Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые экспериментальные подходы в изучении протеома человека и их использование для анализа продуктов генной экспрессии в кератиноцитах человека и для выявления новых генов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Громов, Павел Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 Двумерный электрофорез белков в ПААГ- основной метод анализа протеома.

1.1 Почему именно двумерный эелектрофорез в ПААГ?

1.2. Сколько белков может содержаться в анализируемом образце? Протеомный комплемент эукариотической клетки.

1.3. Современные технологии двумерного электрофореза в

ПААГ: могут ли они быть усовершенствованы?

1.4. Резервы улучшения способов приготовления образца для двумерного анализа и методов детекции белков на двумерных гелях.

ГЛАВА 2 Картирование и идентификация белков на двумерных гелях и блотах.

2.1 Элементы протеомных технологий.

2.2. Метод сопряженной in vitro транскрипции-трансляции.

2.3. Идентификация на двумерных гелях продуктов транзитной экспрессии кДНК клонов в COS-1 клетках.

2.4. Идентификация на двумерных гелях (блотах) белков, составляющих отдельные функциональные семейства путем специфического связывания меченных лигандов.

2.4.1 Двумерное картирование Са++ - связывающих белков.

2.4.2 Низкомолекулярные ОТР-связываюшие белки.

2.5. ЕСЬ иммунодетекция и проблема белков, представленных малым количеством копий.

ГЛАВА 3 Двумерный анализ посттранссляционного процессинга и химических модификаций первичных продуктов трансляции.

3.1 Значение ко- и посттрансляционных модификаций белков в протеомных проектах.

3.2. Фосфорилирование.

3.3 Гликозилирование.

3.4 Липидирование: пальмитилирование и миристолирование.

3.5 Изопренилирование: фарнезилирование и геранилгеранилирование.

ГЛАВА 4. Двумерные карты и базы данных белковых продуктов генной экспрессии в нормальных кератиноцитах человека.

4.1 Кератиноциты человека - как модель изучения клеточной пролиферации и дифференцировки.

4.2 Создание двумерной карты и базы данных белков кератиноцитов человека.

4.2.1 Получение некультивированных нефракционированных эпидермальных кератиноцитов.

4.2.2 Культивирование нормальных кератиноцитов.

4.2.3 Изотопное включение 35Б -метионина в культивированные и некультивированные кератиноциты.

4.2.4 Двумерный электрофорез (изоэлектрофокусирование, ИЭФ, и фокусирование в неравновесном рН градиенте, МЕРНОЕ.

4.2.5 Окраска гелей Кумасси ярко голубым и нитратом серебра.

4.2.6 Радиоавтография и флюорография.

4.2.7 Микросеквенирование.

4.2.8 Масс спектрометрия.

4.2.9 Экспрессия кДНК клонов в системе вируса Vaccinia.

4.2.10 Компъютерный анализ двумерных изображенеий.

4.3 Синтетические двумерные карты-изображения белков кератиноцитов человека.

4.4 Двумерные базы данных белков клеток, тканей и жидкостей человека расположенные е в глобальной сети Интеренет: http://biobase.dlc/cgi-bin/celis.

ГЛАВА 5. Низкомолекулярные GTP-связывающие белки, эспрессирующиеся в нормальных пролиферирующих, дифференцированных и трансформированных кератиноцитах человека.

5.1 Двумерный профиль низкомолекулярных GTPсвязывающих белков кератиноцитов человека.

5.2 Динамика изменений экспрессии низкомолекулярных GTP-связывающих белков в нормальных пролиферирующих, дифференцированных и 8У40-трансформированных (К14) кератиноцитах человека.

Новая стратегия для молекулярного-биологического клонирования низкомолекулярных GTP-связывающих белков

ГЛАВА 6. Новые гены человека.

6.1 Rheb - новый низкомолекулярный GTP-связывающий белок, представляющий новую подгруппу гал-суперсемейства.

6.1.1 Клонирование, секвенирование и анализ первичной структуры rheb.

6.1.2 Дифференциальная экспрессия rheb гена в нормальных и трансформированных клетках человека.

6.1.3 Саузерн-анализ и хромосомное картирование rheb гена.

6.1.4 GTP-азная активность rheb.

6.1.5 Анализ посттрансляционных модификаций rheb.

6.2 Rabila - низкомолекуярный GTP-связывающий белок из семейства rab белков, регулирующих внутриклеточный транспорт.

6.2.1 Rabila транслируется с двух разных типов мРНК, образующихся в результате альтернативного сплайсинга.

6.2.2 Нозерн-блот анализ rabila.

6.2.3 Два вида мРНК, кодирующие rabila, транскрибируются с одного гена, локализующегося на 15q21.3- q22.31.

6.2.4 Анализ in vivo посттрансляционных модификаций rabila.

6.2.5 Влияние гиперэкспрессии rabila на уровни синтеза некоторых низкомолекулярных GTP-связываюших белков.

6.3 Галектин 7 - новый член семейства (3-галактозосвязывающих белков, галектинов.

6.3.1 Идентификация на двумерной белковой карте и клонирование галектина 7.

6.3.2 Галектин 7 - представитель семейства лактозосвязывакмцих белков.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые экспериментальные подходы в изучении протеома человека и их использование для анализа продуктов генной экспрессии в кератиноцитах человека и для выявления новых генов"

С момента начала международного проекта "Геном человека" прошло более 8 лет, и за это время были сделаны замечательные достижения в непосредственном секвенсировании генома человека, в создании физических и генетических карт, а также в идентификации новых генов. Вместе с тем в последннее десятилетие все большее значение стало приобретать направление, сориентированнное в постгеномную эру, которое можно определить как комлексный анализ функционального состояния генома на уровне белковых продуктов генной экспрессии. Под термином "протеом"*, который вначале обозначал просто "белковый комплемент генома"(PROTEOME: entire PROTein complement expressed by the gen ОМЕ), в настоящее время понимают весь набор белков, экспрессирующихся в данной клетке при определенных условиях в данный момент.

Протеом, в отличие от генома, значительно более комлексная и динамичная система, которая коренным образом меняется, как в процессе развития организма так и при различных физиологических и патологических состояниях. Протеом в каждом типе клеток по своему уникален. Только небольшая часть потенциально активного генома транскрибируется в определенном типе клеток, а количество РНК копий далеко не всегда коррелирует с числом соответсвующих функциональных белковых молекул (Anderson, Seilhamer, 1997). К другим факторам, определяющим изменчивость протеома, следует добавить мРНК-коррекцию, альтернативный сплайсинг, ко-трансляционные и посттрансляционные модификации и процессинг. Следует отметить, что догма "ДНК РНК => белок => фенотип (или болезнь)" может быть применена с известной долей надежности лишь в случае моногенных заболеваний, составляющих не более 2% от общего числа болезней человека. Однако и в этих случаях конечный фенотип в значительной степени модулируется многими факторами. По-видимому, именно эпигенетической регуляцией можно в частности объяснить известный факт, что в целом ряде ген-нокаутных моделей, клетки или организмы проявляют нормальный фенотип несмотря на делецию гена . Термин "протеом" был впервые введен Wilkins и Williams (1996) и к настоящему времени стал общепризнанным

Поскольку белки в большинстве случае белки являются функциональными молекулами, качественный анализ протеома (экспрессия новых белков, посттрансляционные модификации) и его количественный анализ (различия в уровне синтеза, координированная экспрессия) могут дать ценную информацию о динамике экспрессии генома при различных условиях в норме и при патологических состояниях.

В связи с вышесказанным крайне важным представляется развитие технологий обеспечивающих разделение, анализ и идентификацию тысяч полипептидов, которые составляют протеом. Несмотря на то, что полностью "прочитанный" геном человека, как конечная цель геномного проекта, еще весьма далек до своего завершения, секвенирование его фрагментов является базовой стадией большинства молекулрно-биологических исследований. В той же мере и протеомные исследования, целью которых в конечном итоге является полностью идентифицированный протеом человека, начинают играть важную роль в различных биологических исследованиях.

Следует подчеркнуть, что, вследствие функциональной динамичности генома, полный протеом эукариотов будет состоять из многих сравнительных двумерных карт, даже в случае одноклеточных организмов. Для более сложных организмов, и человека в частности, задача идентификации полного протеома является неизмеримо более сложной, прежде всего из-за большого разнообразия клеток, тканей и биологических жидкостей. Проблема в значительной степени усложняется тем обстоятельством, что протеом отдельной клетки подвергается значительным изменениям в процессе дифференцировки и развития организма, а также под воздействием различных физиологических факторов и стимулов (клеточная сигнализация). Только небольшая часть общего протеома человека идентифицирована к настоящему времени и очень мало известно о белковом составе отдельных клеток.

Несмотря на вышеуказанные проблемы, исследования направленные на изучение протеома человека ведутся все интенсивнее Это классический пример продуктивности научного противоречия: с одной стороны комплексность и динамичность протеома в значительной степени затрудняет его изучение, с другой , именно в этих различиях , часто незначительных, вероятнее всего находятся ключи к пониманию биологических механизмов, которые в конечном счете определяют тот или иной фенотип клетки или организма.

В настоящее время единственным подходом, позволяющим осуществлять комплексный мониторинг динамики изменений функциональной активности генома клетки на белковом уровне является двумерный электрофорез в полиакриламидном геле, позволяющим одновременно разделять и детектировать тысячи белков в одном образце (Шишкин, 1985,1994; Wilkins и Williams, 1996; Celis и Gromov, 1998). Эта основная технология, в комбинации с сопутсвующими методами, направленными на идентификацию (микросеквенирование пептидов, масс-спектрометрия, иммуноблоттинг), количественную оценку (сканирование, фосфоимидж) полипептидов присутствующих в отдельных пятнах, составляют основу современных протеомных технологий (Celis et. al., 1996, 1998). В нескольких лабораториях мира созданы, постоянно обновляются и совершенствуются базы данных белков, построенные на основе двумерных сравнительных карт. Эти базы данных стали доступны научному сообществу через сеть Интернет и, по мере своего развития и накопления информационной массы, приобретают все большее значение в протеомных исследованиях (.http://biobase.dk/cgi-bin/celis; SWISS-2DPAGE; 2-DEmaps at LSB Corp и другие). Все современные двумерные базы данных белковых продуктов генной экспрессии состоят из двух основных компонентов:

1) Изображение. Этот компонент содержит одну или несколько сравнительных двумерных карт-изображений белков отдельного биологического образца (ткань, физиологичекая жидкость или культивированные клетки). Существует два типа карт: двумерные карты, построенные на основе одного двумерного геля (таких большинство) и карты, построенные из мозаики двумерных гелей, каждая из которых покрывает определенную область значений рН и молекулярных масс.

2) Текстовая информация о каждом белковом пятне, идентифицированном на двумерной карте-изображении. В большинстве баз данных эта секция включает данные о молекулярном весе белка, изоэлектрической точке, название, метод идентификации, клеточная локализация и др. Многочисленные взаимоотношения с другими белковыми и геномными базами данных, обеспечивающие общее информационное поле для анализа структурно-функционального состояния генома иллюстрированы на рис 1.

Комплекс протеомных технологий, является лишь одним из многих подходов, которые доступны сегодня для глобального изучения функционального сотояния генома клетки (рис. 2). Основные из них включают в себя геномные технологии (секвенирование генома, картирование генов), протеомные технологии (двумерный электрофорез, микросеквенирование и масс-спектрометрия белков), к ДНК микрочипы и дифференциальный к ДНК дисплей (сравнительный анализ уровней транскрипции различных генов), фаг-антитело библиотеки, трансгенные и

Рис. 1 Белковые и геномные бызы данных, организующие информационное поле для структурно-функционального анализа генома

Протеомные Методы

Фаг-Антитело Модели

Рис.2 Комплекс протеомных технологий нокаутные модели (функции отдельных белков) (СеНэ е1 а1., 1998). Вместе с тем, следует признать, что в совокупности указанных методов протеомный анализ занимает одно из центральных мест, поскольку именно на белковом уровне обнаруживаются те изменения в регуляции генов, которые в конечном итоге ответственны за те или иные события, происходящие в клетке или организме.

В последнее время протеомные исследования приобретают все большую практическую направленность. Изучение протеома клеток, равно как и отдельных тканей при различных патологических состояниях, включая онкологичесие заболевания, открывают замечательные возможности поиска белковых маркеров, имеющих как диагностичесое так и прогностическое значение. Методология двумерного электрофореза вместе с рядом сопряженных протеомных технологий начинает инитенсивно применяться при анализе человеческих тканей, клеток и жидкостей в фармакологическом и токсикологическом мониторинге с потенциальной ориентацией на клинику. В ближайшем будущем протеомные технологии и белковые базы данных по мере своего совершенствования и накопления информационной массы возможно станут приоритетными при поиске белков - мишеней на пути к разработке новых лекарственных средств. Исходя из сказанного, весьма актуальным является дальнейшее развитие протеомных технологий и создание баз данных белков человека, идентифицированных в различных (ГЕБ) и (ВЕРНОЕ) двумерных картах. Приоритетное значение в эти исследованиях имеет поиск и идентификация белковых маркеров дифференцировки клеток, а также белков, принимающих участие в патогенезе злокачественных перерождений.

В течение последнего десяилетия протеомные иследования на основе двумерного электрофореза проводились на многих клетках, тканях, органах I ^ковйах человека. Среди них можно упомянуть следующие: плазма крови (Голубева и соавторы, 1991; В1ш Ь, е1 а1.Д996) цитозольные и мембранные белки эритроцитов (Громов и соавторы, 1986; Захаров и соавторы 1988; Шишкин и соавторы, 1989; вготоу, СеНв, 1992), лимфоциты (Лукашева и соавторы, 1994; НапазЬ БМ, е1 а1.,1998), тромбоциты (Замотринский, Шишкин, 1991), лизосомы (С11а1а\¥ау ТК, е1 а1.,19986), скелетная мышца (Ковалева и соавторы, 1994); мышца сердца (Ковалев и соавторы, 1988; Лаптев и соавторы, 1994; Шишкин и соавторы, 1994; СогЬей 1М, & а1., 1994; РЫвзпег КР, е1 а\. 1996), первичная культура миобластов (Крохина и соавторы, 1996), стенка аорты (Володина и соавторы, 1992), мозг (Ьагщеп Н, е1 а1. 1999), плацента (СЬа1а\¥ау ТК, а1., 1998а), почки (Байо С, й а1. 1997), амниотическая жидкость (ЫЬегаШп Б, & а1. 1998); слезная жидкость(Мо11оу MP, et al. 1998), моча (Rasmussen HH, et al.,1996), рак молочной железы (Rasmussen RK, et al. 1998; Williams K, et al., 1998); рак прямой кишки (Ji H, et al, 1997) и многие другие.

Кератиноциты эпидермиса человека представляют собой уникальную модель изучения механизмов клеточной пролиферации и дифференцировки ( Celis, 1999). Существующие сегодня технологии поддержания нормальных кератиноцитов в культуре позволяют пролиферировать или дифференцировать кератиноциты в зависимости от совокупности ростовых и регуляторных факторов, применямых в конкретном эксперименте (Rheinwald и Green, 1975; Nicholson и Watt, 1991, 1992; Staiano-Coico et al., 1990). Некоторые из разработанных культуральных систем позволяют успешно воспроизводить многие стадии диференцировки кератиноцитов. Однако, до последнего времени в литературе было немного данных касательно изменений в эспрессии отдельных белков, сопровождающих процесс роста и дифференцировки кератиноцитов в норме и патологии (Celis et al., 1991; Rasmussen и Celis, 1993). На протеомном уровне подобного рода исследования не проводились совсем, поэтому задача создания обширной двумерной протеомной базы данных кератиноцитов человека, представлялась весьма актуальной с точки зрения ее потенциального значения для изучения молекулярных механизмов, регулирующих рост и дифференцировку этого типа клеток.

Основной целью работы являлся анализ экспрессии генома человека в нормальных и трансформированных кератиноцитах эпидермиса и клетках переходно-клеточной карциномы эпителия стенки мочевого пузыря, а также создание соответствующих баз данных белков на основе сравнительных двумерных карт и других протеомных технологий.

В рамках этой общей цели решались следующие конкретные задачи: разработка новых методов разделения, детекции и идентификации белков методом двумерного электрофореза в полиакриламидном геле применительно к отдельным группам белков и малопредставленным белкам;

- анализ посттрансляционного процессинга белков. Разработка методов идентификации на двумерных гелях модифицированных вариантов: фосфопротеины, гликопротеины, липидированные и пренилированные белки

- создание сравнительных двумерных карт и соответствующих баз данных белков, составляющих протеом нормальных и трансформированных кератиноцитов человека;

ГЛПВЯ 1 ДВУМЕРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ В ПВЯГ-ОСНОВНОЙ МЕТОД ЯНЯЛИЗА Í1POTEOMR

1.2 Почему именно двумерный электрофорез в ПААГ?

Высокоразрешающий двумерный электрофорез белков в ПААГ разделяет белки по двум основным характеристикам белковой молекулы: молекулярной массе (Mr) и изоэлектрической точке (pl) и, соответственно, его разрешающая способность на несколько порядков выше по сравнению с одномерным разделением по любому из указанных параметров (Шишкин, 1985, 1990; Шишкин и Калинин, 1992; Celis, Bravo, 1984; Wilkins et al. /eds/, 1997; Celis et al. /eds/, 1998). Различные современные модификации двумерного электрофореза позволяют (а) разделять белковые смеси на составляющие полипептидные компоненты (до нескольких тысяч), (б) сравнивать белковые профили генной экспрессии в паре образцов (например, нормальные и трансформированные клетки, клетки на разных стадиях роста и/или дифференцировки и т.д.), и (в) проследить реакцию клеток или организма на определенный физиологический или патологический фактор (например, добавить цитокин или лекарственное средство к клеточной культуре или ткани и проследить интегральный белковый ответ при выбранных условиях). При этом все обнаруженные изменения в белках могут быть проанализированы как на качественном , так и на количественном уровне по отношению друг к другу. Указанная возможность проиллюстрирована на рис. 3, на котором приведено несколько двумерных гелей (ИЭФ) белков кератиноцитов человека, меченных 35S—метионином На представленных радиоавтографах стрелками показаны некоторые белки, экспрессия которых значительно различается в парах "нормальные кератиноциты - SV40 трансформированные кератиноциты" (Рис ЗА и ЗВ) и "нормальные кератиноциты - нормальные кератиноциты плюс гамма интерферон). В частности резко увеличенный уровень циклина (PCNA) в трансформированной линии ясно отражает различия в скорости клеточной пролиферации. Подробнее двумерный анализ кератиноцитов человека и создание соответствующей белковой базы данных описано ниже (см. главу 4).

Двумерные гели могут быть сканированы и проанализированы количественно с целью поиска различий в уровнях белков, индукции новых продуктов или идентификации ко-регулируемых полипептидов. Возможные белки-мишени могут быть идентифицированы с помощью сопряженных протеомных технологий, таких как микросеквенирование по методу Эдмана

IEF ■

АппфМ * *TroBD#sin BCNA e -- ■

Triosephosphate isoroerase

• 1» t 4-3-3 a

РвР 9:5 " "ЛР - PA-FABP Thioredoxinjji # I Ш

Anne^in I- J TrupoThysift BCNA

J* ■ * * л .

I ' Л ♦ +

Triosephosphate isomerase

PGP 9.5

-31

И 4-3-3 a у PA-FABP Г

NormallKeratinocvtes

Thioredoxin i

Norrnaj Keratinocytes + IFN-y ahy l-t R N . ^ anyl-tRNA" • -16

107 68

Hp*.

- * - * * • •-♦ - « • ««к Aqjifl ш

У

PA28a * ~ т *

4 MnSOD % * v .»J«.»

-.t

Aoiin

-43 * « • . л

A28a %

31 MnSOD

16

Pi I

7.4 I

5.9 I

4.2 I

7.4 I

5.9 I

4.2

Рис. 3 Двумерные радиоавтографы белков, экспрессирующихся в нормальных кератиноцитах (а,с) по сравнению со БУ40 трансформированными (в) и индуцированными интерфероном-у (с1). Белки, дифференциально экспрессирующиеся в представленных парах, показаны стрелками.

Aebersold et al., 1986; Matsudaira, 1987; Bauw, et. al., 1989), масс спектрометрия (Mann, Wilm, 1994; Yates et al., 1995; Schevchenko et al, 1997) и двумерная блот иммунодетекция (ECL) (Celis et al., 1997) ( см. далее главу 2 )

Систематическое проведение подобных исследований позволяет хранить полученную информацию в двумерных базах данных и фиксировать какие гены и как регулируются при различных нормальных и патологических состояниях ( http://biobase.dk/cgi-bin/celis; http:/expasy.hcuge.ch/ch2d/2d-index.htlm ). Многие результаты, приведенные в данной работе вошли в базы данных, созданные Датским Центром Изучения Генома Человека (директор, профессор Х.Е. Целис). По мере того, как эти базы данных накапливают критическую информационную массу, они все более становятся важнейшим источником уникальной информации при исследованиях сигнальных путей и их компонентов, которые могут быть ключевыми в развитии болезни (Celis et al., 1996).

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Громов, Павел Сергеевич

ВЫВОДЫ

1. Созданы новые подходы для картирования и идентификции белков на двумерных гелях и блотах. Показано, что сопряженная in vitro транскрипция/трансляция и транзитная экспрессия кДНК клонов в COS-1 клетках с последующим анализом продуктов реакции двумерным электрофорезом, позволяют эффективно картировать первичные продукты трансляции и посттрансляционные варианты белков на двумерных картах. Разработаны новые методы двумерного анализа ко-и посттрансляционного процессинга белков, основанные на метаболическом включении специфических радиоактивных лигандов, соответствующих типу модификации белковой молекулы. Получены первые двумерные профили фосфорилированных, гликозилированных, липидированных и изопренилированных белков, экспрессирующихся в клетках AMA.

2. Впервые показано, что ECL-иммунодетекция позволяет идентифицировать на двумерных блотах нефракционированных белковых лизатов клеток количество белка в одном пятне вплоть до 500 молекул на клетку. Тем самым подтверждена принципиальная возможность двумерной идентификации полного протеома, экспрессирующегося в эукариотической клетке.

3. Построена синтетическая двумерная карта-изображение и база данных белков, составляющих протеом нормальных кератиноцитов человека, на которой детектировано и каталогизировано 3625 полипептидов, из них 2313 белков в области рН градиента 4-7,5 и 954 белка в области рН 7-11,5. 1285 белков идентифицировано на двумерной карте кератиноцитов человека и информация о них помещена в соответствующую базу данных, которая постоянно обновляется в глобальной сети Интернет (http://biobase.dk/cgi-bin/celis).

4 Впервые получены двумерные профили, характеризующие "субпротеомы" низкомолекулярных GTP-связывающих белков, экспрессирующихся в кератиноцитах человека. На двумерной карте белков нормальных пролиферирующих кератиноцитов человека было картировано 41 (30 - ИЭФ и 11 - неравновесный рН градиент) GTP-связывающих белков. Сравнительный анализ уровней низкомолекулярных GTP-связывающих белков, экспрессирующихся в нормальных пролиферирующих, дифференцированных и SV-40 трансформированных кератиноцитах выявил 13 белков этого класса, синтез которых был полностью блокирован в трансформированной линии, что предполагает их возможное участие в поддержании нормального фенотипа клеток.

5. Разработан принципиально новый подход для молекулярного клонирования кДНК, кодирующих низкомолекулярные GTP-связывающие белки, основанный на скринировании экспрессирующихся к ДНК библиотек с помощью [a32P[GTP.

Предложенный новый метод идентификации ОТРаз-кодирующих кДНК клонов в комбинации соскринированием библиотек нуклеотидными зондами, позволил предложить новую стратегию клонирования, позволяющую в принципе идентифицировать весь пул кДНК, кодирующих белки, которые связывают GTP на нитроцеллюлозном блоте.

6. На основе разработанной новой технологии идентификации низкомолекулярных GTPa3 был клонирован новый белок, rheb, вероятно представляющий неизвестную погруппу гая-суперсемейства. Rheb имеет 23-40% гомологию с остальными ras- rho- rae- гап- подгруппами и имеет в своей первичной структуре все консервативные участки, ответственные за различные этапы ОТРазного цикла. Rheb несет Arg-Ser аминокислотные остатки на позициях 12-13, на которых все другие члены гая-суперсемейства имеют консервативную последовательность Gly-Gly. Показано, что rheb посттрансляционно модифицируется ш vivo изопреноидом фарнезилом. Хромосомное картирование локализовало RHEB ген человека на хромосоме lOqll.l- qll.2

7. В результате скринирования экспрессирующейся библиотеки из кератиноцитов человека лигандом [a32P[GTP был клонирован новый тип мРНК, кодирующей белок rabila, который принадлежит семейству гай-белков, принимающих ключевое участие в регуляции внутриклеточного транспорта. Показано, что белок rabila транслируется с двух разных мРНК, образующихся в результате альтернативного полиаденилирования. Впервые установлено, что rabila посттрансляционно изопренилируется ш vivo геранилгеранилом.

194

Хромосомное картирование локализовало RABI 1а ген человека на хромосоме 15q21.3- q22.31

8. В результате сравнительного анализа протеома нормальных и трансформированных кератиноцитов был выделен и микросекенирован новый белок галектин 7, экспрессируюгцийся в нормальных кератиноцитах, но полностью отсутствующий в трансформированной линии. Показано, что галектин 7, принадлежащий семейству галактозосвязывающих белков, является экскретируемым белком, хотя его аминокислотная последовательность не содержит специфических сигналов секреции. Хромосомное картирование локализовало галектин 7 человека на хромосоме 19.

9. Разработан метод скринирования двумерных профилей белков, экспрессирующихся на разных стадиях развития переходно-клеточного рака эпителия стенки мочевого пузыря (ТСС). Впервые построена двумерная карта протеома, экспрессирующегося в ТСС, на которой детектировано и каталогизировано 3159 белков, разрешенных в обоих направлениях.

10. Выявлен новый белковый маркер, A-FABP, принадлежащий семейству белков, связывающих жирные кислоты и регулирующих клеточный рост и дифференцировку клеток, уровень представленности которого в протеоме опухоли, строго коррелирует со стадией ее дедифференцировки и степенью инвазивности. Установлено, что, по мере злокачественного развития ТСС, уровень экспрессии A-FABP резко снижается. A-FABP полностью отсутствует в дедифференцированных инвазивных формах ТСС.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Громов, Павел Сергеевич, Москва

1. Володина, Т.В., Никитина, З.К., Шишкин, С.С., Кауров, Б.А., Ребров, Л.Б., Козельцев, В.Л. Сравнительное изучение особенностей белкового состава средней оболочки аорты. Биохимия, 57, №6, 919-926,1992

2. Громов, П.С., Шандала, A.M., Ковалев, Л.И. и Шишкин, С.С. Изучение белков мембран эритроцитов человека методом двумерного электрофореза. Бюлл. эксп. биол. мед., 102, №7,28-30,1986

3. Голубева, М.В., Лунга, И.Н., Шишкин, С.С. Использование двумерного электрофореза по С'Фарреллу для изучения полиморфизма белков сыворотки крови. Вопросы мед. химии, 37, №3, 64-67,1991

4. Замотринский, A.B. и Шишкин, С.С. Систематический подход к изучению белков тромбоцитов человека. Построение двумерной карты. Биохимия, 56, №5,863-873,1991.

5. Захаров, С.Ф., Громов, П.С. и Шишкин С.С. Двумерный электрофорез эритроцитарных мембранных белков человека в присутствии тритона Х-305. Вопросы мед. химии, 34, №3,139-142,1988.

6. Ковалев, Л.Й., Пуляева, Е.В., Кириллова, А.И. Шишкин, С.С. и Фещенко С.П. Белки сердечной мышцы человека: двумерный электрофоретический анализ у эмбрионов. Молекул, генет. микробиол. и вирусол. №8, 28-32,1988

7. Ковалева, М.А., Ковалев, Л.И., Худайдатов, А.И., Ефимочкин, A.C. и Шишкин, С.С. Сравнительный анализ белкового состава скелетной и сердечной мышцы человека методом двумерного электрофореза. Биохимия, 59, №5, 675-681,1994.

8. Лукашева, И.В., Ковалев, Л.И., Ефимочкин, A.C. и Шишкин, С.С. Изучениебелков лимфоцитов человека с помощью двумерного электрофореза. Биохимия, 59, № 5,663-674,1994.

9. Цветкова, М.Н., Ковалев, Л.И. и Шишкин, С.С. Изучение аутолитических изменений белков миокарда человека методом двумерного электрофореза. Вопросы мед. химии, 39, №4, 31-34,1993

10. Шишкин, С.С. Молекулярно-анатомическое направление в биохимической генетике. Вестник АМН СССР, №1, 78-84,1985

11. Шишкин, С.С., Захаров, С.Ф. и Громов, П.С. Проблема построения каталога мембранных белков эритроцитов человека. Вопросы мед. химии, 35, №6, 3-13, 1989

12. Шишкин, С.С. От гена к признаку. В кн. " Двадцатый век, биология!" Избранные главы современной биологии, стр. 39-50, Изд-во ВИНИТИ, М., 1994

13. Шишкин, С.С., Егоров, Ц.А., Ковалев, Л.И., Лаптев, A.B., Цветкова М.Н., Пуляева, Е.В. и Барбашев С.В Идентификация тропомиозина сердечной мышцы человека двумерным электрофорезом и секвенированием. Биохимия, 56, №1,136-140

14. Adamson, P., Marshall, C. J., Hall, A., and Tilbrook, P. A. Post-translational modifications of p21rho proteins. J Biol Chem 267(28), 20033-8. 92.

15. Adari, H., Lowy, D. R., Willumsen, B. M., Der, C. J., and McCormick, F. Guanosine triphosphatase activating protein (GAP) interacts with the p21 ras effector binding domain. Science 240(4851), 518-21. 88.

16. Anderson, L. and Seilhamer, J. A comparison of selected mRNA and protein abundances inhuman liver. Electrophoresis 18(3-4), 533-7. 97.

17. Aoki, Y., Kunimoto, M., Shibata, Y., and Suzuki, K. T. Detection of metallothionein on nitrocellulose membrane using Western blotting technique and its application to identification of cadmium- binding proteins. Anal Biochem 157(1), 117-22. 86.

18. Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., and Brown, M. S. CAAXgeranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB. J Biol Chem 270(14), 7864-8. 95.

19. Asselineau, D., Bernard, B. A., Bailly, C., Darmon, M., and Prunieras, M. Human epidermis reconstructed by culture: is it "normal"? J Invest Dermatol 86(2), 181-6. 86.

20. Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., and Darmon, M. Epidermal morphogenesis and induction of the 67 kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface. Exp Cell Res 159(2), 536-9. 85.

21. Ayala, J. Transport and internal organization of membranes: vesicles, membrane networks and GTP-binding proteins. J Cell Sci 107 ( Pt 4), 753-63. 94.

22. Barbacid, M. ras genes. Annu Rev Biochem 1987;56:779-827 .

23. Barondes, S. H., Castronovo, V., Cooper, D. N., Cummings, R. D., Drickamer, K., Feizi, T., Gitt, M. A., Hirabayashi, J., Hughes, C., Kasai, K. and others. Galectins: a family of animal beta-galactoside-binding lectins letter. 94.1. Notes: Cell76

24. Barondes, S. H., Cooper, D. N., Gitt, M. A., and Leffler, H. Galectins. Structure and function of a large family of animal lectins. J Biol Chem 269(33), 20807-10. 94.

25. Barrandon, Y. and Green, H. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc Natl Acad Sci U S A 84(8), 2302-6. 87.

26. Berry, R., Stevens, T. J., Walter, N. A., Wilcox, A. S., Rubano, T., Hopkins, J. A., Weber, J., Goold, R., Soares, M. B., and Sikela, J. M. Gene-based sequence-tagged-sites (STSs) as the basis for a human gene map. Nat Genet 10(4), 415-23. 95.

27. Bhullar, R. P. and Haslam, R. J. Detection of 23-27 kDa GTP-binding proteins inplatelets and other cells. Biochem J 245(2), 617-20. 87.

28. Bichko, V. V. (1998) in DNA transfer to cultured cells (Ravid, K. and Freshney, I., eds.), pp. 193-2121. Wiley-Liss

29. Bjellqvist, B., Ek, K., Righetti, P. G., Gianazza, E., Gorg, A., Westermeier, R., and Postel, W. Isoelectric focusing in immobilized pH gradients: principle, methodology and some applications. J Biochem Biophys Methods 6(4), 317-39. 82.

30. Bokoch, G. M. and Der, C. J. Emerging concepts in the Ras superfamily of GTP-binding proteins. FASEB J 7(9), 750-9. 93.

31. Bos, J. L. All in the family? New insights and questions regarding interconnectivity of Ras, Rapl and Ral. EMBO J 17(23), 6776-82. 98.

32. Bos, J. L. Ras-like GTPases. Biochim Biophys Acta 1333(2), Ml9-31. 97.

33. Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review published erratum appears in Cancer Res 1990 Feb 15;50(4):1352., Cancer Res 49(17), 4682-9. 89.

34. Bourne, H. R., Sanders, D. A., and McCormick, F. The GTPase superfamily: a conserved switch for diverse cell functions. Nature 348(6297), 125-32. 90.

35. Capon, D. J., Chen, E. Y., Levinson, A. D., Seeburg, P. H., and Goeddel, D. V. Complete nucleotide sequences of the T24 human bladder carcinoma oncogene and its normal homologue. Nature 302(5903), 33-7. 83.

36. Carr, S. A., Hemling, M. E., Bean, M. F., and Roberts, G. D. Integration of mass spectrometry in analytical biotechnology. Anal Chem 63(24), 2802-24. 91.

37. Casey, P. J. Protein lipidation in cell signaling. Science 268(5208), 221-5. 95.

38. Casey, P. J., Solski, P. A., Der, C. J., and Buss, J. E. p21ras is modified by a farnesyl isoprenoid. Proc Natl Acad Sci U S A 86(21), 8323-7. 89.

39. Celis, J. E. and Bravo, R. (1984) Two-dimehsional gel electrophoresis of proteins: methods and applications, Academic Pess, New York

40. Celis, J. E., Carter, N., Hunter, T., Shotton, D., Simons, K., and Small, J. V. (1997) Cell Biology. A Laboratory Handbook, Academic Press, New York

41. Celis, J. E. and Gromov, P. 2D protein electrophoresis: can it be perfected? Curr Opin Biotechnol 10(1), 16-21. 99.

42. Celis, J. E., Ostergaard, M., Jensen, N. A., Gromova, I., Rasmussen, H. H., and Gromov, P. Human and mouse proteomic databases: novel resources in the protein universe. FEBS Lett 430(1-2), 64-72. 98.

43. Chamberlain, J. P. Fluorographic detection of radioactivity in poly aery lamide gels with the water-soluble fluor, sodium salicylate. Anal Biochem 98(1), 132-5. 79.

44. Chavrier, P., Vingron, M., Sander, C., Simons, K., and Zerial, M. Molecular cloning of YPTl/SEC4-related cDNAs from an epithelial cell line. Mol Cell Biol 10(12), 6578-85. 90.

45. Chen, C. Y. and Shyu, A. B. AU-rich elements: characterization and importance in mRNA degradation. Trends Biochem Sci 20(11), 465-70. 95.

46. Chomczynski, P. and Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162(1), 1569. 87.

47. Corbett, J. M., Wheeler, C. H., Baker, C. S., Yacoub, M. H., and Dunn, M. J. The human myocardial two-dimensional gel protein database: update 1994. Electrophoresis 15(11), 1459-65. 94.

48. Corbett, J. M., Wheeler, C. H., Baker, C. S., Yacoub, M. H., and Dunn, M. J. The human myocardial two-dimensional gel protein database: update 1994. Electrophoresis 15(11), 1459-65. 94.

49. Cossio, G., Sanchez, J. C., Golaz, O., Wettstein, R., and Hochstrasser, D. F. Spermatocytes and round spermatids of rat testis: protein patterns. Electrophoresis 16(7), 1225-30. 95.

50. Cox, A. D. and Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue? Curr Opin Cell Biol 4(6), 1008-16. 92.

51. Culine, S., Olofsson, B., Gosselin, S., Honore, N., and Tavitian, A. Expression of the ras-related rap genes in human tumors. Int J Cancer 44(6), 990-4. 89.

52. Danesi, R., McLellan, C. A., and Myers, C. E. Specific labeling of isoprenylated proteins: application to study inhibitors of the post-translational farnesylation and geranylgeranylation. Biochem Biophys Res Commun 206(2), 637-43. 95.

53. Der, C. J. and Cox, A. D. Isoprenoid modification and plasma membrane association: critical factors for ras oncogenicity. Cancer Cells 3(9), 331-40. 91.

54. Desnoyers, L., Anant, J. S., and Seabra, M. C. Geranylgeranylation of Rab proteins. Biochem Soc Trans 24(3), 699-703. 96.

55. Devereux, J., Haeberli, P., and Smithies, O. A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX. Nucleic Acids Res 12(1 Pt 1), 387-95. 84.

56. Downward, J. Ras signalling and apoptosis. Curr Opin Genet Dev 8(1), 49-54. 98.

57. Drivas, G. T., Palmieri, S., D'Eustachio, P., and Rush, M. G. Evolutionary grouping of the RAS-protein family. Biochem Biophys Res Commun 176(3), 1130-5. 91.

58. Drivas, G. T., Shih, A., Coutavas, E. E., D'Eustachio, P., and Rush, M. G. Identification and characterization of a human homolog of the Schizosaccharomyces pombe ras-like gene YPT-3. Oncogene 6(1), 3-9. 91.

59. Duncan, R. and McConkey, E. H. How many proteins are there in a typical mammalian cell? Clin Chem 28(4 Pt 2), 749-55. 82.

60. El-Bolkany, M. N. (1983) in The Pathology of Bladder Cancer (Bryan, G. Y. and Cohen, S. M., eds.), CRC Press, Boca Raton

61. Epstein, W. W., Lever, D., Leining, L. M., Bruenger, E., and Rilling, H. C. Quantitation of prenylcysteines by a selective cleavage reaction. Proc Natl Acad Sci USA 88(21), 9668-70. 91.

62. Fischer von Mollard, G., Stahl, B., Li, C., Sudhof, T. C., and Jahn, R. Rab proteins in regulated exocytosis. Trends Biochem Sci 19(4), 164-8. 94.

63. Francke, U. Digitized and differentially shaded human chromosome ideograms for genomic applications. Cytogenet Cell Genet 65(3), 206-18. 94.

64. Freidell, G. H., Nagy, G. K„ and Cohen, S. M. (1983) in The Pathology of Bladder Cancer (Bryan, G. Y. and Cohen, S. M., eds.), CRC Press, Boca Raton

65. Fusenig, N. E. in Biology of Integument (Bereiter-Hahn, J., Matolsy, A. G., and Richards, K. S., eds.), pp. 409-442, Springer-Verlag, Hedelberg

66. Gelb, M. H., Scholten, J. D., and Sebolt-Leopold, J. S. Protein prenylation: from discovery to prospects for cancer treatment. Curr Opin Chem Biol 2(1), 40-8. 98.

67. Glomset, J. A., Gelb, M. H., and Farnsworth, C. C. Geranylgeranylated proteins. Biochem Soc Trans 20(2), 479-84. 92.

68. Glomset, J. A., Gelb, M. H., and Farnsworth, C. C. Prenyl proteins in eukaryotic cells: a new type of membrane anchor. Trends Biochem Sci 15(4), 139-42. 90.

69. Gluzman, Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell 23(1), 175-82. 81.

70. Notes: COMMENTS: Comment in: Science 1997 Feb 21;275(5303):1051-2.

71. Goldenring, J. R., Shen, K. R., Vaughan, H. D., and Modlin, I. M. Identification of a small GTP-binding protein, Rab25, expressed in the gastrointestinal mucosa, kidney, and lung. J Biol Chem 268(25), 18419-22. 93.

72. Goldenring, J. R., Soroka, C. J., ShenR.K., Tang, L. H., Rodriguez, W., Vaughan, H. D., and Modlin, I. M. EMBL/GeneBank/DDJJ databases, accesion number LI9260.

73. Gooley, A. A. and Parker, N. H. (1997) in Proteome Research: new frontiers in functional genomics (principles and practice) (Wilkins, M. R., Williams, K. L., Appel, R. D., and Hochstarsser D.F. eds.), pp. 64-91, Apriger Verlag,

74. Gorg, A., Boguth, G., Obermaier, C., and Weiss, W. Two-dimensional electrophoresis of proteins in an immobilized pH 4-12 gradient. Electrophoresis 19(8-9), 1516-9. 98.

75. Gorg, A., Obermaier, C., Boguth, G., Csordas, A., Diaz, J. J., and Madjar, J. J. Very alkaline immobilized pH gradients for two-dimensional electrophoresis of ribosomal and nuclear proteins. Electrophoresis 18(3-4), 328-37. 97.

76. Gorg, A., Postel, W., Domscheit, A., and Gunther, S. Two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients of leaf proteins from barley (Hordeum vulgare): method, reproducibility and genetic aspects. Electrophoresis 9(11), 681-92. 88.

77. Grand, R. J. and Owen, D. The biochemistry of ras p21. Biochem J 279 ( Pt 3), 609-31.91.

78. Green, H. Terminal differentiation of cultured human epidermal cells. Cell 11(2), 405-16. 77.

79. Gromov, P. and Celis, J. E. Rabl la is modified in vivo by isoprenoid geranylgeranyl. Electrophoresis 19(10), 1803-7. 98.

80. Gromov, P. S., Celis, J.E., and Madsen, P. (1997) in Cell Biology. A Laboratory Handbook (Celis, J. E., Carter, N., Hunter, T., Shotton, D., Simons, K., and Small J.V., eds.), pp. 225-230, Academic Press, New York

81. Gromov, P. S. and Celis, J. E. (1997) in Cell Biology. A Laboratory Handbook (Celis, J. E., Carter, N., Hunter, T., Shotton, D., Simons, K., and Small J.V., eds.),pp. 454-458, Academic Press, New York

82. Gromov, P. S. and Celis, J. E. (1997) in Cell Biology. A Laboratory Handbook (Celis, J. E., Carter, N., Hunter, T., Shotton, D., Simons, K., and Small J.V., eds.), pp. 409-4191. Academic Press, New York

83. Gromov, P. S., Madsen, P., and Celis, J. E. Identification of isoprenyl modified proteins metabolically labeled with 3H.farnesyl- and [3H]geranylgeranyl-pyrophosphate. Electrophoresis 17(11), 1728-33. 96.

84. Gromov, P. S., Madsen, P., Tomerup, N., and Celis, J. E. (1995) FEBS Lett 377, 221-6

85. Gromova, I., Gromov, P., Wolf, H., and Celis, J. E. Protein abundancy and mRNA levels of the adipocyte-type fatty acid binding protein correlate in non-invasive and invasive bladder transitional cell carcinomas. Int J Oncol 13(2), 379-83. 98.

86. Gutierrez, L., Magee, A. I., Marshall, C. J., and Hancock, J. F. Post-translational processing of p21ras is two-step and involves carboxyl-methylation and carboxy-terminal proteolysis. EMBO J 8(4), 1093-8. 89.

87. Hall, A. Ras-related proteins. Curr Opin Cell Biol 5(2), 265-8. 93.

88. Hanash, S. M. and Teichroew, D. Mining the human proteome: experience with the human lymphoid protein database. Electrophoresis 19(11), 2004-9. 98.

89. Hancock, J. F., Magee, A. I., Childs, J. E., and Marshall, C. J. All ras proteins are polyisoprenylated but only some are palmitoylated. Cell 57(7), 1167-77. 89.

90. Hart, G. W. Glycosylation. Curr Opin Cell Biol 4(6), 1017-23. 92.

91. Herr, S., Pepperkok, N., Saffrich, R., Wiemann, S., and Ansorge, W. (1997) in Cell Biology. A Laboratory Handbook

92. Celis, J. E., Carter, N., Hunter, T., Shotton, D., Simons, K., and Small J.V., eds.), pp. 57-92, Academic Press, New York

93. Hesketh, J. E. Sorting of messenger RNAs in the cytoplasm: mRNA localization and the cytoskeleton. Exp Cell Res 225(2), 219-36. 96.

94. Higgins, J. B. and Casey, P. J. The role of prenylation in G-protein assembly and function. Cell Signal 8(6), 433-7. 96.

95. Hochstrasser, D. (1997) in Proteome research: new frontiers in functional genomics (principles and practice) (Wilkins, M. R,, Williams, K. L., Appel, R. D., and Hochstarsser, D. F., eds.), pp. 187-219, Apriger Verlag,

96. Hoffman, H. J., Gromov, P. S., and Celis, J. E. (1997) in Cell Biology. A Laboratory Handbook (Celis, J. E., Carter, N., Hunter, T., Shotton, D., Simons, K., and Small J.V., eds.), pp. 450-454, Academic Press, New York

97. Hohl, D., Mehrel, T., Lichti, U., Turner, M. L., Roop, D. R., and Steinert, P. M. Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins. J Biol Chem 266(10), 6626-36. 91.

98. Honore, B., Madsen, P., and Leffers, H. The tetramethylammonium chloride method for screening of cDNA libraries using highly degenerate oligonucleotides obtained by backtranslation of amino-acid sequences. J Biochem Biophys Methods 27(1), 39-48. 93.

99. Hoppe, B. L., Conti-Tronconi, B. M., and Horton, R. M. Gel-loading dyes compatible with PCR. Biotechniques 12(5), 679-80. 92.

100. Hunt, C. R., Ro, J. H., Dobson, D. E., Min, H. Y., and Spiegelman, B. M. Adipocyte P2 gene: developmental expression and homology of 5'-flanking sequences among fat cell-specific genes. Proc Natl Acad Sci U S A 83(11), 3786-90. 86.

101. Jackson, R. J. Cytoplasmic regulation of mRNA function: the importance of the 3' untranslated region. Cell 74(1), 9-14. 93.

102. Jacobson, A. and Peltz, S. W. Interrelationships of the pathways of mRNA decay and translation in eukaryotic cells. Annu Rev Biochem 1996;65:693-739 .

103. Jensen, O. N., Larsen, M. R., and Roepstorff, P. Mass spectrometric identificationand microcharacterization of proteins from electrophoretic gels: strategies and applications. Proteins 1998;Suppl 2:74-89 .

104. Ji, H., Reid, G. E., Moritz, R. L., Eddes, J. S., Burgess, A. W., and Simpson, R. J. A two-dimensional gel database of human colon carcinoma proteins. Electrophoresis 18(3-4), 605-13. 97.

105. Joberty, G., Tavitian, A., and Zahraoui, A. Isoprenylation of Rab proteins possessing a C-terminal CaaX motif. FEBS Lett 330(3), 323-8. 93.

106. Jordan, M., Schallhorn, A., and Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res 24(4), 596-601. 96.

107. Kahn, R. A., Der, C. J., and Bokoch, G. M. The ras superfamily of GTP-binding proteins: guidelines on nomenclature news. FASEB J 6(8), 2512-3. 92.

108. Kato, K., Cox, A. D., Hisaka, M. M., Graham, S. M., Buss, J. E., and Der, C. J. Isoprenoid addition to Ras protein is the critical modification for its membrane association and transforming activity. Proc Natl Acad Sci U S A 89(14), 6403-7. 92.

109. Kaufman, R. J., Davies, M. V., Pathak, V. K., and Hershey, J. W. The phosphorylation state of eucaryotic initiation factor 2 alters translational efficiency of specific mRNAs. Mol Cell Biol 9(3), 946-58. 89.

110. Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., and Michnick, D. Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus. Nucleic Acids Res 19(16), 4485-90. 91.

111. Kellogg, B. A. and Poulter, C. D. Chain elongation in the isoprenoid biosynthetic pathway. Curr Opin Chem Biol 1(4), 570-8. 97.

112. Khosravi-Far, R., Clark, G. J., Abe, K., Cox, A. D., McLain, T., Lutz, R. J., Sinensky, M., and Der, C. J. Ras (CXXX) and Rab (CC/CXC) prenylation signal sequences are unique and functionally distinct. J Biol Chem 267(34), 24363-8. 92.

113. Khosravi-Far, R., Lutz, R. J., Cox, A. D., Conroy, L., Bourne, J. R., Sinensky, M., Balch, W. E., Buss, J. E., and Der, C. J. Isoprenoid modification of rab proteins terminating in CC or CXC motifs. Proc Natl Acad Sci U S A 88(14), 6264-8. 91.

114. Kitayama, H., Matsuzaki, T., Ikawa, Y., and Noda, M. Genetic analysis of the Kirsten-ras-revertant 1 gene: potentiation of its tumor suppressor activity by specific point mutations. Proc Natl Acad Sci U S A 87(11), 4284-8. 90.

115. Kitayama, H., Sugimoto, Y., Matsuzaki, T., Ikawa, Y., and Noda, M. A ras-relatedgene with transformation suppressor activity. Cell 56(1), 77-84. 89.

116. Klein-Szanto, A. J. Stereologic baseline data of normal human epidermis. J Invest Dermatol 68(2), 73-8. 77.

117. Klinz, F. J. GTP-blot analysis of small GTP-binding proteins. The C-terminus is involved in renaturation of blotted proteins. Eur J Biochem 225(1), 99-105. 94.

118. Klose, J. and Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis 16(6), 1034-59. 95.

119. Knall, C. and Johnson, G. L. G-protein regulatory pathways: rocketing into the twenty-first century. J Cell Biochem Suppl 1998;30-31:137-46 .

120. Koronakis, V. and Hughes, C. Bacterial signal peptide-independent protein export: HlyB-directed secretion of hemolysin. Semin Cell Biol 4(1), 7-15. 93.

121. Krab, I. M. and Parmeggiani, A. EF-Tu, a GTPase odyssey. Biochim Biophys Acta 1443(1-2), 1-22. 98.

122. Kuchler, K. and Thorner, J. Secretion of peptides and proteins lacking hydrophobic signal sequences: the role of adenosine triphosphate-driven membrane translocators. Endocr Rev 13(3), 499-514. 92.

123. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227(259), 680-5. 70.

124. Lai, F., Stubbs, L., and Artzt, K. Molecular analysis of mouse Rabl lb: a new type of mammalian YPT/Rab protein. Genomics 22(3), 610-6. 94.

125. Lamm, D. L. Carcinoma in situ. Urol Clin North Am 19(3), 499-508. 92.

126. Langen, H., Berndt, P., Roder, D., Cairns, N., Lubec, G., and Fountoulakis, M. Two-dimensional map of human brain proteins. Electrophoresis 20(4-5), 907-16. 99.

127. Lapetina, E. G. and Reep, B. R. Specific binding of alpha-32P.GTP to cytosolic and membrane-bound proteins of human platelets correlates with the activation of phospholipase C [published erratum appears in Proc Natl Acad Sci U S A 1988

128. Feb;85(4):1070. Proc Natl Acad Sci U S A 84(8), 2261-5. 87.

129. Leon, J., Guerrero, I., and Pellicer, A. Differential expression of the ras gene family in mice. Mol Cell Biol 7(4), 1535-40. 87.

130. Leonard, D. A., Lin, R., Cerione, R. A., and Manor, D. Biochemical studies of the mechanism of action of the Cdc42-GTPase- activating protein. J Biol Chem 273(26), 16210-5. 98.

131. Lobitz, C. J. and Buxman, M. M. Characterization and localization of bovine epidermal transglutaminase substrate. J Invest Dermatol 78(2), 150-4. 82.

132. Lobsanov, Y. D., Gitt, M. A., Leffler, H., Barondes, S. H., and Rini, J. M. X-ray crystal structure of the human dimeric S-Lac lectin, L-14-11, in complex with lactose at 2.9-A resolution. J Biol Chem 268(36), 27034-8. 93.

133. Madsen, P., Gromov, P. S., and Celis, J. E. (1997) in Cell Biology. A Laboratory Handbook (Celis, J. E., Carter, N., Hunter, T., Shotton, D., Simons, K., and Small J.V., eds.), pp. 187-189, Academic Press, New York

134. Mann, M., Hojrup, P., and Roepstorff, P. Use of mass spectrometric molecular weight information to identify proteins in sequence databases. Biol Mass Spectrom 22(6), 338-45. 93.

135. Mann, M. and Wilm, M. Error-tolerant identification of peptides in sequence databases by peptide sequence tags. Anal Chem 66(24), 4390-9. 94.

136. Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Mol Reprod Dev 42(4), 493-9. 95.

137. Martinez, O. and Goud, B. Rab proteins. Biochim Biophys Acta 1404(1-2), 10112. 98.

138. Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. J Biol Chem 262(21), 10035-8. 87.

139. McCormick, F. Going for the GAP. Curr Biol 8(19), R673-4. 98.

140. McGrath, J. P., Capon, D. J., Goeddel, D. V., and Levinson, A. D. Comparative biochemical properties of normal and activated human ras p21 protein. Nature 310(5979), 644-9. 84.

141. Mehrabian, M., Gitt, M. A., Sparkes, R. S., Leffler, H., Barondes, S. H., and Lusis, A. J. Two members of the S-lac lectin gene family, LGALS1 and LGALS2, reside in close proximity on human chromosome 22ql2-ql3. Genomics 15(2), 418-20. 93.

142. Mitev, V. and Miteva, L. Signal transduction in keratinocytes In Process Citation., Exp Dermatol 8(2), 96-108. 99.

143. Moir, R. D., Spann, T. P., and Goldman, R. D. The dynamic properties and possible functions of nuclear lamins. Int Rev Cytol 1995;162B: 141-82 .

144. Molloy, M. P., Bolis, S., Herbert, B. R., Ou, K„ Tyler, M. I„ van Dyk, D. D.,

145. Mortz, E., Vorm, O., Mann, M., and Roepstorff, P. Identification of proteins in polyacrylamide gels by mass spectrometric peptide mapping combined with database search. Biol Mass Spectrom 23(5), 249-61. 94.

146. Mostofi, F. K., Davis, C. J. Jr, and Sesterhenn, I. A. Current understanding of pathology of bladder cancer and attendant problems. J Occup Med 32(9), 793-6. 90.

147. Mullins, R. D. and Pollard, T. D. Rho-family GTPases require the Arp2/3 complex to stimulate actin polymerizationin acanthamoeba extracts In Process Citation. Curr Biol 9(8), 405-15.99.

148. Mullner, S., Neumann, T., and Lottspeich, F. Proteomics~a new way for drug target discovery. Arzneimittelforschung 48(1), 93-5. 98.

149. Nagano, Y., Matsuno, R., and Sasaki, Y. A cDNA cloning method for monomeric GTP-binding proteins by ligand blotting. Anal Biochem 211(2), 197-9. 93.

150. Nicholson, L. J., Pei, X. F., and Watt, F. M. Expression of E-cadherin, P-cadherin and involucrin by normal and neoplastic keratinocytes in culture. Carcinogenesis 12(7), 1345-9.91.

151. Nicholson, L. J. and Watt, F. M. Decreased expression of fibronectin and the alpha 5 beta 1 integrin during terminal differentiation of human keratinocytes. J Cell Sci 98 (Pt 2), 225-32.91.

152. Novick, P. and Zerial, M. The diversity of Rab proteins in vesicle transport. Curr Opin Cell Biol 9(4), 496-504. 97.

153. O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem 250(10), 4007-21. 75.

154. O'Farrell, P. Z., Goodman, H. M., and O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of basic as well as acidic proteins. Cell 12(4), 1133-41. 77.

155. Patterson, S. D. and Garrel, J. (1994) in Cell biology. A laboratory handbook. (Celis J.E., ed.), pp. 249-257, Academic Press,

156. Pauli, B. U., Alroy, J., and Weinstein, R. S. (1983) in The Pathology of Bladder Cancer. (Bryan G.Y., C. S., ed.), CRC Press, Boca Raton 1983.1. Boca Raton

157. Prunieras, M., Regnier, M., Fougere, S., and Woodley, D. Keratinocytes synthesize basal-lamina proteins in culture. J Invest Dermatol 81(1 Suppl), 74s-81s. 83.

158. Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., and Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis 18(3-4), 307-16. 97.

159. Rasmussen, H. H. and Celis, J. E. Evidence for an altered protein kinase C (PKC) signaling pathway in psoriasis. J Invest Dermatol 101(4), 560-6. 93.

160. Rasmussen, H. H., Orntoft, T. F., Wolf, H., and Celis, J. E. Towards a comprehensive database of proteins from the urine of patients with bladder cancer. J Urol 155(6), 2113-9. 96.

161. Rasmussen, H. H., Orntoft, T. F., Wolf, H., and Celis, J. E. Towards a comprehensive database of proteins from the urine of patients with bladder cancer. J Urol 155(6), 2113-9. 96.

162. Rasmussen, H. H., Van Damme, J., Bauw, J., Puype, M., Celis, J. E., and Vandekerckhove, J. (1991) in Methods in protein sequence analysis (Jornvall, H., Hoog, J. O., and Gustavsson A.M., eds.), Birkhauser, Basel

163. Rasmussen, H. H., Van Damme, J., Puype, M., Gesser, B., Celis, J. E., and Vandekerckhove, J. Microsequencing of proteins recorded in human two-dimensional gel protein databases. Electrophoresis 12(11), 873-82. 91.

164. Rasmussen, R. K., Ji, H., Eddes, J. S., Zugaro, L. M., Reid, G. E., Simpson, R. J.,and Dorow, D. S. Two-dimensional gel database of human breast carcinoma cell expressed proteins: an update. Electrophoresis 19(5), 818-25. 98.

165. Rastinejad, F. and Blau, H. M. Genetic complementation reveals a novel regulatory role for 3' untranslated regions in growth and differentiation. Cell 72(6), 903-17. 93.

166. Raz, A., Carmi, P., Raz, T., Hogan, V., Mohamed, A., and Wolman, S. R. Molecular cloning and chromosomal mapping of a human galactoside- binding protein. Cancer Res 51(8), 2173-8. 91.

167. Raz, A., Zhu, D. G., Hogan, V., Shah, N., Raz, T., Karkash, R., Pazerini, G., and Carmi, P. Evidence for the role of 34-kDa galactoside-binding lectin in transformation and metastasis. Int J Cancer 46(5), 871-7. 90.

168. Reddy, E. P., Reynolds, R. K., Santos, E., and Barbacid, M. A point mutation is responsible for the acquisition of transforming properties by the T24 human bladder carcinoma oncogene. Nature 300(5888), 149-52. 82.

169. Ren, X. D., Kiosses, W. B., and Schwartz, M. A. Regulation of the small GTP-binding protein Rho by cell adhesion and the cytoskeleton. EMBO J 18(3), 578-85. 99.

170. Reuter, G. and Gabius, H. J. Eukaryotic glycosylation: whim of nature or multipurpose tool? In Process Citation. Cell Mol Life Sci 55(3), 368-422. 99.

171. Rheinwald, J. G. and Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell 6(3), 317-30. 75.

172. Rheinwald, J. G. and Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell 6(3), 331-43. 75.

173. Rice, R. H. and Green, H. The cornified envelope of terminally differentiated human epidermal keratinocytes consists of cross-linked protein. Cell 11(2), 417-22. 77.

174. Righetti, P. G. and Bossi, A. Isoelectric focusing in immobilized pH gradients: an update. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 699(1-2), 77-89. 97.

175. Rowell, C. A., Kowalczyk, J. J., Lewis, M. D., and Garcia, A. M. Direct demonstration of geranylgeranylation and farnesylation of Ki-Ras in vivo. J Biol Chem 272(22), 14093-7. 97.

176. Rush, M. G., Drivas, G., and D'Eustachio, P. The small nuclear GTPase Ran: how much does it run? Bioessays 18(2), 103-12. 96.

177. Rychlik, W. and Rhoads, R. E. A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA. Nucleic Acids Res 17(21), 8543-51. 89.

178. Sachs, A. B. Messenger RNA degradation in eukaryotes. Cell 74(3), 413-21. 93.

179. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Guide, Cold Spring Harbor Laboratory, New york

180. Schwartz, J. J. and Rosenberg, R. R. (1998) in : DNA transfer to cultured cells (Ravid, K. and Freshney, I., eds.), pp. 179-192, Wiley-Liss,

181. Seabra, M. C. Membrane association and targeting of prenylated Ras-like GTPases. Cell Signal 10(3), 167-72. 98.

182. Seabra, M. C. Membrane association and targeting of prenylated Ras-like GTPases. Cell Signal 10(3), 167-72. 98.

183. Sebti, S. M. and Hamilton, A. D. Inhibition of Ras prenylation: a novel approach to cancer chemotherapy. Pharmacol Ther 74(1), 103-14. 97.

184. Shevchenko, A., Wilm, M., and Mann, M. Peptide sequencing by mass spectrometry for homology searches and cloning of genes. J Protein Chem 16(5), 481-90. 97.

185. Shigekawa, K. and Dower, W. J. Electroporation: a general approach to the introduction of macromolecules into prokaryotic and eukaryotic cells. Aust J Biotechnol 3(1), 56-62. 89.

186. Shigekawa, K. and Dower, W. J. Electroporation of eukaryotes and prokaryotes: a general approach to the introduction of macromolecules into cells. Biotechniques 6(8), 742-51. 88.

187. Simoneau, A. R. and Jones, P. A. Bladder cancer: the molecular progression to invasive disease. World J Urol 12(2), 89-95. 94.

188. Snow, D. M. and Hart, G. W. Nuclear and cytoplasmic glycosylation. Int Rev Cytol 1998;181:43-74 .

189. St Johnston, D. The intracellular localization of messenger RNAs. Cell 81(2), 16170. 95.

190. Steinberg, T. H., Jones, L. J., Haugland, R. P., and Singer, V. L. SYPRO orange and SYPRO red protein gel stains: one-step fluorescent staining of denaturing gels for detection of nanogram levels of protein. Anal Biochem 239(2), 223-37. 96.

191. Stenmark, H. and Zerial, M. (1997) in Cell Biology. A Laboratory Handbook (Celis, J. E., Carter, N., Hunter, T., Shotton, D., Simons, K., and Small J.V., eds.), pp. 201-204, Academic Press, New York

192. Tabin, C. J., Bradley, S. M., Bargmann, C. I., Weinberg, R. A., Papageorge, A. G., Scolnick, E. M., Dhar, R., Lowy, D. R., and Chang, E. H. Mechanism of activation of a human oncogene. Nature 300(5888), 143-9. 82.

193. Takai, Y., Kaibuchi, K., Kikuchi, A., and Kawata, M. Small GTP-binding proteins. Int Rev Cytol 1992;133:187-230 .

194. Tang, W., Harrata, A. K., and Lee, C. S. Two-dimensional analysis of recombinant E. coli proteins using capillary isoelectric focusing electrospray ionization massspectrometry. Anal Chem 69(16), 3177-82. 97.

195. Thornton, D. J., Carlstedt, I., and Sheehan, J. K. Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels. Mol Biotechnol 5(2), 171-6. 96.

196. Tommerup, N. and Vissing, H. Isolation and fine mapping of 16 novel human zinc finger-encoding cDNAs identify putative candidate genes for developmental and malignant disorders. Genomics 27(2), 259-64. 95.

197. Trahey, M. and McCormick, F. A cytoplasmic protein stimulates normal N-ras p21 GTPase, but does not affect oncogenic mutants. Science 238(4826), 542-5. 87.23 8 Ueno, H. (1994) EMBL/GeneBank/DDJJ databases, accesion number D38516,

198. Urbe, S., Huber, L. A., Zerial, M., Tooze, S. A., and Parton, R. G. Rabl 1, a small GTPase associated with both constitutive and regulated secretory pathways in PC12 cells. FEBS Lett 334(2), 175-82. 93.

199. Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., and Sander, C. The ras protein family: evolutionary tree and role of conserved amino acids. Biochemistry 30(19), 4637-48. 91.

200. Wahle, E. and Keller, W. The biochemistry of 3'-end cleavage and polyadenylation of messenger RNA precursors. Annu Rev Biochem 1992;61:419-40 .

201. Wahle, E. and Keller, W. The biochemistry of polyadenylation. Trends Biochem Sci 21(7), 247-50. 96.

202. Walsh, B. J., Molloy, M. P., and Williams, K. L. The Australian Proteome Analysis Facility (APAF): assembling large scale proteomics through integration and automation. Electrophoresis 19(11), 1883-90. 98.

203. Walter, P. and Blobel, G. Preparation of microsomal membranes for cotranslational protein translocation. Methods Enzymol 1983;96:84-93 .

204. Weiss, P. and Ferris, W. (1954) Experimental Cell Research 6, 546-549

205. Wilkins, M. R., Williams, K. L„ Appel, R. D., and Hochstrasser, D. F. (1997) Proteomic research: new frontiers in functional genomics (principles and practice), Springer Verlag,

206. Williams, K., Chubb, C., Huberman, E., and Giometti, C. S. Analysis of differential protein expression in normal and neoplastic human breast epithelial cell lines. Electrophoresis 19(2), 333-43. 98.

207. Willumsen, B. M., Christensen, A., Hubbert, N. L., Papageorge, A. G., and Lowy, D. R. The p21 ras C-terminus is required for transformation and membrane association. Nature 310(5978), 583-6. 84.

208. Wittinghofer, A. Signal transduction via Ras. Biol Chem 379(8-9), 933-7. 98.

209. Woodman, P. Vesicle transport: more work for the Rabs? Curr Biol 8(6), R199-201. 98.

210. Yamagata, K., Sanders, L. K., Kaufmann, W. E., Yee, W., Barnes, C. A., Nathans, D., and Worley, P. F. rheb, a growth factor- and synaptic activity-regulated gene, encodes a novel Ras-related protein. J Biol Chem 269(23), 16333-9. 94.

211. Yates, J. R. 3d, Eng, J. K., McCormack, A. L., and Schieltz, D. Method to correlate tandem mass spectra of modified peptides to amino acid sequences in the protein database. Anal Chem 67(8), 1426-36. 95.

212. Zahraoui, A., Touchot, N., Chardin, P., and Tavitian, A. The human Rab genes encode a family of GTP-binding proteins related to yeast YPT1 and SEC4 products involved in secretion. J Biol Chem 264(21), 12394-401. 89.

213. Zehickson, A. S. (1967) Ultrastructure of Normal and Abnormal Skin, Lea and Fibiger, Philadelphia

214. Zerial, M. and Lukas, H. (1995) Guidebook to the small GTPases, Sambrook and Tooze Publications, Oxford University Press

215. Zerial, M. and Stenmark, H. Rab GTPases in vesicular transport. Curr Opin Cell Biol 5(4), 613-20. 93.