Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние регуляторных пептидов на процессы синтеза ДНК в эпителиях белых крыс в раннем периоде постнатального онтогенеза

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Влияние регуляторных пептидов на процессы синтеза ДНК в эпителиях белых крыс в раннем периоде постнатального онтогенеза"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РФ

ВЛАДИВОСТОКСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Яценко Татьяна Васильевна

ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ НА ПРОЦЕССЫ СИНТЕЗА ДНК В ЭПИТЕЛИЯХ БЕЛЫХ КРЫС В РАННЕМ ПЕРИОДЕ ПОСГНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА.

03.00.П.- эмбриология, гистология и цитология.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток -1998.

Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории Дальневосточного государственного медицинского университета

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор С.С. Тимошин.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор А.Л. Максимович

кандидат медицинских наук, доцент, В.Ф. Баранов

Ведущая организация: Российский государственный медицинский

университет

Защита диссертации состоится «_»_1998 года в__часов на заседании специализированного диссертационного совета Д 084.24.01 при Владивостокском государственном медицинском университете (690600, г.Владивосток, ГСП, пр.Острякова, 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета (г.Владивосток, пр.Острякова,2)

Автореферат разослан «_»_1998 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доцент

Г.М. Холоденко

Актуальность проблемы.

Изучение процессов регуляции клеточного деления, обеспечивающих адек-атный рост и развитие организма, является одним из главных направлений в овременной биологии и медицине.

В настоящее время известно большое количество биологически активных еществ /Б А В/, обладающих морфогенетическим и активационным действием, 'реди этих веществ опиоидные пептиды занимают особое положение. Изуче-[ие их роли в поддержании гомеостаза оказалось одной из интенсивно разраба-ываемых проблем /Ашмарин И.П., Обухова М.Ф., 1986/. В Центральной науч-ю-исследовательской лаборатории Дальневосточного государственного меди-[инского университета была установлена вовлеченность опиоидных пептидов в егуляцию клеточного деления у половозрелых крыс. В то же время участие тих пептидов в осуществлении регуляции процессов пролиферации на ранних тапах постнатального онтогенеза практически не изучено. Данное исследова-ие представляется актуальным и в прикладном аспекте. Высокая эффектив-юсть, низкая токсичность, модуляторный характер действия и возможность интеза аналогов с заданными свойствами определяет перспективы создания и [спользования лекарственных средств на основе пептидных регуляторов в кушерской и педиатрической практике.

В такой же мере это относится к изучению влияния одного из наиболее фи-огенетически древних регуляторов - пептидного морфогена гидры (ПМГ). 1МГ оказывает выраженное морфогенетическое действие на представителей ипа Сое1еп1:сга1а /БсЬаНег Н. С., Вос1епти11ег Н., 1981/, стимулирует процессы [ролиферации у половозрелых животных /Хомичук А.Ю., 1995/. Сведения о его лиянии на процессы синтеза ДНК на ранних этапах постнатального онтогенеза ■ млекопитающих фактически отсутствуют.

Цель и задачи работы.

Цель настоящего исследования состояла в изучении характера влияния тиоидных пептидов и пептидного морфогена гидры на процессы синтеза ДНК

в различных эпителиях белых крыс в раннем постнатальном периоде развития. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить характер влияния лигандов различных субпопуляций опиатных рецепторов на процессы синтеза ДНК в эпителиях новорожденных крыс.

2. Провести сравнительный анализ действия опиоидных пептидов на процессы синтеза ДНК в различные периоды постиатального онтогенеза.

3. Изучить влияние пептидного морфогена гидры и его биологических фрагментов на пролиферацию гепатоцитов в различных стадиях раннего постиатального онтогенеза.

Научная новизна.

1. Впервые выявлены особенности влияния лигандов опиатных рецепторов (ц, 5, к) на процессы синтеза ДНК в эпителиях языка, желудка, печени новорожденных крыс.

2. Впервые установлены возрастные особенности действия пептидного морфогена гидры и его биологически акгивных фрагментов на пролиферативные процессы в печени белых крыс на различных стадиях раннего постиатального онтогенеза.

Практическая значимость.

1. Полученные данные о влиянии регуляторных пептидов на процессы пролиферации на ранних этапах постиатального онтогенеза позволят внести соответствующие коррективы в показания и противопоказания к назначению фармакологических препаратов на основе данных пептидов при их внедрении в медицинскую практику.

2. Результаты работы помогут целенаправленному синтезу химических веществ с заданными свойствами для использования их в педиатрической практике. Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Характер влияния регуляторных пептидов на пролиферативные процессы в организме млекопитающих существенно зависит от возраста животного.

2. Воздействие рсгуляторных пептидов на процессы синтеза ДНК в различных типах эпителиев новорожденных крыс вызывает изменения, отличные ог тех, соторые наблюдаются у половозрелых животных.

Апробация диссертации. Основные материалы диссертации были доложены i обсуждены на объединенном заседании Ц1 ГИЛ, кафедр нормальной анатомии, отологической физиологии Дальневосточного государственного медицинского ,'пиверситста и лаборатории морфологии ИОМиД СО РАМН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них \ - в центральной печати.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав (обзора литературы, описания материалов и методов, двух глав, представляющих результаты собственных исследований, обсуждения), выводов, практических рекомендаций я списка литературы. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста и содержит 12 таблиц, 8 рисунков. Указатель литературы включает 186 работ отечественных авторов и 165 - иностранных.

Материалы и методы. В работе были использованы следующие вещества:

1. Синтетический аналог дерморфина - мю агониста - А10.

Химическая формула. H - Туг - D-Orn - Phe - Gly - ОН

2. Датаргин - синтетический, стабильный, аргинин-содержащий, гексапептид-ный аналог лейцин-энкефалина, смешанный дельта - мю агонист.

Химическая формула. Туг -D-Ala - Gly - Phe - Leu - Arg

3. Динорфин - каппа агонист. Химическая формула Туг - Gly - Gly - Phe - Leu - Arg - Arg - Ile - Arg - Pro - Lys - Leu - Lys.

4. Налоксон - антагонист опиатных рецепторов (фирма "Koch licht endolaboratories" США ).

5. Пептидный морфоген гидры (ПМГ). Химическая формула: pGlu- Pro - Pro -Gly - Gly - Ser - Lys - Val - Heu - Phe.

6. Фрагменты и аргининовый аналог ПМГ':

а) Arg ПМГ: pGlu-Pro-Pro-GIy-Gly-Scr-Lys-Val-Hcu-Leu-Phe-Arg

б) ЗС: 1Ьеи-Ьеи-РЬе

в) 6С: 8ег-Ьуз-Уа]-1Ьеи-Ьеи-РЬе

г) 5Ы: 01у-Рго-Рго-01у-С1у - физиологический антагонист ПМГ.

Все пептиды были синтезированы с помощью методов классической пептидной химии в растворе и твердофазным методом. Препаративная очистка проведена с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в условиях, индивидуально подобранных для каждого вещества. Среднее содержание пептидов в образцах составляло 97,5%. Экспериментальная идентификация пептидов была проведена информативным методом - 'Н-ЯМР спектроскопией /Рубина А.Ю, 1992/.

Процессы синтеза ДНК изучали в эпителиях пищеварительной системы: эк-тодермального происхождения (эпителий языка) и в эпителии энтодермального происхождения (эпителий пилорического отдела желудка, гепатоциты печени).

Экспериментальный анализ влияния регуляторных пептидов на процессы клеточного деления на ранних этапах онтогенеза проводился в различные периоды постнатального развития. В своих исследованиях мы руководствовались классификациями возрастных периодов Махинько В.И., Никитина В.Н. /1975/; Западшока И.П., Западнюка В.И., Захария Е.А. / 1974/; Фролькис В В. /1982/. В работе были использованы следующие возрастные группы: 5-ти и 7-ми суточные - период новорожденное™; 25-суточные - период инфантильности; 37-ми суточные и 1,5-месячные крысы - период инфантильности; препубертатный период.

По представлениям Фролькиса В.В. /1982/ эти возрастные периоды можно отнести к раннему онтогенезу. Всего в работе было использовано 717 животных.

Введение пептидов осуществляли внутрибрюшинно, однократно и пятикратно. Контрольная и подопытные группы новорожденных формировались путем расщепления выводка. Эвтаназию проводили через 24 часа после заключительного введения пептида посредством быстрой декапитации. Животным

контрольной группы вводили эквиобъемное количество изотонического раствора хлорида натрия.

Активность процессов пролиферации в тканях оценивали с помощью метода радиоавтографии с 3Н-тимидином. Изотоп вводили крысам внутрибрюшин-но за 1 час до эвтаназии из расчета 0,6 мкКюри/г массы (удельная активность 84 кюри/моль). После забора тканей их подвергали гистологической обработке и заливали в парафин. Приготовленные срезы тканей толщиной 6 мкм депара-финировали и покрывали фотоэмульсией НИИХИМФОТО. После экспозиции препараты проявляли проявителем Д19, фиксировали 33% раствором тиосульфата натрия и окрашивали гематоксилином Лилли-Майера. После просмотра 2000-2500 ядер определяли индекс меченых ядер - ИМЯ, который выражали в процентах. Мечеными считали ядра, над которыми было не менее 5 зерен серебра. Интенсивность метки - среднее число греков над ДНК-синтезирующим ядром, рассчитывали на основании подсчета зерен серебра над 20-30 ядрами.

Концентрацию ц-АМФ в тканях определяли с помощью наборов для радиоиммунного исследования, фирма: Amersham Internatinal pic England HP7 9 Na.

Площадь гемопоэтических очагов подсчитывав с помощью программируемой системы анализа клеточного изображения МЕКОС-Ц.

Статистическая обработка результатов проводилась по стандартной методике вычисления выскакивающих вариант (тау-критерий), средних значений и их отклонений, оценки достоверности значений по Фишеру-Стьюденту /Кудрин A.M., Пономарева Г.Т., 1967; Рокицкий П.Ф., 1968/.

Результаты собственных исследований

Влияние лигандов опиатных рецепторов (.410, даларгина, динорфина) на процессы синтеза ДНК в изучаемых эпителиях белых крыс в раннем периоде постиатального онтогенеза.

Опиоидные пептиды вводили внутрибрюшинно, однократно в дозах 10 и 100 мкг/кг, и пятикратно в дозе 100 мкг/кг. При изучении влияния А10- р- аго-ниста на процессы синтеза ДНК у новорожденных крыс (5-суточных) было ус-

тановлено, что однократное введение А10 в дозе 10 мкг/кг не вызывает достоверных изменений ИМЯ и ИМ в эпителии языка (таблица 1). У половозрелых крыс в аналогичных условиях наблюдалось угнетение синтеза ДНК (Флейшман М.Ю., 1996). Введение А10 в дозе 100 мкг/кг достоверно повышало ИМЯ в эпителии языка в 1,6 раза, в эпителии желудка - в 1,3 раза. При этом интенсивность метки также увеличивалась. Результаты опытов представлены в таблице 1. У половозрелых животных введение А10 в дозе 100 мкг/кг угнетало синтез ДНК в эпителии языка и стимулировало - в эпителии желудка (Флейшман М.Ю., 1996). Таблица 1.

Влияние однократного введения А10, даларгина и динорфина в дозе 100 мкг/кг на процессы пролиферации в эпителиях языка и желудка новорожденных крыс (Х+га).

Язык Желудок

Группы животных ИМЯ% ИМ ИМЯ% ИМ

Контроль 6,3+0,2 6,3+0,2 7,6+0,3 5,9+0,2

А10 9,8+0,4* 7,1±0,1* 9,5+0,2* 7,0+0,2*

Контроль 7,1+0,4 7,5+0,3 7,6+0,3 5,9+0,2

Даларгин 7,9+0,4 7,0+0,2 8,8+0,3* 6,6+0,2

Контроль 9,6+0,4 6,7+0,3 6,3+0,4 5,8+0,2

Динорфин 7,2±0,6* 6,5+0,2 5,8+0,4 6,2+0,3

Примечание:* - отличие от контроля достоверно (Р<0,05).

При однократном введении А10 в дозе 10 и 100 мкг/кг новорожденным крысам мы наблюдали стимуляцию синтеза ДНК в ядрах гепатоцитов. ИМЯ увеличивался в 1,7 и в 2 раза соответственно (таблица 2). Аналогичная картина имела место при пятикратном введении исследуемого аналога дерморфина А10 новорожденным крысятам. ИМЯ гепатоцитов 7-суточных крыс, получаемых А10, превышал показатели контрольной группы в 1,4 раза (таблица 3). У 37-суточных крыс, которые полностью перешли на самостоятельное питание, была

выявлена диаметрально противоположная реакция. Пятикратное введение А10 индуцировало у этих животных уменьшение ИМЯ в 1,8 раза (таблица 3). Таблица 2.

Влияние однократного введения А10, даларгина и динорфина на процессы синтеза ДНК в гепатоцитах новорожденных крыс (Х+ш).

Доза 10 мкг/кг Доза 100 мкг/кг

Группы животных ИМЯ% ИМ ИМ Я% ИМ

Контроль 4,5+0,4 13,6+0,5 4,9+0,7 11,2+0,2

А10 7,8+0,8* 14,2+0,7 9,9+0,9* 14,9+0,5*

Контроль 7,3+0,4 7,0+0,3 6,0+0,5 12,5+0,5

Даларгин 7,0+0,4 7,4+0,2 5,8+0,4 11,9+0,4

Контроль 3,2+0,2 7,4+0,1 3,2+0,2 7,4+0,1

Динорфин 4,2+0,2* 7,7+0,2 3,0+0,2 7,0+0,3

Примечание:* - отличие от контроля достоверно (Р<0,05).

Таким образом, при изучении влияния мю-агониста А10 на процессы синтеза ДНК в эпителиях языка и желудка мы установили, что у новорожденных животных введение А10 вызывало стимуляцию синтеза ДНК, в отличие от дифференцированной реакции на это вещество, имевшей место у половозрелых крыс в аналогичных условиях. В гепатоцитах печени новорожденных животных введение А10 приводило к стимуляции процессов синтеза ДНК, а у 37-суточных индуцировало угнетение.

При изучении влияния 6-агониста - даларгина, который является стимулятором клеточного деления у половозрелых крыс в широком диапазоне доз, у новорожденных мы наблюдапи ослабление его активирующего эффекта на процессы синтеза ДНК. Так, введение пептида в дозе 10 и 100 мкг/кг не оказало существенного влияния на синтез ДНК в эпителии языка (таблица 1). В эпителии желудка мы зафиксировали достоверное повышение ИМЯ при введении даларгина в дозе 100 мкг/кг у новорожденных крыс (таблица 1).

При однократном введении даларгина в дозах 10 и 100 мкг/кг новорожденным крысятам, а также при пятикратном введении пептида (¡00 мкг/кг) мы не

наблюдали изменения показателей синтеза ДНК в ядрах гспатоцитов. Результаты опытов представлены в таблицах 2 и 3. У 37-суточных крыс введение далар-гина индуцировало уменьшение величины ИМЯ (таблица 3). Таблица 3.

Влияние многократного введения опиоидных пептидов на процессы синтеза ДНК в гепатоцитах 7- суточных и 37-суточных крыс (Х+т).

7- суточные 37- суточные

Группы животных ИМЯ% ИМ ИМЯ% ИМ

Контроль 3,9+0,2 8,7+0,3 2,5+0,3 10,5+0,3

Л10 5,4+0,3* 9,3+0,2 1,4+0,3* 9,9+0,3

Контроль 3,6+0,3 8,7+0,2 2,5+0,3 10,5+0,3

Даларгин 3,6+0,4 9,2+0,3 1,4+0,4* 9,5+0,4

Контроль 3,6±0,3 7,7+0,2

Динорфин 3,7+0,2 7,6+0,3

Примечание:* - отличие от контроля достоверно (Р<0,05).

При изучении влияния динорфина 1-13 (к-агониста) на процессы синтеза ДНК у новорожденных мы также обнаружили особенности реакции эпителиальных клеток. У половозрелых животных динорфин оказывает угнетающее воздействие на синтез ДНК в эпителиях языка и желудка (Радивоз М.И., 1997). У новорожденных крыс имело место ослабление ингибирующего эффекта динорфина: уменьшение величины ИМЯ наблюдалось только в эпителии языка при введении пептида в дозах 10 и 100 мкг/кг - ИМЯ уменьшился в 1,5 и 1,3 раза соответственно (таблица 1). В эпителии желудка динорфин не оказывал влияния на показатели синтеза ДНК (таблица 1).

В гепатоцитах новорожденных крысят однократное введение динорфина приводило к достоверному повышению ИМЯ в дозе 10 мкг/кг (таблица 2). Однако, введение динорфина в дозе 100 мкг/кг не изменяло этот показатель. Пятикратное введение динорфина в дозе 100 мкг/кг новорожденным крысам также не вызывало изменений величины ИМЯ и ИМ в гепатоцитах (таблица 3).

Таким образом, характер влияния опиоидных пептидов на синтез ДНК на разных стадиях онтогенеза существенно отличается от того, который имеет место у половозрелых животных.

Для доказательства участия опиатных рецепторов в осуществлении изучаемых эффектов мы провели исследования влияния лигандов опиатных рецепторов на фоне блокады их налоксоном. Налоксон вводили в дозе 200 мкг/кг за 30 мин. до инъекции пептидов.

Результаты опытов свидетельствуют о том, что налоксон отменяет действие исследуемых лигандов (А 10, даларгина и динорфина) в эпителиях языка и желудка новорожденных крыс, что дает основание полагать, что данные эффекты опиоидных пептидов в этих эпителиях опосредуются через опиатные рецепторы.

Так как сам налоксон в дозе 200 мкг/кг в наших опытах оказывал стимулирующее воздействие на синтез ДНК в гепатоцитах новорожденных крысят, представлялось затруднительным анализировать эффекты сочеганного воздействия налоксона и опиатных агонистов на изучаемые процессы в печени крысят.

Влияние пептидного морфогена гидры и его биологически активных фрагментов на процессы синтеза ДНК в гепатоцитах белых крыс на ранних стадиях постнатального онтогенеза.

Результаты исследований влияния опиоидных пептидов на процессы пролиферации на ранних этапах постнатального онтогенеза свидетельствуют о существенных различиях этих реакций по сравнению с теми, которые имели место у половозрелых животных. Несмотря на то, что влияние лигандов опиатных рецепторов на клеточное деление оценивается как специфическое, представляется интересным изучить характер влияния других нейропептидов на процессы пролиферации в раннем постнаталыюм периоде. С этой целыо был избран филогенетически древний регуляторный пептид - пептидный морфоген гидры.

Многократное введение ПМГ, его биологически активных фрагментов и ар-гининового аналога мы осуществляли по той же схеме, что и для опиатных аго-нистов - 5-кратное введение в концентрации 10"7 М, что соответствует дозе для ПМГ и А^ПМГ - 100 мкг/кг. Фрагменты ЗС, 6С и 5К1 вводили в эквимолярной концентрации.

Результаты радиоавтографичсского анализа свидетельствуют, что у 7-суточных крыс введение ПМГ и ЗС не выявило изменений в синтезе ДНК (таблица^.

Таблица 4.

Влияние многократного введения ПМГ и его фрагментов на синтез ДНК в гепа-тоцитах новорожденных крыс (Х+ш).

Группы животных Пролиферативные показатели

ИМЯ% ИМ

Контроль 4,6+0,3 8,6+0,3

ПМГ 4,0+0,2 8,6+0,2

Аг^1МГ 2,9+0,2* 7,7+0,2

Зс 3,9+0,3 8,6+0,1

6с 3,5+0,3* 8,6+0,3

Контроль /5Ы/ 5,0±0,3 8,8+0,3

5К 4,1+0,2* 8,4+0,3

Примечание:* - отличие от контроля достоверно ( Р<0,05).

Введение А^ПМГ, 6С и антагониста - 5КТ оказало угнетающее воздействие на процессы синтеза ДНК в гепатоцитах (таблица 4).

В течение раннею иостнатального развития в печени крысят присутствуют гемопоэтические очаги. В ходе постнатального онтогенеза эти очаги элиминируются. В том случае, если площадь очагов кроветворения превышает средние значения, характерные для этого возраста, это оценивается как задержка созревания и морфологическая незрелость печени. Исходя из этого, было решено использовать среднюю площадь очагов кроветворения при введении 6С и как косвенный показатель возрастной зрелости печени. Полученные данные

свидетельствуют, что средние значения площади гемопоэтичсского очага в контрольной группе составляют 330,4+23,1 мкмг. Несмотря на то, что 6С фрагмент индуцировал у животных уменьшение ИМЯ, площадь гемопоэтических очагов в этой группе не отличалась от среднего значения площади в контроле - 309,3+43,2 мкм2. Иная картина наблюдалась при пятикратном введении 5Ы фрагмента. В этой группе среднее значение площади очагов кроветворения на 32% было больше, чем в контроле и составило -436,1+39,9 мкм2 (таблица 5). Таблица 5.

Влияние многократного введения 5М и 6С фрагментов ПМГ на площадь очагов кроветворения у новорожденных крыс.

Группы животных Площадь очага мкм

Контроль 330,4+23,1

6С фрагмент ПМГ 309,3+43,2

514 фрагмент ПМГ 436,1+39,9*

Примечание:* - отличие от контроля достоверно ( Р<0,05).

Таким образом, введение 5Ы фрагмента индуцировало уменьшение величины индекса меченых ядер гепатоцитов и приводило к отставанию гисто-морфологического созревания печени, оцениваемого по площади очагов кроветворения. Введение 6С фрагмента уменьшало ИМЯ гепатоцитов, но не изменяло величину среднего значения площади гемопоэтичсского очага.

Следующая группа исследований проводилась на 25-суточных животных. Напомним, что в этот период происходит переход крыс на самостоятельное питание, покидание гнезда. Согласно данным Бродского В.Я. /1966/ в это время происходит существенное уменьшение митотической активности гепатоцитов, наблюдается их полиплоидизация. При радиоавтографическом анализе было установлено, что на этом сроке исследования величина ИМЯ в контрольной группе достоверно уменьшилась в 3,5 раза по сравнению с величиной ИМЯ контрольной группы 7-суточных крыс (таблица 6).

Таблица 6.

Влияние пятикратного введения ПМГ и его аналогов на синтез ДНК в генато-цитах 25-суточных крыс (Х+ш).

Группы животных Пролиферативные показатели

ИМЯ% ИМ

Контроль 1,3±0,13 13,4+1,2

ПМГ 1,4+0,10 15,2+1,1

АгцПМГ 1,0+0,09* 15,4+1,1

Зс 1,5+0,20 14,0+0,9

бс 1,8+0,18* 17,5+1,0*

5N 0,97+0,08* 15,0+1,3

Примечание: * - отличие от контроля достоверно (Р<0,05).

♦ - отличие от контроля имеет устойчивую тенденцию (Р<0,1).

При анализе результатов введения ПМГ, а также ЗС фрагмента, мы не обнаружили достоверных изменений величины ИМЯ, ИМ в подопытной группе по сравнению с контрольной (таблица 6). Введение наиболее активного фрагмента ПМГ- 6С - привело к достоверному увеличению ИМЯ у 25-суточных крыс в 1,4 раза. Кроме того, этот фрагмент индуцировал достоверное увеличение ИМ, которое свидетельствует об ускорении прохождения гелатоцитами Б-периода (таблица 6). Под влиянием аргининового аналога ПМГ на этом этапе постнатального развития наблюдается устойчивая тенденция к уменьшению ИМЯ. Такая же тенденция обнаруживается и при введении ЗЫ-фрагмента (таблица 6).

Таким образом, на 25-день постнатального развития, когда осуществляется переход крыс на самостоятельное питание, свойственное половозрелым животным, реакция гепатоцитов на введение 6С фрагмента пептидного морфогена гидры изменяется по сравнению с той, которая наблюдается у 7-суточных крыс.

Аналогичную картину мы наблюдали при введении ПМГ и его аналогов полуторамесячным крысам. Пептидный морфоген гидры и его фрагмент-ЗС,

так же как и у 25-суточных крыс, на этом сроке постнатальной жизни не вызывали достоверных изменений ИМЯ и ИМ (таблица 7). Под влиянием введения аргининового аналога, так же как и у 25-суточных крыс, у 1,5-месячных крыс наблюдалась устойчивая тенденция к уменьшению величины ИМЯ по сравнению с контрольной группой (таблица 7). Таблица 7.

Влияние пятикратного введения Г1МГ и его аналогов на синтез ДНК в гепато-цитах 1,5-месячных крыс (Х+т),

Группы животных Пролиферативные показатели

ИМЯ% ИМ

Контроль 0,76+0,07 13,7+0,9

ПМГ 0,8+0,10 15,6+0,7

ЛтбПМГ 0,59+0,07' 14,9+1,1

Зс 0,8+0,10 15,5+1,1

6с 1,2+0,14* 15,9+1,2

5И 0,57+0,04* 14,5+1,2

Примечание: * - отличие от контроля достоверно (Р<0,05).

* - отличие от контроля имеет устойчивую тенденцию (Р<0,1) При введении физиологического антагониста - 5М происходило достоверное уменьшение величины ИМЯ. Введение 6С фрагмента индуцировало увеличение ИМЯ в 1,5 раза, как и у 25-суточных крысят (таблица 7).

При анализе влияния самого ПМГ на пролиферацию гепатоцитов на всех 3-х исследуемых сроках следует учитывать два обстоятельства: по данным Ка-лсниковой Е.И. /1994/ концентрация Н3-Г1МГ в печени по сравнению с другими органами не высока. Второе обстоятельство связано с тем, что стимулирующий эффект ПМГ на активность орнитиндекарбоксилазы в печени проявляется в узком диапазоне доз /Казимирский Л.П. и соавт., 1988/. Авторы объясняют это невысокой представленностью высокоаффинных рецепторов к ПМГ в гепатоцитах. Объяснением того, что биологическая активность проявляется лишь у 6С фрагмента может служить тот факт, что нативная молекула ПМГ

достаточно плохо растворима в воде, в отличие от 6С фрагмента. Полученные нами данные являются косвенным свидетельством целесообразности использования 6С фрагмента для осуществления гепатопротекторного действия.

Таким образом, результаты опытов свидетельствуют, что влияние ПМГ и его аналогов на процессы синтеза ДНК в гепатоцигах имеют отчетливые возрастные особенности. Если введение 6С фрагмента угнетало пролиферативные процессы в гепатоцитах новорожденных крыс, то у 25-суточных и 1,5-месячных - введение этого фрагмента стимулировало процессы синтеза ДНК.

Изменение характера реакции процессов синтеза ДНК на регуляторные пептиды, по-видимому, является одним из последствий общей перестройки в системе пищеварения в связи с переходом на самостоятельное питание.

В то же время, функциональный антагонист пептидного морфогена гидры - 5К фрагмент оказывал однотипный ингибирующий эффект- в различные периоды постнатального развития.

Таким образом, результаты оценки влияния регуляторных пептидов на различные процессы, в том числе и пролиферации, у взрослых животных не могут быть априорно экстраполированы на ранние возрастные периоды. Необходимо учитывать специфику воздействия регуляторных пептидов на разных стадиях онтогенеза, а также отставленные эффекты, связанные с «гормональным им-принтингом».

Выявленные возрастные особенности реакции организма млекопитающих на воздействие РП могут быть обусловлены следующими причинами:

1. Возрастными особенностями рецепторного аппарата новорожденных

2. Возрастными закономерностями внутриклеточной передачи

3. Особенностью функционирования данных веществ на различных этапах онтогенеза.

Подтверждением первого положения являются данные Чаба Д (1986) о становлении лигапд-рецепторного взаимодействия у млекопитающих в онтогенезе

и данные Attali В., Saya D., Vogel Z (1990), согласно которым, у новорожденных крыс в спинном мозге преобладают мю и каппа- рецепторы, причем их плотность выше таковой у взрослых животных. Позднее, в период раннего постна-тального онтогенеза появляются дельта рецепторы. Их количество составляет всего 4-8% от общего числа опиатных рецепторов.

В нашей работе мы исследовали влияние различных опиатных лигандов (Al 0, даларгина, динорфина) па содержание ц-АМФ в ткани желудка новорожденных. В результате опыта было обнаружено достоверное уменьшение уровня ц-АМФ в тканях желудка при введении даларгина. Напомним, что в эпителии желудка мы обнаружили достоверное увеличение величины индекса меченых ядер при введении даларгина. Наличие отрицательной коррелляции между активностью пролиферативных процессов и содержанием ц-АМФ в некоторых клеточных популяциях позволяет считать изменения ц-АМФ в наших опытах закономерными. Введение А10 и динорфина не оказывало влияния на содержание ц-АМФ в тканях желудка новорожденных крыс по сравнению с этим пока-шелем в контрольной группе. Согласно данным Виноградова В.А., Смагина З.Г., Титова М.И. /1986/ опноидные пептиды угнетают активность эденилатциклазы в клетках мозга и активируют этот фермент в клетках сишечника взрослых крыс. Несмотря на то, что исследования были проведены ia разных тканях, разнонаправленный характер реакции системы щенилатциклаза - ц-АМФ в наших опытах, выполненных на новорожденных кивотных, и в опытах Виноградова В.А., Смагина В.Г., Титова М.И. /1986/ - на юловозрелых, можег служить косвенным свидетельством в пользу федположения о вовлеченности системы циклических нуклеотидов в Ьормирование особенностей реакции пролиферативных процессов на опиаты.

При объяснении механизмов возрастных особенностей влияния регулярных пептидов на различные процессы в организме млекопитающих на рап-[их этапах постнаталъного онтогенеза необходимо иметь ввиду становление ндогепной системы пептидов в этот период и изменение проницаемости гема-оэнцефалического барьера в ходе постнатального онтогенеза. Проницаемость

ГЭБ изменяется в ходе онтогенеза, следовательно, и воздействие регуляторных пептидов затрагивает различные уровни регуляции процессов в разные возрастные периоды, что влияет на направленность и выраженность реакции клеток на изучаемые пептиды.

Результаты проведенного исследования дают основание считать, что реакция новорожденных животных на введение регуляторных пептидов отражает наиболее общие закономерности изменения системы пищеварения в онтогенезе, связанное с переходом крыс на самостоятельное питание.

ВЫВОДЫ.

1. Однократное введение ц-агониста - А10 новорожденным крысам вызывает стимуляцию синтеза ДНК в эпителиях языка и желудка, в отличие от дифференцированной реакции на это вещество у половозрелых животных в аналогичных условиях.

2. При однократном введении 5-агониста - даларгина новорожденным крысам имеет место существенное ослабление стимулирующего эффекта на синтез ДНК в изучаемых эпителиях по сравнению с тем, который наблюдается у половозрелых животных.

3. При однократном введении к-агониста динорфина происходит ослабление ингибирующего эффекта этого пептида на процессы синтеза ДНК у новорожденных крыс по сравнению с тем, который имеет место у половозрелых животных.

4. Опиатный пептид А10 вызывает стимуляцию синтеза ДНК в гепатоцитах 7-суточных крыс и угнетение - у 37-суточных.

5. Эффекты исследуемых опиатных пептидов на процессы синтеза ДНК в эпителиях языка и желудка отменяются предварительным введением налоксона, что свидетельствует об опосредованности этих эффектов через опиатные рецепторы.

6 Направленность и выраженность эффектов пептидного морфогена гидры и его биологически активных фрагментов на синтез ДНК в гепатоцитах зависит

от возраста животного. Введение фрагмента 6С угнетает процессы клеточного деления у 7-суточных крыс, и стимулирует - у 25- суточных и 1,5- месячных.

7. Изменение направленности процессов синтеза ДНК в ответ на введение ре-гуляторных пептидов при переходе животных на самостоятельное питание является отражением становления функциональной системы пищеварения в постнатальном онтогенезе.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Гончарова E.H., Яценко Т.В. Влияние регуляторных пептидов на синтез ДНК в миокарде и печени новорожденных белых крыс // Тезисы науч. сообщений -2 съезд физиологов Сибири и Дальнего Востока. - Новосибирск, 1995. -С.103-104.

2. Лебедько O.A., Тимошин С.С., Яценко Т В., Рубина А.Ю. Применение пептидного морфогена гидры для коррекции постгипоксических нарушений у крысят, подвергнутых пренатальной гипоксии // Тезисы сообщений - 1 Всероссийский конгресс по патофизиологии. - Москва, 1996. - С. 121.

3. Гончарова E.H., Тимошин С.С., Яценко Т В. Влияние аналога лей-энкефалина даларгина на синтез ДНК в миокарде и эпителии языка белых крыс на раннем этапе постнатального онтогенеза // Бюлл. эксперим. биол. и мед. -1997. -№1. -С.43-45.

4. Гончарова E.H., Мельникова Н.П, Яценко Т.В. Влияние агониста мю-ошшодных рецепторов тетрапептида AI0 на синтез ДНК в миокарде и печени белых крыс на раннем этапе постнатального онтогенеза // Бюлл. эксперим. биол. и мед.- 1997.-Т.123, №2. -С.212-215.

5. Лебедько O.A., Яценко Т.В., Тимошин С.С., Рубина А.Ю. Влияние пептидного морфогена гидры на постгипоксические нарушения у крысят, подвергнутых пренатальной гипоксии // Бюлл. эксперим. биологии и мед.- 1997,-Т.123, №3- С.269-272.

6. Лебедько O.A., Кулаева В.В., Яценко Т.В. Влияние пептидного морфогена гидры и его аналогов на процессы синтеза ДНК в различных видах эпителия новорожденных крыс // Тезисы докладов. 3-й съезд физиологов Сибири и

- Дальнего Востока,- Новосибирск., 1997,- С.123.

7. Сазонова E.H., Яценко Т.В., Тимошин С.С., Флейшман М.Ю. Возрастные особенности влияния опиодных пептидов на процессы синтеза ДНК в эпителиальной ткани белых крыс // Проблемы фармакологии и фармации на Дальнем Востоке. Материалы конф. - Хабаровск, октябрь 1997,- С.88-90.