Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Арбоксипептидаза Н (энкефалиновразующая карбоксипептидаза) мозга и надпочечников при различных функциональных состояниях организма

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Арбоксипептидаза Н (энкефалиновразующая карбоксипептидаза) мозга и надпочечников при различных функциональных состояниях организма"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ им. U.M. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

УДК 612.822.1.018:[547.95:547.943].015.1

ГРИГОРЬЯНЦ Ольга Орестовна

ЛРБОКСИПЕПТИДАЗА Н (ЭНКЕФЛЛИНОБРЛЗУЮЩЛЯ КАРБОКСИПЕПТИДАЗА) МОЗГА И НАДПОЧЕЧНИКОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СОСТОЯНИЯХ ОРГАНИЗМА

. 03.00.04-- Биохимия .

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Носква - 1990

Работа выполнена в лаборатории физиологически активных пептидов Института биологической и медицинской химии АНН СССР (руководитель лаборатории - д.б.н., профессор O.A. Гомазков).

Научный руководитель • доктор биологических наук, профессор O.A. Гомазков.

Официальные оппоненты .- доктор медицинских наук, профессор D.A. Петрович, доктор биологических наук, профессор Р.Н. Глебов.

Ведущее учреждение • ИГУ им. И.В. Ломоносова

Защита состоится -IL года в 14-00 час на засе-

дании Специализированного Совета (К 074.05.03) при Московской иед

цинской академии им.И.И.Сеченова (Москва,Б.Пироговская ул.,2/6). »

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке акадеии (Зубовская пл., 1).

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор медицинских наук

В.А. Войнов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ [Ктуальность теми. Регуляторные пептиды играют важную роль в уп-¡авлении многими функциями организма - от проведения нервного им-ульса до сложных поведенческих актов. Особый интерес представля-iT собой энкефалины, опиоидные пептиды, входящие в одну из глав-ых стресслимитирующих систем организма. Поддержание должного ровня энкефалинов осуществляется в тканях с помощью ферментов роцессинга.

Экспериментально показано, что регуляция биосинтеза энкефа-инов на уровне посттрансляционного процессинга может происхо-лть при введении различных веществ животному, при внесении фар-1кологических агентов в культуру клеток и при различного рода грессорннх ситуациях. Внимание исследователей, изучавших влия-ie стрессорных воздействий на биосинтез опиоидных пептидов, бы) приковано к изменению содержания самих пептидов или соот-■тсгвующих мРНКОднако решающую роль в регуляции биосинтеза [кефалиноБ могут играть ферменты их процессинга, в частности, |рбоксилептидаза II„ катализирующая конечную стадию образования кефалинов.

Карбоксипептидаза Н (КФ 3.4.17.10) гвдролизует энкефалино-ie предшественники, отщепляя С-концевые лизин или аргинин с об1 зованиеи свободного мег- или лей-энкефалина.

К началу наиего исследования били изучены основные физи--химические свойства, субстратная специфичность карбоксипепти-зы Н [Fricker, Snyder 1982, 1983; Fricker et al. 1982], были исаны частичная очистка карбоксипептидазы Н'из тканей бика ricker, Snyder," 1983), а также получение растворимой и мембра-связанной форм фермента (Hook, 1984).

Изменения активности карбоксипептидазы !1 при различных воз-1ствиях на организм ранее не изучались.

ть исследования.Целью работы являлось исследование регионарной гивности карбоксипептидазы II в мозге и периферических тканях ic на различных моделях измененного функционального состояния 'анизма.

1ач)!| исследования состояли в следующем:

1. Представить доказательства специфичности метода опреде-:ия Со2+-активируемой карбоксипептидазы в гомогеяатах тканей

крыс с использованием дансилышх субстратов.

2. При сравнении дансильных и энкефалинсодераащнх субстратов подтвердить функцию карбоксипептидазы Н как энкефалинобразу-юцего фермента.

3. Исследовать регионарные изменения активности карбоксипептидазы II в гипофизе, надпочечниках и зонах мозга на различных моделях: при эмоционально-болевом и гипергравнтационном стрессах, воздействии инсулина, длительном потреблении этанола и му-рнцидном поведении крыс.

Научная новизна. Получены доказательства специфичности карбоксипептидазы Н как знкефалинобразующего фермента при сравнении дансильных и эякефалинсодернэщих субстратов.

Выявлены изменения активности карбоксипептидазы Н в различных тканевых регионах крыс (гипофиз, надпочечники, сгриатум, та-ламо-гипоталамическая область, средний мозг) при различных функциональных состояниях организма: эмоционально-болевом и гипергравитационном стрессах, воздействии инсулина, длительном потреблении этанола и мурицидном поведении крыс.

Впервые представлены регионарные - для мозга и периферических тканей - характеристики изменений активности карбоксипептидазы Н на моделях эндогенных и-экзогенных изменений функциональных состояний. Эти данные следует рассматривать как отражение участия ферментативного звена энкефалинобразуклцей системы в условиях нормы и патологических изменений функции. Научно-практическое значение работы состоит в обосновании специфичности метода определения карбоксипептидазы Н в мозге и периферических тканях экспериментальных животных.

Проведенные исследования показывают участие карбоксипептида■ зы Н в патогенезе функциональных состояний и доказывают возможность использования карбоксипептидазы Н в качестве подхода к определению энкефалин-зависимых механизмов патогенеза и адаптивной роли регуляторных пептидов при различных воздействиях, а такке открывают возможность фармакологической коррекции нарушенных функциональных состояний с использованием ингибиторов или актив« торов карбоксипептидазы Н.

Публикации. Результаты исследований изложены в Я публикациях. Апробация работы. Результаты работы были доложены на Всесоюзном

симпозиуме по медицинской эизимологии (МахачкалаД986), X Всесоюзной конференции по нейрохимни (Горький,1987), III конференции "Пептиды и адаптация", (Берлин, 1989), конференциях молодых ученых Института медицинской энзимологии АМН СССР (1985, 1986). /Апробация диссертации состоялась на межлаборагорнон семинаре Япститута биологической и медицинской химии АМН СССР 13 июня 1990 г.

Збъем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из зведения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы 1 методы исследования, результаты и обсуждение), выводов и спис-(а литературы, включающего 204 источника. Работа «зложена на ^24 страницах, содержит 11 рисунков и 16 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И ИЕТОДИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В опытах использовали белых нелинейных крыс-самиon массой 80-200 г и крыс-самцов линии Wlstar массой 200-350 г. Зоны моз-а выделяли по методу Gloninskl и Iversen {1966i. Ткани, выде-енные сразу после декапитация крас, гомогенизировали в 10 мИ рис-HCl буфере, рН содержащем 0,25 И сахарозу. Кинетичес-ие характеристики карбоксипептидазы й определяли на суперпатал-е, полученном после центрифугирования гомогеката целого мозга-течение 1 часа при 100.000 g.

Карбоксипептидазную активность в серийных экспериментах оп-эделяли с помощью дансил-фен-ала-арг. Б состав инкубацион-эй пробы входили: ферментный-препарат (50-100 икл), субстрат в энечной концентрации 100 мкМ, +C0CI2 в конечной концентрации' мМ и 50"мМ На-ацегатный буфер рН 5,6 до конечного объема 500 ui. Пробы инкубировали 10 мин при 37°С, реакцию останавливали ) мкл 2,5 н ЯС1. Затем добавляли 2 мл хлороформа, встряхивали измеряли флуоресценцию органической фазы при ЛВОЗ£_=360 км, 1СП =510 ни. Активность карбоксипептидазы H определяли по раз-ще активностей с добавлением и без добавления ионов Са^+. '

Определение карбоксипептидазной активности с помощью далар-¡на. Инкубационные пробы содержали 0,5 мМ даларгин ([D-ала^, !Й^]энкефалин -арг^), [Зн)даларгин (10 000 ерш), ферментный 1впара'т (1-10 мкл), +C0CI2 в конечной концентрации 1 мМ и 50 иИ -ацетатный буфер, рИ 5,6 до конечного объема 50 мкл. Пробы

инкубировали 10 мин при 37°С, реакцию останавливали добавлением 7,5 мкл 2,5 н НС1, и центрифугировали пробы 5 мин при 10 BOO g. Разделение продуктов реакции проводили методом тонкослойной хроматографии в смеси пиридин/СНзСООНЛ^О/н-бутанол в соотношении 2:1:1:5. Участки, соответствующие положению пятен 1^Н]содер»ащн> пептидов, вырезали, радиоактивность определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике.

Определение кинетических констант.Величины Км и Vmax определяли в координатах s/v or s, величины К^ - в координатах 1/v от i (Корниш-Боуден,19791.

Концентрацию белка определяли по методу Lowry et al. [1951], по методу Bradford (19761, а также микробиуретовым методом.

Острый эмоционально-болевой стресс проводили по методике De-siderato et al. [19741. В хроническом эксперименте крыс подвергали стохастическому действию электрического тока на решетке по 1 часу в день в течение 2 недель.

Гипергравитационный стресс проводили путем круглосуточного вращения крыс в центрифуге, создавая гипергравитацив величиной 2 g. Забой ншвоткых производили через 1, 3 и 5 суток.

Влияние больших доз инсулина. Крысам подкожно вводили инсулин в дозе. 50 ед/кг массы. Забой животных производили через 2 часа, 1, 4 и 7 суток после инъекции.

Длительное потребление этанола. Крисы, рассаженные в индивидуальные клетки, потребляли 20% водный раствор этанола при свободном доступе к пище. Через. 40 дней была предоставлена возможность выбора: этанол или вода. Через 2 недели проводили забой крыс, предпочитавших этанол, и крыс, предпочитавших воду.

Ыурицидвое поведение крыс. Крыс помещали в индивидуальные клетки и содержали на стандартной виварийной диете. Из общей группы животных при регулярном тестировании проводили отбор агрессивных крыс, убивавших подсаженную белую мышь. Тестирование и отбор крыс проводили в течение 4-5 недель до получения стабильных показателей мурицидности для кашдого яивотного.

Статистическую обработку проводили с использованием t-критерия Стыодента и непараметрическимн методами.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Энзимологнческая характеристика и регионарная активность карбоксипептидазы Н.

Значительная активация карбоксипептидазы Н ионами Со^+ позволяет определять этот фермент на фоке карбоксипептидазы В, используя к тону же разницу в оптимальном значении рН для этих ферментов.

В таблице 1 представлены данные об активности карбоксипептидазы II в мозге крыс, измеренной по разнице скорости гидролиза цансил-фен-ала-арг в присутствии и в отсутствие ионов Со2+. Как видно из таблицы, удельная активность карбоксипептидазы II в го-югенате мозга в 2,2 раза меньше удельной активности исходной карбоксипептидазы, тогда как в супернатанте удельная активность карбоксипептидазы Н в 1,9 раза превышает исходную карбоксипепти-зазную активность. В то же время при сравнении активности карбоксипептидазы И в гомогенате и супернатанте мозга красы обнаруживается, что после центрифугирования удельная активность фермента возрастает в 3„5 раза. При очистке карбоксипептидазы II из юзга крысы на ДЭАЗ-целлюлозе удельная активность фермента ви-)Осла в 6,4 раза. На этой стадии очистки карбоксипептидазы II ак-'ивация Со^+ увеличивает скорость гидролиза в 3,2 раза.

Удельная активность исходной карбоксипептидазы и карбокси-[ептидазы II, определенная в. гомогенатах нескольких регионов моз-■а, гипофиза и надпочечников крыс, представлена в табл.2. Наи-щсшая активность карбоксипептидазы II обнаруяена в гипофизе' 37,13 нмоль/мин-мг), где она превышала удельную активность фер-1ента в других исследованных регионах больше, чем на порядок. :амая низкая активность карбоксипептидазы Н (0,13 нмоль/мин-мг) ыявлека в надпочечниках. Удельная активность карбоксипептидазы в среднем мозге, стриатуме, талано-гипоталамической области и :оре больших полушарий мозга была примерно одного порядка и сос-авляла 1,99; 2,66; 0,37 и 0,89 нмоль/иин-иг, соответственно, ри сопоставлении удельных активностей карбоксипептидазы И и ис-одной карбоксипептидазы оказалось, что в гипофизе, коре, тала-о-гипртала'-гической области и стриатуме соотноиение активностей кладивается в пользу карбоксипептидазы Н, наиболее отчетливо роявляясь в гипофизе, где оно составило 3,76. В среднем мозге и

Таблица-1.

Активность карбоксипептидазы Н (КП-Н) в иозге крыс

Фракция Белок, мг/мл Удельная активность, нмоль дне-фен-ала/мин-мг

исходная- +Со2+ /\ (кп-н)

Гомогенат 13,91 0,64 0,93 0,29

Супернатант ' 6,95 0,52 1,52 1,00

ДЭАЭ-целлюлоза 0,25 2,00 8,40 6,40

Примечание: мозг крысы гомогенизировали в 10 шМ трис'-НС1 буфере рН 7,7 с 0,3 М сахарозой (гомогенат);аликвоту гоыо-гената центрифугировали 1 час при 100.000 g (супер-натант); супернатант наносили на колонку с ДЭАЭ-цел люлозой.

Таблица 2.

Удельная активность исходной карбоксипептидазы (ИКП) и карбоксипептидазы Н (КП-Н) в гомогенатах тканей гштактнах крыс

Ткань Белок, мг/мл Удельная активность, нмоль дне-фен-ала/мин-мг кп-н/икп

ИКП кп-н

Гипофиз 0,14 9,87 37,13 3,76

Таламус + гипоталамус 3,95 0,22 0,37 1,68

Стриатум' 0,52 2,01 2,66 1,32

Средний мозг 0,34 3,00 1,99 0,66

Кора больших полушарий 0,62 0,63 0,89 1,41

Надпочечники 1,20 0, 38 0,18 0,47

надпочечниках удельная активность карбоксипептидазы Н ниже не -ходной карбокекпэпшцазы.

Функциональную специфичность карбоксипептидазы Н как энке-)алинобразующего фермента проверяли на энкефалинсодержащих субст->атах, 1лейс>]энкефалине-арг^ и [О-ала^лей^энкефалине-арг^ (да-[аргине). Среди продуктов гидролиза [лейл)энкефалина-арг6 фер-'ентным препаратом из мозга крысы на тонкослойной хрсмато-рамме кроме основного продукта - лей-энкефалина присутствовали акже свободный тирозин и трипептид тир-гли-гли. При гидролизе аларгина карбокснпептидазой Н образовывался только один продукт-р-ала2,лей5]-энкефалин.

, Действие ингибиторов на активность карбоксипептидазы II ис-ледовали с использованием в качестве субстрата [лей°]энкефа-ина-арг6. п-Хлормеркурибензоат тормозил активность фермента а 82%, ЭДГЛ -на 71%, СйС12 - на 94%. Структурный аналог аргинина гуанидипоэтилмеркаптоянтарная кислота (ГЭМЯК) - оказался наибо-эе спе цифичным ингибитором карбоксипептидазы II. К^ фермента гии веществом равна 11,5 нМ.

Таблица 3.

Кинетические характеристики исходной карбоксипептидазы (ИКП) и карбоксипептидазы II (КП-Н) мозга крыс

/бстрат Кинетические характеристики ИКП кп-н

1ларгин Ки, мкН 500 46

Ушах, нмоль/шш- иг • 9,6 1,9

1НСИЛ" !И- ала- )Г Ки, мкИ Утах, пноль/иин'нг 35 0,7 - 25 0,2

К^, мгЙ [лей^Гэшефалин-арг® 106 40

даларгин 175 16

ГЭМК 0,0115

Б табл.3 представлены значения констант Миэгаэлиса (Км) и г.ситальнта скоростей реакции для карОокскпептидазч Н

и исходной карбоксипептидазной активности. Км по дансильному субстрату для карбоксипептидазы Н оказалась несколько меньше, чем для исходной активности (25 и 35 мкМ соответственно). При исследовании константы ингибирования ферментов [лей^]эикефали-ном-арг6 были выявлены более четкие различия между карбоксипептидазой Н и исходной карбоксипептидазой. К^ карбоксипептидазы II оказалась в 2,4 раза меньше, чем Kj, исходной карбоксипептидазной активности. При использовании в качестве ингибитора даларгина К^ исходной карбоксипептидазы более, чем на порядок превосходила К^ карбоксипептидазы Н (175 и 16 ккН соответственно). Характер ингибирования [лей^энкефалином-арг^ и даларгином обеих карбокси-пептидазных активностей - конкурентный.

При кинетическом анализе реакции взаимодействия исходной карбоксипептидазы и карбоксипептидазы Н с [3Н]даларгином было установлено, что Кн последней составила 46 нкМ против 500 мкМ для исходной активности (см.табл.3), что свидетельствует о больием сродстве исследуемого фермента к даларгину по сравнению с исходной карбоксипептидазой. Этот факт подтверждает энкефали-нобразуюций характер карбоксипептидазы Н, гак как даларгин структурно близок природному энкефалиновому субстрату. Величины Ки карбоксипептидазы Н по дансильному субстрату и даларгину сопоставимы, что говорит об одинаково хорошем связывании обоих субстратов в активном центре фермента.

Изменение активности карбоксипептидазы Н в тканях крыс при эмоционально болевом стрессе представлено в таблице 4. Наивысшая активность карбоксипептидазы Н наблюдалась в гипофизе, наименьшая - в надпочечниках. В отдельных регионах изменения удельной активности карбоксипептидазы Н происходили следующим образом. При остром стрессе в гипофизе обнаружено достоверное снижение удельной активности по сравнению с контролем с 37,13 нмоль/минмг до 31,23 нмоль/минмг, при хроническом стрессе активность снизилась до 15,В ныоль/мшгмг. В таламо-гипоталамической области также происходило достоверное уменьшение активности карбоксипептидазы Н: при остром стрессе с 0,37 до 0,27 ниоль/мшгмг, при хроническом - до 0,24 нмоль/кин'нг. Аналогичным образом реагировали на стрессориые воздействия еще две зоны мозга - стри.-гум и средний мозг. В стриатуце снивение активности iij и г хрпм стрессе было

вменение активности'исходной карбоксипепгидазы (ИКП) и кар-оксипептидазы Н(КПН) при эмоционально-болевом стрессе у крыс.

кань Группа Концентрация Удельная активность, дивот- белка, нмоль/'мин-мг ных иг/мл ........-...............

ИКП КПН

ипофиз К 0 X 0,14+0,03 0,16+0,02 0,13+0,02 9,87+1,53 7,54+0,95 *5,20+0,40 37,13+2,91 ♦31,23+1,82 * 15,80+1,00

аламус + ипоталамус К 0 X 3,95+0,06 4,00+0,10 3,95+0,02 0,22+0,01 0,19+0,02 •0,14+0,01 0,37+0,04 '0,27+0,04 •0,24+0,01

триатум К О X 0,52+0,10 0,45+0,09 0,57+0,11 2,01+0,30 1,75+0,35 •0,92+0,13 2,66+0,22 2,36+0,33 ♦1,85+0,20

редний 33 г к 0 X 0,34+0,05 0,41+0,06 0,43+0,02 3,00+0,34 '2,28+0,10 * 1,84+0,10 1,99+0,35 •1,24+0,22 •1,15+0,12

зра.больших элушарий к • 0 X 0,62+0,05 0,81+0,03 0,75+0,04 0,63+0,03 ♦0,46+0,04 0,65+0,03 0,89+0,15 0,72+0,08 0,83+0,08

1дпочечники к 0 X 1,20+0,15 1,18+0,07 1,19+0,13 0,38+0,10 0,37+0,04 0,47+0,05 0,16+0,08 0,23+0,06 •0,31+0,07

зуппы животных: К - контрольные;

О - острый стресс; X - хронический стресс. - достоверные различия с показаниями в контроле (р<0,05).

• невелико (на 11%), а при хроническое стрессе более выражено к статистически достоверно (1,£5 пшдь/иинчгг по сравнению с 2,66 нмоль/мин-ыг в контроле). В среднем мозге оба типа стресса привели к существенному статистически достоверному сниаению удельной активности карбоксипептидазы Н (1,24 нмоль/мин-мг при остром стрессе и 1,15 нмоль/мин-мг при хроническом от 1,99 нмоль/мин-ыг в контроле). В коре больших полушарий головного мозга достоверных изменений активности карбоксипептидазы Н не обнаружено. Итак, три зоны мозга и гипофиз проявили идентичную реакцию карбоксипептидазы Н: как при остром,так и при хроническом стрессе удельная ак-. тивцость фермента скиналась по сравнению с контролем.

Иначе проявляла себя периферическая система. В надпочечниках в результате действия эмоционально-болевого стресса удельная активнрсть карбоксипептидазы Н увеличилась, особенно наглядно это проявилось при хроническом стрессе, где активность возросла с 0,18 нмоль/мин-мг у контрольных животных до 0,31 нмоль/мин-мг. Изменения активности карбоксипептидазы Н при гипергравитационном стрессе представлены в таблице 5.

В гипофизе удельная активность карбоксипептидазы И достоверно снизилась через 1 сутки с 27,52 до 19,77 нмоль/мин-мг. На 5 сутки активность фермента восстановилась до исходного уровня. В стриатуме наблюдалось аналогичное снижение удельной активности карбоксипептидазы Н на 1 сутки эксперимента с 4,01 до 3,07 имоль/ иин-мг. На 3 сутки активность ферманта возросла до 3,52 нмоль/ мин-мг, но при атом достоверно отличалась от контроля. К 5 суткам произошло практически полное восстановление активности. В таламо-гипоталамической области также произошло статистически достоверное снижение удельной активности карбоксипептидазы 11 на 1 сутки и затем постепенное восстановление активности к 5 суткам стресса. В среднем мозге достоверных изменении активности карбоксипептидазы К на протяжении 5 суток не наблюдалось. В надпочечниках, не изменяясь в течение 3 суток, активность фермента достоверно увеличилась на 5 сутки с 0,22 нмоль/мин-мг в контроле до 0,29 нмоль/иин.-иг.

Изменения активности карбоксипептидазы Н под влиянием больших доз инсулина представлены в таблице 6.

Изменение активности исходной карбонсипептядазы СИКП) и рбоксипептидазы Н (КПН) пря гияергравитациотгаом стрессе у крыс.

ань Длит ель-Ковцент раик я кость белка, стресса, иг/ил сутки Удельная активность, ниоль/иин-иг ИКП КПН

пофнз Н 1 3 5 0,16+0,03 0,20+0,03 0,24+0,08 0,20*0,06 3,74+1,26 2,20+0,60 3,27+1,95 2,77+1,11 27,52+3,67 ♦19,77+1,14 31,09+2,07 28,07+4,13

лаиус + поталаиус К 1 3 5 4,38+0,12 4,60+0,21 4,55+0,14 4,56+0,25 0,18+0,01 "0,15+0,02 •0,16+0,01 0,18+0,02 0,46+0,03 '0,40+0,02 0,43+0,02 0,45+0,02

риатуи К 1 3 5 1,21+0,09 1,30+0,32 1,43+0,13 1,20+0,07 0,95+0,13 0,84+0,13 1,11+0,11 0,84+0,05 4,01+0,28 ♦3,07+0,31 •3,52+0,16 3,91+0,25

едний зг К . 1 3 5 ' 1,05+0,12 . 0,95+0,05 1,09+0,11 1,00+0,10 1,12+0,09 0,97+0,10 •0,84+0,08 1,14+0,23 0,89+0,06 0,86+0,05 0,86+0,10 0,95+0,13

дпочечники К " 1 3 5 3,95+0,17' 4,07+0,37 4,28+0,26 3,79+0,25 0,30+0,05 0,40+0,08 •0,49+0,08 0,38+0,10 0,22+0,02 0,22+0,03 0,23+0,03 •0,29+0,02

- достоверные различия с показаниями в контроле (р<0,й5).

В гипофизе наблпдались фазные изменения удельной активности* рбоксипептидазы Н. Через 2 часа после инъекции активность фер-нта достоверно падала с 41,09 имоль/мин-мг в контроле до 31,55 оль/мин «г, затем постепенно увеличивалась. Через 1 сутки ельная активность возросла до 51,31 нмоль/ мин;мг, к 4 суткам стигла максимального значения 70,22 нмоль/миниг. К 7 суткам ельная активность фермента снизилась, хотя н продолжала превы-гь контрольный уровень. Все изменения активности карбонсипеп-

Изменение активности исходной карбокснпептидазы (ИКП) и карбоксипептидазц Н (КПП) после ннсулинового вока у крыс.

Ткань Группа Концентрация Удельная активность, еибог- белка, нмоль/ыин-мг ных игУыл ------------------------

ИКП КПК

Гипофиз К 0,06+0,01 28,10+13,65 41,09+5,27

2ч 0,1210,06 15,36+6,09 ♦31,55+4,45

1с 0,06+0,01 22,30+4,53 •51,31+4,87

4с 0,05+0,02 14,60+2,99 •70,22+8,34

7с 0,08+0,01 13,91+4,46 •52,91+4,18

Стриатум К 1,04+0,10 1,58+0,10 1,63+0,07

2ч 1,16+0,36 1,45+0,34 1,89+0,32

1с 1,01+0,09 1,53+0,10 1,74+0,12

4с 1,00+0,12 1,62+0,08 1,63+0,06

7с 1,02+0,11 1,56+0,05 •1,46+0,04

Мозговой слой К 0,11+0,04 5,84+0,65 4,23+1,03

надпочечников 2ч 0,07+0,05 7,04+2,50 ' 4,48+1,06

1с 0,12±0,03 6,70+1,03 3,26+0,38

4с 0,15+0,03 6,68+0,99 4,72+0,63

7с -0,10+0,03 •13,64+3,52 '11,94+1,98

Группы »ивсттех: К - контрольные;

2ч, ,1с, 4с, 7с • животные через 2 час, 1 сут, 4 сут, 7 сут после инъекции инсулина.

* - достоверные различия с показаниями в контроле (р<0,05).

тидазы Н в гипофизе были статистически достоверны.

В стриатуме в отличие от гипофиза изменение удельной актив ности карбоксипептидазц Н были выражены минимально. Достоверное снижение отмечалась только на 7 сутки.

Б мозговом слое надпочечников удельная .активность карбокси

птидазы И на протяжении 4 суток не претерпевала достоверно эна-мых изменений. Однако на 7 сутки после введения инсулина удель-я активность фермента достоверно возросла с 4,23 нмоль/мин-иг контроле до 11,94 нмоль/мин МГ.

ненение активности карбоксипептидазы Н после длительного по-еблеияя крысами этанола.

В таблице 7 представлены данные по регионарной активности ходной карбоксипепгидазы и карбоксипептидазы II у крыс с раз-чным влечением к этанолу. Удельная активность карбоксипептида-Н в гипофизе увеличилась в опытных группах с 13,47 имоль/мин-у контрольных животных до 14,41 иноль/мин*мг у крыс, предпо-тавших воду, и до 15,93 нмоль/нннмг у крыс, предпочитавших анол, причем у последних разница была статистически достовер-й. Еще более наглядное увеличение активности фермента наблюда-сь в стриатуме: при контрольной активности 0,62 имоль/мин-мг, ельная активность карбоксипептидазы Н у крыс, предпочитавших ду, составила 0;83 нмоль/нин-нг, а у крыс, предпочитавших эта-л, 0,78 нмоль/мин мг. В среднем мозге отмечено достоверное еличение удельной активности карбоксипептидазы К в группе агатных, предпочитавших воду, - 0,31 нмоль/кшгмг против 0,23 оль/минмг в контрольной группе. В таламо-гипогаламипеской об-сти не обнаружено изменений фермента. В надпочечниках удельная гивность карбоксипептидазы В достоверно увеличилась у крыс, едпочитавших воду, с 0,17 до 0,25 нмоль/кшгыг. менение активности карбоксипептидазы Н у мурицидных крыс. еди исследованных зон мозга наибольшая активность карбоксй-птидазы Н отмечена в стриатуме 0,62 нмоль/мин-мг. Именно этом регионе мозга было обнаружено значительное и достоверное зличие между величинами удельной активности карбоксипептидазы Н нормальных и мурицидных крыс; у последних эта величина состав-па 0,83 нмоль/мин мг. Можно полагать, что у мурицидных крыс в эиатуме увеличено образование знкефалина. Из этого следует, з изменение концентрации пептида за счет экзогенного введения л связывания антителами моиет явиться фактором, модулирующим эявление мурицидносги.

При интрацеребралыюм введении мурицидным крысам специфи-:ких антител, полученных из антисыворотки к лей-энкефалину,

удалось затормозить проявление агрессивной реакции, что выразилось в "отказе* некоторых животных от мурицвдностн в в увелвче-

Таблица 7.

Регионарная активность исходной карбоксипептидазы (ИКЛ) в кар5оксипептйдази Н (КПП) у крыс с различный влечением к этапол

Ткань Группа Концентрация Удельная активность,

живот- бедка, ниольУмввмг

иых иг/ил ----------------------------

ИКП «ПН

Гипофиз К 0,1710,04 2,31+0,54 13,47+0,60

ПВ 0,20+0,03 2,80+0,30 14,41+0,79 ПЭ 0,21+0,03 а,22+0,57 Ч5,93±0,69

Талапус + К 2,67+0,22 0,19+0,03 0,42+0,03

гипоталамус ВВ 3,03+0,34 0,20+0,07 0,43+0,05

ПЗ 3.12+0,50 0,20+0,10 0,43+0,05

Стрматум К 1,30+0,12 0,30+0,06 0,62+0,06

ПВ 1,56+0,14 *0,43+0,05 '0,83+0,05 ПЭ 1,86+0,29 *0,44+0,05 '0,78+0,10

Средний К 3,05+0,26 0,24+0,03 0,23+0,03

иозг ПВ 3,92+0,42 «0,44+0,07 '0,31+0,05

ПЭ 4,33+0,71 -0,44+0,08 0,29+0,05

Надпочечники К 1,42+0,47 0,28+0,06 0,17+0,06

ПВ 1,19+0,35 0,31+0,07 «0,25+0,05 ПЭ 1,28+0,20 0,28+0,05 0,20+0,03

Группы животных: К - контрольные;

ДБ - предпочитавшие воду;

ПЭ - предпочитавшие этанол.

* - достоверные различия с показаниями в контроле (р<0,05).

нии латентного периода до атаки на жертву у остальных крыс. При интрацеребральном введении таким же мурицидным крысам физиологического раствора или Хёв, выделенных из нормальной сыворотки кролика, достоверных изменений латентного периода не было обиа-руяено. Это указывает на специфичность тормозящего мурицидность влияния лей-энкефалиновых антител.

15

ОБСУЖДЕНИЕ.

Определение карбокеипептндазной активности с помощью даи-льных субртратов при активации фермента ионами Со^+, разрабо-нное Fricker, Snyder (19В2] и используемое в дальнейиих ботах этой и других групп [Fricker et al., 1983, Fricker,, yder, 1983, Strittaatter et al., 19841, показало, что метод вт стабильные результаты и отражает активность карбоксипепти-т Н.

Несмотря на то, что в предлагаемом методе степень а к т и-i ц и и карбокснпептидазы Н под влияние« ионов Ссг+ принима-:я за величину активности фермента, допустимость coro подхода представляется закономерной, поскольку C0CI2 в юльзуемой концентрации активирует очищенную карбоксипептида-в 10 раз [Fricker, Snyder 19821, и долей этого фермента в одной карбоксипепгидазкой активности можно пренебречь.

Сочетание приемов активации ионами Со^+ и торможения ак-нссти карбокснпептидазы Н специфическими ингибиторами [Fri-г, 1988, Hook, La Gamma, 1987) также свидетельствует в пользу го допущения.

Представленные вше результаты наших исследований позволи-убедигься в приемлимости предложенного [Fricker, Snyder 1982] ода определения карбокснпептидазы Н; кроме того били яолу-л дополнительные доказательства, что Со^-стимулируемая Эоксипептидазнаяантивность отражает активность знкефалин-1зующей карбоксипситидазы Н.

Полученные нами кинетические параметры карбокснпептидазы II ■юзга крысы для дансид-фен-ала-арг (см.табл.3) совпадают с шетраии, определенными для фермента из мозга быка [Fricker, ier, 19831.

При сопоставлении кинетических параметров карбокснпептидазы' исподней карбокеипептндазной активности для дансил-феи-ала-н даларпша оказалось, что Км обеих активностей для дансил-ала-арг близки (см.табл.3), однако для даларгина, знкефалин-■р»ащеи> субстрата, резко отличаются (500 миМ для исходной вности и 46 нкМ для карбокснпептидазы II). Это свкдетельству-

болнаем сродстве эшефалинсодержащего субстрата именно ис-

следуемому ферменту в сравнении с исходной карбоксипептидазной активностью, которая в гомогенагах тканей может быть представл! на карбокоипоптидазой Б. Такие ше четкие различия обнаружены п[ исследовании ингибирования карбоксипептидазних активностей энк( -фалинсодеряащими пептидами (см.табл.3). Как |лей5]энкефалин-арг6, так и даларгин, будучи ингибиторами гидролкза дансильногс субстрата, конкурентно тормозили активность карбоксипептидазы I Б случае [лей^]энкефалина-арг^ константа ингибирования для исходной карбоксипептидазной активности составила 106 мкМ, для карбоксипептидазы Н - 46 мкМ; в случае даларгина различие было еще более выраженным - 175 мкМ для исходной активности и 16 мк1 для карбоксипептидазы Н. Эти результы подтверждают энкефалиноб-разующую природу карбоксипептидазы Н.

Активация ионами Со2+ карбоксипептидазной реакции, провод1 мой при рН 5,6, позволяет выявить ферментативную активность, с< ответствующую карбоксипептидазе 11. Различие карбоксипептидазы 1 и карбоксипептидазы В доказано следующими фактами: 1) антисыворотка против карбоксипептидазы Н не давала перекрестной реакцш с другими карбоксипептидазами [Hook et al.,19851; 2) карбокси-пептидаза Н кодируется отличным от карбоксипептидазы В геном IFricker, 1989; Fricker et al.,19891.

Метод определения активности карбоксипептидазы Н в этих у( ловиях с использованием дансил-фен-ала-арг в качестве субстрат; позволяет работать на гомогенатах тканей. Это обстоятельство важно для решения поставленных перед нами задач - определения активности фермента в разных тканях при различных состояниях. При этом речь идет: 1) о достаточно большом объеме исследуемых проб, поскольку рассматриваются несколько моделей и несколько тканей во временном аспекте; 2) об исследовании ферментативной активности в условиях, максимально приближенных к естественным

Таким образом, была подтверждена пригодность метода, пред ловенного [Fricker, Snyder, 1982] для определения активности карбоксипептидазы Н при работе на очищенных и неочищенных ферментных препаратах. Определяемая активность носит характер энкефалинобразугощей. Все это дает основание использовать эту методическую основу для определения активности карбоксипептидазы Н в гомогенатах тканей крыс при различных функциональных

стояниях организма.

Изучение изменений карбоксипептидазы И проводили в гипофизе, ^почечниках и следующих зонах мозга: стриатуме, таламо-гипота-таческой области, среднем мозге. Все эти ткани отличаются вы-мм уровнем содержания энкефалинов. По литературным данным из-:тно, что при различных фармакологических и стрессорных воз-1ствиях уровень энкефалинов в этих тканях изменяется. Исходя этого, монно предположить, что в тех же ситуациях будет ме-'ься активность энкефалинобразуюцего фермента, т.е. карбокси-1тидазн Н.

В таблице 8 представлены сведения об изменении удельной ивности карбоксипептидазы Н в тканях крыс при различных функ-нальных состояниях организма. Для систематизации полученных них по каждому типу воздействия отобрано по одной группе, в орой изменения активности проявлялись наиболее отчетливо. Для ционалыю-болевого стресса использовались данные хронического перимента. Для гипергравитациоиного стресса в качестве анали-уемой группы взяты результаты изменения активности карбокси-гидазц И в острой фазе - через 1 сутки стресса, для "инсули-эго шока" - через 7 суток после инъекции. Из двух групп ®и-шх, подвергавшихся влиянии этанола, рассматривается группа

предпочитавших воду. В последней графе представлены регаты изменения активности фермента у мурицидннх крыс.

При анализе данных, приведенных в табл.8, моино отметить ¡ующее. Наибольшие изменения активности карбоксипептидазы Н Фужепы в надпочечниках, при этом изменения практически во '.•ситуациях носят характер увеличения активности. Другая эн-1инная железа - гипофиз - реагировала в различных ситуациях 1азному. При стрессорных нагрузках происходило заметное сни-е активности фермента, при других воздействиях - увеличение виости.

Среди зон мозга наиболее выраиенная реакция проявлялась в атуме, причем направленность изменений активности карбокси-идазы II такае зависела от вида воздействия: возрастание ак-ости у мурицидннх крыс и животных, длительно потреблявших ол, и снижение активности у крнс после эмоционально-болевого • пр[ч р^витан-чонного стрессов. 1'алаио-гмюталамическая сбласть

оказалась наименее реагирующей зоной: только при эмоционально-болевом стрессе замечено существенное снижение активности карбоксипептидазы Н.

Таблица В.

Изменение удельной активности карбоксипептидазы Н в тканях при-' при различных функциональных состояниях организма.

Воздействие Ткань ЭБС ггс ИНС АЛК МУР

Гипофиз -- -- + 0

Таламус + гипоталамус - н/о 0 0

Стриатум -- -- 0 ++ ++

Средний мозг - н/о ++ 0

Надпочечники 4-4+ 0 (++) +++ ++ +

Условные обозначения:

ЭБС - хронический эмоционально-болевой стресс; ГГС - гипергравятационный стресс (1 сутки); ИНС - ичсулиновый люк (7 сутки):

АЛК - алкогольная интоксикация (крысы, предпочитавшие волу МУР - мурицидность; + (-) изменение активности до 25%; ++ (--) изменение активности от 25 до 70%; +++ увеличение активности >70#; О активность не изменялась;

'н/о активность карбоксипептидазы И не определяли;

В инсулиновом шоке в графе "надпочечники" приведены дэннип по мозговому ело» надпочечников.

В гипергравитациоином стрессе в графе "надпочечники" прите дены данные для 5 суток стресса.

При сравнении эмоционально-болевого и гипергравитационно' о стрессов обнаружилось, что во всех исследуемых регионах мозга " гипофизе удельная активность карбоксипептидазы N уненьиалаоь.

1!(чем для эмоционально-болевого стресса аналогичная картина блшдалась как г.ри зсроннческсм, так и при остром воздействии, я гнлерграннтационного стресса реакция мозговых структур и ги-фиаа на длительный стресс оказалась слабовыраненной. В то же емя в надпочечниках в результате 5-ти дневной гравитации зна-телыю возросла активность карбоксипептидазы Н. Таким образом, вот разных тканей на острый и хронический стресс зависит от • да воздействия.

У мурйцидншг крыс и животных, длительно потреблявших эта-л, во всех исследованных тканях активность карбоксипептидазы ¡1 эличивалась, либо не изменялась; ни в одном случае при этих опциональных состояниях не было отмечено снижение активности, иш образом, выявляется существенная разница в изменениях ак-зности карбоксипептидазы Н при стрессорных воздействиях и эн-'еишп нарушениях гомеостаза (инъекция инсулина, длительное гребление алкоголя, агрессивное поведение).

Поьшеиий ипц понижение активности карбоксипептидазы Н ¡дставляет собой реакцию энкефалинергических структур на внеш! воздействие. Поено полагать, что при стрессах иедиаторная |кция энкефьлинов в центральных областях сказывается затормо-[ной, что проявляется в снижении активности фермента. В ре-!Ьтато долговременного воздействия на организм (действие алко-[я, выработка агрессивного состояния) происходит активация эн-алинергической системы и, для ее осуществления, - увеличение явности энкефалинобразующей карбокенпептидазн Н. Надпочечни-независимо от ситуации, отличаются от центральных образова-постояшшм усилением продукции энкефалинов.

Очевидно, все эти изменения активности карбоксипептидазы ¡1 ажают адаптивную функцию ферментативного звена энкефалиновой темы при изменении функционального состояния организма разной природы.

В1№0ДН

1. ПредеIавленн доказательства специфичности метода опреде-|'я Со-" активируемой карбоксипогпидазц в гоиогенатах тканей с с использование« дансил-фен ала-арг в качестве субстрата, икр-химические и кинетические параметры определяемого фермеи-

га совпадают с характеристиками, соответствующими карбоксипепт дазе Н.

Энкефалин-образующая активность фермента подтверждена при сравнении дансилированных (дансил-фен-ала-арг и дансил-фен-лей арг) и энкефалинсодержащих ([лей^]энкефалин-арг^ и [D-ала2,лей энкефалин-арг^) субстратов.

2 Выявлены изменения активности карбоксипептидазы Н в ги пофизе, надпочечниках, стриатумв, таламо-гипоталамической обла ти и среднем мозге на различных моделях функциональных достояний: при эмоционально-болевом стрессе, гипергравитационном стрессе, воздействии инсулина, длительном потреблении этанола, мурицидном поведении крыс.

3. Наибольшие изменения активности карбоксипептидазы Н вы явлены в эндокринных органах. В надпочечниках при всех состоян ях ферментативная активность была увеличена. В гипофизе происх дило выракенное снижение активности при стрессорных воздействи и увеличение активности при длительном потреблении алкоголя и при введении инсулина.

4. В зонах мо?' • наибольшие изменения активности карбокси пептидазы Н отмечены в стриатуме. Направленность этих сдвигов зависела от вида воздействия: снижение активности после эмоцио нально-болевого и гипергравитационного стрессов, увеличение -после длительного потребления этанола и у мурицидных крыс. Ана логичные, но менее выраженные изменения активности карбоксипеп тидазы Н наблюдались в среднем мозге и таламо-гипоталамической области.

5. Приведенные данные свидетельствуют о регионарной специ фичности изменений активности карбоксипептидазы Н, которые отр кают участие ферментативного звена энкефалиновой системы при различных функциональных состояниях организма.

Список работ, опубликованных по темз диссертации.

1. Григорьянц 0.0., Гомазков O.A. Энкефалинобразующие фер менты //Вопр.мед.химии.-" 1986. -№3.-С.15-20.

2. Ростовцев А.П., Григорьянц 0.0., Гомазков O.A. Изучени каталитических свойств энкефаликобразующей карбоксипептидазы в мозге крысы //Тезисы докл.Всесоюзн. симпозиума по медицинской э

мологии, Махачкала.-1936.-С.219.

3. Ростовцев А.П., Панфилов А.Д., Григорьянц 0.0., Гомааков -Эикефалинобразующая активность в мозге и надпочечниках крыс

я различных вариантах стрессорного воздействия //Тезисы докл. Зсесоюзн.конференции по нейрохимии, Горький.-1987.-С.54-55.

4. Ростовцев А.П., Грнгорьянц 0.0., Гомазков O.A. Субстраты 1 исследования энкефалинобразующей карбоксипептидазы в мозге и ¡почечниках крыс //Вопр.мед.химии.-1980.-№l.-С. 126-129.

5. Ростовцев А.П., Григорьянц 0.0., Башарова Л.А. Получе-

! антител к [ЬеиЬнкефалину и их исследование с помощью имму-1врментного анализа //"Иммуноферментный анализ в диагностике олеваний".Сборник трудов ЦНИИ вакцин и сывороток им.И.И. Меч-ова.-И.-1989.-С.147-151.

6. Ростовцев А.П., Григорьянц 0.0., Гомазков O.A. Получение цифических антисывороток к лей-энкефалину и их исследование ■ уноферментнын анализом //Биологические науки.-1989,-N-12.-С. 54.

7. Ростовцев А.П., Григорьянц 0.0., Фомин В.В., Гомазков

. Синтез физиологически активного конгюгата катионизированно-SCA и ангиотензина II //Докл.All СССР.-1989.-№б. -С. 1500-1502.

8. Гомазков O.A., Григорьянц 0.0. Регуляция биосинтеза эн-1линов: биохимические и физиологические аспекты //Успехи • ).биол.-1989.-Вып.1.-С.109-124.