Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние пептидного морфогена гидры на анаболические процессы в нормальной и регенерирующей печени крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние пептидного морфогена гидры на анаболические процессы в нормальной и регенерирующей печени крыс"

Министерство здравоохранения РСФСР

Второй Московский ордена Ленина государственный медицинский институт им.Н.И.Пирогова

На правах рукописи УДК 616.36-008.931:577.152.213] -092.-02-07

Казимирекий Александр Николаевич ВЛИЯНИЕ' ПЕПТИДНОГО МОРФОГЕНА ГИДРЫ НА АНАБОЛИЧЕСКИЕ

процесса в нормальной и регенерирущей печени крыс

03.00.04 - Биохимия

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1590

Работа выполнена во 2-ом Московском ордена Ленина государственном медицинском институте им.Н.И.Пирогова

Научные руководители:

Член-корреспондент АМН СССР, профессор доктор медицинских наук

Доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

1. Доктор биологических наук, профессор Ткачук В.А.

2. Доктор медицинских наук, профессор Тогузов Р.Т.

Ведущая организация - Институт экспериментальной эндокринологии и химии гормонов.

Защита состоится " 10 ..(Х-НТ^.Р___1990 года в " /....." часов

на заседании специализированного Ученого Совета № К 084.14.05 2-го МОЛШИ им.Н.И.Пирогова по адресу: 117869, г.Москва, ул.Острс витянова, д. I.

I Г.И.Косицкий К.Н.Ярыгин

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке 2-го Московского ордена Ленина государственного медицинского института им.Н.И.Пирогова.

Автореферат разослан

" 1990

Ученый секретарь специализированного Совета,

кандидат медицинских наук, доиент Савенкова В.Т.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОШ

^22&Зьность_п2облеьм2 Количество исследований, посвященных иэуенш пептидергической регуляции функций организма, в последнее время стремительно увеличивается. Отчасти это вызвано тем, что уже сейчас число известных природных олигопептндов и их синтетических аналогов составляет несколько тысяч соединений. В отношении биологического действия пептиды полифункшональны, т.е. способны влиять не на одну, а на несколько функций организма. Установлено, что они действуют через клеточные рецепторы и способны скорее модулировать функцию, а не включать и выключать ее, как классические гормоны, медиаторы я . нейротрансмиттеры.

В 1981 году опубликована структура пептидного мор!«гена гидры pGlu-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Lya-Val-Ile-Leu-Phe ( Schaller Н.С., Bodenrauller Н. 1981 ), обладающего способностью активировать процессы роста и дифференцировки клеток в головном участке тела пресноводной гидры Hydra attenuate, а такте стимулировать процесс почко-образования. Получены данные о влиянии пептидного морфогена гидры (ПМГ) на других беспозвоночных животных - морских гидроидных полипов и плоских червей планарий, у которых этот пептид вли?ет на морфогенез и стимулирует регенерацию утраченных органов (Тита Х.П., I9G5). С помощью хроматографических и иммунохими^еских методов ПМГ обнаружен в организме млекопитающих животных и человека, примем наиболее высокие концентрации пептида зарегистрированы в гипоталамусе и желудочно-кишечном тракте. Функции пептидного морфогена гидрн в организме млекопитающих животных неизвестны. Естественно, однако, предположить, что они могут оказаться сходными с теми, которые атот пептид имеет в организме беспозвоночных животных.

Настоящее исследование, также, затрагивает круг вопросов, относящихся к важной медико-биологической проблеме компенсации функций органа или ткани после повреждения. 3 основе компенсации функций органа после повреждения лежат анаболические (биосинтетические) процессы, ведущие к восстановлению объема и количества клеточных элементов.В настоящее вреия выявлены гуморальные факторы, некоторые ростогые Факторы (гормоны, природные и синтетические антиокси-данты), влияяшие на интенсивность анаболических процессов, происходящих после повреждения органа. Перспективным для изучения п этой связи, представляется пептидный морФоген гидрн, способный активировать процессы биосинтеза макромолекул, влияющий нп митоти»ескуп активность клеток беспотроночных. С теоретической и практической точек зр°ния интепес представляет вопрос о том, способе'! ли

11МГ влиять на рост, дифференцировку и регенерацию клеток и тканей млекопитающих.

Цель и задачи исследования: Изучение влияния пептидного морфогена гидры на анаболические процессы в интактной и регенерирующей печени крыс и выявление некоторых этапов молекулярного механизма действия пептида. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определение динамики активации орнитиндекарбоксилазы - фермента, лимитирующего скорость синтеза клеточных полиаминов и служащего маркером интенсивности синтетических процессов в ткали, в интактной и регенерирующей печени крыс под влиянием ПМГ.

2. Изучение дозовой зависимости активации орнитиндекарбоксилазы в интактной и регенерирующей печени крыс под влиянием низких доз пептидного морфогена, а также выявление оптимальной дозы пептида.

3. Исследование включения ^Н-лейцина в белки интактной и регенерирующей печени крыс под влиянием оптимальной дозы пептида.

4. Определение содержания альбумина в сыворотке крови частично гепат-эктомированных крыс пол влиянием ПМГ.

5. Исследование включения Н-тимидина в ДНК регенерирующей печени под влиянием ПМГ и его синтетических аналогов.

6. Определение содержания цАМФ в ранние послеоперационные сроки в регенерирующей печени крыс под влиянием оптимальной дозы пептида.

7. Изучение связывания ПМГ с препаратом мембран интактной и регенерирующей печени крыс и определение параметров этого процесса.

8. Определение индукции эндогенного ПМГ в ЦНС под влиянием частичной гег.атэктомии.

Научная новизна работы: В результате выполнения настоящего исследования впервые определена роль, ПМГ у млекопитающих (крыс) как активатора биосинтетических процессов, происходящих в ходе регенерации печени.

В работе впервые показано, что ПМГ способен вызывать дополнительную активацию орнитиндекарбоксилазы - ключевого фермента обмена полиаминов, способного служить маркером анаболических процессов в регенерирующей печени крыс при интраперитонеальном введении пептида в низких дозах. Выявлена оптимальная доза ПМГ (¿0 мкг/кг массы тела), вызывающая максимальную дополнительную активацию орнитиндекарбоксилазы в регенерирующей печени крыс. Установлено, что под влиянием этой дозы пептида в регенерирующей печени осуществляется более интенсивное включение ^Н-лейцина и ^Н-тимидина в белки и ДНК органа, а также происходит повышение содержания цАМФ в ткани регенерирующей печени в более ранние сроки, ьолее того, инъекция 11МГ частично гегк.т-'эктомиро ванным крысам замедляет снижение альбумина в сыворотке крови

и нормализует содержание этого белка в более ранние сроки. Вместе с тем, пептид, вводимый интактным животным в указанной дозе, не способен активировать орнитиндекарбоксилазу и влиять на включение ^Н-лейцина в белки органа. Предпринята попытка экспериментального изучения причин наблюдаемого феномена. Так, впервые показано наличие обратимого и насыщаемого специфического связывания ^Н-ПМГ с препаратом мембран регенерирующей печени. Мембранные препараты ин-тактных тканей печени, почек, сердца и головного мозга не способны связывать пептид.

Впервые определено содержание ШГ в гипоталамусе крыс и показано, что снижение его содержания рызнрает операция частичной гепат-эктомии.

Практическая ценность исследования: Полученные результаты имеют определенное теоретическое значение для понимания молекулярного механизма действия ПМГ. В связи с присутствием эндогенного ПМГ в организме человека материалы исследования возможно могут найти применение в клинике для лечения заболеваний, связанных с нарушением функций печени, вызванных поражением ткани этого органа.

К числу практически ценных результатов можно отнести выявление биологически активных синтетических аналогов ПМГ, которые способны как активировать,так и ингибировать синтез ДНК в регенерирующей печени крыс, сти результаты опровергают ранее опубликованные данный, согласно которым структура пептида уникальна в отношении прояаяения биологического эффекта и внутримолекулярные замены аминокислот вызывают исчезновение биологической активности.

Полученные результаты создают возможность для направленного химического синтеза новых синтетических аналогов пептидного морфогена, обладающих теми же биологическими эффектами как природный олигопеп-тид, способных стать новыми лекарственными препаратами.

Апробация работы: Материалы работы были представлены на I Всесовзной конференции "Нейропептиды: их роль в физиологии и патологии" (Томск, 19Во); I Всероссийской конференции Томеостаз - его механизмы и коррекция" (Москва, 1986); Всероссийской конференции "Олигопептиды, как регуляторы функций организма" (Москва, 1У87); Республиканской научной конференции "байкальские встречи-8^" по проблеме "Управление морфогенезом органов и тканей в процессах адалтацуш" (Иркутск, 1989).

Публикации: По темэ диссертация опубликовано 6 научных работ.

Работа состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов исследования, семи разделов собственных исследований с их обсуждениями, заключения и выводов.

Диссертационная работа изложена на русском языке на 142 страницах машинописного текста и включает 2 таблицы, 19 рисунков и список цитированной литературы из 215 источников.

' ■ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЯБДОВАНИЯ

Все эксперименты вцпситнекы на крысах-самцах линии Вистар, массой тела 160-180 гр. Объектом исследования являлись интактная печень и регенерирующая печень крыс, подвергнутых -операции частичной гепат-эктонии (Higgina G.M,, Ajaâexson R.M. 193A), ® ходе ¡которой удшмши 70%. массы органа^ В части экспериментов исследоакиж) подвергали мембранные препараты интактной и регенерирующей печени, толоинохчз чиста-га, сердца и почек, а также экстракты гипоталамуса.

Пептиды растворяли в физиологическом растворе и вводили интакт-«ым или частично гепатэктомированным животным интраперитонеально. Контрольные животные получали инъекцию эквимолярной смеси аминомшаслг.

В работе использовали ПМГ, его аналоги - ПМГ-I и ПМГ-17, синтезированные А.Ю.Рябиной в НИИ экспериментальной кардиологии ВКНЦ АМН СССР под руководством профессора М.И.Титова. В экспериментах по связывании использовали Н-ПЫГ (63 Ки/ммоль). Тритирование пептида осуществлено в Институте молекулярной генетики АН СССР. В экспериментах по радиоиммунологическому определению ПМГ применяли 1 ^-производное яептида.

'Определение активности орнитиндекарбоксилазы проводили по скорости образования ^COg при декарбоксилировании Ь-1^С-орнитина, применяя L- -орнитин хлорид (55 мкКи/ммоль, "Amercham"). Для изучения включения предшественников в белки и ДНК использовали ^Н-лей-цин (49 Ки/ммоль) и ^Н-тимидин (5,4 Ки/ммоль). Белок и ДНК в пробах определяли методами Седмак (Sedmak J.J., Qrossberg S.E. 1977) и Бар-тона (Burton К. 1956) соответственно. Определение содержания цАЫФ ш ткани проводили с помощью набора реактивов "Ameroham". Счет радиоактивности осуществляли на жидкостном сцинпилляотонном счетчике Rackbeta-1215 "1KB", Швеция, используя спинциллятор следующего ■оос-тава:Р0Р0Р - 0,2 г, РРО - 4 г, нафталин- 60 г, метанол - 100 мл,, этиленгликоль - 20 мл, 1,4-диоксан - до I литра.

Электрофорез белков сыворотки крови в полиакриламидноы ч-еле проводили в денатурирующих условиях, используя буферную систему Лем-мги (Laenraili U.K. 1970) 'в приборе для вертикального электоойореяа

"Blo-Rad" США. После отмывания избытка красителя Кумасси r-.:50 гели сканировали с помощью лазерного денситометра 2202 Uitroscan "LKB" Швеция. В качестве маркера и величественного стандарта использовали бычий сывороточный алобумин.

В экспериментах по связванию использовали ПМГ, ^Н-ПМГ, 50мМ Трис-HCI, рН - 7,4. Для снижения уровня неспецифического связывания в пробы добавляли 0,1% бычьего сывороточного альбумина. Реакцию запускали добавлением препарата мембран в пробы. Разделение свободного и связанного пептида проводили методом вакуумного фильтрования через стеклянные фильтры "Vihatnan GF/B" под давлением <¿0 атм. Количество связанного с мембранами ^Н-ПМГ определяли по уровню радиоактивности фильтров. За неспецифическое связывание принимали связывание меченого пептида в присутствии 1000-<:000-кратного избытка немечекного 1ШГ. Счет радиоактивности фильтров проводили в сцинцилляционной смеси следующего состава: 3 л толуола, 1,5 л тритона X-I00, 0,45 л 0,5 н раствора аммиака в воде, ¿2^5 г PP0, 2,25 г P0P0P. Белок мембран определяли по Лоури (Lowry О.H. 1951 ).

Радноиммунологическое определение пептидного морфогена гидры (Кривошеев О.Г. и соавт., 198о) проводили, используя специфические антитела (титр 1:16000), полученные при иммунизации кроликов коньюга-гами ПМГ с гемоцианином. Экстракт гипоталамуса получали сочетая гомогенизацию ткани в 3% уксусной кислота с последующей ацетоновой' экстрацией супернатанта. Ацетоновый экстракт лиофилиэировали и использовали для определения. Пептидный стандарт или неизвестный образец растворяли в натрий-фосфатном буфере (50 мМ, р.Ч - 7,5) инкубировали с антисывороткой, содержащей известное количество меченого пептида. Затем к инкубированной среде добавляли ослиные антитела против гамма-глобулинов кролика и, после повторной инкубации, lôfa раствор поли-этллвнгликоля. После фракционирования определяли радиоактивность осадка на счетчике Rack Ganraa "1KB", Швеция.

Результаты экспериментов обрабатывали, используяt-критерий Стыодента на &БМ 16-ВУМС. Представляя экспериментальные данные, указывали вероятность отличия опытных данных от соответствующих контрольных значений. При р «0,95, р<0,99 и р «0,999 опытные данные обозначали (к), (к*), («et) соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящем исследовании влияние пептидного морфогена гидры на анаболические процессы р интактной и регенерирующей печени крыс оценивали, используя набор параметров, характеризующих биосинтетические возможности ткани, в том числе: определение активности орнитиндекар-

3 3

бохсилази, определение включения Н-лейцина и Н-тимидина в белки и ДНК органа, изучение динамики содержания альбумина в сыворотке крови частично гепатэктомированннх крыс. Было также изучено изменение динамики цАМФ в регенерирующей печени и определены параметры связывания ^11-ПМГ с препаратами мембран интактной и регенерирующей печени. Возможность индукции эндогенного ПМГ в центральной нервной системе, продемонстрирована в экспериментах по радиоиммунологическому определению содержания пептида в гипоталамусе. Первые экспериментальные данные, указывающие на потенциальную способность ПМГ влиять на анаболические процессы, были получены в экспериментах по определению активности ориитиндекарбоксилазы.

I. Модуляция активности ориитиндекарбоксилазы в интактной и регенерирующей печени крыо различными дозами пептидного морфогена гидры.

В делящихся организмах, растущих тканях, регенерирующих органах повышено содержание полиаминов. Полиамини (путресцин, спермин, спер-мндин) ускоряют скорость синтеза макромолекул (белка и ДНК), влияя на процессы трансляции и транскрипции. Орнитиндекарбоксилаза - ключевой и скорость-лимитирующий фермент обмена полиаминов, катализирующий реакцию декарбоксилирования орнитина с образованием путресцина. В растущих тканях, например, в регенерирующей печени, активность ориитиндекарбоксилазы (ОДК) резко увеличивается, поэтому этот фермент может быть попользован как маркер анаболической активности ткани, что и было предпринято в настоящем исследовании.

Определение активности ОДК проводили через 6 час. после введения пептида интактным животным, поскольку этот временной интервал, согласно данным литературы, соответствует периоду максимальной активации фермента (рис. I).

Рис. I. Зависимость активности растворимой формы ОДК в печени крыс от дозы ПМГ.

июлей С02 но I мг

Исходный уровень активности растворимого фермента, определяемого в супернатанте после центрифугирования ромогената 105000 в , в течение 70 мин. составляет 2,70+0,24 нмолей С0о на I мг белка за I час, что соответствует данный литературы. В области низких доз пептида (0-500 ккг/кг массы тела) активность данной формы 0ДК возрастает и при дозах 1,2 и 5 мг/кг массы тела фермент активируется в 2,9, 6,4 и 11,9 раз соответственно. Пропорциональная активация 0ДК в диапазоне доз пептида 1-0 мг/кг возможно связана с неспецифическим действием ПМГ. Показано, что подобная активация ОДК в печени интактных животных происходит при введении лизина, лимитирующего биосинтез белков или медленно метаболизирующегося и-аланина.

Во второй части данного экспериментального раздела описано изменение активности ОДК в регенерирующей печени крыс под влиянием различных доз ПМГ (рис. 2).

Рис. 2. Зависимость общей активности ОДК (I) и растворимой формы фермента (2) от дозы введенного ПМГ.

400

300

200

100

О-1

пмолел СО2 на белка за I час

I мг

кг/кг

^ерез 6 часов после операции частичной гепатэктомии уровень активности растворимой ОдК в регенерирующей печени превышает в 48 раз уровень активности этой формы ОДК в ткани интактной печени. Наименьшая применяемая доза пептида (20 мкг/кг) вызывает достоверное повышение активности фермента в гомогенате в 1,4 раза, а в супернатанте в 1,3 раза по сравнению с контрольным уровнем активности (частично ге-патэктомированные крысы, получившие иньекцию растворителя).

¿_олее высокие дозы вызывают снижение фзрментативной активности в обеих изученных фракциях. При дальнейшем возрастании дезы ГИГ наблюдается постеленное уменьшение ингибиторного глиямия пептида на стимулиоопзннув чкптпной грплтэктомией акгивчость ОДК.

Представленные результаты свидетельствуют о способности ПМГ активировать растворимую форму ОДК в интактной печени и вызывать дополнительную стимуляцию этой формы фермента в регенерирующей печени крыс. Наиболее привлекателен для исследования диапазон низких доз пептида в связи с тем, что в организме животных и человека эндогенный ПМГ обнаружен лишь в низких концентрациях. Результаты изучения актив-1 кости ОДК в интактной и регенерирующей печени под влиянием низких доз ПМГ приведены на рис. 3.

200 -

100

пмолей СО2 на I мг белка за I час

Рис. 3. Зависимость активности растворимой ОДК от дозы введенного ПМГ:

1 - в печени интактных животных;

2 - в регенерирующей печени крыс.

2

О-

Ф-М-Ф-

М&г/кг

0 10 20 30 40 50 '

Уровень активности ОДК в печени интактных животных составляет '.-3 нмолей Ш, на I мг .белка за I час. Этот уровень не изменяется при введении животным ПМГ в диапазоне 0-50 мкг/кг массы тела. Операция частичной гепатзктошш вызввает активацию ОДК, увеличивая активность фермента до 170+28 пмолей СО^ на I мг белка в I час. По данным литературы изучаемая форма фермента через о часов после операции частичной гепатэктомии испытывает активацию с 2-0 до 200-300 пмолей СО^ на I мг белка за I час. Инъекции возрастающих доз ПМГ частично гепатзктомиро-ванным животным неоднозначно влияют на активность ОДК. Так, самая низкая доза ПЫГ (5 мкг/кг) не вызывает дополнительной стимуляции фермента. Более высокие дозы 10 и 20 мкг/кг активируют фермент, причем эффект дополнительной стимуляции ОДК наиболее выражен при введении пептида в дозе ¿0 мкг/кг. Дальнейшее повышение дозы пептида подавляет индуцированную частичной гепатэктомией активность ОДК. Возможно, это объясняется взаимодействием пептида с регенерирующей таань» через специфические рецептора. Тогда некий достаточно узкий диапазон доз пептида обус-

- э -

лавливает биологический эффект (дополнительную активацию ОДК). Дальнейшее повышение дозы пептида ведет к увеличению концентрации продуктов его протеолитической деградации, которые, не утратив способности к связыванию с рецепторами, блокируют связывание неразрушенных молекул пептида.

2. Включение %-лейцина в белки интактной и регенерирующей печени, динамика накопления белков, содержание альбумина в крови.

Введение пептида в дозе ¿0 мкг/кг (наиболее эффективной в отношении активации ОДК в регенерирующей печени) интактным животным не изменяет уровень включения Н-лейцина по сравнению с уровнем включения у контрольных животных (кривые I и 2 на рис. 4). йти результаты согласуются с данными по отсутствию влияния низких доз ПМГ на активность ОДК в печени ннтактньпс животных.

После операции частичной гепатэктомии уровень включения меченой аминокислоты увеличивается в интервале 20-120 ч (кривая 3 на рис. 4). Введение ПМГ частично гепатэктомированным крысам вызывает дополнительное достоверное повышение интенсивности включения "^Н-лейцина в белки регенерирующего органа в 1,4-1,9 раз (кривая 4 на рис. 4) во все изучаемые ороки.

3

Рис. 4. Включение Н-лейцина в белки печени интактных (I, 2) и частично гепатэкхомироваиних (3, 4) крыс. 1,3- введение контрольного раствора экв^молглной снеси аминокислот

Л - вледгние ПМГ.

о

По-видимому, более интенсивное включение Н-лейцина в белки регенерирующей под влиянием ПМГ печени может объясняться увеличением скорости трансляции мРНК, зависящей от концентрации полиами-ноа,концентрации которых определяются активностью ОДК.

Характеризуя анаболические процессы при гипертрофии и гиперплазии, часто прибегают к определению массы органа и содержанию в нем белков в процессе регенерации. В связи с отеком органа на редких этапах регенерации печени определение массы недостаточно корректно (в наших исследованиях не использовалось). Определение содержания белков регенерирующей печени в процессе восстановительного роста приведено на рис. о.

600 500 -I 400 300 200 1С0 0-1

ыг

час

О 20 40 60 80 100 120

■ Рис. 5. Содержание белков в регенерирующей печени крыс: I - введение контрольного роста эквимолярной смеси аминокислот;

* 2 - введение ПМГ;

3 - содержание белков в печени интактных животных.

Количество белков в печени интактных животных, определенное в наших экспериментах, составило 42£н<!5 мг (3 - на рис. 5), Количество белков в органе, регенерирующем под влиянием ПМГ, превышает соответствующие контрольные значения (2 - па рис. 5). Достаточные различия наблюдаются в интервале ¿О-Лдч: Под влиянием ПМГ в эти сроки в регенерирующей печени происходит более быстрое увеличение количества белков, превышающее контрольные значения в 1,4 и 1,2 раза соответственно .

Значительно более интенсивный синтез белков в регенерирующей печени под влиянием ПЫГ, не сопровождалщийся адекватным накопление» белков в органе, возможно указывает на увеличение секреции некоторой части белков плаз»« крови.

С цель» проверки атого предположения определяли содержание альбумина в сыворотке крови частично гепатэктомированных крыс, подучивших инъекцию пептида (¿20 мкг/кг) или контрольного раствора эквимолярной смеси аминокислот. Лосле эдектрофоретического разделения белков сыворотки крови гели денситометрировали и определяли содержание альбумина (рис. о).

Рис. б. Денситограмны белков сыворотки крови крыс, подвергнутых операции частичной гепатэктомии: I - интактная сыворотка крови; 2,3,4 - введение ПМГ; о,о,7 - введение контрольного раствора;

о - два дня после операции; 3,6- девять дней после операции; 4, 7 - пятнадцать дней после операции.

Лазерное сканирование геля осуществляли слева-налразо (катод -справа).

Содержание альбумина в сыворотке крови кнтахтных животных составляет ¿9,7+1,7о мг/мл, что согласуется с данными литературы, где эта величина определена равной ¿9,2 мг/мл. После операции частичной гепатэктомии содерхалие альбумина в сыворотке крови крыс резко уменьсается (кривая I на рис.

мт/мл

30

2

•20

I

сутки

10

0

5

10

15

Рис. 7. Динамика содержания альбумина в сыворотке крова крыс, подвергнутых операции частичной геиатэктомии: I - введение контрольного раствора эквимолярной смеси

аминокислот;

2 - введение ПМГ.

В интервале 2-4 дня после операции регистрируется минимальное содержание альбумина в крови крыс, составляющее 17,10+0,70 мг/мл. По данным литературы этот уровень составляет 17,3 мг/мл, что согла^-суется с нашими, данными. В интервале 9-15 дней после операции содержание альбумина медленно возрастает с 19,9+2,8 до ¿0,7+3,4; в литературе - от 18 до 20-21 мг/мл. Инъекция ПМГ предотвращает стремительное снижение концентрации альбумина (кривая 2 на рис. 7). В интервале 2-9 дней после операции содержание альбумина в крови крыс, получивших инъекцию пептида не снижается ниже 24,8 мг/мл. Через 15 дней после операции содергание альбумина в крови крыс этой группы нормализуется.

Представленные данные свидетельствуют о способности пептидного морфогена влиять на функциональные параметры регенерирующей печени, в короткие сроки нормализуя концентрацию альбумина в крови частично гепатэктомированных животных. По-видимому, это объясняется активацией синтеза альбумина на уровне трансляции соответствующих мРНК.

з

3. Включение Н-тимидина в ДНК регенерирующей печени под влиянием пептидного морфогена гидры.

Синтез ДНК является центральной биохимической характеристикой регенерирующей печени. В большом количестве исследований рсстстиму-лирующую активность биологически активных соединений оценивают, используя включение ^Н-тимидина в ДНК регенерирующей печени. Результаты изучения интенсивности включения ^Н-тимидина в ДНК регенерирующей печени крыо под влиянием ПМГ приведены на рис. 8.

о

Рис. 8. Включение "Н-тимидина в ДНК регенерирующей

печени крыс:

I - введение контрольного реатвора эквнмолярной смеси аминокислот;

I - введение ПМГ (¿0 мкг/кг).

Через 12 часов после операции уровень включения ^Н-тимидина в регенерирующей печени быстро увеличивается и достигает максимума, через 22 часа (кривая I на рис. 8). Под влиянием ПМГ интенсивность включения нуклеотида значительно усиливается и осуществляется в более ранние сроки (кривая 2 на рис. В). Включение ^Н-тимидина в ДНК регенерирующей печени крыс под влиянием ПМГ превосходит соот-эстетвующие .контрольные значения через 18, 19, 20 часов после операции в 2„8_; 4,7; 2,8; 3,5 раз соответственно. Этот эффект может быть .объяснен более высоким содертанием полиаминов (т.к. в ткани регенерирующей печени под влиянием ПМГ повышена активность ОДК), способных увеличивать скорость ядерных поликераз и алиять на иц»тн-лиропокиз и фос.форилирование гистононых и нсгистоновых болков гро-

катина.

В пределах настоящего исследования проводили биологическое тестирование двух синтетических олигопептидов - структурных аналогов ПМГ, используя включение ^Н-тимидина в ДНК регенерирующей печени как меру интенсивности анаболических процессов. Цель исследования состояла в выявлении активных в отношении синтеза ДНК аналогов ПМГ. Результаты этих экспериментов приведены на рис. 9.

1 - ПМГ;

2 - ПМГ-1; pQlu-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Xxx-Val-Ile-Leu-Phe,

3 - контрольный раствор эквимолярной смеси аминокислот;

4 - ПМГ-17; paXu-Pro-Pro-GXy-Gly-Ser-Lys-Val-Ile-Yyy-Phe,

Пептиды вводили в дозе 20 мкг/кг массы тела.

Достоверность различий на рис. 9 указана в сравнении с контролем (3).

: Сопоставление интенсивности включения меченого нуклеотида в ДНК под влиянием ПМГ и его аналогов с соответствующими контрольным]! значениями позволяет заключить, что ПМГ-1 - активный аналог, стимулирующий синтез ДНК как природный ПМГ, а ПМГ-17 - обладает выраженным ингибирующим действием.

Представленные результаты представляются актуальными в теоретическом аспекте, поскольку опровергают существующее представление

об уникальности структуры ШГ для проявления ростстимулирующей активности. В отношении практического применения результатов исследования можно надеяться на использование в клинике аналогов ШГ, спо-

собных как активировать анаболические процессы в поврежденном органе, так и подавлять ростовые процессы.

4. Содержание цШ> в регенерирующей печени под влиянием пептидного морфогена гидры.

Способность низких доз ПМГ активировать ОДК в регенерирующей печени возможно объясняется действием пептида через рецепторы, со-прядвнные с аденилатциклазой, поскольку установлено, что один из путей активации ОДК осуществляется через цАМФ-эависимую протеин-киназу. ,

Содержание цДМФ в регенерирующей печени под влиянием ПМГ

Рис. 10. Содержание цАМФ в регенерирующей печени крыс:

1 - введение контрольной эквимолярной смеси аминокислот;

2 - введение ПМГ.

Содержание цАМФ в печени интактных животных СО" - момент времени) в наших экспериментах составляло 1,4+0,3 пмолей цАМФ/'мг ткани, что согласуется с данными литературы, где эта величина определяется как 0,8-1,2 пмолей цАМй/мг ткани. В регенерирующей печени содержание цАЧФ увеличивается через 4 часа после операции в 1,5 раза по сравнению с уровнем цАМФ у интактных животных (кривая I на рис. 10), что согласуется с данными других исследований, где отмечается подгем содержания цАМ£ в 1,5-3,0 раза.

Под влиянием ГШ1 динамика содержания цА?й иная. Выраженных сдвигов в содержании цАМЬ через 4 часа после операции не наблвдается, но в более ранний срок - I час после операции - регистрируется повышение содержания цАЬй по сравнении; с уровнем цШ>, определенным у контрольных нивотных.

- 1Ь -

5. Связывание пептидного морфогена гидры в ткани регенерирующей и интактной печени.

В процессе выполнения исследований накопились данные, которые могут свидетельствовать о периферическом действии ПЫГ, осуществляа-мом через рецепторы в регенерирующей ткани печени. В их числе: I) низкие действующие дозы пептида; 2) куполообразный характер зависимости доэаг-эффект (доза ПМГ-активность ОДК); 3) быстрый (I час) ответ, регистрируемый по возрастанию содержания цШФ в регенерирующей ткани при введении пептида.

Цель предпринятого исследования состояла в изучении связывания ^Н-ШГ с препаратами мембран регенерирующей и интактной печет! и определения параметров этого процесса.

Для поисков участков связывания ЛМГ применяли радиолигандный матод. Связывание проводили в 50 мМ Трис-НС1 буферном растворе при рН - 7,4. Неспецифцческое связыглкие определяли в присутствии 10 мкМ немеченэго ПЫГ при использовании %-ГИГ в концентрации 0,5 и 5 нМ. При атом исходили из общепринятого предположения, что неспецифическое связывание меченого пептида является нанасыщаамым, т.е. не подавляется избытком немеченого пептида. Специфическое связывание, напротив, представляет собой взаимодействие с мембранными структурами, число которых ограничено.

В, расп.в мин

800

I

600

400

200

концентрация белка в пробе, мкг

О , .200 400 600

з

Рис. II. Зависимость насыщаемого связывания Н-ПМГ с препаратом мембран регенерирующей в течение 4 час. печени крыс от концентрации мембранного белка:

1 - общее связывание ^Н-ПМГ;

2 - неспецифическое связывание ^Н-ПМГ;

3 - специфическое связывание ^Н-ПМГ.

Пробы содержали б иМ ^Н*-ПМГ, за н е с п а ци фи че с к о е связывание принимали связывание %-ПМГ, в присутствии 10 ыий немеченого

3,

3|

Н«Г.

Условия: 50 Ш Трис-НС1,рН - 7,4; БСА - I кг/мл.

Время инкубации - 60 мин. при 25°С.

В трех независимых вьщелениях препарата мембран регенерирующей печени крыс (через 4 часа после операции) из 12 животных зарегистрировано специфическое связывание ^Н-ПМГ и выявлена зависимость специфического связывания от количества добавляемых в пробы мембранных белков. Линейная зависимость специфического связывания обнаружена в диапазоне 0-100 мкг белка на пробу, затем следует участок плато, переходящий в спад (кривая 3 на рис. II). Тенденцию к падению уровня специфического связывания можно объяснить возрастанием концентрации мешающих связыванию молекул, например, желчных кислот, или возрастанием степени протеолитической деградации пептида.

С целью охарактеризовать специфическое связывание пептида определяли кинетику ассоциации-диссоциации ^Н-ПМГ о препаратом мембран регенерирующей печени (рис. 12).

связывание ^-ПМГ,

ратом мембран регенерирующей печени:

1 - ассоциация ^Н-ПМГ с препаратом мембран;

2 - диссоциация %-ПМГ;

Б момент, указанный стрелкой, в предварительно инкубированные в течение I часа, пробы добавляли 20 мкл 100 мкМ раствора ¡МГ.

Условия: оОгкИ Трис-НС1, рН - 7,4, ЬСА - I иг/из, температура 2о°С, '^Н-ИЧГ -- 10 нМ, концентрация белка в пробе -100 мкг/мл.

о

Изучение ассоциации Н-ГМГ с препаратом мембран регенерирующей печени показывает, что за 60 мин. инкубации достигается более чем 70% уровень насыщения, поэтому это время примерно соответствует установлению стационарного уровня связывания (кривая I на рис. 12). Кинетика диссоциации ^Н-ПИГ с тем же мембранным препаратом характеризуется относительно коротким временем диссоциации, Связывание обращается менее чем за 15 мин., при этом вытеснение 10 нМ ^Н-ПМГ 2000-кратным избытком ПМГ происходит до уровня, составляющего примерно &У%> от величины максимального связывания ^Н-ПМГ препаратом мембран регенерирующей печени (кривая 2 на рис. 12).

о

С целью изучения характера ингибирования связывания Н-ПМГ с препаратом мембран регенерирующей печени использовали немеченый пептидный морфоген в конценграциях - М (рис. 13).

Рис. 13. Ингибирование связывания Н-ПМГ препаратом мембран регенерирующей печени крыс немеченым ПМГ. За Й0 принимали связывание ^Н-ПЫГ в отсутствии немеченого пептида.

Условия те же, что и на рис. 12.

Кривая ингибирования связывания имеет характерный сигма-образный вид и выходит на плато в области 10~° М. При использовании ПМГ как вытеснителя в экспериментах по связыванию в концентрации 10 мкМ достигается 94/6 уровень ингибирования связывания ^Н-ПМГ с мембранным препаратом.

Концентрация, при которой происходит ЬЗЗ-ное ингибирование

связывания НчМГ с препаратом мембран регенерирующей печени (ИН^д), определенная по кривой ингибирования составляет 220 нМ. ^та величина примерно соответствует константе диссоциации (Яд). Для более точного определения Кд и концентрации участков специфического связывания, результаты по ингибированию связывания Н-ПМГ пересчитывали в параметрах Скетчерда (рис. 14).

Г1

Рис. 14. Ингибирование связывания Н-ПМГ с препаратом мембран регенерирующей печени крыс в координатах Скетчерда:

В - количество связывавшегося пептида с препаратом

мембран (фмоль/мг белка); р - количество несвязавшегося пептида с препаратом

мембран (нМ). Условия те же, что и на рис. 12.

Обратимость связывания (рис. 13) делает вполне корректны)/ для обработки результатоз применение метода Скетчерда, обычно используемого при изучении лиганд-рецепторных взаимоотношений. Определенная нами константа диссоциации (К ) составляет 190 нМ, количество участков специфического связывания (В с) равно -40 (¡полей на I мг белка.

:1ри изучении связывания с препаратом мембран интакт-

мой печени выделения мембран из У животны) наличия связывания выявлено не было. В препаратах голопного мозга, интактной почини, ссрдця, поччк практически полностью отсутствует еггзмсонив и, слздоэателню, но определяется специфическое сплзызш-И'"! "п-пМГ.

Изучение связызания ^Н-ПМГ с препаратом мембран регенерирую-

щей в течение 4 час. печени крыс позволило выявить ограниченность количества участков специфического связывания и обратимость связывания.

Неясным остается вопрос о том, способны ли выявленные центры связывания пептидного морфогена в мембранных препаратах регенерирующей печени обеспечивать наблюдаемые биологические эффекты (высокую интенсивность анаболических процессов)?

В предположении,что пептид не подвергается после интраперито-неального введения деградации (это очевидно не так), и "in vivo " реализуется то же соотношение связанного пептида к свободному, что и при изучении "in vitro",оценки показывают, что оккупировано будет около % специфических центров связывания.

Обнаружение специфических центров связывания пептидного морфогена в препаратах мембран регенерирующей печени и, параллельно с этим, отсутствие таких центров в мембранных препаратах интакт-ной печени, ведет к перспективному предположению о том, что обнаруженный эффект может иметь прямое отношение не только к объяснению молекулярного механизма действия пептида, но и феномена регенерации

б. Содержание пептидного морфогена гидры в гипоталамусе

интактных и частично гепатэктомированных крыс.. В контексте настоящего исследования актуальным представлялось подучить данные о содержании ПМГ в гипоталамусе в ранние после операции частичной гепатэктомии сроки. Содержание эндогенного ПМГ в гипоталамусе частично гепатэктомированных крыс проводили через 4 и 22 часа после операции (рис. 15). Выбор именно этих послеопе-ционных сроков объясняется тем, что через 4 часа после операции максимально активирована система цАМФ, а через 22 часа регистрируется максимальный синтез ДНК и регенерирующая ткань мало восприимчива к модулирующим синтез макромолекул воздействиям.

в целом.

2000

пгр/гр

Ркс. 15. Содержание ПМГ в гипоталамусе интактных и частично гепатэктомированных крыс через 4 и 22 часа после операции.

1000

шггактные

4 ч ¿2 чНастично гспатэктошровэнные)

Содержание эндогенного ПМГ в гипоталамусе интактных животных составляет 1900+730 пгр/гр ткани. Через 4 часа после удаления 70$ массы печени содержание пептида достоверно снижается в 3 раза. Спустя 22 часа после операции содержание пептида близко к уровня, зсаралтерному для интактных животных.

В литературе отсутствуют данные о том, чтобы изменение содержания какого-либо биологически активного вещества в столь высокой степени коррелировало с динамикой репаративных процессов в регенерирующей печени.

' ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В процессе выполнения работы получен ряд новых данных, имеющих научное и практическое значение.

Способность низких доз пептида в высокой степени активировать биосинтетические процессы, лежащие в основе функциональной к пластической регенерации печени и отсутствие подобных влияний на ана/-болические процессы в интактной ткани печени дают возможность рассматривать пептидный морфоген гидры как перспективное вещество в плане клинического использования.

Ы нашем исследовании выявлено, что в ранние сроки после операции частичной гепатэктомии содержание эндогенного пептида в гипоталамусе снижается в 3 раза, а в период максимального синтеза ДНК в регенерирующей печени его концентрация в гипоталамусе нормализуется. По-видимому, это свидетельствует об индукции пептида и секреции его в кровь. Необходимо отметить, что в литературе отсутствуют данные о том, чтобы изменение содержания какого-либо гормона, медиатора или нейротрансмиттера в стель высокой степени коррелиро-. вало с динамикой репаративных процессов в регенерирующей печени.

В пределах настоящего исследования предпринята попытка объяснить наблюдаемый феномен высокой чувствительности анаболических процессов в регенерирующей печени к пептиду, вводимому в 1шзких дозах, и отсутствию подобных влияний при введении пептида жнтакт-ныы животным. В препаратах мембран регенерирующей печени обнаружены центры связывания пептидного морфогена гидры, удовлетворяющие некоторым критериям, предъявляемым к рецепторам: насыщаемость центров связывания пептидом, обратимость связывания, высокая яфиякость центров связывания. В препаратах мембран интактной П'-.ченк связывание пептида обнаружено не было. Результаты изучения свя.эыиания пептида с тканью рггенерируакей пзчени крыс совместно с полученными данными по биологическому тесгиросамт, п<?п'1*ида и г<2генерируюшвП

печени крыс свидетельствующие о том, что: низкие дозы пептида способны дополнительно активировать орнитиндекарбоксилазу; под влиянием низкой дозы пептида значительно активируется синтез белков и ДНК; регистрируется быстрое (I час) повышение содержания цАМФ в регенерирующей ткани печени при введении пептида; приводят к заключению о присутствии в регенерирущей печени рецепторов к пептидному морфогену.

Поскольку ткани интактной печени к пептиду нечувствительны и отсутствует связывание препаратом мембран интактной печени, следовательно, рецепторов к пептидному морфогену интактная ткань либо не содержит, либо число их невелико. Таким образом, в результате частичной гепатэктомии происходит индукция рецепторов к пептидному морфогену гидры., что, на наш взгляд, может иметь принципиальное значение для объяснения фенил на регенерации.

Результаты по индукции пептидного морфогена в гипоталамусе в результате частичной гепатэктомии и экспериментальные данные об индукции рецепторов в ткани регенерирующей печени формируют представление о механизме действия этого пептида. После повреждения внутреннего органа происходит выделение пептида из гипоталамуса в кровь, а неповрежденные клетки органа индуцируют рецепторы к пептиду. Эффективность пептид-рецепторного взаимодействия определяет интенсивность развития последующих анаболических процессов, направленных на компенсацию сниженной функции. Следует подчеркнуть, что это лишь гипотеза, вытекающая из результатов настоящего исследования. Её проверка требует дополнительных исследований.

В организме беспозвоночных животных роль пептидного ыорфогена изучена достаточно хорошо, У пресноводной гидры пептид влияет на рост головной части тела, а при повреждении органов этого гидро-бионта пептидный морфоген активирует биосинтез макромолекул, ускоряет деление клеток, влияет на дифференцировку.

Как свидетельствуют результаты настоящего исследования, пептидный морфоген гидры способен активировать процессы слнтеза белка и ДНК в регенерирующей ткани печени крыс, причм пептид действует в низких дозах через рецепторы, сопряяенные с системой полиаминов.

Сопоставление биологических эффектов о влиянии пепткдэ на ре-паративные процессы у беспозвоночных животных (пресноводные гидры), по данным литературы, и млекопитающих (крысы), по результатам настоящего исследования убеждает в том, что в организме клеколитаю-щих животных пептидный морфоген гидры способен выполнять функции, сходные с теки, которыми он обладает в организме беспозпоночних.

ВЫВОДЫ:

1. Пептидный морфоген гидры при интраперитонеальном введении крысам, подвергнутым операции частичной гепатэктомии вызывает дополнительную активацию орнитиндекарбоксилазы ©(4.1.1.17) и стимулирует биосинтез белков и ДНК в регенерирующей печени. При введении интактнда крысам пептид не влияет на активность орнитиндекарбоксилазы и биосинтез белков.

2. Пептидный морфоген гидры замедляет снижение концентрации альбумина в сыворотке крови крыс после частичной гепатэктомии и ускоряет нормализацию содержания альбумина в сыворотке крови.

3. Удаление 7С$ массы печени при операции частичной гепатэктомии у крыс вызывает снижение содержания пептидного морфогена в гипоталамусе.

4. Результаты биологического тестирования анаболических эффектов пептидного морфогена гидры и данные по связыванию этого пептида с тканью интактной и регенерирующей печени крыс свидетельствуют о присутствии в регенерирующей ткани печени специфических рецепторов к пептидному морфогену .

5. В организме млекопитающих животных (крыс) пептидный морфоген способен выполнять функции, сходные с теми, которыми он обладает в организме беспозвоночных, т.е. активировать анаболические процессы, повышать митотическую активность и ускорять дкф-ференцировку клеток.

о. Впервые обнаружены модификации первичной структуры пептидного морфогена гидры, не ведущие к утрате его биологической активности, что может служить основанием для поиска аналогов пептида с измененными свойствами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Казимирский А.Н. Влияние пептидного морфогена гидры на анаболизм в нормальной и регенерирующей печени крыс. - В кн.: Ней-ропептиды: их роль в физиологии и патологии. - Томск.: 1985.-С. 59-ьО.

2. Казимирекий А.Н., Пылаеь A.C. Стимулирование биосинтеза белка под влиянием низких доз пептидного морфогена гидры.- В кн.: Молекулярные и клеточные механизмы адаптации в норме и патоло- . гни. Труды I Республиканской конференции. Москва: 1986.- С. 5762.

3. Ярыгин H.H., Казимирский А.Н., Косицский Г.И., Рубина А.Ю., Виноградов В.А., Пылаев A.C. Модуляция активности орнитинде-карбоксилазы в нормальной и регенерирующей печени крыс различными дозами пептидного мофогена гидры. - Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.1986. № 6.- С. 680-682.

4. Казимирский А.Н., Косицкий Г.П., Пылаев A.C. Пептидный мерфо-ген гидры как фактор поддержания гомеостаза регенерирующей печени.- В кн.: Гомеостаз. Его механизмы и коррекция. М.: Труды 2-го МОЛПШ км.Н.И.Пирогова. 1987. - С. 56-62.

5. Казимирский А.Н., Косицкий Г.И., Пылаев A.C. Изучение анаболических аффектов пептидного морфогена гидры на модели регенерирующей печени крыс.- В кн.: Олигопептиды как регуляторы функций организма. Москва: Труды 2-го МОЛГОИ им.H.H.Пирогова. 1У87.

С. 140-146.

6. Казимирский А.Н., Ярыгин К.Н., Косицкий Г.И., Рубина А.Ю., Виноградов В.А., Пылаев A.C. Влияние низких доз пептидного морфогена гидр.ы на биосинтез белка в интактной и регенерирующей печени крыс.г Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. I960. » 4. - С. 424-426.

7. Казимирский А.Н., Федосеев В.А., Пылаев A.C. Пептидный морфоген гидры: метаболические и функциональные параметры в регенерирующей печени и гипертрофирующемся миокарде. - В кн.: Управление морфогенезом тканей и органов в процессах адаптации. Тезисы доклада (часть II). Иркутск: 19У9. - С. 36-37.

8. Казимирский А.Н., Федосеев В.А., Горланов И.В., Шифрина Е.Б. Влияние пептидного морфогена гидры на метаболические и функциональные параметры Напрданно функционирующих тканей.- В кн.: Теоретические и экспериментальные исследования биологических систем. М.: Труды 2-го МОЛ ГШ им.Н.И.Пирогова. - С.4;;-о6.