Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние 13-цис-ретиновой кислоты на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов крыс

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние 13-цис-ретиновой кислоты на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов крыс"

На правах рукописи

ЖУЧКОВ Сергей Александрович

ВЛИЯНИЕ 13-ЦИС-РЕТИНОЕВОЙ КИСЛОТЫ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ КЕРАТИНОЦИТОВ КРЫС

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ООЭ1Б 82-77

Москва-2007

003158277

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Орловский государственный университет» и ЗАО Фармацевтическое научно-производственное предприятие "Ретиноиды"

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор НОЗДРИН Владимир Иванович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук БАРХИНА Татьяна Григорьевна

доктор медицинских наук, профессор ТОРБЕК Виктория Эдуардовна

Ведущая организация: Государственное общеобразовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

на заседании Диссертационного совета Д 001 004 01 ГУ НИИ морфологии человека РАМН по адресу. 117418, Москва, ул Цюрупы, д 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института морфологии РАМН

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан

Ш7 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

МИХАЙЛОВА Л.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Витамин А и его производные являются естественными регуляторами гистогенеза эпителиальных тканей, а синтетические производные витамина А - ретиноиды применяются для лечения кожных заболеваний, протекающих с нарушением морфогенетических процессов в эпидермисе. Всвязи с этим было решено использовать в качестве модификатора морфогенеза 13-цис-ретиноевую кислоту (13цРК), которая образуется в организме из ретинола (Ю И Афанасьев, В.И. Ноздрин, Ю.Т Волков, 1990, G Siegenthaler, JH. Saurat, M Ponec, 1990, M. Maden, M Hind, 2003)

К настоящему времени исследования, посвященные изучению воздействия ретиноидов на гистоструктуру эпидермиса, относительно немногочисленны. В России в последние три десятилетия наиболее последовательно в этой области работали на кафедре гистологии Московской медицинской академии им. И M Сеченова (Ю.И Афанасьев, В И. Ноздрин, 1983 и др.), а позднее - на фармацевтическом научно-производственном предприятии "Ретиноиды" (К С Гузев, В И Ноздрин, 2003, В.И Ноздрин, В.М Земсков, Ю Т Волков, 2004; В И. Ноздрин, В И Альбанова, J1H Сазыкина, 2005, В.И Ноздрин, Т А Белоусова, В И. Альбанова, О И Лаврик, 2006 и др ) Следует отметить, что аналогичные зарубежные исследования посвящены в основном изучению воздействия на эпидермис полностью транс-ретиноевой кислоты, хотя в последние годы наметилось активное изучение свойств и 13цРК Полученные авторами данные (К A Tadini, L R. Gaspar, Р M. Maia Campos, 2006; M Schroeder, С С. Zouboulis, 2007) вполне согласуются с результатами отечественных исследований. Для объективизации морфологических аспектов дерматотропной фармакологической активности ретиноидов применяются морфометрические методы исследований с использованием компьютерных технологий Так, были выявлены определенные закономерности реакции эпидермиса на аппликации препаратов, содержащих 13цРК, в виде увеличения толщины кожного эпителия, снижения уровня кератинизации, тенденции к «омоложению» клеточной популяции при непродолжительном (ежедневном в течение двух недель) нанесении (В И. Ноздрин, А.С Кинзирский, Т А Белоусова и др., 2004) Но механизмы возникновения данных изменений оставались неясными В более ранних экспериментах, выполненных с использованием тимидиновой метки, подсчетом митотического индекса, определением плоидности и применением гистохимических методик, показано, что в условиях воздействия ретиноидов на кожу увеличивается пролиферативная актив-

3

ность кератиноцитов, изменяется плоидность их ядер и содержание в цитоплазме сульфгидрильных групп и гликозаминогликанов (В.И. Ноздрин, М.З. Бахшинян, Н.Я. Артюхина, 1977, 1982; Е.М. Каралова, А.В Петросян и др., 1988). Однако трактовка этих данных носила в значительной степени предположительный характер. Кроме того, не проводилось изучение длительности существования полученных эффектов после окончания нанесения препаратов Знание особенностей изменения гистоструктуры и морфометрических параметров эпидермиса в условиях воздействия ретиноидов определяет необходимость объективной, более информативной, выполненной с применением иммуноморфологических методов исследований оценки дерматотропной активности ретиноидов в отношении пролиферации дифференцировки.

До настоящего времени влияние ретиноидов на пролиферативную активность и дифференцировку клеток нормального эпидермиса изучалось, главным образом, в условиях культуры ткани (G.J. Fisher и J J Voorhees, 1996, A. Lokshin, Н. Zhang et al., 1999). Результаты этих исследований не отражают в полной мере процессы, происходящие в тканях, так как в клеточных культурах отсутствуют регуляторные влияния со стороны нервной, эндокринной, иммунной и др. систем. В литературе мы не встретили исследований, посвященных влиянию ретиноидов на клеточную популяцию кератиноцитов здоровых животных in vivo в свете оценки их цитогенеза, в том числе, выполненных с использованием иммуноморфологических методик. Также не удалось найти исследований по изучению состояния популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса после окончания нанесения препаратов, содержащих 13цРК

В связи с этим, изучение морфогенетических процессов в эпидермисе в норме и при воздействии на кожу биологически активных форм витамина А представляется актуальным. Учитывая, что многослойный плоский ороговевающий эпителий кожи является полидифферонной тканью, ведущая роль в которой принадлежит дифферону кератиноцитов (основному компоненту эпидермальной пролиферативной единицы), изучение гистогенетических процессов внутри этой клеточной популяции является целесообразным, так как может послужить более глубокому пониманию процессов, лежащих в основе регенерации эпидермиса, а также механизмов местного действия ретиноидов.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования явилось изучение пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса у крыс при накожном нанесении растворов 13-цис-ретиноевой кислоты.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи

1 Изучить структурно-функциональные аспекты пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса у интактных крыс-самцов.

2 Изучить структурно-функциональные аспекты пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса при накожном нанесении 13-цис-ретиноевой кислоты в виде растворов разных концентраций

3 Изучить структурно-функциональные аспекты пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса после прекращения нанесения растворов 13-цис-ретиноевой кислоты

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1 Клеточный цикл кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса интактных крыс-самцов имеет суточные колебания Днем (в 1213 ч) доля покоящихся клеток (во -период) составляет 30,56±0,46%, делящихся - 14,71 ±0,46%, полиплоидизирующихся - 54,73±0,47%. В предутренние часы (3-4 ч) покоящихся кератиноцитов - 52,93±0,46%, делящихся - 26,66±0,63%, полиплоидизирующихся - 21,41 ±0,47%.

2. Аппликации растворов 13цРК приводят к увеличению количества делящихся клеток на фоне снижения числа покоящихся (во) и полиплоидных клеток, что способствует накоплению в эпидермисе низко-дифференцированных кератиноцитов Наряду с кератолитическим действием 13цРК это обусловливает «омоложение» популяции кератиноцитов росткового слоя эпидермиса

3 Этот эффект сохраняется на протяжении 2 недель после отмены 13цРК, его снижение было отмечено только через 5 недель.

Научная новизна

Впервые разработан способ оценки пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса с использованием моноклональных антител

Впервые с помощью иммуноморфологических методов охарактеризованы суточные ритмы в эпидермисе крыс с использованием объективных параметров, индексов РСКА, Кл-67, индекса полиплоидизации

Впервые с помощью моноклональных антител проанализировано состояние популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса при местном воздействии 13цРК В условиях ежедневных накожных аппликаций растворов 13цРК происходит активация пролиферативных процессов, проявляющаяся в увеличении количества делящихся клеток,

5

что, на фоне снижения числа покоящихся и полиплоидных клеток, приводит к накоплению в эпидермисе низкодифференцированных кератино-цитов

Охарактеризована динамика структурных, морфометрических и иммуноморфологических показателей популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса в различные сроки после окончания накожных аппликаций 13цРК и установлено, что эффект от воздействия 13цРК является устойчивым, сохраняясь на протяжении 5 недель после окончания аппликаций.

Теоретическая и практическая ценность работы

В результате проведенных исследований выявлены основные характеристики цитогенеза кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса у крыс-самцов Вистар в норме, изученные с помощью иммуноморфологических методик с использованием моноклональных антител (МКА) к Ki-67, PCNA (proliferation cell nuclear antigen - ядерный антиген пролиферирующих клеток), цитокератину 10. Установлено, что клеточный цикл кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса крыс-самцов имеет суточные колебания. Определено процентное соотношение покоящихся (Go), делящихся и полиплоидных кератиноцитов в дневное и ночное время. Установлено что в предутренние часы (3-4 ч) в популяции кератиноцитов больше делящихся и покоящихся клеток и меньше клеток полиплоидных

Установлены структурные и иммуноморфологические проявления воздействия 13цРК на популяцию кератиноцитов Ежедневные, в течение двух недель аппликации растворов 13цРК вызывают утолщение клеточного эпидермиса, увеличение доли делящихся клеток, снижение представительства клеток покоящихся и полиплоидных и накопление в эпидермисе низкодифференцированных клеток. Обнаруженный эффект в сочетании с известным кератолитическим действием 13цРК приводит к «омоложению» популяции кератиноцитов росткового слоя эпидермиса

При экспериментальном исследовании состояния популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса после отмены препаратов, содержащих 13цРК, было установлено, что эффект от применения 13цРК (усиление пролиферативной активности, снижение количества покоящихся и полиплоидных клеток) носит пролонгированный характер, снижаясь только через 5 недель после окончания нанесения растворов 13цРК. Темпы возвращения пролиферативной активности кератиноцитов к показателям интактных животных оказались более медленными при использовании раствора с меньшей концентрацией 13цРК (0,025%), что

объясняется, по-видимому, большей сохранностью в этих условиях камбиального резерва кератиноцитов.

Полученные данные расширяют представление о механизме действия 13цРК на интерфолликулярный эпидермис. Они учтены при выборе концентрации действующего вещества в составе лекарственных форм и в обосновании терапии кожных заболеваний растворами, содержащими 13цРК.

Количественные критерии оценки процессов пролиферации и диф-ференцировки применительно к эпидермису, полученные с применением иммуноморфологических методов, могут оказаться полезным «инструментом» для объективной оценки состояния кожного эпителия.

Внедрение

Результаты исследований использованы при составлении нормативно-технической документации на новое лекарственное средство с 13цРК - Ретасол® (раздел «Специфическая активность»); номер государственной регистрации № 001836/01- 2002 Препарат разрешен для наружного применения и выпускается на производственных мощностях ЗАО "Ретиноиды" Получен патент на изобретение № 2197235 «Раствор для лечения заболеваний кожи, способ его получения и способ лечения заболеваний кожи» с приоритетом от 05.04.2002 г

Апробация работы

Основные материалы работы были доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции «Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей» (С-Петербург, апрель 2001 г.), на «Первом российском конгрессе дерматовенерологов» (С-Петербург, сентябрь 2003 г ), на Всероссийской конференции «Новые лекарственные препараты в дерматовенерологической практике» (Москва, ноябрь 2003 г ), на трех Всероссийских конференциях «Бабухинские чтения в Орле» (июнь 2005, июнь 2006, март 2007 гг ), на Всероссийском научном совещании анатомов, гистологов и эмбриологов «Актуальные проблемы учения о тканях» (С-Петербург, апрель 2006 г), на VII Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Орел, сентябрь 2006 г), на трех Всероссийских съездах «Человек и лекарство» (апрель 2003, апрель 2006, апрель 2007 гг)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 работ, из них в журналах по списку ВАК — 4.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов Работа иллюстрирована 13 таблицами и 59 рисунками. Указатель литературы включает 115 источников, в том числе - 54 отечественных и 61 зарубежный.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В экспериментах использовали субстанцию 13цРЬС (DSM, США) в виде растворов двух концентраций (0,025% и 0,05%). Растворителем служила спиртогликолевая смесь (основа раствора); стабилизаторами -бутилокситолуол и бутилоксианизол. Концентрация 13цРК в растворах определялась содержанием этой субстанции в готовой лекарственной форме (Ретасол®).

Исследование проводили на половозрелых крысах-самцах Вистар со средней массой тела 180 ± 5г, полученных из филиала ГУ Научный центр биомедицинских технологий РАМН «Столбовая» и выдержанных в карантине в течение 2 недель до начала экспериментов Опыты проводили в условиях вивария ЗАО "Ретиноиды". Все параметры содержания животных (температура, влажность, освещенность, корм, вода и др ) были стандартизированы и соответствовали Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) (1973).

Аппликации растворов проводили ежедневно, согласно списку Стандартных операционных процедур и протоколу исследований. Растворы наносили по 0,3 мл при помощи специальной пипетки на предварительно выстриженный участок кожи, размером 3 х 2 см в межлопаточной области спины. Суточная доза составила для 0,025% раствора 13цРК 0,45 мкг/кг, для 0,05% раствора 0,9 мкг/кг.

Было проведено два эксперимента.

I Аппликации растворов и взятие образцов для исследований проводили в дневное время (12-13 ч) Забор материала осуществляли на 14-е сутки эксперимента через 45 минут после последней аппликации, что соответствовало, по данным фармакокинетики (Ю.П Архапчев, 2000), пику концентрации 13цРК в крови.

II Аппликации растворов проводили в вечером (21-22 ч), а взятие образцов - ночью, в предутренние часы (3-4 ч) т.е на пике митотической активности кератиноцитов (И.Н Михайлов, 1979) Забор материала из

области аппликаций осуществляли на 14-е (сразу после окончания аппликаций), 28-е и 49-е сутки от начала эксперимента (т.е через 2 и 5 недель после окончания аппликаций).

Для каждого срока обоих экспериментов было использовано 4 группы животных по 6 особей в каждой (всего 96 крыс)

- интактные животные - контроль,

- животные, получавшие аппликации основы раствора - контроль,

- животные, получавшие аппликации раствора, содержащего 0,025% 13цРК;

- животные, получавшие аппликации раствора, содержащего 0,05% 13цРК

Эвтаназию животных осуществляли парами хлороформа в соответствии с «Методическими рекомендациями по выведению животных из эксперимента» (1985). Все манипуляции с животными проводили с соблюдением этических норм; протокол исследования был утвержден комиссией по биоэтике ЗАО Фармацевтическое научно-производственное предприятие "Ретиноиды".

Образцы кожи из зоны аппликаций фиксировали в 10% нейтральном формалине в расправленном состоянии Дальнейшую проводку и заливку образцов в парафин проводили по стандартным методикам (Г А Меркулов, 1969)

Для проведения морфометрических исследований делали стандартные срезы толщиной 5 мкм на ротационном микротоме LaboCut 4055 (фирма Slee, Германия) с помощью одноразовых микротомных лезвий А35 (фирма Feather, Япония), срезы размещали на стандартных по толщине предметных стеклах фирмы Menzel - Glazer (Германия) и окрашивали гематоксилином и эозином Окраску всех образцов проводили одномоментно, окрашенные срезы покрывали стандартными покровными стеклами той же фирмы Таким образом, подготовка объектов для морфометрических исследований проводилась с учетом требований по технологической стандартизации (В И Ноздрин, В Т Мурников, А.Н. Яц-ковский, 1977)

Морфологический анализ препаратов проводили с использованием световых микроскопов Бимам Р-13-1 (Ломо), Axioscop - 2 (Carl Zeiss) и Axiostar (Carl Zeiss) Морфометрические измерения проводили на аппаратно-программном комплексе ДиаМорф (фирма ДиаМорф, Россия), который состоял из микроскопа Aksioskop-2 фирмы Carl Zeiss (Германия) с TV- адаптером, цифровой видеокамеры Kampro КС 583С (Тайвань), монитора для получения изображений, компьютера с программным обеспечением фирмы ДиаМорф (Россия) При этом использовали программы компьютерного анализа видеоизображений CITO и статистической обра-

9

ботки результатов IPSO. Для отдельных морфометрическнх исследований применяли свободно распространяемое программное обеспечение Image Tool (USA, University Texas), калибровку которого осуществляли при помощи объект-микрометра проходящего света ОМП с ценой деления 0,01 мм

В срезах кожи измеряли толщину эпидермиса по вертикали от ба-зальной мембраны до рогового слоя (клеточный эпидермис). Исследовали по одному срезу от каждого животного. Подсчеты производили при об. 40х, ок lOx во всех полях зрения (20-23 поля зрения на срез), при этом в каждом поле зрения было сделано по три измерения. В каждой группе выполняли не менее 150 измерений соответствующего параметра

Для более детального изучения пролиферации и дифференцировки использовали иммуноморфологические методы исследований При выборе антител учитывали следующие критерии высокая чувствительность метода, доступность, простота постановки и оценки реакции, низкое фоновое окрашивание, воспроизводимость результатов.

Использовали антитела для выявления следующих белков:

- PCNA (proliferation cell nuclear antigen - ядерный антиген проли-ферующих клеток) - представляет собой циклин с молекулярной массой 36 кД, является неотъемлемой частью ДНК-полимеразы 8, экспрессиру-ется на всех стадиях митотического цикла и отражает общий уровень синтеза ДНК как в делящихся, так и в полиплоидизирующихся клетках Этот маркер неселективен, т к не позволяет отличить деление клетки от удвоения ДНК, не сопровождающегося дальнейшей цитотомией

- Ki-67 - ядерный белок, который является высокоселективным маркером пролиферативной активности, после митоза в течение 60 - 90 минут разрушается, поэтому клетки не окрашиваются в раннем Gi периоде, по информативности близок к 3Н-тимидиновой метке (А.В Упоров, В.Ф. Семиглазов, К.М Пожарисский, 2000, Е Endl, J. Gerdes, 2000, Т Scholzen, J. Gerdes, 2000).

- Цитокератин 10 (CK-10) - экспрессируется во всех слоях эпидермиса, кроме базального, его количество линейно связано с уровнем дифференцировки клеток и нарастает по направлению от базального слоя к роговому. Маркер информативен при исследовании дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса

Постановку иммуногистологического окрашивания осуществляли согласно рекомендациям фирмы-производителя. После депарафинирова-ния и регидратации срезов проводили демаскировку антигенов кипячением образцов вЮ мМ цитратном буфере на водяной бане. Для проведения иммуногистохимической реакции применяли следующие монокло-

нальные антитела. PCNA (Clone PC 10), Ki-67 (Clone SP-6), Keratin 10 (Clone LHP1) фирмы Labvision (США) Использовались следующие рабочие разведения антител. PCNA - 1:600, Ki-67 - 1 500, Keratin 10 -1 400 Визуализацию результатов проводили с помощью непрямой стрептавидин-биотиновой пероксидазной реакции с использованием Ultra Vision Detection System HRP/DAB той же фирмы (фермент - перок-сидаза хрена, субстрат - 3,3' диаминобензидин). Срезы докрашивали гематоксилином Карацци и заключали в канадский бальзам Оценка качества проведенной реакции проводилась сравнением с позитивным контролем для каждого из антигенов (Labvision, США)

Экспрессию Ki-67 и PCNA оценивали путем расчета индексов PCNA (Ipcna) и Ki-67 (IKi-67> по формуле

I (%) = (n+/N) х 100, где п+ - количество меченых ядер, N - общее число ядер в базальтом и шиповатом слоях в поле зрения микроскопа

Исследовали по одному срезу кожи от каждого животного Подсчеты производили при об 100, ок. 15 в 20-23 полях зрения на срез.

Для разделения делящихся и полиплоидизирующихся кератиноци-тов использовали индекс полиплоидизации (1Р)

1р (%) =IPCNA"IKI-67

Установлено, что индекс PCNA корреллирует с 3Н тимидиновой меткой, т е отражает общий уровень синтеза ДНК (Р Galand, С Degraef, 1989,), в то время как Ki-67 экспрессируется только делящимися клетками (М Heen, S Thiriar, J С Noel, 1998; Т Scholzen, J Gerdes, 2000) Известно, что полиплоидизация играет большую роль в ранней дифферен-цировке кератиноцитов (В Я. Бродский, И В Урываева, 1981), и поэтому этот показатель может использоваться для оценки ее уровня. Кроме того, в ряде исследований показано, что большую часть популяции кератиноцитов росткового слоя эпидермиса составляют клетки с гипердиплоидным содержанием ДНК в ядрах (В.И Ноздрин, М 3. Бахшинян, Н.Я. Артюхина, 1977, 1982, Е М Каралова, А.В Петросян и др , 1988) Используя термин «индекс полиплоидизации», мы понимаем, что он отражает не только полиплоидизацию, но и репарацию ДНК при её повреждении

Для оценки результатов иммуногистохимического окрашивания с использованием антител к CK-10 измеряли ширину зоны положительной и «отрицательной» экспрессии белка (в мкм) при помощи комплекса Микмед-2-1600-3 и программного обеспечения Image Tool (USA, University Texas).

Статистическую обработку проводили с помощью параметрических методов вариационной статистики (вычисление наименьших квадратов разностей, корреляция Пирсона и t-критерий Стьюдента) Все вычисле-

11

ния производили с использованием программного обеспечения Microsoft Excel. Статистически значимыми считали результаты с уровнем вероятности не менее 95%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение состояния популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса у интактных крыс

Интерфолликулярный эпидермис кожи интактных крыс представлен многослойным плоским ороговевающим эпителием, состоящим из четырех слоев Кератиноциты базального слоя имеют преимущественно кубическую форму, встречаются единичные митозы В шиповатом слое насчитывается 2—4 уровня кератиноцитов, зернистый слой хорошо выражен, насчитывает, как правило, 3-4 ряда клеток, кератиноциты этого слоя содержат много кератогиалина В роговом слое отмечается чередование участков компактного и рыхлого расположения кератиновых пластов Дистрофические изменения кератиноцитов в виде их вакуолизации встречаются редко.

Эпидермис крыс в условиях ежедневных аппликаций основы раствора визуально не отличается от кожи интактных животных. При мор-фометрическом исследовании толщины клеточного эпидермиса отличий также выявлено не было.

При изучении срезов, окрашенных с помощью моноклональных антител к маркерам пролиферации (PCNA, Ki-67), было выявлено, что у интактных животных меченые ядра расположены в базальтом слое интерфолликулярного эпидермиса, нередко группами по 2-4 клетки (рис. 1.1, 13) Визуальных отличий между образцами кожи животных контрольных групп обнаружено не было, что подтвердилось при вычислении соответствующих индексов. Используя индексы PCNA и Ki-67, рассчитали индекс полиплоидизации для популяции кератиноцитов росткового слоя эпидермиса (табл 1)

В качестве еще одного критерия для оценки процессов дифферен-цировки кератиноцитов выбран CK-10. При обзорной микроскопии было выявлено, что у интактных животных этот белок отсутствует только в базальном слое эпидермиса и появляется уже в супрабазальных керати-ноцитах (рис 1 5), что согласуется с данными других авторов (В Korge, R Stadler, D. Mischke, 1990) Результаты измерений ширины зон положительной экспрессии белка и толщины пласта клеток, не синтезирующих CK-10, представлены в таблице 2.

Рис. I. Кожа мсжлопаточиой области крыс-самцов - пнтактннх (1,3, 5) и после ежедневного в течение 2-х недель нанеоения раствора, содержащего 0,05 % ¡З-иис-репшоеваи кийлота (2, 4, 6). Иммуногистохимическое окрашивание с использованием моноклинальных антител - к РСЫА (I, 2), К ¡-67 (3,4), Ц ню кератину 10 (5.6), Локализация метки указана стрелками. Об.: х 100,ок. х 10(1 -4); об. Ч 20, ок. х ¡0(5-6).

Таблица 1

СМдельные иокалатеди морфотеигтл тттсрфч.шику.чмрн«! о эпидермиса в условиях ежедневны* кшожнр аппликаций растворов 13цРК (М±ш)

Группа Показатели ^^ Интактыс Основа раствора 0,025% раствор 13цРК 0,05% раствор ! 3 цРК

Толщина клеточного эпидермиса(мкм) 21,41±0,26 22,26±0,30 24,96*0,30" 25,02±0,39*

Индекс РС^А (%) 69,44+0,47 67,62±0,58 83,5) ±0,33* 82,10+0,62'

Индекс К1-67 (%) 14,71 ±0,46 13,82 ±0,6 32,85±0,52' 48,53 ±0,4 9'

1р (количество полиплоидных клеток ш 54,73±0,47 53.3±0,47 50,66+0,56* 3/,45+0,58'

Таблица 2

Экспрессия СК-Ю ксратиноцитамн пнтерфол.гшкуларного эпидермиса и условиях ежедневных иакджнш аппликации растворов 13цРК (Млт)

Группа Толщ и на клеточного эпидермиса ("мкм) Толщина зоны экспрессии СЖ-10 Толщина пласта клеток не синтезирующих СК-Ю

Интактная 21,41±0,26 14,95±0,2! 6,46*0,09

Основа раствора 22,20+0,30 15,5410,25 6,72±0,25

0,025% раствор 13цРК 24,9 6± 0,30' 14,40+0,24 10,55*0,16'

0,05% раствор 13цРК 25,02±0,39* 14,78±0,29 10,24±0,2Г

" - вероятность различий с пктаю'нон группой > (р < (I 05)

иптактпые основа р-ра 0,025% р-р 0,05%р-р

13ирк 13цРК

□ покоящиеся клетки □ полиплоидные клетки ■ делящиеся клетки

Рис. 2. Состояние популяции кератиноцитов интерфолликуяярноп) эпидермиса я условиях ежедневных иакажаых аппликаций раетторог. 1 ЗцРК

70.00

60,00

g

I 50,00

те

| 40,00 ¡2

0 зцоо

1

Е 20,00

I

10,00 0,00

14 суг 28 сут 49 су i

■Ш0,025% 13цРК I 10.05% 13uPK —W— инштные -"»—ос но на р-ра

Рис. 3. Динамика экспрессии Ki-67 керагиноцитами росткового слоя эпидермиса после отмены аппликаций растворов, содержащих 13цРК

Таблица 3

Динамика экспрессии I4NA (%) кс-ратин опытам и интерфолликулярного эпидермиса после отмены накожных аппликаций растворов 13ц1'К (М±т).

"руша Срок ^ Иптактная Основа раствора 0,025% раствор 13цРК 0,05% раствор 13цРК

14 сут 47,07±0.68 4R5faO,56 75,49±0,87* 75,67±0,77*

28 суп 56,35±0.87 54,55*0,76 73,85±0,61 * 74,86±0,67*

49 суг 5Я.59±0,И8 57,25^-0,65 67,38±0,84* б1.84±0,77

" - вероятность различий £ Hrtfarrlhoft группой ' 95% (р < 0.05)

Таблица 4

Динамика индекса ноднплиидтянни в интерфолликуларном эпидермисе после отмены накожных аппликаций растворов 13цi'K' (M+nil

-s^J'jiyn" а Срок ^^^^ Иишпяа* Основа раствора 0,025% pací пор [ЗцРК 0,05% расткор 13цРК

14 сут 20.41:1-0,68 20,!6±0,56 26,37*0,87" 12,02±0.77"

28 суг 22.88±0,87 22.24±0,76 26.65±0,61' 3l.86i0.67"

49 сут 25.4&ЫШ 23.64±0.65 35,34±0,84' 28,64±0.77

* - вероятность разлитой с шпаки mi г > 9?% (у < 0 05)

Таким образом, использование методов иммуногистологии позволяет оценить состояние популяции кератиноцитов росткового слоя эпидермиса: у интактных животных доля покоящихся клеток составляет 30,56±0,46%, делящихся - 14,71±0,46%, полиплоидизирующихся -54,73±0,47%

2. Изучение состояния популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса при накожном нанесении 13цРК

Интерфолликулярный эпидермис межлопаточной области спины у крыс после воздействия 0,025% и 0,05% растворов 13цРК неравномерно утолщается; при этом количество рядов клеток в зернистом слое увеличивается и становится равным 3-10. Эпидермис иногда образует гребневидные выросты, образованные клетками зернистого слоя, перегруженными крупными, слившимися гранулами кератогиалина, количество которого возрастает - его гранулы обнаруживаются в клетках не только зернистого слоя, но и шиповатого. Роговой слой истончен, разрыхлен. В эпителии встречаются единичные вакуолизированные клетки, причем их количество визуально больше в образцах кожи животных, получавших аппликации 0,05% раствора 13цРК.

Эти наблюдения подтвердились при морфометрическом исследовании. Его результаты представлены в таблице 1, из которой следует, что ежедневные накожные аппликации растворов 13цРК вызывают достоверное увеличение толщины клеточного эпидермиса.

При изучении срезов, окрашенных с помощью МКА к маркерам пролиферации (РСЫА, Кл-67), было выявлено, что у интактных животных метка локализуется, в основном, в ядрах базального слоя. Накожное нанесение растворов, содержащих 13цРК, вызывает увеличение количества позитивно окрашенных ядер в базальном и шиповатом слоях (рис. 1.2, 1.4). Эти наблюдения были объективизированы путем подсчета соответствующих индексов (табл. 1). Так, двухнедельные аппликации растворов 13цРК вызывают достоверное увеличение экспрессии РСИА кератиноцитами клеточного эпидермиса, что отражает интенсификацию процесса редупликации ДНК в этих клетках, свидетельствующую как об их подготовке к митозу, так и о процессе полиплоидизации клеточных ядер. При оценке экспрессии Кл-67 было установлено, что аппликации растворов 13цРК вызывают достоверное дозозависимое увеличение индекса КИ>7, т.е. под влиянием 13цРК происходит усиление процесса пролиферации кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса, что было обнаружено и другими исследователями (Е. Сгесг1ща-8етепшк, Б. \Volczynski, Т. АпсЫт, 2002). Учитывая тот факт, что экспрессия РСЫА отражает удвоение ДНК как при клеточном делении, так и при полиплоидизации, а Кь67 экспрессируется только в делящихся клетках, мы

16

смогли рассчитать индекс полиплоидизации для популяции кератиноци-тов росткового слоя эпидермиса (табл 1) 13цРК вызывает достоверное снижение этого параметра Уменьшение индекса полиплоидизации может свидетельствовать как о снижении общего уровня дифференцировки эпидермоцитов, так и о накоплении в эпидермисе низкодифференциро-ванных клеток.

Для проверки этого предположения оценивали экспрессию CK-10. При обзорной микроскопии выявлено, что в условиях воздействия 13цРК ширина пласта клеток, не синтезирующих этот белок, увеличивается CK-10 отсутствует в кератиноцитах супрабазального слоя (рис. 1 6). Это подтверждено с помощью морфометрических исследований, результаты которых представлены в таблице 2.

Растворы 13цРК при накожном нанесении в течение двух недель способствуют увеличению толщины пласта клеток, не синтезирующих CK-10, в то время как ширина зоны положительной экспрессии CK-10 остается практически неизменной, что согласуется с данными G.J. Fisher и J.J. Voorhees (1996) и подтверждает версию о накоплении в эпидермисе низкодифференцированных клеток.

Для выяснения связи между полученными параметрами был произведен расчет корреляции по методу Пирсона, который между значениями 1Р и значениями толщины пласта низкодифференцированных клеток, не синтезирующих СК-10, оказался равен |-0,6| Это значение позволяет предположить, что между этими показателями имеется достаточно тесная обратная связь. На рисунке 2 в виде диаграммы представлено состояние популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса в обеих контрольных группах и сразу после окончания двухнедельного воздействия растворов 13цРК.

3. Изучение состояния популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса после прекращения накожного нанесения растворов 13цРК

Для исследования возможностей интерфолликулярного эпидермиса возвращаться к исходному состоянию, животным опытных групп наносили растворы 13цРК в течение 14 сут, после чего аппликации прекращали.

При обзорной микроскопии гистологических срезов кожи после двухнедельного воздействия модификатора морфогенеза выявленные изменения сопоставимы с результатами первого эксперимента Так, отмечается неравномерное утолщение эпидермиса (местами до 12 слоев клеток), расширение зернистого слоя (до 4-6 слоев клеток). Кератогиа-линовые гранулы крупные, причем при использовании 0,05% раствора 13цРК отмечается тенденция к их слиянию; они встречаются и в керати-

17

ноцитах шиповатого слоя. В эпидермисе присутствуют единичные ва-куолизированные клетки Эпидермис образует гребневидные выросты из клеток зернистого слоя, перегруженных крупными слившимися гранулами кератогиалина Роговой слой разволокнен, пласты кератина расположены рыхло Выраженность эффекта зависит от концентрации 13цРК

Через 2 недели после окончания воздействия (28-е сут эксперимента) вышеописанные признаки сохранялись, хотя их выраженность несколько уменьшилась Через 5 недель после окончания аппликаций растворов 13цРК (49-е сут от начала эксперимента) гистоструктура кожи близка к таковой у животных контрольных групп, однако сохраняются участки, содержащие кератиноциты с признаками вакуолизации. Мор-фометрические исследования подтвердили визуальные наблюдения

Анализируя полученные данные, следует отметить, что вызываемый аппликациями растворов 13цРК эффект гиперплазии эпидермиса является устойчивым, но обратимым: через 5 недель после окончания аппликаций, морфологическая картина и морфометрические параметры толщины эпидермиса приближаются к таковым у животных контрольных групп, хотя и не равны им.

При изучении экспрессии маркеров пролиферации установлено, что ежедневные в течение двух недель аппликации 0,025% и 0,05% растворов изотретиноина достоверно увеличивают по сравнению с обеими контрольными группами индекс РС1ЧА Были выявлены те же тенденции, что и в предыдущем эксперименте, т.е экспрессия РСЫА оказалась достоверно выше, чем в контрольных группах. Повышение этого показателя отличается устойчивостью и сохраняется в течение двух недель после окончания нанесения препарата В контрольных группах также отмечается некоторое увеличение 1РСыа, что отражает, по-видимому, возрастные изменения в эпидермисе (табл. 3)

Через 5 недель после окончания воздействия (49-е сут эксперимента) изучаемый показатель достоверно не отличается у животных контрольных групп и особей, получавших аппликации 0,05% раствора 13цРК При этом у крыс, которым наносили 0,025% 13цРК, сохраняется повышенный уровень экспрессии РСЫА, однако происходит его некоторое снижение Таким образом, ежедневные аппликации растворов 13цРК вызывают усиление синтетической активности кератиноцитов, которая сохраняется на протяжении достаточно длительного времени после прекращения аппликаций

При изучении экспрессии Кл-67 установлено, что ежедневные в течение двух недель аппликации 0,025% и 0,05% растворов изотретиноина достоверно увеличивают по сравнению с обеими контрольными группами число К1-67-позитивных ядер 1К,.67 с контрольных значений

18

26,66±0,63 и 29,40±0,52 возрастает до 49,12±0,59 и 63,65±0,98 соответственно, т.е. эффект носит дозозависимый характер. Через 2 недели после окончания воздействия 0,025% раствора 13цРК индекс Кл-67 снижается незначительно (с 49,12±0,59 до 47,20±0,55), в то время как этот же показатель у животных, получавших аппликации 0,05% раствора 13цРК, уменьшается достоверно (с 63,65±0,98 до 43,00±0,69). Индекс К.1-67 популяции кератиноцитов животных обеих контрольных групп за это время несколько увеличивается по сравнению с исходными показателями (с 26,66±0,63 до 33,47±0,51 у интактных животных и с 29,40±0,52 до 32,31±0,56 у крыс, получавших аппликации основы раствора), что отражает, по-видимому, возрастные изменения и/или последствия повторной стрижки волосяного покрова Через 5 недель после окончания воздействия (49-е сут эксперимента) изучаемый показатель у всех животных (контрольных и опытных) практически одинаковый (рис. 3)

Ежедневные аппликации растворов 13цРК вызывают усиление пролиферативной активности эпидермальных кератиноцитов, что является одним из важных критериев дерматотропной активности препаратов, содержащих ретиноиды Эффект носит пролонгированный характер, исчезая только через 5 недель после окончания воздействия. Темп возвращения пролиферативной активности кератиноцитов к показателям контрольных животных оказался более медленным при применении 0,025% раствора 13цРК, что объясняется, по-видимому, меньшим исчерпанием камбиального резерва в условиях воздействия раствора с меньшей концентрацией 13цРК

При изучении динамики индекса полиплоидизации было выявлено, что у животных контрольных групп этот показатель отличается относительным постоянством, несколько увеличиваясь через 49 суток после начала эксперимента, что, с известной долей вероятности, можно расценивать как возрастные особенности кожи крыс. При ежедневных накожных аппликациях растворов, содержащих 0,025% и 0,05% 13цРК, на 14-е сут, т е. сразу после отмены аппликаций, отмечается снижение индекса полиплоидизации лишь при использовании раствора большей концентрации, что связано, по-видимому, с массивным вступлением клеток в митотиче-ский цикл При использовании 0,025% раствора 13цРК отмечается незначительное повышение индекса полиплоидизации, что свидетельствует о согласованном усилении процессов деления и редупликации ДНК

Через 2 недели после окончания аппликаций (28-е сут эксперимента) в группе животных, которым наносили 0,05% раствор изотретиноина, отмечается повышение данного показателя, что вероятно, может быть вызвано массивным вступлением поделившихся клеток в процессы диф-ференцировки В опытной группе 0,025% 1Р остается практически без из-

менений Через 5 недель после окончания воздействия субстанции (49-е сут эксперимента) в опытной группе с использованием 0,05% концентрации 13цРК происходит снижение 1Р до цифр, сопоставимых с контрольными группами. В первой же опытной группе, с применением 0,025% раствора 13цРК, наблюдается всплеск этого показателя («запаздывание процесса»), что может быть связано с более мягким, постепенным действием низких концентраций 13цРК. Результаты расчетов этого показателя представлены в таблице 4.

Сопоставляя полученные результаты, можно допустить существование двух стадий в механизме воздействия 13цРК на интерфолликулярный эпидермис

1-я стадия — непосредственное воздействие 13цРК на кератино-циты интерфолликулярного эпидермиса, а также дермальные фиброб-ласты через стимуляцию выработки ростовых факторов Рядом авторов выявлено, что 13цРК вызывает усиление синтеза гепариноподобного эпидермального фактора роста (heparin-binding epidermal growth factor) супрабазальными кератиноцитами, а также фактора роста гепатоцитов (hepatocyte grown factor) фибробластами дермы. Эти вещества активизируют пролиферативную активность базальных клеток, вызывая рети-ноид-индуцированную гиперплазию эпидермиса (В. Chapellier, М. Mark, N Messaddeq et al, 2002- К. Yoshimura, G. Uchida, M. Okazaki et al, 2003; L Rittie, J Varani, S Kang et al, 2006).

II стадия — опосредованное воздействие путем влияния на эпидермис биологически активных веществ, вырабатываемых активированными Т-лимфоцитами.

Как известно, 13цРК обладает иммуностимулирующими свойствами, вызывая активацию и направленную миграцию Т-лимфоцитов в дерму, которые регулируют пролиферативную активность кератиноци-тов в норме и при регенераторных процессах, протекающих в интерфолликулярном эпидермисе (А Г. Бабаева, 1972, 1985; В.И Ноздрин, В М Земсков, Ю.Т Волков, 2004).

В пользу влияния 13цРК на морфогенез кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса через активацию Т-лимфоцитов может свидетельствовать так называемый «эффект переноса» который был исследован для 13цРК Ю.Т Волковым и др. (2004). Так, введение интактным животным лимфоцитов от мышей, получавших 13цРК, вызывало в коже появление эффектов, свойственных 13цРК.

Таким образом, длительность эффектов от двухнедельных аппликаций 13цРК может быть обусловлена длительностью жизни активированных лимфоцитов Результаты экспериментальных исследований це-

лесообразно учитывать при планировании курсовой и поддерживающей терапии кожных заболеваний ретиноидами.

Сравнение результатов двух идентичных экспериментов, различия между которыми заключались главным образом во времени суток, в которое производились аппликации и взятие материала для исследований, позволило установить, что, клеточный цикл кератиноцитов имеет суточные колебания.

Было выявлено, что экспрессия РСИА у интактных животных днем (69,44+0,47%) была достоверно выше, чем ночью (47,07+0,68). В отношении экспрессии Кл-67 была выявлена обратная тенденция: максимум экспрессии наблюдался в предутренние часы (26,66±0,63), а минимум - в дневное время (14,71 ±0,46)

На основании полученных данных можно было бы предположить, что максимальный уровень синтеза ДНК приходится на дневные, а пик деления - на ночные часы. Известно, что у человека эти процессы происходят именно таким образом. Однако данные о суточных колебаниях пролиферативной активности кератиноцитов у крыс противоречивы, что требует более глубокого изучения и может стать темой для отдельного исследования (ИН Михайлов, 1979; ЛИ Аруин, А Г Бабаева, В.Б Гельфланд и др., 1987)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В соответствии с поставленной целью изучение пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса у при накожном нанесении растворов 13цРК было проведено на лабораторных крысах с использованием методов морфометрического и имму-номорфологического анализа состояния эпителиально-клеточного пласта кожи.

Исследование показало, что клеточный цикл кератиноцитов имеет суточные колебания. Днем (12-13 ч) в популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса интактных животных доля покоящихся клеток составляет 30,56±0,46%, делящихся - 14,71±0,46%, полиплоиди-зирующихся - 54,73±0,47% В предутренние часы (3-4 ч) покоящихся кератиноцитов - 52,93±0,46%, делящихся - 26,66±0,63%, полиплоиди-зирующихся - 21,41± 0,47% Использование в качестве модификатора морфогенеза растворов 13цРК приводит к усилению экспрессии маркеров пролиферации, причем для К1-67 это увеличение носит дозозавис-мый характер, что свидетельствует об интенсификации пролифератив-ных процессов в клетках росткового слоя эпидермиса Также в исследованных условиях происходит снижение общего уровня дифференци-

ровки кератиноцитов, что проявляется снижением индекса полиплоиди-зации и увеличением толщины пласта клеток, не синтезирующих цито-кератин 10. Следует отметить, что выявленные изменения не являются специфичными только для 13цРК и могут выявляться при использовании препаратов, стимулирующих пролиферативную активность кератиноцитов, а также в условиях регенерации Эффект от применения 13цРК характеризуется устойчивостью, существенно снижаясь только через 5 недель после окончания воздействия субстанции, при этом оказалось, что использование раствора с меньшей концентрацией (0,025%) 13цРК обеспечивает более длительное проявление специфической активности субстанции за счет, по-видимому, большей сохранности камбиального резерва ткани

Использование морфометрии с применением компьютерных технологий и иммуноморфологии с количественной оценкой полученных результатов дало возможность получить новые данные об отдельных показателях интерфолликулярного эпидермиса в норме и в условиях накожных аппликаций 13цРК. Это может оказаться полезным при разработке тактики лечения кожных заболеваний ретиноидами Представленная работа является частью комплексных исследований, проводящихся на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии медицинского института Орловского государственного университета совместно с научным отделом ЗАО "Ретиноиды" в рамках направления «Гистофармакологические исследования кожи»

ВЫВОДЫ

1 Клеточный цикл кератиноцитов крыс-самцов Вистар имеет суточные колебания Днем в популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса интактных животных преобладают покоящиеся (О0-период) и полиплоидизирующиеся клетки, в то время как в предутренние часы доминируют покоящиеся и делящиеся кератиноциты.

2 Аппликации растворов, содержащих 13-цис-ретиноевую кислоту, вызывают увеличение количества делящихся клеток на фоне снижения числа покоящихся и полиплоидных клеток Это способствует накоплению в эпидермисе низкодифференцированных кератиноцитов, что проявляется увеличением толщины пласта клеток, не синтезирующих цито-кератин 10

3 Эффект от применения 13-цис-ретиноевой кислоты (усиление пролиферативной активности, снижение количества покоящихся и полиплоидных клеток) носит пролонгированный характер, уменьшаясь только к пятой неделе после отмены воздействия субстанции

4. Дозозависимость эффекта от воздействия 13-цис-ретиноевой кислоты на интерфолликулярный эпидермис у крыс проявляется изменением соотношения количества делящихся, дифференцирующихся и покоящихся кератиноцитов, отражающим усиление пролиферативной и синтетической активности клеток.

5. Полученные данные использованы при разработке нормативной документации (раздел «Специфическая активность») на новое лекарственное средство «Ретасол®» Препарат запатентован, разрешен к клиническому применению и выведен на Российский фармакологический рынок.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Для достижения эффектов усиления пролиферации и снижения дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса, препараты, содержащие 13цРК, целесообразно назначать пациентам 1 раз в сутки, в позднее вечернее или ночное время

2 Для оценки дерматотропной активности новых лекарственных средств целесообразно применять иммуноморфологические методы исследований с последующей количественной оценкой.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Ноздрин В И, Кинзирский А С , Белоусова Т А, Сазыкина J1Н, Лаврик О И, Жучков С.А., Яцковский А Н Сравнительное изучение действия стимуляторов регенерации на эпидермис интактной кожи // Материалы науч конф "Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей" (19-20 апреля 2001 г) — С -Пб Изд-во BMA, 2001 -С 62

2 Яцковский А Н, Кинзирский А С , Белоусова Т А, Архапчев Ю П, Жучков С.А., Ноздрин В И Влияние некоторых лекарственных препаратов на репаративные процессы в коже // Материалы науч конф "Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей" (19-20 апреля 2001 г ) - С -Пб Изд-во BMA, 2001 - С 93-94

3 Ноздрин В И, Белоусова Т А, Кинзирский А С , Лаврик О И, Остапчук Н В , Поляченко Л Н, Гузев К С, Сазыкина Л Н, Жучков С.А., Яцковский А Н Изучение себостатического действия препарата Ретасол® // Тез докл X Российский нац конгр "Человек и лекарство" -М,7-11апр 2003 -С 641-642

4 Альбанова В И, Белоусова Т А , Жучков С.А., Сазыкина Л Н Структурные изменения в коже, обусловленные действием 13-цис-ретиноевой кислоты в составе наружных препаратов // Тез докл Первого Российск конгр дерматовенерологов - СПб, 23-26 сентября 2003 г - Том 1 - С 9-10

5 Альбанова В И, Белоусова Т А, Жучков С.А., Сазыкина Л Н Морфологические изменения кожи, обусловленные действием 13-цис-ретиноевой кислоты в составе рети-ноевой мази // Актуальные проблемы уретрогенных инфекций, передаваемых половым

путем Новые лекарственные препараты в дерматовенерологической практике Материалы науч -практ конф - М, 2003 - С 9-10

6 Ноздрин В И, Кинзирский А С , Белоусова Т А, Жучков С. А., Крутых Е Г, Лаврик О И, Бобылев В П, Яцковский А С Закономерности изменения толщины эпидермиса животных при воздействии стимуляторов регенерации // Омский научный вестник «Морфологические науки - практической медицине» - Март 2004 - С 75-78

7 Ноздрин В И, Белоусова Т А, Жучков С.А., Крутых Е Г, Горпинич И В , Горелова М В , Бобылев В П Иммуноморфологические подходы к изучению действия ре-тиноидов на эпидермис // В сб Ретиноиды - М Изд ФНПП "Ретиноиды" - 2005 -Вып 21 -С49-51

8 Белоусова Т А, Альбанова В И, Жучков С.А., Сазыкина JIН, Ноздрин В И Гистоструктурные проявления дерматотропной активности ретиноевой мази // Росс ж кожных и венерических болезней -2005 -№2 - С 61-66

9 Жучков С.А., Кинзирский А С , Белоусова Т А , Крутых Е Г , Бобылев В П, Горпинич И В , Алексеев А Г, Ноздрин В И Изучение влияния препарата Ретасол на экспрессию PCNA кератиноцитами интерфолликулярного эпидермиса // Тез докл XIII Российский нац конгр "Человек и лекарство" -М,3-7апр 2006 - С 641-642

10 Ноздрин В И, Белоусова Т А, Жучков С.А., Крутых Е Г К вопросу об участии стволовых клеток в реакциях эпидермиса на аппликации дерматотропных средств // Материалы науч совещ "Актуальные проблемы учения о тканях" (14 апреля 2006 г ) -С -Пб Изд-во BMA, 2006 - С 68-69

11 Ноздрин В И, Жучков С.А. Методические подходы к оценке вновь разрабатываемых лекарственных препаратов кожного действия // Мат 5-й Всероссийской научн конф Бабухинские чтения в Орле 5-7 июня 2006 г - В сб Ретиноиды - М Изд ЗАО «Ретиноиды,2006 -Вып24 -С 49-51

12 Жучков С.А , Крутых Е Г, Алексеев А Г, Горелова М В , Бобылев В П, Ноздрин В И К вопросу об эпидермальной пролиферативной единице // Мат 5-й Всероссийской научн конф Бабухинские чтения в Орле 5-7 июня 2006г - В сб Ретиноиды - М Изд ЗАО «Ретиноиды, 2006 - Вып 24 - С 100-105

13 Белоусова Т А, Жучков С.А, Крутых Е Г , Альбанова В И, Ноздрин В И Цитокератины эпидермиса (краткий обзор) // Мат 5-й Всероссийской научн конф Бабухинские чтения в Орле 5-7 июня 2006г-В сб Ретиноиды -М Изд ЗАО «Ретиноиды, 2006 - Вып 24 - С 88-95

14 Ноздрин В И, Белоусова Т А, Жучков С.А., Крутых Е Г Реактивные изменения пролиферирующих клеток эпидермиса крыс при аппликациях изотретиноина // Морфология - 2006 - Т 129, №4 - С 94

15 Ноздрин В И, Кинзирский А С , Белоусова Т А, Лаврик О И, Остапчук Н В, Жучков С.А, Крутых Е Г Некоторые видовые, региональные, половые и возрастные особенности строения кожи экспериментальных животных в норме // Морфология -2006 -Т 130,№5 -С 66

16 Ноздрин В И, Жучков С.А Состояние популяции кератиноцитов в условиях экспериментально модифицированного морфогенеза // Мат 6-й Всероссийской научн конф Бабухинские чтения в Орле 28-29 марта 2007г - В сб Ретиноиды - М Изд ЗАО «Ретиноиды», 2007 - Вып 25 - С 47-56

17 Ноздрин В И, Белоусова Т А, Жучков С.А., Крутых Е Г, Алексеев А Г, Горелова М В Изучение влияния препарата Ретасол на пролиферативную активность кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса // Тез докл XIV Российский нац конгр "Человек и лекарство"-М, 16-20 апр 2007 -С 857-858

18 Жучков С. А., Ноздрин В И, Белоусова ТА, Крутых ЕГ Количественная оценка влияния препарата Ретасол на экспрессию цитокератина 10 кератиноцитами ин-

терфолликулярного эпидермиса // Тез докл XIV Российский нац конгр "Человек и лекарство" - М, 16-20 апр 2007 - С 823

19 Жучков С.А. Состояние кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса при аппликации 13-цис-ретиноевой кислоты (иммуноцитохимический анализ) // Морфология -2007 -Т 132,№4 -С 68-72

ПАТЕНТ

Ноздрин В И, Гузев К С , Поляченко Л Н, Альбанова В И , Архапчев Ю П , Бело-усова Т А , Кинзирский А С , Сазыкина Л Н, Лаврик О И, Жучков С.А., Яцков-ский А Н, Архапчева Л Д, Володин П В , Володин К В , Ноздрин К В Раствор для лечения заболеваний кожи, способ его получения и способ лечения заболеваний кожи // Патент на изобретение № 2197235 приоритет от 05 04 2002г

Соискатель:

Жучков С А

• ¿ь

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю благодарность и глубокую признательность сотрудникам научного отдела ЗАО "Ретиноиды" - вед. науч сотруд, канд. мед наук, доц Т.А. Белоусовой, вед науч. сотруд, канд. биол. наук О.И. Лаврик, докт. мед. наук, проф. В.И. Альбановой, докт. мед. наук, проф кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ММА им И.М. Сеченова А.Н. Яц-ковскому за постоянные и полезные консультации и обсуждение полученных результатов, а также сотрудникам кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Медицинского института Орловского государственного университета - старш. лаб. Л.В. Маркиной за помощь в освоении гистологической техники, проф. В.П. Бобылеву за постоянную организационную под держку, асс. Е.Г. Крутых за обсуждение экспериментальных данных

Подписано в печать 14 09 2007 г Формат 60x84/16 Гарнитура Times New Roman Бумага тип Печать цифровая Тираж 100 экз Заказ № 201

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором в типографии ЗАО "Ретиноиды" 111123, Москва, ул Плеханова, д 2/46 стр 5 Тел/факс (495)788-50-14

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жучков, Сергей Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Строение интерфолликулярного эпидермиса.

1.1.1. Кератиноциты.

1.1.2. Меланоциты.

1.1.3. Клетки Лангерганса.

1.1.4. Клетки Меркеля.

1.1.5. Клетки Гринстейна.

1.1.6. Лимфоциты.

1.1.7. Эпидермальная пролиферативная единица.

1.2. Ретиноиды, их метаболизм и влияние на морфогенез кератино-цитов интерфолликулярного эпидермиса.

1.2.1. Фармакологические свойства ретиноидов.

1.2.2. Влияние ретиноидов на морфогенез кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Животные.

2.1.2. Субстанция.

2.2. Методы.

2.2.1. Морфологические и морфометрические методы исследований.

2.2.2. Иммуноморфологические методы исследований.

2.2.3. Методы обработки цифровых изображений, увеличение.

2.3. Статистическая обработка экспериментального материала.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Изучение состояния популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса у интактных крыс.

3.1.1. Гистологическое и морфометрическое исследование интерфолликулярного эпидермиса.

3.1.2. Иммуногистологическое исследование пролифера-тивной активности кератиноцитов.

3.1.3. Иммуногистологическое исследование процессов дифференцировки кератиноцитов.

3.2. Изучение состояния популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса при накожном нанесении растворов 13цРК.

3.2.1. Гистологическое и морфометрическое исследование интерфолликулярного эпидермиса животных опытных групп.

3.2.2. Иммуногистологическое исследование пролифера-тивной активности кератиноцитов при накожном нанесении

13цРК

3.2.3. Иммуногистологическое исследование процессов дифференцировки кератиноцитов при накожном нанесении

13цРК

3.3. Изучение состояния популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса после прекращения накожного нанесения растворов 13цРК.

3.3.1. Гистологическое и морфометрическое исследование интерфолликулярного эпидермиса у животных контрольных и опытных групп.

3.3.2. Иммуногистологическое исследование пролифера-тивной активности кератиноцитов после прекращения нанесения растворов 13цРК.

3.3.3. Изучение процессов дифференцировки кератиноцитов после прекращения нанесения растворов 13цРК.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ.

4.1. Циркадные ритмы в популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса крыс-самцов Вистар.

4.2. Отдельные аспекты влияния и возможный механизм действия

13цРК на интерфолликулярный эпидермис крыс-самцов Вистар.

4.3. Длительность полученных эффектов после окончания накожных аппликаций 13цРК.

4.4. Дозозависимость воздействия 13цРК на интерфолликулярный эпидермис крыс.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние 13-цис-ретиновой кислоты на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов крыс"

Актуальность проблемы

Эпидермис представляет собой постоянно обновляющуюся-систему клеток (с преобладанием кератиноцитов), в которой одновременно протекают процессы пролиферации, дифференцировки и апоптоза, поддерживающие динамическое равновесие и играющие важную роль в сохранении целостности эпителиального пласта (M.Haftek, 2002). В основе многих заболеваний кожи лежит нарушение одного или нескольких процессов морфогенеза кератиноцитов. Например, при псориазе увеличивается пролифе-ративная активность клеток, что вместе с уменьшением уровня их дифференцировки и апоптотической гибели приводит к появлению» псориатиче-ских папул и бляшек (А.И. Новиков, А.В. Кононов, В.А. Охлопков и* др., 2003; Г.М. Цветкова, В.В. Мордовцева, A.M. Вавилов, 2003; И.А.Казанцева, 2004; В.И. Прохоренков, Т.Г. Рукша, JI.JL Петрова и др., 2005).

Известно большое количество химических веществ как естественного (ростовые факторы, интерлейкины, кейлоны, гормоны и др.), так и искусственного происхождения (ретиноиды, цитостатические препараты, мети-лурацил и др.) которые могут изменять процессы гистогенеза и цитогенеза в коже. Понимание протекающих в эпидермисе процессов морфогенеза представляется важным, поскольку это может пролить свет на возможность модифицирования с помощью лекарственных препаратов в условиях патологии морфогенеза кожных структур в желаемом направлении.

Витамин А и его производные являются естественными регуляторами гистогенеза эпителиальных тканей, а синтетические производные витамина А (ретиноиды) применяются< для. лечения «кожных заболеваний, протекающих с нарушением морфогенетических процессов в эпидермисе. В связи с этим было решено использовать в качестве модификатора морфогенеза 13-цис-ретиноевую кислоту (13цРК), которая образуется в организме из ретинола (Ю:И. Афанасьев, В.И. Ноздрин, Ю.Т. Волков, 1990; G. Siegenthaler, J.H. Saurat, М. Ропес, 1990; М. Maden, М. Hind, 2003).

К настоящему времени исследования, посвященные изучению» воздействия ретиноидов на гистоструктуру эпидермиса, относительно немногочисленны. В России в, последние три десятилетия наиболее последовательно в этой области работали на кафедре гистологии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (Ю.И. Афанасьев, В.И. Ноздрищ 1983 и др.); а позднее - на фармацевтическом научно-производственном предприятии "Ретиноиды" (К.С. Гузев, В.И. Ноздрин, 2003; В.И. Ноздрин, В.М. Земсков, Ю.Т. Волков, 2004; В.И. Ноздрин, В.И. Альбанова, JI.H. Сазыкина, 2005; В.И. Ноздрин, Т.А. Белоусова; В.И. Альбанова, О.И. Лаврик, 2006 и др.). Следует отметить, что аналогичные-зарубежные исследования посвящены в основном изучению воздействия на эпидермис полностью • транс-ретиноевой кислоты, хотя в последние годы наметилось активное изучение свойств и 13цРК. Полученные авторами данные (К.А. Tadini, L.R. Gaspar, P.M. Maia Campos, 2006; M. Schroeder, G.G. Zouboulis, 2007) вполне согласуются с результатами отечественных исследований. Для объективизации морфологических аспектов дерматотропной фармакологической активности ретиноидов применяются морфометрические методы исследований с использованием компьютерных технологий. Так, были выявлены определенные закономерности реакции эпидермиса на аппликации препаратов, содержащих 13цРК, в виде увеличения толщины кожного эпителия, снижения уровня кератинизации, тенденции к «омоложению» клеточной популяции при непродолжительном (ежедневном в течение двух недель) нанесении (В.И. Ноздрин, А.С. Кинзирский, Т.А. Белоусова и др., 2004). Но механизмы возникновения данных изменений оставались неясными. Bs более ранних экспериментах, выполненных с использованием тимидиновой метки, подсчетом митотического индекса, определением плоидности и применением гистохимических методик, показано, что в условиях воздействия ретинои-дов на кожу увеличивается пролиферативная активность кератиноцитов, изменяется плоидность их ядер и содержание в цитоплазме сульфгидриль-ных групп и гликозаминогликанов (В.И. Ноздрин, М.З. Бахшинян, Н.Я. Артюхина, 1977, 1982; Е.М. Каралова, А.В. Петросян и др., 1988). Однако трактовка этих данных носила в значительной степени предположительный характер. Кроме того, не проводилось изучение длительности существования полученных эффектов после окончания нанесения препаратов. Знание особенностей изменения гистоструктуры и морфометрических параметров эпидермиса в условиях воздействия ретиноидов определяет необходимость объективной, более информативной, выполненной с применением иммуно-морфологических методов исследований оценки дерматотропной активности ретиноидов в отношении пролиферации дифференцировки.

До настоящего времени влияние ретиноидов на пролиферативную активность и дифференцировку клеток нормального эпидермиса изучалось, главным образом, в условиях культуры ткани (G .J. Fisher и J .J. Voorhees, 1996; A. Lokshin, Н. Zhang et al., 1999). Результаты этих исследований не отражают в полной мере процессы, происходящие в тканях, так как в клеточных культурах отсутствуют регуляторные влияния со стороны нервной, эндокринной, иммунной и др. систем. В литературе мы не встретили исследований, посвященных влиянию ретиноидов на клеточную популяцию кератиноцитов здоровых животных in vivo в свете оценки их цитогенеза, в том числе, выполненных с использованием иммуноморфологических методик. Также не удалось найти исследований по изучению состояния популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса после окончания нанесения препаратов, содержащих 13цРК.

В связи с этим, изучение морфогенетических процессов в эпидермисе в норме и при воздействии на кожу биологически активных форм витамина А представляется актуальным. Учитывая, что многослойный плоский ороговевающий эпителий кожи является полидифферонной тканью, ведущая роль в которой принадлежит дифферону кератиноцитов (основному компоненту эпидермальной пролиферативной единицы), изучение гистоге-нетических процессов внутри этой клеточной популяции является целесообразным, так как может послужить более глубокому пониманию процессов, лежащих в основе регенерации эпидермиса, а также механизмов местного действия ретиноидов.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования^явилось изучение пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса у крыс при накожном нанесении растворов 13-цис-ретиноевой кислоты.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить структурно-функциональные аспекты пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса у ин-тактных крыс-самцов.

2. Изучить структурно-функциональные аспекты пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса при накожном? нанесении 13-цис-ретиноевой кислоты в виде растворов разных концентраций.

3. Изучить структурно-функциональные аспекты пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса после прекращения нанесения растворов 13-цис-ретиноевой кислоты.

Основные положения диссертации, выносимые на,защиту

1. Клеточный цикл кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса интактных крыс-самцов имеет суточные колебания. Днем (в 12-13 ч) доля покоящихся клеток (Go -период) составляет 30;56±0,46%, делящихся -14,71±0,46%, полиплоидизирующихся - 54,73±0,47%. В'предутренние часы (3^4 ч) покоящихся кератиноцитов - 52,93±0,46%, делящихся -26,66±0,63%, полиплоидизирующихся - 21,41±0,47%.

2. Аппликации растворов 13цРК приводят к увеличению количества делящихся клеток на фоне снижения числа покоящихся (G0) и полиплоидных клеток, что способствует накоплению в эпидермисе низкодифференци-рованных кератиноцитов. Наряду с кератолитическим действием 13цРК это обусловливает «омоложение» популяции кератиноцитов росткового слоя эпидермиса.

3. Этот эффект сохраняется на протяжении 2 недель после отмены 13цРК; его снижение было отмечено только через 5 недель.

Научная новизна

Впервые разработан способ оценки пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса с использованием моноклональных антител.

Впервые с помощью иммуноморфологических методов охарактеризованы суточные ритмы в эпидермисе крыс с использованием объективных параметров: индексов PCNA, Ki-67, индекса полиплоидизации.

Впервые с помощью моноклональных антител проанализировано состояние популяции кератиноцитов* интерфолликулярного эпидермиса при местном воздействии 13цРК. В условиях ежедневных накожных аппликаций растворов 13цРК происходит активация пролиферативных процессов, проявляющаяся в увеличении количества делящихся клеток, что на фоне снижения числа покоящихся и полиплоидных клеток приводит к накоплению в эпидермисе низкодифференцированных кератиноцитов.

Охарактеризована динамика структурных, морфометрических и им-муноморфологических показателей популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса в различные сроки после окончания накожных аппликаций 13цРК и установлено, что эффект от воздействия 13цРК является в значительной степени устойчивым, так как ряд характеризующих его параметров отличается от таковых у животных контрольных групп на протяжении 5 недель после окончания аппликаций.

Теоретическая и практическая ценность работы

В результате проведенных исследований выявлены основные характеристики цитогенеза кератиноцитов - интерфолликулярного эпидермиса у крыс-самцов Вистар в норме, изученные с помощью иммуноморфологиче-ских методик с использованием моноклональных антител (МКА) к Ki-67, PCNA (proliferation cell nuclear antigen - ядерный антиген пролиферирую-щих клеток), цитокератину 10. Установлено, что клеточный цикл кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса крыс-самцов имеет суточные колебания. Определено процентное соотношение покоящихся (Go), делящихся и полиплоидных кератиноцитов в дневное и ночное время. Установлено что в предутренние часы (3-4 ч) в популяции кератиноцитов больше делящихся и покоящихся клеток и меньше клеток полиплоидных.

Установлены структурные и иммуноморфологические проявления воздействия' 13цРК на популяцию кератиноцитов. Ежедневные, в течение двух недель аппликации растворов Л ЗцРК вызывают утолщение клеточного эпидермиса, увеличение доли делящихся клеток, снижение представительства клеток покоящихся и полиплоидных и накопление в эпидермисе низко-дифференцированных клеток. Обнаруженный эффект в сочетании с известным кератолитическим действием 13цРК приводит к «омоложению» популяции кератиноцитов росткового слоя эпидермиса.

При экспериментальном исследовании состояния популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса после отмены препаратов, содержащих 13цРК, было установлено, что эффект от применения 13цРК носит пролонгированный характер, снижаясь только через 5 недель после окончания нанесения растворов 13цРК. Темпы возвращения пролифератив-ной активности кератиноцитов'к показателям интактных животных оказались более медленными при использовании раствора с меньшей концентрацией 13цРК (0,025%), что объясняется, по-видимому, большей сохранностью в этих условиях камбиального резерва кератиноцитов.

Полученные данные расширяют представление о механизме действия 13цРК на интерфолликулярный эпидермис. Они учтены при выборе концентрации действующего вещества в составе лекарственных форм; и в обосновании терапии кожных заболеваний растворами, содержащими* 13цРК.

Количественные критерии оценки процессов пролиферации и диф-ференцировки применительно к эпидермису, полученные с применением иммуноморфологических методов, могут оказаться полезным «инструментом» для объективной оценки состояния кожного эпителия.

Внедрение

Результаты исследований использованы при составлении нормативно-технической документации на новое лекарственное средство с 13цРК -Ретасол® (раздел «Специфическая активность»); номер государственной регистрации № 001836/01- 2002. Препарат разрешен для наружного применения и выпускается на производственных мощностях ЗАО"Ретиноиды". Получен патент на изобретение № 2197235 «Раствор для лечения заболеваний кожи, способ его получения и способ лечения заболеваний кожи» с приоритетом от 05.04.2002 г.

Апробация работы

Основные материалы работы были доложены и обсуждены: на Всероссийской научной конференции «Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей» (С-Петербург, апрель 2001 г.), на «Первом российском конгрессе дерматовенерологов» (С-Петербург, сентябрь 2003 г.), на Всероссийской конференции «Новые лекарственные препараты в. дерматовенерологической практике» (Москва, ноябрь 2003 г.), на трех Всероссийских конференциях «Бабухинские чтения в Орле» (июнь 2005, июнь 2006, март 2007 гг.), на Всероссийском научном совещании анатомов, гистологов и эмбриологов «Актуальные проблемы учения о тканях» (С-Петербург, апрель 2006 г.), на-VII Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Орел, сентябрь 2006 г.), на трех Всероссийских съездах «Человек и лекарство» (апрель 2003, апрель 2006, апрель 2007 гг.)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 работ, из них в журналах по списку ВАК - 4.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 59 рисунками. Указатель литературы включает 118'источников, в том числе - 55 отечественных и 63 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Жучков, Сергей Александрович

выводы

1 Клеточный цикл кератиноцитов крыс-самцов Вистар имеет суточные колебания. Днем в популяции кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса интактных животных преобладают покоящиеся (Go-период) и полиплоидизирующиеся клетки, в то время как в предутренние часы доминируют покоящиеся и делящиеся кератиноциты.

2. Аппликации растворов, содержащих 13-цис-ретиноевую кислоту, вызывают увеличение количества делящихся клеток на фоне снижения числа покоящихся и полиплоидных клеток. Это способствует накоплению в эпидермисе низкодифференцированных кератиноцитов, что проявляется увеличением толщины пласта клеток, не синтезирующих цитокератин 10.

3. Эффект от применения 13-цис-ретиноевой кислоты (усиление про-лиферативной активности, снижение количества покоящихся и полиплоидных клеток) носит пролонгированный характер, уменьшаясь только к пятой неделе после отмены воздействия субстанции.

4. Дозозависимость эффекта от воздействия 13-цис-ретиноевой кислоты на интерфолликулярный эпидермис у крыс проявляется изменением соотношения количества делящихся, дифференцирующихся и покоящихся кератиноцитов, отражающим усиление пролиферативной и синтетической активности клеток.

5. Полученные данные использованы при разработке нормативной документации (раздел «Специфическая активность») на новое лекарственное средство «Ретасол®». Препарат запатентован, разрешен к клиническому применению и выведен на Российский фармакологический рынок.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для достижения эффектов усиления пролиферации и снижения дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса, препараты, содержащие 13цРК, целесообразно назначать пациентам 1 раз в сутки, в позднее вечернее или ночное время.

2. Для оценки дерматотропной активности новых лекарственных средств целесообразно применять иммуноморфологические методы исследований с последующей количественной оценкой.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жучков, Сергей Александрович, Москва

1. Алексеев А.Г., Жучков С.А. Методические подходы к оценке воздействия депигментирующих средств // Мат. 6-й Всероссийской научн. конф. Бабухинские чтения в Орле. 28-29 марта 2007г. - М.: Изд. ЗАО «Ретиноиды», 2007а. - Вып 25. - С. 37-39.

2. Алексеев А.Г., Жучков С.А. Способ оценки содержания меланина в эпидермисе // Мат. 6-й Всероссийской научн. конф. Бабухинские чтения в Орле. 28-29 марта 2007г.- М.: Изд. ЗАО «Ретиноиды», 20076. -Вып 25. С. 75-76.

3. Альбанова В.И., Сазыкина Л.Н. Опыт применения ретиноевой мази в лечении обычных угрей // Вест. дерм, и венер.,2000. №4. - С. 46-47.

4. Аруин Л.И., Бабаева А.Г., Гельфланд В.Б. и др. Структурные основы адаптации и компенсации нарушенных функций: Руководство/АМН СССР. М.: Медицина, 1987. - 448 с.

5. Архапчев Ю.П. Исследование фармакокинетики и стабильности ретиноидов. Автореф. дисс. докт. фармацевт, наук. Купавна, 2000. - 43 с.

6. Афанасьев Ю.И., Ноздрин В.И., Волков Ю.Т., Никифоров С.А. Витамин А — регулирующий фактор процессов гистогенеза // Усп. соврем, биол., 1990. Т.110., № 3(6). - С.410-418.

7. Афанасьев Ю.И., Ноздрин В.И., Михайлов О.И. Популяционно-клеточные аспекты механизма действия витамина А // Усп. совр. биол., 1983. Т. 95, № 3. - С. 358-372.

8. Афанасьев Ю.И., Ноздрин В.И., Михайлов О.И. и др. Функции витамина А // Усп. совр. биол., 1986. Т. 101, № 2. - С. 215-228.

9. Бабаева А.Г. Иммунологические механизмы регуляции восстановительных процессов. -М.: Медицина, 1972. 150с.

10. Бабаева А.Г. Регенерация и система иммуногенеза. М.: Медицина, 1985. - 255с.

11. Бродский В.Я., Урываева И.В. Клеточная полиплоидия. Пролиферация и дифференцировка. М.: Наука, 1981г. -259с.

12. Волков Ю.Т., Гузев К.С., Масюлис А.В.-К. и др. Специфическая активность мази с 13-цис-ретиноевой кислотой (13цРК) // Альманах «Ретиноиды». М.: Изд-во ФНПП «Ретиноиды», 1997. - вып. 4. - С. 9-14.

13. Гетлинг З.М. Современные данные о тонком строении эпидермиса нормальной кожи человека. М. 1969. - С. 353-361.

14. Горпинич И.В., Ноздрин В.И. Стволовые клетки волосяного фолликула // Мат. 6-й Всероссийской научн. конф. Бабухинские чтения в Орле. 5-7 июня 2006г.- М.: Изд. ЗАО «Ретиноиды», 2006. Вып 24. -С. 95-99.

15. Горпинич И.В., Жучков С.А. Идентификация фаз цикла роста волос у крыс // Мат. 6-й Всероссийской научн. конф. Бабухинские чтения в Орле. 28 29 марта 2007г.- М.: Изд. ЗАО «Ретиноиды», 2007 - Вып 25. -С. 79-81.

16. Гузев К.С., Ноздрин В.И. Новые отечественные лекарственные средства с ретиноидами. М.: Изд-во ФНПП «Ретиноиды», 2003. - 112с.

17. Доронин Ю.К., Голиченков В.А. Временной модуль онтогенеза. М.: Изд. Московского университета, 2006. 116с.

18. Душейко А.А. Витамин А: обмен и функции Киев: Наук, думка, 1989.-288с.

19. Казанцева И.А. Апоптоз и его роль в патологии кожи // Российский журнал кожных и венерологических болезней. 2004. - №4. -С. 17-22.

20. Капитца Х.Г. Первые шаги в микроскопии. Изд 2-ое, переработанное. Йена: Карл Цейсс, 1997. - 44с.

21. Каралова Е.М., Петросян А.В., Аброян Л.О., Ноздрин В.И., Ма-гакян Ю.А. Синтез и содержание ДНК в ядрах клеток эпидермиса кожи мышей в процессе их дифференцировки и специализации // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 1988. -№11. -С. 604-606.

22. Кошевенко Ю.Н. Витилиго. Клиника, этиология, патогенез, лечение реабилитация, профилактика. М.: «Косметика и медицина», 2002. -644с.

23. Кубанова А.А., Кисина В.И., Блатун JI.A. и др. Рациональная фармакотерапия заболеваний кожи и инфекций, передаваемых половым путем. Руководство для практикующих врачей. / Под общей ред. А.А. Кубано-вой, В.И. Кисиной. М.:«Литтерра», 2005. - 882с.

24. Кузнецов C.JL, Горячкина В.Л., Цомартова Д.А. Структура и функции эпидермиса и дермы (лекция для врачей-дерматологов) // Альманах «Ретиноиды». М.: Изд. ЗАО «Ретиноиды», 2006. - вып. 23. - С. 5-34.

25. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. Д.: Медицина, 1969.-423с.

26. Михайлов И.Н. Структура и функции эпидермиса. М.: Медицина, 1979.-240с.

27. Мяделец О.Д., Адаскевич В.П. Морфофункциональная дерматология. М.: Медлит, 2006. - 752с.

28. Мяделец О.Д., Антилевский А.А., Фомченко Ю.Ф. и др. Изменения клеток Лангерганса эпидермиса при некоторых дерматозах // Матер, научн. конф. Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей. -С-Пб.: Изд-во ВМА, 2001. С. 59-60.

29. Новиков А.И., Кононов А.В., Охлопков В.А., Правдина О.В., Братухина Г.Д., Городилов Р.В. Иммунохимические исследования при псориазе. // Вестник дерматологии и венерологии. 2003. - №3. - С. 26-31.

30. Ноздрин В.И. Морфофункциональные проявления реактивных изменений эпителиально-, миелоидно- и лимфоидноклеточных популяций при введении в организм производных ретиноевой кислоты: Автореф. дисс. д-ра мед.н. Москва, 1989. - 48 с.

31. Ноздрин В.И., Альбанова В.И., Сазыкина JI.H. Морфогенетиче-ский подход к лечению угрей ретиноидами. М., изд. ФНПП «Ретиноиды», 2005.- 151с.

32. Ноздрин В.И., Барашкова С.А., Семченко В.В. Кожа и её производные. Омск-Орел: ОГМА, ЗАО «Ретиноиды», Омская областная типография, 2005 - 192с.

33. Ноздрин В.И, Белоусова Т.А., Альбанова В.И., Лаврик О.И. Гистофармакологические исследования кожи. М.: ЗАО «Ретиноиды», 2006г. - 376с.

34. Ноздрин В.И, Земсков В.М., Волков Ю.Т. Иммуноморфологи-ческие аспекты действия витамина А. М.: Ретиноиды, 2004. — 104с.

35. Ноздрин В.И., Мурников В.Т., Яцковский А.Н. К методике количественной микрофотометрии // Сист. Свойства тканевых организаций -Сб. М., Изд I ММИ, 1977. С. 173-176.

36. Ноздрин В.И., Яцковский А.Н., Гузев К.С. и др. Экспериментальное исследование специфической фармакологической активности мази Видестим // Альманах «Ретиноиды». М.: Изд. ФН1Ш «Ретиноиды», 2000. -Вып. 8.-С.11-16.

37. Персина И.С. Клетки Лангерганса структура, функция, роль в патологии. // Архив Патологии. - 1985. - т. 47. - С. 86-93.

38. Плецитый К.Д. Экспериментальный и клинический анализ им-мунорегуляторных свойств жирорастворимых витаминов в норме и патологии. Автореф. дис. докт. мед. наук. М., 1998. - 40с.

39. Прохоренков В.И., Рукша Т.Г., Петрова JI.JL, Салмина А.Б. Запрограммированная клеточная гибель кератиноцитов и её роль в патогенезе некоторых заболеваний кожи // Вестник дерматологии и венерологии. — 2005.-№4.-С. 4-7.

40. Сазыкина JI.H. Применение Ретасола® в терапии обыкновенных угрей с морфологическим и клинико-экспериментальным обоснованием: Дис. канд. мед. наук. М., 2004. - 154 с.

41. Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев). Утверждены Главным государственным санитарным врачом СССР 06.04.1973 г. № 1045-73

42. Скрипкин Ю.К., Лезвинская Е.М. Кожа орган иммунной системы. // Вестник дерматол. - 1989. - №10. - С. 14-18.

43. Суханов А.Ф., Мяделец О.Д. Роль внутриэпидермальных макрофагов (клеток Лангерганса) в структурно-функциональной организации эпидермиса. // Архив анат. гист. эмбр. 1988. - №4. - С. 81-86.

44. Терских В.В., Васильев А.В., Воротеляк Е.А. Стволовые клетки: эволюция концепции. // Вестник дерматологии и венерологии. 2005. - №2. -С. 4-8.

45. Терских В.В., Васильев А.В., Воротеляк Е.А. Стволовые клетки и структура эпидермиса. // Вестник дерматологии и венерологии. — 2005 .— №3. С. 11-15.

46. Упоров А.В., Семиглазов В.Ф., Пожарисский К.М. Иммуногистохимическое изучение клеток рака молочной железы с использованием разных маркеров пролиферации. // Арх. патол. 2000. - Т. 62, №2. - С.26-30

47. Цветкова Г.М., Гетлинг З.М. Возрастные особенности ультраструктуры эпидермиса // В кн. Морфология кожи человека. J.E. Purkyne University, Brno Medical Faculty (J.Karasek, G.M.Cvetkova, eds), 1980. -C. 53-68.

48. Цветкова Г.М., Мордовцева B.B., Вавилов A.M., Мордовцев B.H. Патоморфология болезней кожи. Руководство для врачей. -М.: Медицина, 2003г. 496с.

49. Шубникова Е.А. Эпителиальные ткани. М.: Изд-во МГУ, 1996.-256с.

50. Эвтаназия экспериментальных животных (методические рекомендации по выведению животных из эксперимента). М.: Наука, 1985. -32с.

51. Эрнандес Е. Витамин А и кожа. Часть 1. тайна ретинола // Косметика и медицина. -2000. -№4. С. 21-33.

52. Юрина Н.А., Радостина А.И. Кожа и её производные. Развитие, строение, функции. М.: Изд-во РУДН, 1996. - 57с.

53. Allen T.D., Potten C.S. Fine-structural identification and organization of the epidermal proliferative unit // J Cell Sci. 1974. - V.15, No 2. -P. 291-319.

54. Cumberbatch M, Dearman R.J., Griffiths C.E., Kimber I. Epidermal Langerhans cell migration and sensitisation to chemical allergens // APMIS. — 2003.-V. Ill, No 7-8. P.797-804.

55. Eckert R.L., Rorke E.A. Molecular biology of keratinocyte differentiation // Environmental Health Perspectives. 1989. - V. 80 - P. 109-116.

56. Eckert R.L., Yaffe M.B., Crish J.F. et al. Involucrin structure and role in envelope assembly // J. Invest. Dermat. - 1993. - V.100, No 5. -P. 613-617

57. Endl E, Gerdes J. The Ki-67 protein: fascinating forms and an unknown function // Exp Cell Res. 2000. - V. 257, No 2. - P. 231-237.

58. Fartasch M., Bassukas I.D., Diepgen T.L. Structural relationship between epidermal lipid lamellae, lamellar bodies and desmosomes in human epidermis An ultrastructural study // Brit. J. dermatol. - 1993. - V. 128, No 1. -P. 1-9.

59. Fisher G.J., Voorhees JJ. Molecular mechanisms of retinoid actions in skin. // FASEB J. 1996. - V. 10, No 9. - P. 1002-13.

60. Fuchs E., Green H. Regulation of terminal differentiation of cultured human keratinocytes by vitamin A // Cell. 1981. - V. 25, No 3. -P. 617-625.

61. Ghazizadeh S., Taichman L.B. Organization of stem cells and their progeny in human epidermis // J Invest Dermatol. 2005. - V. 124, No 2. -P. 367-72.

62. Galand P. Degraef C. Cyclin/PCNA immunostaining as an alternative to tritiated thymidine pulse labeling for marking S phase cells in paraffin sections from animal and human tissues // Cell Tissue Kinet. 1989. - V. 22, No 5.-P. 383-392.

63. Haftek M. Stratum corneum // Ann. Dermatol. Venerol. 2002. - V. 129.-P. 117-122.

64. Heen M., Thiriar S., Noel J.C. Galand P. Ki-67 immunostaining of normal human epidermis: comparison with 3H-thymidine labeling and PCNA immunostaining //Dermatology.- 1998.-V. 197, No 2.-P. 123-126.

65. Heyman R.A., Mangelsdorf D.J., Dyck J.A. et al. 9-Cis retinoic Acid is a high affinity ligand for the retinoid receptor // Cell. 1992. -V.68. - P. 284287.

66. Jones P.H., Harper S., Watt F.M. Stem cell patterning and fate in human epidermis // Cell. 1995. - V80, No 1. - P. 83-93.

67. Kanitakis J. Anatomy, histology and immunohistochemistry of normal human skin // Eur J Dermatol. 2002. - V. 12, No 4. - P. 390-399.

68. Kopan R., Traska G., Fuchs E. Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examination keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization // J. Cell Biol. 1987. - V. 105, No 1. -P. 427-440.

69. Korge В., Stadler R., Mischke D. Effect of retinoids on hyperprolif-eration-associated keratins K6 and K16 in cultured human keratinocytes: A quantitative analysis // J. Invest. Dermatol. 1990. - V. 95, No 4. - P. 450-455.

70. Lohnes D, Dierich A, Ghyselinnck N. et al. Retinoid receptors and binding proteins // J. Cell Sci. 1992. - Suppl. 6. - P. 69-76.

71. Lokshin A, Zhang H, Mayotte J, Lokshin M, Levitt ML. Early effects of retinoic acid on proliferation, differentiation and apoptosis in non-small cell lung cancer cell lines // Anticancer Res. 1999. - V.19, No 6B. - P. 52515254.

72. Lombardi Т., Hauser C., Budtz-Jorgensen E. Langerhans cells: structure, function and role in oral pathological conditions. // J Oral Pathol Med. 1993. - V. 22, No 5. - P. 193-202.

73. Maden M, Hind M. Retinoic acid, a regeneration-inducing molecule // Dev Dyn. 2003. - V. 226, No2. - P. 237-244.

74. Madison K.C., Howard EJ. Ceramides are transported through the Goldgi Apparatus in human keratinocytes in vitro // J. Invest. Dermatol. — 1996. -V.106, No5. P.1030-1035.

75. Marks R. The stratum corneum barrier: the final frontier // J. Nutr. -2004. V. 134, S. 8. - P. 2017-2021.

76. Marks R., Hill S., Barton S.P. The effect of an abrasive agent on normal skin and on photoaged skin in comparison with topical tretinoin // Br. J. Dermatol. 1990. - V. 123, No 4. - P. 457-466.

77. Merad M., Manz M.G., Karsunky H., et al. Langerhans cells renew in the skin throughout life under steady-state conditions. // Nat Immunol. — 2002. -V. 3,No 12.-P. 1135-1141.

78. The Merck Index. Twelth Edition. (An Encyclopedia of chemicals, drugs and biologicals ) // Merck and Co., 1996. P. 1046.

79. Moll I., Roessler M., Brandner J.M., Eispert A.C. et al. Human Merkel cells aspects of cell biology, distribution and functions // Eur. J. Cell Biol. - 2005. - V. 84, No 2-3. - P. 259-271.

80. Moll R., Werner W.F., Schiller D.L. The catalog of human cy-tokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells // Cell. 1982.-V. 31, No l.-P. 11-24.

81. Morris R.J., Fischer S.M., Slaga T.J. Evidence that the centrally and peripherally located cells in the murine epidermal proliferative unit are two distinct cell populations. // J Invest Dermatol. 1985. -V. 84, No 4. - P. 277-281.

82. Nakamura K., Saitoh A., Yasaka N., et al. Molecular mechanisms involved in the migration of epidermal dendritic cells in the skin // J Investig Dermatol Symp Proc. 1999. - V.4, No 2. - P. 169-172.

83. Nelson A.M., Gilliland K.L., Cong Z., Thiboutot D.M.13-cis Reti-noic acid induces apoptosis and cell cycle arrest in human SEB-1 sebocytes // J Invest Dermatol. -2006. V. 126, No 10.-P. 2178-2189.

84. Papini S., Cecchetti D., Campani D., et al. Isolation and clonal analysis of human epidermal keratinocyte stem cells in long-term culture // Stem Cells. -2003. -V.21, No 4. P. 481-494.

85. Pavlidou D, Vourekas A, Monastirli A, Kalavrizioti D, Tsambaos D, Drainas D. Isolation of ribonuclease P activity from human epidermis and its regulation by retinoids in vitro // Acta Derm Venereol. 2006. - V. 86, No 2. -P. 114-118.

86. Pavlovitch J.H., Rizk-Rabin M., Jaffray P., et al. Characteristics of homogeneously small keratinocytes from newborn rat skin: possible epidermal stem cells // Am J Physiol. 1991. - V. 261, No 6 Pt 1. - P. 964-972.

87. Parkinson E.K. Epidermal keratinocyte stem cells: their maintenance and regulation // Semin Cell Biol. 1992.- V. 3, No 6. - P. 435-444.

88. Potten C.S. The epidermal proliferative unit: the possible role of the central basal cell // Cell Tissue Kinet. 1974. - V.7, No 1. - P. 77-88.

89. Potten C.S., Booth C. Keratinocyte stem cells: a commentary // J Invest Dermatol. 2002. - V.l 19, No 4. - P. 888-899.

90. Potten C.S., Morris RJ. Epithelial stem cells in vivo // J Cell Sci Suppl. 1988. - V.10. -P. 45-62.

91. Raff M.C. Social controls on cell survival and cell death // Nature. -1992. V.356, No 6368. - P. 397-400.

92. Saurat J.H. // Retinoid Symp. Suppl. Retinoids today and tomorrow- Basel, Roche, 1992.- P. 2-5.

93. Scholzen T, Gerdes J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown//J. Cell Physiol. 2000. - Vol. 182, No3.-P. 311-322.

94. Schroeder M, Zouboulis C.C. All-trans-retinoic acid and 13-cis-retinoic acid: pharmacokinetics and biological activity in different cell culture models of human keratinocytes // Horm Metab Res. 2007. - V. 39, No 2. -P. 136-40.

95. Siegenthaler G, Saurat JH, Ponec M. Retinol and retinal metabolism. Relationship to the state of differentiation of cultured human keratinocytes // Bio-chem. J. 1990. - V. 268, No 2. - P. 371-378.

96. Smith F.J.D. The molecular genetics of keratin disorders // Am. J. Clin. Dermatol. 2003. - Vol. 4, No 5. - P. 347-364.

97. Stoitzner P., Pfaller K., Stossel H., Romani N. A close-up view of migrating Langerhans cells in the skin. // J Invest Dermatol. -2002. Vol. 118, No l.-P. 117-125.

98. Tadini KA, Gaspar LR, Maia Campos PM. Epidermal effects of tretinoin and isotretinoin: influence of isomerism. // Pharmazie. 2006. -Vol. 61, No 5.-P. 453-456.

99. Tani H., Morris R., Kaur P. Enrichment for murine keratinocytes stem cells based on cell surface phenotype. // proc Nat Acad Sci USA. 2000. -V. 97.-P. 10960-10965.

100. Teunissen M.B. Dynamic nature and function of epidermal Langer-hans cells in vivo and in vitro: a review, with emphasis on human Langerhans cells // Histochem J. 1992. - V. 24, No 10. - P. 697-716.

101. Thaler M., K. Fukuyama, W.L. Epstein and K.A. Fisher. Comparative studies of keratins isolated from psoriasis and atopic dermatitis // J. Invest. Dermatol. 1980. -Vol. 75. - P. 158.

102. Tsamboas D., Orfanos C.E. Chemotherapy of psoriasis and other skin disorders with oral retinoids // The chemotherapy of psoriasis. Oxford: Pergamon press, 1984. - P. 287-306.

103. Wanner R, Henseleit-Walter U, Wittig B, Kolde G. Proliferation-dependent induction of apoptosis by the retinoid CD437 in p53-mutated keratino-cytes // J Mol Med. 2002. - V. 80, No l.-P. 61-67.