Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регенерация глотки у планарий DUGESIA TIGRINA и ее регуляция

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Регенерация глотки у планарий DUGESIA TIGRINA и ее регуляция"

РОССИЙСКАЯ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ

АКАДЕМИЯ НАУК РАЗВИТИЯ им. Н.К.Кольцова

На правах рукописи

КРЕЩЕНКО НАТАЛЬЯ ДМИТРИЕВНА

РЕГЕНЕРАЦИЯ ГЛОТКИ У ПЛАНАРИЙ DUGESIA TIGRINA И ЕЕ РЕГУЛЯЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология

Москва - 1995

Работа выполнена в Институте биофизики клетки Российской Академии наук.

Научный руководитель: кандидат биологических наук Шейман Инна Моисеевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Миташов Виктор Иванович

кандидат биологических наук, Сахарова Наталья Юрьевна

Ведущая организация: Биологический факультет

Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится " М " ре-УиЯ^Л 1995 г в часов на заседании диссертационного совета Д002.85.01. при Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН (117808, Москва, ул. Вавилова, д. 26)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН.

Автореферат разослан " 1г

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Е.М. Протопопова

Актуальность проблемы.

Регенерация - одна из основных проблем биологии развития. Изучение регенерации сводится к нескольким аспектам. Важнейшие из них: клеточные источники регенерации в различных регенерационных системах, морфогенез вновь формирующихся в ходе регенерации структур; проблема регуляции регенерационных процессов.

Исследования химической регуляции морфогенеза позволяют предполагать, что в процессах запуска и реализации генетической программы важную роль играют определенные биологически активные молекулы, с недавнего времени объединяемые общим термином "морфогены". Среди большого числа морфогенетически активных молекул особенно интересным представляется изучение регуляторных нейропептидов (НП), обладающих морфогенетическим действием. При этом правомочно их исследование на моделях как эмбрионального развития, так и регенерации.

Известно большое разнообразие регенерационных явлений, а также способов регенерации у разных организмов, что делает детальное исследование этих процессов чрезвычайно сложным. В связи о этим, особую ценность приобретают исследования регенерационных процессов, проводимые на простых моделях. Сведения, полученные на простых биологических объектах могут быть применены при исследовании явлений регенерации у высших животных. В настоящей работе в качестве объекта исследования были использованы плоские черви планарии. Планарии характеризуются очень высокой регенерационной способностью, довольно простой организацией и относительно небольшим количеством типов клеток. Планарии достаточно хорошо изучены и являются удобной моделью, позволяющей изучать регенерационные явления не только на уровне феноменов, но и на клеточном уровне.

Планария может регенерировать из небольшого участка тела, которое характеризуется выраженной морфогенетической пластичностью. Глотка, которая также хорошо регенерирует, как и часть тела, отличается функциональной и структурной стабильностью. Поэтому изучение регенерации такого автономного и структурно оформленного органа, как глотка представляется особо перспективным. Глотка планарий сложно устроена и состоит из дифференцированных слоев ткани, т.е. из нескольких типов клеток, имеет автономную нервную систему и задействована в пищевом поведении животного.

Регенерация глотки была использована в качестве модели для характеристики морфогенетической активности ряда НП, а также для выявления эндогенных морфгенетических факторов в процессе регенерации. Цели и задачи исследооанпя. Целью настоящей работы являлось функциональное, гистологическое и морфометрмческое исследование регенерации глотки у планарий Dugesia и ее регуляции. Были поставлены следующие

задачи:

1. Изучить динамику регенерации глотки у планарий. 2. Изучить восстановление исходных размеров глотки в ходе регенерации. 3. Исследовать морфогенетическую функцию нейропептидов на модели регенерации глотки у планарий О.Нцгиш. 4. Изучить влияние эндогенных факторов на регенерацию глотки. 5. Исследовать особенности восстановления глотки у планарий при дополнительных морфогенетических воздействиях.

Научная новизна результатов. В настоящем исследовании впервые проведен систематический анализ закономерностей формирования, функционирования и роста глотки у планарий в ходе регенерации, изучена динамика восстановления

глотки. Впервые с помощью методики прижизненной компьютерной морфометрии изучен рост и восстановление дефинитивных размеров регенерирующей глотки, разработаны количественные критерии ее регенерации. Была изучена динамика регенерации глотки при рассечении плакарий на разных уровнях. Впервые на модели регенерации глотки у планарий был протестирован ряд известных нейропептидов, их фрагментов и аналогов и обнаружено или подтверждено их морфогенетическое действие. Также впервые были получены данные по динамике пролиферативной активности клеток в зоне регенерации глотки. С новых позиций было изучено влияние нервной системы на регенерацию глотки у планарий. Исследовано влияние эндогенных регуляторов, образующихся в процессе регенерации. Были исследованы некоторые закономерности взаимодействия разных морфогенезов в ходе регенерации глотки; бесполого размножения, физиологической регенерации кишечника, регенерации других частей тела.

Научно практическое значение работы. Полученные данные могут быть использованы при анализе общих механизмов развития и регенерации. Они позволяют расширить представление о явлении регенерации у планарий. Сведения, полученные при изучении регенерации глотки у планарий используются при обучении студентов биологических специальностей. Регенерация глотки у планарий используется в качестве модели для изучения общих механизмов регенерации на клеточном, тканевом, органном уровнях. Предложенная количественная модель регенерации глотки, основанная на прямых измерениях морфологических характеристик, может найти применение в практике исследовательских работ при изучении биологически активных веществ - регуляторов морфогенеза, роста, пролиферации, а также для испытания веществ, предполагаемых к клиническому применению.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и были представлены на Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества гидробионтов" (Владивосток, 1991), на Всесоюзной научной конференции "Медико-биологические аспекты охраны окружающей среды" (Купавна, 1991), на Всесоюзном рабочем совещании по морфогенетически активным веществам "Морфоген-111" (Пущино, 1992), на научной конференции Института биофизики клетки (Пущино, 1993 г.), 7-й Международной конференции по биологии турбеллярий (Финляндия, 1993), на Международной конференции "Простые нервные системы" (Пущино, 1994). Структура и объем диссертации. Диссертация изложена по общепринятой научной схеме, состоит из введения, 7 глав (обзора литературы, методов исследования, 4 глав результатов и их обсуждения) выводов. Работа изложена на 156 страницах машинописного текста, иллюстрирована 26 рисунками, включает 29 таблиц. Список литературы включает 195 названий, из которых 145 на иностранных языках.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы представлены сведения о тонкой структуре глотки, хорошо изученной на морфологическом, гистологическом и ультраструктурном уровнях. Строение стенки глотки на тканевом уровне хорошо соотносится со строением тела планарйи и включает подразделение на внутренний и внешний эпителиальные, продольный и круговой мышечные, и центральный паренхимный слон. Глотка имеет собственную нервную систему. В нервной системе глотки

обнаружены дофамин, норадреналин, серотонин (Wikgren et al.,1986; Sakliarov, 1989; Reuter, Eriksson, 1991).

Регенерацию глотки у планарий изучали при их регенерации из фрагментов тела. Исследования проводили на гистологическом уровне. В большинстве случаев в работах отсутствуют сведения о функциональной активности глотки. За исключением работы Пасколини (Pascolini, 1966), практически отсутствуют морфометрические сведения о размерах глотки при ее регенерации. Литературные данные в отношении клеточных источников регенерации глотки противоречивы. Большинство исследователей придерживаются мнения об участии необластов (или стволовых резервных клеток) в регенерационном процессе, однако в некоторых работах обсуждается участие клеток кишечника в регенерации глотки (Ohodera et al., 1992).

В литературном обзоре приведены сведения об индуктивном влиянии нервной системы на формирование глотки, которое изучалось в экспериментах по трансплантации, а также данные о действии неочищенных гомогенатов и экстрактов тела на регенерацию глотки у планарий. Имеющиеся литературные сведения о морфогенах приведены в 5 главе, посвященной влиянию НП на регенерацию глотки. При попытках выделения регуляторов развития у планарий в нескольких работах была обнаружена их пептидная природа (Lender, 1956; Steel, Lange, 1977; Webb, Friedl, 1979). Недавно был охарактеризован специфический НП планарий из 39 аминокислотных остатков (NPF) (Haiton et al., 1992).

С помощью иммуноцитохимических исследований у планарий обнаружены нейрофизин, соматостатин, АКТП17-39) (Shilt et al., 1981; Bautz, Shilt, 1986), нейротензин, b-эндорфин (Kerschbaum et aL, 1984; Carraway et al., 1982), мет-энкефалин (Venturini et al., 1983), рилизинг-фактор гормона роста человека (Reuter et al., 1988), малый кардиоактивный пептид-Б, гастрин, окситоцин (Reuter, Gustaisson, 1989), лей-энкефалин, FMRF- и RF-амиды (Wikgren et al., 1986). Радиоиммунологическим методом у планарий обнаружен морфоген гидры (Тирас и др., 1990), ранее выделенный и охарактеризованный как активатор морфогенетических процессов у гидры (Schaller, 1973; Schaller, Bodenmuller, 1981). Обнаружены рецепторы к фактору роста нервов (Palladini et al., 1988).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Опыты проводили на планариях бесполой лабораторной расы Dugesia tigrinn, животных содержали при комнатной температуре и кормили мотылем. Удаление глотки проводили тонким глазным скальпелем под бинокулярным микроскопом через разрез на спинной стороне тела. В опытах было использовано около 7 тысяч животных.

1. Гистологическое исследование проводили на 1-5 сутки после удаления глотки. Планарий фиксировали в ФСУ , обезвоживали в 700 этаноле. В качестве пропитывающей и заливочной среды использовали полиэтиленгликоль с целлоидином (Eiimov, 1993). Серийные срезы толщиной 5-6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином по Бемеру. Для каждого срока регенерации глотки было взято по 10 планарий.

2. Изучение пролиферативной активности клеток проводили через 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 часов после удаления глотки. Окологлоточные и предглоточные фрагменты тела, взятые от 10 планарий диссоциировали на клетки по методу Багуньн (Baguna, 1984). Суспензию клеток окрашивали 0.1 мМ Hoechst-33342, и фиксировали формалином. Под флюоресцентным микроскопом Fluoval (Carl Zeiss,

lena) подсчитывали митотический индекс на 1000 клеток в трех пробах для каждого срока регенерации.

3. Функциональный анализ регенерации. Функциональным критерием регенерации глотки служило восстановление пищевой реакции. Для каждого дня регенерации определяли количество животных начавших питаться и находили их процент от общего числа особей. Для статистической обработки использовали критерий "хи-квадрат" для альтернативных распределений.

4. Морфометрическое исследование регенерации. При исследовании роста регенерирующей глотки была применена модификация оригинальной методики прижизненной компьютерной морфометрии (Тирас, Хачко, 1990). Исследования проводили на одних и тех же животных в течение всего периода восстановления. Каждая экспериментальная группа составляла 30-40 животных. Морфометрические показатели глотки регистрировали на 7, 14, 21, 28 дни.. Определяли длину тела планарии, площадь тела, длину и площадь регенерирующей глотки. Вычисляли критерии регенерации: отношение длины и площади регенерирующей глотки к длине и площади тела планарии. Для оценки статистической значимости различий средних размеров глотки у разных групп планарии применяли Т-критерий Стьюдента. Удельную скорость роста глотки определяли по формуле, предложенной И.И. Шмальгаузеном (Мина, Клевезаль, 1976).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Гистологическое исследование регенерации глотки показало, что в течение 1-го дня после удаления глотки происходит образование зачатка глотки. В течение 2-го дня регенерации зачаток глотки увеличивается, постепенно врастая в глоточную камеру и в нем образуется глоточная полость, которая увеличивается по направлению к дистальному концу формирующейся глотки. На 3-й день регенерации глоточная полость соединяется с полостью передней ветви кишечника и с полостью глоточной камеры, К 4-5-му дням регенерации ткани глотки дифференцированы (эпителиальные, мышечный, паренхимный слои).

Изучение пролиферативной активности клеток в ходе регенерации глотки у планарии. Пролиферативная активность регенерационных клеток лежит в основе данного морфогенетического процесса. Изучали изменение митотического индекса в окологлоточной области тела (ОГ) через 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 часов после удаления глотки. Для сравнения использовали участок тела, взятый из предглоточной области (ПГ), более удаленный от зоны регенерации глотки.

Как показали проведенные исследования, в ходе регенерации глотки в окологлоточной и предглоточной зонах тела изменяется пролиферативная активность клеток (табл.1). Изменения происходили неодинаково в области регенерации (ОГ) и в области удаленной от места регенерации (ПГ). В ОГ области тела в первые 8 часов регенерации глотки митотический индекс снижается, после чего наблюдали подъем числа митозов. Максимальное число митозов обнаружено к 24 часам регенерации. В ПГ зоне тела в первые 2 часа регенерации количество митозов также уменьшается, после чего митотический индекс увеличивается и достигает максимума к 12 часам регенерации. Второе значительное повышение митотического индекса было отмечено на 3 и 4 сутки. Итак, по нашим данным, в ОГ зоне тела существует относительно высокий уровень пролиферативной активности. Уменьшение числа митозов,

Таблица I. Митотический индекс в окологлоточном и предглоточном

происходящее в первые часы регенерации может означать, что клетки, находившиеся в стадии 02-фазы клеточного цикла (т.е. готовые к делению) поделились за это время. Следующее увеличение числа делящихся клеток происходит через 24 часа, когда к делению приступают клетки прошедшие Б-стадию клеточного цикла. Сравнение динамики мито-тической активности в ОГ и ПГ зонах указывает на то, что, в более поздние сроки регенерации глотки (3-4 сутки) вероятно используются резервы про-лиферирующих клеток (необластов) из более удаленной от зоны регенерации области.

участках тела в ходе регенерации

глотки (х ± 2ст, % )

Время регенерации (часы) Окологлоточный участок Предглоточ-ный участок

0 (инт) 0.25±0.08 0.20+0.08

2 0.60±0.08 0.10±0.08

4 0.50±0.01 0.30±0.16

8 0.35±0.08 0.40+0.08

12 0.50±0.16 0.50±0.08

24 0.70±0.16 0.25±0.08

48 0.20±0.16 0.2510.08

72 0.40±0.16 0.60±0.16

96 О.ЗОЙ). 16 0.60Ю.16

Функциональное восстановление глотки. Исследование динамики функционального восстановления глотки проведено в 53 повторных экспериментах, всего на 2225 животных. Показателем регенерации служило восстановление функции глотки - пищевая реакция на мотыль. У большинства планарий глотка восстанавливалась на 4-7 дни после ее удаления. К 5-му дню регенерации более половины планарий (61.1 %) были способны принимать пищу, к 6-му дню глотка функционировала у 91.8 % планарий, а на 7-й день после ампутации 99.5 % животных нормально питались (Рис.1).

Компьютерная морфометрия регенерации глотки. Восстановление исходных размеров глотки происходило в течение 30 дней после ее ампутации. На 7-й день длина глотки регенерирующих планарий составляла 65.2 %, а на 14-й день - 87.0 % от средней длины глотки интактных планарий. К 21-му дню длина регенерирующей глотки достигала "исходной" длины. Сходные изменения происходили с площадью глотки. К 21-му дню регенерации площадь новой глотки составляла 87.9 %, а к 28-му дню - 95.1 % от площади глотки интактных планарий. Изменение размеров планарий в ходе регенерации глотки приведены в таблице 2. Изменение удельной -скорости роста глотки в процессе регенерации также показало, что длина глотки восстанавливается несколько раньше (к 21-дню), чем ее площадь (к 28 дню). Изменения относительных показателей роста -критериев регенерации (И и Кб) адекватно отражают закономерности роста регенерирующей глотки (Рис.2).

Роль нервной системы в регенерации глотки. У планарий подопытной группы удаляли глотку и одновременно передний конец тела с головным ганглием. Планариям контрольной группы удаляли глотку. У планарий, у которых был удален головной ганглий, наблюдали торможение функциональной регенерации глотки, по сравнению с контрольной группой планарий (табл. 3). Удаление головного конца тела с головным ганглием также тормозило рост регенерирующей глотки. Морфо-метрическое исследование размеров глоток подопытных и контрольных групп планарий показало достоверное отличие на 10-й день регенерации. У подопытных планарий длина глотки составляла 2.27±0.33, у контрольных - 3.07±0.41.

50 40 30 20 10 0

3456789 10

Рис.1. Динамика функционального восстановления глотки. По оси абсцисс регенерации

К1 Кз

19.0

17.0 15.0 13.0 11.0 9.0 7.0 5.0

14

21

28

4.5 4.0 3.5 3.0 2.5

Рис.2. Изменение критериев регенерации в ходе роста глотки. По оси абсцисс - дни регенерации.

Таблица 2. Изменение размеров тела и глотки планарий в ходе регенерации

Дни Длина Площадь Длина Площадь

регенерации планарии планарии глотки глотки

7 227.1±18.5 559.1±77.7 26.1±4.9 18.5±3.0

14 239.3±28.4 671.7±106.0 34.8±6.1 24.5±4.3

21 250.5±33.5 729.0±116.7 39.7±8.4 26.9±5.0

28 247.9±21.4 762.5±108.9 40.7±5.3 29.1±6.3

Интактные 231.1 ±21.1 574.5*87.2 40.016.2 30.6±5.8

Таблица 3. Динамика функциональной регенерации глотки у планарий О. tigrina после удаления головного конца тела (%)_

Группы планарий (удалены) Кол-во жив-х Дни регенерации глотки

4 5 6 7 8

Глотка 271 14.8 60.1 22.9 2.2 -

Головной конец+глотка 234 0.4 56.4 34.6 6.4 2.2 ■

Значение 32.7** 17.6**

Удаление головного ганглия задерживало регенерацию глотки у планарий, если предварительную операцию проводили за 4 и 5 дней до ампутации глотки. У планарий, которым головной ганглий удаляли за 1, 2, и 3 дня до удаления глотки достоверных отличий от контрольной группы не было обнаружено. При получении

70 60 50 40 30 20 10 О

Рис.3. Динамика регенерации глотки у планарий с интактными (1) и удаленными (2) нервными стволами. По оси абсцисс - дни регенерации.

планариями-реципиентами гомоге-натов головных участков планарий-доноров было обнаружено их стимулирующее действие на регенерацию глотки. В подопытной группе к 5-му дню регенерации глотка восстановилась у 70.6 % животных, в то время, как в контрольной группе лишь у 45 % планарий. В дополнительном эксперименте у передних фрагментов планарий удаляли также боковые участки, содержащие брюшные нервные стволы. При удалении нервных стволов регенерация глотки задерживалась на 2 дня по сравнению с группой животных, у которых нервные стволы оставались интактными (Рис.3)

Действие нейропептидов (НП) на регенерацию глотки у планарий.

Подопытных планарий с удаленной глоткой помещали в раствор исследуемого пептида. Пептиды применяли в концентрации 10"^ М и 10'9 М. Каждой подопытной группе соответствовала индивидуальная контрольная группа. При изучении действия НП на регенерацию глотки использовали функциональный и морфологический критерии регенерации. Исследовали действие нескольких НП: даларгина, фрагмента АКТГ4_(о, аналога АКТГ4.10, аналога АКуГ8-Ю (Рго-01у-Рго)' люлиберина и его фрагментов Лю\_2 и Люд.ц), тиролиберина (ТРГ), меланостатина (МСТ), морфогена гидры (МГ) и его фрагментов МГ7.] ] и МГд.ц.

При исследовании функционального восстановления глотки люлиберин -продемонстрировал стимулирующий эффект на регенерацию глотки. На всем протяжении опыта (4-6 дни) подопытная группа планарий опережала контрольную, однако различия не достигали уровня достоверности. У планарий, находившихся под воздействием Лю1_2, восстановление функции удаленной глотки происходило более интенсивно, чем у планарий контрольной группы. К 6-му дню регенерации различия между опытной и контрольной группами были достоверны (значение Х2 составило 6.01). Люд.ю в концентрации 10-"^ М проявил слабое тормозящее влияние (Х2=2 .62- ). Итак, Лю]_2 из этой группы пептидов проявлял наиболее выраженный эффект на этапе функционального восстановления глотки.

При воздействии МГ в концентрации 10"9 М у подопытных планарий регенерация глотки происходила более интенсивно на всем протяжении опыта, чем у контрольных. При добавлении раствора пептида в концентрации 10'^ М обнаружен достоверный стимулирующий эффект 12.7, Р>0.999) на

Таблица 5. Динамика восстановления функции глотки у планарий во время регенерации под воздействием пептидов и их фрагментов (%)

Группы Концентра Кол-во Дни регенерации глотки

планарий ция (М) жив-х 4 5 6 7 8

Контроль 30 - 43.3 36.7 20.0 -

Люлиберин 10-9 32 9.4 43.8 40.6 6.3 -

Контроль 64 6.3 31.3 48.3 14.1 -

Лю(1-2) 10-7 70 14.3 30.0 54.3 1.4 -

Контроль 10-9 63 9.5 47.6 34.9 6.3 1.6

Лю(9-10) 66 1.5 50.0 34.8 7.6 6.1

Контроль 31 12.9 25.8 38.7 22.6 -

Лю(9-10) ю-7 32 31.3 28.1 31.3 9.4 -

Контроль 62 4.8 58.1 24.7 9.7 -

МГ 10-9 — 67 6.0 61.2 32.8 - -

Контроль 10-7 139 17.3 30.9 43.9 7.9 -

МГ 134 22.9 46.3 25.4 4.5

Контроль 46 17.4 73.9 8.7 -

МГ(7-11) 10-7 43 7.0 83.7 9.3

МГ(9-11) 10-7 42 2.4 21.4 71.4 4.8 -

Контроль 250 4.8 48.0 20.0 19.6 7.6

Даларгин Ю-7 245 4.1 37.1 29.0 24.1 5.7

Контроль 74 1.4 8.1 63.5 27.0

Даларгин Ю-9 78 5.1 12.8 65.4 16.7 -

Контроль 10-9 66 16.7 57.6 22.7 3.0 -

АКТГ(4-10) 65 13.8 56.9 24.7 4.6 -

Контроль 64 29.7 60.9 9.4 -

аналог АКТГ(4-10) 10'9 68 44.1 42.7 13.2 -

Контроль 63 22.2 66.7 11.1 - -

аналог АКТП8-10) 10"9 65 18.5 52.3 24.6 4.6

Контроль 10-7 86 33.7 34.9 26.7 4.7

МСТ 91 24.2 41.8 26.4 6.5 1.1

ТРГ 10-7 88 29.5 40.9 20.5 6.8 2.3

Контроль 96 26.0 45.9 25.0 3.1

МСТ 10-9 93 21.5 46.2 28.0 4.3 -

ТРГ 10-9 95 23.2 43.2 28.3 5.3 -

регенерацию глотки. С-концевые фрагменты пептида МГ.7.Ц и МГд.ц не оказали влияния на регенерацию глотки.

Аналог энкефалина даларгин в концентрации 10'7 М тормозил регенерацию глотки (значение Х^ составило 6.19, Р>0.99). В то же время, направление действия даларгина изменялось на положительное при добавлении раствора пептида в концентрации 10"9 М. Аналог АКТГй.ю обнаружил достоверное тормозящее действие на регенерацию глотки (Х2=5.42, Р>0.99). Фрагмент АКТГ4.10 не проявил морфогенетического действия на модели регенерации глотки, тогда как его аналог (АКТГ4_[0) оказывал слабое стимулирующее влияние на регенерацию. Тиролиберин и меланостатин не оказывали влияния на скорость восстановления функции регенерирующей глотки.

На втором этапе регенерации был применен морфометрический анализ роста и восстановления исходных размеров регенерирующей глотки. Таким методом были исследованы: МГ, Лю]_2. даларгин, меланостатин, тиролибернн.

При изучении действия НП на рост регенерирующей глотки, был обнаружен стимулирующий эффект фрагмента Лю|_2 наблюдаемый в течение всего периода роста. Тормозной эффект даларгина на рост глотки проявлялся на 7-й день регенерации (Р>0.95). Слабое тормозящее действие даларгина сохранялось до 14 дня регенерации. При действие МГ, на 7-й день регенерации размеры сформированных глоток у подопытных и контрольных животных были одинаковыми. Отличия относительных размеров глоток были обнаружены на 14, 21, 28-й дни. Тиролиберин и меланостатин не оказывали существенного действия на рост регенерирующейглотки. Примеры действия НП на рост глотки приведены на рисунке 4.

Таблица 6. Влияние нейропептидов на рост регенерирующей глотки у планарий (значение критериев регенерации)

Группы планарий Критерий Дни регенерации

7 14 21 28

Лк>|_2 Контооль Т-кпит 16.45±0.29 14.81±0.25 3,27** 21.86Ю.37 20.8410.30 2.27* 23.7010.41 21.8410.35 3.20** 22.67Ю.32 21.9110.28 1.21

Лю|_2 Контооль Т-кпит К| 9.67Ю. 16 9.3810.14 1.62 11.5610.15 11.17Ю.16 1.41 13.1810.19 12.4410.14 2.04* 14.25Ю.19 13.4110.16 2.45"

МГ Контроль Т-крит К] 9.33+0.12 9.2510.15 0.21 11.7310.16 10.5810.16 2.78** 13.2510.17 12.9110.14 0.85 15.43Ю.20 14.04±0.17 2.62**

МГ Контроль Т-крит К*, 14.3410.27 14.9510.26 0.88 16.24Ю.25 14.25Ю.04 3.55*** 19.9610.19 18.58Ю.28 2.03* 20.80Ю.31 18.4410.19 3.74***

МГ Контроль Т-крит к* 2.7210.06 2.54Ю.04 1.53 . 3.14Ю.04 2.82Ю.04 1.77 3.65Ю.04 3.31Ю.05 2.03* 3.44Ю.06 3.15Ю.04 2.78**

Даларгин Контроль Т-крит К, 3.01Й.04 3.32Ю.06 2.51* 3.64Ю.06 3.71Ю.04 0.40 3.67Ю.05 3.7210.08 0.37 4.1110.08 3.76Ю.06 1.87

ТРГ Контроль Т-крит МСТ Т-крит - к, 2.72Ю.04 2.64Ю.05 0.59 2.81Ю.06 1.55 3.31Ю.06 2.93Ю.05 1.74 3.34Ю.06 1.83 3.65Ю.05 3.30Ю.05 1.87 3.24Ю.04 1.16 3.69Ю.06 3.44Ю.04 1.56 4.0110.07 3.89*

Примечания: Звездочки обозначают достоверные отличия между опытными и контрольными группами, соответственно: * - Р>0.95; ** - Р>0.99; и *** - Р>0.999; Т - критерий Стьюдента, Концентрация всех нейропептидов 10"7 М.

к

24.0 22.0 20.0 18.0 16.0 14.0 12.0

7 14 21 28

25.0 23.0 21.0 19.0 17.0 15.013.0

7 10 14 21 28

Рис.4. Влияние МГ (а) и Лю]_2 (б) на рост регенерирующей глотки. 1- подопытная группа, 2 - контрольная группа. По оси абсцисс - дни регенерации, по оси ординат - значение критериев регенерации.

Влияние МГ на пролиферативную активность клеток в ходе регенерации глотки. Исследование митотического индекса у планарий, показало, что через 2 часа регенерации в окологлоточной области тела планарий происходило повышение числа митозов под действием МГ в концентрации 10"7 М, в то время как у контрольных планарий повышение митотического индекса происходило только через 24 часа после удаления глотки. У подопытных животных более высокие значения митотического индекса по сравнению с контрольными планариями наблюдали в течение первых 8 часов регенерации. В предглоточной зоне тела планарий, находящихся под воздействием пептида, значительное увеличение митотического индекса происходило через 24 часа после удаления глотки, а не на 3-й сутки, как у контрольных животных (рис.5 а,б). Таким образом, изменение динамики пролиферативной активности в ОГ и ПГ зонах под действием МГ может указывать на значительное ускорение прохождения клеточного цикла пролиферирующих клеток.

Итак, на модели регенерации глотки планарий было обнаружено морфогенетическое действие нескольких нейропептидов. Наиболее выраженный морфогенетический эффект проявили МГ (ю-7 М) и Лю].2 (10"® М), которые ускоряли регенерацию глотки планарий О. Нцппа как на этапе функционального, так и морфологического восстановления. Даларгин в концентрации 10-7 м

1

тормозил восстановление функции регенерирующей глотки, а также ее рост в начальной стадии: до 7-го дня. Слабое стимулирующее влияние на процесс регенерации глотки оказали люлиберин (10"9 М), Лю9_ю (10"? М), аналог АКТГфю (10"9 М). Аналог АКТГд.ю (10"9 М) достоверно задерживал функциональное созревание глотки. Тиролиберин, меланостатин и фрагмент АКТГ4.10 - не оказали влияния на регенерацию глотки. МГ повышал значение митотического индекса в зоне регенерации глотки.

Рис. 5. Изменение динамики пролиферативной активности клеток в окологлоточной (о) и предглоточной (б) областях тела планарий во время регенерации глотки. 1- подопытная группа, 2 - контрольная группа. По оси абсцисс - время регенерации, часы: по оси ординат значение митотического индекса (%).

Регенерация глотки у планарий является удобной моделью для исследования влияния морфогенетических факторов. Однако, при изучении регенерации необходимо учитывать и множество эндогенных факторов, способных оказывать влияние на этот процесс.

В ходе изучения регенерации глотки в разных участках тела планарий значительный интерес вызывает проблема взаимодействия разных морфогенезов, одновременно происходящих в теле планарии. У планарий О. ^гта бесполой расы, размножающихся путем поперечного архитомического деления, передняя половина восстанавливает хвостовой отдел, а задняя - большую часть тела: мозг, глаза, глотку и другие органы.

У контрольных и подопытных животных удаляли глотки. У материнских зооидов, поделившихся накануне удаления глотки, процесс бесполого размножения, не оказывал существенного влияния на ее регенерацию. При изучении регенерации глотки у хвостовых зооидов, отделившихся в ходе бесполого размножения регенерация глотки происходила значительно быстрее, чем у аналогичных по размеру, но отсеченных экспериментально хвостовых фрагментов.

Исследование влияния процесса пищеварения на регенерацию глотки, обусловленное морфогенетической пластичностью пищеварительной системы планарий, ¡¡оторая связана с периодической физиологической регенерацией кишечника, показало, что кормление планарий за 1 и 2 дня до удаления глотки не оказывало влияния на процесс ее регенерации. Регенерация глотки у планарий, находящихся на стадии 3-го, 4-го и 5-го дней пищеварения ускорялась по сравнению с контрольными планариями.

В опыте, проведенном на 292 планариях, было обнаружено, что при рассечении планарии на три равные части тела новая глотка формировалась в окологлоточных участках более интенсивно, чем в головных и хвостовых. К 5-му дню регенерации в окологлоточных фрагментах глотка сформировалась у 81.3 % особей, тогда как у хвостовых регенерантов глотка функционировала у 63.1 % особей, а у головных регенерантов в это время глотка восстановилась только у 39.8 % особей. В то же время гомогенаты ОГ тканей регенерирующих планарий оказывали тормозящее действие на восстановление глотки у планарий-реципиентов, Наиболее выраженный эффект обнаруживали гомогенаты ОГ области 4-го и 5-го дней регенерации глотки. Эти данные свидетельствуют об особой роли окологлоточной зоны в процессе формирования глотки.

ОБСУЖДЕНИЕ

Как показали проведенные исследования, регенерация глотки у планарий Б. ^ппа происходит в два этапа. На первом этапе восстановления глотки происходит дифференцировка структур (гистологическое исследование), и восстановление функции глотки. Он продолжается у большинства планарий 4-7 дней. Второй этап регенерации этап роста, во время которого происходит восстановление исходных размеров глотки. Он характеризуется постепенным увеличением параметров регенерирующей глотки и завершается месяц спустя после операции. Сравнение динамики восстановления глотки после ее удаления с регенерацией других структур (ганглий, кишечник) обнаруживает общие закономерности этих процессов, проявляющиеся в восстановлении функции на первом этапе в среднем в течение 5 дней (Шейман, 1984).

Основная часть работы посвящена изучению регуляции регенерации глотки. При изучении роли нервной системы в регенерации глотки было установлено, что в присутствии головного ганглия она происходила более интенсивно, чем после его удаления, а гомогенаты головного ганглия стимулировали регенерацию глотки у планарий-реципиентов. Вместе с тем то, что регенерация ганглия и регенерация глотки происходят в сопоставимые сроки (около 5 дней), указывает на относительную автономность глотки, возможно обусловленную собственной нервной системой. Удаление нервных стволов задерживало регенерацию глотки у подопытных планарий. Существование анатомической связи глотки с нервными

стволами (Joffe, Reuter, 1993), делает возможным непосредственное регуляторное влияние нервных стволов на ее функцию и регенерацию. Некоторые авторы полагают, что нервные стволы могут осуществлять в процессе регенерации трофическую функцию (Kishida, Asai, 1984).

При изучении НП стимулирующие влияние на регенерацию разных органов и тканей пзвоночных животных было обнаружено для фрагментов АКТГ (Dekker, Gipsen, et al., 1987; Saint-Come, Strand, 1985; Edvards, Gipsen, 1985), даларгина (Корнилова, 1S92), МГ (Спевак и др., 1988; Казимирский, и др., 1986; Виноградов, 1988). Интересны данные, полученные при исследовании морфогенетического действия НП на беспозвоночных животных. Так, было показано, что аналог АКТГ 4-Ю ускорял прохождение линек, а аналог даларгина задерживал линьки у личинок и предкуколок мучного хрущака (Балобанова, Незовибатько и др., 1992). Даларгин стимулировал регенерацию головного конца планарий (Шейман и др., 1985). Люлиберин и его фрагмент Лю|_2 ускоряли развитие личинок насекомых (Шейман и др., 1990), но тормозили регенерацию головного конца тела у планарий (Шейман и др., 1989), а Люд.)о задерживал рост и развитие насекомых (Шейман и др., 1990). МГ ускорял развитие личинок мучного хрущака на фоне высокого титра ювенильного гормона (Балобанова, Крещенко, 1990), стимулировал регенерацию головного отдела у планарий (Тирас, и др. 1990). Очевидно при оценке морфогенетических свойств известных нейропептидов, должно приниматься во внимание филогенетическое положение используемых в эксперименте животных, поскольку у отстоящих друг от друга в эволюционном ряду организмов, один и тот же пептид, может приобретать или утрачивать некоторые функции (Уголев, 1985).

При изучении влияния НП на регенерацию глотки наиболее выраженное действие проявили МГ и Лю1_2, которые ускоряли регенерацию глотки на первом этапе (функционального созревания) и на втором этапе (роста глотки), и даларгин, который тормозил восстановление глотки и ее рост в начальный период регенерации, а также аналог АКТГ3.10, задерживавший регенерацию глотки на первом этапе.

Стимулирующее влияние МГ на регенерацию глотки может быть обусловлено его действием на пролиферативную активность клеток, что проявляется в увеличении митотического индекса клеток в первые часы регенерации и ускорении прохождения ими клеточного цикла. В литературе имеются отдельные сообщения о митогенном эффекте МГ: так, МГ стимулировал клеточную пролиферацию через 2 часа после апликации на клетках гидры и на клеточной линии N1I15-CA2, но не увеличивал синтез ДНК (Schaller et al., 1989), что позволило предположить его участие в качестве контрольного сигнала в G2/M переходе, а не в Gl/S переходе. В недавних исследованиях показано, что МГ увеличивал число делящихся клеток в эпителии языка белых крыс через 4 и 24 часа после сведения, усиливал митотический индекс в эпителии желудка через 24 часа после введения пептида, ускорял прохождение клетками самого митоза с 88.5 мин в контроле до 63 мин в опыте (Хомчук, Тимошин, 1990; 1991).

Полученные нами данные и приведенные литературные сведения говорят о некоторых различиях в проявлении действия нейропептидоз: так, МГ ускорял регенерацию глотки и регенерацию головного конца тела у планарий, однако при действии даларгина были обнаружены различия - петид ускорял регенерацию голоеного отдела, но тормозил регенерацию глотки у планарий, люлиберин и его фрагмент (Лк>[_2) проявляли стимулирующее влияние на регенерацию глотки, и тормозили регенерацию "головы". Таким образом, неодинаковый эффект НП вероятно может зависеть от их действия на разные морфогенетические модели.

мг

Люлиберин (1-2)

Даларгин

■н

Рпс.6. Сравнение действия НП на регенерацию глотки п головного конца тело у планарнп: (+) - стимулирующее, (-) - тормозящее. Концентрация пептидов Ю'^М.

Попытка выявления эндогенных факторов была сделана при изучении влияния на регенерацию глотки таких дополнительных морфогенетических процессов, как регенерация головного конца тела, бесполое размножение и физиологическое восстановление кишечника, происходящее во время пищеварительного процесса.

Как показали исследования, при параллельном прохождении разных морфогенезов возможны их достаточно сложные взаимоотношения. Удалось установить, что 1-2 день регенерации головного конца тела (после его ампутации) и 1-2 дни физиологической регенерации кишечника (после принятия пищи) - не оказывали влияния на регенерацию глотки. В то время, как 4-5 дни этих процессов были значимы для регенерации глотки. При этом, регенерирующий головной конец тормозил, а морфогенез, связанный с восстановлением кишечника, стимулировал регенерацию глотки. В отсеченных на уровне зоны деления хвостовых фрагментах тела планарий глотка регенерировала более интенсивно, чем в таких же по размеру головных фрагментах. Кроме того, восстановление глотки у отделившихся в процессе бесполого размножения хвостовых зооидов происходило значительно быстрее, чем в отсеченных экспериментально хвостовых фрагментах. В некоторых опытах обнаруживалась стимуляция регенерации глотки после отсечения у планарий хвостового участка тела. Ряд этих данных указывает на то, что стимулирующее влияние могло быть обусловлено повышенной морфогенетической активностью зоны деления и, возможно, функционированием морфогенетического фактора.

Таким образом, на модели регенерации глотки охарактеризовано морфогенетическое действие ряда ргуляторных иейропептидов экзогенного происхождения, а также эндогенных факторов разной направленности функционирующих в теле интактных и регенерирующих планарий.

выводы

1. Регенерация глотки у планарий О. t¡gr¡na происходит в два этапа: восстановления функции и восстановления исходных размеров глотки;

а) гистологические исследования показали, что на 5-й день регенерации структура новой глотки, за исключением размеров, соответствовала интактной глотке;

б) физиологическая функция глотки восстанавливалась через 4-7 дней после ее удаления;

в) исходные размеры глотки восстанавливались в течение месяца после ее ампутации.

2. Центральная нервная система планарий оказывала регуляторное влияние на регенерацию глотки:

а) временные характеристики процесса регенерации ганглия и глотки близки (около 5 дней) и указывают на возможность унезависимого прохождения данных морфогенезов;

б) вместе с тем, функциональное восстановление глотки задерживалось у части планарий при удалении головного ганглия;

в) при удалении головного ганглия происходила задержка восстановления размеров регенерирующей глотки в начальный период ее роста;

г) при введении гомогената головных частей тела планарий-доноров регенерация глотки у планарий-реципиентов ускорялась;

д) удаление брюшных нервных стволов задерживало регенерацию глотки;

3. Некоторые НП оказывали морфогенетическое действие на регенерацию глотки у планарий £>. tigrina:

а) МГ стимулировал функциональное восстановление и рост регенерирующей глотки планарий;

б) МГ повышал митотическую активность пролиферирующих клеток в зоне регенерации глотки;

в) Ы-концевой фрагмент люлиберина (1-2) оказывал выраженное стимулирующее действие на регенерацию глотки на этапе функционального восстановления и на этапе ее роста;

г) даларгин тормозил восстановление и рост глотки;

д) аналог АКТГд.ю тормозил регенерацию глотки на этапе функционального восстановления;

е) тиролиберин и меланостатин не оказали существенного влияния на регенерацию глотки.

4. Предполагается существование эндогенных регуляторных факторов, оказывающих влияние на регенерацию глотки, которые связаны с зонами повышенной физиологической активности:

а) регенерация глотки происходила наиболее интенсивно у фрагментов планарий, содержащих окологлоточную зону, что указывает на ее особую роль в процессе формирования глотки;

б) гомогенаты окологлоточных областей, взятые у планарий после 1-го, 2-го, и 5-го дней регенерации глотки, оказывали тормозящее действие на регенерацию глотки у планарий-реципиентов, что может указывать на существование фактора, предотвращающего формирование дополнительных глоток;

в) в хвостовых зооидах, отделяющихся при бесполом размножении, глотка формировалась быстрее, чем в аналогичных участках, отсеченных у интактных планарий, что указывает на возможность существования активного морфогенетического фактора в период деления планарии;

г) поздние стадии пищеварения (4-5 дни) и связанная с ними физиологическая регенерация кишечника оказывали положительное влияние на регенерацию глотки.

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Крещенко Н.Д. Регенерация глотки у планарий Dugesia tigrina. - Онтогенез, • 1993, т.24, N. 1, с. 66-71.

2. Крещенко Н.Д., Шейман И.М. Регенерация глотки у планарий. Влияние нейропептидов. - Онтогенез, 1994, т. 25, N. 6, с. 60-67.

3. Шейман И.М., Крещенко Н.Д. Регенерация глотки у планарий. Влияние нервной системы. - Онтогенез, 1995, т. 26, N. 3, с. 1-5.

4. Тирас Х.П., Крещенко Н.Д. Прижизненная морфометрия регенерации планарий - система биотестирования росТ-регулирующих факторов гидроёионтов. - Всссоюзн. сов. по биол. актив, в-вам гидробионтов., Тез. докл., Владивосток, 1991, с. 104.

5. Тирас Х.П., Крещенко Н.Д., Завада Е.Н., Шейман И.М. Клеточные основы регенерации планарий и проблема специфического биотестирования. - Всесоюзн. науч. конф. "Мед.-биол. и гигиен, аспекты охр. окр. среды". (Купавна), 1991.

6. Крещенко Н.Д., Шейман И.М. Влияние нейропептидов на регенерацию глотки у планарий. -.111 Всесоюзн. совещ. по морфогенетич. актив, в-вам., Пущино, -Онтогенез, 1992, т. 22, N. 3, с. 302.

7. Тирас Х.П., Крещенко Н.Д., Лейбсон Н.Л., Шамотиенко О. Г., Красноперое В. Г., Сухарев С.А. Выделение и очистка биологически активного стимулятора регенерации планарий . из лиофилизата тканей дальневосточного трепанга. - 111 Всесоюзн. совещ. по морфогенетич. актив.в-вам., Пущино, Тез. докл., - Онтогенез, 1992, т.22, N. 3, с. 318.

8. Kreshchenko N.D.* Sheiman I.M., Regeneration о! pharynx in planaria Dugesia tigrina and its regulation. - VI1 International Symposium on the biology of (he Turbellaria, Abstr., ABO Akademy University, Finland, 1993, p. 60.

9. Kreshchenko N.D., Sheiman I.M., Relationship between the central and autonomous nervous system in Planaria. - Reg. meet, oi international soc. for invertebrate neurobiol, Abstr., Pushchino, 1994, p.23.

10. Sheiman I.M., Kreshchenko N.D., Regeneration of pharynx in planarian Dugesia tigrina. - Сотр. Biochem. Physiol., 1995 (in press)

11. Sheiman I.M., Kreshchenko N.D., Feeding behavior in Planarian. - Animals Behav., 1995 (in press)

58.06.95 г. Зак.6029Р. Тир. 70 экз. Усд.печ.л. 1,0 Отпечатано на ротапринте и СИП! ГЕЦ РАН