Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ физиологических механизмов действия ЕМКЕамид-подобных пептидов на организм млекопитающих

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Анализ физиологических механизмов действия ЕМКЕамид-подобных пептидов на организм млекопитающих"

с-.

На правах рукописи

ТИНЯКОВ РУСЛАН ЛЕОНИДОВИЧ

АНАЛИЗ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ЕМКЕамид-ПОДОБНЫХ ПЕПТИДОВ НА ОРГАНИЗМ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

ТИНЯКОВ РУСЛАН ЛЕОНИДОВИЧ

АНАЛИЗ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ЕМКГамид-ПОДОБНЫХ ПЕПТИДОВ НА ОРГАНИЗМ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена на базе лаборатории патофизиологии Нижегородского научно-исследовательского института травматологии и ортопедии.

Научные руководители:

д.б.н., профессор Крылов В.Н. к.б.н., доцент Парин С.Б.

Официальные оппоненты:

д.б.н., профессор Гелашвили Д.Б. д.б.н., профессор Кошелев В.Б.

Ведущая организация:

Нижегородская государственная медицинская академия им.С.М.Кирова

Защита состоится « 1998г. в /5 часов

на заседании диссертационного совета К063.77.13 Нижегордского государственного университета им.Н.И.Лобачевского (603600, Нижний Новгород, пр.Гагарина, 23)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета

Автореферат разослан « // » ¿г^и/^г^л 1998 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

к.б.н., доцент у* */^Жл^ Александрова И.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Параопиоидный тетрапептид Phe-Met-Arg-Phe-NH2 (FMRFaMii/i, FMRFa), первоначально выделенный из нервных ганглиев моллюска Macrocallista nimbosa (Price, Greenberg, 1977), позднее был обнаружен в различных тканях млекопитающих (Raffa,1988). В настоящее время семейство РМИРамидов включает в себя 34 олигопептида, которые имеют квазиконсервативную аминокислотную последовательность на С-конце молекулы (За-мятнин, 1990). Установлено, что пептиды этого семейства обладают выраженным кардиостимулирующим и вазопрессорным действием на организм млекопитающих (Жуковский и др., 1989; Mues et al., 1982). Выявлен защитный эффект FMRFa при некоторых патологических состояниях в эксперименте (Белов и др.,1992, Chai et al.,1986). Однако, мнения разных авторов относительно физиологических механизмов действия FMRFa чрезвычайно противоречивы. Так, некоторые авторы, основываясь на сходстве первичной структуры FMRFa и некоторых опиоидов, предполагают наличие у данного пептида специфической анти-опиоидной активности (Соколова и др., 1992; Бастрикова и др., 1996; Raffa, 1988), тогда как в ряде публикаций указывается на способность FMRFa взаимодействовать с собственными, специфическими рецепторами, отличными от опиатных (Vinsent et al., 1989; Paiza et al., 1993). В то же время, результаты некоторых авторов (Жуковский и др., 1989; Barnard, Dockray, 1984; Roth et al., 1987) позволяют предположить, что в реализации эффектов FMRFa-подобных пептидов участвует симпатическая нервная система.

Таким образом, вопрос о механизме действия и, соответственно, о физиологической роли FMRFa-подобных пептидов у млекопитающих остается пока без ответа. Тот факт, что в настоящее время делаются попытки применять регуляторные пеп-

тиды (в том числе и РМЯРа ) в качестве лекарственных средств при терапии некоторых экстремальных состояний, делает задач}' выяснения механизма действия РМКРамида еще более актуальной.

Цель работы. Выяснить механизмы действия олигопеп-тидов семейства БМКРамида на важнейшие вегетативные функции организма млекопитающих в условиях нормы и патологии.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ гемодинамических и респираторных эффектов пептидов семейства РМИРамида, опио-идных пептидов и катехоламинов.

2. Провести фармакологический анализ механизмов прес-сорного и кардиостимулирующего действия РМИРамида.

3. Исследовать роль эндогенной опиоидной и симпато-адреналовой систем в реализации эффектов РМИРа.

4. Выяснить механизмы повреждающего действия высоких доз пептида.

5. Изучить метаболические эффекты РМКРа.

6. Исследовать гемодинамические эффекты пептидов семейства РМЛРамида при терминальных состояниях.

Новизна научных исследований

В работе впервые проведен развернутый физиолого-фармакологический анализ механизмов действия РМЯРамид-подобных пептидов на организм млекопитающих; установлено, что пептиды этого семейства являются лигандами адренорецеп-торов. Впервые выявлены некоторые физиологические (гипергликемия, сокращение мигательной перепонки, мидриаз) и патологические (отек легких, экстрасистолия) эффекты РМИРамида; доказано, что физиологические эффекты пептида реализуются независимо от активации эндогенной опиоидной и симпато-адреналовой систем.

На модели острой альтерации функций сердечнососудистой системы при 10-ти минутной клинической смерти у крыс показано, что введение РМ11Рамид-подобных пептидов в комплекс стандартных реанимационных мероприятий улучшает восстановление важнейших вегетативных функций и повышает выживаемость животных после реанимации.

Научно-практическая ценность работы

Выявленные адреномиметические свойства у пептидов семейства БМИРамида указывают на существование ранее не известного пути регуляции физиологических функций организма, что расширяет существующие на сегодняшний день представления о принципах пептидергической регуляции. Выявленная способность РМШ-амид-подобных пептидов в больших дозах вызывать патологические эффекты позволяет использовать их при экспериментальном моделировании различных патологических состояний (экстрасистолии, отека легких). На основании полученных результатов разработан способ моделирования острого гемодинамического отека легких.

Основные положения диссертации, выносимые на

защиту

БМКРамид и родственные ему пептиды при системном введении в организм млекопитающих вызывают гемодинамиче-ские, метаболические и миотропные эффекты, характерные для адреномиметиков. Гемодинамические и миотропные эффекты РМЯРамида проявляются только при парентеральном введении пептида и отсутствуют при введении его в желудочки головного мозга. Наиболее отчетливо эффекты РМИРамид-подобных пептидов проявляются в условиях глубокой альтерации функций сердечно-сосудистой системы. Физиологические эффекты пептидов данного семейства реализуются независимо от активации эндогенной опиоидной и симпато-адреналовой систем. При введении в больших дозах РМЯРамид-ггодобные пептиды вызывают

патологические эффекты (сердечные аритмии, отек легких) у млекопитающих. ГМ ЯР амид и родственные ему пептиды являются эндогенными пептидными лигандами адреноредепторов.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Второй Нижегородской сессии молодых ученых (Н.Новгород, 1997), Втором съезде биохимического общества Российской Академии наук (Москва, 1997), заседании Нижегородского физиологического общества (1997).

Структура и объем работы

Материалы диссертации изложены на /<?3 страницах машинописного текста, иллюстрированы 30 таблицами, 21 рисунком. Работа состоит из введения, обзора литературы, характеристики методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего 116 источников, из которых 51 на русском языке и 65 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе было использовано 230 белых беспородных крыс обоего пола, 11 разнополых кошек и 18 лягушек.

В качестве исследуемых веществ в экспериментах использовались следующие пептиды, синтезированные в ВКНЦ РАМН:

- тетрапептид Р11е-Ме1:-А^-РКе-1ЧН2 (РМЯРамид, БМ^а);

- дипептид А^-РИе-ИНг (ИБамид, ИРа), являющийся С-концевым фрагментом РМЯРа;

- дипептид А^-РЬех2НС1 (КРх2НС1), являющийся не-амидированным аналогом ЯР а:

- гептапептид Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Arg-Phe-NH2 (YGGFMRFa, Arg6-Phe7 -мет-энкефалинамид), возможно, являющийся предшественником FMRFa;

- гексапептид Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Argx2CH3COOH (даларгин).

Изучение гемодинамических эффектов пептидов. Эксперименты проводили на наркотизированных нембуталом (50 мг/кг, в/б) животных. Было использовано 11 кошек обоего пола с массой тела от 2,0 до 4,5 кг и 119 разнополых белых крыс массой 150-250 г. Перед началом эксперимента животным производили катетеризацию бедренной вены (для инфузий) и общей сонной артерии (для измерения АД). С целью предотвращения свертывания крови животным за 5-10 минут до опыта внутривенно (в/в) вводили 500 Ед/кг гепарина.

О состоянии вегетативных функций судили по показателям АД, ЧСС и ЧД, регистрируемым на протяжении всего эксперимента общепринятыми методами.

FMRFa и RFx2HCl вводили крысам в/в в дозе 0,1 мг/кг (в 0,1 мл стандартного физиологического раствора). Кошкам тетра-пептид FMRFa вводился внутрижелудочково (в/ж) и внутривенно (в/в). В/в пептид вводили в дозах 0,01; 0,05 и 0,1 мг/кг. Объем каждой в/в инфузии равнялся 2 мл. В желудочки головного мозга кошек пептид вводился в дозах 200-500 нмоль (10-25 мкл). Вживление канюль для инфузий в боковые желудочки головного мозга производили с использованием стереотаксического аппарата СЭЖ-3 по координатам: АР+1, S2, V+4; АР+4, S2,5, V+б,- рассчитанным по атласу Е.Фифкова и Дж.Маршала (Буреш и др., 1962).

При проведении фармакологического анализа механизмов действия ГМЯРамида использовались следующие фармакологические агенты с известным механизмом действия: опиатный антагонист налоксон; опиатные агонисты фентанил и даларгин; неизбирательный блокатор а-адренорецепторов преимуществен-

но периферического действия дигидроэрготамин; нейролептик аминазин, блокирующий как центральные, так и периферические адренергические и дофаминергические рецепторы; агонист преимущественно центральных а2-адренорецепторов клофелин; неселективный антагонист р-адренорецепторов пропранолол (обзи-дан); м-холинолитик атропин; деплетор эндогенных катехолами-нов резерпин; ганглиоблокаторы пентамин и бензогексоний.

В отдельных сериях экспериментов исследовалось влияние ваготомии, адреналзктомии и стабилизации дыхания (ИВЛ) на гемодинамические эффекты РМЯРа.

С целью сравнения исследовались также гемодинамические реакции, вызываемые адреналином, норадреналином и УООРМЯРа.

Исследование влияния РМИРа на тонус мигательной перепонки у кошек проводили одновременно с исследованием ге-модинамических реакций. Сокращение мигательной перепонки регистрировали с помощью чернильно-пишущего кимографа на бумаге.

Контрольное максимальное сокращение мигательной перепонки вызывали путем электрической стимуляции шейного симпатического нерва через биполярные электроды. Стимуляцию в течение 3 сек. проводили прямоугольными импульсами амплитудой 10 В, длительностью 5мс с частотой 30 Гц.

В части опытов (п=8) с целью полной денервации третьего века у кошек производилась перерезка ипсилатерального п. зутрагЫсиБ.

Исследование аритмогенных свойств РМКРа проводилось в тех же экспериментах на кошках. Регистрировались следующие показатели:

- латентный период появления аритмий;

- длительность периода аритмий.

Исследование эдемогенного действия FMRFa-подобных пептидов. Эксперименты проводили на 78 крысах-самцах с массой тела от 150 до 385 г в весенне-летний период.

В первой серии опытов на 30 бодрствующих крысах отек легких вызывали внутрибрюшинным введением FMRFa (0,5 и 5,0 мг/кг) и адреналина (0,5 и 5,0 мг/кг). Через 30 минут после инфу-зии веществ крыс декапитировали.

Во второй серии экспериментов отек легких у 24 наркотизированных нембуталом крыс вызывали в/в введением RFx2HCl в дозах 0,1; 0,3 и 0,5 мг/кг.

В третьей серии экспериментов с целью индукции отека легких 24 наркотизированным крысам в/в вводили РМЯРамид в дозе 0,1 мг/кг в виде 4 повторных (с интервалом в 15 мин.) инфу-зий. В этих экспериментах проводилось исследование влияния предварительной ганглиоблокады пентамином (10,0 мг/кг; в/в) и а-адреноблокады дигйдроэрготамином (1,0 мг/кг; в/в) на эдемо-генное действие FMRFамида.

По окончании опыта легкие у крыс извлекались, взвешивались с точностью до 5 мг и высушивались в сушильном шкафу при t=200°C до постоянного веса.

О наличии и выраженности отека легких у крыс судили по морфологической картине, а также по изменению весового коэффициента (ВК) и сухого остатка (СО) легких, рассчитываемым, как описано В.И.Смирновой и др. (1994), по следующим формулам:

BK = £W?cO = -^^xlOO%, где

тт. твл.л.

тТ. - масса тела животного, в г;

т„л л - масса влажных легких, в г;

тсул л - масса легких, высушенных до постоянного веса, в г.

Морфологические изменения в легочной ткани исследовали методом световой микроскопии с помощью микроскопа "DIALUX 22ЕВ" (Leitz, Германия).

Исследование уровня глюкозы в плазме крови крыс. Эксперименты проводили одновременно с исследованием эдемоген-ных свойств пептидов. Концентрацию глюкозы в плазме крови определяли гексокиназным методом на биохимическом анализаторе "Express plus (М-560)" (Ciba-Corning, Англия).

Исследование эффектов пептидов при клинической смерти. Клиническую смерть у 33 крыс-самок массой от 180 до 220 г моделировали в условиях нембуталового наркоза (40 мг/кг, в/б) и гепаринизации (500 Ед/кг, в/а) выпусканием максимально возможного объема крови через полиэтиленовый катетер, введенный в общую сонную артерию. Клиническая смерть у крыс длилась 10 минут с момента последнего атонального вдоха.

Исследуемые вещества: налоксон, FMRFa, RFa и RFx2HCl,- в дозах по 0,5 мг/кг добавлялись в выпущенную кровь перед реинфузией. Реанимацию крыс проводили стандартными методами (Неговский, 1975): внутриартериальная (в/а) реинфузия выпущенной крови, искусственная вентиляция легких (ИВЛ). При необходимости проводили закрытый массаж сердца. ИВЛ проводили по открытому контуру аппаратом "Вита-1", параметры вентиляции подбирались индивидуально. Постреанимационный период наблюдения длился 40 минут, после чего выжившие животные подвергались эвтаназии (эфир, внутрисердечно). В ходе эксперимента регистрировались следующие показатели: АД, ЧСС и ЧД, а также выживаемость на 40-ю минуту после реанимации.

Исследование мидриатического эффекта FMRFa. Эксперименты проводили на лягушках по методике, описанной Я.М. Кабаком (1968). У лягушек вырезались глаза и помещались попарно в штатив с лунками, заполненными 0,6%-ным раствором NaCl. Штатив ставился на 30-40 минут под настольную лампу,

чем достигалось максимальное сужение зрачков. После этого орошающий раствор в одной лунке из каждой пары заменяли растворами адреналина или FMRFa в разведении 1:20000. Второй глаз оставлялся в качестве контроля.

Мидриатическое действие оценивали через 60-90 мин. после замены раствора. Результаты фотографировали с помощью фотоаппарата "Зенит-TTL".

При обработке результатов использовали стандартные методы статистического анализа. Достоверность различий в группах проверяли с использованием t-критерия Стьюдента, F-критерия Фишера и критерия Манна-Уитни. Данные обрабатывались на IBM PC АТ-386 с помощью программы STADIA.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование механизмов, опосредующих гемоднна-мнческие эффекты ЕМКРамид-подобных пептидов. При проведении этой части работы выяснилось, что в/в введение наркотизированным крысам РМЯРамида вызывает у них двухфазные изменения АД, ЧСС и ЧД. Сразу после инфузии пептида развивалась резкая, но кратковременная гипертензия, сменявшаяся затем довольно продолжительной и выраженной гипотензией. Во время гипертензивной фазы гемодинамической реакции наблюдалось появление рефлекторной вагусной брадикардии, отменявшейся атропином, и снижение частоты дыхания. Во время гипотензивной фазы регистрировались умеренная тахикардия и тахипноэ.

При введении крысам неамидированного аналога FMRFa - RFx2HCI - наблюдалась только прессорная реакция с рефлекторными изменениями дыхания и сердечного ритма. Кроме того, в отличие от РМЯРамида, RFx2HCl не оказывал заметного кар-диостимулируюхцего действия.

Принимая во внимание неоднократно высказывавшееся в литературе мнение о наличии у РМЯРамида свойств опиоидного

антагониста, мы исследовали роль ЭОС в реализации гемодина-мического ответа у крыс на введение пептида.

Выяснилось, что ни стимуляция опиатных рецепторов фентанилом и даларгином, ни блокада их налоксоном не сказываются на выраженности гемодинамических эффектов РМ11Ра-мида (Рис.1.). Кроме того, сам РМЯРамид не отменяет ингиби-рующего действия опиатов на сердечно-сосудистую и дыхательную системы у крыс. Характерно, что гипотензия и брадикардия, наблюдавшиеся при введении УСОРМИРамида, полностью блокировались предварительной инфузией налоксона.

Таким образом, результаты этой серии свидетельствуют о том, что эндогенная опиоидная система не участвует в реализации гемодинамических эффектов РМИРамида, тогда как УООРМИРамид проявляет свойства типичного опиоида.

Дальнейшие эксперименты были направлены на исследование роли симпатической нервной системы в реализации гемодинамических эффектов РМЯРамида.

Данные, полученные в этих экспериментах (Рис. 1.), свидетельствуют о том, что ни адреналэктомия, ни истощение эндогенных депо катехоламинов резерпином, ни снижение центральной симпатической активности клофелином достоверно не ослабляют прессорного и кардиостимулирующего действия РМЯРамида. Пропранолол, достоверно не сказываясь на выраженности прессорного эффекта пептида, отменял гипотензивную фазу реакции, однако не препятствовал развитию тахикардии. Предварительная симпатическая ганглиоблокада пентамином и бензогексонием также достоверно не сказывались на выраженности прессорного и кардиостимулирующего эффекта РМЯРамида.

Гипер- Бради- Бради- Гипо- Тахи- Тахи-

тензия кардия пноэ тензия кардия пноз

Блокада опиатных рецепторов О О О О О о

Стимуляция опиатных рецепторов о О о о о о

Симпатическая ганглиоблокада о о о • о о

Истощение депо катехоламинов о о о о о о

Удаление надпочечников о о о о о о

Блокада а-адреиорецепторов • • • о о о

Блокада (5-адренорецепторов о о о • о о

Стимуляция а2-адренорецепторов о о о о о о

Стволовая ваготомия о • о о о о

Блокада м-холинорецепторов о • о о о о

Стабилизация дыхания о о о о о о

(3 не влияет на указанный эффект пептида; ф отменяет указанный эффект пептида; (3 неоднозначные данные.

Рис. I. Результаты физиолого-фармакологического анализа механизма действия ГМЯГамида.

Вместе с тем, на фоне блокады периферических а-адренорецепторов аминазином пептид оказывал лишь слабое прессорное действие, сопровождавшееся выраженной тахикардией. Рефлекторной брадикардии и угнетения дыхания не наблюдалось. Блокада периферических а-адренорецепторов дигидроэрго-тамином полностью отменяла прессорный эффект пептида, выявляя его депрессорное действие. При этом у крыс также наблюдалось значительное увеличение частоты сердечных сокращений и некоторое учащение дыхания без начального брадипноэ.

Характерно, что при в/в введении крысам адреналина у них наблюдалась гемодинамическая реакция, сходная с реакцией на введение РМИРамида, а действие норадреналина напоминало действие 11Рх2НС1.

Эксперименты на кошках, в которых проводилось исследование гемодинамических реакций на введение пептида, в целом, подтвердили данные проведенного нами фармакологического анализа. РМЯРамид при в/в введении в дозах от 0,01 до 0,1 мг/кг вызывал у кошек дозозависимое увеличение АД, сопровождавшееся значительным учащением сердечного ритма. Симпатическая ганглиоблокада бензогексонием достоверно не сказывалась на выраженности гемодинамических сдвигов, тогда как предварительная а-адреноблокада дигидроэрготамином полностью отменяла прессорное действие, а (3-адреноблокада ослабляла кардиовозбуждающее действие пептида.

Однако, введение РМИгамида в боковые желудочки головного мозга кошек существенных изменений гемодинамических показателей не вызывало, что указывает на преимущественно периферическое приложение действия пептида.

Полученные данные свидетельствуют о том, что гемоди-намические эффекты РМЯРамида реализуются с непосредственным участием периферического адренорецепторного аппарата, однако симпатическая нервная система не вовлекается в реализацию этих эффектов пептида. Таким образом, можно предполо-

жить, что FMRFc-шид является пептидным лигандом адреноре-депторов.

Однако, адреномиметики, как известно, обладают не только гемодинамическим действием, но и целым рядом других свойств, таких, например, как: способность повышать уровень глюкозы в крови, способность вызывать сокращение или расслабление изолированных гладкомышечных препаратов in vitro и in situ и др. Известна также способность адреномиметиков вызывать патологические эффекты при ведении в больших дозах. С целью выявления и изучения этих эффектов пептида нами была проведена следующая часть работы.

Действие FMRFaMHfla на гладкомышечпые органы.

При введении FMRFaMima у кошек одновременно с бурной гемодинамической реакцией наблюдалось дозозависимое сокращение третьего века, являющегося, как известно, адреноре-активным органом. Ни симпатическая ганглиоблокада, ни перерезка шейного симпатического нерва не сказывались на выраженности миотропного действия пептида, тогда как предварительная а-адреноблокада полностью отменяла его. Следут отметить, что сокращение мигательной перепонки у кошек наблюдалось только при парентеральном введении пептида (Табл. 1)..

При проведении экспериментов на энуклеированных глазах лягушек выяснилось, что РМИБамид, подобно адреналину, вызывает мидриаз при добавлении его в орошающую глаз жидкость в разведении 1:20 ООО, что указывает на прямое адреноре-цепторное действие пептида.

Таблица 1.

Сокращение мигательной перепонки у кошек под действием

РММ<амида.

Условия опыта Амплитуда сокращения, %

Электро стимуляция Дозы пептида, мг/кг

0,01 0,05 0,1

Исходно (контроль) 100,0+8,6 (п=10) 11,2±4,3 (п=6) 27,0±3,2* (п=13) 37,8±6,8 (п=7)

На фоне бензогексония 24,5+9,4д (п=6) 11,5±2,5 (п=6) 21,9±3,6* (п=7) 42,8±5,0" (п=6)

После денервации 0 (п=8) 14,0±5,8 (п=6) 23,7+4,7 (п=8) 37,4±6,Г* (п=8)

На фоне дигид-роэрготамина 0 (п=6) 0 (п=6) 0 (п=6) 0 (п=6)

Примечание. Амплитуда сокращения мигательной перепонки выражается в % к максимальному сокращению, вызванному электростимуляцией, в контроле; п - количество экспериментов.

Л - р < 0,05 при сравнении с показателем в контроле; - р < 0,05 при сравнении с дозой 0,01 мг/кг;

**- р < 0,05 при сравнении с дозой 0,05 мг/кг.

Эти данные свидетельствуют о том, что миотропное действие РМИРамида реализуется через а-адренергические механизмы независимо от активации симпатической нервной системы, что косвенно подтверждает высказанное ранее предположение.

С целью исследования способности РМКРамида изменять концентрацию глюкозы в плазме крови было проведено 3 серии экспериментов.

Как выяснилось при проведении 1-ой серии, внутрибрю-шинное введение РМЯРа в дозе 0,5 и 5,0 мг/кг бодрствующим крысам вызывает у них развитие выраженной гипергликемии, не отличавшейся от вызванной равной дозой адреналина .

В следующей серии экспериментов нами была предпринята попытка выявить некоторые механизмы гипергликемиче-ского действия РМЯРамида (Табл. 2).

Таблица 2.

Влияние пентамина и днгидроэрготамина на гипергликемический эффект ПУДОЕамида.

Условия эксперимента Концентрация глюкозы, ммоль/л

до опыта после опыта

РМЯРамид 4,93±0,35 9,45+0,96*А

Пентамин+ РМЛРамид 5,73±0,30 12,42±2,35*

Дигидроэрготамин+РМКРамид 4,74+0,23 7,33±0,77*л

* - р < 0,05 при сравнении со значением показателя до опыта; 4 - р < 0,05 при сравнении с группой " Пентамин+ РМИРамид".

В ходе экспериментов выяснилось, что РМЯБа при в/в введении также вызывает у крыс достоверное увеличение концентрации глюкозы в плазме крови. Предварительная симпатическая ганглиоблокада пентамином не ослабляла гипергликемиче-ского эффекта пептида. Уровень гликемии в этих условиях был даже несколько выше, чем в предыдущей группе. Вместе с тем, предварительная а-адреноблокада дигидроэрготамином существенно ослабляла вызванное РМКРамидом увеличение концентрации глюкозы в плазме крови. Гипергликемия у крыс при введении им пептида на фоне действия днгидроэрготамина была вы-

ражена достоверно слабее, чем при введении пептида на фоне симпатической ганглиоблокады.

При проведении третьей серии экспериментов выяснилось, что КРх2НС1, в отличие от РМ11Р'амида, обладает достаточно низкой метаботропной активностью.

Исследование патологических эффектов

РМ11Рамида.

Исследование эдемогенного действия ГМИГамид-

подобных пептидов.

Результаты первой серии экспериментов показали, что при в/б введении РМИР амида и адреналина в дозах по 5,0 мг/кг у крыс в обеих группах наблюдается развитие острого отека легких. Следует отметить, что выраженность отека легких при введении РМИРамнда была несколько меньшей, чем при введении адреналина, однако эти различия были статистически недостоверны.

В таблице 3 представлены результаты исследования эде-могенных свойств КРх2НС1, в ходе которого выяснилось, что в/в болюснос введение пептида в дозах 0,1; 0,3 и 0,5 мг/кг вызывает у крыс развитие выраженного отека легких. Максимальная выраженность отека легких наблюдалась в группе животных, получавших дипептид в дозе 0,5 мг/кг. Из результатов этой серии экспериментов видно, что имеется четкая корреляция между тяжестью развивающегося отека легких и дозой вводимого вещества. Следует отметить также, что смертность животных в течении первого часа после инъекции пептида также зависела от дозы вводимого ЯРх2НС1.

На вскрытии легкие имели характерные признаки отека: они были полнокровны, тонули в воде, легкие имели мраморную окраску, с разреза легких стекала обильная кровянистая жидкость; трахея и бронхи были заполнены густой кровянистой пеной.

Таблица 3.

Изменение легочных коэффициентов у крыс под действием

МРх2НС1.

Вариант опыта ВК СО, %

Контроль (п=6) 0,56±0,03 19,50 + 0,71

ЯРх2НС1 0,1 мг/кг (п=8) 0,82±0,03д 18,71 ±0,41

11Рх2НС1 0,3 мг/кг (п=8) 1,10±0,03д* 15,59±0,57д*

КРх2НС1 0,5 мг/кг (п=8) 1,45±0,02д*" 13,67±0,74л*"

Л - р < 0,05 при сравнении с контролем;

* - р < 0,05 при сравнении с дозой 0,1 мг/кг;

* - р < 0,05 при сравнении с дозой 0,3 мг/кг.

При проведении третьей серии экспериментов была предпринята попытка выявить некоторые механизмы формирования отека легких под действием РМЯРа-подобных пептидов. В результате выяснилось, что предварительная симпатическая ганг-лиоблокада ослабляет выраженность отека легких, вызванного РМКРамидом, а блокада а-адренорецепторов полностью отменяет эдемогенное действие пептида.

Итак, при проведении этой части работы мы установили следующее: парентеральное введение РМКРамида и ЛРх2НС1 крысам в больших дозах вызывает у них развитие отека легких; выраженность отека легких у крыс носит дозозависимый характер; отек легких, индуцируемый РМЛРа, ослабляется предварительной инфузией пентамина и полностью отменяется предварительной а-адреноблокадой при помощи дигидроэрготамина.

Таким образом, РМИРа-подобные пептиды при введении в больших дозах оказывают эдемогенное действие, реализуемое, по-видимому, через а-адренорецепторный аппарат сосудов.

Аритмогенное действие ЕМКРамида.

Как уже указывалось, при проведении экспериментов на кошках мы обратили внимание на то, что при в/в введении РМЯРамида у них довольно часто на высоте гипертензии наблюдалось появление экстрасистолии. Причем, если введение пептида в дозе 0,01 мг/кг вызывало аритмии лишь в 18,2% случаев, то при введении пептида в дозах 0,05 и 0,1 мг/кг аритмии наблюдались 86,9% и 93,3% случаев, соответственно.

Характерно, что длительность периода аритмий у кошек зависела от вводимой дозы пептида. Аритмии, вызываемые РМИРамидом, не отменялись и не ослаблялись предварительной симпатической ганглиоблокадой.

Обзидан полностью отменял аритмогенное действие РМКРамида в дозе 0,01 мг/кг и достоверно ослаблял аритмогенное действие пептида, вводившегося в дозе 0,05 мг/кг. Вместе с тем, введение пептида в различных дозах на фоне действия ди-гидроэрготамина, блокирующего его прессорный эффект, не вызывало аритмий у кошек ни в одном случае, что свидетельствует, на наш взгляд, о рефлекторном характере наблюдавшихся аритмий.

По-видимому, появление аритмий у кошек обусловлено возникновением дисбаланса в вегетативной регуляции сердца при введении РМЯРамида в указанных дозах. Действуя непосредственно на (3-адренорецегггоры, ¡-МКРамид повышает возбудимость миокарда, однако одновременно за счет усиления им-пульсации с барорецепторов рефлексогенных сосудистых зон повышается тонус блуждающего нерва, ингибирующего сино-атриальный узел. В результате наблюдается появление политоп-ных экстрасистол.

Эффекты пептидов семейства ЕМЫЕамида в условиях альтерации функций при клинической смерти у крыс.

По данным, представленным в таблице 4, видно, что реанимация животных после 10-ти минутной клинической смерти, проводимая с помощью стандартных мероприятий (реинфузия выпущенной крови, искусственная вентиляция легких, закрытый массаж сердца), приводит к частичному восстановлению функций сердечно-сосудистой системы у половины крыс контрольной группы. У остальных животных контрольной группы во время реинфузии крови или сразу после нее развивалась неукротимая фибрилляция сердца. Несмотря на некоторое улучшение гемоди-намических показателей у части крыс контрольной группы на 10-ой минуте реанимации, в дальнейшем у них наблюдалось прогрессивное снижение показателей АД и ЧСС, и к 30-ой минуте постреанимационного наблюдения все животные этой группы погибли.

Таблица 4.

Изменение частоты сердечных сокращений (ЧСС), частоты дыхания (ЧД) и уровня среднего артериального давления (АД) у крыс в процессе реанимации после клинической смерти, вызванной острой кровопотереи (М±ш).

Параметры Группа животных

контроль ЯРа КРх2НС1 БМ^а налоксон

Исходные значения ЧСС, уд/мин 340,0+9,6 348,0+18,9 387,5±33,9 314,8±24,0 362,0+18,9

чд, вд/мин 37,5±2,9 29,2+4,0 69,2±5,7 46,2±12,4 39,5+6,7

АД,мм. рт.ст. 102,5±7,3 108,0+9,6 131,7±17,2 112,0±7,7 108,0+5,7

10 мин. реанимации ЧСС, уд/мин 76,6±11,6 171,0±10,5* 212,5±24,0* 180,6±17,2* 53,0+11,6

чд, вд/мин 0 0,4+0,3* 2,0±0,9* 5,8±4,7* 0

АД,мм. рт.ст. 25,0+3,2 66,0+11,5* 68,3±13,4* 96,0+17,2* 20,0±3,2

40 мин. реанимации ЧСС, уд/мин — 105,0±24,0 209,2+33,9 197,4±33,9 —

чд, вд/мин — 4,8+2,7 25,3±12,3 23,8±9,9 —

АД,мм. рт.ст. — 38,0±15,3 68,3±18,9 64,0±5,7 —

*- р<0,05 по сравнению с контролем (критерий Манна-Уитни).

Введение налоксона в комплекс реанимационных мероприятий существенно не сказывалось на результатах реанимации. До сороковой минуты постреанимационного наблюдения ни одна крыса не дожила.

Добавление в кровь перед реинфузией КГамида, Ш;х2НС1 или РМИРамида приводило к достоверному, по сравнению с контролем, улучшению гемодинамических показателей у крыс. Это способствовало восстановлению самостоятельного дыхания и повышению выживаемости животных после реанимации. Выживаемость в этих группах животных на 40-ую минуту постреанимационного наблюдения составляла 42,9%, 62,5% и 83,3%, соответственно.

Полученные результаты позволяют заключить, что при реанимации после 10-ти минутной клинической смерти у крыс на фоне восполнения объема крови все исследованные олигопепти-ды оказывают отчетливое стимулирующее действие на функции сердечно-сосудистой и респираторной систем, повышая выжи-

ваемость животных. При этом эффекты RFx2HCl и, особенно, FMRFaMHAa значительно более выраженны, чем эффекты RFa-мида.

Отсутствие положительного эффекта у налоксона свидетельствует, во-первых, о том, что роль эндогенной опиоидной системы в формировании терминального состояния при остром обескровливании минимальна, а во-вторых, о том, что механизмы действия FMRFaMHAa и налоксона различны.

В целом, полученные нами данные позволяют заключить, что FMRFa-подобные пептиды являются агонистами адреноре-цепторов.

В свете наших данных приобретает физиологический смысл факт локализации FMRFa-иммуннореактивного материала в адренергических нейронах ствола головного мозга и гипофизе (Weber et al., 1981; Hokfelt atal., 1982): в адренергических синапсах пептиды этого семейства способны выполнять роль медиатора или модулятора, а попадая в кровоток, играют роль пептидных адреналин-подобных гормонов. Последнее предположение косвенно согласуется с данными И.А.Волчегорского и др. (1994) об обнаружении в составе некоторых фракций "средних молекул" симпатомиметических компонентов, способных оказывать стресс-потенциирующее действие.

Из литературы (Ашмарин, Каменская, 1988; Гомазков, 1992; Иванов и др., 1992) известно, что FMRFa-подобные пептиды могут образовываться путем ограниченного протеолиза из некоторых опиодных пептидов. Это позволяет предположить существование принципиально новой связи между эндогенной опиоидной и симпато-адреналовой системами: фрагменты опио-идов, образующиеся в результате их ограниченного протеолиза, обладают способностью взаимодействовать с адренорецептора-ми, выступая, таким образом, в качестве функциональных антагонистов своих предшественников.

Весьма вероятно, что в физиологических условиях роль РМИРамид-подобных пептидов в регуляции функций не велика, но она может существенно возрастать при некоторых состояниях, сопровождающихся гиперпродукцией опиоидов (таких, например, как шок, гибернация и т.п.), когда создаются условия для образования этих пептидов и высвобождения их в кровь или спи-номозговую жидкость. При этом Р М К. Рам и д-под об ны е пептиды играют роль факторов активации физиологических функций, способствующих выходу из гипобиотического состояния.

ВЫВОДЫ

1. РМ11Рамид при системном введении в организм млекопитающих вызывает гемодинамические, метаболические и мио-тропные эффекты, характерные для адреномиметиков.

2. Гемодинамические и миотропные эффекты РМКРамида проявляются только при парентеральном введении пептида и отсутствуют при введении его в желудочки головного мозга.

3. Эндогенная опиоидная система не участвует в реализации гемодинамических эффектов пептида.

4. Кардио-васкулярное, гипергликемическое и миотроп-ное действие РМЯРамида реализуется через периферический адренорецепторный аппарат и не зависит от уровня функциональной активности и анатомической целостности симпатической нервной системы.

5. В/в введение РМЯРамида в больших дозах вызывает развитие острого отека легких у крыс, предотвращаемого а-адреноблокадой.

6. Кардиостимулирующее и вазопрессорное действие РМКРамида у крыс наиболее выраженно проявляется при реанимации их после 10-ти минутной клинической смерти.

7. РМИРамид является эндогенным пептидным лигандом адренорецепторов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО

ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Парин С.Б. Зимин Ю.В., Кузьмин Е.Г., ТИНЯКОВ Р.Л., Соколова НА., Крылов В.Н. Применение пептидов опиоидного ряда в экспериментальной терапии шока. - Антигипоксанты и актопротекторы: Мат. Рос. науч. конф. - С.-Пб., вып. 4, 1994 .

2. ТИНЯКОВ Р.Л., Парин С.Б., Крылов В.Н., Соколова H.A., Беспалова Ж.Д., Дубынин В.Н., Каменский A.A., Ашмарин И.П. Реанимирующее действие FMRFa-подобных пептидов при клинической смерти у крыс. - Бюлл. эксперим. биол. и мед. -

1996. -№4.-С. 417-419.

3. ТИНЯКОВ Р.Л., Белякова О.В. Адренергический механизм действия FMRFaMima.- Вторая Нижегородская сессия молодых ученых (21-25 апреля 1997 г.)// Тез. докл.- Н. Новгород.-

1997,- С. 243.

4. ТИНЯКОВ Р.Л., Парин С.Б., Беспалова Ж.Д. Адрено-миметические свойства кардиоактивных пептидов семейства FMRF-амида.- Сравнительная электрокардиология-97. IV Международный симпозиум по сравнительной электрокардиологии (2-5 июня 1997 г., Сыктывкар) // Тез. докл.- Сыктывкар.- 1997.- С. 112-113.

5. ТИНЯКОВ PJL, Парин С.Б., Корягин A.C., Зимин Ю.В., Крылов В.Н., Пономаренко A.A., Стрелкова И.Г., Дончен-ко Е.В. Изучение механизма влияния FMRFaMHfla на углеводный обмен у крыс,- Второй съезд биохимического общества Российской Академии наук (19-23 мая 1997 г., Москва)// Тез. стендовых сообщ.- Пущино.- 1997,- Ч. 1.- С. 237.

6. ТИНЯКОВ Р.Л., Парин С.Б., Корягин A.C., Крылов В.Н., Пономаренко A.A., Звонкова М.Б. Исследование механизмов действия регуляторных пептидов семейства FMRFa.Mnaa.-Второй съезд биохимического общества Российской Академии наук (19-23 мая 1997 г., Москва)// Тез. стендовых сообщ,- Пущино.- 1997.- Ч.2.-С. 469.

7. Ларин С.Б., ТИНЖОВ P.JL, Беспалова Ж.Д. Опиатные антагонисты и регуляторные пептиды в терапии шока,- VI съезд травматологов и ортопедов России (9-12 сентября 1997 г., Н. Новгород)// Тез. докл.- Н. Новгород.- 1997.- С. 123.

8. ТИНЯКОВ PJL, Парин С.Б., Соколова H.A., Ашмарин И.П. Неопиоидная природа прессорного эффекта FMRF-амида,-Бюлл. эксперим. биол. и мед.- 1997.-Т. 124.- №11,- С. 513-515.

9. ТИНЖОВ Р.Л., Парин С.Б., Пономаренко A.A., Беспалова Ж.Д., Малиновская И.В. Способ моделирования отёка лёгких,- Приоритетная справка №97117810/14 от 24.10.97. на предполагаемое изобретение.