Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние энкефалинов на активность ферментов обмена регуляторных пептидов в головном мозге и периферических органах крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Митюшина, Наталья Валентиновна, Пенза

61- 99 -5/3?/-5"

ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ В.Г. БЕЛИНСКОГО

На правах рукописи МИТЮШИНА Наталья Валентиновна

ВЛИЯНИЕ ЭНКЕФАЛИНОВ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ОБМЕНА РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ И ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ ТКАНЯХ

КРЫС

03.00.04 - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель кандидат биологических наук профессор Генгин М.Т.

ПЕНЗА - 1999

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ..........................................................................................................6

ВВЕДЕНИЕ ..............................................................................................................................................7

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ..........................................................................................10

1.1. Опиоидные пептиды в системе регуляторных пептидов........................10

1.1.1. Общие представления о регуляторных пептидах................................10

1.1.2. Биологическая роль и свойства опиоидных пептидов..................12

1.2. Биогенез опиоидных пептидов ....................................................................................19

1.3. Ферменты обмена регуляторных пептидов и механизмы регуляции их активности ..............................................................................................................23

1.3.1. КарбоксипептидазаН (Кф 3.4.17.10) ..........................................................27

1.3.2. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза ..............................................31

1.3.3. Ангиотензинпревращающий фермент (Кф 3.4.15.1)......................33

1.3.4. Механизмы регуляции активности ферментов обмена регуляторных пептидов............................................................................................................36

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................40

2.1. Материалы исследования ..................................................................................................40

2.2. Методы определения активности ферментов ................................................41

2.2.1. Определение активности карбоксипептидазы Н ..............................41

2.2.2. Определение активности ФМСФ-ингибируемой КП......................42

2.2.3. Определение активности ангиотензинпревращающего фермента ..................................................................................................................................................43

2.3. Метод определения содержания белка ..................................................................43

2.4. Методы определения активности ферментов in vitro................................43

2.4. Статистическая обработка результатов исследования..............................44

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ........................................................45

3.1. РЕГИОНАЛЬНОЕ И ТКАНЕВОЕ РАСПРЕДЕЛИЕ АКТИВНОСТЕЙ ФЕРМЕНТОВ ОБМЕНА РЕГУЛЯТОРНЫХ

ПЕПТИДОВ У ИНТАКТНЫХ ЖИВОТНЫХ И ПРИ

ИНСТИЛЛЯЦИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА.................. 45

3.2. ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ДОЗ ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИН-АРГ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ОБМЕНА РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ И ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ ОРГАНАХ КРЫС................................................................. 50

3.2.1. Активность карбоксипептидазы Н в тканях и отделах мозга крыс при введении различных доз лей-энкефалин-арг................ 51

3.2.2. Активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях и отделах мозга крыс при введении различных доз лей-энкефалин-арг ................................................................ 55

3.2.3. Активность ангиотензинпревращающего фермента в тканях и отделах мозга крыс при введении различных доз лей-

энкефалин-арг ................................................................. 58

3.3. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЛЕЙ- И МЕТ-ЭНКЕФАЛИНОВ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ОБМЕНА НЕЙРОПЕПТИДОВ В МОЗГЕ И ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ ТКАНЯХ КРЫС..........,.................................................................. 63

3.3.1. Активность карбоксипептидазы Н в мозге и периферических тканях крыс при введении лей-энкефалина........... 64

3.3.2. Активность карбоксипептидазы Н в мозге и периферических тканях крыс при введении мет-энкефалина........... 66

3.3.3. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в мозге и периферических тканях крыс при введении лей-энкефалина........... 69

3.3.4. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в мозге и периферических тканях крыс при введении мет-энкефалина........... 71

3.3.5. Активность ангиотензинпревращающего фермента в мозге и периферических тканях крыс при введении лей-энкефалина . 74

3.3.6. Активность ангиотензинпревращающего фермента в мозге и периферических тканях крыс при введении мет-энкефалина. 75

3.4. ВЛИЯНИЕ ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИН-АРГ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ОБМЕНА РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ И ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ ОРГАНАХ КРЫС..... 79

3.4.1. Активность карбоксипептидазы Н в мозге и периферических тканях крыс при введении лей-энкефалин-арг........ 80

3.4.2. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в мозге и периферических тканях крыс при введении лей-энкефалин-арг....... 83

3.4.3. Активность ангиотензинпревращающего фермента в мозге и периферических тканях крыс при введении лей-энкефалин-

арг................................................................................... 85

3.5. ВЛИЯНИЕ ЭНКЕФАЛИНОВ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ

ОБМЕНА РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ IN VITRO.................. 89

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ....... 93

ВЫВОДЫ .......................................................................... 110

ЛИТЕРАТУРА ..................................................................... 112

АКТГ

АМПЯК

АПФ

АПЯК

БСА

гп як

ГЭБ

гэмяк кгт кпн мгтк

мсг помк

ПХМБ

смж

ФМСФ

цнс

ЭПР

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

адренокортикотропный гормон аминопропилмеркаптоянтарная кислота ангиотензинпревращающий фермент аминопропилянтарная кислота бычий сывороточный альбумин гуанидинопропилянтарная кислота гематоэнцефалический барьер гуанидиноэтилмеркаптоянтарная кислота карбоксипептидаза карбоксипептидаза Н

ОЬ-2-меркаптометил-3-гуанидиноэтилтио-пропановая кислота

меланоцитстимулирующий гормон проопиомеланокортин п-хлормеркурийбензоат спинномозговая жидкость фенилметилсульфонилфторид центральная нервная система эндоплазматический ретикулум

ВВЕДЕНИЕ

В последнее время внимание многих исследователей направлено на изучение нейропептидов - эндогенных регуляторов, выполняющих в организме функции нейромедиаторов, нейромодуляторов и гормонов [40, 47, 82, 143, 169]. Особый интерес вызывают опиоидные пептиды. Высокая анальгетическая активность [57, 200], антистрессорное действие [И, 52, 70, 76, 184], влияние на нейромедиаторную [194], нейроэндокринную [6, 58, 100] и иммунореактивную [62, 93, 104, 110] системы, на эмоциональное и психическое состояние организма [53, 143] - все эти эффекты дают возможность рассматривать опиоидные пептиды в качестве эндогенных регуляторов многих физиологических и патологических процессов в организме. В связи с этим, представляется перспективным для медицинской практики экзогенное введение опиоидов и их аналогов в организм в качестве средств, идентичных или близких по природе к эндогенным.

В настоящее время особый интерес вызывает факт длительного последействия регуляторных пептидов, в том числе опиоидных [4, 39, 51, 73, 74], механизм которого до сих пор не изучен. По современным представлениям, проявление длительных эффектов короткоживущих регуляторных пептидов объясняется на основе концепции о функциональной непрерывности, регуляторном континууме [3-5, 51]. Такой континуум характеризуется способностью каждого из регуляторных пептидов индуцировать выход определенной группы других пептидов, которые в свою очередь способны к такого же рода модулирующим эффектам. В результате чего, вслед за прямыми эффектами того или иного пептида, может возникать целых ряд цепных или каскадных процессов [3-5, 51]. Поскольку интенсивность обмена нейропептидов определяется пептидгидролазами, участвующими в посттрансляционном процессинге и в инактивации регуляторных пептидов

[79, 143, 164, 221, 228], то не исключена возможность, что образование таких сложных регуляторных цепей в организме осуществляется путем активации протеолитических ферментов.

Известно, что на конечной стадии процессинга принимают участие основные КП (карбоксипептидазо-В-подобные ферменты), которые катализируют гидролитическое отщепление основных аминокислот -аргинина и лизина с С-конца пропептидов, превращая их в активные формы. Одним из ключевых ферментов процессинга энкефалинов в мозге является карбоксипептидаза Н (КПН) (Кф 3.4.17.10) [41, 124, 126-132]. Кроме энкефалинов, она вовлекается в генез многих других нейропептидов - АКТГ, вещества Р, вазопрессина, окситоцина и др. [32, 124, 126, 133]. Недавно обнаружена еще одна основная КП - фенилметилсульфонил-фторид-ингибируемая КП (ФМСФ-ингибируемой КП) [28, 31], также отщепляющая остатки С-концевых основных аминокислот и обладающая сходной с КПН субстратной специфичностью. Однако функции этой карбоксипептидазы еще не изучены. На уровень энкефалинов, а также других регуляторных пептидов может воздействовать и ангиотензинпревращающий фермент (АПФ) (Кф 3.4.15.1), принимающий участие, как и их процессинге, так и инактивации, проявляя при этом дипептидилкарбоксипептидазную и эндопептидазную активности [44, 121, 122]. Однако эти ферменты изучены недостаточно. Менее всего исследовано их участие в различных физиологических и патологических процессах, взаимодействие и взаимовлияние с другими компонентами системы обмена нейропептидов, а также механизмы регуляции их активности. Поэтому, изучение вышеперечисленных вопросов имеет большое значение для решения проблем целенаправленного воздействия на их активность, что немаловажно для медицинской практики. В свою очередь, изучение влияния нейропептидов на активность протеолитических ферментов приблизит нас к пониманию механизмов их

действия в организме, длительного сохранения биологических эффектов, а также молекулярных механизмов функционирования пептидэргических систем в мозге.

В этой связи, целью настоящей работы был сравнительный анализ влияния энкефалинов на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в головном мозге и периферических тканях крыс через различные сроки после инсталляции. Для осуществления намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить региональное и тканевое распределение активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс у интактных животных и после инстилляции физиологического раствора.

2. Сравнить влияние различных доз лей-энкефалин-арг на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс.

3. Изучить влияние лей-, мет-энкефалинов и лей-энкефалин-арг на активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в мозге, надпочечниках и семенниках животных в различные сроки после введения.

4. В опытах in vitro оценить влияние энкефалинов на активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в среде инкубации.

Полученные данные позволят, в определенной степени, пролить свет на роль протеолитических ферментов в обмене опиоидных пептидов и в проявлении индивидуальных особенностей действия энкефалинов в организме - их полифункциональности и длительного последействия, а также дают возможность рассматривать роль энкефалинов в эндогенных механизмах регуляции активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ головного мозга и периферических органов крыс.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ОПИОИДНЫЕ ПЕПТИДЫ В СИСТЕМЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ

ПЕПТИДОВ

1.1.1. ОБЩИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДАХ

За последние годы было открыто и изучено более шестисот регуляторных пептидов. Действуя в качестве нейромодуляторов, нейромедиаторов и гормонов [82, 143, 169], нейропептиды играют важную роль практически во всех функциях мозга и организма в целом. Показано, что они участвуют в регуляции и реализации многих процессов, таких как память, обучение, сон, эмоциональное поведение, ощущение боли, адаптивных процессов, половых функций, воздействуют на возбуждение и торможение деятельности нервных клеток, на формирование, хранение и реализацию информации и пр. [6, 66, 70, 86, 143, 195]. Благодаря способности влиять на ЦНС, регуляторные пептиды получили название "нейропептиды".

Нейропептиды широко представлены в мозге и в периферической нервной системе, кроме того, обнаружено их присутствие в некоторых периферических органах и биологических жидкостях организма [96, 103, 135, 165, 169, 198]. Содержание их в тканях варьирует преимущественно в пределах 10"12-10"9М [5].

Современная классификация биологически активных пептидов [5] включает около 40 семейств. Она основывается на сочетании трех основных принципов: функционального, структурного и топологического:

♦ Самым многочисленным и разнообразным по функциям семейством нейропептидов являются опиоиды - вещества, специфически

связывающиеся в структурах мозга и периферических тканях с рецепторами морфина.

♦ Семейство гипоталамических рилизинг-факторов состоит из либеринов -веществ, стимулирующих выход (а в ряде случаев и синтез) определенных гормонов из клеток гипофиза и статинов - веществ, тормозящих его. Рилизинг-факторы весьма разнообразны по структуре и синтезируются не только в гипоталамусе, но и во многих других отделах мозга и организма в целом. Помимо их основной функции, либерины и статины обладают также нейротропным действием.

♦ Наиболее изученным представителем семейства меланокортинов является АКТГ, основной функцией которого является стимуляция выделения надпочечниками кортикостероидов [224]. Кроме того, многими авторами показано участие АКТГ в адаптивных перестройках нервной системы при различных функциональных состояниях организма (стресс, шок и т.п.), а также во многих физиологических функциях мозга, таких как память, обучаемость, внимание и т.д.[143, 184].

♦ Представители следующего семейства - вазопрессин и окситоцин образуются в гипоталамусе, хранятся в нейрогипофизе и секретируются в кровь. Кроме их основных функций (вазопрессин - дистантный ингибитор диуреза и вазопрессор, а окситоцин - стимулятор сокращения матки при родах), эти нейропептиды обладают и нейротропными свойствами [143].

♦ Вещество Р - наиболее изученный представитель семейства тахикининов, обладает сложным спектром центральных и периферических эффектов (является одним из медиаторов и модуляторов сенсорных импульсов; обладает гипотензивными свойствами и участвует в адаптации организма к стрессу) [59, 195].

♦ Интересным в плане сходства с опиоидными пептидами является представитель следующего семейства нейропептидов - нейротензин. Как и эндогенные опиоиды, он обладает анальгетическим действием (хотя реализует это не через опиатные рецепторы), причем сочетает анальгезию с гипотермической и гипотензивной активностью [95, 209].

♦ Представители семейств кининов и ангиотензинов - брадикинин и ангиотензин - давно известные факторы формирования тонуса сосудов. Кроме того, показано, что они способны изменять нейрональную активность и влиять на поведение (например, брадикинин известен как местный модулятор боли, а ангиотензин участвует в формировании агрессивности) [7, 42].

♦ Нейропептиды также представлены множеством других семейств: глюкагонсекретины, "панкреатические" пептиды, бомбезины, мотилины, кальцитонины, атриопептиды, эндозепины и др.

Однако при любом делении большого количества нейропептидов, неизбежно остаются отдельные соединения, которые "не вписываются" в принятую классификацию (например - пептид-8-сна). Кроме того, большинству из хорошо изученных нейропептидов присущи столь разнохарактерные свойства (с одной стороны - уникальные, а с другой -схожие с другими пептидами), что каждое из них претендует на отдельную классификацию. Поэтому, необходимо признать, что до сих пор, единой классификации не существует.

1.1.2. БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ И СВОЙСТВА ОПИОИДНЫХ

ПЕПТИДОВ

Среди всех регуляторных пептидов, особый интерес вызывают опиоидные пептиды, которые обладают наиболее широким спектром

физиологического действия. Они вовлекаются в регуляцию большинства процессов, протекающих в организме, а в том числе в развитие и патогенез многих психических и неврологических расстройств, таких как алкоголизм и наркомания и др. [10, 70, 91, 160, 178, 218, 227].

Изучение эндогенных опиатов началось с 1973 года, когда в лабораториях Terenius, Snyder и Simon было показано существование в мозге млекопитающих рецепторов морфина. Два года спустя, Hughes и Kosterlitz впервые выделили из мозга свиней эндогенные опиоиды -пентапептиды, имитирующие действие природного морфина - Тир-Гли-Гли-Фен-Лей и Тир-Гли-Гли-Фен-Мет - и назвали их энкефалинами. В это же время Li и Chang выделили и охарактеризовали ß- эндорфин, как фрагмент ß-липотропного гормона 61-91. Эти открытия стали отправной точкой изучения не только эндогенных опиоидов, но и регуляторных пептидов вообще. В настоящее время открыто свыше 30 опиоидных пептидов. Однако изучение механизма их действия на организм весьма затруднено вследствие сложной структуры ЦНС.

Опиоидные пептиды широко представлены как в нервной системе, так и в периферических органах и тканях. Существуют многочисленные экспериментальные данные, показывающие распределение эндогенных опиатов в организме [98, 103, 135, 165, 169, 198, 203, 241]. В мозге энкефалины присутствуют практически во всех отделах, причем достаточно неравномерно. Их концентрация особенно высока в стриатуме и гипоталамусе и относительно низка в коре, гиппокампе и в мозжечке [96, 187, 248]. При этом известно, что содержани�