Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеомная характеристика сыворотки крови, цитозольной и микросомальной фракций гепатоцитов крыс при адаптации к характеру питания в процессе онтогенеза

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Протеомная характеристика сыворотки крови, цитозольной и микросомальной фракций гепатоцитов крыс при адаптации к характеру питания в процессе онтогенеза"

На правах рукописи

005020645

ШАРАНОВА НАТАЛЬЯ ЭДУАРДОВНА

Протеомная характеристика сыворотки крови, цитозольной и микросомалыюй фракций гепатоцитов крыс при адаптации к характеру питания в процессе онтогенеза

2 9 мдр 2012

03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2012

005020645

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательском институте питания» Российской академии медицинских наук

доктор биологических наук, профессор Васильев Андрей Валериевич

Яровая Галина Алексеевна доктор биологических наук, профессор, ГБОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Минздравсоцразвития России, заведующая кафедрой биохимии, декан медико-биологического факультета

Коничев Александр Сергеевич доктор биологических наук, профессор, ГОУ ВПО Московский государственный областной университет,

заведующий кафедрой органической и биологической химии, директор Естественно-экологического института

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук

Защита состоится 16 апреля 2012 г. в 14 ч 00 мин. на заседании Диссертационного Совета Д 001.002.01 в ФГБУ «НИИ питания» РАМН по адресу: Москва, Устьинский проезд, д.2/14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ питания» РАМН. Автореферат разослан 14 марта 2012 г.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь

Диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

В.М.Коденцова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Исследования последних лет в области генома и, в частности, нутригеномики показали, что знание нуклеотидных последовательностей, кодирующих геном, не позволяет в полной мере описать функционирование даже отдельно взятой конкретной клетки, не говоря уже об организме в целом, поскольку, если каждая клетка организма содержит одинаковую генетическую информацию, то именно функционирование белков определяет ее специфичность и это дало основание сформулировать понятие "протеом" [Говорун В.М. с соавт., 2002; Schweigert F.J., 2007]. Под ним понимается совокупный набор белковых молекул конкретной клетки, являющийся продуктом реализации исходной геномной информации. Протеомика подразумевает инвентаризацию всех белков, закодированных в геноме определенного организма и их взаимодействий между собой [Арчаков А.И., 2000]. Протеомные исследования направлены как на идентификацию белков в исследуемых объектах, так и на их функциональные изменения. В отличие от генома, протеом не остается постоянным, а меняется под воздействием внешних и внутренних факторов, поэтому при изучении изменений протеома под воздействием различным факторов можно выявить основные признаки, указывающие на характер таких воздействий. Таким образом, несмотря на уникальную (в норме) стабильность этого набора белков можно говорить о том, что состав протеомного пула не является просто маркером клеток и тканей, а представляет собой гибкую систему, реагирующую на изменения в организме [Jiang Y.,2010]. Вместе с тем посггрансляционные события, в результате которых собственно и формируется протеомный пул, специфичность которого определяется эндогенными и экзогенными факторами, в настоящее время только становятся предметом системных исследований, среди которых актуальным является проведение нутрипротеомных исследований в области выявления специфичного действия биологически активных компонентов пищи природного происхождения [Clarke S.D. et al, 1999; Jacobs M.N. et al, 2002; Kaput J. et al, 2004].

Работа выполнена в соответствии с планом НИР НИИ питания РАМН в рамках темы № 105 «Пищевая и метаболическая регуляция энергетического статуса клетки при адаптации к характеру питания».

Целью настоящей работы явилось экспериментальное исследование отдельных нутрипротеомных особенностей сыворотки крови и субклеточных структур гепатоцитов крыс в процессе адаптации организма к характеру питания при включении в состав рациона биологически активных компонентов пищи являющихся одновременно естественными эндогенными медиаторами антиоксидантного и энергетического гомеостаза на различных этапах онтогенеза.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести протеомное картирование минорных компонентов сыворотки крови, микро-сомальной и цитозольной фракций клеток печени крыс на различных этапах онтогенетического развития при длительном включении в состав рациона микронутриентов -коэнзима Q10 и таурина с параллельной оценкой показателей, характеризующих апоп-тоз, ферментные и неферментные маркеры ПОЛ.

2. Провести протеомное картирование минорных компонентов сыворотки крови, микро-сомальной и цитозольной фракций клеток печени крыс на различных этапах онтогенетического развития при модификации рациона по жировому компоненту на фоне введения коэнзима Q10 с параллельной оценкой показателей, характеризующих апоптоз, ферментные и неферментные маркеры ПОЛ.

3. Идентифицировать с использованием масс-спектрометрии пул протеомных различий, характеризующих адаптационные свойства организма в процессе онтогенеза.

4. Выявить характер взаимосвязи между протеомными особенностями сыворотки крови, микросомальной и цитозольной фракций и особенностями свободно-радикального окисления и интенсивностью апоптоза на используемых экспериментальных моделях.

Научная новизна

На основе протеомного картирования минорных компонентов сыворотки крови и субклеточных фракций клеток печени крыс с использованием двумерного электрофореза с последующим масс-спектрометрическим анализом идентифицированы специфические проте-омные пулы, характерные для различных этапов онтогенетического развития при алиментарных воздействиях, влияющих на энергетический и антиоксидантный гомеостаз.

Показано влияние потребления коэнзима Q10 и таурина на экспрессию каталазы в микросомальной фракции клеток печени крыс на фоне выраженного снижения уровня IGF-1 в сыворотке крови крыс.

Выявлено достоверное снижение интенсивности фермент-независимых процессов свободно-радикального окисления у животных, получавших рыбий жир в составе рациона в процессе онтогенеза.

Показано, что включение в состав рациона таурина и коэнзима Q10 повышает экспрессию лектина С-типа в цитозольной фракции клеток печени крыс на поздних сроках развития животных, что согласуется со снижением уровня процессов «позднего» апоптоза к 12-у месяцу жизни животных.

Практическая значимость работы

Результаты работы позволяют обосновать необходимость использования методов протеомной диагностики при нутрипротеомных исследованиях для идентификации проте-омных маркеров с целью донозологической оценки действия алиментарных факторов.

Разработанный алгоритм нутрипротеомного исследования может быть использован для выявления белковых маркеров онтогенетических изменений и алиментарного воздействия.

Идентифицированные характеристические белки, отражающие изменение протеом-ного профиля сыворотки, цитозольной и микросомальной фракций клеток печени крыс в процессе онтогенеза при адаптации к характеру питания, могут быть использованы для обоснования соответствующей диетотерапии и профилактики алиментарно-зависимых заболеваний.

Внедрение результатов в практику

Материалы проведенных исследований использованы в курсе лекций по биохимии в ГЕОУ ВПО Нижегородской государственной медицинской академии и ГБОУ ВПО Рязанском государственном медицинском университете им. И.П.Павлова.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены на XII Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов с международным участием «Питание и здоровье» (Москва, 2010); на конкурсе молодых ученых XIII Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов с международным участием «Персонифицированная диетология: настоящее и будущее» представленная работа заняла 3 место (Москва, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 работы, в том числе 3 статьи в научных рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Материал диссертации изложен на 107 страницах машинописного текста, содержит 19 рисунков и 15 таблиц, указатель литературы включает 205 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали белых беспородных крыс самцов, свободных от возбудителей патогенных заболеваний. Всего в работе использовали 192 крысы. Животных содержали на

стандартном полусинтетическом рационе, в состав которого входил казеин (источник белка - 23% по калорийности), крахмал маисовый - источник углеводов 52%, жировой компонент в зависимости от группы - 23% по калорийности, смесь минеральных солей, в качестве пищевых волокон использовали отруби пшеничные. В экспериментальных исследованиях использовали коэнзим Q10 (Wirud Co., Ltd.) и таурин (Sichuan amino acids Co., LTD).

В зависимости от вида жира и включенного в состав рациона микронутриента было сформировано 6 групп животных (по 32 в каждой):

1 Группа (контроль) - источник жира лярд и подсолнечное масло (1:1);

2 Группа - источник жира лярд и подсолнечное масло + Q10 100 мг/кг массы тела;

3 Группа ПМ - источник жира пальмовое масло + Q10 100 мг/кг массы тела;

4 Группа РЖ - источник жира рыбий жир + Q10 100 мг/кг массы тела;

5 Группа JIM - источник жира льняное масло + Q10 100 мг/кг массы тела;

6 Группа - источник жира лярд и подсолнечное масло + таурин (1% водный раствор).

Животных ежедневно осматривали, раз в месяц производили определение массы тела. Продолжительность эксперимента составила 12 месяцев. Для установления влияния времени пребывания животных на рационах на изучаемые показатели отбирали из всех групп по 8 животных через 1, 3, 6 и 12 месяцев эксперимента. Забой предварительно наркотизированных крыс производили путем декапитации, после чего подвергали патологоана-томическому вскрытию с целью макроскопического изучения структуры внутренних органов, обнаружения интеркуррентных заболеваний.

Определение коэнзима Q10 в сыворотке крови и печени осуществляли при помощи ВЭЖХ системы Agilent 1100 со спектрофотометрическим детектором.

Определение таурина в сыворотке крови осуществляли при помощи ВЭЖХ системы Agilent 1100 с флуориметрическим детектором.

Интенсивность фермент-зависимых процессов ПОЛ в сыворотке крови и печени животных оценивали по содержанию диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА).

Исследование активности фермент-независимых процессов ПОЛ (определение F2-простанов в сыворотке крови), а также определение антиапоптозного фактора IGF-I проводили с использованием ИФА-наборов для лабораторных крыс ImmunoDiagnosticSystems Ltd. (Великобритания).

Двумерный электрофорез сыворотки крови, цитозольной и микросомальной фракций клеток печени крыс проводили с использованием системы PROTEAN II xi 2-D Cell («BioRad», США). Полученные протеомные карты анализировали с помощью программы PDQest 8.0 («Bio-Rad», США).

Для изучения протеома выбранных фракций и сыворотки крови характеристические белки выделяли из окрашенных гелей и подвергали гидролизу трипсином, после чего регистрировали масс-спектры на времяпролетном MALDI-масс-спектрометре BRUKER Ultraflex II (Германия), оборудованном УФ лазером (Nd) в рефлекторном режиме с регистрацией положительных ионов1. Поиск проводился в базе данных NCBI.nr среди белков всех организмов. Идентификацию белка считали достоверной, если вычисленный для него эмпирический критерий «Mascot score» превышал 63.

Для исследование апоптоза гепатоцитов крыс методом проточной цитометрии с помощью автоматической системы для механической гомогенизации ткани «BD Medimachine» производства «Becton Dickenson and Company» (США) получали суспензию гепатоцитов2. Окрашивание гепатоцитов производили конъюгированным с флуорохромом (FITC) аннексином V (AnV-FITC) и витальным красителем 7-аминоактиномицином (7-ADD) с последующей детекцией на проточном цитофлуориметре FC500 производства «Beckman Coulter Int.» (США).

Все данные подвергали компьютерному анализу по программе SPSS Statistics Base 17.0. Сравнение между группами проводили по критерию Стьюдента. Различия между группами считали достоверными при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование отдельных особенностей адаптационного статуса j> крыс при включении с состав рациона коэюима Q10 и таурина на различных этапах онтогенетического развития

Определение содержания таурина в сыворотке крыс, получавших его в течение года в дополнение к рациону, свидетельствует, что концентрация таурина, начиная с 1-го месяца эксперимента, повышалось в 3,9 раза, достигая максимума к 3-у месяцу жизни (в 6,6 раз выше по сравнению с контролем). В дальнейшем в опытных группах животных концентрация таурина в сыворотке крови существенно снижалась, превышая, тем не менее, уровень содержания таурина в сыворотке крови контрольных животных 6-го и 12-го месяцев жизни в 2,6 и 3,8 раз соответственно (табл.1).

' Исследования методом масс-спектрометрии были выполнены в Центре коллективного пользования "Протеом человека" ИБМХ РАМН (г. Москва) совместно со старшим научным сотрудником лаборатории диагностической протеомики Торопыгиным И.Ю.

2 Оценка интенсивности апоптоза в гепатоцитах печени была проведена старшим научным сотрудником лаборатории спортивного питания с группой алиментарной патологии ФГБУ «НИИ питания» РАМН к.м.н. Трушиной Э.Н. и научным сотрудником к.м.н. Мустафиной O.K.

Таблица 1. Содержание таурина в сыворотке крыс (М±т)

Группы животных Таурин в сыворотке крови, мкг/мл

1 месяц 3 месяца 6 месяцев 12 месяцев

Группа контроля 0,030 ± 0,004 0,031 ± 0,00В 0,04В ± 0,005 0,043 ± 0,005

Группа опытная 0,118 ±0,026* 0,204 ± 0,050* 0,124 ±0,011* 0,163 ± 0,096*

* - р<0,05

Исследование содержания коэнзима Q10 в сыворотке крови и печени животных показало, что вплоть до 6-го месяца жизни животных в опытной группе его концентрация в сыворотке крови и печени была стабильно выше по сравнению с контролем в среднем в 1,7 - 2,4 раза (Табл. 2).

Таблица 2. Содержание коэнзима Q10 в сыворотке крови и печени крыс в процессе онтогенеза на фоне его включении в состав контрольного рациона (М±т)

Орган/ ткань 1 месяц 3 месяца 6 месяцев 12 месяцев

Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт

Сыворотка крови, мкг/мл 0,58±0,29 1,23±0,15* 1,76±0,7б 4,34±0,67* 3,23±1,25 5,65±0,48 3,17±1,17 3,68±0,56

Печень, мкг/мг ткани 27,5±7,5 56,2±9,4* 21,7±7,4 42,4±3,3* 19,9±8,9 38,2±6,7* 17,45±3,51 2б,9±2,0

*- р<0,05

Рассматривая коэнзим (}10 и таурин как эндогенные антиоксиданты и мембранные стабилизаторы, было проведено исследование неферментных (Р2-изопростаны) и ферментных (МДА, ДК) маркеров перекисного окисления липидов (табл.3). Как следует из представленных результатов, в сыворотке крови крыс 3-го месяца жизни отмечено умеренное снижение концентрации ДК и МДА (на 35 и 32% соответственно), а в печени 12-месячных животных выявлено увеличение содержания МДА на 33%, что свидетельствует о малосущественном изменении фермент-зависимых процессов ПОЛ в период 1-го года жизни. В свою очередь обнаружена выраженная активация фермент-независимых процессов свобод-норадикального окисления, о чем можно судить по увеличению концентрации в сыворотке крови Р2-изопростанов.

Анализ результатов, характеризующих интенсивность фермент-зависимых и фермент-независимых процессов свободно-радикального окисления, не выявил сколько-нибудь значимых различий, позволяющих судить об антиоксидантном действии коэнзима РЮ и таурина. Необходимо отметить, что изопростаны не только маркеры окислительного стресса, они также обладают рядом биологических эффектов, как патофизиологические медиаторы окислительного воздействия.

Таблица 3. Содержание Р2-изопростанов в сыворотке крови и продуктов ПОЛ в сыворотке крови и печени крыс в процессе онтогенеза на фоне введения коэнзима 010 и тау-рина в состав стандартного рациона (М±т)___

Показатель ДК, усл. ед./мл сыворотки МДА, нмоль /мл сыворотки МДА, нмоль /г ткани печени Р2і$оРг, нг/мл

Возраст Контроль <310 Таурин Контроль 010 Таурин Контроль <510 Таурин Контроль <510 Таурин

1 месяц 2,39 ± 0,10 2,22 ± 0,09 2,02 ± 0,07 10,74 ± 0,07 11,16 ± 0,45 9,74 ± 0,12 221,10 ±4,32 228,62 ±5,02 220,25 ±6,36 0,57 ± 0,03 0,45 ± 0,14 0,69 ± 0,10

3 месяца 1,56 ± 0,08 1,02 ± 0,04* 1,10 ± 0,04* 7,35 ± 0,21 6,78 ± 0,29 6,62 ± 0,31 245,38 ±2,25 225,76 ±5,99 222,05 ±8,72 - - -

6 месяцев 2,22 ± 0,04 2,43 ± 0,03 2,45 ± 0,08 10,26 ± 0,18 10,70 ± 0,12 8,28 ± 0,20* 193,03 ±2,51 192,43 ±3,76 200,51 ±7,46 2,08 ± 0,95 2,05 ± 1,29 2,30 ± 0,71

12 месяцев 1,97 ± 0,06 2,18 ± 0,05 1,57 ± 0,04* 10,24 ± 0,10 11,66 ± 0,14 10,39 ±0,16 294,61 ±1,95 291,61 ±2,91 280,12 ±4,81 2,17 ± 0,86 2,00 ± 1,29 2,28 ± 0,92

* - р<0,05

Исследование апоптоза гепатоцитов крыс методом проточной цитометрии, а также оценка уровня антиапоптозного фактора ЮИ-! в сыворотке животных различных возрастных групп (табл.4) указывает на характерные для онтогенетических процессов возрастания интенсивности процессов «раннего апоптоза» и общего числа апоптотических клеток.

Таблица 4. Апоптоз гепатоцитов крыс и содержание ЮР-1 в сыворотке крови крыс, получавших коэнзим 0Ю и таурин, в процессе онтогенеза (М±т)_

Возраст Показатель

Группа «Ранний» апоптоз АпУ-Р1ТС+/7-ААО- «Поздний» апоптоз АпУ-Р1ТС+/7-ААО+ Общее число клеток в апоптозе ЮР-1, нг/мл

1 месяц Контроль 1,9040,44 0,60±0,19 2,17±0,48 1309,0 ±72,3

010 1,57±0,41 0,85±0,21 2,42±0,35 627,9 ±173,3*

Таурин 1,93±0,25 1,00±0,22 2,93±0,08 741,7 ±362,3

3 месяца Контроль 2,30±0,64 0,20±0,06 2,50±0,66 -

010 1,90±0,41 0,35±0,07 2,25±0,38 -

Таурин 2,02±0,21 0,75±0,23* 2,77±0,15 -

6 месяцев Контроль 5,20±0,51 0,17±0,06 5,37±0,49 523,7 ± 99,7

ОЮ 4,37±0,27 0,12±0,05 4,48±0,25 689,0 ± 135,2

Таурин 5,05±0,34 0,12±0,03 5,17±0,34 425,0 ± 58,2

12 месяцев Контроль 6,25±0,74 0,50±0,07 6,75±0,78 500,8 ± 80,8

010 6,73±0,55 0,25±0,13* 6,98±0,60 489,8 ± 80,2

Таурин 6,03±1,08 0,18±0,14* 6,20±0,99 547,3 ±111,9

*- р<0,05

Сравнительное исследования интенсивности апоптоза в процессе онтогенеза позволило отметить два существенных момента: выраженное снижение процессов «позднего» апоптоза к 12-у месяцу у животных, получавших таурин (на 64%) и коэнзим Q10 (на 50%). Одновременно следует отметить снижение уровня IGF-I у животных первого месяца жизни, получавших коэнзим Q10 на 52%, получавших таурин на 43%.

Сравнение электрофореграмм двухмерного электрофореза белков с помощью программы PDQest 8.0 («Bio-Rad», США) позволило выявить отличительные особенности в экспрессии белков сыворотки крови крыс различных возрастных групп. В среднем на элек-трофореграммах с диапазоном pH 3-10 наблюдалось около 335±51 белковых пятен (типичные электрофореграммы сыворотки крови крыс представлены на рис. 1).

В ходе сравнительного анализа протеомных карт было выявлено 12 белковых пятен, характеризующих молодой возраст животных (1 и 3 месяца), 9 из которых присущи исключительно крысам в возрасте 1 месяца, а также 5 отличительных белков сыворотки крыс возрастных групп (6 и 12 месяцев), 3 из которых проявляются только в 12-месячном возрасте. Сравнительный анализа электрофореграмм сыворотки крови крыс, получавших в составе стандартного рациона 1% раствор таурина в свободном доступе, позволил выявить 300±61 белковых пятна, при этом раннему возрасту соответствовали 9 отличительных пятен, 6 из которых проявлялись на электрофореграммах до 6 месяцев. Из 7 белков характерных для старшего возраста только 5 были выявлены в возрасте 12 месяцев.

Рис.1 Электрофореграммы сыворотки крови крыс группы контроля в процессе онтогенеза.

а - 1 месяц, б - 3 месяца, в - 6 месяцев, г - 12 месяцев. Обозначения:

о - белковые пятна, выделенные у животных 1 и 3 месяца жизни; о - белковые пятна, выделенные у животных 6 и 12 месяцев жизни; —» - белки, идентифицированные масс-спектрометрически.

В отличие от остальных испытуемых групп, в группе, получавшей коэнзим <310, удалось выявить 3 характерных белка, проявившихся во всех возрастных точках эксперимента. В среднем на электрофореграммах с диапазоном рН 3-10 наблюдалось около 266±4 белковых пятен, при этом для раннего возраста отличительным стали 9 белков, экспрессия 4 из которых сохранялась до 6 месяцев. Старшему возрасту соответствовали 2 характерных белка.

Основываясь на полученных результатах сравнительного анализа протеомных карт сыворотки крови крыс, можно сделать вывод о геропротекторном действии коэнзима 010, на что указывает снижение количества отличительных белков старших возрастных групп в случае включения в рацион 010 по сравнению с группой контроля и группой, получавшей таурин в качестве добавки к основному рациону.

Сравнительный анализ электрофореграмм двумерного электрофореза микросомаль-ной фракции гепатоцитов крыс четырех возрастных групп позволил выявить 193±20 белковых пятна (типичные электрофореграммы микросомальной фракции гепатоцитов крыс представлены на рис.2). В процессе определения характеристических белков контрольной группы были выявлены 20 белковых пятен, проявившихся в старших возрастных группах, и 8 пятен, отличающих ранний возраст экспериментальных животных.

Рис.2 Электрофореграммы микросомальной фракции гепатоцитов крыс группы контроля в процессе онтогенеза.

а - 1 месяц, б - 3 месяца, в - 6 месяцев, г - 12 месяцев. Обозначения:

о - белковые пятна, выделенные у животных 1 и 3 месяца жизни; □ - белковые пятна, выделенные у животных 3, 6 и 12 месяцев жизни; —> - белки, идентифицированные масс-спектрометрически.

Следует отметить, что в отличие от аналогичного анализа сыворотки крови крыс, в случае микросомальной фракции белки, характеризующие онтогенетические изменения экспериментальных животных, начинали проявляться уже с 3-хмесячного возраста.

Сравнение протеомных карт микросомальной фракции гепатоцитов крыс, получавших в составе рациона таурин, позволило вывить 208±30 белковых пятен. Как и в случае контрольной группы, характерные возрастные изменения на протеомном уровне начали проявляться уже с 3 месяцев жизни экспериментальных животных. Из 27 белков, отличающих онтогенетические изменения, 18 были выявлены уже в возрасте 3-х месяцев, 23 - с 6 месяцев жизни. Сравнение электрофореграмм микросомальной фракции гепатоцитов крыс, получавших коэнзим Q10 в составе рациона, позволило определить 218±12 белковых пятен. При этом среди них 9 характеризуют ранний возраст животных и 6 -старший возраст, что существенно меньше по сравнению с группой контроля.

Анализ протеомных карт цитозольной фракции гепатоцитов крыс 1, 3, 6 и 12 месяцев жизни выявил 318±113 белковых пятен (типичные электрофореграммы цитозольной фракции гепатоцитов крыс представлены на рис. 3).

Рис. 3 Электрофореграммы цитозольной фракции гепатоцитов крыс группы контроля в процессе онтогенеза.

а - 1 месяц, б - 3 месяца, в - 6 месяцев, г - 12 месяцев. Обозначения:

о - белковые пятна, выделенные у животных 1 и 3 месяца жизни; □ - белковые пятна, выделенные у животных 3, 6 и 12 месяцев жизни; —> - белки, идентифицированные масс-спектрометрически.

Характерной особенностью данной фракции от микросомальной, а также от протеомного профиля сыворотки крови крыс указанных групп, стало проявление белков, свойственных раннему возрасту вплоть до 6 месяцев (из 12 белков, характеризующих ранний воз-

12

раст, 6 были определены в группе 6 месяцев). Кроме того, были выявлены 2 характерных белка, не экспрессируемых исключительно в группе 3 месяцев. В возрастных группах выраженную экспрессию проявили 15 белков, 14 из которых были обнаружены уже в группе 3 месяца, при этом 3 белка к 12 месяцам не проявлялись.

Среднее количество белков, определенных на электрофореграммах цитозольной фракции гепатоцитов крыс, получавших таурин в составе рациона, составило 294±33. Основным отличием в протеомном спектре данной фракции от микросомальной стало проявление малого количества белков, характеризующих старший возраст животных, так, для раннего возраста отличительными стали 28 белков (экспрессия 21 сохранилась до 6 месяцев), а для возрастных групп только 3.

В случае сравнения протеомных цитозольной фракции гепатоцитов крыс, получавших коэнзим (210, было выявлено 262±29 белковых пятен. В данной опытной группе было выявлено 17 характеристических белков старшего возраста и 8 белковых пятен, отличающих ранний возраст животных, также определен один из белков, не экспрессируемый исключительно в группе 3 месяцев. При этом, как и в группе контроля, наблюдалось снижение экспрессии отличительных белков молодого возраста к 6 месяцу жизни крыс в 2 раза.

Исследование отдельных особенностей адаптационного статуса у крыс при модификации рациона по жировому компоненту на различных этапах онтогенетического развития

Анализ данных по содержанию коэнзима (}10 в печени животных под влиянием различных жировых компонентов в зависимости от продолжительности эксперимента показал, что в возрасте 1 месяца содержание коэнзима (}10 в сыворотке было максимальным для группы, получавшей в составе рациона пальмовое масло (табл.5).

В возрасте 3 месяцев, в период наиболее активного роста животных, отмечена общая тенденция к снижению уровня коэнзима 010 в печени животных всех групп, что, очевидно, объясняется его большей активностью и востребованием как источника энергии и антиок-сиданта в метаболических процессах. Можно предположить, что увеличенное содержание коэнзима 010 в печени животных опытных групп по сравнению с контролем на сроке опыта 12 месяцев, связано с необходимостью его большего содержания в печени в случае дефицита ПНЖК (пальмовое масло) или сниженного содержания ПНЖК омега 6 (рыбий жир, льняное масло) в рационе.

Таблица 5. Содержание коэнзима QI0 в сыворотке крови и печени животных в процессе онтогенеза на фоне изменения состава ПНЖК в рационе при введении коэнзима Q10 (М±т)

Группа 1 месяц 3 месяца 6 месяцев 12 месяцев

Q10 в сыв., мкг/мл Q10 в печ., мкг/мг ткани Q10 в сыв., мкг/мл Q10 в печ., мкг/мг ткани QIOb сыв., мкг/мл QIOb печ., мкг/мг ткани QIOb сыв., мкг/мл QIOb печ., мкг/мг ткани

Контроль 0,58 ± 0,29 27,5 ± 7,5 1,76 ± 0,76 21,7 ±7,4 3,23 ± 1,25 19,9 ±8,9 3,17 ± 1,17 17,4 ± 3,5

Пальмовое масло +СП0 1,25 ± 0,87 62,6 ± 16,7* 3,83 ± 1,75 51,8± 12,7* 22,62 ± 5,10* 23,2 ± 7,6 1,51 ± 0,68 45,5 ± 13,7*

Рыбий жир +010 0,65 ± 0,31 50,7 ± 9,9* 0,25 ± 0,09* 36,6 ± 9,3 10,92 ± 1,06* 87,1 ± 26,1* 1,34 ± 0,73 81,7± 24,3*

Льняное масло +ою 0,71 ± 0,19 40,3 ± 12,8 0,31 ± 0,15* 24,7 ±5,2 6,21 ± 0,73* 82,4 ± 30,6* 2,30 ± 1,08 113,9 ± 36,3*

* - р<0,05

Взаимосвязь влияния коэнзима 010 на содержание продуктов ПОЛ в сыворотке крови и печени животных в зависимости от продолжительности эксперимента отражена в таблице 6. В 3-х месячном возрасте отмечено снижение содержания коэнзима (310 в печени животных всех групп и наименьшее содержание продуктов ПОЛ в сыворотке. Содержание первичных продуктов окисления липидов (ДК) было наивысшим у крыс в возрасте 1 месяца в группах животных, содержащихся на РЖ и ЛМ.

К 12 месяцам в рационах с РЖ и ЛМ, жировой компонент которых обладал большей степенью ненасыщенности, содержание ДК в сыворотке крови было наименьшим, особенно в группе с ЛМ, что связано, по-видимому, с наибольшим содержанием коэнзима (310 в сыворотке крови крыс данной опытной группы. Содержание Р2-изопростанов в сыворотке крови у крыс 1 месяца жизни было наибольшим в группе с ПМ (в 2 раза по сравнению с контролем), а наименьшим в группе с РЖ и составляло 56% от контроля. В 3-х месячном возрасте содержание ДК и МДА в сыворотке уменьшались во всех группах, при этом концентрация коэнзима <310 в сыворотке крови увеличилась лишь в группе контроля и ПМ, а к 6 и 12 месяцам показатель ПОЛ нивелировался между группами, исключение составляет контрольная группа с наивысшим показателем содержания продуктов ПОЛ, которая характеризуется высоким содержанием ПНЖК омега 6 в рационе. Концентрация Р2-изопростанов на фоне введения коэнзима <310 к 6 месяцу жизни была наибольшей в группе животных получавших ПМ и практически не отличалась от контрольного уровня, тогда как у животных, получавших на фоне введения коэнзима <310 в составе рациона РЖ и ЛМ кон-

центрация F2-n3onpocTaHOB была ниже по сравнению с контролем на 70% и 74% соответственно.

Таблица 6. Содержание Р2-изопростанов в сыворотке крови и продуктов ПОЛ в сыворотке крови и печени крыс в процессе онтогенеза на фоне изменения состава ПНЖК в рационе при введении коэнзима 010 (М±т)_

Возраст Показатель

ПНЖК ДК, усл. ед./мл сыворотки МДА нмоль /мл сыворотки МДА нмоль /г ткани печени F2isoPr, нг/мл

1 месяц Контроль 2,39 ±0,10 10,74 ±0,07 228,62 ± 5,02 0,57 ± 0,03

Пальмовое масло 2,41 ±0,11 9,56 ±0,11 215,04 ±2,25 1,19 ±0,57

Рыбий жир 3,19 ±0,13* 12,41 ± 0,25* 265,08 ± 2,88* 0,32 ±0,20

Льняное масло 3,12 ±0,11* 8,86 ±0,17* 249,05 ±3,14 0,47 ±0,10

3 месяца Контроль 1,56 ±0,08 7,35 ±0,21 225,70 ± 6,0 -

Пальмовое масло 1,14 ±0,03* 5,47 ±0,30* 237,43 ± 5,96 -

Рыбий жир 1,18 ±0,05* 6,81 ±0,09 314,74 ± 1,22* -

Льняное масло 1,01 ±0,04* 6,52 ±0,16 246,79 ± 2,76 -

6 месяцев Контроль 2,22 ± 0,04 10,26 ±0,18 192,43 ±3,8 2,08 ± 0,95

Пальмовое масло 2,23 ± 0,09 9,41 ±0,11 187,90 ±2,89 2,13 ±0,78

Рыбий жир 1,95 ±0,01 9,11 ±0,14 176,47 ±4,12 0,63 ±0,12*

Льняное масло 1,58 ±0,04* 9,16 ±0,10 163,46 ± 2,63* 0,54 ±0,17*

12 месяцев Контроль 1,97 ±0,06 10,24 ±0,10 291,62 ±2,9 2,17 ±0,86

Пальмовое масло 2,18 ±0,02 10,19 ±0,29 272,73 ±2,09 1,48 ±0,69

Рыбий жир 1,94 ±0,06 9,96 ±0,12 306,28 ±3,21 0,90 ± 0,09*

Льняное масло 1,49 ±0,01* 9,84 ±0,09 270,97 ± 2,97 1,41 ±0,97

* - р<0,05

Исследование процессов «раннего» и «позднего» апоптоза (табл.7) показало, что к 1-у месяцу жизни потребление ПМ приводило к умеренному снижению «раннего» апоптоза, тогда как интенсивность процессов «позднего» апоптоза достоверно возрастала в 2 раза (р<0,05). Существенно, что у 3-х месячных животных интенсивность «позднего» апоптоза весьма значительно возрастала во всех группах по сравнению с контролем. В дальнейшем активность процессов, характеризующих «позднюю» стадию апоптоза снижалась и к концу эксперимента у животных, получавших ПМ и ЛМ, хотя и не достоверно составляло 60 и 80% от контроля. Рыбий жир и льняное масло являются источниками ПНЖК соЗ, которые, как установлено, обладают свойствами индукторов апопотоза различных клеток in vitro и ex vivo, изменяя трансмембранный потенциал митохондрий, вызывая гипоэкспрессию анти-апоптогенных белков семейства bcl-2 и индукцию экспрессии Fas-лиганда [Reddy А., 1999; Arita К., 2001; Switzer К., 2003]. В качестве патогенетического фактора рассматриваются гидроперекиси ненасыщенных жирных кислот и свободные радикалы, участвующие в пере-кисном окислении липидов [Johnson Р., 2002].

15

Таблица 7. Апоптоз гепатоцитов крыс и содержание ГСР-1 в сыворотке крови крыс в процессе онтогенеза на фоне изменения состава ПНЖК в рационе при введении коэнзима 010 (М±т)_

Показатель

Возраст ПНЖК Живые клетки AnV-FITC-/7-AAD- «Ранний» апоптоз AnV-FITC+/7-AAD- «Поздний» апоптоз AnV-FITC+/7-AAD+ Общее число клеток в апоптозе Мертвые клетки AnV-FITC-/7-AAD+ IGF-I, нг/мл

Контроль 96,40±0,44 1,90±0,44 0,60±0,19 2,17±0,48 1,12±0,16 1309,0 ± 72,:3

1 месяц Пальмовое масло 95,98±0,41 1,48±0,25 1,18±0,31* 2,67±0,3б l,3ft±0,13 659,8 ± 173,3*

Рыбий жир 94,60±0,36 2,25±0,20 1,30±0,04* 3,55±0,19* 1,68±0,33 702,5 ± 301,1

Льняное масло 94,52±0,37 2,15±0,31 1,63±0,25* 3,78±0,47* 1,70±0,47 518,3 ± 139,0*

Контроль 96,23±0,63 2,30±0,64 0,20±0,06 2,50±0,66 1,30±0,27 -

3 месяца Пальмовое масло 97,32±0,25 1,15±0,21* 0,68±0,15* 1,83±0,14 0,78±0,14 -

Рыбий жир 94,92±0,70 2,42±0,27 1,13±0,17* 3,55±0,40 0,87±0,18 -

Льняное масло 95,52±0,59 2,32±0,20 1,07±0,29* 3,22±0,37 1,12±0,22 -

Контроль 93,82±0,45 5,20±0,51 0,17±0,06 5,37±0,49 0,80±0,12 523,7 ± 99,7

6 меся- Пальмовое масло 93,27±0,22 5,07±0,34 0,18±0,07 5,42±0,50 1,65±0,41 496,2 ± 120,3

цев Рыбий жир 93,23±0,77 5,88±0,64 0,13±0,06 6,02±0,69 0,77±0,23 645,7 ± 77,4

Льняное масло 93,98±0,85 5,17±0,40 0,08±0,03 5,25±0,41 0,77±0,51 552,4 ± 105,4

Контроль 91,85±0,82 6,25±0,74 0,50±0,07 6,75±0,78 1,40±0,23 500,8 ± 80,8

12 меся- Пальмовое масло 93,03±0,78 5,15±0,81 0,30±0,23 5,45±0,75 1,53±0,38 489,8 ± 104,9

цев Рыбий жир 91,35±0,96 6,60±1,32 1,00±0,55 7,60±1,0б 1,05±0,23 556,9 ± 202,2

Льняное масло 91,70±0,29 6,60±0,33 0,40±0,22 7,00±0,45 1,28±0,30 581,3 ± 207,9

* - р<0,05

Сравнительный анализ электрофореграмм микросомальной фракции гепатоцитов крыс, получавших РЖ в составе рациона позволил выявить 213±10 белковых пятен, 5 из которых характеризуют старший возраст крыс. В то же время раннему возрасту соответствовало одинаковое число белковых пятен, как в контрольной, так и в опытной группе (8 и 7, соответственно).

В случае группы, получавшей JIM с добавлением коэнзима Q10, сравнение электрофореграмм микросомальной фракций клеток печени показало снижение количества белков,

отличающих старший возраст крыс по сравнению с группой контроля при равенстве общего числа определенных белковых пятен. Так, при среднем числе определенных пятен 203±10 (в случае контроля 193±20), удалось обнаружить 6 белков отличительных для старшего возраста (в случае группы контроля - 20).

В ходе сравнительного анализа электрофореграмм микросомальной фракции гепато-цитов крыс, получавших ПМ и коэнзим Q10 в составе рациона, было выявлено 183±18 белковых пятен. При этом были установлены существенные отличия по сравнению с электро-фореграммами данной фракции клеток крыс контрольной группы. Так, в опытной группе было значительно повышено содержание белков, характерных для раннего возраста животных (14 в опытной, 8 в контрольной), при этом в старшем возрасте не было определено ни одного характеристического белкового пятна (в группе контроля старший возраст животных отличали 20 белков).

Сравнение электрофореграмм цитозольной фракции гепатоцитов крыс, получавших РЖ выявило 286±36 белковых пятен, что совпадает с учетом погрешности с аналогичным показателем для группы контроля. Однако основным отличием в протеомном спектре цитозольной фракции гепатоцитов опытной группы от контрольной явилось относительно сниженное количество белков, характеризующих ранний возраст животных (3 в опыте против 12 в контроле). При этом старший возраст отличало наличие 12 характерных белков, экспрессия 9 из которых проявилась уже в 3-х месячном возрасте. Кроме того, были выявлены 3 белковых пятна, отсутствующих в группе 6 месяцев.

На элеткрофореграммах цитозольной фракции гепатоцитов крыс, содержавшихся на рационе с JIM с включением коэнзима Q10, было выявлено 256±21 белковых пятен. При этом, если старший возраст животных отличали 11 характерных белков (15 в контроле), то молодой лишь 3, что существенно меньше по сравнению с группой контроля (12 в контроле).

Сравнение протеомных карт цитозольной фракции гепатоцитов крыс, получавших ПМ в составе рациона, выявило наличие 4 белковых пятна, характерных для раннего возраста животных, и 13 белков, отличающих старший возраст, при общем количестве определенных белков 280±31. Полученные данные коррелируют с аналогичными показателями других опытных групп, рацион которых изменен по жировому составу с добавлением Q10, но существенно отличаются от значений в контрольной группе и группе, получавшей в качестве добавки таурин.

Исследование протеомных различий при воздействии алиментарных факторов в процессе онтогенеза

Анализ характерных сывороточных белков групп контроля, таурина и коэнзима Q10, полученных с применением метода масс-спектрометрии, позволил выявить некоторые закономерности, проявляющиеся на протеомном уровне (табл. 8). Так, наблюдалась экспрессия протеинфосфатазы-1 (РР1) и неисследованного белка rCG25855 в сыворотке крови крыс, получавших в качестве добавки к рациону коэнзим Q10 в возрасте 1 и 3 месяцев, при этом эти же белки были выявлены в группе, получавшей в составе рациона таурин на сроках 6 и 12 месяцев. Как известно, протеинфосфатаза-1 - фермент с широкой специфичностью и играет важную роль в регуляции метаболизма гликогена, поскольку дефосфорили-рование фосфорилазы а, киназы фосфорилазы и гликогенсинтазы b катализируется именно этим ферментом.

Таблица 8. Характеристика протеомных особенностей сыворотки крови крыс при

включении в состав рациона коэнзима Q10 и таурина в онтогенезе._

Название белка___Характеристика__

возраст__контроль__Q10__таурин

1 месяц___*__

rCG25855 3 месяца___*__

6 месяцев____*_

__12 месяцев____*_

возраст__контроль__Q10__таурин

1 месяц *

протеинфосфатаза- —----;--

г т т 3 месяца_____

б месяцев____*_

12 месяцев____*_

возраст__контроль__Q10__таурин

1 месяц__*__*__*_

3 месяца___*__*_

б месяцев___*__*_

12 месяцев___*__

возраст__контроль__Q10__таурин

1 месяц____

rCG48501 3 месяца____

б месяцев__*__*__*_

__12 месяцев___*__*_

8Н2-домен белка 1В

БШ-домен белка 1В был выявлен в группе (}10 на всех сроках эксперимента, в то время как в группе контроля он был обнаружен только у крыс 1 месяца жизни, а в группе, получавшей в составе рациона таурин на сроках 1, 3 и 6 месяцев. 8Н2-В участвует в передачи сигналов через ряд цитокинов и рецепторов фактора роста, включая соматотропин (вН), ЮМ, фактор роста тромбоцитов (РООР) и фактор роста нерва (N0?).

В случае протеомного исследования микросомальной фракции гепатоцитов крыс (табл. 9) удалось установить идентичное проявление каталазы на сроках 3, 6 и 12 месяцев в случае групп, получавших в составе рациона коэнзим ()10 и таурин. При этом данный белок не был идентифицирован ни в группе контроля, ни в группах с измененными по жиро-

вому компоненту рационом. Как известно, каталаза является основным первичным антиоксидантом системы защиты, который катализирует разложение перекиси водорода до воды, разделяя эту функцию с глутатионпероксидазой.

Таблица 9. Характеристика протеомных особенностей микросомальной фракции ге-патоцитов крыс при включении в состав рациона коэнзима <310 и таурина на фоне изменения жирового компонента рациона._

Название белка Характеристика

трансмембранный етр24 белок возраст контроль Q10 таурин РЖ ЛМ ПМ

1 месяц

3 месяца *

6 месяцев *

12 месяцев *

каталаза возраст контроль Q10 таурин РЖ лм ПМ

1 месяц

3 месяца * *

6 месяцев * *

12 месяцев * *

цитохром Ь5 возраст контроль ою таурин РЖ ЛМ ПМ

1 месяц * *

3 месяца * *

6 месяцев * * * * *

12 месяцев * * *

гомогентизат-1,2-диоксигеназа возраст контроль Q10 таурин РЖ ЛМ ПМ

1 месяц * *

3 месяца # *

6 месяцев *

12 месяцев

транстиретин возраст контроль Q10 таурин РЖ ЛМ ПМ

1 месяц * ♦ * *

3 месяца * * * *

6 месяцев * * *

12 месяцев *

белок, богатый лейцином (FLII) возраст контроль Q10 таурин РЖ ЛМ ПМ

1 месяц * * *

3 месяца

6 месяцев * *

12 месяцев *

rCG26823 возраст контроль Q10 таурин РЖ ЛМ ПМ

1 месяц *

3 месяца *

6 месяцев * *

12 месяцев #

Следует отметить характерную особенность в проявлении цитохрома Ь5 в исследуемых группах. Так, в случае групп контроля, таурина и РЖ данный белок был обнаружен на поздних сроках развития животных (6 и 12 месяцев), в то время как в группе коэнзим (^10 и ПМ он был идентифицирован в возрасте 1, 3 и 6 месяцев. Цитохром Ь5 играет важную роль в метаболизме эндогенных и экзогенных соединений ферментами системы цитохрома Р-450, локализованными в различных органах и тканях. Интересным наблюдением является

выявление в микроеомальной фракции гепатоцитов крыс, получавших коэнзим Q10 в составе рациона гомогентизат-1,2- диоксигеназы на сроках 1, 3 и 6 месяцев, белка катализирующего превращение фенилаланина и тирозина с образованием малеилацетоацетата гомо-гентизиновой кислоты, поскольку превращение фенилаланина в тирозин прежде всего необходимо для удаления избытка фенилаланина, так как высокие концентрации его токсичны для клеток.

Схожая степень экспрессии наблюдалась в случае транстиретина в группах контроля и опытных группах с измененным жировым компонентом рациона (1, 3 и 6 месяцы), в то время как данный белок не был обнаружен в группе коэнзима Q10, а в группе таурина был выявлен на сроках 6 и 12 месяцев. Транстиретин - белок острой фазы, относящийся к фракции альбуминов. Он способен присоединять в одном центре связывания ретинолсвязываю-щий белок, а в другом - до двух молекул тироксина и трийодтиронина и его основная функция заключается в транспорте тироксина и трийодтиронина из плазмы в мозг.

В таблице 10 представлены данные по протеомному анализу цитозольной фракции гепатоцитов крыс контрольной и опытной групп. Экспрессия лектина С-типа наблюдалась преимущественно на поздних сроках онтогенеза, однако в случае группы контроля данный белок был обнаружен на 1, 3 и 6-ти месячных сроках исследования. Известно, что лектины С-типа принимают участие в иммунных реакция и апоптозе, кроме того могут индуцировать синтез цитокинов и активных форм кислорода в фагоцитах.

Экспрессия ras-связанного белка Rab-14 была установлена на раннем сроке онтогенеза (1 месяц) в группах контроля, таурина и JIM и сохранялась до 12 месячного возраста только в группе контроля. Белки rab принадлежат к группе низкомолекулярных GTP-связывающихся белков относящихся к семейству RAS белков, участвуют в транспорте белков. Эти белки регулируют внутриклеточный транспорт мембранных струетур. Семейство повсеместно распространенных белков ras (млекопитающие, насекомые, дрожжи, нематоды) регулирует различные аспекты клеточной пролиферации, дифференцировки и морфологии. Они являются протоонкогенами: постоянная активация ведет к злокачественному перерождению клеток.

Протеомная характеристика цитозольной фракции гепатоцитов крыс выявила также экспрессию субъединицы протеасомного комплекса, задействованного в расщеплении антигенов до пептидов на ранних этапах развития у животных 1,3 и 6 месяцев в группах контроля и таурина, в то время как эта же субъединица «включилась» в группе коэнзима Q10, начиная с 3-х месячного возраста, но и не была идентифицирована в группах с измененным жировым компонентом рациона.

Таблица 10. Характеристика протеомных особенностей цитозольной фракции гепатоцитов крыс при включении в состав рациона коэнзима <310 и таурина на фоне изменения жирового компонента рациона._

Название белка Характеристика

лектин семейства С-типа возраст контроль ОЮ таурин РЖ лм ПМ

1 месяц * *

3 месяца ♦ *

6 месяцев * * *

12 месяцев * * * *

бОБ рибосомный белок Ь29 возраст контроль ОЮ таурин РЖ лм ПМ

1 месяц * *

3 месяца * *

6 месяцев *

12 месяцев

протеасома 26Б частицы, изоформа СЯА Ь возраст контроль от таурин РЖ лм ПМ

1 месяц * *

3 месяца * * * * *

6 месяцев * * * * *

12 месяцев * * * *

гаЬ/СБР альфа ингибитор диссоциации возраст контроль ОЮ таурин РЖ лм ПМ

1 месяц *

3 месяца *

6 месяцев *

12 месяцев ♦

газ-связанный белокЯаЬ-14 возраст контроль 010 таурин РЖ лм ПМ

1 месяц * * *

3 месяца

6 месяцев *

12 месяцев *

субъединица протеасомного комплекса возраст контроль 010 таурин РЖ ЛМ ПМ

1 месяц * *

3 месяца * * *

6 месяцев * * *

12 месяцев *

Б-Ьох белок возраст контроль о 10 таурин РЖ ЛМ ПМ

1 месяц * *

3 месяца *

6 месяцев *

12 месяцев *

ци клин-зависимая киназа (СЭК5) возраст контроль ОЮ таурин РЖ ЛМ ПМ

1 месяц * * * *

3 месяца * *

6 месяцев

12 месяцев

ГСС33743 возраст контроль ОЮ таурин РЖ ЛМ ПМ

1 месяц * *

3 месяца * * *

6 месяцев * * *

12 месяцев * *

При этом повышенная экспрессия 26Э частицы протеасомы на тех же сроках наблюдалась в группах таурина и РЖ (до 6 месяца жизни). В группе контроля и остальных опыт-

ных группах, данная частица была обнаружена, начиная с 3-х месячного возраста вплоть до 12 месяцев жизни. В ходе исследования циклин-зависимая киназа 5 (Cdk5) была выявлена на 1 месяце жизни у животных из группы контроля, таурина, коэнзима Q10, а также ПМ, но экспрессия сохранилась до 3 месячного возраста только в группе таурина и ПМ. Cdk5 является несвойственным участником широко распространенного семейства циклин-зависимых киназ (Cdks). В отличие от остальных Cdks она активируется нециклиновыми белками р35 и р39. Cdk5 фосфорилирует ряд белков, большинство из которых связано с клеточной морфологией и подвижностью. Большинство известных субстратов Cdk5 представляют собой сигнальные молекулы или регуляторные белки. Свое основное участие Cdk5 принимает в диф-ференцировке нервных клеток.

F-box белок, идентифицированный на последних сроках онтогенеза в цитозольной фракции гепатоцитов крыс, получавших в составе рациона Q10, а также в первые месяцы жизни у крыс, содержавшихся на рационе с добавлением РЖ и ПМ, является регуляторным и входит в состав убиквитинлигазного комплекса SCFCOI1 (Skpl + Cullin + F-box-protein), участвующего в деградации белков с помощью убиквитина в 26S протеасоме. Через F-box-белок осуществляется перенос убиквитина на фосфорилированные регуляторные белки.

По существу, подавляющее большинство протеомных маркеров идентифицированных при воздействии модуляторов энергообмена - коэнзима Q10 и таурина, а также в зависимости от потребляемого жирнокислотного состава, в значительно большей степени характеризуют особенности регуляции адаптационного статуса клетки по сравнению с обобщенной оценкой интенсивности апоптоза или экспрессии определенного набора сигнальных белков, что является убедительным свидетельством необходимости использования методов протеомной диагностики при нутрипротеомных исследованиях.

ВЫВОДЫ

1. Впервые проведено системное исследование протеомного пула минорных белков в сыворотке крови, микросомальной и цитозольной фракции гепатоцитов крыс при воздействии различных алиментарных факторов в процессе онтогенеза.

2. В сыворотке крови крыс в процессе онтогенеза при потреблении коэнзима Q10 и таурина выявлена экспрессия ЭШ-домена белка (вероятность > 80%, Р < 0.05), участвующего в рецептор-сигнальной регуляции к инсулину и IGF-1.

3. В цитозольной фракции гепатоцитов крыс при включении в состав рациона коэнзима Q10 впервые идентифицирован ингибитор диссоциации rab/GDP-a (вероятность >80%, Р < 0.05), играющий ведущую роль в эндоплазматическом, микротубулярном и везикулярном транспорте.

4. В цитозольной фракции гепатоцитов крыс при включении в состав рациона коэнзима Q10, таурина, рыбьего жира и пальмового масла на поздних сроках развития (12 месяцев) выявлена экспрессия лектина С-типа (вероятность > 80%, Р < 0.05), что согласуется со снижением уровня процессов «позднего» апоптоза к 12-у месяцу у животных опытных групп.

5. В микросомальной фракции гепатоцитов крыс в процессе онтогенеза при потреблении коэнзима Q10 и таурина выявлена экспрессия каталазы (вероятность > 80%, Р < 0.05) в на фоне выраженного снижения уровня IGF-1 в сыворотке крови на 22% и 26% соответственно (Р < 0.01), что является свидетельством выраженной активации системы антиокислительной защиты.

6. В микросомальной фракции гепатоцитов крыс в группах, получавших коэнзим Q10 и пальмовое масло с коэнзимом Q10, не обнаружен цитохром Ь5 на поздних стадиях онтогенетического развития (12 месяцев), участвующий в десатурации и элонгации жирных кислот в печени, что комплементарно увеличению концентрации F2-изопростанов к этому периоду жизни на 78% и 20% соответственно (Р<0.01), и интенсивности неферментных процессов свободнорадикального окисления.

7. Полученные результаты свидетельствуют о формировании специфичных нутрипро-теомов микросомальной и цитозольной фракций гепатоцитов крыс при длительном потреблении коэнзима Q10 и таурина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, определенных ВАК

1. Кулакова С.Н., Корф И.И., Батурина В.А., Шарапова Н.Э., Карагодина З.В., Арутюнова М.Б., Тарасова И.Б. Влияние жирового компонента рациона и коэнзима Q10 на показатели липидного обмена в печени крыс в онтогенезе // Вопросы питания.-2011.- Т.80. - № 5. -С.24-29.

2. Карагодина З.В., Кулакова С.Н., Шарапова Н.Э., Батурина В.А., Сото, С.Х., Васильев A.B. Взаимосвязь изменений показателей ПОЛ, коэнзима Q10 и свободных жирных кислот в крови и печени крыс под влиянием жирового компонента рациона // Вопросы питания. - 2011. - Т.80. - № 6. - С.4-8.

3. Шаранова Н.Э., Васильев A.B.,. Гаппаров М.М.Г Влияние таурина на протеомный профиль цитозольной и микросомальной фракций гепатоцитов крыс в процессе онтогенеза // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,- 2012.- № 2 - с.158-162.

Материалы научных конференций

1. Кулакова С.Н., Корф И.И., Шаранова Н.Э., Карагодина З.В. Сравнительное влияние в эксперименте источников ПНЖК омега-3, как эссенциальных факторов питания, на показатели липидното обмена печени // Материалы XII Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов с международным участием «Питание и здоровье».- М., 2010. - С.39.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

IGF-1 - инсулиноподобный фактор роста

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ДК - диеновые конъюгаты

МДА - малоновый диальдегид

ИФА - иммуноферментный анализ

Заказ № 41-П/03/2012 Подписано в печать 12.03.2012 Тираж 130 экз. Усл. п.л.1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:1п/о@с/г.ги

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шаранова, Наталья Эдуардовна, Москва

61 12-3/752

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Шаранова Наталья Эдуардовна

Протеомная характеристика сыворотки крови, цитозольной и микросомальной фракций гепатоцитов крыс при адаптации к характеру

питания в процессе онтогенеза

03.01.04 - «Биохимия»

На правах рукописи

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

профессор Васильев А.В.

Москва - 2012

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

ЮР-1 - инсулиноподобный фактор роста

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ДК - диеновые конъюгаты

МДА - малоновый диальдегид

ИФА - иммуноферментный анализ

БАВ - биологически активные вещества

Содержание

1. Введение..................................................................................5

2. Обзор литературы. Современные проблемы нутрипротеомики...............9

2.1 Влияние белкового компонента пищи на особенности протеома различных структур клеток...............................................................9

2.2 Влияние жирового компонента пищи на особенности

протеома различных структур клеток................................................20

2.3 Влияние различных БА компонентов пищи на особенности

протеома различных структур клеток................................................28

3. Экспериментальная часть............................................................32

3.1 Материалы и методы.................................................................32

3.2 Результаты собственных исследований..........................................36

3.2.1. Исследование онтогенетических особенностей процессов метаболической регуляции адаптационного статуса клетки.....................36

3.2.2 Характеристика протеомных особенностей сыворотки крови, микросомальной и цитозольной фракций клеток печени

крыс в онтогенезе..........................................................................40

3.2.3 Исследование отдельных особенностей адаптационного статуса у крыс при включении в состав рациона таурина

на различных этапах онтогенеза........................................................42

3.2.4 Характеристика протеомных особенностей сыворотки крови, микросомальной и цитозольной фракций клеток печени крыс

при включении в состав рациона таурина............................................46

3.2.5 Исследование отдельных особенностей адаптационного статуса у крыс при включении в состав рациона

коэнзима Р10 на различных этапах онтогенеза....................................48

3.2.6 Характеристика протеомных особенностей сыворотки крови, микросомальной и цитозольной фракций клеток печени крыс

при включении в состав рациона коэнзима С>10....................................51

3.2.7 Исследование отдельных особенностей адаптационного статуса у крыс при модификации рациона по жировому компоненту

на различных этапах онтогенеза

53

3.2.8 Характеристика протеомных особенностей микросомальной

и цитозольной фракций клеток печени крыс при включении в состав рациона коэнзима <310 на фоне изменения

жирового компонента рациона........................................................58

3.2.9 Исследование протеомных особенностей сыворотки крови, микросомальной и цитозольной фракций клеток печени крыс при включении в состав рациона 010 и таурина

с использованием масс-спектрометрии...............................................64

4. Заключение..............................................................................77

5. Выводы....................................................................................85

6. Список литературы........................................................................87

ВВЕДЕНИЕ

Исследования последних лет в области генома и, в частности, нутригеномики показали, что знание нуклеотидных последовательностей, кодирующих геном, не позволяет в полной мере описать функционирование даже отдельно взятой конкретной клетки, не говоря уже об организме в целом, поскольку, если каждая клетка организма содержит одинаковую генетическую информацию, то именно функционирование белков определяет ее специфичность и это дало основание сформулировать понятие "протеом" [7, 169]. Под ним понимается совокупный набор белковых молекул конкретной клетки, являющийся продуктом реализации исходной геномной информации. Протеомика подразумевает инвентаризацию всех белков, закодированных в геноме определенного организма и их взаимодействий между собой [4]. Протеомные исследования направлены как на идентификацию белков в исследуемых объектах, так и на их функциональные изменения. В отличие от генома, протеом не остается постоянным, а меняется под воздействием внешних и внутренних факторов, поэтому при изучении изменений протеома под воздействием различным факторов можно выявить основные признаки, указывающие на характер таких воздействий. Таким образом, несмотря на уникальную (в норме) стабильность этого набора белков можно говорить о том, что состав протеомного пула не является просто маркером клеток и тканей, а представляет собой гибкую систему, реагирующую на изменения в организме [106]. Вместе с тем посттрансляционные события, в результате которых собственно и формируется протеомный пул, специфичность которого определяется эндогенными и экзогенными факторами, в настоящее время только становятся предметом системных исследований, среди которых актуальным является проведение нутрипротеомных исследований в области выявления специфичного действия биологически активных компонентов пищи природного происхождения [50, 103, 112].

Работа выполнена в соответствии с планом НИР НИИ питания РАМН в рамках темы № 105 «Пищевая и метаболическая регуляция энергетического статуса клетки при адаптации к характеру питания».

Целью настоящей работы явилось экспериментальное исследование отдельных нутрипротеомных особенностей сыворотки крови и субклеточных структур геиатоцитов крыс в процессе адаптации организма к характеру питания при включении в состав рациона биологически активных компонентов пищи являющихся одновременно естественными эндогенными медиаторами антиоксидантного и энергетического гомеостаза на различных этапах онтогенеза.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести протеомное картирование минорных компонентов сыворотки крови, микросомальной и цитозольной фракций клеток печени крыс на различных этапах онтогенетического развития при длительном включении в состав рациона микронутриентов - коэнзима 0*10 и таурина с параллельной оценкой показателей, характеризующих апоптоз, ферментные и неферментные маркеры ПОЛ.

2. Провести протеомное картирование минорных компонентов сыворотки крови, микросомальной и цитозольной фракций клеток печени крыс на различных этапах онтогенетического развития при модификации рациона по жировому компоненту на фоне введения коэнзима (^10 с параллельной оценкой показателей, характеризующих апоптоз, ферментные и неферментные маркеры ПОЛ.

3. Идентифицировать с использованием масс-спектрометрии пул протеомных различий, характеризующих адаптационные свойства организма в процессе онтогенеза.

4. Выявить характер взаимосвязи между протеомными особенностями сыворотки крови, микросомальной и цитозольной фракций и особенностями свободно-радикального окисления и интенсивностью апоптоза на используемых экспериментальных моделях.

Научная новизна

На основе протеомного картирования минорных компонентов сыворотки крови и субклеточных фракций клеток печени крыс с использованием двумерного электрофореза с последующим масс-спектрометрическим анализом

идентифицированы специфические протеомные пулы, характерные для различных этапов онтогенетического развития при алиментарных воздействиях, влияющих на энергетический и антиоксидантный гомеостаз.

Показано влияние потребления коэнзима (^10 и таурина на экспрессию каталазы в микросомальной фракции клеток печени крыс на фоне выраженного снижения уровня ЮБ-1 в сыворотке крови крыс.

Выявлено достоверное снижение интенсивности фермент-независимых процессов свободно-радикального окисления у животных, получавших рыбий жир в составе рациона в процессе онтогенеза.

Показано, что включение в состав рациона таурина и коэнзима С>10 повышает экспрессию лектина С-типа в цитозольной фракции клеток печени крыс на поздних сроках развития животных, что согласуется со снижением уровня процессов «позднего» апоптоза к 12-у месяцу жизни животных.

Практическая значимость работы

Результаты работы позволяют обосновать необходимость использования методов протеомной диагностики при нутрипротеомных исследованиях для идентификации протеомных маркеров с целью донозологической оценки действия алиментарных факторов.

Разработанный алгоритм нутрипротеомного исследования может быть использован для выявления белковых маркеров онтогенетических изменений и алиментарного воздействия.

Идентифицированные характеристические белки, отражающие изменение протеомного профиля сыворотки, цитозольной и микросомальной фракций клеток печени крыс в процессе онтогенеза при адаптации к характеру питания, могут быть использованы для обоснования соответствующей диетотерапии и профилактики алиментарно-зависимых заболеваний.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены на XII Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов с международным участием «Питание и здоровье» (Москва, 2010); на конкурсе молодых ученых XIII Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов с международным

участием «Персонифицированная диетология: настоящее и будущее» представленная работа заняла 3 место (Москва, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 работы, в том числе 3 статьи в научных рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ.

Положения, выносимые на защиту

■ Экспериментальные доказательства формирования специфичного протеома в процессе онтогенеза.

■ Экспериментальные доказательства формирования специфичного нутрипротеома при длительном потреблении биологически активных минорных компонентов пищи.

■ Экспериментальные доказательства формирования специфичного нутрипротеома при изменении состава макрокомпонента рациона в процессе онтогенеза.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ НУТРИПРОТЕОМИКИ

2.1 Влияние белкового компонента пищи на протеом различных структур клеток.

Начиная со второй половины XX столетия отмечается резкое возрастание внимания научной общественности к проблемам питания. Наука о питании стала мультидисциплинарной отраслью знаний, не только изучающей законы превращения пищи в организме и ее значение для здоровья человека, но и реальной силой, оказывающей активное влияние при решении важных социальных и экономических проблем современности. Анализируя развитие науки о питании, нельзя не подчеркнуть роль биохимии как ее теоретической основы, а также то, что выдающиеся успехи биохимии в области расшифровки путей метаболизма отдельных веществ в организме оказали решающее влияние на развитие науки о питании [112]. Современное учение о потребностях человека в пище получило выражение в концепции сбалансированного питания, согласно которой обеспечение нормальной жизнедеятельности возможно не только при условии снабжения организма адекватными количествами энергии и макронутриентов, но и при соблюдении достаточно сложных взаимоотношений между многочисленными незаменимыми факторами питания, каждому из которых в обмене веществ принадлежит специфическая роль. Вместе с тем качественные и количественные характеристики формулы сбалансированного питания в большей степени зависят от метаболических особенностей каждого биологического вида, выработанных в процессе длительной эволюции, от биохимической зрелости организма, от индивидуальных особенностей типа обменных процессов и т.д.[15].

Современная наука о питания ставит своей целью поддержание здоровья и предотвращение заболеваний. Концепция сбалансированного питания требует глубокого понимания механизмов идентификации и действия биологически активных веществ, а также доказательств их эффективности.

Все принципиальные успехи наук о жизни в т.н. «постгеномную эру» базируются на общем фундаменте - высокопроизводительных методах анализа все

возрастающего объема биологической информации: будь то секвенирование и анализ генома (геномика), экспрессии генов (транскриптомика), характеристика белков (протеомика), клеточных метаболитов (метаболомика, флаксомика) и прочих направлениях исследований в данной области, называемые общепринято «Омики». Основные задачи для «Омик» в биохимии питании до сих пор ещё только предстоит решить. В то же время некоторые из дисциплин «Омик» могут быть использованы в контексте своего классического применения, другие требуют специфического подхода, ориентированного на проблемы питания. Так, интеграция экспрессии генов и белков с метаболическим фингерпринтом до сих пор находится на начальной стадии своего развития, поскольку необходимо сформировать представление и критерии выбора значимого подмножества информации, а также как разрешить проблему в реальном времени, при котором белки и метаболиты появляются и действуют. «Омики» в питании должны быть особенно точны и высокочувствительны, поскольку для определения ранних отклонений от нормального состояния необходимо исследовать огромное количество сигналов, пиков и т.д. с низкой степенью интенсивности [152].

Структурно-пластические и биологически активные компоненты пищи напрямую или косвенно могут вызывать генную экспрессию. Данное утверждение имеет принципиальное значения для вопросов о биологической ценности пищевых продуктов (Рис.1).

Нутригеном ика

Д Н К /Р н К

Н утрипротеомика

Белковый профиль

Коли чествен ные изменения

По сттрансляционн ые модиф п к а ц п и

Н и а к о м о л с к у л я р и ы белковые в э а и м о л е ¡1 с т ни я

Функциональные изменения

Рис. 1. Нутрипротеомика характеризует влияние биологически активных компонентов пищи на протеом организма.

На клеточном уровне отдельные нутриенты могут выступать как лиганды рецепторов фактора транскрипции [103], в качестве межуточных метаболитов быть метаболизированы и изменять, таким образом, концентрацию субстратов и промежуточных продуктов [112], оказывать воздействие на сигнальные пути [50].

Метаболические превращения компонентов пищи и их метаболитов также служат контрольным механизмом генной экспрессии. Уровни стероидных гормонов в конечном счете образующиеся из холестерина, регулируются ферментами в многошаговом пути биосинтеза стероидов. Следовательно, специфическая комбинация аллелей для данных ферментативных этапов будет влиять на концентрацию лигандов.

Несбалансированное потребление любого из трёх основных макронутриентов (белков, жиров, углеводов) способствует инициации, развитию, прогрессу и/или усугублению хронического заболевания [111]. Потребление в пищу животных белков, по-видимому, коррелирует с повышенным риском развития хронических заболеваний, включая рак кишечника и колоректальный рак, а также сахарный диабет 2 типа [119]. Молекулярная эпидемиология предполагает, что определенные гены, такие как кодирующие эпоксидгидролазу, глутатион- S-тран сфер азу и другие детоксифицирующие ферменты могут изменяться под влиянием потребления белка животного происхождения [53, 185]. В попытках исследовать потребление белка и его последствия для организма на молекулярном уровне используется метабономика как инструмент для оценки эффективности и безопасности потребления аминокислот [148]. Метабономика -новая технология количественного измерения динамического мультипараметрического метаболического ответа живых систем при патофизиологических или генетических изменениях [142]. Изучение динамического зависимого от времени профиля метаболитов in vivo уже сегодня приносит полезную диагностическую информацию. Токсические эффекты, генетические и соматические заболевания могут проявляться нарушением синтеза некоторых белков. Однако, в конечном счете, происходит изменение управления биохимическими процессами, что отражается на соотношении концентраций многих эндогенных веществ в потоках биологических жидкостей [193].

Нарушение динамического равновесия в биологических жидкостях организма, вызванное заболеванием или интоксикацией, изменяет их качественный и (или) количественный состав. Для установления факта происходящих изменений необходимо одновременно определить множество метаболитов в широком диапазоне концентраций в плазме крови, моче или желчи. При этом используют образцы как после типовой пробоподготовки, так и без предварительного выделения.

Ни один пример так живо не иллюстрирует величину влияния потребления пищи на организм как последовательное наблюдение за эффектом снижения �