Мелатонин и ретиноевая кислота как морфогены планарий

Ермакова, Ольга Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Мелатонин и ретиноевая кислота как морфогены планарий
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Мелатонин и ретиноевая кислота как морфогены планарий"

На правах рукописи

Ермакова Ольга Николаевна

МЕЛАТОНИН И РЕТИНОЕВАЯ КИСЛОТА КАК МОРФОГЕНЫ

ПЛАНАРИЙ

03.00.13 — физиология человека и животных

1 П О П ?

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2009 г

003483192

Работа выполнена в лаборатории биофизики внутриклеточной регуляции Учреждения Российской академии наук Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Леднев Валерий Васильевич

кандидат биологических наук Тирас Харлампий Пантелсевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Маевский Евгений Ильич

кандидат биологически наук Шсйман Инна Моисеевна

Ведущая организация: Московский государственный

университет им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится « 2 » декабря 2009 г. в 13 часов 30 минут на заседании совета Д 002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физ.-мат. наук Ланина Надежда Федоровна

Актуальность проблемы

Процессы роста и развития, морфогенеза и регенерации у животных являются неотъемлемыми системами онтогенетического развития и поддержания жизнеспособности организма. Они осуществляются путем многоуровневого контроля с множеством триггеров, прямых и обратных связей, в основе которых лежат генетические механизмы, реализующиеся на клеточном, тканевом и организменном уровнях.

Актуальной проблемой в изучении морфогенеза, пролиферации и дифференцировки клеток является поиск и создание адекватной биологической модели на низших животных. Классическим организмом для изучения процессов развития и роста являются пресноводные плоские черви - планарии (Morgan, 1901). Эти животные обладают уникальной высокой способностью к регенерации с помощью стволовых клеток - необластов (Baguna, 1981). Именно поэтому многие молекулярно-биологические, иммуногистохимические, биохимические, физиологические и другие методы адаптированы применительно к планариям для исследования процессов регенерации, развития и роста (Sánchez Alvarado et al., 2002). Для планарий (Schmidtea mediterránea, Dugesia japónica) производится секвенирование генома, и его результаты показывают, что белки, играющие ключевую роль в регуляции процессов пролиферации и дифференцировки клеток, морфогенеза, имеют высокую степень гомологии с аналогичными белками у высших животных (Oviedo, Levin, 2008). Полагают, что планарии по многим параметрам могут соответствовать современным требованиям экспериментальной биологии к модельному организму (Sánchez Alvarado, 2006). Однако вопрос адекватности и возможности экстраполяции получаемых на уровне планарий биологических эффектов на сходные процессы у высших животных требует более глубоких экспериментальных доказательств.

Для получения этих доказательств мы решили проследить воздействие физиологически активных веществ - мелатонина и ретиноевой кислоты на морфогенез и регенерацию планарий, пролиферацию и дифференцировку их стволовых клеток - необластов. Эти вещества, будучи различными по своей природе и механизмам воздействия, вызывают у высших животных схожие вполне определенные морфогенетические эффекты. Так мелатонин способен подавлять пролиферацию раковых клеток, стимулировать их дифференцировку и вызывать апоптоз (Анисимов и др., 1973; Pandi-Perumal et al., 2006). Ретиноевая кислота контролирует процессы эмбрио- и морфогенеза, и также способна подавлять пролиферацию и стимулировать дифференцировку и апоптоз раковых клеток (Breitman et al., 1980; Chen et al., 2006). У беспозвоночных животных роль мелатонина и ретиноевой кислоты в процессах морфогенеза до настоящего времени не выяснена.

Настоящая работа представляет исследование морфогеиетической роли мелатонина и ретиноевой кислоты в процессах регенерации и морфогенеза планарий. Экспериментальный анализ воздействия этих веществ на регуляцию процессов развития и роста у планарий позволит расширить представления о степени адекватности и применимости данной биологической модели для исследования морфогенетически активных веществ. Цель работы:

Изучение действия мелатонина и ретиноевой кислоты на молекулярные и клеточные механизмы регенерации планарий. Задачи исследования:

1. Исследование морфогенетического действия мелатонина и ретиноевой кислоты на регенерацию различных частей тела планарий.

2. Изучение механизмов действия мелатонина и ретиноевой кислоты на пролиферацию необластов у интактных и регенерирующих планарий.

3. Выявление рецепторов взаимодействующих с исследуемыми морфогенами.

4. Выявление экспрессии мелатониновых и ретиноидною рецепторов в различных физиологических состояниях планарий.

5. Изучение действия мелатонина и ретиноевой кислоты на экспрессию генов у планарий.

6. Выяснение возможности модуляции воздействия мелатонина и ретиноевой кислоты на регенерацию планарий с помощью физических факторов -переменных магнитных попей.

Научная новизна работы

Показано, что мелатонин и ретиноевая кислота способны ингибировать регенерацию головного, но не хвостового конца тела планарий. Обнаружено, что данный эффект реализуется путем подавления этими веществами пролиферации стволовых клеток планарий. Продемонстрирована возможность модуляции данных эффектов с помощью переменных магнитных полей путем изменения переменной компоненты комбинированного магнитного поля. Впервые с помощью проточной цитофлуориметрии выявлены фазы клеточного цикла пролиферирующих стволовых клеток планарий - необластов, на которые оказывают воздействие исследуемые вещества. С помощью фармакологического анализа обнаружено, что эффекты мелатонина у планарий опосредуются мембранными рецепторами, а ретиноевой кислоты - ядерными рецепторами. Впервые с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени количественно определена экспрессия мембранных рецепторов мелатонина в теле планарий и выявлено дистально-проксимальная неоднородность их распределения, которая обуславливает ассиметрию в реализации морфогенетических эффектов мелатонина на пролиферацию необластов и

регенерацию плоских червей. Продемонстрированы молекулярно-генетические механизмы регуляции мелатонином и ретиноевой кислотой процессов пролиферации стволовых клеток и регенерации у беспозвоночных животных; показаны их подобия и различия по сравнению с позвоночными животными. Научно-практическое значение

Полученные результаты свидетельствуют об адекватности применения планарий в качестве биологической модели для исследования проблем регуляции процессов регенерации, происходящих с участием стволовых клеток на организменном, тканевом, клеточном и молекулярном уровнях. Результаты работы могут быть использованы при создании молекулярно-генетических тестов для исследования различных биологически активных веществ. Данное исследование демонстрирует возможность экстраполяции биологических процессов, происходящих у планарий на эволюционно более развитые группы животных, включая человека. Сведения, полученные в настоящем исследовании, и простота планарий как экспериментального биологического объекта позволяют использовать этих животных в биомедицинском образовании, в курсах по изучению регенерации, клеточной пролиферации и дифференцировки. Апробация диссертации

Результаты диссертационной работы доложены на 10-й международной школе - конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006); IV Международном Конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (СПб, 2006); Ежегодной Всероссийской и международной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва, 2007); 12-й школе - конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008); Conference on modern biology «BioNews» (Kazan, 2008); XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2009» (Москва, 2009) Публикации

По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 5 статей.

Благодарности

Автор выражает благодарность своему руководителю к.б.н. Тирасу Х.П. за руководство работой и профессиональную помощь; д.б.н. Железной Л.Д., к. б. н. Ушаковой Т.Е. и Еадокимовскому Э.А. за активную помощь в отладке методов молекулярной биологии; к.б.н Кудрявцеву A.A. за предоставленную возможность работы по цитофлуориметрии клеток планарий; Дееву A.A. за помощь в программной обработке изображений планарий.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения,

основных выводов работы, списка литературы. Диссертация изложена на_

страницах машинописного текста, содержит _ рисунков и _ таблиц.

Список литературы включает_наименований.

Объекты и методы исследования

Исследование выполнено на бесполых клональных расах двух видов пресноводных плоских червей планарий: Girardia tigrína и Schmidtea mediterránea. Животных содержали в прудовой воде при комнатной температуре и кормили раз в неделю личинками двукрылых (мотыль). Для стандартизации биологических процессов в эксперимент отбирали планарий длиной около 10 мм и прекращали их кормление за 7 дней до опытов. В работе использовались как интактные (около 300 особей), так и регенерирующие животные (более 10000 особей). Для обнаружения дистально-проксимальных эффектов регенерации исследовали регенерацию головы и хвоста планарий. Регенерация головы вызывалась путем ампутации 2 мм головной части тела планарий, содержащей головной ганглий, хвост ампутировали на расстоянии 1-2 мм от конца тела планарии.

Температура воды в экспериментальном и контрольном сосудах поддерживалась одинаковой, на уровне 21 ±0.5 °С. Эксперименты в каждой серии повторялись не менее 3-х раз на группах, включающих в среднем по 30 животных.

Метод прижизненной компьютерной морфометрии. Для оценки динамики роста регенерационной почки (бластемы) использовали метод прижизненной морфометрии планарий. Метод базируется на регистрации фотоконтраста между старыми (пигментированными) и новыми (прозрачными) частями тела. Молодая формирующаяся бластема в первые дни не покрыта пигментным эпителием, что позволяет четко выделить ее область на фоне пигментированной остаточной старой части тела (Тирас, Сахарова, 1984). Стандартные изображения регенерирующих планарий получали с помощью комплекса, включающего видеокамеру Аррго 7900, смонтированную на окуляре бинокулярного микроскопа МБС-10, и компьютера IBM РС, состыкованных с помощью видеограббера DigitEye DE-15 (Candela). С помощью оригинального пакета программ Plana 4.4 разработанного А. А. Деевым (ИТЭБ РАН) определялась общая площадь тела животного и площадь бластемы. В качестве количественного критерия роста использовали индекс регенерации R=s/S, где s -площадь бластемы, S - площадь всего тела регенеранта. Каждое из измеряемых значений R - результат усреднения измерений по 30 животным. Изменение индекса регенерации в эксперименте (R3) по сравнению с контролем (RK)

определялась по формуле:

&я=

-£¿100%

- где AR - разница (%) между

величинами R3 и RK, 5э,к - стандартные ошибки измерений в опыте и контроле. Стандартная ошибка &R не превышала 6%.

Определение пролиферативной активности необластов. Биологический эффект оценивали после 24 часов регенерации по разнице величин митотического индекса ДМИ (%) в опытных и контрольных образцах клеточных суспензий, полученных методом кислотной мацерации тканей (Леднев и др., 1996). Регенерация обеспечивается пролиферацией, миграцией и дифференцировкой резервных клеток, необластов, сосредоточенных в области постбластемы толщиной 0.5 мм, примыкающей к раневой поверхности. Колхицин, добавленный в среду в конечной концентрации 0.05 % сразу после ампутации, останавливал митозы в метафазе и приводил к накоплению метафазных пластинок в течение всей экспозиции. Определялось число митозов в суспензии клеток, приготовленной из участков постбластемы. Ткань планарий подвергалась диссоциации на отдельные клетки в растворе, содержащем смесь ледяной уксусной кислоты, 96% этилового спирта, глицерина, воды в соотношении объемов 1:3:2:14. Каждый экспериментальный образец содержал постбластемы от 4 животных в 70 мкл раствора. Через 20-30 минут образец встряхивали на вортексе (Elmi), до образования суспензии диссоциированных клеток. Для выявления метафазных фигур в каждый образец вносили 20 мкл 0.05% раствора Hoechst-33342 (Sigma) и фиксировали образец, добавляя 20 мкл 20% формалина. Каплю суспензии (40 мкл) наносили на предметное стекло и высушивали. После высушивания препарат заключали в 20% глицерин и накрывали покровным стеклом. Количество метафазных фигур на 1000 клеток определяли с помощью флуоресцентного микроскопа ЛЮМАМ - 2 (ЛОМО) путем фотографирования и подсчета клеток на микрофотографиях. Каждое экспериментально полученное значение МИ является результатом усреднения по 30000 клеток. Величина

средняя величина митотического индекса в экспериментальных, a Ml« -контрольных образцах, Шк, э - ошибки среднего для измерений.

Метод проточной цитофлуорииетрии. Для исследования клеточного цикла пролиферирующих необластов применяли проточную цитофлуориметрию. Для этого из ткани области постбластемы суточных регенерантов готовили суспензию клеток с помощью разработанного нами метода. Кусочки тела животных (0.5 мм) помещали в 300 мкл 0.1 М раствора лимонной кислоты (Sigma), содержащего 0.5 % Твин 20 (Sigma), на 10 мин при комнатной температуре; далее ткань суспендировали кратковременным встряхиванием на вортексе (Elmi) в течение 10 сек. К полученной суспензии клеток добавляли 1 мл 0.4 М раствора

эффекта вычислялась по формуле:

Ш1 =

{М1э-М1к)±(тэ+тк)

Щ-

ii.100%

- где М1э -

NaH2P04, (Россия, осч), содержащего 10 мкг/мл флуоресцентного красителя для ДНК Hoechst 33342 (Sigma), и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Непосредственно перед анализом клеточную суспензию фильтровали через нейлоновый фильтр (Filcons) с диаметром пор 50 мкм. Отсутствие клеточных агрегатов в полученных суспензиях контролировали с помощью флуоресцентного микроскопа ЛЮМАМ - 2 (ЛОМО). Клеточные суспензии анализировали на проточном цитофлуориметре Partee PAS III со скоростью 100-200 клеток в секунду. Цитограммы строили путем определения в 50000 клетках относительного содержания ДНК в клеточных ядрах (детектор FL 4). На полученных цитограммах с помощью программы FloMax (Partee) оценивали долю клеток, находящихся в Gc/G-i, S и G2/M фазах клеточного цикла. Изменения доли клеток в разных фазах

до/о = {Э-К)±{т? + тк) # 1(Ю% клеточного цикла вычислялись по формуле: к , где: К

и Э - контрольные и экспериментальные значения количества клеток в S или G2/M фазах клеточного цикла, Шк и тэ - стандартные ошибки контрольных и экспериментальных значений количества клеток в S или G2/M фазах.

Метод ПЦР в реальном времени. Для определения изменений уровня экспрессии генов под воздействием исследуемых веществ применяли метод ПЦР в реальном времени (Gibson et al., 1996). В качестве референсного гена был использован хаус кипинг ген - фактор элонгации EF-1a, относительно которого нормализовалась экспрессия всех исследованных генов. Для выделения общей матричной РНК из ткани планарий использовали набор «Выделение полноразмерной поли (А) мРНК на магнитных частицах» (Силекс (Москва)), Полученную мРНК использовали для получения комплементарной ДНК, с помощью набора «Синтез первой цепи кДНК (олиго(дТ)15)» фирмы Силекс. Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР в реальном времени. ПЦР в реальном времени проводили на приборе ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems), используя набор фирмы Синтол (для ПЦР в реальном времени), содержащий интеркалирующий краситель SybrGreen и референсный краситель ROX. Гек - специфические праймеры подбирались с помощью программы Primer Express 3 (Applied Biosystems). Длина праймеров составляла в среднем 24 нуклеотида. Температура отжига 59-60°С, длина амплифицируемого фрагмента 94-100 пар нуклеотидов. Реакцию проводили по следующей схеме: 1 цикл 95°С - 5 мин; 40 циклов 95°С - 30 сек, 60°С - 40 сек; 1 цикл (стадия диссоциации) 95°С - 15 сек, 60°С - 1 мин, 95°С - 15 сек.

На стадии отладочных экспериментов для проверки специфичности реакции продукты амплификации проверялись электрофорезом в 2% агарозе. Во всех остальных случаях специфичность реакции проверялась на кривых температурной диссоциации полученных ампликонов. Анализ данных, полученных

с помощью ПЦР в реальном времени, производили по пороговой флуоресценции методом ДС(Т) по формуле: ДС(Т)гена = С(Т)геиа - C(T)Smed-ef ю, где C(T)Sm«^f i„ -пороговая флуоресценция хаус кипинг гена.

Разницу между экспрессией гена в опыте и контроле вычисляли методом ДДС(Т) т.е. по формуле: ДДС(Т)гена = ДС(Т)гвна опыт - ДС(Т)гена контр*

Относительный уровень экспрессии гена вычисляли по формуле: Отн. экспр.= 2^°Пвна.

Помимо этих значений на начальных этапах проведения ПЦР оценивалась также эффективность амплификации для каждого из генов.

Облучение ппанарий рентгеновскими лучами. Гены, экспрессирующиеся в необластах, выявляли путем облучения планарий рентгеновскими лучами, которые избирательно уничтожают стволовые клетки этих животных. Для этого планарий помещали в чашки Петри под 5 мм слой прудовой воды и подвергали рентгеновскому облучению в дозе 30 Гр и при интенсивности 2 Гр/мин с помощью рентгеновской установки РУТ-250-14-1. Анализ экспрессии генов производили через 3 дня после облучения.

Техника получения магнитных полей. Комбинированное магнитное поле, состоящее из коллинеарно направленных постоянной BDc и переменной Вас компонент, создавали следующим способом. В качестве постоянной компоненты поля Вис использовали локальное поле Земли в месте расположения тест-системы, а переменную компоненту, направленную параллельно земному полю, создавали с помощью катушечной пары Гельмгольца диаметром около 30 см. Величина постоянной компоненты поля Вес определялась с помощью феррозондового магнитометра типа СГК-64М (завод "Геологоразведка") с точностью +0.01 мкТл. Амплитуду и частоту переменной компоненты задавали с помощью генераторов ГЗ-112. Амплитуду переменной компоненты поля устанавливали с учетом величины передаточного коэффициента к (10 мкТл/1В) катушек Гельмгольца. Значения соотношения амплитуд постоянного и переменного компонентов поля Вдс/Вос, а также частоты переменного компонента поля fас устанавливались в соответствии с теорией магнитного параметрического резонанса в биосистемах (Леднев, 1996; Леднев и др., 1996).

Используемые в работе фармакологические препараты. Для исследования использовали вещества, являющиеся лигандами (агонистами и антагонистами) изучаемых рецепторов. В качестве агонистов рецепторов мелатонина использовали мелатонин (Sigma) и IIK7 (М-бутаноил-2-(2-метокси-6Н-изоиндоло [2,1-а] индол-11-ил) этанамин) (Sigma), который специфичен для MTj рецептора. В качестве антагонистов рецепторов мелатонина применялись празозин гидрохпорид - 1-(4-амино-6,7-диметокси-2-хиназолинил)-4-(2-фуранилкарбонил) пиперазин гидрохлорид (Sigma), который специфичен для МТз рецептора, и К185 (М-бутаноил-2 (5,6,7-тригидро-И-метоксибензо [3,4] циклогепт

[21-а] индол-13-ил) этанамин) (Sigma), который специфичен для MTj рецептора. Для активации рецептора ретиноевой кислоты использовали а\\-транс-ретиноевую кислоту (Sigma) и 9-цис-ретиноевую кислоту (Sigma). В качестве агонистов ретиноидных рецепторов применялись TTNPB (аротиноидная кислота) (4-[(Е)-2-(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафталенил)-1-пропенил] бензоевая кислота) (Sigma), специфичную для RAR рецептора ретиноевой кислоты, и цис-4,7,10,13,16,19-докозагексеноевая кислота (Sigma), специфичная для RXR рецептора ретиноевой кислоты. Маточный раствор мелатонина (2 мг/мл) готовили следующим образом: навеску гормона растворяли в 30 мкл этанола и затем доводили дистиллированной водой до 1 мл. Исходные растворы всех остальных веществ (10"2 М) готовили путем растворения их в диметилсульфоксиде (ДМСО). Фармакологические препараты добавляли непосредственно после операции декапитации или декаудолизации в стаканы с водой, в которых помешали регенерантов. Вода контрольных групп планарий содержала этанол или ДМСО, в тех же концентрациях, что и в воде опытных групп. Конечные концентрации этанола и ДМСО для животных во всех группах не вызывали гибели или морфогенетических изменений животных.

В экспериментах по изучению изменений экспрессии генов под воздействием ретиноидов для повышения активности препарата применяли метод кормления планарий искусственной пищей (Newmark, Sánchez Alvarado, 2000). Для этого 100 мкл 0,75 % легкоплавкой агарозы (ICN) смешивали с 100 мкл гемолимфы мотыля и добавляли раствор ретиноидов в ДМСО до конечной концентрации действующего препарата 10"4 М. Полученную смесь охлаждали до полного застывания агарозы, нарезали на мелкие кусочки и скармливали животным. Контрольные группы планарий кормились смесью, состоящей из агарозы, гемолимфы и ДМСО.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «Sigma-Plot 9». Для сравнения данных применяли параметрический критерий Стьюдента (tst тест) и критерий Фишера.

Результаты и обсуждения

Ингибирующее влияние мелатонина и ретиноевой кислоты на рост бластемы и пролиферацию стволовых клеток планарий Воздействие мелатонина и ретиноевой кислоты на регенерацию головного и хвостового отдела планарий

Как показано на рисунке 1 мелатонин в концентрации от 10"1СМ до Ю^М вызывал ингибирование роста головной бластемы планарий G. tigrina и S. mediterránea. При этом наблюдалась нелинейная зависимость ингибирующей

активности мелатонина на рост головной бластемы планарий с двумя максимумами эффекта действия равными -25±3 % при концентрациях мелатонина 10'4М и 10"8М (для G. tigrina) и 10'6М, 10"9М (для S. mediterránea). В интервалах концентраций мелатонина, между «пиковыми» значениями, происходило уменьшение степени ингибирования регенерации головного конца тела животных.

Регенерацию хвостовой части планарий G. tigrina мелатонин, даже в достаточно высоких концентрациях (Ю^М) не подавлял (величина ÜR составляла 0+3.3 %).

Инкубация регенерирующих планарий в растворах all-трэнс и 9-цис-ретиноевых кислот приводила к достоверному подавлению роста головной бластемы планарий G. tigrina и S. mediterránea, но не действовала на регенерацию хвостовой части тела. Эффект действия а1Илранс-ретиноевой кислоты на регенерацию планарий G. tigrina прямо зависел от концентрации препарата с максимумом -35±4 % при концентрации, равной Ю^М, и минимумом -8±3 % при концентрации - Ю"10М (рис. 2, а). Сходные концентрационные эффекты наблюдали и в серии разведений 9-цис-ретиноевой кислоты. Так максимальный уровень ингибирования роста бластемы (-28±3 %) наблюдали при концентрации 10'7М, а минимальный (-9±3.5 %) при концентрации 10"10М (рис. 2, б).

Рис. 1. Регенерация головы планарий G. tigrina (а) и S. mediterránea (б) под действием мелатонина. Все отличия достоверны (* р < 0.001; ts, тест). Здесь и ниже данные представлены в виде среднего ± доверительный интервал. Контроли в каждом эксперименте были не отличны один от другого.

Концентрация мелатонина, М

5*10"' Ю"6

Концентрация а11-траис ретиноевой кислоты, М

контроль ю-И) ю-? jo-8 jff-7 Концентрация 9-цнс рстнноевой кислоты, М

Рис. 2.

Регенерация головы планарий С. й^ппа под действием а11-транс (а) и 9-иис-региноевых кислот (б). Все отличия достоверны (* р < 0.001; гжг тест).

Ингибирование роста головной бластемы планарий S. mediterránea растворами alt-трзнс-ретиноевой кислоты имело концентрационную зависимость с максимумом эффекта (-31 ±3 %) при концентрации вещества 10"7М и минимумом

Рис. 3 Зависимость уровня ингибирования роста головной бластемы £ mediterránea от концентрации аН-т/кгнс-ретиноевой кислоты. Все отличия достоверны (* р < 0.001; t., тест).

Таким образом, ингибирование мелатонином регенерации головы у планарий G. tigrína и S. mediterránea характеризовалось двумя концентрационными максимумами биологического эффекта. Возможно, это связано с особенностями физиологической активности изучаемого гормона в организме планарий. Например, с наличием у этих животных разных рецепторов мелатонина с различными константами связывания с лигандом и, соответственно, проявляющих максимальную активность при разных концентрациях гормона или имеющих лигандную инактивацию за счет интернализации рецепторов. Согласно полученным данным, оба типа лигандов - мелатонин и ретиноевые кислоты обладают дистапьно-проксимальным эффектом воздействия на регенерацию планарий. Подобную зависимость эффекта от области регенерации можно объяснить градиентами распределения в теле планарий рецепторов этих веществ, или же ферментов, участвующих в их метаболизме. Антипролиферативкая активность мелатонина и ретиноевой кислоты

Исследование митотической активности в суспензии необластов из головной постбластемы показало, что добавление мелатонина в концентрации 10' 4М сопровождается достоверным снижением уровня пролиферации необластов на 49±2.3 %. All-транс-ретиноевая кислота в концентрации 10'7М снижала митотический индекс в постбластеме подопытной группы регенерирующих планарий G. tigrína на 50±3 %. В хвостовой постбластеме ни мелатонин, ни ретиноевые кислоты не влияли на величину данного параметра (рис. 4; табл. 1).

Проточная цитофлуориметрия клеточных суспензий, полученных из ткани головной постбластемы регенерирующих планарий S. mediterránea, после инкубации в растворах 9-цис и аП-транс-ретиноевой кислоты в концентрации 10' 7М, показала, что оба вещества вызывают существенное снижение количества пролиферирующих клеток, находящихся в S и G2/M фазах клеточного цикла (рис. 5, а; табл. 2). Причем 9-цис-ретиноевая кислота ингибировала клеточный цикл интенсивнее, чем а1!-трзнс-ретиноевая кислота (табл. 2).

(-11+3.4 %) при концентрации Ю'10М (рис. 3).

Концентрации яН-траыс ретиноевой кислоты, М

Таблица 1. Сравнение митотической активности необластов при воздействии мелатонина в головной и хвостовой постбластеме планарий G. tigrina. *** р<0.001 (tst тест)

Концентрация Головная постбластема

мелатонина, контроль опыт биологический

М MI ± m MI ± ш эффект ДМ1% ± ШдМ1%

0.0261±0.0004 0.0133±0.0002 -49%±2.3%*"

Ю-6 0.0243±0.0003 0.0170±0.0003 -30%±2.5%"*

Хвостовая постбластема

10" 0.0122±0.0002 0.0125±0.0001 2.4%±2.5%

10"" 0.0133±0.0003 0.013б±0.0004 2.3%±5.2%

о 0,025

5й * о

| 0,02

1К

| 0,015

£ 0,01

2 0,005

«fel

El контроль 9 опыт

JJ1

Голова Хвост

Рис 4. Воздействие aU-fnpa/ic-ретиноевой кислоты (10~7М) на пролиферацию необластов в головной и хвостовой постбластеме планарий G. tigrina. * р < 0.001 (ts, тест)

Таблица 2. Изменения в клеточном цикле необластов в головной постбластеме планарий S. mediterráneo под воздействием ретиноевых кислот и мелатонина. ** р < 0.01, * р < 0.001 (tsl тест, п=6)

Доля клеток в фазах клеточного цикла. % Уменьшение доли клеток в фазах клеточного цикла,

Группа животных go/g, S g2/m S g¡/m

Регенерирующие, контроль 81.4 ±0,1 9.65 ± 0.2 8.95 ±0.28 -

Регенерирующие, инкубация с 9-цис-ретиноевон кислотой 91.77 ± 0.09 5.16 ±0.11 3.08 ± 0.4 47 ±3.2* 66 ± 7.6*

Регенерирующие, инкубация с а!1-т/7яне-ретииоевой кислотой 87.34 i 0,1 8,52 ± 0.15 4.14 ± 0.32 12 ± 3.6** 56 ± 6.7*

Регенерирующие, инкубации с мелатоннном 89.98 ± 0.1 5.23± 0.14 4.79± 0.3 47± 3.5* 46 ±6.4*

* 3500

ж 3«»

-—контроль Р

—контроль — опыт

X 2560

500: s G2/M *

** мев

500

250

: s G2/M

100 / 1М

100

S s «м

S «f so I«

И tW 1« Я» 350

JM_ 1Й 2« 25Й

Относительное содержание ДНК*

Рис. 5 Сравнение цитометричсских профилей клеточных суспензий, полученных m регенерирующих в течение суток планарий S. mediterranen, и из регенерантов после суточной инкубации в растворах (а) 9-цнс-ретиноевой кислоты и (б) мелатонина (10**М). G1/GD - соматические клетки и необласты, находящиеся в Gt/Gfl фазах клеточного цикла; S - иеобласты, находящиеся е S фазе клеточного цикла; G2/M - необласты в G:/M фазах клеточного цикла.

Мелатонин, в концентрации 10"6М достоверно уменьшал в головной постбластеме количество пролиферирующих необластов, находящихся в S и G2/M фазах клеточного цикла на 47% и 46 % соответственно (рис. б, б; табл. 2).

Как и следовало ожидать из вышеприведенных данных, инкубация регенерирующих планарий в растворах мелатонина и ретиноевых кислот не приводила к изменениям в клеточном цикле пролиферирующих стволовых клеток хвостовой постбластемы животных.

Полученные данные указывают на то, что биологический эффект воздействия мелатонина и ретиноевых кислот на регенерацию планарий реализуется посредством подавления этими веществами митотической активности стволовых клеток - необластов. Эти данные хорошо согласуются с результатами, полученными на культурах клеток высших животных, где мелатонин вызывал торможение пролиферации клеток путем остановки клеточного цикла (Tarn et al., 2007).

У планарий, под воздействием ретиноевых кислот и мелатонина, происходит специфическое ингибирование пролиферации необластов в точке перехода от Gi/G0 к S фазе клеточного цикла, что приводит к падению количества клеток, находящихся в S и G2/M фазах. Возможно, что данный эффект обуславливается не только ингибированием клеточного цикла необластов, но и индукцией гибели этих клеток путем апоптоза. Подобным образом мелатонин и ретиноевые кислоты воздействуют на активно пролиферирующие раковые и стволовые клетки высших животных (Nelson et al., 2006; Cui et al., 2006).

Фармакологический анализ рецепторов мелатонина и ретиноевой кислоты, участвующих в регуляции регенерации и пролиферации необластов

На рис. 6 и 7 приведены результаты экспериментов по воздействию различных агонистов и антагонистов рецепторов мелатонина и ретиноевой кислоты на регенерацию головного конца тела планарий. Ингибирующее действие мелатонина на рост головы животных полностью снималось антагонистом мембранного МТг рецептора мелатонина К185 и частично антагонистом для мембранного МТ3 рецептора - празозином (рис.7, а). Агонист МТг рецептора - ПК7 подавлял рост головной бластемы планарий, при этом наблюдалась концентрационная зависимость биологического эффекта, сопоставимая с ингибированием регенерации мелатонином (рис.7, б).

конт К185 Прэаози^Яолат Mortar Мелет IIK7 pon- 10-7м 10„7М 10-6„ ^«1а5»Приози«,0-Гм

контроль I г.

Кнпкектрлция ягониста 1UC7, М

а б

Рис 6, Изменение индекса регенерации головного конца тела двух видов планарий под воздействием агонистов и антагонистов мембранных рецепторов мелатонина. a) S. mediterránea, и б) G. tigrina. К185 - антагонист МТ2 рецептора, празозин - антагонист МТ3 рецептора, ПК 7 - агонист МТ2 рецептора, мелат - мелатонин. * р < 0.001, ** р < 0,01 (t,, тест)

Рис. 7. Рост головной бластемы планарий С. tigrina под действием агоииста рецепторов ретиноевой кислоты - докозагексеноевой кислоты (б). * р < 0.001 ((з, тест).

контроль

Концентрация докозагексеноевой кислоты, М

Приведенные результаты указывают на ключевую роль мембранных рецепторов мелатонина (МТ2 и МТ3) в регуляции процессов пролиферации необластов и регенерации планарий. Полное снятие эффекта мелатонина антагонистом К185 и частичное антагонистом празозином, возможно, связано с различием реализуемых путей передачи сигнала в зависимости от активности МТг и МТз рецепторов на разных стадиях пролиферации и дифференцировки

стволовых клеток - необластов. Это предположение подтверждается ингибированием роста бластемы препаратом |1К7 (агонист для МТ2 рецепторов) и отсутствием характерного для мелатонина (агонист для всех типов рецепторов) двух пиков активности.

Инкубация регенерирующих планарий в растворе TTNPB (аротиноидной кислоты) (Ю'10М - 10'7М) - агониста ядерного RAR-рецептора ретиноевой кислоты не приводила к изменению динамики роста головной бластемы. В то же время, агонист ядерного RXR-рецептора ретиноевой кислоты - докозагексеноевая кислота достоверно подавляет рост головной бластемы планарий с максимальным эффектом при концентрации препарата 10"7М (рис. 7), сопоставимой с концентрацией ретиноидов в тканях животных.

Исследование показало наличие в клетках планарий (которые являются первичноротыми животными) только RXR рецептора ретиноевых кислот, в отличие от вторичноротых, имеющих как RXR, так и RAR рецепторы.

Экспрессия рецепторов мелатонина и ретиноевой кислоты в теле интактных и регенерирующих планарий Schmidtea meditteranea

С помощью поиска в базе данных по геному S. mediterranea были найдены ортологи мембранных рецепторов мелатонина Smed-mt1, Smed-mt2, Smed-mel 1c и ортолог ядерного рецептора ретиноевой кислоты - Smed-rxr (Robb et al., 2008). На основании этих данных с помощью метода ПЦР в реальном времени, была исследована экспрессия обнаруженных рецепторов мелатонина и ретиноевой кислоты в теле интактных и регенерирующих планарий.

Экспрессия рецепторов мелатонина и ретиноевой кислоты у интактных планарий

Нами выявлен четкий градиент экспрессии рецепторов мелатонина в теле интактных животных. Максимальный уровень содержания мРНК Smed-mt2 рецептора наблюдался в головной части планарий. В туловищном отделе животных экспрессия данного рецептора была в 16 раз ниже, а в хвостовом в 32 раза. мРНК рецепторов Smed-mt1 и Smed-mel 1с распределена в планариях также неравномерно: максимальная ее концентрация наблюдается в голове, а минимальная - в туловище и хвосте животного (рис. 8). Сравнение уровня экспрессии всех трех мелатониновых рецепторов в разных отделах тела планарии показало, что в головной части животных наиболее распространен Smed-mt2 рецептор, тогда как в туловищном и хвостовом отделе более представлен Smed-mel 1с.

Рецептор ретиноевой кислоты, в отличие от рецепторов мелатонина, в теле интактных планарий не имеет сколько-нибудь существенного отличия в дисто -проксимальном распределении экспрессии (рис. 8).

■ Smed-mt2 Smed-rnef 1c Smed-mtl • Smed-rxr ±SD

Голова

Туловище Хвост

Рис. 8. Уровни экспрессии мелатониновых и ретиноидного рецепторов в головном, центральном и хвостовом отделах интакгных планарий, обозначенные в относительных единицах. В качестве единицы принята экспрессия рецепторов мелатонина в голове. Здесь и далее представлены средние по трем независимым экспериментальным значениям,

полученным на 12 животных ± стандартное отклонение. *р < 0.001

Экспрессия рецепторов мелатонина и ретиноевой кислоты у регенерирующих планарий, и планарий после рентгеновского облучения

Проведенные исследования показали, что регенерация планарий сопровождается снижением уровня экспрессии рецепторов мелатонина и ретиноевой кислоты. Через сутки после ампутации головной части планарий концентрация мРНК Smed-mt2 в головной постбластеме была меньше на 30% по сравнению с интактными животными, экспрессия Smed-mtl - снизилась в 2 раза, экспрессия Smed-mel 1с- в 10 раз, а уровень экспрессии ретиноидного рецептора Smed-rxr снизился в 8 раз (рис. 9). Уровень экспрессии рецептора Smed-mt2 вс время регенерации хвостовой части планарий уменьшался в 13 раз, Smed-mel 1с -в 40 раз, Smed-mt1 -в2 раза, a Smed-rxr- в 7 раз (рис. 9).

Рис 9, Уровни экспрессии рецептрров мелатонина Smed-mt2, Smed-mtl Smed-mel 1с и рецептора ретиноевой кислоты Smed-rxr у иитактных (части, соответствующие головной н хвостовой постбластеме регенерирующих

животных) и регенерирующих планарий (части головной и хвостовой ностбластемы). В качестве единицы принята экспрессия рецепторов мелатонина у интактных планарий. *р < 0.001, **р< 0.01

Известно, что облучение планарий рентгеновским излучением приводит к гибели необластов. Эта особенность широко используется для исследования процессов, происходящих с участием необластов (Wolff, Dubois, 1948). В данном исследовании был применен этот метод для выяснения наличия экспрессии генов изучаемых рецепторов в стволовых клетках планарий.

ES3 Интактные ЧШ& Постбластема

головы 7772} Постбластема хвоста

Smed- Smed- Smed-mt2 mel 1c mt1

Облучение интактных планарий рентгеновским излучением (30 Гр) приводило к достоверному уменьшению количества мРНК рецептора мелатонина 8тес1-п\12, а также к снижению экспрессии гена втес^-рт 1, который представлен только в необластах планарий и' служит маркером гибели стволовых клеток. В то же время, экспрессия остальных рецепторов мелатонина {Бтеб-тН, Этед-те! 1с) и рецептора ретиноевой кислоты 5тес!-гхг в теле интактных планарий после рентгеновского облучения не изменялась (рис. 10).

Ж 1,2 О

О ф

0.1,0 п

л 0.0

та

0,6

§0,2 X

О о,о

) Итактныз Г Облученные (30 Гр)

Рис 10. Экспрессия мелатониновых и ретиноидного рецепторов, а также гена Smed-piwi 1 у интактных планарий через три дня после облучения рентгеном. *р <0.001, "р< 0.01

5тес/- Зтес1~ Ътсф Этос!- 5тес/~ т<2 те/ 1с тН гхг р/ютЧ

Представленные данные свидетельствуют о наличии двух концентрационных пиков действия мелатонина на регенерацию плоских червей, что обусловлено присутствием в теле животных нескольких типов рецепторов, которые контролируют различные физиологические функции. Дистально-проксимальный эффект ингибирования мелатонином регенерации планарий обусловлен, по-видимому, разным распределением и разным уровнем экспрессии рецепторов к этому гормону в теле животных. Высокий уровень чувствительности к мелатонину регенерирующей головы обусловлен преимущественной экспрессией Зтес/-тН, и втед-те! 1с рецепторов в головной части

планарий. Практически полное отсутствие мРНК этих рецепторов в хвостовой части животных делает процесс роста хвостовой бластемы не чувствительным к мелатонину.

Уменьшение (на 20%) экспрессии Бтес<-т(2 рецептора мелатонина в теле интактных планарий после рентгеновского облучения может быть обусловлено его экспрессией не только в дифференцированных клетках, но и в необластах, число которых также составляет около 20% от общего числа клеток планарий. Тем самым обеспечивается возможность контроля мелатонином пролиферации необластов через взаимодействие с рецепторами на их поверхности.

Ген рецептора ретиноевой кислоты (КХ1Ч) экспрессируется равномерно по всему телу планарий. Следовательно, механизм дистально-проксимальной регуляции регенерации планарий ретиноевой кислотой отличен от такового для мелатонина.

При регенерации, как головной, так и хвостовой части планарий наблюдается снижение уровня экспрессии рецепторов мелатонина и ретиноевой

кислоты. По-видимому, это снижение является защитным механизмом необластов от действия эндогенных ингибиторов пролиферации и регенерации - мелатонина и ретаноевой кислоты.

Воздействие мелатонина и ретиноевой кислоты на экспрессию генов, контролирующих клеточный цикл необластов и морфогенез планарий

Полученные результаты относительно роли мелатонина и ретиноевых кислот в процессах морфогенеза, регенерации и пролиферации стволовых клеток планарий дали основание для проведения исследования действия этих веществ на экспрессию некоторых генов, отвечающих за реализацию позиционной информации, и регулирующих клеточный цикл необластов. В процессах морфогенеза особую роль играют гены Нох, активность которых обеспечивает контроль развития определенных частей и органов тела. Так, ген Нох аЗ регулирует развитие передних частей тела вторичноротых животных (Daftary, Taylor, 2006). В регуляции клеточного цикла пролиферирующих клеток ключевую роль играют цикпин-зависимые киназы (CDK). Они, экспрессируясь в определенных фазах клеточного цикла и взаимодействуя с различными типами циклинов, обеспечивают контроль пролиферации клеток. Например, CDK 2 экспрессируется на протяжении всего клеточного цикла, тогда как CDK 6 активна в точке перехода от G-i/Go к S фазе клеточного цикл. Подавление экспрессии специфических циклин-зависимых киназ приводит к остановке клеточного цикла животной клетки в определенной фазе. На основании этих представлений для исследования были выбраны найденные у планарий in silico гомологи генов Нох A3 (Smed-hox аЗ) и циклин-зависимые киназы 2 и 6 (Smed-cdk 2 и Smed-cdk 6). Под воздействием ретиноевой кислоты изучалась экспрессия RXR-рецептора (Smed-rxr).

Как показано на рисунке 11, в теле интактных планарий при действии мелатонина в концентрации 10 5М сутки инкубации уровень экспрессии Smed-cdk 6 снижался в 2,3 раза, тогда как количество мРНК Smed-hox аЗ и Smed-cdk 2 по сравнению с контролем увеличивалось. Суточная инкубация планарий в 10"®М растворе а\\-транс и 9-цис-ретиноевой кислоты приводила к подавлению транскрипции гена cdk 6. При этом аП-транс-ретиноевая кислота увеличивала экспрессию гена cdk 2 и не действовала на экспрессию hox аЗ и гхг, а 9-цис-ретиноевая кислота не влияла на транскрипцию генов cdk 2 и гхг, но подавляла экспрессию hox аЗ (рис. 11).

К 1.8 S

" 16

u ,|0 o

a 1,4 с

U 1 7

Sí 1,2 fl

К 1,0 «

J 0,8

® 0,6

O 0,4 O

¡E 0,2 °0,0

Smed-cdk2

Smed-cdk6

Smed-hox a3

Рис. 11. Экспрессии генов в теле интактных планарий S. mediterráneo

шш контроль

. Э-цно ретиноевая

кислота при воздействии мелатонина (I0'sM)

аЧ-граис ретиноеаая кислота I I «ьпэтанин ÍS0

Smed-rxr

ретиноевых кислот (10 М) (суточная инкубация). Здесь и ниже в качестве единицы принята экспресиия генов в теле контрольной группы планарий. Значении представлены в виде средних по трем независимым экспериментальным значениям ± стандартное отклонение. ' |> < 0.001, **р<0.01

Суточная инкубация планарий при концентрации ретиноевых кислот 10"7М {рис. 12, а) в меньшей степени снижала уровень транскрипции генов 8тед-сс1к 6 (в 1,4 раза в аП-транс-ретиноевой кислоте и 1,88 раз в 9-цис-ретиноевой кислоте), 5/т)ес/-/?ох аЗ (1,25 раза в 9-цис-ретиноевой кислоте) и втеб-гхг (в 1,23 раза в аИ-транс и 1,47 раза в 9-цос-ретиноевой кислоте). Экспрессия Бтес1-сс1к 2 не изменялась (рис 12, а).

Увеличение экспозиции планарий до двух суток в растворах ретиноевых кислот с концентрацией 10"7М приводило лишь к незначительному снижению экспрессии генов 8тес1-сс1к 6, 8тес1-гхг и Этед-Ьох аЗ (рис. 12, б). Это явление можно объяснить тем, что ретиноевые кислоты в силу своей высокой химической активности достаточно быстро окисляются в биологически - неактивные соединения.

£0,2 О

■■■■ контроль 1,2 9-ЦИС

а11-транс 1(о

±SD

0.8

Smed-edk 2

Smed-cdk б

Smed-йохаЗ

Smed-rxr

Smed-cdk 2

Smed-cdk 6

Smed-hoy эЗ

Smed-rxr

Рис 12. Экспрессия генов в теле интактных планарий S. mediterránea при воздействии аН трит' и 9-г<ис-ретиноевой кислоты ПО 7М). а - суточная инкубация, б - двухсуточная инкубация. 9-цис - 9-«цс-ретиноевая кислота, аН-транс - аП-т/мнс-ретиноевая кислота. *р < 0.001, **р < 0.01

Воздействие ретиноевых кислот на экспрессию генов в теле регенерирующих планарий представлено на рис. 13. Суточная инкубация регенерантов планарий в растворе, содержащем 9-цис-ретиноевую кислоту при начальной концентрации Ю^М, приводила к уменьшению экспрессии втеб^ох аЗ, тогда как уровень транскрипции остальных исследуемых генов не изменялся. АН-транс-ретиноевая кислота не влияла на экспрессию исследуемых генов в регенерирующих планариях. Инкубация регенерирующих животных в растворе мелатонина приводила к уменьшению экспрессии только 5тес/-сс#г 6.

Рис. 13. Изменение уровня экспрессии генов в области

К 1,2

% 1,0 а

1 о,в

0 к

« 0,6

a 0.4

О 0,2 X h

О „„

Шт контроль CZ3 9-цис

ретиноевзя кислота аП-трамс

ретнкоевая кислота мелатонин ±SD

головной постбластемы

регенерирующих планарий

mediterránea после инкубации в мелатонина, 9-цис трапе- ретиноевой *р < 0.001

суточной растворе или аН-кислоты.

Smed-cdk 2

Smed-cdk 6

Smed-hox аЗ

Smed-rxr

Для прямого введения ретиноевых кислот внутрь организма планарий был применен способ доставки препарата с помощью его скармливания. Планарии после приема пищи переваривают ее посредством фагоцитоза, который происходит в течение первых суток после кормления (БИе^апп, вакИагсл/а, 1974). Экспрессия генов Этеб-сбк 2, 8теб-сбк 6, Этеб-гхг, Бтеб^ох аЗ в теле планарий на 1, 2 и 3 день после кормления их аН-транс-ретинсевой кислотой представлена на рис. 14.

Через сутки после кормления у планарий достоверно понижался уровень транскрипции гена втеб-ебк 6. На вторые сутки после кормления, в момент максимальной фагоцитарной активности клеток планарий, достоверно уменьшилась экспрессия Этеб-сбк 6 (3.3 раза), ЭтесМюх аЗ (1,3 раза) и Бтеб-осг (1,5 раза). К третьему дню (завершение процесса пищеварения у планарий) эффект ингибирования транскрипции генов Бтеб-ебк 6 и 8теб-Ьох аЗ уменьшился, тогда как уровень ингибирования экспрессии ретиноидного рецептора остался прежним.

Увеличение экспрессии циклин-зависимой киназы 2 и Нох аЗ после суточной инкубации интактных планарий в растворе мелатонина, по-видимому, можно рассматривать как адаптивную реакцию пролиферирующих необластов, которые в ответ на ингибирование пролиферации ускоряют клеточный цикл индукцией синтеза факторов пролиферации. Подобное воздействие на

пролиферирующие необласты мы наблюдаем и при инкубации планарий в растворе ретиноевой кислоты.

Изменение экспрессии большинства исследуемых генов под воздействием ретиноевой кислоты только у интактных планарий, тогда как у регенерантов подобного эффекта не было, что свидетельствует о различии реализации механизмов регуляции пролиферации необластов у интактных и регенерирующих животных.

з контроль

а all-трачс ретиноавая кислота iSD

Smetf- Smed- Smed- Smed-cdk 2 cdk 6 hox a3 rxr б

Рис. 14. Изменение экспрессии генов в теле интактных планарий S. mediterránea после

кормления искусственной пищей, содержащей all-транс-ретиносвую кислоту, а - 1 день после кормления, 6-2 дня после кормления, в — 3 дня поле кормления. *р< 0.001, "р< 0.01

Smed- Smed- Smed-ctíK« hox эЗ rxr

Сравнение результатов действия мелатонина и ретиноевой кислоты на экспрессию генов в теле планарий демонстрирует их способность регулировать клеточный цикл необластов и морфогенез через экспрессию циклин-зависимой киназы 6 и гомеотического гена Нох аЗ. Ингибирование экспрессии циклин-зависимой киназы 6 мелатонином и ретиноевой кислотой приводит к остановке клеточного цикла пролиферирующих необластов в точке перехода от вч фазы к Б фазе. Подавление экспрессии другого гена - Нох аЗ, являющегося одним из звеньев механизма контролирующего морфогенез головного конца у вторичноротых животных, вероятно, обуславливает дистально-проксимальную морфогенетическую активность ретиноевых кислот и у первичноротых животных -планарий.

Модуляция морфогенетической активности мелатонина и ретиноевой кислоты с помощью крайне слабых переменных магнитных полей

Раннее было установлено, что уровень митотической активности необластов планарий можно регулировать физическими факторами, например такими, как переменные магнитные поля (ПеМП). Они способны вызывать ингибирование или стимуляцию пролиферации необластов и регенерации при

определенном соотношении амплитуды и частоты переменного магнитного поля (Леднев, 1996).

В нашей работе мы исследовали возможность модуляции ингибирующей активности мелатонина и ретиноевой кислоты с помощью переменных магнитных полей.

На рис. 15 а и б представлены результаты, отражающие отдельное и совместное действие ПеМП в сочетании с выбранными лигандами на регенерацию планарий С. Идта. Как видно из рис. 15 а, экспонирование регенерирующих планарий в магнитном поле с параметрами амплитуды (ВАС) = 1.6 мкТл и частоты = 76 Гц увеличивает индекс регенерации на 21+6 %. Добавление лигандов - ингибиторов, экзогенного мелатонина (1(Г6М) или ретиноевой кислоты (10"'М) в среду сразу после ампутации уменьшает величину К до 14+5 % и 26+6 %, соответственно. При одновременном воздействии магнитного поля и мелатонина величина К у подопытной группы не отличалась от контрольной. Сходное явление наблюдалось и при совместном действии на регенерацию данного магнитного поля и ретиноевой кислоты (рис. 15, а).

О 0)

с с _

Рис. 15. Совместное действие мелатонина, ретиноевой кислоты и КС ПеМП на регенерацию планарий (> й%та. а) КС ПеМП с параметрами амплитуды (ВАс) = 1.6 мкТл и частоты (Где) = 76 Гц, б) КС ПеМП с параметрами амплитуды (Вас) = 140 мкТл и частоты IГчг ) = 50 Гц. Все отличия достоверны (р < 0.001; тест)

Напротив, при экспонировании планарий в ПеМП с параметрами амплитуды (Вдс) = 140 мкТл и частоты ^Ас) = 50 Гц регенерация замедлялась на 17+6 % (рис. 15, б). Добавление в среду мелатонина (Ю^М) или ретиноевой кислоты (10"8М) усиливало эффект ингибирования регенерации планарий ПеМП (рис. 15, б). Таким образом, в обоих случаях аддитивный ингибирующий эффект мелатонина и ретиноевой кислоты на процесс регенерации может быть модифицирован (увеличен или ослаблен) действием магнитных полей.

Настоящие эффекты совместного действия физических и химических факторов - регуляторов морфогенеза, подобны результатам, полученным при действии слабых магнитных полей и серотонина - стимулятора регенерации и пролиферации необластов (¡Чодйеэй/епзкауа е! а!., 2001). В совокупности,

представленные данные свидетельствуют о том, что морфогенез планарий можно контролировать факторами как химической, так и физической природы, возможно, за счет воздействия на одни и те же уровни регуляции процессов пролиферации и дифференцировки необластов.

Заключение

Накопленный и описанный в литературе материал свидетельствует о том, что ряд ключевых процессов пролиферации клеток и регенерации тканей могут быть исследованы на специфическом объекте - пресноводных плоских червях планариях (беспозвоночных, первичноротых животных), обладающих высоким лролиферативным и регенеративным потенциалом (Шейман, Тирас, 1989).

В работе исследована роль мелатонина и ретиноевой кислоты как морфогенов, активно влияющих на регенерацию и пролиферацию клеток у высших животных, при контроле регенерации и морфогенеза у планарий. Обнаружено, что эти вещества избирательно подавляют регенерацию головной части планарий и не влияют на регенерацию хвоста животного.

Оказалось, что дифференцированная дистапьно-проксимальная морфогенетическая активность мелатонина у планарий обусловлена неоднородным распределением экспрессии мелатониновых рецепторов в теле животного. Так максимальная концентрация мРНК рецепторов мелатонина наблюдалась в головной части планарий, а минимальная в туловищной и хвостовой части планарий. Это явление дистально-проксимальной неравномерности впервые продемонстрировано у планарий и, возможно, играет существенную роль в других систематических группах позвоночных и беспозвоночных животных.

Представленный материал свидетельствует о том, что клеточные механизмы морфогенетической активности мелатонина и ретиноевой кислоты на уровне планарий в значительной мере аналогичны таковым у высших животных: обеспечиваются подавлением пролиферации стволовых клеток (необластов) е точке перехода от Gi к S фазе клеточного цикла.

Фармакологический анализ активности рецепторов мелатонина и ретиноевой кислоты с помощью специфичных агонистов и антагонистов, а также облучение животных рентгеновскими лучами позволило установить, что в процессах регенерации и пролиферации необластов у планарий ключевую роль играют мембранные рецепторы мелатонина МТг и МТ3. Сигнальный путь ретиноевой кислоты у плоских червей опосредуется только ядерным RXR рецептором, в отличие от вторичноротых животных, у которых есть два ядерных рецептора для ретиноевой кислоты RXR и RAR.

Методом ПЦР в реальном времени нами показано, что на молекулярном уровне действие мелатонина и ретиноевой кислоты у планарий реализуется через

взаимодействие со специфическими рецепторами, которые имеются в теле лланарий и гомологичны соответствующим рецепторам у высших животных.

В ходе исследования методом ПЦР в реальном времени экспрессии рецепторов мелатонина и ретиноевой кислоты у регенерирующих животных обнаружено, что во время регенерации, как головной, так и хвостовой части планарий происходит значительное снижение уровня экспрессии исследуемых рецепторов для «тормозных медиаторов». По-видимому, это снижение является защитным механизмом необластов от действия эндогенных ингибиторов пролиферации и регенерации - мелатонина и ретиноевой кислоты.

Методом ПЦР в реальном времени нами продемонстрировано, что антипролиферативная активность мелатонина обуславливается подавлением экспрессии гена СОК 6 (циклин-зависимая киназа 6), обеспечивающего переход пролиферирующих клеток от С) к Э фазе клеточного цикла.

Анализ данных по экспрессии генов у планарий даёт основание полагать, что морфогенетическая активность ретиноевой кислоты у интактных и регенерирующих планарий (подобно высшим животным) опосредуется изменением транскрипции гомеотического гена Нох аЗ, экспрессирующегося в передней части планарий и контролирующего развитие головного конца тела животного. Антипролиферативная активность ретиноевой кислоты у интактных планарий обуславливается подавлением экспрессии гена СОК 6, обеспечивающего переход пролиферирующих клеток от к Э фазе клеточного цикла. Под воздействием ретиноевой кислоты у интактных планарий выявлено снижение экспрессии ретиноидного рецептора РООЧ. При этом нами не обнаружено изменение экспрессии гена СОК 6 и 14X14 у регенерирующих животных, что указывает на различие механизмов ингибирования пролиферации необластов ретиноевой кислотой у интактных и регенерирующих планарий.

В работе установлено, что наряду со специфическими химическими морфогенами процесс регенерации и пролиферации необластов планарий может контролироваться направленным образом при действии такого физического фактора, как комбинированное магнитное поле. Нам удалось показать, в частности, что с помощью изменения слабой переменной компоненты магнитного поля, способного стимулировать или подавлять пролиферацию необластов в постбластме (Леднев и др., 1996), можно модулировать ингибирующую активность мелатонина и ретиноевой кислоты при регенерации целого животного. Вероятно, подобные магнитные поля способны изменять параметры лиганд-рецепторного взаимодействия и таким образом модулировать внутриклеточный сигнальный каскад.

уровень организации и накладывает свои особенности на реализацию сигнальных путей. Представлены доказательства высокой степени адекватности и возможности экстраполяции, получаемых на уровне планарий биологических эффектов по регуляции процессов морфогенеза, регенерации и пролиферации стволовых клеток у высших животных.

Выводы

1. Показано, что мелатонин и ретиноевые кислоты (аП-/пранс-ретиноевая кислота и Э-цис-ретиноевая кислота) ингибируют регенерацию головной части планарий и не оказывают воздействия на регенерацию хвостовой части.

2. Впервые разработана оригинальная методика получения отдельных клеток планарий, что позволило с помощью проточной цитофлуориметрии установить место действия мелатонина и ретиноевой кислоты: подавление клеточного цикла необластов планарий в точке перехода от Gi к S фазе.

3. С помощью специфических агонистов и антагонистов установлено, что в регуляции пролиферации стволовых клеток планарий мелатонином участвуют мембранные рецепторы МТ2 и МТз, а с ретиноевой кислотой взаимодействует только ядерный RXR рецептор, но не RAR и RXR, характерные для высших животных.

4. С помощью метода ПЦР в реальном времени выявлено дистально-проксимальное распределение экспрессии рецепторов мелатонина в теле планарий (с максимумом в головной и минимумом в туловищной и хвостовой части), что обуславливает пространственную неоднородность морфогенетической активности мелатонина. Обнаружено снижение экспрессии рецепторов мелатонина и ретиноевой кислоты во время регенерации планарий.

5. Показано, что антипролиферативная активность мелатонина и ретиноевой кислоты, аналогично высшим животным, обусловлена ингибированием экспрессии гена циклин-зависимой киназы 6, регулирующего клеточный цикл. Морфогенетическая активность ретиноевой кислоты у планарий опосредуется изменением экспрессии гомеотического гена Нох аЗ, отвечающего за реализацию позиционной информации.

7. Показано, что морфогенетическая активность мелатонина и ретиноевой кислоты может быть модулирована направленным образом с помощью слабых переменных магнитных полей.

Список публикаций по теме диссертации

1. Lednev V.V., Ermakov A.M., Ermakova O.N., Rozhdestvenskaya Z.E., Srebnitskaya L.K., Tiras Kh.P. Modulation of the effect of pharmacological agents by weak and extremely weak alternating magnetic fields on a model of regeneration of the planarian Girardia tigrina. Biophysics. 2005, Vol. 50 (Suppl. 1), p. S130-S133.

2. Lednev V. V., Tiras Kh. P., Belova N. A., Ermakova O. N.. Ermakov A. M. Biological effect of extremely weak industrial-frequency magnetic fields. Biophysics. 2005, Vol. 50 (Suppl. 1), p. S157-S162.

3. Belova N.A., Ermakova O.N., Ermakov A.M., Rozhdestvenskaya Z. Ye., Lednev V.V. The bioeffects of extremely weak alterating magnetic fields. The Enviromentalist. 2007, Vol. 27, №4, p. 411-416.

4. Ермакова O.H., Ермаков A.M., Тирас Х.П. Влияние мелатонина на регенерацию планарий Girardia tigrina. Онтогенез. 2009, №6, с.

5. Ермакова О.Н., Ермаков A.M., Тирас Х.П. Ретиноевая кислота - как регулятор морфогенеза планарий. Онтогенез. 2009, №6, с. 449-455.

6. Belova N.A., Ermakova O.N., Ermakov A.M., Lednev V.V. The dependence of biological effects on the amplitude of extremely weak power-frequency magnetic field. Biological effects of EMFs 4 th international workshop. Crete, Greece. 2006, p. 685-691.

7. Ермаков A.M., Ермакова O.H., Тирас Х.П. Влияние мелатонина и ретиноевой кислоты на регенерацию планарий Girardia tigrina. Морфология. 2006, № 2, с.37.

8. Ермаков A.M., Ермакова О.Н., Тирас Х.П. Мелатонин и ретиноевая кислота как морфогены планарий Girardia tigrina. Сборник тезисов IX международной конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века». Пущино. 2006, с. 137.

9. Ермаков. A.M., Ермакова О.Н. Леднев В.В. Модификация влияния фармакологических агентов на регенерацию планарий с помощью слабых переменных магнитных полей. Сборник тезисов IV Международного Конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине». СПб. 2006, с.110.

10. Ермаков A.M., Ермакова О.Н., Леднев В.В. Модуляция пролиферативной активности стволовых клеток регенерирующих планарий с помощью магнитных полей и фармакологических агентов. Материалы ежегодной всероссийской и международной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении», Москва. 2007, с.35-37.

11. Ermakov A.M., Ermakova O.N., Tiras Kh.P. Melatonin and retinoic acid as the regulators of the proliferative activity of the planarian stem cells. Conference on modem biology «Bio-News». Kazan. 2008, p. 23.

12. Ермаков A.M., Ермакова O.H., Кудрявцев A.A. Изучение пролиферации стволовых клеток планарий с помощью проточной цитофлуориметрии. Сборник

тезисов XII международной конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века». Пущино. 2008, с. 127-128.

13. Ермакова О.Н., Ермаков А.М., Евдокимовский Э.В. Изучение экспрессии мелатониновых и ретиноидногб рецепторов у планарий. Сборник тезисов XII международной конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века». Пущино. 2008, с. 128.

14. Ермакова О.Н., Ермаков А.М., Евдокимовский Э.В. Влияние мелатонина и ретиноевой кислоты на экспрессию генов в теле планарий. Тезисы докладов XVI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2009». Москва. 2009, с. 253-254.

15. Ермаков А.М., Ермакова О.Н. Мелатонин и ретиноевая кислота как индукторы апоптоза стволовых клеток планарий. Тезисы докладов XVI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2009». Москва. 2009, с. 252-253.

Подписано в печать:

29.10.2009

Заказ № 2870 Тираж - 90 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ермакова, Ольга Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

Список сокращений.

1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Планарии как модель для изучения фундаментальных проблем биологии.

1.1.1. Регенерация и морфогенез планарий.

1.1.2. Стволовые клетки планарий — необласты.

1.1.3. Плоские черви - альтернативный объект для медико-биологических исследований.

1.1.4. Новая роль планарий как модели для молекулярно-биологических исследований.

1.2. Мелатонин и его роль в организме животных и человека.

Физиологическая активность мелатонина.

1.2.1 Открытие мелатонина как гормона секретируемого эпифизом и сетчаткой, мелатонин в различных систематических группах (растения, грибы, животные).

1.2.2. Экстрапинеальный мелатонин.

1.2.3. Биосинтез мелатонина.

1.2.4 Циркадный ритм синтеза мелатонина и его модуляция фотопериодом. Регуляция мелатонином циркадных и сезонных ритмов.

1.2.5. Мелатонин как иммуномодулирующий и онкостатический агент, антиоксидант - скавенжер свободных радикалов.

1.2.6. Мелатонин в планариях.

1.3 Биохимические и молекулярно-биологические аспекты действия мелатонина на организменном и клеточном уровнях.

1.3.1 Мембранные рецепторы мелатонина. MTi и МТ2 рецепторы, их фармакологические характеристики, механизмы внутриклеточной трансдукции сигналов от данных рецепторов и эффекты, вызываемые активацией этих рецепторов. МТз рецептор мелатонина как мембранная убихинон оксидоредуктаза 2.

1.3.2. Внутриклеточное действие мелатонина. Ядерные рецепторы мелатонина и механизмы их активности.

1.3.3. Механизмы антиокислительного действия мелатонина.

1.3.4. Мелатонин как хелатор металлов.

1.4. Ретиноиды как морфогены. Роль ретиноидов в процессах морфогенеза и регенерации.

1.4.1. Открытие эффекта воздействия ретиноидов и ретиноевых кислот на эмбрио и морфогенез животных.

1.4.2. Биосинтез ретиноевых кислот.

1.4.3. Влияние ретиноевых кислот на эмбрио и морфогенез животных (позвоночных и беспозвоночных).

1.4.4. Ретиноиды - как регуляторы процесса пролиферации и дифференцировки клеток.

1.5 Механизмы воздействия ретиноидов на процессы развития и роста.

1.5.1. Мембранные и цитоплазматические ретиноид связывающие белки.

1.5.2. Ядерные рецепторы ретиноевых кислот, их характеристика и механизмы функционирования.

1.6. Ретиноевая кислота и регенерация планарий.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Животные.

2.2. Метод прижизненной компьютерной морфометрии.

2.3. Определение пролиферативной активности необластов.

2.4. Метод проточной цитофлуориметрии.

2.5. Метод ПЦР в реальном времени.

2.6. Облучение планарий рентгеновскими лучами.

2.7. Техника получения магнитных полей.

2.8. Используемые в работе фармакологические препараты.

2.9. Статистическая обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Ингибирующее влияние мелатонина и ретиноевой кислоты на рост постбластемы и пролиферацию стволовых клеток планарий.

3.1.1. Воздействие мелатонина и ретиноевой кислоты на регенерацию головного и хвостового отдела планарий.

3.1.2. Антипролиферативная активность мелатонина и ретиноевой кислоты.

3.1.3. Фармакологический анализ рецепторов мелатонина и ретиноевой кислоты, участвующих в регуляции регенерации и пролиферации необластов.

3.2. Экспрессия рецепторов мелатонина и ретиноевой кислоты в теле интактных и регенерирующих планарий Schmidtea meditteranea.

3.2.1. Экспрессия рецепторов мелатонина и ретиноевой кислоты у интактных планарий.

3.2.2. Экспрессия рецепторов мелатонина и ретиноевой кислоты у регенерирующих планарий, и планарий после рентгеновского облучения.

3.3. Воздействие мелатонина и ретиноевой кислоты на экспрессию генов, контролирующих клеточный цикл необластов и морфогенез планарий.

3.4. Модуляция морфогенетической активности мелатонина и ретиноевой кислоты с помощью крайне слабых переменных магнитных полей.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Мелатонин и ретиноевая кислота как морфогены планарий"

Актуальность проблемы. Процессы роста и развития, морфогенеза и регенерации у животных являются неотъемлемыми системами онтогенетического развития и поддержания жизнеспособности организма. Они осуществляются путем многоуровневого контроля с множеством триггеров, прямых и обратных связей, в основе которых лежат генетические механизмы, реализующиеся на клеточном, тканевом и организменном уровнях.

Актуальной проблемой в изучении морфогенеза, пролиферации и дифференцировки клеток является поиск и создание адекватной биологической модели на низших животных. Классическим организмом для изучения процессов развития и роста являются пресноводные плоские черви - планарии (Morgan, 1901). Эти животные обладают уникальной высокой способностью к регенерации с помощью стволовых клеток -необластов (Baguna, 1981). Именно поэтому многие молекулярно-биологические, иммуногистохимические, биохимические, физиологические и другие методы адаптированы применительно к планариям для исследования процессов регенерации, развития и роста (Sanchez Alvarado et al., 2002). Для планарий (Schmidtea mediterranean Dugesia japonica) производится секвенирование генома, и его результаты показывают, что белки, играющие ключевую роль в регуляции процессов пролиферации и дифференцировки клеток, морфогенеза, имеют высокую степень гомологии с аналогичными белками у высших животных (Oviedo, Levin, 2008). Полагают, что планарии по многим параметрам могут соответствовать современным требованиям экспериментальной биологии к модельному организму (Sanchez Alvarado, 2006). Однако вопрос адекватности и возможности экстраполяции получаемых на уровне планарий биологических эффектов на сходные процессы у высших животных требует более глубоких экспериментальных доказательств.

Для получения этих доказательств мы решили проследить воздействие физиологически активных веществ — мелатонина и ретиноевой кислоты на морфогенез и регенерацию планарий, пролиферацию и дифференцировку их стволовых клеток - необластов. Эти вещества, будучи различными по своей природе и механизмам воздействия, вызывают у высших животных схожие вполне определенные морфогенетические эффекты. Так мелатонин способен подавлять пролиферацию раковых клеток, стимулировать их дифференцировку и вызывать апоптоз (Анисимов и др., 1973; Pandi-Perumal et al., 2006). Ретиноевая кислота контролирует процессы эмбрио- и морфогенеза, и также способна подавлять пролиферацию и стимулировать дифференцировку и апоптоз раковых клеток (Breitman et al., 1980; Chen et al., 2006). У беспозвоночных животных роль мелатонина и ретиноевой кислоты в процессах морфогенеза до настоящего времени не выяснена.

Настоящая работа представляет исследование морфогенетической роли мелатонина и ретиноевой кислоты в процессах регенерации и морфогенеза планарий. Экспериментальный анализ воздействия этих веществ на регуляцию процессов развития и роста у планарий позволит расширить представления о степени адекватности и применимости данной биологической модели для исследования морфогенетически активных веществ.

Цель работы: Изучение действия мелатонина и ретиноевой кислоты на молекулярные и клеточные механизмы регенерации планарий. Задачи исследования:

2. Изучение механизмов действия мелатонина и ретиноевой кислоты на пролиферацию необластов у интактных и регенерирующих планарий. исследуемыми морфогенами.

4. Выявление экспрессии мелатониновых и ретиноидного рецепторов в различных физиологических состояниях планарий.

5. Изучение действия мелатонина и ретиноевой кислоты на экспрессию генов у планарий.

3. Выявление рецепторов с

6. Выяснение возможности модуляции воздействия мелатонина pi ретиноевой кислоты на регенерацию планарий с помощью физических факторов — переменных магнитных полей. Научная новизна работы. Показано, что мелатонин и ретиноевая кислота способны ингибировать регенерацию головного, но не хвостового конца тела планарий. Обнаружено, что данный эффект реализуется путем подавления этими веществами пролиферации стволовых клеток планарий. Продемонстрирована возможность модуляции данных эффектов с помощью переменных магнитных полей путем изменения переменной компоненты комбинированного магнитного поля. Впервые с помощью проточной цитофлуориметрии выявлены фазы клеточного цикла пролиферирующих стволовых клеток планарий - необластов, на которые оказывают воздействие исследуемые вещества. С помощью фармакологического анализа обнаружено, что эффекты мелатонина у планарий опосредуются мембранными рецепторами, а ретиноевой кислоты - ядерными рецепторами. Впервые с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени количественно определена экспрессия мембранных рецепторов мелатонина в теле планарий и выявлено дистально-проксимальная неоднородность их распределения, которая обуславливает ассиметрию в реализации морфогенетических эффектов мелатонина на пролиферацию необластов и регенерацию плоских червей. Продемонстрированы молекулярно-генетические механизмы регуляции мелатонином и ретиноевой кислотой процессов пролиферации стволовых клеток и регенерации у беспозвоночных животных; показаны их подобия и различия по сравнению с позвоночными животными.

Научно-практическое значение. Полученные результаты свидетельствуют об адекватности применения планарий в качестве биологической модели для исследования проблем регуляции процессов регенерации, происходящих с участием стволовых клеток на организменном, тканевом, клеточном и молекулярном уровнях. Результаты работы могут быть использованы при создании молекулярно-генетических тестов для исследования различных биологически активных веществ. Данное исследование демонстрирует возможность экстраполяции биологических процессов, происходящих у планарий на эволюционно более развитые группы животных, включая человека. Сведения, полученные в настоящем исследовании, и простота планарий как экспериментального биологического объекта позволяют использовать этих животных в биомедицинском образовании, в курсах по изучению регенерации, клеточной пролиферации и дифференцировки.

Апробация диссертации. Результаты диссертационной работы доложены на 10-й международной школе — конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006); IV Международном Конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (СПб, 2006); Ежегодной Всероссийской и международной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва, 2007); 12-й школе - конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2008); Conference on modern biology «Bio-News» (Kazan, 2008); XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2009» (Москва, 2009).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПЦР - полимеразная цепная реакция кДНК - комплементарная ДЕК NAT - арилалкиламин-Ы-ацетилтрансфераза HIOMT - гидроксииндол-О-метилтрансфераза

МТЬ МТг, МТз и Mel 1с - рецепторы мелатонина соответственно 1-го, 2-го, 3-го и 1с типов

RORa и RORP - ядерные орфановые рецепторы мелатонина аир RAR - ядерный рецептор ретиноевой кислоты RXR - ядерный X рецептор ретиноевой кислоты ПеМП - переменное магнитное поле

1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Ермакова, Ольга Николаевна

выводы

1. Показано, что мелатонин и ретиноевые кислоты (а\\-транс-ретиноевая кислота и 9-г/мс-ретиноевая кислота) ингибируют регенерацию головной части планарий и не оказывают воздействия на регенерацию хвостовой части.

3. С помощью специфических агонистов и антагонистов установлено, что в регуляции пролиферации стволовых клеток планарий мелатонином участвуют мембранные рецепторы МТг и МТз, а с ретиноевой кислотой взаимодействует только ядерный RXR рецептор, но не RAR и RXR, характерные для высших животных.

4. С помощью метода ПЦР в реальном времени выявлено дистально-проксимальное распределение экспрессии рецепторов мелатонина в теле планарий (с максимумом в головной и минимумом в туловищной , и хвостовой части), что обуславливает пространственную неоднородность морфогенетической активности мелатонина. Обнаружено снижение экспрессии рецепторов мелатонина и ретиноевой кислоты во время регенерации планарий.

6. Явление ингибирования экспрессии ретиноевой кислотой гена циклин-зависимой киназы 6 и гена ретиноидного рецептора RXR наблюдается только у интактных животных, что свидетельствует о наличие различных механизмов ингибирования пролиферации необластов у интактных и регенерирующих планарий 7. Показано, что морфогенетическая активность мелатонина и ретиноевой кислоты может быть модулирована направленным образом с помощью слабых переменных магнитных полей.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ермаков A.M., Ермакова О.Н. (2009) Мелатонин и ретиноевая кислота как индукторы апоптоза стволовых клеток планарий. Тезисы докладов XVI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2009». Москва: 252-253.

2. Ермаков A.M., Ермакова О.Н., Кудрявцев А.А. (2008) Изучение пролиферации стволовых клеток планарий с помощью проточной цитофлуориметрии. Сборник тезисов XII международной конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века». Пущино: 127-128.

3. Ермаков A.M., Ермакова О.Н., Леднев В.В. (2007) Модуляция пролиферативной активности стволовых клеток регенерирующих планарий с помощью магнитных полей и фармакологических агентов. Материалы ежегодной всероссийской и международной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении». Москва: 35-37.

4. Ермаков A.M., Ермакова О.Н., Тирас Х.П. (2006) Влияние мелатонина и ретиноевой кислоты на регенерацию планарий Girardia tigrina. Морфология № 2: 37.

5. Ермаков A.M., Ермакова О.Н., Тирас Х.П. (2006) Мелатонин и ретиноевая кислота как морфогены планарий Girardia tigrina. Сборник тезисов IX международной конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века». Пущино: 137.

6. Ермаков. A.M., Ермакова О.Н. Леднев В.В. (2006) Модификация влияния фармакологических агентов на регенерацию планарий с помощью слабых переменных магнитных полей. Сборник тезисов IV Международного Конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине». СПб: 110.

7. Ермакова О.Н., Ермаков A.M., Евдокимовский Э.В. (2008) Изучение экспрессии мелатониновых и ретиноидного рецепторов у планарий. Сборник тезисов XII международной конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века». Пущино: 128.

8. Ермакова О.Н., Ермаков A.M., Евдокимовский Э.В. (2009) Влияние мелатонина и ретиноевой кислоты на экспрессию генов в теле планарий. Тезисы докладов XVI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2009». Москва: 253-254.

9. Ермакова О.Н., Ермаков A.M., Тирас Х.П. (2009) Влияние мелатонина на регенерацию планарий Girardia tigrina. Онтогенез 40(6): 466-469.

10. Ермакова О.Н., Ермаков A.M., Тирас Х.П. (2009) Ретиноевая кислота - как регулятор морфогенеза планарий. Онтогенез 40(6): 449-455.

11. Belova N.A., Ermakova O.N., Ermakov A.M., Lednev V.V. (2006) The dependence of biological effects on the amplitude of extremely weak power-frequency magnetic field. Biological effects of EMFs 4 th international workshop. Crete, Greece: 685-691.

12. Belova N.A., Ermakova O.N., Ermakov A.M., Rozhdestvenskaya Z. Ye., Lednev V.V. (2007) The bioeffects of extremely weak alterating magnetic fields. The Enviromentalist 274(4): 411-416.

13. Ermakov A.M., Ermakova O.N., Tiras Kh.P. (2008) Melatonin and retinoic acid as the regulators of the proliferative activity of the planarian stem cells. Conference on modern biology «Bio-News». Kazan: 23.

14. Lednev V. V., Ermakov A. M., Ermakova O. N., Rozhdestvenskaya Z. E., Srebnitskaya L. K., Tiras K. P. (2005) Modulation of the effect of pharmacological agents by weak and extremely weak alternating magnetic fields on a model of regeneration of the planarian Girardia tigrina. Biophysics 50(1): 130-133.

Lednev V. V., Tiras Kh. P., Belova N. A., Ermakova O. N., Ermakov A. M. (2005) Biological effect of extremely weak industrial-frequency magnetic fields. Biophysics 50(1): S157-S162.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Накопленный и описанный в литературе материал свидетельствует о том, что ряд ключевых процессов пролиферации клеток и регенерации тканей могут быть исследованы на специфическом объекте — пресноводных плоских червях планариях (беспозвоночных, первичноротых животных), обладающих высоким пролиферативным и регенеративным потенциалом (Шейман, 1984).

Оказалось, что дифференцированная дистально-проксимальная морфогенетическая активность мелатонина у планарий обусловлена неоднородным распределением экспрессии мелатониновых рецепторов в теле животного. Так максимальная концентрация мРНК рецепторов мелатонина наблюдалась в головной части планарий, а минимальная в туловищной и хвостовой части планарий. Это явление дистально-проксимальной неравномерности впервые продемонстрировано у планарий и, возможно, играет существенную роль в других систематических группах позвоночных и беспозвоночных животных.

Представленный материал свидетельствует о том, что клеточные механизмы морфогенетической активности мелатонина и ретиноевой кислоты на уровне планарий в значительной мере аналогичны таковым у высших животных: обеспечиваются подавлением пролиферации стволовых клеток (необластов) в точке перехода от G] к S фазе клеточного цикла.

Сигнальный путь ретиноевой кислоты у плоских червей опосредуется только ядерным RXR рецептором, в отличие от вторичноротых животных, у которых есть два ядерных рецептора для ретиноевой кислоты RXR и RAR.

Методом ПЦР в реальном времени нами показано, что на молекулярном уровне действие мелатонина и ретиноевой кислоты у планарий реализуется через взаимодействие со специфическими рецепторами, которые имеются в теле планарий и гомологичны соответствующим рецепторам у высших животных.

В ходе исследования методом ПЦР в реальном времени экспрессии рецепторов мелатонина и ретиноевой кислоты у регенерирующих животных обнаружено, что во время регенерации, как головной, так и хвостовой части планарий происходит значительное снижение уровня экспрессии исследуемых рецепторов для «тормозных медиаторов». По-видимому, это снижение является защитным механизмом необластов от действия эндогенных ингибиторов пролиферации и регенерации -мелатонина и ретиноевой кислоты.

Методом ПЦР в реальном времени нами продемонстрировано, что антипролиферативная активность мелатонина обуславливается подавлением экспрессии гена CDK 6 (циклин-зависимая киназа 6), обеспечивающего переход пролиферирующих клеток от Gi к S фазе клеточного цикла.

Анализ данных по экспрессии генов у планарий даёт основание полагать, что морфогенетическая активность ретиноевой кислоты у интактных и регенерирующих планарий (подобно высшим животным) опосредуется изменением транскрипции гомеотического гена Нох аЗ, экспрессирующегося в передней части планарий и контролирующего развитие головного конца тела животного. Антипролиферативная активность ретиноевой кислоты у интактных планарий обуславливается подавлением экспрессии гена CDK 6, обеспечивающего переход пролиферирующих клеток от Gi к S фазе клеточного цикла. Под воздействием ретиноевой кислоты у интактных планарий выявлено снижение экспрессии ретиноидного рецептора RXR. При этом нами не обнаружено изменение экспрессии гена CDK 6 и RXR у регенерирующих животных, что указывает на различие механизмов ингибирования пролиферации необластов ретиноевой кислотой у интактных и регенерирующих планарий.

В работе установлено, что наряду со специфическими химическими морфогенами процесс регенерации и пролиферации необластов планарий может контролироваться направленным образом при действии такого физического фактора, как комбинированное магнитное поле. Нам удалось показать, в частности, что с помощью изменения слабой переменной компоненты магнитного поля, способного стимулировать или подавлять пролиферацию необластов в постбластме (Леднев и др., 1996а, Леднев и др., 19966), можно модулировать ингибирующую активность мелатонина и ретиноевой кислоты при регенерации целого животного. Вероятно, подобные магнитные поля способны изменять параметры лиганд-рецепторного взаимодействия и таким образом модулировать внутриклеточный сигнальный каскад.

Таким образом, механизмы регуляции мелатонином и ретиноевой кислотой процессов морфогенеза и пролиферации стволовых клеток планарий оказались весьма схожими с аналогичными процессами у высших животных, хотя уровень организации и накладывает свои особенности на реализацию сигнальных путей. Представлены доказательства высокой степени адекватности и возможности экстраполяции, получаемых на уровне планарий биологических эффектов по регуляции процессов морфогенеза, регенерации и пролиферации стволовых клеток у высших животных.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ермакова, Ольга Николаевна, Пущино

1. Анисимов В.Н., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Дильман В.М. (1973) Сопоставление противоопухолевой активности экстрактов эпифиза, гипоталамуса, мелатонина и сигетина у мышей с перевиваемым раком молочной железы. Вопр. онкол. 10: 99-101.

2. Богоровская Г.И. (1969) Регенерация нервной системы планарий. Цитология 11(8): 964-972.

3. Иванов А.В., Мамкаев Ю.В. Ресничные черви. Их происхождение и эволюция. Л., Наука, 1973, 221 с.

4. Кричинская Е.Б. (1980) Клеточные источники регенерации у планарий. Арх анат гистол и эмбриол 63(9): 102-109.

5. Лиознер Л.Д., Замараев В.Н. (1965) Процессы перестройки при регенерации у планарий Dugesia lugubris. Журн общ биологии 26(4): 436-442.

6. Мелатонин в норме и паталогии (под ред. Ф.И. Комарова, С.И. Раппопорта, Н.К. Малиновской, В.Н. Анисимова) — М: ИД Медпрактика-М, 2004, с. 36.

7. Сахарова Н.Ю. (1972) К вопросу об источниках регенерации планарий. Онтогенез 3(1): 95-99.

8. Тирас Х.П. (1986) Морфогенез и способы регенерации планарий. Журнал общей биологии 47 (1): 103-109.I

9. Тирас Х.П., Лукьянов С.А., Лакирев А.В., Белоусов Л.В. (1986) Влияние головного активатора пресноводной гидры на регенерацию морских гидроидных полипов. Онтогенез 17(1): 84-87.

10. Тирас Х.П., Сахарова Н.Ю. (1984) Прижизненная морфометрия планарий. Онтогенез 15(1): 42-48.

11. Тирас Х.П., Сребницкая Л.К., Ильясова Е.Н., Леднев В.В. (1996) Влияние слабого комбинированного магнитного поля на скорость регенерации планарий Dugesia tigrina. Биофизика 40(4): 826-831.

12. Тирас Х.П., Ханко В.И. (1990) Критерии и стадии регенерации в планариях. Онтогенез 21(6): 620-624.

13. Тирас Х.П., Шейман И.М. (1984) Химические факторы регуляторы морфогенеза планарий. Онтогенез 15(4): 374-380.

14. Черкашин А.Н., Шейман И.М., Богоровская Г.И. (1966а) Условные рефлексы у планарий и опыты с регенерацией. Ж высш нервн деят 16(12): 1110-1112.

15. Черкашин А.Н., Шейман И.М., Сергеева Э.П. (19666) Действие сочетаний света и электрического тока на планарий. Ж высш нервн деят 16(2): 266-273.

16. Шейман И.М. Регуляторы морфогенеза и их адаптивная роль. М. Наука, 1984, 157 с.

17. Шейман И.М., Балобанова Э.Ф. (1986) Пептидные нейрогормоны беспозвоночных. Успехи современной биологии 101(2): 203-213.

18. Шейман И.М., Тирас Х.П. (1983) Влияние на память у планарий эндогенных факторов регенерации. Журнал общей биологии 44(1): 94-99.

19. Шейман И.М., Тирас Х.П., Балобанова Э.Ф. (1989) Морфогенетическая функция нейропептидов. Физиол ж СССР 75: 619-626.

20. Abe М., Reiter R.J., Orchil Р.В., et al. (1994) Inhibitory effect of melatonin on cataract formation in newborn rats: evidence for an antioxidative role of melatonin. J. Pineal Res., 17: 94-100.

21. Agata K. (2003) Regeneration and gene regulation in planarians. Curr.• Opin. Genet. Dev. 13: 492-496.

22. Allenby G, Bocquel M.T., Saunders M., Kazmer S., Speck J.,

23. Rosenberger M., Lovey A., Kastner P., Grippo J.F., Chambon P., et al. (1993) Retinoic acid receptors and retinoid X receptors: interactions with endogenous retinoic acids. Proc Natl Acad Sci USA 90: 30-34.

24. Anisimov V.N. (2003) Effects of exogenous melatonin review. Toxicol Pathol 31: 589-603.

25. Arendt J. (1994) Human response to light and melatonin. In: Advances in Pineal Research. London 8: 439 441.

26. Arrendt J. Melatonin and the mammalian pineal gland. London. Chapman & Hall. 1995,331 p.

27. Axelrod J. (1974) The pineal gland: a neurochemical transducer. Science 184: 1341-1348.

28. Axelrod J., Weissbach H. (1960) Enzymatic O-methylation of N-acetylserotonin to melatonin. Science 131: 1312-3.

29. Baguna J. (1981) Planarian neoblasts. Nature 290 (5): 14-15.

30. Baguna J., Romero R. (1981) Quantitative analysis of cell types during growth, degrowth and regeneration in the planarians Dugesia mediterranea and Dugesia tigrina. Hydrobiologia 84: 181-194.

31. Baguna J., Salo E., Auladell C. (1989) Regeneration and pattern formation in planarians. III. Evidence that neoblasts are totipotent stem cells and the source of blastema cells. Development 107: 77-86.

32. Baguna J., Salo E., Romero R., Garcia-Fernandez J., Bueno D., Munoz-Marmol A. M., Bayascas-Ramirez J. R. Casali A. (1994) Regeneration and pattern formation in planarians: cells, molecules and genes. Zool. Sci. 11:781-795.

33. Battle Т. E., Yen A. (2002) Ectopic expression of CXCR5/BLR1 accelerates retinoic acid- and vitamin D3-induced monocytic differentiation of U937 cells. Exp. Biol. Med. 227: 753-762.

34. Becker-Andre M., Andre E., DeLamarter J.F. (1993) Identification of nuclear receptor mRNAs by RT-PCR amplification of conserved zinc-finger motif sequences. Biochem Biophys Res Commun 194: 1371—1379.

35. Becker-Andre M., Wiesenberg I., Schaeren-Wiemers N., Andre E., Missbach M., Saurat J.H., Carlberg C. (1994) Pineal gland hormonemelatonin binds and activates an orphan of the nuclear receptor superfamily. J Biol Chem 269: 28531-28534.

36. Benitez-King G. (2006) Melatonin as a cytoskeletal modulator: implications for cell physiology and disease. J Pineal Res 40: 1-9.

37. Benoit G., Cooney A., Giguere V., Ingraham H., Lazar M., Muscat G., Perlmann Th., Renaud J., Schwabe J., Sladek F., Tsai M., Laudet V (2006) International Union of Pharmacology. LXVI. Orphan Nuclear Receptors. Pharmacol Rev 58: 798-836.

38. Best J. В., Morita M. (1991) Toxicology of planarians. Hydrobiologia 277: 375-383.

39. Blask D.E. Melatonin in oncology. In "Melatonin. Biosynthesis, physiological effects, and clinical applications". H.-S. Yu., R.J. Reiter. (eds.)- Boca Raton, FL: CRC Press. 1993: 447-475

40. Boncinelli E., Simeone A., Aampora D, Mavilio F. (1991) HOX gene activation by retinoic acid. Trends Genet 7: 329-334.

41. Boutin J. A., Audinot V., Ferry G. and Delagrange P. (2005) Molecular tools to study melatonin pathways and actions. Trends Pharmacol Sci. 26: 412-419.

42. Breitman T. R., Selonick, S. E., Collins S. J. (1980) Induction of differentiation of the human promyelocytic leukemia cell line (HL-60) by retinoic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77: 2936-2940

43. Bronsted H. V. (1969). Planarian regeneration. Pergamon Press.

44. Bubenik G.A., Brown G.M., Grota L.J. (1976) Immunochistochemical localization of melatonin in the rat Harderian gland. J. Histochem. Cytochem. 24: 1173-1177.

45. Capsoni S., Viswanthan M., De Oliviera A.M., Saavedra J.M. (1994) Characterization of melatonin receptors and signal transduction system in rat arteries forming the circle of Willis. Endocrinology 135: 373-378,

46. Cebria F. (2007) Regenerating the central nervous system: How easy for planarians! Dev. Genes Evol. 217: 733-748.

47. Chambon P. (1995) The molecular and genetic dissection of the retinoid signaling pathway. Recent Prog Horm Res 50: 317-332.

48. Chambon P. (1996) A decade of molecular biology of retinoic acid receptors. FASEB J 10:940-954.

49. Chambon P. (2005) The nuclear receptor superfamily: a personal retrospect on the first two decades. Mol Endocrinol 19: 1418-1428.

50. Chen H., Namkung M.J., Junchau M.R. (1995) Biotransformation of all-trans-retinol and all-trans-retinal to all-trans-retinoic acid in rat conceptal homogenates. Biochem Pharmacol 50: 1257-1264.

51. Chen J.Y., Clifford J., Zusi C., Starrett J., Tortolani D., Ostrowski J., Reczek P.R., Chambon P., and Gronemeyer H. (1996) Two distinct actions of retinoid-receptor ligands. Nature (Lond) 382: 819-822.

52. Claustrat В., Brun J., Chazot G. (2005) The basic physiology and pathophysiology of melatonin. Sleep Med Rev 9: 11-24.

53. Cohlan S.Q. (1953) Excessive intakes of vitamin A as a cause of congential anomalies in the rat. Science 117: 535—536.

54. Cos S., Blask D.E., Lemus-Wilson A., Hill A.B. (1991) Effects of melatonin on the cell cycle kinetics and "estrogen-rescue" of MCF-7 human breast cancer cells in culture. J. Pineal Res 10: 36-42.

55. Cos S., Sanchez-Barcelo EJ. (2000) Melatonin and mammary pathological growth. Front. Neuroendocrin. 17: 133-170.

56. Daftary G.S., Taylor H.S. (2006) Endocrine regulation of HOX genes. Endocrine Reviews. 27(4):331-355.

57. Dubocovich M.L. (1988) Pharmacology and function of melatonin receptors. FASEB J 2: 2765 2733.

58. Dubocovich M.L., Cardinali D.P., Delagrange P., Krause D.N., Strosberg D., Sugden D., Yocca F.D. (2000) Melatonin receptors. In The IUPHAR Compendium of Receptor Characterization and Classification, 2nd edn. (IUPHAR, ed.): 271-277.

59. Dubocovich M.L., Markowska M. (2005) Functional MT1 and MT2 melatonin receptors in mammals. Endocrine 27: 101-110.

60. Dupe V., Davenne M., Brocard J., Dolle P., Mark M., Dierich A., Chambon P., Rijli F.M. (1997) In vivo functional analysis of the Hoxa-1 31 retinoic acid response element (3' RARE). Development 124: 399-410.

61. Ebisawa Т., Karne S., Lerner M.R., Reppert S.M. (1994) Expression cloning of a high-affinity melatonin receptor from Xenopus dermal melanophores. Proc. Nat Acad. Sci. USA 91: 6133-6137.

62. Edward M., Gold J. A., Mackie R. M. (1988) Different susceptibilities of melanoma cells to retinoic acid-induced changes in melanotic expression. Biochem. Biophys. Res. Commun 155: 773-778.

63. Eisenhoffer G.T., Kang H., and Sanchez Alvarado A. (2008) Molecular analysis of stem cells and their descendants during cell turnover and regeneration in the planarian Schmidtea mediterranea. Cell Stem Cell 3: 327-339.

64. Forman BM, Umesono K., Chen J., Evans R.M. (1995) Unique response pathways are established by allosteric interactions among nuclear hormone receptors. Cell 81: 541-550.

65. Fujii H., Sato Т., Kaneko S., Gotoh O., Fujii-Kuriyama Y., Osawa K., Kato S., Hamada H. (1997) Metabolic inactivation of retinoic acid by a novel P-450 differentially expressed in developing mouse embryos. EMBO J 16:4163-4173.

66. Fujiwara S., Kawamura K. (2003) Acquision of retinoic acid signaling pathway and innovation of the chordate body plan. Zoological science 20: 809-818.

67. Garcia-Maurino S., Pozo D., Carrillo-Vico A., Calvo J.R. Guerrero J.M. (1999) Melatonin activates Thl lymphocytes by increasing IL-12 production. Life Sci 65: 2143-2150.

68. Germain P., Chambon P., Eichele G., Evans R. M., Lazar M. A., De Lera A. R., Lotan R., Mangelsdorf D. J., Gronemeyer H. (2006) International union of pharmacology. LXIII. retinoid X receptors. Pharmacol Rev 58: 760-772.

69. Ghyselinck N.B., Dupe V., Dierich A., Messaddeq N., Gamier J.M., Rochette-Egly C., Chambon P., Mark M. (1997) Role of the retinoic acid receptor p (RAR P) during mouse development. Int J Dev Biol 41: 425447.

70. Giguere V., Ong E.S., Segui P., Evans R.M. (1987) Identification of a receptor for the morphogen retinoic acid. Nature (Lond) 330: 624-629.

71. Glass C.K. (1994) Differential recognition of target genes by nuclear receptor monomers, dimers, and heterodimers. Endocr Rev 15: 391-407.

72. Goldstein J.T., Dobrzyn A., Clagett-Dame M., Pike J.W., DeLuca H.F. (2003) Isolation and characterization of unsaturated fatty acids as natural ligands for the retinoid-X receptor. Arch Biochem Biophys 420: 185-193.

73. Gonzales-Estevez C., Momose Т., Gehring W. J. Salo E. (2003) Planarian transgenic lines obtained by electroporation using transposon-derivedvectors and an eye-specific GFP marker. Proc Natl Acad Sci USA 100: 14046-14051.

74. Guecheva Т., Henriques J. A. P., Erdtman B. (2001) Genotoxic effects of copper sulphate in freshwater planarian in vivo, studied with the single-cell gel test (comet assay). Mutat. Res. 497: 19-27.

75. Gulcin I., Buyukokuroglu M.E., Kufrevioglu O.I. (2003) Metals chelating and hydrogen peroxide scavenging effects of melatonin. J Pineal Res 34: 278.

76. Guo Т., Peters A.H., Newmark P.A. (2006) A Bruno-like gene is required for stem cell maintenance in planarians. Dev Cell 11: 159-169.

77. Hamilton T. (1969) Influence of environmental light and melatonin upon mammary tumor induction. Brit J Surg 56: 764-766.

78. Handberg-Thorsager M., Salo E. (2007) The planarian nanos-like gene Smednos is expressed in germline and eye precursor cells during development and regeneration. Dev Genes Evol 217: 403^111.

79. Hardeland R., Poeggeler B. (2003) Non-vertebrate melatonin. J Pineal Res 34: 233-241.

80. Hardeland R., Poeggeler В., Behrmann G., Fuhrberg B. (1996) Enzymatic and non-enzymatic metabolism of methoxyindoles. In Metabolism and

81. Cellular Dynamics of Indoles (Hardeland R., ed.), University of Goettingen, Goettingen: 6-22.

82. Hardeland R., Reiter R.J., Poeggeler B. Tan D.X. (1993) The significance of the metabolism of the neurohormone melatonin: antioxidative protection and formation of bioactive substances. Neurosci Biobehav Rev 17: 347-357.

83. Hayashi Т., Asami M., Higuchi S., Shibata N., Agata K. (2006) Isolation of planarian X-ray-sensitive stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Dev Growth Differ 48: 371-380.

84. Higuchi S., Hayashi Т., Hori I., Shibata N., Sakamoto H., Agata K. (2007) Characterization and categorization of fluorescence activated cell sorted planarian stem cells by ultrastructural analysis. Dev Growth Differ 49: 571-581.

85. Hori I. (1997) Cytological approach to morphogenesis in the planarian blastema. II. The effect of neuropeptides. J Submicrosc Cytol Pathol 29: 91-97.

86. Horstman J.A., Wrona M.Z., Dryhurst G. (2002) Further insights into the reaction of melatonin with hydroxyl radical. Bioorg Chem 30: 371-382

87. Ijpenberg A., Tan N.S., Gelman L., Kersten S., Seydoux J., Xu J., Metzger D., Canaple L., Chambon P., Wahli W., et al. (2004) In vivo activation of PPAR target genes by RXR homodimers. EMBO (Eur Mol Biol Organ) J 23: 2083-2091.

88. Illerova H., Vanecek J. (1982) Two-oscillator structure of the pacemaker controlling the circadian rhythm of N-acetyltransferase in the rat pineal gland. J Comp Physiol 145: 539-548.

89. Itoh M.T., Shinozawa Т., Sumi Y. (1999) Circadian rhythms of melatonin-synthesizing enzyme activities and melatonin levels in planarians. Brain Res 830: 165—173.

90. Jung H.Y., Park S.H., Yoo Y.D., Kim J.S., Kim Y.H. (2005) CDK2/4 regulate retinoic acid-induced G1 arrest in hepatocellular carcinoma cells. Hepatol Res 31: 143-152.

91. Karasek M., Marek K., Swetoslawski J., Stepien H. (1991) Relationship between the pineal gland and estrogen-induced prolactinoma in Ficsher 344 rat with special reference to the ultrastructure of pinealocytes. Adv. Pineal Res 6: 27-35.

92. Karasek M., Winczyk K., Kunert-Radek J., Wiesenberg I., Pawlikovski M. (1998) Antiproliferative effects of melatonin and CGP52608 on the murine colon 38 adenocarcinoma in vitro and in vivo. Neuroendocrinol Lett 19: 71-78.

93. Karbownik M., Lewinski A., Reiter R.J. (2001) Anticarcinogenic actions of melatonin which involve antioxidative processes: comparison with other antioxidants. Int J Biochem Cell Biol 33: 735-753.

94. Kawaguchi R., Yu J., Honda J., Hu J., Whitelegge J., Ping P., Wiita P., Bok D., Sun H. (2007) A membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science 315: 820-825.

95. Kiefer Т., Ram P.T., Yuan L. Hill S.M. (2002) Melatonin inhibits estrogen receptor transactivation and cAMP levels in breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat 71: 37-45.

96. Klein D. C., Weller J. L. (1970) Indole metabolism in the pineal gland: a circadian rhythm in pineal serotonin N-acetyl transferase activity. Science 177: 532-533.

97. Kolar J., Machackova I. (2005) Melatonin in higher plants: occurrence and possible functions. J Pineal Res 39: 333-341.

98. Kostrouch Z., Kostrouchova M., Love W., Jannini E., Piatigorsky J., Rail J.E. et al. (1998) Retinoic acid X receptor in the diploblast, Tripedalia cystophora. Proc Natl Acad Sci USA 95: 13442-13447.

99. Krause D.N., Dubocovich M.L. (1990) Regulatory sites in the melatonin system of mammals. Trends Neurosci 13: 464 470.

100. Kurokawa R., DiRenzo J., Boehm M., Sugarman J., Gloss В., Rosenfeld M.G., Heyman R.A., Glass C.K. (1994) Regulation of retinoid signalling by receptor polarity and allosteric control of ligand bindig. Nature (Lond) 371: 528-531.

101. Kvetnoy I.M., Yuzhakov V.V. (1993) Extrapineal melatonin: advanced in microscopical identification of hormones in endocrine and non endocrine cells. Microscopy and Analysis 21: 27 29.

102. Ladurner P., Reiger R., Baguna J. (2000) Spatial distribution and differentiation potential of stem cells in hatchlings and adults in the marine platyhelminth Macrostomus sp.: a bromodeoxyuridine analysis. Dev Biol 226: 231-241.

103. Lednev V. V., Tiras Kh. P., Belova N. A., Ermakova O. N., Ermakov A. M. (2005) Biological effect of extremely weak industrial-frequency magnetic fields. Biophysics 50(1): S157-S162.

104. Lender T. N. (1952) Le role inducteur du cerveau dans la regeneration des yeux d'une planaire d'eau douce. Ann Biol 28: 191-198.

105. Leon J., Acuna-Castroviejo D., Escames G., Tan D.X., Reiter R.J. 2005 Melatonin mitigates mitochondrial malfunction. J Pineal Res 38, 1-9.

106. Lerner A.B., Case J.D., Takahashi Y., Lee Т.Н., Mori W. (1958) Isolation of melatonin, the pineal gland factor that lightens melanocytes. J Am Chem Soc 80: 2587

107. Liao S., Dulaney J.T. Williams-Ashman H.G. (1962) Purification and properties of a flavoprotein catalyzing the oxidation of reduced ribosyl nicotinamide. J Biol Chem. 237: 2981-2987.

108. Limson J., Nyokong Т., Daya S. (1998) The interaction of melatonin and its precursors with aluminium, cadmium, copper, iron, lead, and zinc. An adsorptive voltammetric study. J Pineal Res 24: 12-21.

109. Lissoni P., Crispino S., Barni S. et al. (1990) Pineal gland and tumor cell kinetics: serum levels of melatonin in relation to Ki-67 labeling rate in breast cancer. Oncology 47: 275-277.

110. Maden M. (1982) Vitamin A and pattern formation in the regenerating limb. Nature 295: 672-675.

111. Maden M. (1983) The effect of vitamin A on the regenerating axolotl limb. J Embryol Exp Morph 83: 273-295.

112. Maestroni G.J. (2001) The immunotherapeutic potential of melatonin. Expert Opin Invest Drugs 10: 467-476.

113. Maestroni G.J., Cardinali D.P., Esquifino A.I., Pandi-Perumal S.R. (2004) Does melatonin play a disease-promoting role in rheumatoid arthritis? J Neuroimmunol 158: 106-111.

114. Maestroni G.J., Conti A., Lissoni P. (1994) Colony-stimulating activity and hematopoietic rescue from cancer chemotherapy compounds are induced by melatonin via endogenous interleukin 4. Cancer Res 54: 4740-4743.

115. Maestroni G.J., Conti A., Pierpaoli W. (1986) Role of the pineal gland in immunity. Circadian synthesis and release of melatonin modulates the antibody response and antagonizes the immunosuppressive effect of corticosterone. J Neuroimmunol 13: 19-30.

116. Maharaj D.S, Glass B.D., Daya S. (2007) Melatonin: New Places in Therapy. Biosci Rep 27: 299-320

117. Mamgelsdorf D.J., Thummel C., Beato M., Herrlich P., Schutz G., Umesono K., Blumberg В., Kastner P., Mark M., Chambon P. (1995) The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell 83: 835-839.

118. Mangelsdorf D.J., Borgmeyer U., Heyman R.A., Zhou J.Y., Ong E.S., Ого A.E., Kakizuka A., Evans R.M. (1992) Characterization of three RXR genes that mediate the action of 9-cis retinoic acid. Genes Dev 6: 329-344.

119. Mangelsdorf D J., Evans R.M. (1995) The RXR heterodimers and orphan receptors. Cell 83: 841-850.

120. Mangelsdorf D.J., Ong E.S., Dyck J.A., Evans R.M. (1990) Nuclear receptor that identifies a novel retinoic acid response pathway. Nature (Lond) 345: 224-229.

121. Mark M., Ghyselinck N.B., Chambon P: (2006) Function of retinoid nuclear receptors: lessons from genetic and pharmacological dissections of the retinoic acid signalling pathway during mouse embryogenesis. Annu Rev Pharmacol Toxicol 46: 451-480.

122. Marletaz F., Holland L.Z., Laudet V., Schubert M. (2006) Retinoic acid signaling and the evolution of chordates. International Journal of Biological Sciences 2(2): 38-47.

123. Maywood E.S., Hastings M.H., Max M., Ampleford E., Menaker M., Loudon A.S. (1993) Circadian and daily rhythms of melatonin in the blood and pineal gland of free-running and entrained Syrian hamsters. J Endocrinol 136: 65-73.

124. McCaffery P., Drager U.C. (2000) Regulation of retinoic acid signaling in the embryonic nervous system: a master differentiation factor. Cytokine Growth Factor Rev 11: 233-249.

125. McConnell J.V. ed. A manual of psychological experimentation on planarians. Worm Runner's Digest, Ann Arbor, MI. 1965.

126. McKay R.D. (2004). Stem cell biology and neurodegenerative disease. Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci 359: 851-856.

127. Metzger D., Ghyselinck N.B., et al. (2002) Physiological and retinoid-induced proliferations of epidermis basal keratinocytes are differently controlled. EMBO (Eur Mol Biol Organ) J 21: 3402-3413.

128. Mic F.A., Haselbeck R.J., Cuenca A.E., Duester G. (2002). Novel retinoic acid generating activities in the neural tube and heart identified by conditional rescue of Raldh2 null mutant mice. Development 129: 22712282.

129. Missbach M., Jagher В., Sigg I., Nayeri S., Carlberg C., Wiesenberg I. (1996) Thiazolidine diones: specific ligands of the nuclear receptor RZR/ROR with potent anti-arthritic activity. J Biol Chem 271: 1351513522.

130. Miura K., Oda M., Mikita S., Chinzei Y. (2005) Characterization of the Drosophila Methoprene-tolerant gene product: Juvenile hormone binding and ligand-dependent gene regulation. FEBS J 272: 1169-1178.

131. Morgan, Т.Н. (1898) Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata. Arch Ent Mech Org. 7: 364-397.

132. Morgan Т.Н. (1901) Regeneration. New York. The Macmillan Company

133. Morgan Т.Н. (1902). Arch Ent Mech Org. 13: 179 -212.

134. Morita M., Best J.B. (1984) Effect of photoperiods and melatonin on planarian asexual reproduction. J Exp Zool 231: 273-282.

135. Morita M., Hall F., Best J.B., Gem W. (1987) Photoperiodic modulation of cephalic melatonin in planarians. J Exp Zool 214: 383-388.

136. Moss J.B., Xavier-Neto J., Shapiro M.D., Nayeem S.M., Mccaffery P., Drager U.C., Rosental N. (1998) Dynamic patterns of retinoic acid synthesis and response in the developing mammalian heart. Dev Biol 199: 55-71.

137. Namboodiri M.A., Dubbels A. R., Klein D.C. (1987) Arylalkylamine N-acetyltransferase from mammalian pineal gland. Methods Enzymol 142: 583-590.

138. Natesan A.K., Cassone V.M. (2002) Melatonin receptor mRNA localization and rhythmicity in the retina of the domestic chick, Gallus domesticus. Visual Neurosci. 19: 265-274.

139. Newmark P.A., Sanchez Alvarado A. (2000) Bromodeoxyuridine specifically labels the regenerative stem cells of planarians. Dev Biol 220: 142-153.

140. Nosjean O., Ferro M., Coge F., Beauverger P., Henlin J. M., Lefoulon F., Fauchere J. L., Delagrange P., Canet E. and Boutin J. A. (2000) Identification of the melatonin-binding site MT3 as the quinone reductase 2. J Biol Chem 275:31311-31317.

141. Noy N. (2000) Retinoid-binding proteins: mediators of retinoid action. Biochem J 348: 481^195.

142. Orii H., Sakurai Т., Watanabe K. (2005) Distribution of the stem cells (neoblasts) in the planarian Dugesia japonica. Dev Genes Evol 215: 143157.

143. Oviedo N.J. Levin M. (2008) The planarian regeneration model as a context for the study of drug effects and mechanisms. In Planaria: A model for drug action and abuse (ed. R.B. Raffa). RG Landes, Austin, TX.

144. Oviedo N.J., Newmark P.A., Sanchez Alvarado A. (2003) Allometric scaling and proportion regulation in the freshwater planarian Schmidtea mediterranea. Dev Dyn 226: 326-333.

145. Palakodeti D., Smielewska M., Graveley B. R. (2006) MicroRNAs from the planarian Schmidtea mediterranea: A model system for stem cell biology. RNA 12: 1640-1649.

146. Pandi-Perumal S.R., Srinivasan V., Maestroni G.J.M., Cardinali G.P., Poeggeler В., Hardeland R. (2006) Melatonin. Nature's most versatile biological signal? FEBS Journal 273: 2813-2838.

147. Pedersen K.J. (1959) Cytological studies on the planarian neoblast. Z Zellforsch 50: 799-817.

148. Pellettieri J., Sanchez Alvarado A. (2007) Cell turnover and adult tissue homeostasis: from humans to planarians. Annu Rev Genet 41: 83-105.

149. Pellettieri J., Sanchez Alvarado A. (2007) Cell turnover and adult tissue homeostasis: From humans to planarians. Annu Rev Genet 41: 83-105.

150. Perissi V., Rosenfeld M.G. (2005) Controlling nuclear receptors: the circular logic of cofactor cycles. Nat Rev Mol Cell Biol 6: 542-554.

151. Petkovich M., Brand N.J., Krust A., Chambon P. (1987) A human retinoic acid receptor which belongs to the family of nuclear receptors. Nature (Lond) 330: 444-450.

152. Pieri C., Marra M., Moroni F., Recchioni R., Marcheselli F. (1994) Melatonin: a peroxyl radical scavenger more effective than vitamin E. Life Sci 55: 271-276.

153. Pierrefiche G., Topall G., Courbin I., Henriet I., Laborit H. (1993) Antioxidant activity of melatonin in mice. Res Comm Chem Pathol Pharmacol 80: 211-223

154. Pintor J., Pelaez Т., Hoyle Ch. H.V., Peral A. (2003) Ocular hypotensive e.ects of melatonin receptor agonists in the rabbit: further evidence for an MT3 receptor. British Journal of Pharmacology 138: 831-836.

155. Pozo D., Reiter R.J., Calvo J.R., Guerrero J.M. (1994) Physiological concentrations of melatonin inhibit nitric oxide synthase in rat cerebellum. Life Sci 55: L455-L460.

156. Quadro L., Blaner W.S., Salchow D.J., Vogel S., Piantedosi R., Gouras P., Freeman S., Cosma M.P., Colantuoni V., Gottesman M.E. (1999). Impaired retinal function and vitamin A availability in mice lacking retinol-binding protein. EMBO J 18: 4633-4644.

157. Raikhlin N.T., Kvetnoy I.M. (1976) Melatonin and enterochomaffine cells. Acta Histochem. 55: 19-25.

158. Rastinejad F., Wagner Т., Zhao Q., Khorasanizadeh S. (2000) Structure of the RXR-RAR DNA-binding complex on the retinoic acid response element DR1. EMBO (Eur Mol Biol Organ) J 19: 1045-1054.

159. Ray W.J., Bain G., Yao M., Gottlieb D.I. (1997) CYP26, a novel mammalian cytochrome P-450, is induced by retinoic acid and defines a new family. J Biol Chem 272: 18702-18708.

160. Reddien P.W., Bermange A.L., Murfitt K.J., Jennings J.R., Sanchez Alvarado A. (20056) Identification of genes needed for regeneration, stem cell function, and tissue homeostasis by systematic gene perturbation in planaria. Dev Cell 8: 635-649.

161. Reddien P.W., Oviedo N.J., Jennings J.R., Jenkin J. C., Sanchez Alvarado A. (2005a) SMEDWI-2 is a PlWI-like protein that regulates planarian stem cells. Science 310: 1327-1330.

162. Regodon S., Martin-Palomino P., Fernandez-Montesinos R., Herrera J.L., Carrascosa-Salmoral M.P., Piriz S., Vadillo S., Guerrero J.M., Pozo D. (2005) The use of melatonin as a vaccine agent. Vaccine 23: 5321-5327.

163. Reiter R.J. (1991) Melatonin: that ubiquitously acting pineal hormone. News Physiol Sci 6: 109-131.

164. Reiter R.J., Tan D.X., Osuna C., Gitto E. (2000) Actions of melatonin in the reduction of oxidative stress: a review. J Biomed Sci 7: 444-458.

165. Reppert S.M., Godson C., Mahle C.D., Weawer D.R., Slaugenhaupt S.A., Gusella J.F. (1995) Molecular characterization of a second melatonin receptor expressed in human retina and brain: the Mel lb melatonin receptor. Proc Natl Acad Sci USA 92: 734-8738.

166. Reppert S.M., Weaver D.R., Ebisawa T. (1994). Cloning and characterization of a mammalian melatonin receptor that mediates reproductive and circadian responses. Neuron 13: 1177-1185.

167. Romero M.P., Garcia-Pergadena A., Guerrero J.M., Osuna C. (1998) Membrane-bound calmodulin in X. laevis oocytes as a novel binding site for melatonin. FASEB J. 12: 1401-1408.

168. Romero R., Bueno D. (2001) Disto-proximal regional determination and intercalary regeneration in planarians, revealed by retinoic acid induced disruption of regeneration. Int J Dev Biol 45: 669-673.

169. Rossi L., Salvetti A., Marincola F. M., Lena A., Deri P., Mannini L., Batistoni R., Wang E., Gremigni V. (2007) Deciphering the molecular machinery of stem cells: A look at the neoblast gene expression profile. Genome Biol 8: R62.

170. Roy D., Angelini N.L., Fujieda H., Brown G.M., Belsham D.D. (2001) Cyclical regulation of GnRH gene expression in GT1-7 GnRH — secreting neurons by melatonin. Endocrinology 142: 4711-4720.

171. Salo E., Munoz-Marmol A.M., Bayascas-Ramirez J.R., Garciafernandez J., Miralles A., Casali A., Corominas M., Baguna J. (1995) The freshwater planarian Dugesia (G) tigrina contains a great diversity of homeobox genes. Hydrobiologia 305: 269-275.

172. Salvetti A., Rossi L., Lena A., Batistoni R., Deri P., Rainaldi G., Locci M.T., Evangelista M., Gremigni V. (2005) DjPum, a homologue of Drosophila Pumilio, is essential to planarian stem cell maintenance. Development 132: 1863-1874.

173. Sanchez Alvarado A. (2006) Planarian regeneration: Its end is its beginning. Cell 124: 241-245.

174. Sanchez Alvarado A., Kang H. (2005) Multicellularity, stem cells, and the neoblasts of the planarian Schmidtea mediterranea. Exp Cell Res 306: 299-308.

175. Sanchez Alvarado A., Newmark P. A. (1999) Double-stranded RNA specifically disrupts gene expression during planarian regeneration. Proc Natl Acad Sci USA 96: 5049-5054.

176. Sanchez Alvarado A., Newmark. P. A., Robb S. M., Juste R. (2002) The Schmidtea mediterranea database as a molecular resource for studyingplatyhelminthes, stem cells and regeneration. Development 129: 56595665.

177. Sato K., Shibata N., Orii H., Amikura R., Sakurai Т., Agata K., Kobayashi S., Watanabe K. (2006) Identification and origin of the germline stem cells as revealed by the expression of nanos-related gene in planarians. Dev Growth Differ 48: 615-628.

178. Sauzin-Morton M. J. (1973) Etude ultrastructurale des neoblastes de Dendrocoelum lacteum au cours de la regeneration. J Ultrastruct Res 45: 206-222.

179. Schubert M., Yu J.K., Holland N.D., Escriva H., Laudet V., Holland L.Z. (2005) Retinoic acid signaling acts via Hoxl to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus. Development 132: 61-73.

180. Sessler R.J., Noy N. (2005) A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II. Mol Cell 18: 343-353.

181. Sharon A.R., McCaffery P.J., Drager U.C. De Luka L.M. (2000) Retinoids in embryonal development. Physiol Rev 80: 1021-1054.

182. Sheiman I.M., Sakharova NJ. (1974) On peculiarity of planarian digestion. Comp Biochem Physiol 48(3): 601-607.

183. Shibata N., Umesono Y., Orii H., Sakurai Т., Watanabe K., Agata K. (1999) Expression of vasa(vas)-related genes in germline cells and totipotent somatic stem cells of planarians. Dev Biol 206: 73-87.

184. Srinivasan V., Pandi-Perumal S.R., Maestroni G.J., Esquifino A.I., Hardeland R., Cardinali D.P. (2005) Role of melatonin in neurodegenerative diseases. Neurotox Res 7: 293-318.

185. Sugden D., Cena V., Klein D.C. (1987) Hydroxyindole-O-methyltransferase. Methods Enzymol 142: 590-596.

186. Tamarkin L., Baired C.J., Almeida O.F.X. (1985) Melatonin: a coordinating signal for mammalian reproduction? Science 227: 714-720.

187. Tan D.X., Chen L.D., Poeggeler В., Manchester L.C., Reiter R.J. (1993a) Melatonin: a potent, endogenous hydroxyl radical scavenger. Endocrine J 1:57-60

188. Than N.N., Heer C., Laatsch H. Hardeland R. (2006) Reactions of the melatonin metabolite Nl-acetyl-5-methoxykynuramine (AMK) with the ABTS cation radical: identification of new oxidation products. Redox Rep 11: 15-24.

189. Tickle C., Alberts B.M., Wolpert L., Lee J. (1982) Local application of retinoic acid to the limb bud mimics the action of the polarizing region. Nature 296: 564-565.

190. Tilden A.R., Becker M.A., Amma L.L. et al. (1997) Melatonin production in an aerobic photosynthetic bacterium: an evolutionarily early association with darkness. J Pineal Res 22: 102-106.

191. Urbach J., Rando R.R. (1994) Isomerization of all-trans-retinoic acid to 9-cis-retinoic acid. Biochem J 299: 459-465.

192. Vanecek J. (1998) Cellular mechanisms of melatonin action. Physiol Rev 78: 687-721.

193. Vanecek J., Illerova H. (1982) Night pineal N-acetyltransferase activity in rats exposed to white or red light pulses of various intensity and duration. Experientia 38: 1318-1320.

194. Vieira De Souza A., Visconti M.A., De Lauro Castrucci A.M. (2003) Melatonin biological activity and binding sites in human melanoma cells. J Pineal Res 34: 242-248.

195. Vijaylaxmi I., Reiter R.G., Meltz M.L. (1995) Melatonin protects human blood lymphocytes from radiation induced chromosome damage. Mutat Res 346: 23-31.

196. Vonesch J.L., Nakshatri H., Philippe M., Chambon P., Dolle P. (1994) Stage and tissue-specific expression of the alcohol dehydrogenase 1 (Adh-1) gene during mouse development. Dev Dyn 199: 199-213,

197. Wehr T.A. (1996) A «clock for all seasons» in the human brain. Prog Brain Res 111:321-342.

198. Wittenderby P.A., Dubocovich M.L. (1996) Characterization and regulation of the human ML1A melatonin receptor stably expressed in Chinese hamster ovary cells. Mol Pharmacol 50: 166-174,

199. Wolff E., Dubois F. (1948) Sur la migration des cellules de regeneration chez les planaires. Rev Suisse Zool 55: 218-227.

200. Y. Yoshizawa, K. Wakabayashi, T. Shinozawa. (1991) Inhibition of planarian regeneration by melatonin. Hydrobiologia 227: 31-40.

201. Yasuo S., Yoshimura Т., Bartel P.A., Iigo M., Makino E., Okabayashi N., Ebihara S. (2002) Effect of melatonin administration on qPer2, qPer3, andqClock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of Japanese quail. Eur JNeurosci 16: 1541-1546.

202. Zemkova H., Vanecek J. (2000) Differences in gonadotropin-releasing hormone-induced calcium signaling between melatoninsensitive and melatonin-insensitive neonatal rat gonadotrophs. Endocrinology 141:1017-1026.

203. Zhang M., Chen W.G., Smith S.M., Napoli, J.L. (2001) Molecular characterization of a mouse short chain dehydrogenase/reductase active with alltrans-retinol in intact cells, mRDHl. J Biol Chem 276: 4408344090.

204. Zhao D., Mccaffery P., Ivins K.J., Neve R.L., Hogan P., Chin W.W., Drager U.C. (1996) Molecular identification of a major retinoicacid-synthesizing enzyme, a retinaldehyde-specific dehydrogenase. Eur J Biochem 240: 15-22.M

Информация о работе

Ермакова, Ольга Николаевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2009
ВАК 03.00.13

Диссертация

Мелатонин и ретиноевая кислота как морфогены планарий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Мелатонин и ретиноевая кислота как морфогены планарий ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Мелатонин и ретиноевая кислота как морфогены планарий"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ермакова, Ольга Николаевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Мелатонин и ретиноевая кислота как морфогены планарий"

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Ермакова, Ольга Николаевна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ермакова, Ольга Николаевна, Пущино

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Мелатонин и ретиноевая кислота как морфогены планарий
ВАК РФ 03.00.13, Физиология