: 1064-72.

Are A.F., Galkin V.E.. Pospelova Т. Г., Pinaev G.P. 2000. The p65/RelA subunit of NF-kappaB interacts with actin-containing structures, Exp. Cell Res. 256: 533-44.

Bahakov V.N.. Petukhova О.A.. Turoverova L.V.. Kropacheva I.V.. Tentler D.G., Bolshakova A.V.. Poilolskaya E.P., Magnusson K.E., Pinaev G.P. 2008. RelA/NF-kappaB transcription factor associates with alpha-actinin-4. Exp. Cell Res. 314: 1030-8.

Bell J. 1989. The polymerase chain reaction Immunol Today. 10:351-5.

Benecke B.-J.. Ben-Zccv A., Penman S. 197Я. The control of mRNA production, translation and turnover insuspended and reattached anchorage - dependent fibroblasts. Cell. 14:931 -9.

Bergquist J., GohomJ., Blombcrg A.. Roepstorjf P.. Ekman II 2001. Identification of nuclei associated proteins by 2D-ge) electrophoresis and mass spectrometry. Neurosci. Methods. 109: 3-11.

Bolshakova A.. I'dukhovu ().. Turoverova /.., Tentlcr II. Babukov K, Magnmson K.E., Pauley G. 2007. Extra-cellular matrix proteins induce re-distribution of alpha-aetinin-1 and alpha-actinin-4 in A431 cells. Cell Biol. Int. 3: 360-5.

Feu-ranis A.-K. 2008. Chromatin remodelling and actin organization. H UBS L. 582: 2041-50.

lazal F, Minliajllddin M, Bijli KM, McGralli JL, Rahman A. 2007. Evidence for actin eytoskeleton-dependcnt and -independent pathways for RelA/p65 nuclear translocation in endothelial cells. J. Biol. Clietn. 282:3940-50.

Gencmaiis J.. Van hn/ie K.. Dcjanotc V.. Hubert T.. Vandekerekbove J., De Carte V. 2005. Nuclear actin-binding proteins as modulators ol" gene transcription. Traffic. 6: 847-57.

Gojfart S. Franko A.. Clemen C.S.. Wiesner Ji.J. 2006. Alpha-Actinin 4 and BAT1 interaction with the Cytochrome c promoter upon skeletal muscle differentiation. C'uit. Genet. 49: 125-35.

Hansen J.M.. Moriartv-Craige S.. Jones D.P. 2007. Nuclear and cytoplasmic peroxiredoxin-1 differentially regulate NF-kll activities. Free Rud. Biol. Med. 43: 282-8.

Honda K„ Yamada T„ Endo It.. Ino >'.. Cutoh At. T.sudtt II.. Yamada K. Chiba II.. Hirohashi S. 1998. Actinin-4, a novel actin-bundling protein associated with cell motility and cancer invasion. J. Cell Biol. 140: 1383-93.

Hofmann U'.A.. S/ujiljkinic L, Fnchsova B., Vargas G.M.. Mavroninmtis E., PliiUnwnenko V. Kysela K., Goodrieh J.A.. Lessard J.L., Hope T.J.. Hozak P.. De Lanerolle P. 2004. Actin is part of pre-initiation complexes and is necessary for transcription by RNA polymerase II. Nat. Cell Biol. 6: 1094-110

Hu P., Il'u S., Hernandez N. 21)0-1. A role forbeta-actin in RNA polymerase 111 transcription. Genes Dev. 18: 3010-5.

Laeinmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature. 227: 680-5.

Lelievre S.A. 2009. Contributions of extracellular matrix signaling and tissue architecture to nuclear mechanisms and spatial organization of gene expression control. Biochim Biophys Acta. 1790:925-35.

■Kttstermam G.. El Mjiyad N.. Morion J., Jacobs N.. Pielte J.. Legrand-Poels S. 2008. Actin cytoskeleton differentially modulates NF-kappaB-tnediated tL-8 expression in myclomonocylic cells. Bioclicm. Pharmacol. 76:1214-28.

Perdpalle P.. Jonsson A.. Nashebekin D., Karlsson C., Bergman T„ Guialis A.. Daneholt B. 2002. Nuclear aclin is associated with a specifi c subset of hnRNP A/B-type proteins. Nucleic Acids Res. 30: 1725-34.

Pereipalle P. 2009. The long journey of actin and actin-associated proteins from genes to polysomes. Cell Mol Life Sci. 66:2151-65

Poch M.T.. Al-Kassim L. Smolinski S.M.. Hines R.N. 2004. Two distinct classes of CCAAT box elements that bind nuclear factor-Y/alpha-actinin-4: potential role in human CYPIAI regulation. Toxicol. Appl. Pharmacol. 199: 239-50.

Philimonenko V.V.. Zhao J., /ben S.. Dblgovu II.. Kysela A'., Kalile A/., Zentgraf H, Hofmann W.A.. de Lanerolle P., Hozak P.. Grmnint 1. 2004. Nuclear actin and myosin I are required for RNA polymerase I transcription. Nat. Cell Biol. 6: 1165-72.

Towbin //.. Staehelin T.. Gordon J. 1979. Electrophoretie transfer of proteins from polyacrylatnide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 4350-4.

Vartiainen M.K. 2008. Nuclear actin dynamics - from form to function. FEBS Letters. 582: 2033^40.

Shevehenko A.. Tomas //.. Ilavlisj.. OlsenJ.V.. Mann M. 2006. ln-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat. Protoc. 1: 2856-60.

Автор выражает глубочайшую признательность проф. Г.П. Пинаеву, Д.Г. Тентлеру, Л.В. Туроверовой, проф. К.Э. Магнуссону, 6.Ю. Аксеновой, Е.П. Подольской, А.В. Соловьевой, проф. В.О. Самойлову, A.B. Большаковой, своим родным и близким за помощь и поддержку при выполнении данной диссертационной работы.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 17.05.2010. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 6045Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812)550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хотин, Михаил Георгиевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Клеточная адгезия.

1.1.1 Внеклеточный матрикс.

1.1.2 Рецепторы клеточной адгезии.

1.1.3 Взаимодействие интегриновых рецепторов и актинового цитоскелета.

1.1.4 Изменение экспрессии генов в результате адгезии.

1.2 Цитоскелет - ключевой компонент передачи сигнала от поверхности клетки в ядро.^.

1.2.1 Организация актинового цитоскелета.

1.3 Актин в ядре.

1.3.1 Формы организация актина в ядре.

1.3.2 Актин принимает участие в ремоделировании хроматина.

1.3.3 Ядерный актин и РНК-полимеразы.27 •

1.3.4 Участие ядерного актина в созревании мРНК.

1.4 Ядерные актин-связывающие белки.

1.4.1 Малые актин-связывающие белки в ядре: профилин, тимозин [34 и кофилин.

1.4.2 Гельзолин-подобные белки: Cap G, гельзолин и flightless 1.

1.4.3 Белки, содержащие LIM домены - семейство зиксинов и паксилинов.

1.4.4 Белки, организующие и группирующие актиновые филаменты.

1.5 а-Актинин 4.

1.5.1 Механизмы накопления а-актинина 4 в ядре.

1.5.2 Белки, образующие комплексы с а-актинином 4.

1.6 Транскрипционный фактор NF-kB.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Культивирование клеток.

2.2 Нанесение клеток на иммобилизованные белки внеклеточного матрикса.

2.3 Выделение клеточных ядер.

2.4 Иммунопреципитация ядерных белковых комплексов.

2.5 Определение состава белковых комплексов методами SDS-электрофореза и иммунобл отинга.

2.6 Двумерный электрофорез белков.

2.7 Масс-спектрометрический анализ.

2.8 Анализ экспрессии генов-мишеней р65 субъединицы NF-kB.

2.9 Анализ наличия изоформ а-актинина 4 в клетках А431.

2.10 Конструирование экспрессионных плазмид.

2.11 Трансфекция клеток НЕК293 сконструированными экспрессионными плазмидами.

2.12 Денситометрический анализ и статистическая обработка данных.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Взаимодействие клетки с белками внеклеточного матрикса влияет на формирование ядерных белковых комплексов а-актинина 4 и р65 субъединицы транскрипционного фактора NF-kB в клетках линии А431.

3.2 Зависимость активности транскрипционного фактора NF-kB от содержания а-актинина 4 в ядерных белковых комплексах р65.

3.3 Состав ядерных белковых комплексов а-актинина 4.

3.3.1 Анализ ядерных белковых комплексов, содержащих а-актинин 4.

3.3.2 Выбор метода окрашивания белков в геле для последующего масс-спектрометрического анализа.

3.3.3 Идентификация белков, образующих ядерные комплексы с а-актинин 4, методом MALDI-TOF масс-спектрометрии.

3.3.4 Идентификация белков, связанных с а-актинин 4 в ядерных белковых комплексах методом MALDI-TOF-TOF.

3.3.5 Подтверждение данных масс-спектрометрии методами иммунохимии.

3.3.6 а-Актинин 4 взаимодействует с белками, регулирующими метаболизм мРНК

3.4 Анализ включения различных изоформ а-актинина 4 в ядерные белковые комплексы, регулирующие транскрипцию и созревание мРНК.

3.4.1 Выявление новой изоформы а-актинина 4.

3.4.2 Вовлечение изоформ а-актинина 4 в различные ядерные белковые комплексы

3.5 Влияние гиперэкспрессии изоформ а-актинина 4 на активность транскрипционного фактора NF-kB.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие α-актинина 4 с ядерными белковыми комплексами, регулирующими экспрессию генов"

Изучение роли цитоскелета в регуляции экспрессии генов с каждым годом приобретает все большую актуальность по мере того, как открываются новые факты о его регуляторных функциях (Sotiropoulos et al., 1999; Fazal et al., 2007; Kustermans et al., 2008).

Цитоскелет состоит из актиновых филаментов, микротрубочек и промежуточных филаментов. Он образует мобильную сеть в цитоплазме клетки, организует внутриклеточное пространство, определяя форму клетки, участвует в клеточной адгезии и миграции (Bershadsky, Vasiliev, 1988; Hynes, 1999). Его перестройки являются первичной реакцией клеток на различные внеклеточные сигналы, такие, как изменение состава внеклеточного матрикса (ВКМ) или воздействие ростовых факторов, и могут приводить к изменению экспрессии генов (Fazal et al., 2007). Некоторые сигнальные молекулы, в том числе и транскрипционные факторы, взаимодействуют с белками актинового цитоскелета и перераспределяются в клетке при индуцированных перестройках цитоскелета (Otey and Carpen, 2004; Kustermans et al., 2008). Однако остаются невыясненными механизмы участия цитоскелета в сигнальных каскадах.

Обнаружение в ядре актина и ряда актин-связывающих белков, таких как зиксин, паксилин, винкулин, гельзолин, а-актинин 4 и др., стало ключевым этапом в исследовании возможных механизмов участия цитоскелета в экспрессии генов. Существует ряд работ, в которых показано участие ядерного актина в регуляции активности всех трех РНК-полимераз (Hofman et al., 2004; Ни et al., 2004; Philimonenko et al., 2004). Известно о его включении в белковые комплексы, регулирующие сплайсинг мРНК (Percipalle et al., 2002), и участии в ремоделировании хроматина (Farrants, 2008). Однако не установлено, какие функции выполняет актин в этих процессах (Pederson, 2008). Если его роль в ядре изучена недостаточно, то ядерные функции актин-связывающих белков, в большинстве своем, неизвестны вовсе. Исследование механизмов участия актин-связывающих белков в ядерных процессах необходимо для понимания их роли в клетке и открывает возможность получения дополнительной информации о путях передачи сигнала с поверхности клетки в ядро и реализации сигналов в виде изменения уровня экспрессии генов.

Одним из актин-связывающих белков, имеющих ядерную локализацию, является а-актинин 4 (Actn4). Он принадлежит к спектриновому суперсемейству и, наряду с а-актинином 1, относится к группе немышечных актининов (Honda et al., 1998). Основными функциями Actn4 в цитоплазме считаются соединение микрофиламентов актина при формировании актиновых стресс-фибрилл, их стабилизация, а также участие в образовании фокальных контактов. Тем не менее вопрос о функциональности его ядерной транслокации остается открытым. Перераспределение Actn4 в ядро наблюдали при ингибировании Р1РЗ-киназы, деполимеризации актина и распластывании .клеток на белках внеклеточного матрикса (Honda et al., 1998; Бабаков и др., 2004).

Существует ряд литературных данных, свидетельствующих о том, что Actn4 может взаимодействовать с белками, непосредственно участвующими в экспрессии генов. Он входит в состав белкового комплекса, образованного транскрипционным фактором NF-Y при активации процесса транскрипции (Poch et al., 2004), и может совместно со сплайсинговым фактором ВАТ1 связываться с промотором гена CYT С (Goffart et al., 2006), а также взаимодействует с гистон-деацетилазой 7 (HDAC 7) (Chakraborty et al., 2006). Между тем роль Actn4 в этих комплексах остается неизвестной.

Ранее в Лаборатории биологии клетки в культуре ИНЦ РАН при исследовании взаимодействия активного цитоскелета и транскрипционного фактора NF-кВ было выявлено, что Actn4 является белком, который может связываться как с актином, так и с р65 субъединицей этого транскрипционного фактора (Are et al., 2000). При воздействии на клетки TNF-a и цитохалазина происходит совместная транслокация р65 и Actn4 в ядро (Бабаков и др., 2004; Babakov et al., 2008). Кроме того, эти два белка содержатся в одном ядерном белковом комплексе во фракции транскрипционных факторов (Bolshakova et al., 2007). В экспериментах in vitro установлено, что Actn4 принимает участие в ДНКсвязывающей активности NF-кВ (Большакова, 2009). Таким образом, предварительные данные позволили предположить участие Actn4 в регуляции активности NF-кВ. Однако неизвестно влияет ли включение Actn4 в ядерные белковые комплексы, содержащие р65 субъединицу NF-кВ на активность этого транскрипционного фактора. Также непонятно является ли одновременное перераспределение Actn4 и р65 в ядро следствием активации NF-кВ посредством Actn4.

Транскрипционный фактор NF-кВ регулирует активность большого числа генов, вовлеченных в различные клеточные процессы, такие как пролиферация, апоптоз, клеточный цикл и др. (Pahl, 1999). Установлено, что р65 субъединица транскрипционного фактора NF-кВ может перераспределяться в цитоплазме совместно со структурами актинового цитоскелета при адгезии на различных белках ВКМ (Are et al., 2000). Выявлена корреляция между реорганизацией актинового цитоскелета и ДНК-связывающей активностью NF-кВ при распластывании клеток А431 на фиброиектине, ламинине и антителах к рецептору эпидермального фактора роста (ЭФР) (Емельянов, 2006). Таким образом, белки ВКМ активируют цитоскелет-зависимый путь регуляции транскрипционного фактора NF-кВ. Исследование роли Actn4 в регуляции активности NF-кВ имеет особое значение в изучении неканонических путей активации этого транскрипционного фактора и участия Actn4 в регуляции пролиферации, апоптоза и трансформации клетки.

Данные о ядерной локализации Actn4 и результаты исследований взаимодействия Actn4 с транскрипционным фактором NF-кВ, проводимых в Лаборатории биологии клетки в культуре ИНЦ РАН, привели к необходимости проведения системного анализа функций этого актин-связывающего белка в ядре и его роли в регуляции активности NF-kB.

Цель настоящей работы заключалась в выявлении ядерных процессов, в которых принимает участие а-актинин 4.

Достижение поставленной цели предполагает решение следующих задач.

1. Исследовать взаимодействие а-актинина 4 с ядерными белковыми комплексами р65 субъединицы NF-кВ при распластывании клеток на различных белках внеклеточного матрикса.

2. Провести анализ возможности участия а-актинина 4 в регуляции активности транскрипционного фактора NF-кВ в отношении ряда р65-зависимых генов.

3. Определить состав ядерных белковых комплексов, в которые входит а-актинин 4.

4. Сравнить включение изоформ а-актинина 4 в ядерные белковые комплексы, выполняющие различные функции.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Клеточная адгезия

В организме все клетки находятся в окружении внеклеточного матрикса. Взаимодействие с ним оказывает влияние на большинство клеточных процессов. Основными структурами, осуществляющими и регулирующими это взаимодействие, являются комплексы фокальной адгезии. Они образуются в местах концентрации активированных рецепторов ВКМ - интегринов, которые пронизывают клеточную мембрану. Эти комплексы состоят из рецепторов клеточной адгезии, белков, стабилизирующих эту структуру, и белков, передающих сигнал от рецепторов в клетку. Формирование комплексов фокальной адгезии происходит при участии актинового цитоскелета, а сигнал от белков ВКМ передается в клетку при его участии. Связь между комплексами фокальной адгезии и актиновыми филаментами осуществляется за счет ряда актин-связывающих белков (Burridge and Chranowska-Wodnicka, 1996).

Взаимодействие клетки с разными белками ВКМ запускает различные сигнальные каскады. Комбинация этих сигналов приводит к специфической реакции клетки на ВКМ определенного состава. Так, ВКМ окружает стволовые клетки, находящиеся в специфических нишах. Изменения в его составе или структуре регулируют активацию их дифференцировки (Watt, 2002).

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Хотин, Михаил Георгиевич

выводы

1. Количество а-актинина 4 в ядерных белковых комплексах, содержащих р65 субъедипицу транскрипционного фактора NF-кВ отличается при распластывании клетки на различных белках внеклеточного матрикса. Изменение содержания а-актинина 4 коррелирует с уровнем экспрессиии генов-мишеней р65 — В АХ и TNC, что свидетельствует о возможном участии а-актинина 4 в регуляции активности транскрипционного фактора NF-kB.

2. Помимо ассоциации с р65 субъединицей NF-кВ а-актинин 4 входит в состав ряда других ядерных комплексов, содержащих около 50 различных белков. Идентификация этих белков методом масс-спектрометрии показала, что в их число входят белки, регулирующие экспрессию генов на уровнях транскрипции и процессинга мРНК.

3. Полноразмерный а-актинин 4 и его укороченная изоформа с делецией кальпониновых доменов входят в состав разных белковых комплексов. Полноразмерная изоформа связана с белками гетерогенного рибонуклеопротеинового комплекса, а укороченная — с а-тубулином.

4. В клетках НЕК-293, в которых NF-кВ находится в неактивном состоянии, гиперэкспрессия полноразмерной и укороченной изоформ а-актинина 4 не приводит к изменению активности NF-kB.

5 а-Актинин 4 входит в состав ядерных белковых комплексов, регулирующих экспрессию генов на уровнях транскрипции, процессинга и транспорта мРНК. Вероятно, его ядерные функции связаны с участием в этих процессах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хотин М.Г., Туроверова Л.В., Подольская Е.П., Краснов И.А., Соловьева А.В., Аксенова В.Ю., Магнуссон К.-Э., Пинаев Г.П., Тентлер Д.Г. 2009. Исследование ядерных белковых комплексов а-актинина 4 методами двумерного электрофореза и масс-спектрометрии. Цитология, 51 (8): 684-690.

2. Туроверова Л.В., Хотин М.Г., Юдинцева Н.М., Магнуссон К-Э., Блинова М.И., Пинаев Г.П., Тентлер Д.Г. 2009. Метод анализа белков внеклеточного матрикса, синтезируемого клетками в культуре. Цитология, 51 (8): 691-697.

3. Хотин М.Г., Туроверова Л.В., Соловьева А.В., Пинаев Г.П., Тентлер Д.Г. 2010 Содержание альфа-актинина-4 в ядерных белковых комплексах р65 субъединицы NF-kB коррелирует с активностью этого транскрипционного фактора. Цитология, 52 (6): 522.

4. Хотин М.Г., Туроверова Л.В., Аксенова В.Ю., Соловьева А.В., Пинаев Г.П., Тентлер Д.Г. 2010. а-Актинин 4 участвует в ядерных белковых комплексах регулирующих экспрессию генов. Цитология, 52 (3): 267.

5. Аксенова В.Ю., Хотин М.Г., Туроверова Л.В., Пинаев Г.П., Тентлер Д.Г. Исследование ядерных функций актин-связывающего белка альфа-актинина 4 и его участия в регуляции экспрессии генов. Материалы съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Ч.Дарвина, и V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. 21-27 июня 2009 г., Москва. С.41.

6. Хотин М. Г., Соловьева А. В., Тентлер Д. Г., Туроверова Л. В., Magnusson К. Е., Пинаев Г. П. Экспрессия генов-мишеней р65 субъединицы NF-кВ у кератиноцитов человека при культивировании на различных белках ВКМ. Материалы IV съезда Общества биохимиков и молекулярных биологов. 10-16 мая 2008 г. Новосибирск. С. 184.

7. Хотин М.Г. Анализ состава мультимолекулярных белковых комплексов, содержащих а-актинин-4 в клеточном ядре, методами масс-спектрометрии. XIII

Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов. 15 декабря 2008, Санкт-Петербург. С.50

8. Спичкина О.С., Хотин М.Г., Соловьева А.В., Тентлер Д.Г., Туроверова JI.B., Блинова М.И., Пинаев Г.П. (2007) Влияние белков внеклеточного матрикса на распределение р65 субъединицы транскрипционного фактора NF-кВ и а-актинина 4 в ядре кератиноцитов человека. Цитология, 49 (9): 796.

9. Tentler D., Turoverova L., Khotin M., Solovyeva A., Petukhova O., Bolshakova A., Magnusson K., Pinaev G. P. 2007 Extracellular matrix proteins define the composition of nuclear protein complexes with alpha-actinin 4 and NF-kappaB in human keratinocytes. The American society for cell biology abstracts. Mol. Biol. Cell 18 (supl. 1): 431.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хотин, Михаил Георгиевич, Санкт-Петербург

1. Арэ А.Ф. 2000. Взаимодействие поверхностных рецепторов клетки с различными иммобилизованными и свободными лигандами определяет структуру актинового цитоскелета. Диссертация на соискание ученой степени канд. биол. наук. С.-Петербург.

2. Бабаков В.Н. 2004. Взаимодействие изоформ а-актинина с транскрипционным фактором RelA/NF-кВ. Диссертация на соискание ученой степени канд. биол. наук. С.-Петербург. 100 с.

3. Большакова А.В. 2009 Распределение р65 мубъединицы транскрипционного фактора NF-кВ и изоформ а-актинина в связи с реорганизацией актинового цитоскелета. Диссертация на соискание ученой степени канд. биол. наук. С.-Петербург. 130 с.

4. Галкин В.Э., Туроверова Л.В., Константинова И.М., Пинаев Г.П. 1998. 26S-рибонуклеопротеиновый комплекс (268-протеасома) непосредственно взаимодействует с фибриллярным актином. Цитология. 40 (7): 618-626.

5. Емельянов А.Н. 2006. Изменения ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов при реорганизациях актинового цитоскелета клеток А431. Диссертация на соискание ученой степени канд. биол. наук. С.-Петербург.

6. Калмыкова Н.В. 2004. Влияние разных изоформ ламинина на адгезию и миграцию нормальных и трансформированных кератиноцитов человека. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, С-Петербург. 98 с.

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. 1984. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование, перевод с англ. под ред. Баева А.А. и Скрябина К.Г. М: Мир. 480 с.

8. Петухова О. А., Туроеерова Л. В., Кропачёва И. В., Пинаев Г. П. 2004. Анализ морфологических особенностей популяции клеток эпидермоидной карциномы А431, распластанных на иммобилизованных лигандах. Цитология. 46 (1): 5- 15.

9. Пинаев Г.П. 2009. Сократительные системы клетки: от мышечного сокращения к регуляции клеточных функций. Цитология. 51 (3): 172 181.

10. Пинаев ГЛ., Аре А.Ф., и др. 2004. Роль внеклеточного матрикса в процессах дифференцировки стволовых клеток и регенерации тканей. Цитология 2004.46(10): 934.

11. Abe Н., Obinata Т., Minamide L.S., Bamburg J.R. 1996. Xenopus laevis actin-depolymerizing factor/cofilin: a phosphorylation-regulated protein essential for development. J. Cell Biol. 132 (5): 871 85.

12. Akoumianaki Т., Kardassis D., Polioudaki H., Georgatos S.D., Theodoropoulos P.A. 2009. Nucleocytoplasmic shuttling of soluble tubulin in mammalian cells. J. Cell Sci. 122 (8): 1111-8.

13. Araki N., Hatae Т., Yamada Т., Hirohashi. 2000. Actinin-4 is preferentially involved in circular ruffling and macropinocytosis in mouse macrophages: analysis by fluorescence ratio imaging. J. of Cell Science. 113: 3329 3340.

14. Archer S.K., Claudianos C., Campbell H.D. 2007. Evolution of the gelsolin family of actin-binding proteins as novel transcriptional coactivators. BioEssays. 27: 388 -396.

15. Are A.F., Galkin V.E., Pospelova T.V., Pinaev G.P. 2000. The RelA/p65 subunit of NF-кВ interacts with actin-containing structures. Exp. Cell Res. 256: 533 544.

16. Armstrong S.J., Wiberg M, Terenghi G., Kingham P.J. 2008. Laminin activates NF-карраВ in Schwann cells to enhance neurite outgrowth. Neurosci. Lett. 439 (1): 426.

17. Babakov V.N., Petukhova OA., Turoverova L.V., Kropacheva I.V., Tentler D.G., Bolshakova A. V., Podolskaya E.P., Magnusson K.E., Pinaev G.P. 2008. RelA/NF-kappaB transcription factor associates with alpha-actinin-4. Exp. Cell Res. 314: 10301038.

18. Banno Т., Gazel A., Blumenberg M. 2005. Pathway-specific profiling identifies the NF-kB-dependent TNFa-regulated genes in epidermal keratinocytes. J.Biol. Chem. 280: 18973 -80.

19. Batchelor C.L., Woodward A.M., Crouch D.H. 2004. Nuclear ERM (ezrin, radixin, moesin) proteins: regulation by cell density and nuclear import. Exp. Cell Res. 296: 208-222.

20. Beck K., Hunter I., Engel J. 1990. Structure and function of laminin: anatomy of multidomain glycoprotein. FASEB J. 4: 148 160.

21. Beckerle M.C., Yeh R.K. 1990. Talin: role at sites of cell-substratum adhesion. Cell Motil Cytoskeleton.16 (1): 7 13.

22. Beckerle M. C. is ed. 2001. Cell adhesion. Oxford. 403 p.

23. Belkin A.M., Koteliansky V.E. 1987. Interaction of iodinated vinculin, metavinculin and alpha-actinin with cytoskeletal proteins. FEBS Lett. 220 (2): 291-4.

24. Benecke B.-J., Ben-Zeev A., Penman S. 1978. The control of mRNA production, translation and turnover insuspended and reattached anchorage dependent fibroblasts. Cell. 14:931-9.

25. Bergquist J., Gobom J., Blomberg A., Roepstorjf P., Ekman R. 2001. Identification of nuclei associated proteins by 2D-gel electrophoresis and mass spectrometry. Neurosci. Methods. 109: 3-11.

26. Bershadsky, A.D., Vasiliev, J.M. 1988. Cytoskeleton. New York. Plenum Press: 298

27. Bettinger B.T., Gilbert D.M., and Amberg D.C. 2004. Actin up in the nucleus. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5: 410-5.

28. Beyaert R. 2004. Nuclear Factor-kappaB: Regulation and Role in Disease. Kluwer Academic Publishes. Dordrecht: The Netherlands. 426 p.

29. Bolshakova A., Petukhova O., Turoverova L., Tender D., Babakov V., Magnusson K.E., Pinaev G. 2007. Extra-cellular matrix proteins induce re-distribution of alpha-actinin-1 and alpha-actinin-4 in A431 cells. Cell Biol. Int. 3: 360-365.

30. Broderick M.J.F., Winder S.J. 2005. Spectrin, a-actinin, and dystrophin. Adv. Prot. Chem. 70:203 -33.

31. Buratti E., Dork Т., Zuccato E., Pagani F., Romano M., Baralle F.E. 2001. Nuclear factor TDP-43 and SR proteins promote in vitro and in vivo CFTR exon 9 skipping. EMBO J. 20 (7): 1774 84.

32. Burridge K., Chrzanowska-Wodnicka M. 1996. Focal adhesions, contractility, and signaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 12: 463 518.

33. Carlier M.F., Wiesner S., Le Clainche C., Pantaloni D. 2003. Actin-based motility as a self-organized system: mechanism and reconstitution in vitro. С R Biol. 326 (2): 161-70.

34. Carlotti F., Dower S.K., Qwarnstrom E.E. 2000. Dinamic shuttling of nuclear factor kB between the nucleus and cytoplasm as a consequence of inhibitor dissociation. The journal of biological chemistry. 275 (52): 41028 34.

35. Carman C.V, Springer T.A. 2003. Integrin avidity regulation: are changes in affinity and conformation underemphasized? Curr. Opin. Cell Biol. 15 (5): 547 56.

36. Chen H., Bernstein B.W., Bamburg J.R. 2000. Regulating actin-filament dynamics in vivo. Trends Biochem Sci. 25 (1): 19-23.

37. Choi C.K., Vicente-Manzanares M, Zareno J., Whitmore L.A., Mogilner A., Horwitz A.R. 2008. Actin and alpha-actinin orchestrate the assembly and maturation ofnascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nat. Cell Biol. 10 (9): 1039 -50.

38. Clark TG, Rosenbaum JL. 1979. An actin filament matrix in hand-isolated nuclei ofX. laevis oocytes. Cell. 18 (4): 1101-8.

39. Clubb B.H., Locke M. 1998. Peripheral nuclear matrix actin forms perinuclear shells. J. Cell. Biochem. 70: 240-51.

40. Dahl K.N., Ribeiro A.J.S., 2008. Lammerding J. Nuclear shape, mechanics, and mechanotransduction. Circ. Res. 102 (11): 1307 18.

41. Dhawan J., Farmer S.R. 1990. Regulation of al(I) collagen gene expression in response to cell adhesion in swiss 3T3 fibroblasts. J. of Biol. Chem. 265 (16): 9015 - 6.

42. Dike L.E., Farmer S.R. 1988. Cell adhesion induces expression of growth -associated genes in suspension arrested fibroblasts. Cell Biology. 85: 6792 - 6.

43. Domazetovska A., Ilkovski В., Cooper S.T., Ghoddusi M., Hardeman E.C., Minamide L.S., Gunning P.W., Bamburg J.R., North K.N. 2007. Mechanisms underlying intranuclear rod formation. Brain. 130 (Pt 12): 3275 84.

44. Dzidek M, Timpl R. 1985. Expression of nidogen and laminin in basement membranes during mouse embryogenesis and teratocareinoma cells. Dev. Biol. 11: 372 -82.

45. Farrants A.-K. 2008. Chromatin remodelling and actin organization. FEBS L. 582: 2041 -50.

46. Fazal F., Minhajuddin M, Bijli KM., McGrath J.L., Rahman A. 2007. Evidence for actin cytoskeleton-dependent and independent pathways for RelA/p65 nuclear translocation in endothelial cells. J. Biol. Chem. 282(6): 3940-50.

47. Feng Y., Walsh C.A. 2004. The many faces of filamin: A versatile molecular scaffold for cell motility and signaling. Nat. Cell Biol. 6: 1034 38.

48. Fomproix N., Percipalle P. 2004. An actin-myosin complex on actively transcribing genes. Exp. Cell Res. 294: 140 8.

49. Fraley T.S., Pereira C.B., Tran T.C., Singleton C., Greenwood J.A. 2005. Phosphoinositide binding regulates alpha-actinin dynamics: mechanism for modulating cytoskeletal remodeling. J. Biol. Chem. 280 (15): 15479 82.

50. Franco S.J., Rodgers M.A., Perrin B.J., Han J., Bennin D.A., Critchley D.R., Hnttenlocher A. 2004. Calpain-mediated proteolysis of talin regulates adhesion dynamics. Nat. Cell Biol. 6 (10): 977 83.

51. Frisch S.M., Screaton R.A. 2001. Anoikis mechanisms. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (5): 555 62.

52. Geiger В., Bershadsky A., Pankov R., Yamada KM. 2001. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix-cytoskeleton crosstalk. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2(11): 793 -805.

53. George E.L., et. al. 1993. Defects in mesoderm, neural tube and vascular development in mouse embryos lacking fibronectin. Development. 119: 1079 91.

54. Gettemans J., Van Impe K., Delanote V., Hubert Т., Vandekerckhove J., De Corte V. 2005. Nuclear actin-binding proteins as modulators of gene transcription. Traffic. 6: 847 57.

55. Gilmore A.P., Burridge К. 1996. Regulation of vinculin binding to talin and actin by phosphatidyl-inositol-4-5-bisphosphate. Nature. 381 (6582): 531 -5.

56. Goffart S., Franko A., Clemen C.S., Wiesner R.J. 2006. Alpha-Actinin 4 and BAT1 interaction with the Cytochrome с promoter upon skeletal muscle differentiation. Curr. Genet. 49: 125- 135.

57. Griffith B.N., Walsh C.M., Szeszel-Fedorowicz W., Timperman A.T., Salati L.M. 2006. Identification of hnRNPs K, L and A2/B1 as candidate proteins involved in the nutritional regulation of mRNA splicing. Biochim Biophys Acta. 1759 (11-12): 552 -61.

58. Grummt I. 2006. Actin and myosin as transcription factors. Curr Opin Genet Dev. 16(2): 191-6.

59. Habib A.A., Chatterjee S., Park S-K., Ratan R.R., Lefebvre S., Vartanian T. 2001. The epidermal growth factor receptor interacting protein and nuclear factor -kB (NF-kB)-inducing kinase to activate NF-кВ. J Biol Chem. 276: 8865 74.

60. Hansen J.M., Moriarty-Craige S., Jones D.P. 2007. Nuclear and cytoplasmic peroxiredoxin-1 differentially regulate NF-кВ activities. Free Rad. Biol. Med. 43: 2828.

61. Нага Т., Honda K., Shitashige M., Ono-M., Matsuyama H., Naito K., Hirohashi S., Yamada T. 2007. Mass Spectrometry Analysis of the Native Protein Complex Containing Actinin-4 in Prostate Cancer Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 6: 479 -91.

62. He Y., Smith R. 2009. Nuclear functions of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A/B. Cell. Mol. Life Sci. 66: 1239 56.

63. He Y., Smith R. 2009. Nuclear functions of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A/B. Cell. Mol. Life Sci. 66 (7): 1239 56.

64. Hiroi Y., Guo Z., Li Y., Beggs A.H., Liao J.K. 2008. Dynamic regulation of endothelial NOS mediated by competitive interaction with alpha-actinin-4 and calmodulin. FASEB J. 22 (5): 1450 7.

65. Hofmann W. 2009. Cell and molecular biology of nuclear actin. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 6: 219-63.

66. Hofmann W.A., de Lanerolle P. 2006. Nuclear actin: to polymerize or not to polymerize. J. Cell Biol. 172 (4): 495 6.

67. Honda It, Yamada Т., Endo R., Ino Y., Gotoh M., Tsuda H., Yamada Y., Chiba H., Hirohashi S. 1998. Actinin-4, a novel actin-bundling protein associated with cell motility and cancer invasion. J. Cell Biol. 140: 1383-93.

68. Horwitz A.F., Hunter T. 1996. . Cell adhesion: integrating circuitry. Trends in Cell Biol. 6:460-461.79. http:// www.nf-kb.org

69. Ни P., Wu S., Hernandez N. 2004. A role for beta-actin in RNA polymerase III transcription. Genes Dev. 18: 3010-15.

70. Huang T.T., Kudo N., Yoshida M., Miyamoto S. 2000. A nuclear export signal in the N-terminal regulatory domain of IB controls cytoplasmic localization of inactive NF-kB/IkB complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 1014 19.

71. Huang T.T., Kudo N., Yoshida M., Myamoto S. 2000. A nuclear export signal in the Nterminal regulatory domain of Ikappa В a controls cytoplasmic localization of inactive NF kappa В/ Ikappa В a complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 1014 19.

72. Huff Т., Rosorius О., Otto A.M., Muller C.S., Ballweber E., Hannappel E., Mannherz H.G. 2004. Nuclear localization of the G-actin sequestering peptide thymosin beta4. J.Cell Sci. 117: 5333 -41.

73. Jenq W., Wu S.J., Kefalides N.A. 1994. Expression of a2-subunit of laminin correlates with increased cell adhesion and metastatic propensity. Differentation. 58 (1): 29 -36.

74. Johnston I.M., Allison S.J., Morton J.P., Schramm L., Scott P.H., White R.J. 2002. CK2 forms a stable complex with TFIIIB and activates RNA polymerase III transcription in human cells. Mol. Cell Biol. 22(11): 3757 68.

75. Jonson L., Vikesaa J., Krogh A., Nielsen L.K., Hansen Т., Borup R., Johnsen A.H., Christiansen J., Nielsen F.C. 2007. Molecular composition of IMP1 ribonucleoprotein granules. Mol. Cell. Proteomics. 6: 798 811.

76. Kanungo J., Pratt S.J., Marie H, Longmore G.D. 2000. Ajuba, a cytosolic LIM protein, shuttles into the nucleus and affects embryonal cell proliferation and fate decisions. Mol. Biol. Cell. 11 (10): 3299-313.

77. Koizumi Т., Nakatsuji H., Fukawa Т., Avirmed S., Fukumori Т., Takahashi M., Kanayama H. 2010. The role of actinin-4 in bladder cancer invasion Urology. 75 (2): 357 -64.

78. Krauss S. W., Chen C., Penman S., Heald R. 2003. Nuclear actin and protein 4.1: essential interactions during nuclear assembly in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (19): 10752-7.

79. Krecic A.M., Swanson M.S. 1999. hnRNP complexes: composition, structure, and function, Curr. Opin. Cell Biol. 11: 363 371.

80. Kukalev A., Nord Y., Palmberg C., Bergman Т., P. Percipalle. 2005. Actin and hnRNP U cooperate for productive transcription by RNA polymerase II. Nat. Struct. Mol. Biol. 12: 238-244.

81. Kumar C.C. 1998. Signaling by integrin receptors. Oncogene. 17: 1365 — 73.

82. Kumeta M., Yoshimura S.H., Harata M., Takeyasu K. 2010. Molecular mechanisms underlying nucleocytoplasmic shuttling of actinin-4. J. Cell. Sci. 123: 1020 -30.

83. Kustermans G., El Mjiyad N., Horion J., Jacobs N., Piette J., Legrand-Poels S. 2008. Actin cytoskeleton differentially modulates NF-kappaB-mediated IL-8 expression in myelomonocytic cells. Biochem. Pharmacol. 76 (10): 1214 28.

84. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature. 227: 680 685.

85. Lafranie R.M., Berner S.M., Yamada K.M. 1998. Adhesion to flbronectin or collagen 1 gel induced rapid, extensive, biosynthetic alterations in epithelial cells. J. of cellular physiology. 175: 163 173.

86. Lane N.J. 1969. Intranuclear fibrillar bodies in actinomycin D-treated oocytes. J. Cell Biol. 40 (1): 286-291

87. Lederer M., Jockusch B.M., Rothkegel M. 2005. Profilin regulates the activity of 42POP, a novel Myb-related transcription factor. J. Cell Sci. 118(Pt 2): 331 41.

88. Lee K.S., Buck M., Houglum K., Chojkier M. 1995. Activation of hepatic stellate cells by TGF alpha and collagen type I is mediated by oxidative stress through c-myb expression. J. Clin. Invest. 96 (5): 2461 8.

89. Leffers II, Dejgaard K., Celis J.E. 1995. Characterisation of two major cellular poly(rC)-binding human proteins, each containing three K-homologous (KH) domains. Eur J Biochem. 230 (2): 447 53.

90. Loy С. J., Sim К. S., Yong E. L. 2003. Filamin-A fragment localizes to the nucleus to regulate androgen receptor and coactivator functions. PNAS. 100: 4562 -4567.

91. Maciver S.K., Hussey P.J. 2002. The ADF/cofilin family: actin-remodeling proteins. Genome Biol. 3 (5): 3007.1 -3007.12

92. Makeyev A.V., Kim C.B., Ruddle F.H., Enkhmandakh В., Erdenechimeg L., Bayarsaihan D. 2005. HnRNP A3 genes and pseudogenes in the vertebrate genomes. J Exp Zool A Comp Exp Biol. 303 (4): 259-71.

93. Matsuda K. 2004. Laminin and Alzheimer's disease. Psichogeriatrics. 4: 19-38.

94. McMahon L.W., Walsh C.E., Lambert M.W. 1999. Human alpha spectrin II and the Fanconi anemia proteins FANCA and FANCC interact to form a nuclear complex. J. Biol. Chem. 274 (46): 32904 8.

95. Menko A.S., Tan K.B. 1980. Nuclear tubulin of tissue culture cells. Biochim Biophys Acta. 629 (2): 359 70.

96. Merkurio F., Manning A.M. 1999. Multiple signals converging on NF-кВ. Curr. Opinion in Cell Biol. 11: 226 232.

97. Mettouchi A., Cabon F., Montreau N., Dejong V., Vernier P., Gherzi R., Mercier G., Binetruy B. 1997. The c-Jun-induced transformation process involves complex regulation of tenascin-C expression. Mol. Cell Biol. 17 (6): 3202 9.

98. Mili S., Shu H.J., Zhao Y., Pinol-Roma S. 2001. Distinct RNP complexes of shuttling hnRNP proteins with pre-mRNA and mRNA: candidate intermediates in formation and export of mRNA. Mol Cell Biol. 21 (21): 7307 19.

99. Minner J.H., Yurchenco P.D. 2004. Laminin functions in tissue Morphogenesis. Cell Dev. Biol. 20: 255 84.

100. Mizuguchi G., Shen X., Landry J., Wu W.H., Sen S., Wu C. 2004. ATP-driven exchange of histone IT2AZ variant catalyzed by SWR1 chromatin remodeling complex. Science. 303 (5656): 343 8.

101. Nielsen J., Kristensen M.A., Willemoes M., Nielsen F.C., Christiansen J. 2004. Sequential dimerization of human zipcode-binding protein IMP1 on RNA: a cooperative mechanism providing RNP stability. Nucleic Acids Res. 32: 4368 76.

102. Nishida E., JidaK., Yonezawa N., KoyasuS., Yahara I., Sakai H. 1987. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 5262 6.

103. Nix D.A., Becker le M.C. 1997. Nuclear-cytoplasmic shuttling of the focal contact protein, zyxin: a potential mechanism for communication between sites of cell adhesion and the nucleus. J. Cell Biol. 138 (5): 1139-47.

104. Nuckolls G.H., Turner C.E., Burridge K. 1990. Functional studies of the domains oftalin. J. Cell Biol. 110 (5): 1635-44.

105. ObrdlikA., Kukalev A., Louvet E., O. Farrants A.-K., Caputo L., and Percipalle P. 2008. The histone acetyl transferase PCAF associates with actin and hnRNP U for RNA polymerase II transcription. Mol. Cell Biol. 28: 6342 57.

106. Olave LA., Reek-Peterson S.L., Crabtree G.R 2002. Nuclear actin and actin-related proteins in chromatin remodeling. Annu Rev Biochem.71: 755 781

107. Otey C.A., Carpen O. 2004. Alpha-actinin revisited: A fresh look at an old player. Cell Motil. Cytoskeleton. 58: 104 111.

108. Otey C.A., Burridge K. 1990. Patterning of the membrane cytoskeleton by the extracellular matrix. Semin. Cell Biol. 1 (5): 391-9.

109. Ozanne D. M., Brady M. E., Cook S., Gaughan L., David E. N., Robson C. N. H. 2000. Androgen receptor nuclear translocation is facilitated by the f-actin cross-linking protein filamin. Mol. Endocrinol. 14: 1618-26.

110. Pahl H.L. 1999. Activators and target genes of Rel/NF-kappaB transcription factors. Oncogene. 18 (49): 6853 66.

111. Pancov R., Yamada KM. 2002. Fibronectin at a glance. Cell Sc. 115: 3861 -3863.

112. Pederson T. 2008. As functional nuclear actin comes into view, is it globular, filamentous, or both? J. Cell Biol. 180 (6): 1061 -4.

113. Percipalle P., Fomproix N., Kylberg K., Miralles F., Bjorkroth В., Daneholt В., Visa N. 2003. An actin-ribonucleoprotein interaction is involved in transcription by RNA polymerase II. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100 (11): 6475 80.

114. Percipalle P., Jonsson A., Nashchekin D., Karlsson C., Bergman Т., Guialis A., Daneholt B. 2002. Nuclear actin is associated with a specifi с subset of hnRNP A/B-type proteins. Nucleic Acids Res. 30: 1725 34.

115. Percipalle P., Visa N. 2006. Molecular functions of nuclear actin in transcription. J. Cell Biol. 172: 967 71.

116. Percipalle P., Zhao J., Pope В., Weeds A., Lindberg U., Daneholt B. 2001. Actin bound to the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein hrp36 is associated with Balbiani ring mRNA from the gene to polysomes. J. Cell Biol. 153: 229 36.

117. Pestic-Dragovich L., Stojiljkovic L., Philimonenko A.A., Nowak G., Ke Y., Settlage R.E., Shabanowitz J., Hunt D.F., Hozak P., de Lanerolle P. 2000. A myosin I isoform in the nucleus. Science. 290 (5490): 337-41.

118. Philimonenko V.V., Zhao J., Iben S., Dingova H, Kysela K., Kahle M., Zentgraf H., Hofmann W.A., de Lanerolle P., Hozak P., Grummt I. 2004. Nuclear actin and myosin I are required for RNA polymerase I transcription. Nat. Cell Biol. 6: 1165 72.

119. Plow E.F. et al. 2000. Ligand binding to integrins. J. Biol. Chem. 275: 2178588.

120. Poch M.T., Al-Kassim L„ Smolinski S.M., Hines R.N. 2004. Two distinct classes of CCAAT box elements that bind nuclear factor-Y/alpha-actinin-4: potential role in human CYP1A1 regulation. Toxicol. Appl. Pharmacol. 199: 239-250.

121. Pollard T.D., Cooper J.A. 1986. Actin and actin-binding proteins. A critical evaluation of mechanisms and functions. Annu Rev Biochem. 55: 987 1035.

122. Posern G., Sotiropoulos A., Treisman R. 2002. Mutant Actins Demonstrate a Role for Unpolymerized Actin in Control of Transcription by Serum Response Factor. Molecular Biology of the Cell. 13: 4167 78.

123. Prockop D. J., and Kivirikko, К. I. 1995. Collagens: Molecular Biology, diseases, and potentials for therapy. Annu. Rev. Biochem. 64: 403 34.

124. Reiner R., Ben-Asouli Y., Krilovetzky I., Jarrous N. 2006. A role for the catalytic ribonucleoprotein RNase P in RNA polymerase III transcription. Genes Dev. 20 (12): 1621 -35.

125. Ridley A.J., Hall A. 1992. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesion and actin stress fibers in response to growth factors. Cell. 1992. 70: 389-99.

126. Ronai Z. 1993. Glycolytic enzymes as DNA binding proteins.Int. J. Biochcm. 25:1073 -76.

127. Ruegg C., Mariotti A. 2003.Vascular integrins: pleiotropic adhesion and signaling molecules in vascular homeostasis and angiogenesis. Cell. And Mol. Life Sciences. 6: 1135 57.

128. Santoro R., Li J., Grummt I. 2002. The nucleolar remodeling complex NoRC mediates heterochromatin formation and silencing of ribosomal gene transcription. Nat. Genet. 32 (3): 393 -6.

129. Schleicher M., Jockusch B.M. 2008. Actin: its cumbersome pilgrimage through cellular compartments . Histochem.Cell Biol. 129: 695 704.

130. Sen R., Baltimor D. 1986. Inducibility of к immunoglobulin enchancer binding protein NF-кВ by a post-translational mechanism. Cell. 47: 921 - 928.

131. Shaker A. Mousa is ed. 1998. Cell adhesion mallecules and matrix proteins: Role in health and diseases. Springer. Germany.

132. Shevchenko A., Tomas H., Havlis J., Olsen J. V., Mann M. 2006. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat. Protoc. 1: 2856 -60.

133. Sjolinder M., Bjork P., Soderberg E., Sabri N., Farrants A.K., Visa N. 2005. The growing pre-mRNA recruits actin and chromatin-modifying factors to transcriptionally active genes. Genes Dev. 19 (16): 1871 -84.

134. Skare P., Kreivi J-P., Bergstrom A., Karlsson R. 2003. Profilin colocalizes with speckles and Cajal bodies: a possible role in pre-mRNA splicing. Exper. Cell Res. 286: 12-21.

135. Small J.V., Rottner K., Kaverina I., Anderson K.I. 1998. Assembling an actin cytoskeleton for cell attachment and movement. Biochim. Biophys. acta. 1404: 271 -281.

136. Smith A, Carrasco Y.R, Stanley P, Kieffer N, Batista F.D, HoggN. 2005. A talindependent LFA-1 focal zone is formed by rapidly migrating T lymphocytes. J. Cell Biol. 170(1): 141-51.

137. Sotiropoulos A., Gineitis D., Copeland J., Treisman R. 1999. Signal-regulated activation of serum response factor is mediated by changes in actin dynamics. Cell. 98 (2): 159-69.

138. Stuven Т., Hartmann E., Gorlich D. 2003. Exportin 6: a novel nuclear export receptor that is specific for profilin.actin complexes. EMBO J. 22 (21): 5928 40.

139. Svitkina T.M, Borisy G.G. 1999. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofllin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. J. Cell Biol. 145 (5): 1009 26.

140. Swanson J.A., Watts C. 1995. Macropinocytosis. Trends Cell Biol. 5 (11): 424 -428.

141. Takimoto M., Tomonaga Т., Matunis M., Avigan M., Krutzsch H., Dreyfuss G., Levens D. 1993. Specific binding of heterogeneous ribonucleoprotein particle protein К to the human c-myc promoter, in vitro. J. Biol. Chem. 268 (24): 18249 58.

142. Tani Т., Lehto V-P., Virtanen I. 1999. Expression of laminins 1 and 10 in carcinoma cells and comparison of their roles in cell adhesion. Exp. Cell Res. 248: 115121.

143. Terry L.J., Shows E.B., Wente S.R. 2007. Crossing the nuclear envelope: hierarchical regulation of nucleocytoplasmic transport. Science. 318 (5855): 1412-6.

144. Thanos D., Maniatis T. 1995. NF-кВ: a lesson in family values. Cell. 80: 529 -532.

145. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Nat. Acad. Sci. 76: 4350-4.

146. Vartiainen M.K., Guettler S., Larijani В., Treisman R. 2007. Nuclear actin regulates dynamic subcellular localization and activity of the SRF cofactor MAL. Science. 316 (5832): 1749 52.

147. Vartiainen M.K. 2008. Nuclear actin dynamics from form to function. FEBS Letters. 582:2033 -40.

148. Vicente-Manzanares M., Choi C.K., Horwitz A.R. 2009. Integrins in cell migration the actin connection. J. Cell Sci. 122 (2): 199 - 206.

149. Visa N., Percipalle P. 2010. Nuclear functions of actin. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (4): a000620.

150. Visegrady В., Lorinczy D., Hild G., Somogyi В., Nyitrai M. 2005. A simple model for the cooperative stabilisation of actin filaments by phalloidin and jasplakinolide. FEBS Lett. 579 (1): 6 10.

151. Vogel W.F. 2001. Collagen-receptor signaling in health and disease. European J. of dermatology. 11 (6): 506 14.

152. Walsh J.L., Keith T.J., Knull H.R. 1989. Glycolytic enzyme interactions with tubulin and microtubules. Biochim. biophys. acta. 999: 64 70.

153. Wang Y., Gilmore T.D. 2001. LIM domain protein Trip6 has a conserved nuclear export signal, nuclear targeting sequences, and multiple transactivation domains. Biochim. Biophys. Acta. 1538 (2-3): 260 72.

154. Wang Y., Gilmore T.D. 2003. Zyxin and paxillin proteins: focal adhesion plaque LIM domain proteins go nuclear. Biochim Biophys Acta. 1593 (2-3): 115 20.

155. Watt F.M. 2002. Role of integrins in regulating epidermal adhesion, growth and differentiation. EMBO J. 21 (15): 3919 26.

156. We ins A., Schwarz K., Faul C., Barisoni L., Linke W., Mundel P. 2001. Differentiation- and stressdependent nuclear cytoplasmic redistribution of myopodin, a novel actin-bundling protein. J.Cell Biol. 155 (3): 393-403.

157. Wewer U.M., Engvall E. 1994. Laminins. Meth.Enzymol. 245: 85 104.

158. White D.J., Puranen S., Johnson M.S., Heino J. 2004. The collagen receptor subfamily of integrins. Int. J. ofBioch. And Cell Biol. 36: 1405 10.

159. Xu Y., Gurusiddappa S., Rich R.L., Owens R.T., Keene D.R., Mayne R.L., Hook A., Hook M. 2000. Multiple Binding Sites in Collagen Type I for the Integrins aipi and a2(31. J. Biol. Chem. 275 (50): 38981 9.

160. Yarwood S. J., Woodgeft J.R. 200J. Extracellular matrix composition determines the transcriptional response to epidermal growth factor receptor activation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (8): 4472 77.

161. Ye J., Zhao J, Hoffmann-Rohrer U., Grummt I. 2008. Nuclear myosin I acts in concert with polymeric actin to drive RNA polymerase I transcription. Genes Dev. 22 (3): 322-30.

162. Ylanne J., Scheffzek K., Young P., Saraste M. 2001. Crystal structure of the alpha-actinin rod reveals an extensive torsional twist. Structure. 9 (7): 597 604.

163. Young K.G., Kothary R. 2005. Spectrin repeat proteins in the nucleus. BioEssays. 27: 144- 152.

164. Yurchenco P.D., Cheng Y.S., Colognato H. 1992. Laminin forms an independent network in basement membranes. J. Cell Biol. 117 (5): 1119 33.

165. Zabel U., Henkel Т., Silva M.S., Baeuerle P.A. 1993. Nuclear uptake control of NF-kappa В by MAD-3, an I kappa В protein present in the nucleus. EMBO J. 12 (1):

166. Zhang X., Jiang G., Cai Y„ Monkley S.J., Critchley D.R., Sheetz M.P. 2008. Talin depletion reveals independence of initial cell spreading from integrin activation and traction. Nat Cell Biol. 10 (9): 1062 8.

167. Zheng В., Han M., Bernier M., Wen J.K. 2009. Nuclear actin and actin-binding proteins in the regulation of transcription and gene expression. FEBS J. 276 (10): 2669

168. Zhou Z., Licklider L.J., Gygi S.P., Reed R. 2002. Comprehensive proteomic analysis of the human spliceosome. Nature. 419 (6903): 182-5.

169. ZhuX., ZengX., Huang В., Hao S. 2004. Actin is closely associated with RNA polymerase II and involved in activation of gene transcription. Biochem. Biophys. Res. Commun. 321: 623-630.201.11.85.