Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие регуляторных пептидов в морфогенезе миокарда белых крыс

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Участие регуляторных пептидов в морфогенезе миокарда белых крыс"

На правах рукописи

МЕЛЬНИКОВА Наталья Павловна

УЧАСТИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ В МОРФОГЕНЕЗЕ МИОКАРДА БЕЛЫХ КРЫС

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Владивосток - 2005

Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории Дальневосточного государственного медицинского университета

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор С.С. Тимошин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор СТ. Мамонтов

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник, А.А. Вараксин

доктор медицинских наук Е.В. Елисеева

Ведущая организация: Российская академия медицинских наук, государственное учреждение научно-исследовательский институт морфологии человека

Защита состоится ««3 » СС'^ОН-!.^'''_2005 года в «_» часов на

заседании диссертационного совета Д 207.007.01 при Владивостокском государственном медицинском университете (690950, г. Владивосток, пр. Острякова, 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета

Автореферат разослан

2005 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

.д.м.н., профессор Г.В. Рева

Актуальность проблемы

Поражения сердечно-сосудистой системы продолжают оставаться широко распространенными и по-прежнему являются основной причиной заболеваемости и смертности населения в индустриально развитых странах. Экспертами ВОЗ прогнозируется, что такая тенденция сохранится и до 2020 года [Crackower M.A. et al., 2002].

Развитие сердца представляет широкое поле исследования для различных специалистов, включая анатомов, физиологов, молекулярных биологов [Rothenberg F. et al., 2003]. Такие области молекулярной и клеточной кардиологии как детерминация клеток миокарда, процессы пролиферации и клеточной гибели, дистрофические и фиброзные изменения, продолжают оставаться актуальными проблемами, вызывающими интерес исследователей различных направлений медицины и биологии [Epstein J.A., Buck CA, 2000].

Изучение биологической роли пептидов и белков, их синтеза и метаболизма, а также рецепторного аппарата является необходимым для более полного понимания развития сердца [Linask K.K., 2003].

Морфогенез сердца определяется генетической программой развития [Бродский В.Я. и соавт., ,1986, 1991]. Эпигеномные влияния, среди которых основным является гемодинамическая нагрузка [Schroder EA et al., 2002], также способны изменять морфогенез сердца. К эпигеномным факторам можно отнести и влияние различных биологических веществ, в том числе пептидов. Эндогенные пептидергические системы (эндотелиновая, ангиотензиновая, опиатергическая) служат, наряду с гормональными и нейротрансмиттерными, основными посредниками, через которые реализуются морфологические, функциональные и биохимические механизмы адаптации сердца в ответ на изменение окружающей среды. В зависимости от силы действующего фактора и срока, на котором осуществляется вмешательство, последствия могут проявляться на клеточном, тканевом или органном уровне [Колесников СИ. и соавт., 1999]. Изменение процессинга пептидов на различных этапах эмбриогенеза способно модулировать активность процессов клеточной пролиферации, дифференцировки, миграции и апоптоза, приводя к различного рода порокам [Yanagisawa H. et al., 1998; Treinen K.A. et al., 1999; Choi J.H. et al., 2002]. Пептидные факторы влияют на различные звенья метаболизма клеток - изменяют транскрипционную активность генов (приводя, например, к активации фетальных генов), регулируют процессы синтеза белка и активность ферментных систем, модулируют функцию систем вторичных мессенджеров, свободнорадикальные процессы и т.д. [Chua C.C. et al., 1994; Fu S.G. et al., 2000; Ostrom R.S. et al., 2003]. Способность представителей различных семейств нейропептидов изменять эти процессы в онтогенезе во многом определяется степенью зрелости эндогенных систем их рецепции и метаболизма. В процессах формирования и роста сердца для каждой системы существуют онтогенетические закономерности ее функциональной и морфогенетической активности. Для многих нейропептидов максимум активности наблюдается именно в критические периоды морфогенеза сердца, либо при развитии патологических изменений в нем [Shanmugam S. et al., 1994; Habets P.E. et al., 2002].

Как и для любого органа, для сердца существует ряд особенно важных в морфогенетическом плане периодов в постнатальном развитии, когда оно наиболее чувствительно к эндо- и экзогенным влияниям. Одним из таких критических временных промежутков для миокарда, согласно сведениям литературы, является период, в котором сочетаются процессы активной пролиферации и программированной клеточной гибели, а также дифференцировки кардиомиоцитов и созревания иннервации сердца. Для крыс этот период составляет 3-4 недели после рождения, для человека - 10-12 лет [Румянцев П.П., 1982; Большакова Г.Б., 1991]. В последующие периоды процессы синтеза ДНК и клеточного деления кардиомиоцитов хотя и не исчезают полностью, не вносят значительного вклада в репарацию сердца при его повреждении. Способность сердца к адаптации при действии патологических факторов на более поздних этапах развития во многом определяется интенсивностью и адекватностью синтеза ДНК на ранних этапах онтогенеза. Накопление ДНК в кардиомиоцитах осуществляется опережающими темпами, создается генетический запас, до которого будет нарастать белковый синтез на более поздних стадиях развития [Бродский В.Я., 1995].

Белок-синтетические процессы не имеют жесткой временной константы, они более лабильны и пластичны. Например, при развитии гипертрофии сердца его масса может возрастать в 3 и более раза в основном за счет накопления сократительных белков [Непомнящих Л.М. и соавт., 1986].

Помимо непосредственных эффектов, при введении ряда ксенобиотиков, в том числе гормонов и пептидных регуляторов, отмечается формирование отсроченных эффектов, проявляющихся в поведенческих, биохимических и структурных изменениях на более поздних этапах и даже на протяжении всей жизни индивидуума. Это особенно характерно при экспозиции в критические периоды онтогенеза [Колесников СИ., 1999; Рыжавский Б.Я., 1999; Csaba G. et al., 2003].

В последние годы большое внимание уделяется участию процессов программированной клеточной гибели в нормальном и патологическом развитии сердца. Изменение этих процессов описано при ИБС, аритмиях, пороках сердца, гипертрофических состояниях, миокардитах, трансплантации и т.д. [Fisher S.A. et al., 2000; Matturri L. et al., 2001]. При ряде патологических состояний в миокарде взрослых крыс этим путем может элиминироваться до 1/3 кардиомиоцитов [Лушникэва Е.Л. и соавт., 2000; Непомнящих Л.М., Семенов Д.Е., 2000].

Для нормального функционирования сердца особое значение имеет поддержание адекватного баланса между паренхиматозным и стромальным компонентами. Сдвиг соотношения этих компартментов миокарда в сторону избыточного развития кардиомиоцитов (например при гипертрофической кардиомиопатии) или фиброзирования (что встречается гораздо чаще и сопровождает развитие подавляющего числа заболеваний сердца), неблагоприятно отражается на процессах метаболизма паренхиматозных клеток и их основных свойств - возбудимости, проводимости, сократимости [Непомнящих Л.М. и соавт., 1986].

Модуляция морфогенеза сердца путем влияния на различные звенья метаболизма пептидергических посредников в сердечно-сосудистой системе представляет перспективное направление фармакологии. Лиганды опиатных рецепторов применяются при острых поражениях сердца в течение нескольких десятилетий. Не ограничиваясь только опиатергической системой, это положение нашло подтверждение в создании антагонистов ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, являющихся препаратами выбора при гипертонической болезни и сердечной недостаточности, внедрении в кардиологическую практику первого блокатора рецепторов эндотелина -бозертана, а также рекомбинантного препарата человеческого натрийуретического пептида - незиритида.

Цель исследования Изучить закономерности ближайших и отдаленных последствий введения регуляторных пептидов на структурный гомеостаз миокарда крыс.

Достижение этой цели планировалось осуществить с помощью решения следующих конкретных задач:

1. Оценить влияние вазоактивных, опиоидных пептидов и ПМГ на пролиферативный потенциал стромальных и паренхиматозных клеток миокарда новорожденных и половозрелых крыс, а также отсроченные эффекты введения пептидов новорожденным животным у крыс позднего молочного и предпубертатного возраста.

2. Исследовать активность зон ЯОР, размеры кардиомиоцитов и содержание в них общего белка у крыс при введении исследуемых пептидов.

3. Изучить влияние вазоактивных, опиоидных пептидов и ПМГ на соотношение паренхимы и стромы в миокарде новорожденных и половозрелых крыс, а также отсроченные эффекты введения пептидов новорожденным животным у крыс позднего молочного и предпубертатного возраста.

Научная новизна

Впервые описано возрастное изменение динамики экспрессии PCNA в миокарде крыс новорожденного, позднего молочного, предпубертатного и половозрелого возраста, а также проведено сравнение с интенсивностью инкорпорации кардиомиоцитами меченного по тритию тимидина.

Впервые исследованы онтогенетические особенности изменения геометрических и текстурных параметров зон ЯОР ядер кардиомиоцитов при импрегнации нитратом серебра.

Впервые предпринято сравнительное изучение изменения числа стромальных и паренхиматозных клеток в миокарде левого желудочка с учетом возраста животных, проведенное с применением иммуногистохимических маркеров виментина и десмина.

Впервые обнаружена способность эндотелина-1 активировать процессы апоптоза кардиомиоцитов новорожденных крыс при повторном введении.

Впервые обнаружено, что изменения соотношения стромального и паренхиматозного компонентов миокарда, возникающие при введении эндотелина-1 и ангиотензина-И новорожденным крысам сохраняются и у

животных позднего молочного возраста, а при введении эндотелина-1 и у крыс предпубертатного возраста.

Впервые показано, что введение новорожденным крысам агониста к-ОР динорфина А(1-13) способно вызывать избыточное развитие соединительной ткани в миокарде крыс через 15 дней после заключительной инъекции.

Впервые выявлено, что повторные инъекции АНП-2 крысам на первой постнатальной неделе способны снижать активность зон ЯОР кардиомиоцитов у крыс позднего молочного периода.

Впервые обнаружено, что введение ПМГ новорожденным крысам снижает синтез ДНК в клетках стромы миокарда крыс позднего молочного периода.

Впервые показано сохранение изменений гистологических параметров миокарда, возникающих при введении регуляторных пептидов новорожденным крысам у животных позднего молочного и предпубертатного периодов.

Научно-практическая значимость

Работа имеет теоретический характер. Результаты проведенного исследования могут служить отправной точкой для создания препаратов, регулирующих процессы пролиферации и дифференцировки кардиомиоцитов, а также модулирующих процессы развития соединительной ткани и фиброзирования в миокарде в норме и при действии патологических факторов. Знание возрастных закономерностей позволяет сформулировать показания и противопоказания к назначению фармакологических средств, изменяющих процессы синтеза, рецепции и метаболизма исследованных пептидов. Кроме того, изучение препаратов, используемых в медицинской практике в настоящее время - верапамила, лозартана и эднита, расширяют наши представления об их фармакодинамике и дают объяснение ряду известных эффектов с позиций морфологии. Экспериментальный материал, полученный при проведении данного исследования, может быть использован при подготовке лекций в вузах медицинской и биологической ориентации по специальностям гистология, физиология и патофизиология, анатомия и патологическая анатомия.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В процессе постнатального морфогенеза миокарда отмечается однонаправленное снижение пролиферативного потенциала кардиомиоцитов и клеток стромы. Процентное содержание клеток стромы возрастает, однако объемная доля паренхиматозного компонента увеличивается, что обусловлено возрастанием размеров кардиомиоцитов.

2. Вазоактивные пептиды - ангиотензин-П и эндотелии-1 увеличивают апоптоз кардиомиоцитов, активируют зоны ЯОР, рост кардиомиоцитов и накопление в них белка, изменяют межтканевой баланс миокарда новорожденных крыс в сторону преобладания стромы. Эффект сохраняется у животных позднего молочного возраста, а в отношении эндотелина-1 и у животных предпубертатного возраста.

3. АНП-2 при введении в период новорожденности снижает активность зон ЯОР у крыс позднего молочного периода.

4. Пятикратное введение ПМГ новорожденным крысам угнетает ДНК-синтетическую активность клеток стромы миокарда животных позднего молочного возраста.

5. Агонисты к- и м-ОР оказывают активирующее влияние на синтез ДНК в миокарде новорожденных крыс, стимулируют активность зон ЯОР. Динорфин А(1-13) при введении новорожденным крысам вызывает избыточное развитие соединительной ткани в миокарде животных позднего молочного периода.

Апробация работы

Основные положения диссертации представлены на 3-м съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1997); на конференции по проблемам фармакологи и фармации на Дальнем Востоке (Хабаровск, 1997); на юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию Б.А.Саакова (Ростов-на-Дону, 1999), на 8-м Российско-Японском медицинском симпозиуме (Благовещенск, 2000), на III Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Владивосток, 2002), а также на заседании Хабаровского отделения Всероссийского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов 17.06.2004.

Публикация результатов работы

Основные положения диссертации отражены в 10 статьях, 8 тезисах докладов и 2 рационализаторских предложениях.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из оглавления, списка сокращений, введения, 10 глав собственных исследований, заключения (11 глава), выводов и библиографического указателя.

Объем диссертации составляет 323 страницы машинописного текста и включает ПО таблиц, 107 рисунков и список литературы (622 источника). Диссертация изложена на русском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика исследуемых веществ

Проведено изучение морфогенетической активности пептидов, принадлежащих к трем семействам: опиоидные (агонисты ц-ОР - ДАГО, тетрапептид А10, казоморфин-7; агонист к-ОР динорфин А(1-13)), вазоактивные пептиды - ангиотензин-П, эндотелии-1, биологический аналог атриального натрийуретического пептида АНП-2; представитель семейства морфогенов - пептидный морфоген головы гидры. Пептиды (за исключением казоморфина-7) синтезированы в лаборатории синтеза пептидов РКНПК МЗ РФ.

В качестве агонистов ц-ОР вводились тетрапептиды ДАГО и А10, а также казоморфин-7, имеющие следующие структурные формулы: ДАГО: H-Tyг-DAla-Gly-Phe-OH

А 10: Н - Туг - DOm - Phe - Gly - ОН Р-казоморфин-7: Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile

Тетрапептид ДАГО является высокоспецифичным агонистом Ц-ОР, имеющим, как и большинство агонистов ОР, незначительную способность связываться с

Тетрапептид А10 представляет собой синтетический аналог дерморфина. А10 синтезирован проф. Е.П. Яровой и обладает большей, по сравнению с ДАГО, тропностью к

Казоморфин 1-7, синтезированный в лаборатории регуляторных пептидов Института молекулярной генетики РАН, является представителем семейства казоморфинов (в частности ß-казоморфина), содержащихся в молоке и образующихся в результате ферментативного расщепления из более длинных белков - казенное. Пептид обладает способностью связываться с

Биологически активный фрагмент динорфина А - динорфин А(1-13) -является селективным агонистом к-ОР и имеет следующую формулу:

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys

Эндотелии-1 представляет собой 21-аминокислотный пептид, имеющий 2 связи между цистеиновыми остатками:

Cys-Ser-Cys-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr-Phe-Cys-ffis-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp

Ангиотензин-П представляет собой октапептид :

H-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH

АНП-2 - 23-аминокислотный остаток (5-27) естественного пептида, содержащего 28 аминокислот. Основные биологические свойства этого пептида сходны с таковыми нативного АНП [Беспалова Ж.Д. и соавт., 1988].

АНП-2: Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Ile-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg

Головной активатор, или пептидный морфоген гидры (ундекапептид) относится к одному из древнейших в эволюционном плане семейству морфогенов и имеет следующую структуру:

ПМГ: pGlu-Pro-Pro-Gly-Gly-Ser-Lys-Val-Ile-Leu-Phe

Все пептиды синтезированы с использованием классического и твердофазного методов. Они были гомогенны при контроле методами ТСХ (тонкослойной хроматографии) и ВЭЖХ (высокоэффективной обращеннофазовой жидкостной хроматографии). Абсолютное содержание пептидов в сухом веществе составляло не менее 97,5%.

Кроме того, в работе исследовали активность ряда фармакологических препаратов, нашедших широкое применение в практической медицине:

Козаар (лозартан) - блокатор рецепторов ангиотензина-П 1 типа. Производится фирмой MERCK SHARP & DOHME BV.

Эднит (эналаприл) - блокатор ангиотензин-превращающего фермента. Производится фирмой GEDEON RICHTER.

Верапамил - блокатор L-типа потенциалчувствительных кальциевых каналов, выпускается фирмой KNOLL.

Характеристика объектов исследования

В проведенных исследованиях изучался миокард белых крыс различного возраста - 7-, 21-, 45-дневных и половозрелых. Возраст 7 суток, согласно классификации Западнюк И.П. и соавт. [1974], относится к новорожденности (подсосному периоду молочного кормления), или к раннему молочному по классификации Махинько В.И. и Никитина В.Н. [1975]. 21 день -инфантильный период, или поздний молочный, 45 дней - завершение инфантильного или предпубертатный период соответственно.

Большинство исследователей выделяют 2 фазы роста кардиомиоцитов: гиперпластическую и гипертрофическую [Jackson T. et al., 1990]. Первая заканчивается к 18-21 дню постнатального развития у крыс (а у человека - к 1012 годам). Вторая наиболее интенсивно происходит после перехода крысят к самостоятельному питанию. Другими авторами дефинитивное созревание кардиомиоцитов сдвигается к возрасту 45-50 дней [Загоруйко Г.Е., 1985]. В миокарде крыс, масса тела которых увеличивается на протяжении всей жизни, процессы изменения количества и соотношения различных клеточных элементов волнообразно протекают в течение всего постнатального онтогенеза [Абуладзе З.С., 1990].

Иммуногистохимическими критериями кардиомиоцитов является наличие в них маркеров мышечной дифференцировки - десмина, актина, миоглобина, миозина [Capetanaki Y. et al., 1997; Петров СВ., Киясов А.П., 1998; Hayman R. et al., 2000].

К клеткам немышечной фракции миокарда относятся, в первую очередь, фибробласты и фиброциты. Основным критерием их определения служит присутствие виментина как основного промежуточного филамента цитоскелета, синтез коллагена и фибронектина, локализация в межклеточном веществе соединительной ткани миокарда. К немышечным относятся и клетки эндотелия сосудов. Микроциркуляторное русло более развито в субэпикардиальных отделах миокарда [Большакова Г.Б., 1980; Румянцев П.П., 1982].

Соотношение клеток стромы и паренхимы в миокарде меняется в зависимости от периода онтогенеза и развития заболеваний. В целом, в нормальном миокарде с возрастом увеличивается количество стромальных клеток, однако объемная доля этого компонента снижается, что связано с опережающим ростом кардиомиоцитов и накоплением в них белка под влиянием гемодинамической нагрузки [Ерохина И.Л., 1968]. Кроме того, при развитии заболеваний, таких как ИБС, гипертоническая болезнь, миокардит, системные заболевания соединительной ткани и др., происходит изменение этого баланса в подавляющем большинстве случаев в сторону увеличения доли интерстиция. Это определяется особенностями гистологического строения и закономерностями регенеративных процессов, которые в миокарде половозрелых млекопитающих носят характер субституции [Непомнящих Л.М., 1981; Саркисов Д.С. и соавт., 1983; Непомнящих Л.М. и соавт., 1986].

Постановка экспериментов

Опыты проводились на беспородных белых крысах. На протяжении всего срока беременности крысы содержались в виварии в условиях естественного освещения, при температуре 18-20°С, имея свободный доступ к воде и пище. За 2-3 суток до предполагаемых родов самки помещались в индивидуальные клетки.

Экспериментальные группы животных формировали через сутки после рождения случайным равномерным разделением выводков.

Растворы приготовлялись стандартным образом, введение осуществлялось из расчета 0,025 мл на каждые 5 грамм массы тела с использованием инсулинового шприца. Перед введением пептидов производилось взвешивание животных на весах ВЖТ-500-М с точностью до 0,1 г. Сразу после инъекции крысы возвращались в гнездо. Контрольным животным инъецировали эквиобъемное количество 0,9% раствора хлорида натрия. Пептиды вводили внутрибрюшинно.

В первой серии экспериментов введение пептидов производилось ежедневно, с 2 по 6 постнатальные дни, между 11 и 13 часами. Забой проводили методом декапитации на 7 сутки жизни, через 24 часа после 5, заключительной инъекции.

Во второй серии экспериментов введение пептидов осуществлялось по описанной выше схеме, декапитация животных проводилась на 21 сутки после рождения, т.е. через 15 дней после окончания экспериментального воздействия. В одном из опытов (с введением тетрапептида А10) мы несколько модифицировали схему эксперимента. Декапитацию проводили на 24 сутки жизни, при этом 3Н-тимидин вводился 2-кратно, за 24 часа и за 1 час до забоя.

В третьей серии опытов исследование влияния пептидов на морфогенез сердца при их введении новорожденным животным по схеме, описанной выше, проводили на 45 день жизни, т.е. через 39 суток после заключительной инъекции пептидов.

Кроме того, ряд пептидов, обладающих выраженным морфогенным действием на миокард у новорожденных крысят, был протестирован на половозрелых крысах-самцах (5-7 месячного возраста). При этом введение осуществлялось внутрибрюшинно, пятикратно (в эксперименте с эндотелином-1 и ангиотензином-П), или в течение 21 дня (при введении А10). Введение антагонистов РААС (эднита и лозартана) осуществлялось энтерально с использованием желудочного зонда в течение 2 недель.

В отдельном эксперименте исследовали миокард интактных крыс соответствующих возрастов (7-, 21-, 45-дневных и половозрелых), которые не подвергались каким-либо экспериментальным и манипуляционным воздействиям.

Во всех экспериментах забой осуществляли методом декапитации через сутки после заключительного введения исследуемого вещества.

За 1 час до забоя внутрибрюшинно вводился 3Н-тимидин в дозе 1 мкКи/г массы тела (7-дневным и 21-дневным крысам) и 0,6 мкКи/г массы тела (45-суточным и половозрелым), удельная радиоактивность 1530 ТБк/моль [Епифанова О.И., 1969; Епифанова О.И. и соавт., 1977].

Новорожденным животным пептиды вводились внутрибрюшинно в дозе 100 мкг/кг. В эксперименте на половозрелых крысах ЭТ-1 вводился в дозе 10 мкг/кг [Сазонов О.А., 2002]. Казоморфин-7 инъецировали новорожденным крысам в дозе 1 мг/кг [Дубынин В.А. и соавт., 2000; Дубынин В.А., 2001]. Лозартан и эднит вводили в желудок с помощью зонда в дозе 10 мг/кг, верапамил инъецировали внутрибрюшинно из расчета 1,5 мг/кг [Prescott M.F. et al., 1991; McEwan P.E. et al., 1996].

Доза вводимых веществ была выбрана на основании проведенных ранее экспериментов в нашей лаборатории и с привлечением данных литературы [Панькова Т.Д., Тимошин С.С., 1990; Лишманов Ю.Б., Маслов Л.Н., 1994; Хомичук А.Ю., 1995; Флейшман М.Ю., 1996; Гончарова Е.Н. и соавт., 1996; Радивоз М.И., 1998; Животова Е.Ю., 2001; Сазонова Е.Н. и соавт., 2002; Лебедько О.А., 2004].

Эксперименты проведены на 1063 белых крысах.

Приготовление гистологических препаратов

После вскрытия грудной клетки сердце выделяли путем пересечения сосудистого пучка, осушали с помощью фильтровальной бумаги, после чего взвешивали на торсионных весах. Фиксировали в жидкости Карнуа (70° этиловый спирт и уксусная кислота 3:1) в течение 12 часов при температуре 4°С (для последующего авторадиографического исследования). Препарат промывали в 3 сменах 70° спирта и помещали в 70° спирт не менее чем на 24 часа. Затем вдоль длинной оси делали разрез с таким расчетом, чтобы открылись 4 камеры сердца - оба предсердия и желудочка. Для проведения иммуногистохимического и цитологического исследования сердце фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина (рН 7,5), приготовленного на фосфатном буфере. Проводка по восходящей батарее спиртов и толуолов осуществлялась по общепринятой схеме. Препараты заключались в парафин (гистовакс). С использованием микротома МС-2 приготовлялись срезы толщиной 5-7 мкм.

Методика авторадиографии

Срезы монтировали на обезжиренные предметные стекла, депарафинировали в хлороформе и ксилоле и проводили по батарее спиртов нисходящей концентрации (100°, 96°, 70°). Для улучшения расправления и адгезии готовые стекла выдерживали в термостате при температуре 37°С не менее 24 часов. Затем срезы покрывали тонким слоем фотоэмульсии НИИХИМФОТО с использованием прямоугольной петли из металлической проволоки [Епифанова О.И., 1969; Епифанова О.И. и соавт., 1977]. Для этого эмульсию расплавляли в темноте при температуре 40°С в термостате с добавлением пластификатора и дистиллированной воды в соотношении 1:1. Препараты в светонепроницаемом ящике в условиях постоянной влажности (для чего в ящик помещался пакет с силикагелем) хранили в холодильнике при температуре 4-6°С. Время экспозиции определялось типом фотоэмульсии и составляло от 1 до 6 недель. Далее препараты обрабатывали проявителем Д 19

и фиксировали раствором тиосульфата натрия. Время проявления подбирали индивидуально для каждой партии препаратов. Стекла промывали в воде и окрашивали гематоксилином Лилли-Майера и эозином.

Для оценки ДНК-синтетической активности клеток миокарда проводили подсчет ИМЯ (%) и ИМ. Мечеными считались ядра, над которыми проецировались не менее 5 гранул серебра. Для определения ИМ подсчитывалось число треков на 1 ядро. В каждой из 5 зон миокарда (левом и правом предсердиях, левом и правом желудочках, межжелудочковой перегородке) для определения ИМЯ просчитывали не менее 1000 ядер кардиомиоцитов (ИМЯ - процентное соотношение ядер кардиомиощпов, имеющих не менее 5 гранул серебра). У 21- и 45-суточных животных, в связи с меньшими значениями ИМЯ, для его определения просматривали не менее 5000 ядер кардиомиоцитов. Для оценки ИМ подсчитывали количество гранул серебра не менее чем в 20 ядрах каждого отдела миокарда одного животного. Подсчет ИМЯ и ИМ проводился раздельно в мышечных и немышечных клетках миокарда, а также в эндотелии сосудов микроциркуляторного русла.

Анализ гистологических препаратов производился с использованием микроскопа Микмед-1, объектив 90х, окуляры 7х.

Исследование морфометрических показателей ядра и зон ядрышкового организатора (ЯОР) кардиомиоцитов

Срезы монтировали на предметные стекла, покрытые смесью глицерина и яичного белка для улучшения адгезии. Окраску проводили по методике, описанной в работах Мамаева Н.Н. и соавт. [1989] и Коржевского Д.Э. [1990], и адаптированной в нашей лаборатории. После депарафинирования срезы выдерживали 20 минут в 1% растворе муравьиной кислоты и переносили на 10 минут в дистиллированную воду. Затем под покровное стекло наносили гель из смеси 1 части желатины, приготовленной на 1% водном растворе муравьиной кислоты и 2 частей 50% водного раствора нитрата серебра. Выдерживали 10-15 минут в термостате при температуре 37°С, интенсивность реакции оценивали под контролем зрения, после чего промывали в дистиллированной воде. Исследование показателей зон ЯОР проводили на анализаторе изображения "МЕКОС - Ц" в интерактивном режиме. Использовался объектив 60х, окуляр 7х. В полуавтоматическом режиме оценивали площадь сечения ядра, количество и площадь сечения зон ЯОР, число и площадь гранул серебра в них - ДОТы, отношение площадей зон ЯОР и ядра.

Методика приготовления цитологических препаратов изолированных кардиомиоцитов

После длительной (не менее 2 недель) фиксации в 10% растворе нейтрального формалина на фосфатном буфере из левого желудочка вырезали участок массой 25-30 мг и помещали на 12 часов в 50% раствор КОН, после чего дважды промывали в дистиллированной воде при температуре 4-6°С. Затем в пробирку добавляли 2 мл дистиллированной воды и выдерживали в течение 4 часов, периодически помешивая стеклянной палочкой. Через 4 часа с

помощью микропипетки полученную суспензию наносили на предметное стекло и высушивали при комнатной температуре. Методика описана в работах Коган М.Е. и соавт. [1976] и Семеновой Л.А. и соавт. [1985].

Исследование содержания общего белка в кардиомиоцитах

Изучение содержания общего белка проводилось на окрашенных раствором амидочерного Б цитологических препаратах изолированных кардиомиоцитов. Данный гистохимический краситель окрашивает общие белки [Брумберг В.А., Певзнер Л.З., 1972; Schauenstein E. et al., 1980; Nohammer G., 1984]. 0,03% раствор амидочерного Б готовили по стандартной прописи на веронал-ацетатном буфере, рН 5,3. Стекла с изолированными методом щелочной диссоциации кардиомиоцитами помещали на 20 минут в раствор красителя, после чего промывали в дистиллированной воде и высушивали при комнатной температуре. Измерения проводили на анализаторе изображения "МЕКОС - Ц". Изучали площадь и периметр, среднюю и интегральную оптические плотности кардиомиоцитов. Измеряли не менее 50 мышечных клеток левого желудочка каждого животного. Средняя оптическая плотность характеризует концентрацию белка в цитоплазме кардиомиоцитов. Интегральная оптическая плотность является производной от 2 величин -концентрации белка и площади клетки, и тем самым характеризует содержание белка в клетках.

Оценка соотношения кардиомиоцитов с различным числом ядер

Мазки изолированных кардиомиоцитов окрашивали по Романовскому-Гимзе готовым красителем в разведении 1:20 в течение 5 минут, промывали в проточной воде и высушивали на воздухе. Методом сплошного подсчета оценивали процентное содержание кардиомиоцитов с одним, двумя, тремя и более ядрами. В каждом препарате исследовали не менее 1000 клеток.

Исследование объемных долей различных тканевых компонентов миокарда

После депарафинирования срезы окрашивали гематоксилином Вейгерта, промывали в водопроводной и дистиллированной воде, наносили на 1-2 минуты хромотроп 2В, приготовленный по стандартной прописи. Далее помещали в свежеприготовленный раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты на 5-10 секунд и промывали в дистиллированной воде 5-10 минут. Под контролем зрения срезы окрашивали водным голубым 5-7 секунд, промывали в водопроводной воде, заключали в бальзам. Для оценки объемных плотностей различных тканевых компонентов миокарда левого желудочка использовали 50-точечную окулярную вставку. Исследование проводили при окулярах 15х, объективе 90х. В каждом препарате проводили не менее 20 наложений сетки. Далее вычисляли процентное содержание паренхимы, стромы и сосудов в миокарде левого желудочка. В работах Непомнящих Л.М. [1981], Семеновой Л.А. и соавт. [1985], Непомнящих Л.М. и соавт. [1986], приводятся основные принципы оценки объемной плотности тканевых компонентов миокарда.

Методика иммуногистохимического окрашивания препаратов

Иммуногистохимическое окрашивание проводили по протоколу, рекомендуемому фирмой DAKO (Дания) и адаптированному в нашей лаборатории.

Протокол окраски непрямым пероксидазным методом

1. Для улучшения адгезии парафиновые срезы толщиной 5 мкм монтировали на стекла, предварительно обработанные в течение 5 минут 0,01% раствором поли-л-лизина (Poly-1-Lysine solution 0,01%, Sigma, USA) и высушенные в термостате при 56°С в течение часа. В части экспериментов применяли покрытые поли-л-лизином стекла заводского изготовления.

2. После стандартной процедуры депарафинирования в толуолах и спиртах срезы для восстановления антигенной структуры подвергали термической обработке в специальном растворе (Target Retrieval Solution, DAKO, Denmark) на водяной бане при температуре 95-97°С в течение 30 минут.

3. Стекла охлаждали до комнатной температуры, промывали 5 минут в дистиллированной воде.

4. Обрабатывали в течение 5 минут 3% раствором перекиси водорода для подавления эндогенной пероксидазы, после чего промывали в 3-х сменах 0,02 М фосфатного буфера рН 7,5 по 5 минут в каждой.

5. Наносили первичные антитела (DAKO, Denmark), инкубировали в течение 30 минут во влажной камере в термостате при 37°С, промывали в 3-х сменах 0,02 М фосфатного буфера рН 7,5 по 5 минут в каждой. В работе использовали разведенные, готовые к применению антитела к ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA, clone РС10), десмину (clone D33) и виментину (clone V9).

6. Наносили вторичные, биотинилированные антитела (Biotinylated Anti-Mouse, Anti-Rabbit, Anti-Goat Immunoglobulins, DAKO, Denmark), инкубировали 20 минут во влажной камере в термостате при 37°С, промывали в Зх сменах 0,02 М фосфатного буфера рН 7,5 по 5 минут в каждой.

7. Наносили стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена (Streptavidin Peroxidase Conjugated, DAKO, Denmark), инкубировали 20 минут во влажной камере в термостате при 37°С, промывали в 3-х сменах 0,02 М фосфатного буфера рН 7,5 по 5 минут в каждой.

8. Наносили 0,1% раствор диаминобензидина с добавлением 3% раствора перекиси водорода (DAB solution, DAKO, Denmark). Интенсивность окрашивания контролировали под микроскопом. После появления коричневого окрашивания срезы промывали в дистиллированной воде 5 минут, докрашивали гематоксилином, заключали в бальзам.

Подсчет числа меченных антителами к PCNA ядер производился аналогично описанному выше исследованию меченных тимидином ядер. При иммуногистохимическом выявлении виментина и десмина отмечается цитоплазматическая окраска клеток, в которых присутствуют эти белки промежуточных филаментов. Виментин является маркером клеток мезенхимального происхождения, в миокарде он окрашивает клетки интерстиция, эндотелия и гладкие миоциты сосудов. Оценивали процентное

соотношение всех ядер, располагающихся в виметин-позитивных клетках миокарда к общему числу ядер клеток миокарда левого желудочка.

Десмин присутствует в клетках миогенного происхождения - сердечных поперечно-полосатых и гладких миоцитах сосудов (применительно к миокарду). Подсчитывали процентное соотношение ядер, располагающихся в десмин-позитивных клетках миокарда (за исключением гладких миоцитов сосудов) к общему числу ядер клеток миокарда левого желудочка.

Оценка процессов апоптоза

Исследование концевых разрывов ДНК (TUNEL, in situ end-labeling of apoptotic DNA) проведено в г. Турку, Финляндия. Мы выражаем благодарность за помощь в проведении исследований Л.И. Пеллиниеми (лаборатория электронной микроскопии университета г. Турку, Финляндия, Laboratory of Electron Microscopy, University ofTurku, FIN-20520 Turku, Finland), И. Иокинен (департамент педиатрии университета Хельсинки, Финляндия (Department of Pediatrics, University of Helsinki, FIN-00290 Helsinki, Finland), E. Абдельвахид (департамент педиатрии и медицинских исследовательских лабораторий университета г. Турку, Финляндия (Department of Pediatrics and MediCity Research Laboratories, University ofTurku, FIN-20520 Turku, Finland).

Применяли методику, описанную в работе Billig H. и соавт. [1994]. После депарафинирования срезы обрабатывали протеиназой-К (Boehringer, Germany), промывали в дистиллированной воде и TdT буфере (Boehringer, Germany). Затем срезы инкубировали с терминальной трансферазой в присутствии АТФ во влажной камере в течение 1 часа, промывали в ТРИС буфере и инкубировали в течение 30 минут с блокирующим буфером. В течение 2 часов срезы выдерживали во влажной камере в присутствии антител к дигоксигенину, конъюгированных с щелочной фосфатазой. Последовательно промывали в ТРИС и фосфатазном буферах, наносили 5-бромо-4-хлоро-3-индолфосфат и после появления окраски промывали в ТРИС буфере [Abdelwahid E. et al., 1999; Abdelwahid E. et al., 2001]. Препараты докрашивали по Романовскому-Гимзе. В миокарде левого желудочка 7-дневных крыс оценивали процентное соотношения ядер кардиомиоцитов с признаками апоптоза.

Биохимические исследования

Изучение содержания катехоламинов в сердце проводили флюориметрическим методом [Меньшиков В.В., 1974]. Флюориметрическое исследование осуществляли с помощью спектрофлюориметра MPF-4 (HITACHI) и выражали в мкг/г свежей ткани.

Определение содержания белка в сердце проводили биуретовым методом [Покровский А.А., 1969]. После гомогенизации ткани в 0,9% растворе хлорида натрия и центрифугирования, в надосадочной жидкости определяли содержание общего белка с помощью набора реактивов фирмы «Biocon», Германия. Результат выражали в г%.

Методика статистической обработки полученных данных

Вычисление средней арифметической (М), ее ошибки (m) проводили в модуле Basic statistic программы Statistica 5.5. Сравнение этих показателей между подопытной и контрольной группами проводили с использованием t-критерия Стьюдента [Сепетлиев Д.А., 1968]. Считали, что достоверные различия показателей наблюдаются при р<0,05, а при р<0,1 имеется статистически значимая тенденция к изменению показателя.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Морфологическая характеристика миокарда крыс

С целью лучшего понимания морфогенетических свойств пептидных регуляторов гистогенеза, предварительно проведено исследование морфометрических параметров интактного миокарда в периоде новорожденности (7 дней), позднем молочном периоде (21 день) и предпубертатном периоде (45 дней), а также у половозрелых крыс. Эксперимент проведен на 73 животных.

Процессы пролиферации исследовались с использованием 2 методов -авторадиографически с применением меченного по тритию тимидина, а также иммуногистохимически с применением антител к РСКЛ. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

В сравнении с кардиомиоцитами на этом этапе онтогенеза большее число клеток интерстиция находится в синтетической фазе клеточного цикла, что характерно и для микрососудов - ИМЯ эндотелия микрососудистого русла левого желудочка составил 10,14+2,16%.

Количество ядер кардиомиоцитов с признаками концевых разрывов ДНК в миокарде левого желудочка составило 0,044+0,01%.

Оценка морфометрических параметров зон ЯОР проведена в миокарде левого желудочка. Количество их колеблется от 1 до 6 в одном ядре, в среднем составляет 2,47+0,21 (табл. 2). Аргентумпозитивные зоны ЯОР расположены, как правило, дискретно, в средней части ядра или ближе к кариолемме. На большом увеличении в структуре зон ЯОР можно различить более интенсивно окрашенные участки или гранулы, которые при компьютерном исследовании автоматически расценивались как ДОТы (от английского слова dot - точка).

Таблица 2

Морфометрические показатели миокарда крыс, М±т

Показатель 7-дневные 21-дневные 45-дневные Половозрелые

Суммарная площадь зон ЯОР, мкм2 2,50+0,1 1,9 ±0,02*| 2,73±0Л*| 3,97Ю,24*Т

Число зон ЯОР 2,4710,21 1,81±0,15*| 2,1±0,10 2,14+0,15

Площадь ядра, мкм2 34,11±1,33 35,83±1,49 38,12±2,64 53,1413,21*1

Суммарная площадь зон ЯОР/Площадь ядра 0,07±0,003 0,05±0,001*| 0,07±0,001*1 0,07±0,001

Средняя площадь зон ЯОР, мкм2 1,02+0,06 1,05±0,02 1,3±0,1*Т 1,86±0,13*Г

Число ДОТов 3,8010,04 4,21 ±0,61 4,03±0,06 3,35±0,42

Площадь ДОТа, мкм2 0,06+0,002 0,06±0,001 0,08±0,001*| 0,18±0,09

Периметр кардиомиоцита, мкм 139,22+5,14 181,54±б,72*| 243,78±19,63*Т 316,28125,85*1

Площадь кардиомиоцита, мкм2 689,84+52,72 1429,12±64,21*Т 2189,32±45,13*Т 3806,56196,58*Т

Интегральная оптическая плотность, усл.ед. 36,17±3,59 63,31±2,15*Т 96,51±6,57*Т 148,49±13,67*Т

Средняя оптическая плотность, усл.ед. 0,05+0,01 0,046±0,004 0,06±0,01 0,039±0,001*1

Мышечные волокна, % 37,3±2,86 53,52±3,18*Г 53,11±ЭД5 69,82±7,14*Т

Сосуды, % 30,6±3,4 22,57±1,19*| 21,70±1,56 13,3211,23*1

Строма, % 32,1±2,9 24,00±2,15П 25,32±1,23 16,8712,18*1

Примечание: * - р < 0,05 по сравнению с аналогичными показателями крыс предшествующего возрасного периода.

Изолированные после формалиновой фиксации кардиомиоциты имеют вытянутую, большей частью правильную форму. Цитолемма в местах вставочных дисков неровная, зубчатая. Часть кардиомиоцитов имеет 2-4 отростка цитоплазмы, обычно расположенные по длинной оси клетки, обеспечивающие контакт с соседними кардиомиоцитами в пределах одного мышечного волокна. Их морфометрические параметры представлены в таблице 2.

С целью дифференцировки тканевой принадлежности клеток миокарда обычно применяют иммуногистохимическую реакцию выявления промежуточных филаментов в клетках [Tamiolakis D. et al., 2001].

Окраска парафиновых срезов сердца 7-суточных крыс антителами к десмину выявила характерную картину его распределения. В желто-коричневый цвет окрашивалась цитоплазма кардиомиоцитов, отмечалась поперечно-полосатая исчерченность миофибрилл. Кроме того, окрашивались гладкие миоциты сосудов. Отсутствие окраски клеток стромы позволило провести оценку соотношения ядер паренхиматозных и соединительнотканных клеток. С учетом того, что при окраске антителами к десмину не всегда удается выявить места вставочных дисков, и, тем самым, произвести точный подсчет числа кардиомиоцитов, производили подсчет числа ядер, лежащих в пределах мышечного волокна, считая эти ядра ядрами кардиомиоцитов. Их количество составило 71,3+3,41% от всех ядер клеток миокарда левого желудочка.

К трехнедельному возрасту в миокарде крыс завершается становление автономной иннервации сердца [Большакова Г.Б., 1991], синтетические процессы практически полностью переключаются с обеспечения синтеза ДНК на синтез белка [Румянцев П.П., 1982; Engelmann G.L., Gerrity R.G., 1988]. После 20 дня жизни у крыс характеристики типов коллагена соответствуют взрослым крысам [Borg Т.К. et al., 1982]. Изучение пролиферативных процессов в кардиомиоцитах и клетках стромы выявило их достоверное снижение по сравнению с новорожденными животными (табл. 3).

Таблица 3

Индекс меченных ядер клеток миокарда 21-суточных крыс, М+m, %

Примечание: * - р < 0,05 по сравнению с аналогичными показателями 7-дневных крыс.

Обращает на себя внимание достоверное снижение суммарной площади зон ЯОР и их числа, а вследствие этого и отношения площадь зон ЯОР/площадь ядра у 21-дневных крыс при сравнении миокардом 7-суточных животных (табл. 2).

Иммуногистохимическая окраска гистологических срезов антителами к десмину и последующий подсчет количества ядер кардиомиоцитов, выявили в миокарде 61,63±2,96% ядер паренхиматозных клеток, что достоверно меньше чем у 7-дневных крыс (р<0,05). 45,14±2,56% ядер всех клеток миокарда левого желудочка отнесено нами к стромальным элементам.

Анализ показателей ДНК-синтетической активности клеток миокарда 45-дневных крыс (табл. 4) выявил дальнейшее прогрессивное снижение тимидинового индекса в кардиомиоцитах и интерстициальных клетках, достоверное по сравнению с 3-недельными крысами. Первично меченными 3Н-тимидином были 0,54±0,03% клеток эндотелия, достоверно меньше чем у 21-дневных животных (р<0,05).

Отмечается увеличение рада параметров зон ЯОР (табл. 2). Отношение площадь зон ЯОР/площадь ядра возросло.

При исследовании объемной плотности различных тканевых компонентов миокарда 45-дневных крыс не выявлено статистически значимых изменений при сравнении с 21-дневными животными.

Количество ядер в десмин-позитивных клетках составило 51,12±3,89%, что было статистически меньше, чем у крыс трехнедельного возраста (р<0,05). На долю виментин-позитивных клеток приходилось 53,49±3,46% ядер, что статистически не отличалось от 21-дневных животных (р>0,05).

Таблица 4

Примечание: * - р < 0,05 по сравнению с аналогичными показателями 21-дневных крыс.

Исследование ДНК-синтетической активности кардиомиоцитов (табл. 5) половозрелых крыс при однократном введении радиоактивного тимидина выявило его накопление в единичных ядрах кардиомиоцитов, что не позволило нам в связи с низкой величиной ИМЯ, с достаточной объективностью статистически охарактеризовать этот процесс. В клетках стромы тимидиновый индекс был значительно более высоким, что позволило провести подсчет числа меченых ядер.

Таблица 5

ИМЯ клеток миокарда половозрелых крыс, М±т,

Зона миокарда Клетки стромы, тимидиновый индекс, % Кардиомиоциты, РСЖ, %

Левое предсердие 0,02±0,001*1 0,64±0,02*1

Правое предсердие 0,02±0,002*1 0,58±0,01*1

Левый желудочек 0,014±0,001*1 0,61±0,01*1

Межжелудочковая перегородка 0,018±0,001*1 0,59±0,02

Правый желудочек 0,02±0,001*1 0,43±0,01*1

Примечание: * - р < 0,05 по сравнению с аналогичными показателями 45-дневных крыс.

Отмечается возрастание суммарной и средней площади зон ЯОР и площади ядра. Изменения достоверны при сравнении с 45-дневными животными. Размеры и интегральная оптическая плотность кардиомиоцитов достоверно возрастают, тогда как средняя оптическая плотность снижается при сравнении с 45-дневными животными (табл. 2). Объемная плотность мышечных волокон в миокарде левого желудочка возрастает, доля стромы достоверно снижается при сравнении с 45-дневными крысами (табл. 2).

Количество ядер, располагающихся в пределах мышечного волокна при окраске десмином (т.е. ядер кардиомиоцитов) составляет 39,23±2,45%. Количество ядер клеток стромы при окраске виментином составляет 63,68±5,32%. Снижение числа ядер десмин-позитивных кардиомиоцитов было достоверно при сравнении с 45-дневными крысами, возрастание числа ядер виментин-позитивных клеток было достоверным лишь при сравнении с 21-дневными животными.

Анализируя экспериментальные данные, можно сделать вывод об однонаправленном уменьшении активности включения 3Н-тимидина и интенсивности мечения антителами к PCNA клеточных элементов миокарда крыс с возрастом. Это касается как паренхиматозного, так и стромального компонентов миокарда. В проведенных нами исследованиях максимальные величины индексов меченых ядер (тимидинового и PCNA) отмечаются у 7-дневных крыс, затем наблюдается их постепенное снижение у животных позднего молочного и предпубертатного возраста. У половозрелых крыс встречаются единичные меченные 3Н-тимидином ядра кардиомиоцитов, что не дает возможности провести количественное изучение числа ДНК-синтезирующих ядер. Экспрессия PCNA во всех возрастных периодах характеризовалась более высокими цифрами, позволившими статистически оценить величину ИМЯ и у половозрелых крыс, которая была, например, в кардиомиоцитах левого желудочка в 46 раз меньше, чем у новорожденных животных. Таким образом, интенсивность экспрессии PCNA, является достоверным критерием выявления пролиферативного потенциала миокарда на различных этапах онтогенеза.

Число ядер в клетках, экспрессирующих десмин, у 7-дневных крыс составляет около 2/3 от общего числа ядер клеток миокарда. В дальнейшем отмечается снижение их числа при нарастании количества клеток,

экпрессирующих виментин, и у половозрелых крыс число ядер виментин-позитивных клеток в 1,6 раза больше, чем десмин-позитивных. Это свидетельствует о возрастании количества интерстициальных клеток в миокарде, и, соответственно, снижении процентного содержания ядер мышечных клеток.

Вместе с тем, исследование объемных плотностей тканевых компонентов с использованием 50-точечной сетки и 3-цветной окраски хромотропом 2В, которая позволяет дифференцировать мышечные и коллагеновые волокна, свидетельствует о возрастании доли мышечного компонента. Таким образом, увеличение размеров кардиомиоцитов вследствие накопления в них белка, опережает рост соединительнотканного компонента в процессах онтогенеза крыс. Основным стимулом к такому росту кардиомиоцитов является возрастающая нагрузка на сердце вследствие опережающего роста массы тела по сравнению с сердцем. Это подтверждается снижением индекса масса сердца/масса тела более чем в два раза (с 8,82±0,6 мг/г у 7-дневных крыс до 4,37+0,56 мг/ г у половозрелых).

Влияние эндотелина-1 на морфогенез миокарда крыс

Исследование влияния эндотелина-1 на гистологические параметры миокарда проведено с использованием дозы 100 мк/кг при введении с 2 по 6 сутки после рождения. Эксперимент проведен на 81 крысах.

При гистологическом исследовании поперечных срезов сердца, окрашенных гематоксилином-эозином, в желудочковом миокарде выявлялся спазм артериол и снижение кровенаполнения капилляров и венул, что является выражением его сосудосуживающих свойств, достаточно полно описанных в литературе [Гомазков О.А., 1999; Гомазков О.А., 2001; Okada M. et al., 2002].

Изучение величин экспрессии PCNA ядрами кардиомиоцитов в контрольной и экспериментальной группах не выявило достоверных различий, что совпадает с данными Е.Н. Сазоновой, изучавшей процессы синтеза ДНК при введении ЭТ-1 в аналогичной дозе с использованием меченного по тритию тимидина [Сазонова Е.Н. и соавт., 2000].

Количество ядер кардиомиоцитов с признаками апоптоза в миокарде левого желудочка составило в контроле 0,044+0,01%, в эксперименте оно достоверно увеличилось до 0,12+0,02% (р<0,05). Сведения о влиянии ЭТ-1 на процессы апоптоза в миокарде неоднозначны и во многом определяются дозой вводимого вещества. Описано как стимулирующее, так и угнетающее действие этого пептида [Hasegawa К. et al., 2001]. В нашем исследовании количество ядер с концевыми разрывами ДНК, характерными для апоптоза, было достоверно выше контрольных величин. Одним из возможных объяснений может быть активация процессов свободнорадикального окисления в сердце [Сазонова Е.Н. и соавт., 2000]. В условиях оксидантного стресса отмечается дисфункция митохондрий кардиомиоцитов, что сопровождается увеличенной экспрессией ЭТ-1 в сердце [Kakimura Y.et al., 2000] и активацией апоптоза мышечных клеток миокарда [Iwai-Kanai E. et al., 2001; Suzuki Y.J., 2003].

Изучение зон ядрышкового организатора выявило достоверное возрастание их числа (табл. 7). Размеры кардиомиоцитов и количество белка в

них статистически значимо увеличились. Периметр возрос на 13%, площадь на 30,4%, интегральная оптическая плотность на 34,4%. Исследование объемный плотностей различный тканевый компонентов миокарда левого желудочка выявило статистически достоверное снижение (на 18%) доли мвшечнвж волокон (табл. 7). Исследование процентного соотношения ядер клеток различной тканевой принадлежности не выявило статистически достоверных изменений - число ядер, отнесенный к кардиомиоцитам при окраске антителами к десмину, в контроле составило 69,85+4,11%, при введении эндотелина-1 - 65,33+3,64%.

Сравнительный подсчет числа первично меченный 3Н-тимидином ядер кардиомиоцитов у крыс 3-недельного возраста, которым в период новорожденности вводили эндотелии-1 в дозе 100 мкг/кг не вышвил статистически достоверных изменений в миокарде животных контрольной и подопытной групп. В то же время, в стромальном компоненте отмечено достоверное возрастание ИМЯ в 4 отделах миокарда (табл. 6). Интенсивность тимидиновой метки быша достоверно выше контрольный величин в ядрах клеток стромы левого предсердия (на 25,2%), левого желудочка (на 12,6%) и межжелудочковой перегородки (на 12,8%) (рис. 1).

Таблица 6

Влияние пятикратного введения эндотелина-1 новорожденным крысам на индекс меченный 3Н-тимидином ядер клеток миокарда 21-суточныж животнык, М±т, %_

Зона миокарда Кардиомиоциты Клетки стромы

Контроль Эндотелии Контроль Эндотелии

Левое предсердие 0,23±0,03 0,29±0,02 1,32±0,07 1,68±0,14*Т

Правое предсердие 0,19±0,021 0,21±0,02 1,38±0,02 1,82±0,09*Т

Левый желудочек 0,23±0,02 0,22±0,018 1,37±0,21 2,01±0,13*1

Межжелудочковая перегородка 0,28±0,017 0,26±0,021 1,49±0,15 1,96±0,11*|

Правый желудочек 0,21 ±0,02 0,24±0,02 1,27±0,1 1,42±0ДЗ

Примечание: * - р < 0,05 по отношению к контролю.

Тимидиновый индекс меченыж ядер эндотелия сосудов миокарда левого желудочка подопы тны х кры с достоверно превы шал контрольны й уровень и составил 1,39±0,14 % в контроле, в эксперименте - 1,82±0,11% (р<0,05).

Кроме достоверного возрастания числа зон ЯОР (на 26,5%), что носило однонаправленный характер при сравнении с новорожденны ми кры сятами, через 15 дней после заключительной инъекции пептида отмечалось статистически достоверное увеличение суммарной площади зон ЯОР на 26,8% и числа ДОТов на 9,1%. Размеры и содержание белка в кардиомиоцитах 3-недельнык животнык, получавших ЭТ-1, достоверно превышали контрольные величины. Периметр кардиомиоцитов возрос на 11,6%, площадь - на 17,3%, интегральная оптическая плотность - на 34,6% (табл. 7).

Помимо достоверного снижения доли мы шечной ткани, что бы ло сходным с эффектом введения ЭТ-1 у новорожденный крысят, через 15 дней после окончания экспериментального воздействия объемная доля стромы бы ла

увеличена. Это подтверждается исследованием соотношения числа ядер клеток, экспрессирующих десмин и виментин. Отмечается достоверное снижение числа ядер десмин-позитивных (на 9,5%) и возрастание (на 20,9%) количества виментин-позитивных клеток в миокарде при введении эндотелина-1 (рис. 2).

Рис. 1. Влияние пятикратного введения эндотелина-1 новорожденным крысам на ИМ в клетках стромы 21-суточных животных, М±т. * - изменения достоверны по отношению к контролю, р < 0,05.

Рис. 2. Влияние пятикратного введения эндогелина-1 новорожденным крысам на изменение числа ядер виментин-позитивных и десмин-позитивных клеток в миокарде 21-суточных животных, М±m, %.*- изменения достоверны по отношению к контролю, р < 0,05.

Через 39 дней после введения ЭТ-1 новорожденным крысам отмечалось отсутствие изменений пролиферативной активности кардиомиоцитов, исследовавшейся с применением меченного по тритию тимидина и иммуногистохимическим выявлением ядер, экспрессирующих РСКЛ. Количество клеток стромы, синтезирующих ДНК, было достоверно выше правом желудочке подопытных крыс на 37,8% по сравнению с контрольными животными (0,45±0,03 % в контроле и 0,62±0,07% в эксперименте).

Интегральная оптическая плотность кардиомиоцитов, окрашенных амидочерным 10 Б, оставалась статистически повышенной (на 25,4%) (табл. 7).

601 5040% 3020100

Виментин Десмин

Рис. 3. Влияние пятикратного введения эндотелина-1 новорожденным крысам на изменение числа ядер виментин-позитивных и десмин-позитивных клеток в миокарде 45-суточных животных, М±т, %. * - изменения достоверны по отношению к контролю, р < 0,05.

Отмечается достоверное возрастание на 10% количества ядер виментин-позитивных клеток (рис. 3) в миокарде при введении эндотелина-1. Это сопровождается возрастанием доли стромы на 16,7% (табл. 7).

Пятикратное введение ЭТ-1 в дозе 10 мг/кг массы тела половозрелым крысам способствовало достоверному возрастанию синтеза ДНК в клетках интерстиция при неизмененных показателях ИМЯ РСКЛ в кардиомиоцитах (табл. 8).

Влияние введения ЭТ-1 на морфологические показатели миокарда белых крыс, М+m

Таблица 7

Показатель 7-дневные 21-дневные 45-дневные Половозрелые

Контр. ЭТ-1 Контр. ЭТ-1 Контр. ЭТ-1 Контр. ЭТ-1

Суммарная площадь зон ЯОР, мкм2 2,59 ±0,09 2,74 ±0,2 1,64 ±0,11 2,08 ±0,16*Г 2,83 ±0,11 2,94 ±0,22 3,44 +0,21 2,79 ±0,09*1

Число зон ЯОР 2,47 ±0,05 2,69 ±0,08*| 1,62 ±0,03 2,05 ±0,05*| 2,21 ±0,08 2,15 ±0,12 2,49 ±0,10 2,05 ±0,06*1

Число ДОТов 3,8 ±0,04 3,69 ±0,07 3,51 ±0,1 3,83 ±0,09*| 4,15 ±0,08 4,23 ±0,1 4,5 ±0,08 4,65 ±0,11

Периметр кардиомиоцита, мкм 142,72 ±5,4 161,23 ±3,87*1 198,46 ±4,16 221,48 ±7,15*| 261,13 +21,18 289,64 ±31,22 252,03 ±8,63 254,87 +22,55

Площадь кардиомиоцита, мкм* 685,75 ±57,32 894,17 ±31,94*| 1655,75 ±55,56 1942,87 ±114,21*1 2223,65 ±35,32 2439,15 ±144,83 2005,1 ±348,9 2430,7 ±465,3

Интегральная оптическая плотность, усл.ед. 29,13 ±2,75 39,16 ±3,35*1 60,39 ±3,68 81,27 ±6,97*| 138,66 ±13,41 173,94 ±7,94*| 252,06 ±27,55 230,98 ±12,81

Мышечные волокна, % 36,15 ±2,01 29,64 ±2,14*| 44,18 ±1,41 40,15 ±1,19*1 55,18 ±6,33 53,33 ±4,14 70,65 ±2,09 64,31 ±2,03*1

Строма, % 34,9 ±2,56 36,48 ±3,07 25,21 ±1,21 28,97 ±1,25*| 25,04 ±1,32 29,23 ±1,39*1' 16,89 ±1,20 20,28 ±0,87*|

* - изменения достоверны по отношению к контролю, р < 0,05.

В эндотелии микроциркуляторных сосудов наблюдалось достоверное возрастание величины тимидинового ИМЯ при введении ЭТ-1 (р<0,05). В контроле ИМЯ составил 0,25±0,02%, в эксперименте - 0,46±0,03%.

Таблица 8

Влияние введения эндотелина-1 на ИМЯ клеток миокарда половозрелых крыс, М±m, % _

Зона миокарда Кардиомиоциты, РСЫА Клетки стромы, 3Н-тимидин

Контроль Эндотелии-1 Контроль Эндотелии-1

Левое предсердие 0,56±0,10 0,48±0,11 0,021±0,002 0,04±0,01

Правое предсердие 0,47±0,09 0,36±0,08 0,033±0,002 0,059±0,003*Т

Левый желудочек 0,73±0,16 0,51±0,02 0,032±0,001 0,046±0,002*|

Межжелудочковая перегородка 0,61±0,18 0,57±0,07 0,02±0,006 0,067±0,003*Т

Правый желудочек 0,52±0,14 0,61±0,20 0,026±0,008 0,053±0,001*|

Примечание: * - изменения достоверны по отношению к контролю, р <

0,05.

68,64*

70-] 605040%

3020100-

Виментин Десмин

Рис. 4. Влияние пятикратного введения эндотелина-1 на изменение числа ядер десмин-позитивных и виментин-позитивных клеток в миокарде половозрелых крыс, М±m, %. * - изменения достоверны по отношению к контролю, р < 0,05.

При оценке параметров активности зон ЛОР отмечено достоверное снижение площади (на 18,9%) и числа зон ЯОР (на 17,7%). Размеры

кардиомиоцитов и содержание в них белка не претерпевали статистически достоверных изменений (табл. 7). Доля мышечного компонента при введении ЭТ-1 статистически достоверно снижалась (на 9%), доля стромы возрастала (на 20%) (табл. 7). Кроме того, в миокарде левого желудочка отмечено достоверное снижение числа ядер десмин-позитивных клеток (на 16,9%) и возрастание виментин-позитивных клеток (на 14,4%) (рис. 4).

Таким образом, инъекции ЭТ в один из критических периодов кардиомиогенеза - периоде новорожденности, способствовали включению механизмов долгосрочного закрепления морфологических изменений в миокарде.

В различные периоды онтогенеза ответные реакции на экзогенный ЭТ могут претерпевать прямо противоположные изменения. ЭТ-1 обладаег положительным инотропным действием на изолированные неонатальные кардиомиоциты, тогда как у взрослых мышей - отрицательным [Sekine T. et al., 1999].

Характер направленности морфогенетической активности ЭТ во многом определяется дозой вводимого пептида. В экспериментах, выполненных в ЦНИЛ ДВГМУ, однократное и пятикратное введение ЭТ-1 в дозе 10 мкг/кг новорожденным крысам способствовало активации процессов синтеза ДНК в миокарде [Сазонова Е.Н. и соавт., 2000], при отсутствии подобных изменений при введении пептида в дозе 100 мкг/кг [Тимошин С.С. и соавт., 2000].

Эффект ЭТ на миокард может осуществляться через изменение в системе ПОЛ-АОЗ [Сазонова Е.Н. и соавт., 2000]. В реализацию морфогенетического эффекта ЭТ-1 вовлечены NO-зависимые механизмы [Лебедько О .А. и соавт., 2002; Лебедько О.А., 2004].

В проведенных нами экспериментах ЭТ-1 вводился повторно. В этих условиях возможно включение механизмов обратной связи регуляции продукции, рецепции и метаболизма ЭТ-1. Введение ЭТ-1 приводит к быстрому уменьшению числа ЭТА рецепторов [Drimal J. et al., 1999]. ЭТ способен подавлять экспрессию мРНК ЭТ-конвертирующего фермента и, тем самым, саморегулировать свое выделение [Гомазков ОА, 1999, 2001]. В гепатоцитах отмечена положительная обратная связь - введение экзогенного эндотелина стимулирует синтез эндогенного пептида [Shao R., Rockey D.C., 2002].

Влияние ангиотензина-Н на морфогенез миокарда крыс

Физиологическим синергистом ЭТ-1 в отношении регуляции функциональной активности сердечно-сосудистой системы является ангиотензин-И, который активно участвует в морфогенезе сердца. А-П может оказывать на сердечно-сосудистую систему системное влияние, а также действовать ауто- и паракринно, синтезируясь непосредственно в кардиомиоцитах. В культуре кардиомиоцитов, а также in vivo, введение А-П способствует активации синтеза ДНК и белка [Ikeda Y. et al., 2000; Kawano H. et al., 2000; Paradis P. et al., 2000; Животова Е.Ю., 2001; Warnecke С et al., 2001; Zhang S.Q. et al., 2004].

Исследование влияния ангиотензина-П на гистологические параметры миокарда крыс проведено с использованием дозы 100 мк/кг. Эксперимент проведен на 151 крысе.

Процессы синтеза ДНК в данной серии экспериментов исследовали с применением иммуногистохимического метода выявления РСКЛ. Результаты представлены в табл. 9. В миокарде левого желудочка и межжелудочковой перегородки отмечено статистически значимое возрастание величины ИМЯ. Увеличение составило 28,4% и 23,9%, соответственно.

Исследование морфометрических параметров зон ЯОР позволяет сделать вывод об активации транскрипционной активности зон ЯОР, о чем свидетельствует возрастание на 24,3% суммарной площади зон ЯОР, а также на 13,8% их числа (табл. 10).

Таблица 9

Влияние пятикратного введения ангиотензина-11 на индекс меченных

антителами к РСКЛ ядер кардиом] иоцитов 7-суточных крыс, М±т

Зона миокарда Контроль Ангиотензин-Н

Левое предсердие 30,21±1,58 33,4912,17

Правое предсердие 28,45±1,69 32,91±2,54

Левый желудочек 27,36±1,07 35,14±3,04*Т

Межжелудочковая перегородка 28,97±2,31 35^8±2,11*Т

Правый желудочек 26,39±2,03 30,21+1,97

Примечание: * - р < 0,05 по отношению к контролю.

Количество и концентрация белка в кардиомиоцитах не претерпели статистически достоверных изменений, однако, площадь кардиомиоцитов была увеличена на 27,1% (табл. 10) (р<0,05 по сравнению с контролем).

Исследование объемных плотностей основных тканевых компонентов миокарда левого желудочка выявило достоверное увеличение доли стромального компонента. Число ядер, отнесенных к кардиомиоцитам при окраске десмином, в контроле составило 69,85±4,11%, при введении ангиотензина-И - 60,04±2,07%, что статистически достоверно ниже (р<0,05).

Величина инкорпорации радиоактивного предшественника ДНК в ядрах кардиомиоцитов 21-дневных крыс, получавших в период новорожденности А-II, не претерпевала статистически достоверных изменений. В миокарде левого предсердия достоверно большее число ядер клеток соединительной ткани находились в синтетической фазе клеточного цикла (тимидиновый ИМЯ в контроле составил 1,32±0,07%, в эксперименте 1,89±0,01%, р<0,05) при неизмененных показателях длительности синтеза ДНК. Тимидиновый индекс меченых ядер эндотелия сосудов в контроле составил 1,39±0,14%, в эксперименте - 1,42±0,13%, что не имеет достоверных отличий.

Ядра кардиомиоцитов 21-дневных крыс, как и новорожденных животных, содержали достоверно большее (на 24%) число зон ЯОР в сравнении с контрольными величинами (табл. 10).

Пятикратное введение ангиотензина-П на первой постнатальной неделе способствовало увеличению размеров изолированных клеток паренхимы

миокарда животных трехнедельного возраста. Площадь клеток возросла на 12,7%, периметр - на 8,9% (табл. 10).

Помимо увеличения доли стромального компонента на 33,6%, наблюдавшегося и у новорожденных крыс, в данном эксперименте отмечено достоверное снижение объемной плотности мышечного компонента миокарда левого желудочка на 14,7% (табл. 10).

Число ядер, располагающихся в окрашенных антителами к виментину клетках миокарда крыс подопытной группы статистически значимо превышало контрольные показатели (рис. 5). Увеличение составило 17%.

У 45-дневных животных, которым в период новорожденности инъецировали А-11 не отмечено достоверных изменений изучаемых морфологических показателей миокарда (табл. 10).

Введение ангиотензина-И половозрелым крысам при стабильных показателях синтеза ДНК в кардиомиоцитах, способствовало активации синтеза ДНК в клетках стромы миокарда (табл. 11). При этом увеличение ИМЯ отмечалось во всех зонах, за исключением левого предсердия. Максимальная активизация наблюдалась в межжелудочковой перегородке (более чем в 3 раза).

Рис. 5. Влияние пятикратного введения ангиотензина-11 новорожденным крысам на изменение числа ядер виментин-позитивных и десмин-позитивных клеток в миокарде 21-суточных животных, М±т, %. * - изменения достоверны по отношению к контролю, р < 0,05.

Влияние введения А-П на морфологические показатели миокарда белых крыс, М±m

Таблица 10

Показатель 7-дневные 21-дневные 45-дневные Половозрелые

Контр. А-И Контр. А-И Контр. А-И Контр. А-П

Суммарная площадь зон ЯОР, мкм2 2,59 ±0,09 3,22 ±0,22*Т 1,64 ±0,11 1,75 ±0,12 2,83 ±0,11 2,61 ±0,19 3,31 ±0,33 4,51 ±0,43*Т

Число зон ЯОР 2,47 ±0,05 2,81 ±0,1*Т 1,62 ±0,03 2,01 ±0,09*? 2,21 ±0,08 2,21 ±0,06 2,54 ±0,14 3,84 ±0,24*Т

Периметр кардиомиоцита, мкм 142,72 ±5,4 155,32 ±4,42 198,46 ±4,16 216,12 ±5,0*1 261,13 ±21,18 248,25 ±21,89 302,56 ±10,34 322,49 ±8,86

Площадь кардиомиоцита, мкм'' 685,75 ±57,32 871,72 ±54,09*| 1655,75 ±55,56 1866,22 ±76,04*1 2223,65 ±35,32 2114,6 ±61,68 3700,6 ±168,82 3886,21 ±179,38

Интегральная оптическая плотность, усл.ед. 29,13 ±2,75 27,84 ±2,56 60,39 ±3,68 66,61 ±3,15 138,66 ±13,41 126,21 ±10,38 102,88 ±14,81 168,48 ±20,78*|

Средняя оптическая плотность, усл.ед. 0,04 ±0,003 0,03 ±0,006 0,05 ±0,009 0,046 ±0,002 0,05 ±0,008 0,04 ±0,001 0,027 ±0,005 0,046 ±0,006*Т

Мышечные волокна, % 36,2 ±2,54 31,9 ±2,61 44,18 ±1,41 37,68 ±2,58*4 55,18 ±6,33 53,88 ±4,12 67,24 ±2,61 58,64 ±3,02*4

Строма, % 34,9 ±2,78 42,6 ±2,15*1 25,21 ±1,21 33,69 ±2,83*| 25,04 ±1,32 27,65 ±1,86 18,52 ±1,72 26,18 ±1,92*1

Примечание: * - р < 0,05 по отношению к контролю.

ы о

Исследование функциональной активности зон ЛОР, оцениваемое с использованием геометрических и текстурный параметров, вышвило достоверное увеличение площади (на 36,3%) и числа зон ЯОР (на 51,2%) в кардиомиоцитах левого желудочка, что представлено в табл. 10. Отмечалось возрастание содержания белка на 63,8%, а также концентрации общего белка в клетках на 70,4%. Как и при введении ангиотензина-11 новорожденным крысам, у половозрелый животнык отмечалось возрастание объемной плотности соединительной ткани (на 41,4%) при снижении доли мышечного компартмента миокарда (на 12,8%) (табл. 10).

Таблица 11

Влияние пятикратного введения ангиотензина-П на пролиферативные процессы в клетках миокарда половозрелых белык крыс, М±т, %_

Зона миокарда Кардиомиоциты, ИМЯ, PCNA Клетки стромы, ИМЯ, 3Н-тимидин

Контроль A-II Контроль А-И

Левое предсердие 0,37±0,08 0,62±0,18 0,02±0,002 0,017±0,002

Правое предсердие 0,54±0,1 0,51±0,11 0,03±0,003 0,07±0,004*t

Левый желудочек 0,63±0,06 0,64±0,20 0,03±0,008 0,058±0,004*î

Межжелудочковая перегородка 0,60±0,12 0,57±0,15 0,02±0,003 0,062±0,003*t

Правый желудочек 0,51 ±0,1 0,48±0,12 0,022±0,008 0,044±0,005*t

Примечание: * - р < 0,05 по отношению к контролю.

Результаты иммуногистохимического исследования миокарда левого желудочка подтверждают это положение. Статистически достоверное увеличение виментин-позитивным клеток (на 18,1%) сопровождалось снижением десмин-положительного материала (на 17%) (рис. 6).

Действие ангиотензина-И может опосредоваться не только прямым влиянием на кардиомиоциты. Рецепторы А-П располагаются непосредственно на кардиомиоцитах, а также на интра- и эктракардиальнык нейронах и симпатических терминалях в сердце и модулируют высвобождение норадреналина и захват метил-3Н-холина [Lee Y.A., Lindpaintner К., 1993; Marchant E.G., Mistlberger R.E., 1995; Horackova M., Armour J.A., 1997; Nakamura Y. et al., 1999; Matsusaka T. et al., 1999; Seyedi N. et al., 2002]. В эндотелиальнык клетках сердца ангиотензин-П индуцирует накопление ТФР р1 [Chua C.C. et al., 1994], повышает чувствительность миофиламентов к Са++ [Ikenouchi H. et al., 1994], индуцирует высвобождение арахидоновой кислоты [Lokuta A.J. et al., 1994], существенно уменьшает содержание NO в неонатальнык кардиомиоцитах [Fu S.G. et al., 2000].

В отдельном эксперименте исследовано энтеральное, с использованием желудочного зонда, введение эднита (эналаприла) в дозе 10 мг/кг и лозартана (козаара) в аналогичной дозе на морфометрические показатели миокарда половозрелый крыс. Опыпы проведены на 29 животныж.

В миокарде животнык, которым перорально вводили эднит не бышо отмечено достовернык изменений изучаемых показателей. Вместе с тем, у крыс, получавших лозартан, отмечалось статистически значимое снижение

площади зон ЯОР на 18,3% (1,78±0,08 мкм2) при сравнении с интактной группой животных (2,18±0,12 мкм2).

Возможным объяснением полученных эффектов, на наш взгляд может служить различие механизмов действия этих препаратов. Известно, что А-П, помимо участия АПФ, может образовываться при помощи других ферментов, например химазы. Поэтому блокада АПФ и последующее компенсаторное возрастание концентрации ангиотензина-1 в плазме может приводить к включению других механизмов его процессинга и обуславливать развитие толерантности к ингибиторам АПФ [ЛитоП М.С., .ТиНаМ 1.М., 2001]. Химазный путь образования А-П, например, принимает участие в пролиферативном ответе гладких миоцитов сосудов [КвЫто1о М. Ы а1., 2001]. Поэтому, на наш взгляд, блокада рецепторов ангиотензина оказывает более выраженное морфогенетическое действие на миокард.

0-|-,-

Виментин Десмин

Рис. 6. Влияние пятикратного введения ангиотензина-И на изменение числа ядер десмин-позитивных и виментин-позитивных клеток в миокарде половозрелых крыс, М±т, %. * - изменения достоверны по отношению к контролю, р < 0,05.

Влияние АНП-2 на морфогенез миокарда крыс

Система натрийуретических пептидов в функциональном плане проявляет антагонистические свойства по отношению к эндотелиновой и ангиотензиновой системам [Johnston C.I. et al., 1990]. Это справедливо и для

морфогенетических свойств АНП в отношении гладких миоцитов сосудов, надпочечников, лимфоцитов, клеток ЦНС и ряда других клеточных популяций [Furuya M. et al., 1993; Neuser D. et al., 1993; Doi K. et al, 1997; Markeiink-Van Ittersum M. et al, 1997; Vollmar A.M., 1997; Hamad A.M. et al., 1999; Dong M.Q. et al, 2000].

Эксперименты проведены на 83 крысах. Пятикратное введение АНП-2 новорожденным животным в дозе 100 мкг/кг не приводило к статистически достоверным изменениям ДНК-синтетической активности кардиомиоцитов, клеток стромы и эндотелиоцитов 3-недельных крыс, оцениваемой по интенсивности инкорпорации меченного по тритию тимидина, а также при изучении экспрессии PCNA.

При исследовании морфометрических параметров зон ЯОР обращает на себя внимание достоверное снижение (на 16%) их площади (табл. 12). Размеры кардиомиоцитов и содержание в них белка не претерпевали статистически значимых изменений.

Таблица 12

Влияние пятикратного введения АНП-2 новорожденным крысам на морфометрические показатели кардиомиоцитов левого желудочка 21-суточных животных, М±т _

Показатель Контроль АНП-2

Суммарная площадь зон ЯОР, мкм2 1,69±0,1 1,4210,06*1

Число зон ЯОР 1,81 ±0,06 1,72±0,08

Суммарная площадь зон ЯОР/Площадь ядра 0,05±0,003 0,05±0,002

Средняя площадь зон ЯОР, мкм2 0,99±0,06 0,92±0,06

Число ДОТов ' 3,48+0,14 3,42±0,13

Площадь ДОТа, мкм2 0,06±0,002 0,06±0,002

Периметр кардиомиоцита, мкм 184,66±4,16 177,88±2,36

Площадь кардиомиоцита, мкм2 1248,0+51,76 1135,49±30,99

Интегральная оптическая плотность, усл.ед. 42,17±8,08 44,6217,28

Средняя оптическая плотность, усл.ед. 0,036±0,007 0,04210,006

Примечание: * - р < 0,05 по отношению к контролю.

У 4 5-дневных животных нами не отмечено статистически значимых изменений морфометрических параметров миокарда при сравнении с контрольными крысами.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что введение АНП крысам в период новорожденности способно индуцировать ряд долгосрочных изменений морфогенеза миокарда, и что эти изменения в отношении транскрипционной активности кардиомиоцитов противоположны влиянию ангиотензина-И и эндотелина-1.

Влияние агонистов ц-опиатных рецепторов на морфогенез миокарда

крыс

Эксперименты проведены на 296 крысах. Селективный агонист Ц-ОР, синтетический аналог дерморфина, тетрапептид А10 вводился пятикратно в дозе 100 мкг/кг массы тела.

Достоверных изменений тимидинового индекса кардиомиоцитов при введении тетрапептида А10 не произошло. В то же время наблюдалось статистически значимое возрастание ИМ (рис. 7), что отражает ускорение процессов синтеза ДНК во всех исследованных отделах миокарда.

Повторное введение тетрапептида А10 способствовало достоверному увеличению числа ДНК-синтезирующих ядер стромальных клеток левого желудочка на 54,4% (в контроле величина ИМЯ составила 7,69± 1,28%, в эксперименте 11,87+1,09%, р<0,05) и межжелудочковой перегородки на 39,6% (7,9±1,03% и 11,03±1,06% соответственно, р<0,05).

Введение тетрапептида А10 способствовало достоверному снижению средней площади зон ЯОР (0,7310,04 мкм2 контроле и 0,44±0,006 мкм2 в эксперименте, р<0,05).

25.0-1 20.0-

15.0-

ИМ

10.05.000-1-1-1-1-!-1

лп пп лж мжп пж

Рис. 7. Влияние пятикратного введения тетрапептида А10 на ИМ кардиомиоцитов новорожденных крыс, М±т. *- р < 0,05 по отношению к контрольной группе животных.

Изучение показателей ДНК-синтетической активности клеток миокарда при двукратном введении 3Н-тимидина у животных 24-дневного возраста,

которым инъецировали тетрапептид А10 в период новорожденности, не выявило достоверных изменений.

Вместе с тем, отмечалось статистически значимое возрастание числа (на 20,8%) и суммарной площади (на 16,5%) зон ЯОР кардиомиоцитов (в контроле эти показатели составили 2,4±0,18 мкм2 и 1,76±0,05, в эксперименте 2,9±0,13 мкм2и 2,05±0,04 соответственно, р<0,05).

21-дневное введение тетрапептида А10 половозрелым крысам в дозе 100 мкг/кг при стабильных показателях пролиферации в кардиомиоцитах способствовало активации синтеза ДНК в клетках стромы, а также числа зон ЯОР. Кроме того, отмечено достоверное возрастание концентрации белка в кардиомиоцитах (средней оптической плотности), при сравнении с контрольными (на 46,7%) и интактными животными (на 63%) (табл. 13).

Эти изменения не сопровождались достоверным изменением числа клеточных элементов и соотношения объемных плотностей различных тканевых компонентов миокарда. Концентрация адреналина в сердце возросла в 2,7 раза, норадреналина - в 7,3, ДОФА - в 8 раз при сравнении контрольной и экспериментальной групп (табл. 13).

Таблица 13

Влияние хронического введения тетрапептида А10 на морфологические и биохимические показатели миокарда половозрелых крыс, М±m_

Зона миокарда Интакгные Контроль А10

Левое предсердие, ИМЯ, РС^, % 0,015±0,001 0,017±0,002 0,022±0,001*4|

Правое предсердие, ИМЯ, РСЫА, % 0,017±0,001 0,018±0,002 0,023±0,002*Т

Левый желудочек, ИМЯ, РСЫА, % 0,02±0,001 0,018±0,001 0,041±0,002**Т

Межжелудочковая перегородка, ИМЯ, РСЫА, % 0,016±0,001 0,018±0,001 0,035±0,003*'|

Правый желудочек, ИМЯ, РСКА, % 0,019±0,002 0,017±0,002 0,023±0,003

Число зон ЯОР 2,17±0,11 2,0±0,07 2,42±0,11*Г

Интегральная оптическая плотность, усл.ед. 108,84±16,3 98,33±9,9 146,7б±15,82*|

Средняя оптическая плотность, усл.ед. 0,027±0,004 0,03±0,003 0,044±0,004*'Т

Адреналин, мкг/г 0,18±0,02 0,23 ±0,02 0,62±0Д*'Т

Норадреналин, мкг/г 0,25±0,07 0,31±0,05 2,26±0,49*'|

ДОФА, мкг/г 0,02±0,003 0,03±0,005 0,24±0,06**Т

Примечание: * - изменения достоверны по отношению к контролю, р <

0,05.

* - изменения достоверны по отношению к интактным, р < 0,05

Исследование показателей ДНК-синтетической активности в миокарде новорожденных крыс при пятикратном введении агониста Ц-ОР ДАГО,

выявило сходные с наблюдавшимися при введении тетрапептида А10, результаты. Не отмечалось достоверных изменений числа ядер кардиомиоцитов, синтезирующих ДНК. Вместе с тем, произошло увеличение интенсивности метки во всех исследованных отделах миокарда в среднем на 37%. Максимальным оно было в правом желудочке - на 39,9%, минимальным -на 32,5% - в правом предсердии (табл. 14).

При пятикратном введении ДАГО в клетках стромы миокарда количество ядер, синтезирующих ДНК не отличалось от контрольных величин, в левом и правом желудочках произошло статистически значимое возрастание величины ИМ (на 36,7% и 35,6% соответственно) (величины ИМ составили в контроле 18,28±2,21 и 17,63±2,16, в эксперименте 24,98±2,03 и 23,91±1,67 соответственно).

Таблица 14

Влияние пятикратного введения ДАГО на показатели синтеза ДНК в кардиомиоцитах новорожденных крыс при введении 3Н-тимидина, М±т.

Примечание: * - р < 0,05 - по отношению к контролю.

Возрастание суммарной площади зон ЯОР (на 50,5%) и их числа (на 48,5%) способствовало достоверному увеличению отношения площадь зон ЯОР/площадь ядра (на 42,9%) в кардиомиоцитах 7-дневных крыс. Активация зон ЯОР сочеталась с достоверным увеличением суммарного содержания белка (интегральной оптической плотности) в кардиомиоцитах на 27,3% при неизмененной концентрации белка в клетке (средней оптической плотности) (табл. 15).

Статистически значимых изменений доли различных тканевых компартментов миокарда при повторных инъекциях агониста ДАГО не

произошло.

Стимуляция ДНК-синтетических процессов, наблюдаемая в остром эксперименте у 7-дневных крыс через 2 недели нивелировалась, и у животных экспериментальной группы статистически не отличалась от контрольной.

Вместе с тем, через 2 недели после прекращения введения агониста сохранялась активация зон ЯОР (табл. 15). В ядрах кардиомиоцитов выявлялось достоверно большая (на 24,9%) площадь аргентум-позитивных зон, чем у подопытных крыс. Кроме того, площадь ДОТа достоверно возрастала (на 16,7%). Кардиомиоциты животных, которым в период новорожденности вводили ДАГО, у 3-х недельных крыс содержали достоверно большее количество белка (на 68,7%), их размеры превышали площадь (на 21,4%) и

периметр (на 11,4%) паренхиматозных клеток миокарда животных, получавших 0,9% раствор хлорида натрия (табл. 15).

Исследование показателей ДНК-синтетической активности кардиомиоцитов и клеток стромы 45-дневных крыс с применением авторадиографии и иммуногистохимически не выявило статистически значимых изменений этих величин. Изучение геометрических и текстурных параметров зон ЯОР выявило увеличенное количество зон ЯОР у животных экспериментальной группы. Увеличение составило 21,7% (2,03±0,13 в контроле, 2,47±0,1 в эксперименте, р<0,05).

Пятикратные инъекции новорожденным крысам казоморфина-7 в дозе 1 мг/кг способствовали достоверному возрастанию у животных 3-недельного возраста числа зон ЯОР в ядрах кардиомиоцитов (1,81±0,06 в контроле и 2,1±0,07 в эксперименте), а также интегральной оптической плотности кардиомиоцитов, окрашенных амидочерным Б (42,17±8,08 усл. ед. в контроле и 70,87±8,68 усл. ед. в эксперименте).

Таблица 15

Влияние пятикратного введения ДАГО на морфометрические показатели кардиомиоцитов левого желудочка крыс, М±m__

Показатель 7-суточные крысы 21-суточные крысы

Контроль ДАГО Контроль ДАГО

Суммарная площадь зон 2,14 3,22 1,69 2,11

ЯОР, мкм2 ±0,11 ±0,21 *Т ±0,1 ±0,12*|

Число зон ЯОР 2,31 3,43 1,81 1,9

±0,14 ±0,24*1 ±0,06 ±0,1

Суммарная площадь зон 0,07 0,1 0,05 0,06

ЯОР/Площадь ядра ±0,01 ±0,01 *т ±0,003 ±0,01

Площадь ДОТа, мкм* 0,05 0,06 0,06 0,07

±0,01 ±0,01 ±0,002 ±0,002*|

Периметр 157,21 169,37 184,66 205,62

кардиомиоцита, мкм ±6,21 ±10,39 ±4,16 ±5,28 *t

Площадь кардиомиоцита, 691,15 761,93 1248,0 1515,08

мкм2 ±50,87 ±63,28 ±51,76 ±116,16*t

Интегральная оптическая 38,67 49,22 42,17 71,12

плотность, усл.ед. ±2,69 ±3,66*t ±8,08 ±9,94* t

Средняя оптическая 0,04 0,04 0,036 0,044

плотность, усл.ед. ±0,01 ±0,01 ±0,007 ±0,008

Примечание: * - р < 0,05 по отношению к контролю.

Влияние агониста к-опиатных рецепторов динорфина А(1-13) на морфогенез миокарда крыс

В кардиомиоцитах обнаружены ген и мРНК продинорфина [Ventura С. et al., 1993; Wu I.P. et al., 1993]. к-ОР сердца представляют неоднородную популяцию. Выделяют низкоаффинные и высокоаффинные рецепторные участки, различающиеся по величине константы диссоциации в 70 и более раз.

Возрастное увеличение числа к-ОР, в основном, связано с увеличением числа высокоаффинных рецепторов ^тИЛтап R. et а1., 1996].

Эксперименты проведены на 207 крысах. Авторадиографический анализ показателей ДНК-синтетической активности кардиомиоцитов новорожденна крыс, которым с 2 по 6 постнатальные дни инъецировали динорфин А(1-13) в дозе 100 мкг/кг выявил достоверное возрастание числа ДНК-синтезирующих ядер, а также сокращение времени 8-фазы клеточного цикла в этих ядрах (табл. 16). В клетках стромы стимуляция процессов синтеза ДНК отмечалась в миокарде левого желудочка, где произошло увеличение ИМЯ на 21% и в межжелудочковой перегородке, в которой возрастание ИМ составило 17,6% (6,2±0,2% и 13,1±0,3 в контроле и 7,5+0,5% и 15,4±0,8 в эксперименте, р<0,05).

Таблица 16

Влияние пятикратного введения динорфина А(1-13) на синтез ДНК в миокарде новорожденных крыс, М±т.

Правый желудочек 6,8±0,24 10,91±0,35*Г 16,0110,43 18,12±0,34*|

Примечание: * - р < 0,05 по отношению к контролю.

Стимуляция процессов синтеза ДНК в кардиомиоцитах сопровождалась активацией зон ЯОР, о чем свидетельствует увеличение их числа более чем в 2 раза (1,32±0,09 в контроле и 2,82±0,19 в эксперименте, р<0,05).

У 3-недельных крыс, получавших динорфин А(1-13) в период новорожденности, не отмечалось статистически значимых изменений показателей пролиферативной активности кардиомиоцитов. При анализе морфометрических параметров зон ЯОР кардиомиоцитов, отмечено достоверное возрастание их числа на 13,2%, (1,9±0,05 в контроле и 2,15±0,07 в эксперименте). Интегральная оптическая плотность кардиомиоцитов, окрашенных амидочерным Б, достоверно возрастала (68,42±5,73 усл. ед. в контроле и 85,74±4,35 усл. ед. в эксперименте).

Пятикратные инъекции пептида на первой постнатальной неделе привели к увеличению числа клеток стромы и уменьшению числа ядер мышечного компартмента (рис. 8), что привело к сдвигу баланса в сторону возрастания доли соединительнотканного компонента в миокарде левого желудочка 21-дневных крыс (28,18±1,97% в контроле и 34,24±2,03% в эксперименте, р<0,05).

При сходности морфогенетических эффектов агонистов ц и к-ОР в отношении синтеза ДНК, активности зон ЯОР и стимуляции накопления белка в кардиомиоцитах, влияние на соотношение паренхиматозного и стромального компонентов в миокарде значительно различалось. Агонисты ц-ОР не изменяли этого баланса, тогда как динорфин А(1-13) способствовал избыточному

развитию соединительной ткани через 15 дней после заключительной инъекции.

Рис. 8. Влияние пятикратного введения динорфина А(1-13) новорожденным крысам на изменение числа ядер виментин-позитивных и десмин-позитивных клеток в миокарде 21-суточных животных, М+т, %. * -изменения достоверны по отношению к контролю, р < 0,05.

Влияние пептидного морфогена гидры на морфогенез миокарда крыс

Высокий консерватизм пептидного активатора гидры в эволюционном плане и выраженная морфогенетическая активность, его присутствие в организме млекопитающих, а также обнаружение рецепторов ПМГ у человека, послужили отправной точкой для проведения изучения влияния ПМГ на морфогенез миокарда крыс.

Эксперимент проведен на 80 крысах, пептид вводили в дозе 100 мкг/кг с 2 по 6 сутки после рождения.

Процессы синтеза ДНК в данной серии экспериментов исследовали с применением иммуногистохимического метода выявления РСКЛ в миокарде левого желудочка. У новорожденных крыс контрольной группы ИМЯ составил 25,14±2,54%, у подопытных - 28,24±3,92%, что не имело статистически достоверных отличий.

Количество ядер кардиомиоцитов с признаками апоптоза в миокарде левого желудочка составило в контроле 0,044±0,01%, в эксперименте оно было 0,058±0,01%, что не имело достоверных различий.

Статистически достоверных изменений морфометрических показателей зон ЯОР под влиянием пятикратных инъекций ПМГ не произошло. Также неизменными остались геометрические и оптические параметры кардиомиоцитов, окрашенных амидочерным Б.

Введение ПМГ не изменяло пропорций тканевых компартментов в миокарде и числа ядер, отнесенных к миогенным при иммуно гистохимической окраске срезов антителами к десмину.

Через 15 дней после заключительной, пятой, инъекции пептида исследование числа клеток миокарда, находящихся в синтетической фазе клеточного цикла, не было зафиксировано достоверных изменений, как в паренхиме, так и в строме органа. Вместе с тем, величина ИМ клеток стромы в 2 отделах - правом предсердии и межжелудочковой перегородке была статистически меньше у животных экспериментальной группы (на 26,8% и 37,6% соответственно, р<0,05). В контрольной группе показатели составили 1,38+0,02% и 1,49+0,15%, в экспериментальной 1,01+0,14% и 0,93+0,11% соответственно.

Введение ПМГ новорожденным крысам способствовало активации ядрышкового аппарата кардиомиоцитов левого желудочка, что выражалось в достоверном возрастании числа зон ЯОР на 10,5% (1,62+0,03 в контроле и 1,79+0,06 в эксперименте, р<0,05).

Инъекции морфогена новорожденным животным не сопровождались изменениями в числе клеток, а также объемной плотности паренхимы и стромы миокарда 21-дневных крыс.

К 45 дню эти изменения ДНК-синтетической активности клеток стромы и активности зон ЯОР кардиомиоцитов нивелировались и миокард подопытных животных гистологически не отличался от контрольных крыс.

Возможно, отмеченные нами эффекты лежат в основе благоприятного действия ПМГ при развитии гипертрофии миокарда, что описано в работах В.А. Федосеева и соавторов [Федосеев В.А. и соавт., 1993]. Полученные экспериментальные данные дают дополнительные доказательства кардиотропного эффекта ПМГ, который планируется к применению в кардиологии.

Реализация морфогенного эффекта ПМГ осуществляется с участием цАМФ [Слепушкин В.Д. и соавт., 1989; Fenger U. et al., 1994; Galliot B. et al., 1995; Schaller H.C. et al., 1996].

В ранее проведенных исследованиях, выполненных в ЦНИИ ДВГМУ, отмечено участие Na+/H+ обмена в пролиферативном эффекте ПМГ [Хомичук А.Ю., Тимошин С.С., 1991].

Кроме того, эффект ПМГ может быть опосредован изменением гормонального статуса и созданием благоприятного фона для реализации митогенных стимулов [Мурзина Н.Б. и соавт., 1991; Хомичук А.Ю., 1995]. Влияние на гормональный статус и половое созревание отмечено и в работах других авторов [Виноградов ВА. и соавт., 1987; Вараксин А.А. и соавт., 2000].

Снижение стрессорного компонента и активация гипофиз-надпочечниковой системы [Тимошин С.С. и соавт., 1997; Яковенко И.Г., 2002], а также нормализация процессов ПОЛ-АОЗ, влияние на образование активных

кислородных метаболитов и NO-ергического компонента [Лебедько ОА и соавт., 1997; Тимошин С.С. и соавт., 1998; Лебедько ОА, 2004], также могут служить важными компонентами реализации биологической активности ПМГ.

Влияние блокатора кальциевых каналов верапамила на морфогенез миокарда новорожденных крыс

Ионы кальция, наряду с системой циклических нуклеотидов и инозитолфосфата, являются универсальным звеном внутриклеточной передачи информации. Изменение концентрации ионов кальция внутри клетки, согласно данным литературы, принимает участие в реализации эффектов всех исследованных нами пептидов [Jin W. et al., 1994; Cigola E. et al, 1997; Kajstura J. et al., 1997]. В связи с этим представляло интерес исследовать влияние блокатора L-типа потенциалчувствительных каналов верапамила на морфогенез миокарда крыс. Эксперимент проведен на 63 крысятах. Пятикратное введение верапамила в дозе 1,5 мг/кг привело к достоверным изменениям гравиметрических показателей новорожденных крыс (табл. 17). Отмечалось снижение массы животных на 9%, возрастание абсолютной (на 18,5%) и относительной (на 27,4%) массы сердца.

Таблица 17

Влияние пятикратного введения верапамила на соматометрические показатели новорожденных крыс, М±т _

Показатель Контроль Верапамил

Масса крысят на 7 сутки, г 14,55±0,4б 13,23±0,3*1

Абсолютная масса сердца, мг 76,31±3,06 90,44±2,45*|

Относительная масса сердца, мг/г 5,32±0,24 6,78±0,58*|

Примечание: * - р < 0,05 по отношению к контролю.

Изучение процессов синтеза ДНК проведено с применением меченного по тритию тимидина. В желудочковом миокарде наблюдалось возрастание числа ДНК-синтезирующих ядер кардиомиоцитов (табл. 18). Скорость синтеза ДНК достоверно увеличилась во всех исследованнык отделах (рис. 9).

Таблица 18

Влияние верапамила на ИМЯ кардиомиоцитов 7-дневных крыс, М±т, %

Отдел миокарда Контроль Верапамил

Левое предсердие 8,02±0,78 8,ОНО,35

Правое предсердие 8,64±1,01 8,3±0,44

Левый желудочек 9,29±0,43 ll,87±0,26*t

Межжелудочковая перегородка 9,31 ±0,42 ll,77±034*t

Правый желудочек 7,63±0,49 9,04±0,46*Т

Примечание: * - р < 0,05 по отношению к контролю.

Количество интерстициальны х клеток, находящихся в синтетической фазе клеточного цикла, возросло в левом желудочке на 46,1% (8,13+1,11% в контроле и 11,88± 1,17% в эксперименте), в межжелудочковой перегородке - на 40,9% (8,21±1,07% в контроле и 11,57+1,14% в эксперименте), что

статистически достоверно выше при сравнении с контрольными животными (р<0,05).

лп пп лж мжп пж

Рис. 9. Влияние пятикратного введения верапамила на ИМ кардиомиоцитов новорожденных крыс, М±т. * - р < 0,05 по отношению к контролю.

Активация ДНК-синтетических процессов в миокарде новорожденных крыс при введении верапамила может объясняться онтогенетическими особенностями. На ранних этапах постнатального онтогенеза отмечается конфликт синтетических процессов - накопление сократительных белков приводит к торможению пролиферативных процессов [Румянцев П.П., 1982]. Снижение периферического сопротивления при введении верапамила может приводить к уменьшению гемодинамической нагрузки на сердце, которая является основным стимулятором синтеза сократительного белка в миокарде и, тем самым, создавать благоприятные условия для пролонгирования процессов пролиферации в миокарде. Проведенное исследование морфометрических параметров зон ЯОР кардиомиоцитов не выявило достоверных изменений при введении верапамила.

При исследовании гематоксилин-эозиновых препаратов сердца обращало на себя внимание расширение микрососудов и переполнение их кровью. Последующее исследование миокарда левого желудочка с применением 50-точечной сетки выявило достоверное возрастание доли сосудистого компонента Увеличение составило 29,7% (28,6±1,81% в контроле и 37,1±2,36% в эксперименте, р<0,05). Таким образом, возрастание массы сердца при введении

верапамила может быть обусловлено депонированием крови в сосудах микроциркуляторного русла.

Подводя итог проведенным исследованиям, по характеру влияния на гистологические параметры миокарда, изученные пептиды можно расположить следующим образом (табл. 19). Наиболее благоприятным и перспективным эффектом, с точки зрения дальнейшего изучения и внедрения в кардиологическую практику, на наш взгляд, обладает ПМГ. Единственный из всех исследованных нейропептидов, он способен снижать ДНК-синтетическую активность клеток стромы, при этом не изменяя соотношения строма-паренхима в миокарде. Данный факт, на наш взгляд, может найти применение при фиброзных изменениях миокарда - постинфарктном и атеросклеротическом кардиосклерозе, после перенесенных воспалительных заболеваний миокарда.

Агонисты ц-ОР обладают способностью активировать синтез ДНК и транскрипционную активность кардиомиоцитов, вызывать увеличение их размеров. При этом баланс строма-паренхима остается неизменным. На наш взгляд, для этих препаратов открываются перспективы применения при гипертонической болезни, сердечной недостаточности и т.д. для активации сократительной способности миокарда.

При различии в механизмах действия агонист к-ОР динорфин А(1-13), ЭТ-1 и А-П обладают способностью активировать синтез ДНК в кардиомиоцигах и клетках стромы, а также приводить к избыточному развитию соединительной ткани в миокарде. Данные изменения при возникновении в критическом периоде морфогенеза сердца - периоде новорожденности -сохраняются длительное время после устранения действующего фактора.

Анализируя морфогенетические эффекты введения ЭТ-1 и А-11 в отношении структурного гомеостаза миокарда, можно отметить значительное сходство. Комплиментарность действия данных пептидергических систем в организме в функциональном отношении достаточно хорошо изучена и проявляется в их вазоконстрикторном влиянии, способности повышать артериальное давление, изменять водно-солевой баланс и т.д. ЭТ принимает участие в начальной стадии развития ангиотензиновой гипертензии [Исай 8. et а1., 2001]. Возможно, такое сходство связано со значительной степенью гомологии рецепторов ангиотензина и эндотелина ^шг-Орааэ N. et а1., 1998].

Важность изучения введения ЭТ-1 и А-П в период новорожденности определяется тем, что изменение процесссинга этих пептидов в эмбриогенезе и на ранних этапах постнатального онтогенеза может вызывать структурные изменения формирования органов и систем. Снижение образования эндотелинов в эмбриогенезе ведет к развитию врожденных патологий -болезни Гиршпрунга, велокардиофациальному синдрому и другим нейропатиям [Yanagisawa Н. et а1., 1998]. Описано тератогенное действие антагонистов эндотелиновых рецепторов [Тгетеп К.А. et а1., 1999].

Таблица 19

Влияние введения пептидов новорожденным крысам на морфометрические показатели миокарда___

Пептид Синтез ДНК в кардиомиоци- тах новорожденных крыс Активность зон ЯОР и содержание белка в кардиомио-цитах 21-дневных крыс Влияние на соотношение паренхиматозного и стромального компонентов миокарда 21-дневных крыс

ПМГ, 100 мкг/кг - т Снижение синтеза ДНК в клетках стромы

АНП-2 100 мкг/кг 1 -

Агонисты ц-ОР:ДАГО, А10(100 мкг/кг) > -

Агонист кОР динорфин А(1-13), 100 мкг/кг Увеличение объемной плотности стромаль-ного компонента, возрастание числа ядер виментин-позитивных и снижение числа ядер десмин-позитивных клеток

Ангиотензин -И, 100 мкг/кг Увеличение синтеза ДНК в клетках стромы, возрастание числа ядер виментин-позитивных клеток, увеличение объемной плотности стромы, снижение объемной плотности паренхимы

Эндотелии-1, 100 мкг/кг - • Увеличение синтеза ДНК в клетках стромы, возрастание числа ядер виментин-позитивных и снижение числа ядер десмин-позитивных клеток, увеличение объемной плотности стромы, снижение объемной плотности паренхимы

Примечание: * - снижает по данным Гончаровой Е.Н. и соавт., 1996.

Таким образом, полученные нами экспериментальные данные позволяют предполагать, что при активации эндотелиновой и ангиотензиновой систем, например у беременных при поздних гестозах, в момент родов, при врожденных пороках сердца, почечной патологии и т. д., возможно неблагоприятное влияние на миокард и развитие фиброзных изменений, что может сохраняться длительное время после прекращения влияния действующего фактора.

Помимо способности нейропептидов изменять процессы морфогенеза миокарда как у новорожденных, так и у половозрелых крыс, в наших экспериментах выявлен еще один факт - наличие отставленных гистологических изменений миокарда при введении пептидов на ранних этапах постнатального онтогенеза.

Поиск веществ, влияющих на различные звенья метаболизма нейропептидов - блокаторов рецепторов или средств, подавляющих образование активных форм пептидов, может оказаться полезным при развитии фиброзных изменений в миокарде, а также для профилактики их возникновения при патологии беременности у матери, осложненных родах, развитии заболеваний почек, сосудов и т.д. в раннем периоде онтогенеза, т.е. в условиях активации ренин-ангиотензиновой, эндотелиновой и опиатергической систем. Вместе с тем, наличие у большинства препаратов, влияющих на метаболизм пептидов и применяемых в настоящее время, тератогенного и фетотоксического действия, препятствует их применению в период беременности. Это делает актуальным дальнейшее исследование биологической роли пептидов, а также поиск более эффективных путей сохранения эндогенного баланса этих пептидергических систем или его регуляции при развитии различных заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. Оценка пролиферативного потенциала клеток миокарда, проведенная иммуногистохимическим (экспрессия РСКЛ) и авторадиографическим (инкорпорация 3Н-тимидина) методами выявила однонаправленную динамику изменения этих показателей пролиферации на различных этапах постнатального онтогенеза. Максимальные величины индексов меченых ядер, как в кардиомиоцитах, так и в клетках стромы, отмечаются у новорожденных животных. В позднем молочном и предпубертатном периоде происходит постепенное снижение их величины, минимальные значения отмечаются у половозрелых животных. Сравнительная оценка двух методов позволяет считать более предпочтительным изучение пролиферативного потенциала миокарда на поздних этапах онтогенеза с помощью определения экспрессии РСМЛ.

2. У новорожденных крыс морфометрические параметры зон ядрышкового организатора кардиомиоцитов коррелируют с интенсивностью пролиферативных процессов, у животных предпубертатного возраста и половозрелых крыс - с размерами кардиомиоцитов.

3. В постнатальном онтогенезе миокарда, при исследовании в период новорожденности, позднем молочном и предпубертатном периодах, отмечается

постепенное возрастание процентного числа ядер клеток стромы (виментин-позитивных) при снижении процентного количества ядер кардиомиоцитов (десмин-позитивных клеток). Объемная плотность стромального компонента максимальна у новорожденных крыс, минимальна у половозрелых животных.

4. Повторное введение эндотелина-1 новорожденным крысам оказывает воздействие на морфогенетические процессы в миокарде непосредственно в период новорожденности, а также проявляется в период позднего молочного возраста и в предпубертатный период. У новорожденных крыс имеет место стимуляция роста и накопление белка в кардиомиоцитах. У крыс позднего молочного возраста при сохранении этих эффектов отмечается активация ДНК-синтетических процессов в клетках стромы миокарда, сдвиг баланса тканевых компонентов миокарда в сторону преобладания стромы. Этот эффект сохраняется и у крыс предпубертатного возраста.

5. Повторное введение ангиотензина-П новорожденным крысам также оказывает воздействие на морфогенез миокарда. У новорожденных крыс имеет место стимуляция синтеза ДНК, активности зон ядрышкового организатора кардиомиоцитов и увеличение размеров клеток. Кроме того, имеет место избыточное развитие стромы миокарда. Данные эффекты сохраняются у крыс позднего молочного возраста. У половозрелых животных в целом отмечается сходная реакция миокарда на введение A-II.

6. Повторное введение эндотелина-1 и ангиотензина-П, наряду со стимуляцией пластических процессов в кардиомиоцитах новорожденных крыс, приводит к активации процессов апоптоза.

7. Повторное введение новорожденным крысам АНП-2 - функционального антагониста ЭТ-1 и АТ-И, способствует снижению активности зон ядрышкового организатора кардиомиоцитов у животных позднего молочного возраста.

8. Повторные инъекции агонистов ц-ОР тетрапептида А10 и ДАГО новорожденным крысам активируют синтез ДНК в кардиомиоцитах. 3-недельные инъекции А10 половозрелым животным активируют синтез ДНК в стромальных клетках, приводят к активации зон ядрышкового организатора и накоплению белка в кардиомиоцитах, возрастанию содержания катехоламинов в сердце.

9. Повторное введение агониста к-ОР динорфина А(1-13) новорожденным крысам приводит к активации синтеза ДНК и возрастанию числа зон ядрышкового организатора в кардиомиоцитах. Эти эффекты сохраняеюся и у животных позднего молочного возраста, что сопровождается возрастанием содержания белка в клетках паренхимы миокарда. Количество клеток стромы и ее объемная плотность в миокарде крыс позднего молочного возраста превышают контрольные величины.

10.Повторное введение ПМГ новорожденным крысам вызывает снижение синтеза ДНК в клетках стромы миокарда и активацию зон ядрышкового организатора кардиомиоцитов животных позднего молочного возраста.

11. Изученные нейропептиды, представители семейства опиоидных и вазоактивных, а также ПМГ, обладают морфогенетическими свойствами в отношении миокарда крыс различных возрастных групп. При введении

новорожденным крысам они способны изменять гистологические характеристики миокарда, которые могут сохраняться на последующих этапах онтогенеза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фельдшеров Ю.И., Мельникова Н.П., Каганский Б.М. Методика регистрации электрокардиограммы у новорожденных белых крыс. Рационализаторское предложение № 1645 от 12.03.96.

2. Фельдшеров Ю.И., Мельникова Н.П., Каганский Б.М. Методика регистрации частоты дыхательных движений у новорожденных белых крыс. Рационализаторское предложение № 1646 от 12.03.96.

3. Сазонова Е.Н., Мельникова Н.П., Тимошин С.С. Влияние опиоидных пептидов на тканевой гомеостаз миокарда белых крыс в раннем периоде постнатального онтогенеза // Тезисы докладов 3 съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока, Новосибирск, 1997.- С. 199.

4. Гончарова Е.Н., Мельникова Н.П., Яценко Т.В., Тимошин С.С, Ярова Е.П. Влияние агониста ц-опиоидных рецепторов тетрапептида А 10 на синтез ДНК в миокарде и печени белых крыс на раннем этапе постнатального онтогенеза // Бюлл. эксп. биол. и мед.-1997, № 2,- С. 212-215.

5. Мельникова Н.П. Влияние агонистов ^, б, и к-опиатных рецепторов на процессы синтеза ДНК в миокарде белых крыс // Проблемы фармакологи и фармации на Дальнем Востоке. 1. Экспериментальная фармакология. Материалы региональной научной конференции. Хабаровск, октябрь, 1997. Издательство Дальневосточного государственного медицинского университета, 1997.- С. 58-60.

6. Мельникова Н.П., Тимошин С.С. Влияние блокатора Са-каналов верапамила на ДНК-синтетические процессы в миокарде белых крыс // Проблемы фармакологи и фармации на Дальнем Востоке. 1. Экспериментальная фармакология. Материалы региональной научной конференции. Хабаровск, октябрь, 1997. Издательство Дальневосточного государственного медицинского университета, 1997,- С. 60-62.

7. Мельникова Н.П., Тимошин С.С. Вовлеченность опиатных рецепторов в регуляцию синтеза ДНК в миокарде новорожденных крыс. Механизмы некоторых патологических процессов в эксперименте и клинике // Тезисы докладов юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию Б.А.Саакова.- Ростов-на-Дону, 1999.- С. 110.

8. Мельникова Н.П., Гончарова Е.Н., Тимошин С.С, Обухова Г.Г. Влияние динорфина А(1-13) на синтез ДНК и уровень цАМФ в миокарде белых крыс на раннем этапе постнатального онтогенеза //Бюлл. эксп. биол. и мед.-1999, № 7.-С 63-65.

9. Мельникова Н.П., Тимошин С.С Влияние блокатора кальциевых каналов верапамила на ДНК-синтетические процессы и активность ядрышкового организатора клеток миокарда новорожденных белых крыс // Бюлл. эксп. биол. и мед.-1999, № 6.- С. 658-660.

10. Мельникова Н.П., Тимошин С.С, Цыганков В.И., Мурзина Н.Б., Обухова Г.Г., Беспалова Ж.Д. Влияние введения динорфина крысам в период

новорожденности на морфогенез сердца // Бюлл. эксп. биол. и мед.- 2000, № 6.-С.623-625.

И. Мельникова Н.П., Тимошин С.С., Мурзина Н.Б., Сазонова Е.Н., Кузнецов А.В., Ярова Е.П. Влияние введения агониста ц-опиатных рецепторов тетрапептида А 10 на синтез ДНК и содержание белка в миокарде белых крыс // Бюлл. эксп. биол. и мед.- 2000, № 12.- С. 693-695.

12. Мельникова Н.П., Сазонова Е.Н., Лебедько О.А., Пикалова В.М., Сазонов О.А. Влияние эндотелина на морфогенез сердца белых крыс // Тезисы докладов Российско-Японского медицинского симпозиума 21-22 сентября 2000, Благовещенск.- С. 452.

13. Мельникова Н.П. Влияние Динорфина на количество клеток соединительной ткани миокарда белых крыс // Мониторинг биологического разнообразия и особенности его использования в учебном процессе в школе и ВУЗе. Хабаровск, издательство ХГПУ.- 2000.- С. 218-220.

14. Мельникова Н.П. Изменение активности ядрышкового организатора кардиомиоцитов белых крыс в постнатальном онтогенезе // Мониторинг биологического разнообразия и особенности его использования в учебном процессе в школе и ВУЗе. Хабаровск, издательство ХГПУ.- 2000.- С. 220-221.

15. Мельникова Н.П. Отдаленные последствия введения ангиотензина на миокард белых крыс. Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины // Тезисы докладов Ш Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, 25 апреля 2002.- С. 6.

16. Мельникова Н.П. Применение иммуногистохимических методик для прогнозирования развития клеточных популяций нормальных и опухолевых тканей //Дальневосточный медицинский журнал.- 2002, № 2.- С. 75-81.

17. Сазонова Е.Н., Сазонов ОА., Мельникова Н.П., Пикалова В.М., Тимошин С.С. Онтогенетические особенности влияния эндотелина-1 на тканевой гомеостаз различных клеточных популяций белых крыс // Бюлл. эксп. биол. и мед.-2002, №7.-С. 36-39.

18. Мельникова Н.П., Тимошин С.С. Влияние эндотелина-1 и предсердного натрийуретического пептида-П на морфогенез сердца белых крыс // Бюлл. эксп. биол. и мед.- 2002, № 7.- С. 101-103.

19. Мельникова Н.П., Тимошин С.С, Животова Е.Ю. Изменение процессов синтеза ДНК и морфометрических параметров миокарда белых крыс при введении ангиотензина-П // Бюлл. эксп. биол. и мед.- 2003, № 3.- С. 287-290.

20. Мельникова Н.П., Тимошин С.С, Пеллиниеми Л.И., Иокинен И., Абдельвахид Е. Процессы апоптоза, пролиферации иа синтеза белка в кардиомиоцитах новорожденных белых крыс при введении эндотелеина-1 // Бюлл. эксп. биол. и мед.- 2004, № 6.- С. 687-689.

Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Тираж 100 экз. Заказ № 154. Отпечатано в типографии ДВНИИТС. 68000 ул. Ленина 57

22 AilР 2005