Клеточные механизмы нормального и репаративного роста печени млекопитающих

Кудрявцев, Борис Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клеточные механизмы нормального и репаративного роста печени млекопитающих
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Клеточные механизмы нормального и репаративного роста печени млекопитающих"

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ АКАДЕМИИ НАУК СССР

На правах рукописи УКД 576.362:575.224.234.2

КУДРЯВЦЕВ Борис Николаевич

КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ НОРМАЛЬНОГО И РЕПАРАТИВНОГО РОСТА ПЕЧЕНИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.00,25 - клеточная биология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учвной степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Санкт-Петербург 1991

Работа выполнена в Группе научно-методически* основ цитодиагностики и биотехнологического приборостроения Института цитологии АН СССР

Официальные оппоненты;

Доктор биологически* наук, профессор В.Я.БРОДСКИИ Доктор биологических наук, профессор Ю.Б. БАХТИН Член-корреспондент АН СССР, профессор А.Л.ПОЛЕНОВ

Ведущее учреждение: Латвийская медицинская академия

в " -/3 " часов на заседании Специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии АН СССР по адресу: 194064, С.Петербург, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии АН СССР.

Автореферат разослан "¿З " 199^ г.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологически* наук Л.Н. Писарева

Защита состоится

1992 г.

@ - Институт цитологии АН СССР

.5. -ЛИ: ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

; Актуальность проблемы. Проблема регенерации органов, вос-'становления их Функции, нарушенной в результате повреждения

--—-агентами различной природы, занимает важное место в современной биологии и медицине. Одним из классических объектов при исследовании этой проблемы является печень. Известно, что печень может не только значительно усиливать при необходимости свою Функциональную активность, но и обладает в то же время уникальной способностью к регенерации.

Несмотря на огромное число работ, посвященных различным аспектам регенерации печени (см., например, обзорьс Воронцова, 1953; Воронцова, Лиознер, 1955, 1957; Сидорова и др., 1966; Рябинина, Бенюш, 1973; Лиознер, 1975; Сидорова, 1976; Солопаев, 1980; Бродский, Урываева, 1981; Урываева, 1987; и др. ), которые в подавляющем большинстве проведены на лабораторных животных, несмотря на крупные достижения в этой области, актуальность дальнейших исследований регенерации печени не снижается. Это объясняется, во-первых, тем, что целый ряд вопросов был либо только слегка затронут, либо вообще не исследован. В частности, это касается клеточных механизмов регенерации нормального и патологически измененного органа, уровней органоспециФических Функций в процессе нормального и репаративного роста печени; причем наиболее слабо исследованы вопросы, связанные с регенерацией печени у человека. Во-вторых, внимание к усилению компенсаторных и регенераторных возможностей печени возрастает в связи с резким ухудшением экологической, санитарной и социальной обстановки, которое отмечается почти повсеместно. Ежегодно только вирусные поражения печени охватывают сотни тысяч людей в нашей стране, не говоря уже о таких социальных явлениях как алкоголизм, токсикомания и наркомания, которые непосредственно связаны с заболеваниями печени.

Любой патологический процесс в печени заключает в себе комплекс некрогенных и регенераторных реакций. От взаимоотношений последних, генетики организма и условий, в которых протекает заболевание, зависят Функциональная полноценность печени и в конечном итоге сохранение здоровья человека и даже его выживание. Отсюда можно заключить, какое важное значение в практическом и Фундаментальном плане имеют исследования клеточных механизмов регенерации и Функции печени человека при различных гепатопатологиях. К сожалению, в настоящее время данные в этом направлении практически отсутствуют.

Несмотря на то, что печень обладает громадными компенсаторными и регенераторными возможностями, последние все же ш беспредельны. Сложность лечения многочисленных заболеваний печени число которых растет с каждым годом, заключается в том, что применение лекарственных препаратов в данном случае ограничено I масштабах из-за того, что их использование затрагивает одну и: основных органоспецифичных Функций печени - Функцию детоксикации I тем самым ложится дополнительной нагрузкой на пораженный болезнь; орган. Пересадка печени, конечно, является радикальным способа лечения особенно тяжелых поражений этого органа (starzl et а1. 1987). Однако совершенно ясно, что такой подход никогда не буде массовым и магистральным в гепатологии. Остается только один путь закладывающий основы для обратимости патологических изменений печени - исследование кинетики клеточных популяций печени клеточных источников и механизмов нормального и репаративног роста печени, выявление способов усиления регенераторных возмож ностей органа, поиск оптимальных условий для протекани регенерации и глубокое знание существа Функциональных изменений происходящих в гепатоцитах в ходе развития патологическог процесса или при восстановлении органа. Очевидно также, что многи из этих вопросов не могут быть решены только на человеке, бе проведения экспериментов на лабораторных животных.

Нормальный и репаративный рост печени млекопитающих, как из вестно, может осуществляться: 1) путем увеличения числа клеток органе, 2) путем увеличения числа геномов в клетке, вследстви чего ее размер и масса увеличиваются, и, наконец, 3) путе гипертрофии клеток, связанной главным образом с увеличение размеров их цитоплазмы. В такой же последовательности можн расположить эти процессы по степени их изученности. Действи тельно, имеется значительное число работ, посвященных митоти ческой активности клеток в нормальной и патологически измененно печени. Сведения о полиплоидии ограничиваются главным образо констатацией изменений в количестве полиплоидных клеток ил установлением максимальных уровней плоидности, достигаемых гепа тоцитами. Роль гипертрофии клеток как Фактора роста ткан исследована крайне недостаточно. Очень мало сведений о коли чественном вкладе пролиферации, полиплоидии и клеточной гипер троФии в нормальный и репаративный рост печени, о Физиоло гической и биологической роли этих процессов. При этом печен человека остается наименее изученной.

В связи с вышесказанным основная цель настоящей работ заключалась в сравнительном исследовании клеточных механизмо

роста печени у млекопитающих (на примере печени человека и крысы) в ходе постнатального онтогенеза, при хроническом повреждении и регенерации нормального и патологически измененного органа. При этом важно отметить следующее: во-первых, большее внимание в работе будет уделено клеточной полиплоидии, не только как одному из компонентов роста органа, но и как явлению, Физиологическая и биологическая роль которого остается во многом неизвестной, во-вторых, определенное внимание будет уделено исследованию морфологических и Функциональных изменений в печени, на Фоне которых осуществляются процессы пролиферации, полиплоидизации и гипертрофии клеток.

Конкретные задачи работы состояли в следующем:

1. Сравнить кинетику клеточной популяции в печени человека и животных на различных этапах их постнатального онтогенеза.

2. Провести морФометрический анализ содержания соединительной ткани и исследовать состояние одной из тканеспецифичных Функций печени - гликогенной в ходе развития экспериментального цирроза печени и при усилении тяжести поражения печени у человека.

3. Сравнить кинетику клеточной популяции в печени человека и животных при хроническом повреждающем воздействии различных агентов на печень.

4. Определить относительный вклад клеточной пролиферации, полиплоидизации и гипертрофии в нормальный и репаративный рост печени при развитии экспериментального цирроза печени и при регенерации нормального и патологически измененного органа у крыс после проведения частичной гепатэктомии.

5. Исследовать у разных особей кинетику клеточных популяций и клеточные механизмы роста печени в ходе развития экспериментального цирроза печени и при регенерации патологически измененного органа в результате его частичной резекции.

6. Сравнить по различным Функциональным параметрам одноядерные и двуядерные клетки паренхимы печени различных классов плоидности.

7.Найти возможное объяснение полиплоидизации клеток печени в онтогенезе млекопитающих, различной частоте встречаемости полиплоидных клеток у разных видов.

Научная новизна работы. 1. Впервые подробно описана кинетика клеточной популяции паренхимы печени человека в различные периоды его постнатальной жизни. Показано, что заметная митотическая активность клеток печени отмечается лишь в первые годы после рождения человека, после чего она быстро снижается и достигает минимальных значений в периоде зрелости. В целом же пролиферативная активность гепатоцитов в

печени человека находится на значительно более низком уровне, че в печени крыс в сравнимые периоды жизни. Впервые показано, чт процесс полиплоидизации в печени человека сходен с таковым лабораторных животных, хотя и имеет ряд особенностей. Они состо? прежде всего в том, что переход клеток на путь полиплоидизац1 осуществляется в печени человека с гораздо меньшей интенсивность! чем в печени крыс и мышей. Вероятность вступления диплоидн! гепатоцитов человека на путь умножения генома возрастает лишь периоде старения, когда по сравнению с периодом зрелости несколь» усиливается ДНК-синтетическая активность гепатоцитов.

2. Впервые оценена роль и определены уровни полиплоидии гепатс цитов при различных формах и различной тяжести хроническог гепатита у человека. Это дало возможность показать, что репаре тивный рост печени человека, как и нормальный, осуществляете главным образом за счет митотических делений диплоидных гепатс цитов.Несмотря на возрастание полиплоидизации гепатоцитов пг усилении тяжести поражения печени, этот процесс играет ли! небольшую роль в репаративном росте печени человека. Характернс чертой процесса полиплоидизации при хроническом гепатите человека является ускоренное накопление двуядерных клеток с диплоидными ядрами.

3. Впервые проведена количественная оценка вклада размножен клеток, их полиплоидизации и гипертрофии в увеличение массы пeчe^ в ходе постнатального развития, в процессе развития экс периментального цирроза и регенерации нормального и патологическ измененного органа после его частичной резекции. При этом впервь показано, что клеточная гипертрофия, обусловленная увеличение размеров цитоплазмы клеток, является важнейшим Фактором нормаль ного и репаративного роста печени млекопитающих. Ocoбeн^ значителен вклад этого клеточного механизма роста органов увеличение массы печени в ходе постнатального развития животных Впервые при использовании методики получения повторных биопсий одного и того же животного показано, что относительный вкла полиплоидии и клеточной гипертрофии в репаративный рост печени разных животных может сильно отличаться, причем какая- либо свя; между этими процессами отсутствует.

4. Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие том, что при длительном хроническом повреждении печени крь четырех хлористым углеродом и при хроническом гепатите и цирроз печени у человека происходит усиленное накопление гликогена гепатоцитах. При этом степень гликогеноза нарастает по мер усиления тяжести поражения печени.

5. Обобщение данных по кинетике клеточной популяции гепатоцитов у крысц в ходе развития экспериментального цирроза печени и человека при хроническом гепатите и циррозе разной этиологии и степени тяжести позволило сформулировать представление о стадийности развития клеточной популяции паренхимы печени при ее длительном хроническом повреждении. На первом этапе, при относительно легкой степени поражения печени, регенераторные процессы в паренхиме характеризуются усилением полиплоидизации и гипертрофии гепатоцитов. Видовые особенности на этой стадии проявляются в большей выраженности процессов полиплоидизации и гипертрофии у крысы по сравнению с человеком. На следующей стадии происходит постепенное снижение темпов гипертрофии клеток, но особенно замедляется в этом случае скорость полиплоидизации гепатоцитов. Характерной чертой популяции гепатоцитов при длительном хроническом повреждении печени крысы является резкое снижение количества двуядерных клеток с диплоидными ядрами. В противоположность этому, в печени человека при усилении тяжести поражения печени количество двуядерных гепатоцитов с диплоидными ядрами постепенно увеличивается. Стадия, где процессы полиплоидизации и гипертрофии клеток стабилизируются, постепенно переходит в заключительную Фазу развития патологического процесса, которая имеет следующие особенности: значительно возрастает гетерогенность популяции гепатоцитов по уровню плоидности в различных микроучастках печени и усиливается пролиферация низкоплоидных, главным образом диплоидных гепатоцитов. Этиология хронического гепатита и цирроза оказывает лишь небольшое влияние на состояние и эволюцию клеточной популяции паренхимы печени при ее хроническом повреждении.

На основании собственных результатов и данных, имеющихся в литературе, впервые предложена гипотеза, объясняющая полиплоиди-зацию гепатоцитов в онтогенезе млекопитающих и разную частоту встречаемости полиплоидных клеток у разных видов.

Практическое значение работы. Результаты работы важны прежде всего для понимания существа процессов, происходящих в печени в ходе развития патологического процесса , и для объективной оценки состояния клеточной популяции паренхимы печени при различных хронических заболеваниях этого органа.

Результаты работы по исследованию содержания гликогена и его Фракций в гепатоцитах, полученные при анализе материала от более чем 300 пациентов, могут быть использованы для диагностики и прогноза хронических гепатитов и циррозов различной этиологии (Авт. свидетельство N' 1115722).

Способ получения изолированных гепатоцитов и приготовления

мазков клеток на предметных стеклах из материала прижизненнь пункционных биопсий печени может быть использован в клиническс практике для получения количественной информации о химическс составе клеток на очень ограниченном количестве материала (22).1

Цитофлуориметрические методы определения в клетках содержани ДНК (1, 3), гликогена и его Фракций (2, 4), комбинированнь цитоФотометрические методы определения в одной и той же клет» содержания гликогена, ДНК, сухого веса и 3н-тимидиновой мети (Авт. свидетельство № 78974-7), содержания РНК и ДНК (411 содержания белка и 3н-тимидиновой метки (26) и др. используются Институте цитологии АН СССР, Институте биологии развития АН СССР Агрофизическом интитуте и др. научных учреждениях АН и АМН СССР.

Методы количественной оценки кинетики слабопролиферируюпн-клеточных популяций печени человека и животных и вклада пролифе рации, полиплоидизации и клеточной гипертрофии в репаративный рос печени могут быть использованы для объективной оценки состояв клеточных популяций печени при ее хронических заболеваниях.

Результаты работы включены в курсы лекций по цитологии щ студентов биолого-почвенного Факультета СПбУ.

Апробация работы. Материалы работы докладывались на ] Всесоюзном симпозиуме по соматической полиплоидии (Ереван, 19771 на VI .VII и VIII Всесоюзных симпозиумах "Структура и Функ^ клеточного ядра" (Алма-Ата, 1977; Харьков,1980; Пущино, 1984), ь заседании Ленинградского научного общества патологоанатоме (Ленинград, 1978), на III Всесоюзном симпозиуме по медицинскс энзимологии (Астрахань, 1979), на Международной конференции г количественной микроскопии (Лейпциг, 1979), на I Всесоюзно симпозиуме "Генетические процессы в опухолевых клетках (Ленинград, 1980), на VI Всесоюзном совещании эмбриологов (Москве 1981), на Всесоюзных совещаниях "Люминесцентный анализ в медициь и биологии и его аппаратурное обеспечение" (Рига, 1981,1989), ь Всесоюзном совещании "Клеточная репродукция: сравнительные аспект и механизмы регуляции" (Ленинград, 1981), на конферен^ "Морфология и люминесцентная гистохимия" (Чебоксары, 1983), на V: научно-практической конференции патологоанатомов (Рига, 1984), ^ Всесоюзном семинаре "Автоматизация цитологических исследованиР (Киев, 1985), на VII Всесоюзной конференции по регенерации клеточному размножению (Москва, 1985), на городском семина[ "Патогенез и клинико-лабораторная диагностика эндогенной интс

^ — здесь и дол»» о и скоЛкйх указаны раОоты, приведенное п описке литературы о конце автореферата.

ксикации" (Ленинград, 1987), на конференции по медицинской биохимии "Молекулярные механизмы Формирования патологических состояний" (Ленинград, 1988), на конференции по проблемам биологии развития (Тбилиси, 1989), на совместном заседании Ленинградского научного общества микробиологов и эпидемиологов и Ленинградского отделения Всесоюзного научного общества инфекционистов (Ленинград, 1989), на городском семинаре по эндогенной интоксикации (Ленинград, 1989), на III Всесоюзном симпозиуме "Клеточные механизмы адаптации" (Чернигов, 1991), на Всесоюзной конференции "Функциональная морфология клетки" (С.Петербург, 1991).

Результаты работы неоднократно докладывались на научном семинаре Группы научно-методических основ цитодиагностики и биотехнологического приборостроения и обсуждались на Научном собрании Института цитологии АН СССР.

Главные результаты работы и сделанные на их основе выводы изложены в обобщенном виде в настоящем докладе.

Работа суммирует результаты собственных исследований автора которые были выполнены в 1974-1991 гг. в Лаборатории биохимической цитологии и цитохимии (зав.лабораторией д.б.н., профессор А.Д. Браун и д.б.н. С.А.Кроленко) и в группе научно-методических основ цитодиагностики и биотехнологического приборостроения Института цитологии АН СССР. В работе на разных ее этапах принимали участие ряд сотрудников других лабораторий Института цитологии АН СССР и других научных учреждений Ленинграда.

КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основная часть исследований проведена на печени самцов белых беспородных крыс. В работе также использовался биопсийный и автопсийный материал печени человека, полученный во II Санитарно-гигиеническом медицинском институте (кафедра инфекционных болезней). Военно-медицинской академии им.Кирова (каФедра военно-полевой хирургии),клинике для ветеранов войны и труда и детской больнице № 10. Кроме того, в работе использовался материал печени различных видов млекопитающих, полученный в Ленинградском зоопарке. Зоологическом институте АН СССР и в экспедициях.

Работа проведена на мазках изолированных гепатоцитов, которые получали либо путем перфузии печени смесью равных объемов 0.067М фосфатного буфера (рН 8,0) и 5'/.-ного р-ра сахарозы (6), либо с помощью методики щелочной диссоциации ткани печени, предварительно

Фиксированной ЮУ.-ным нейтральным формалином (Белов и др., 1975 Мазки изолированных гепатоцитов из биопсий печени человека и кры приготавливали с помощью оригинальной методики (22). В качест основных методов исследования использовалась абсорбционная Флуоресцентная цитоФотометрия, микроинтерферометрия и авторади граФия. Ряд методических разработок, используемых в работ являются новыми. К ним, в частности, относятся: цитоФлуор метрический метод определения содержания суммарного гликогена ( и его легкодоступной и труднодоступной Фракций (4) в изол рованных гепатоцитах, комбинированные цитоФотометрические мето определения в одной и той же клетке: сухого веса, гликогена, ДНК 3Н-тимидиновой метки (8,12), содержания белка и 3Н-аминокислотн метки (26), содержания ДНК и 3Н-тимидиновой метки (42), содержан ДНК и РНК (41). Более подробная характеристика объектов исслед вания, способов изоляции и Фиксации клеток, методов измерения то или иного вещества в клетке описаны в статьях, приведенных списке литературы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РОСТА ПЕЧЕНИ КРЫС В ПОСТНАТАЛЬНОМ

ОНТОГЕНЕЗЕ

1.1. Исследование процессов пролиферации и полиплоидизации паренхиме печени после рождения животных

Интенсивный рост печени в эмбриональном периоде развит (Кудрявцева, 1967 ) продолжается и после рождения животных, первые 6 мес жизни вес печени крыс увеличивается примерно в раз. При этом обращает на себя внимание не только высокий те увеличения веса печени, но и его неравномерность в различи интервалы времени (таблица 1).

Параллельно быстрым ростовым процессам происходят больш изменения в составе клеточной популяции печени. Известно, ч после рождения печень млекопитающих некоторое время сохраня Функцию миелоидного кроветворения. МорФометрический анализ срез печени, окрашенных гематоксилин-эозином, показал, что объем гем поэтической ткани в печени крыс в возрасте 1 сут после рожден составляет 5,3 '/., в возрасте 7 сут - 2,2 "/., а у двухнедельн крысят - лишь 0,2 '/.. У взрослых животных основную массу пече (около 90 У. ) составляют клетки ее паренхимы, популяция котор претерпевает сложные и закономерные изменения в течение пос натальной жизни.

Пролиферативная активность гепатоцитов, высокая в пренатальн периоде ( Заварзин, 1967 ), после рождения животных быст

ТАЛЛИНА 1. ИЗМЕНЕНИЯ МАССЫ ПЕЧЕНИ И ПОКАЗАТЕЛЕЙ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИХ КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РОСТА ПЕЧЕНИ, В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВОЗРАСТА ЖИВОТНЫХ

Воз- Масса печени Сухая масса Средняя плоидн. Сухая масса Относит.число рост, гепатоцита гепатоцитов на 2с-гепат. гепатоцитов

сут мг пг с пг

1 245.4-13.0 364. 0-23. 4 2. 00 364. 0-23. 4 1.00

(232. 4-12. 0)

7 450. 0-32. 0 446. 3-20. Э 2. 00 446. 3-20. 9 1. 54

( 440. 0-31. 0)

14 674. 4-56. 7 500. 0-20. 9 2. 01±0. 01 498. 0^0. 8 2. 11

21 1135. 5-77. 3 717. 9-26. 7 2. 40-0. 06 598. 3-22. 0 2. 59

30 1Э68. 7-98. 6 890. 9-29. 3 2. 96±0. 08 601. 9-21.2 3. 46

60 6200. 0-240. 2 1163.1-46. 4 3. 83-0. 10 607. 3-24. 0 8. 35

ISO 11750. 0-420. 0 1306. 3-44. 3 3. Э8±0. 09 645. 2-21. 5 14. 09

Примечания. 1. В таблице указаны средние значения - ошибка среднего.

2.В скобках указана масса паренхимы печени за вычетом массы гемопоэтической

ткани. 3. с- гаплоидное содержание ЛИК.

снижается. Количественная характеристика процессов репродукции клеток в печени являлась предметом многочисленных и обширных исследований ( Post, Hoffman, 1964, 1965; Grisham, 1969; Tsanev, 1975; schultze et al., 1978 ). Основным методом исследования этих процессов является метод авторадиогра$ии. Эффективность использования этого метода оказывается, однако, далеко не всегда высокой из-за быстрого падения ДНК-синтетической активности гепатоцитов после рождения животных. По нашим данным, у недельных крысят индекс однократно меченных 3Н-тимидином гепатоцитов составляет 6,60 - 0,73 7., на 14-е сут - 1,52 - 0,14 У., на 21-е сут - 1,2 -0,13 '/., в то время как у крысят в возрасте 1 мес лишь 0,88 - 0,19 '/. гепатоцитов оказывались мечеными. У взрослых животных индекс

меченых гепатоцитов составлял сотые доли процента. Ясно, ч получение полноценной информации о продолжительности клеточно цикла и его отдельных Фаз, о соотношении пролиФерирующих вышедших из цикла клеток и о других показателях репродуктивн активности клеток оказывается в данном случае очень трудной, после 3-й нед постнатальной жизни и практически невозможн задачей. В этой ситуации единственным показателем, позволяют судить о состоянии пролиферативных процессов в клеточной поп ляции, является процесс полиплоидизации гепатоцитов, протекают на Фоне ослабления их ДНК-синтетической активности.

Интенсивная полиплоидизация клеток в печени крыс происход после 3-й нед постнатального развития. Характерной особенност процесса полиплоидизации в печени лабораторных животных являет чередование ацитокинетического митоза одноядерных гепатоцитов бимитоза двуядерных гепатоцитов ( Nadal, Zajdela, 1966; Brodsk Uryvaeva, 1977 ), которое может привести к образованию клет высоких степеней плоидности.

Анализ гистограмм распределения ядер и клеток по содержанию Д показывает, что в течение первых двух недель после рождения кр практически вся клеточная популяция паренхимы печени состоит одноядерных диплоидных гепатоцитов ( ОД-гепатоциты ). Двуядерн гепатоциты с диплоидными ядрами (ДД-гепатоциты) на 14-е сут пос рождения составляют 1.17 7. гепатоцитов, на 21-е сут - 4.93 тогда как на 30-е сут эти клетки составляют более половины вс популяции гепатоцитов (52.9 %). После этого происходит снижен относительного числа ДД-гепатоцитов и постепенное накопление популяции одноядерных тетраплоидных- гепатоцитов ( ОТ-гепатоцитов и клеток более высоких классов плоидности. У взрослых кр ОТ-гепатоциты составляют около 80 7. клеток паренхимы печени.

Вследствие низкой митотической активности гепатоцитов после 2 нед постнатального развития животных для исследования кинети таких слабопролиФерирующих клеточных популяций был применен нов подход, основанный на регистрации частот одноядерных и двуядерн гепатоцитов разных классов плоидности в ходе постнатально развития ( 38, 51 ). Предлагая этот метод, мы исходили из тог что данные о динамике полиплоидии содержат в себе более богат информацию о процессе полиплоидизации клеток и их пролиферативн активности, чем та, которую обычно получают, используя трудоемк цитоФотометрические измерения. Информация о кинетике слабопр лиферирующих полиплоидизирующихся клеточных популяций печени мож быть получена путем сравнения экспериментальных данных по кинети полиплоидизации гепатоцитов с математической моделью процесс

которая основана на обобщенной схеме полиплоидизации гепатоцитов, предложенной для печени лабораторных животных (Nadal, zajdela, 1966; Brodsky, uryvaeva, 1977). Метод позволяет определить скорости переходов гепатоцитов (относительное число клеток в единицу времени) из одного класса плоидности в другой, коэффициенты изменения митотической активности гепатоцитов при увеличении степени их плоидности и скорости гибели клеток в популяции.

Исследование показало, что расчетные кривые относительного числа одноядерных и двуядерных клеток классов плоидности хорошо описывают реальный процесс частот встречаемости гепатоцитов с возрастом животных

изменения различных изменения (Рис. 1

г 16 зо чч 5в.су? о г * б мес.

Рис.1. Изменение относительного числа гепатоцитов разных классов плоидности в ходе постнатального развития крыс (а) и у взрослых крыс, начиная с возраста 6 мес (б). 1- 2с; 2- 2с*2; 3- 4с; 4-4с* 2; 5- 8с.

Для альтернативной проверки метода проведено исследование процесса изменения во времени количества 3Н-тимидиновой метки в гепатоцитах различной плоидности после однократного введения изотопа новорожденным крысятам (51). В этом случае использовалась методика определения в одной и той же клетке содержания ДНК и количества 3Н-тимидиновой метки (42). Используя математическую модель процесса разведения изотопной метки в гепатоцитах в результате митотических делений и полиплоидизации клеток, определили скорости переходов клеток из одного класса плоидности в другой. Они оказались близки к значениям, полученным в результате

применения модели по изменению частот встречаемости гепатоцит различных классов плоидности (Табл.2).

Полученные данные позволили сделать вывод о правильное принципов построения моделей. Проверка устойчивости обоих модел к возмущающему влиянию ошибок эксперимента показала, ч Таблица 2. Относительные скорости переходов клеток в печени

новорожденных и взрослых крыс для двух типов моделей (А- по кинетике полиплоидизации и Б- по разбавлению метки )

Модель Начальные скорости перех одов( нед" 1 ) о а

2с- 2с 2с-2с«2 2с- 4 с 2с« 2 -4с %

А.Новорожденные 0. .33 0.13 0. 00 0. 19 0.35 5.2

А.Взрослые 0. .03 0.06 0. 00 0. 54 0. 06 1.0

Б.Новорожденные 0. .27 0.06 0. 00 0. 08 0.48 4.1

Примечание: « - коэффициент изменения пролиферативной активное гепатоцитов при увеличении их плоидности; ^ - мера соответств! экспериментальных данных расчетным .

применение модели, основанной на кинетике полиплоидизации клето предпочтительнее, особенно на поздних сроках постнатальной жиз животных.

Представленные в таблице 2 данные позволяют заключить, что (1 на ранних стадиях онтогенеза соотношение полных и ацитокинет ческих митозов в печени крыс составляет примерно 3 : 1, в то вре как в печени взрослых животных оно иное и составляет пр близительно 1 : 2; (2). в нормальной печени крыс наиболее вер ятный путь полиплоидизации гепатоцитов проходит через стадию о' разования двуядерных клеток; скорость прямого перехода 2с — практически равна нулю.

1.2. Исследование динамики гипертрофии гепатоцитов в ходе постнатального развития крыс

В отличие от кинетики пролиферации и полиплоидизации клето динамика клеточной гипертрофии в ходе постнатального роста печ ни исследована значительно менее подробно. Результаты интерфер метрического анализа сухого веса гепатоцитов у крыс на различи стадиях постнатального развития представлены в табл.1, представленных данных следует, что с момента рождения до I

месячного возраста происходит постоянное увеличение сухой массы клеток. Сухая масса гепатоцитов за этот период увеличивается примерно на 250 У. , причем наибольший прирост сухой массы гепатоцитов происходит в период от 14 до 21 сут. Этот период, когда крысята перестают питаться молоком матери и переходят на самостоятельное питание, характеризуется появлением в печени ряда новых ферментов углеводного обмена, появлением циркадных ритмов гликогена, сильными гормональными перестройками в организме, дальнейшей интенсификацией Функций печени (Walker et al., 1974; Greengard, 1977), В дальнейшем темпы прироста сухой массы гепатоцитов несколько снижаются, оставаясь все же на довольно высоком уровне до 2 мес после рождения животных. В период от 2 до 6 мес сухая масса гепатоцитов увеличивается лишь на 10 У..

Увеличение сухой массы гепатоцитов, которое, как полагают, объективно отражает увеличение содержания макромолекулярных веществ в клетке, главным образом белков (Бродский, 1966; Бенеке, 1969), может быть обусловлено как полиплоидизацией клеток, так и гипертрофией, не связанной с ДНК-синтетической активностью клеток. Для определения вклада гипертрофии, не связанной с размножением клеток, в увеличение сухой массы гепатоцитов вычисляли среднюю сухую массу m в расчете на диплоидный гепатоцит, равную m=(p/G) 2, где р - средняя сухая масса гепатоцитов, g - их средняя плоидность (табл.1). Оказалось, что сухая масса в расчете на диплоидный гепатоцит постепенно увеличивается с 364.0 - 23.4 пг у новорожденных крысят до 598.3 - 20.2 пг у животных в возрасте 21 сут. В дальнейшем этот показатель изменялся незначительно. В отличие от результатов, полученных Джеймсом с соавт. (James et al., 1979), результаты полученные нами свидетельствуют, что на всех сроках постнатального развития гепатоциты накапливают белок строго пропорционально степени их плоидности (16). Полученные данные свидетельствуют о значительном вкладе гипертрофии клеток, не связанной с их размножением, в рост печени, особенно на ранних стадиях постнатального развития крыс.

1.3. Количественный анализ вклада отдельных клеточных компонентов роста в увеличение массы крыс Известно, что рост печени, как и любого другого органа, в принципе может осуществляться тремя способами: путем увеличения числа клеток в результате обычных митотических делений (пролиферации), путем увеличения числа геномов в клетках (полиплоидизации), которое приводит к пропорциональному возрастанию веса клеток (Rigler, 1962; Fukuda et al., 1979; 16,

28) и путем гипертрофии клеток, не связанной с процесса» пролиферации и полиплоидизации и обусловленной главным образе ростом цитоплазмы. При исследовании ростовых процессов, кг правило, ограничиваются описанием какого-либо одного из этих тре клеточных компонентов роста. Анализ подобных данных не дае четкого представления о соотношении процессов пролиФерацт полиплоидизации и гипертрофии гепатоцитов в постнатальнс онтогенезе , о количественном вкладе этих процессов в увеличен* массы печени на разных стадиях развития животных. Известна ли! одна работа, в которой сделана попытка решить эту проблему (Дело! и др., 1987). В нашей работе для количественного анализа рост развивающейся печени применена методика, исключающая трудоемк! процесс подсчета абсолютного числа гепатоцитов. На разных стали) постнатального развития крыс определяли массу печени, распр! деление гепатоцитов по содержанию ДНК, среднюю плоидность клеток сухую массу отдельных гепатоцитов (табл.1). Анализ этих параметр« и специальные расчеты позволили оценить относительный вкл. процессов пролиферации, полиплоидизации и гипертрофии в ро( печени крыс на разных этапах постнатального развития животн! (49). Основные уравнения, использовавшиеся при расчетах, приведе: ниже.

Относительное увеличение числа гепатоцитов в печени N определенный промежуток времени рассчитывали по Формуле:

N = МР£ /Р2 .

Увеличение массы печени за счет увеличения числа клет! (относительно общего прироста массы органа) определяли I

Формуле:

_ МР /р2 - 1 М - 1

Относительное увеличение массы печени за счет увеличения чис геномов в клетках (полиплоидизации) 02 определяли «ормуле: =

2 (м - 1) Р2

Относительное увеличение массы печени за счет гипертрофи клеток, не связанной с увеличением числа геномов в них о рассчитывали по Формуле: мд (т - в )

(м -1) Р2

где: м - величина, показывающая во сколько раз увеличила масса печени за исследуемый период развития; р и р- средн

сухая масса гепатоцитов; g, и д2 - средняя плоидность гепато-цитов, деленная на 2; и,и «г - рассчитанная на диплоидный гепатоцит средняя сухая масса. Индексы 1 и 2 соответствуют началу и концу исследуемого периода.

Среднюю плоидность клеток g рассчитывали по формуле:

G = 2 1 п ,

i = О

где: п.- относительное число гепатоцитов i-того класса плоидности ( i=0 - диплоидный класс, i=l - тетраплоидный класс и т.д. ) (Делоне и др., 1987).

Результаты расчетов по приведенным выше Формулам относительного вклада процессов пролиферации Q,, полиплоидизации Q, и гипертрофии Q3 гепатоцитов в рост развивающейся печени крыс представлены в табл.3.

Таблица 3. Относительный вклад основных компонентов роста в увеличение массы печени на разных стадиях постнатального развития крыс

Стадия Вклад процесса Вклад процесса Вклад процесса

развития, пролиферации. полиплоидизации, гипертрофии.

сут 7. г 7.

1-7 61 0 39

7-14 68 2 30

14-21 30 32 38

21-30 51 47 2

30-60 65 34 1

60-180 76 8 16

Расчеты показывают, что вклад основных клеточных компонентов роста в увеличение массы печени крыс претерпевает значительные изменения на различных стадиях постнатального онтогенеза. В увеличение массы печени в раннем постнатальном периоде (с момента рождения до 14- сут) наибольший вклад, по сравнению с другими периодами, вносят пролиферация и гипертрофия клеток, которая может быть обусловлена увеличением количества и размеров различных органоидов и других компонентов цитоплазмы вследствие интенсификации Функций печени. Значительный вклад полиплоидизации гепатоцитов в увеличение массы печени характерен для периода с 14-х по 60-е сут. Рост печени от 2 до 6 мес обеспечивается в основном пролиферацией гепатоцитов, вклад которой в рост органа оказывается в этот период наибольшим.

2. КИНЕТИКА КЛЕТОЧНОЙ ПОПУЛЯЦИИ ГЕПАТОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА В ХОДЕ ПОСТНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА

2.1. Исследование уровней плоидности клеток паренхимы печени человека в разные периоды его жизни

В настоящее время имеется несколько десятков работ посвященных изучению проливеративных процессов в печени человека тем не менее многое из того, что касается кинетики клеточно популяции в этом органе, клеточных механизмов роста печени способов образования полиплоидных клеток, остается неизвестным Подавляющее большинство работ, относящихся к изучению клеточнс популяции нормальной печени человека, проводилось на ограничение количестве материала и почти все они посвящены исследовани какого-либо одного, как правило, узкого отрезка времени, н протяжении которого прослеживалось состояние репродуктивнь процессов в органе. В большинстве исследований о состоянии особенностях репродуктивных процессов в печени на разных этапа жизни судили на основании изменений, происходящих в уровн плоидности гепатоцитов. Характерной особенностью работ, посвя щенных исследованию полиплоидии клеток паренхимы печени человека является то, что большинство из них выполнено на срезах ткани и^ на изолированных ядрах. Это обстоятельство не позволяет достаточной надежностью судить о процессе полиплоидизации в печен человека.

Цитофотометрический анализ содержания ДНК на мазках изолирс ванных гепатоцитов, полученных из нормальной печени 155 человек возрасте от 1 сут после рождения до 92 лет, показал, чт полиплоидные клетки в печени человека появляются в возрастнс группе 1-5 лет. Однако далее в ходе постнатального развития у относительное количество увеличивается незначительно(рис.2). В конце периода интенсивного роста органа доля полиплоидных клетс в печени человека не превышает ЗУ.. Двуядерные клетки с диплоидныь ядрами присутствуют уже в эмбриональной печени (на уровне 4-5"/. с всей клеточной популяции гепатоцитов). После рождения их 4hcj медленно возрастает и достигает в возрастной группе 16-20 ле 7.1%. Из этого следует, что постнатальный рост печени человеке когда вес органа увеличивается почти в 12 раз (Boyd,i94i: осуществляется главным образом путем митотических делений ОД-гепс тоцитов, относительное количество которых на всех этапах постне тального развития превышает 90'/..

В периоде зрелости (от 21 до 50 лет), когда рост пече! практически прекращается, уровни плоидности гепатоцитов измен)

10 20 30 40 50 60 70 80 90

Рис.2. Относительное число гепатоцитов различны* классов плоидности в разные периоды постнатальной жизни человека. По оси абсцисс - годы; по оси ординат - доля гепатоцитов классов плоидности (в 7.7.); 1- 2с; 2- 2с»2; 3- 4с.

различных

ются незначительно* продолжает медленно снижаться доля ОД-гепа-тоцитов (до 847. в конце периода) и столь же медленно нарастает численность двуядерных гепатоцитов с диплоидными ядрами (ДД-ге-патоциты). Количество полилоидных клеток, хотя и увеличивается в несколько раз, составляет в конце периода лишь 77. от всех гепатоцитов.

При старении, на Фоне атрофии печени человека, происходит ускорение полиплоидизации гепатоцитов. В возрастной группе 86-92 года доля ОД-гепатоцитов составляет около 607., ДД-гепатоцитов -примерно 167., а полиплоидные клетки все вместе составляют около 257. от всей клеточной популяции паренхимы печени. Максимальные уровни плоидности, достигаемые гепатоцитами нормальной печени человека в периоде старения, составляют для одноядерных клеток 16с, а для двуядерных - 8с«2.

2.2. Кинетика клеточной популяции гепатоцитов в ходе постнаталь-ного роста печени, в периоде зрелости и при старении

Многие авторы, отмечая высокую скорость роста печени человека после рождения, приходят в то же время к заключению, что мито-

тическая активность гепатоцитов находится на чрезвычайно низке уровне (Ashworth, Reid, 1947; Swartz, 1956). Количество клеток находящихся в s-фазе, в нормальной печени человека колеблется, п данным разных авторов, от 0.02-0.05 ( Leevy, 1963, 1967; Takehai et al., 1975) до 0.43-0.607. ( Ranek, 1976; Koike et al., 1982) Очень слабая пролиферативная активность клеток печени человек ставит серьезные препятствия в изучении кинетики клеточне популяции в этом органе. В связи с этим для исследования кинетик клеточной популяции в паренхиме печени человека мы использоваг метод (42,52), кратко представленный в разделе 1.1, которь основан на определении относительного количества одно-двуядерных гепатоцитов различных классов плоидности на разнь этапах постнатальной жизни организма.

После рождения жизнь человека, как и других млекопитающих разделяют на три основных периода: период развития (роста) репродуктивный период (период зрелости) и период старени (Канунго, 1982). Границы этих периодов для человека составляк 0-20 лет, 21-50 лет и после 50 лет соответственно.

Результаты определения относительных скоростей переходов межг гепатоцитами различных классов плоидности в разные периоды жизн человека представлены в табл.4.

Представленные в табл.4 результаты свидетельствуют, чте во-первых, пролияеративная активность гепатоцитов (сумма все переходов,кроме перехода 2сх2--4с) в начале периоде развит человека более чем в 60 раз превышает таковую в периоде зрелости в 20 раз - активность гепатоцитов в периоде старения. При эте ТАБЛИЦА 4. ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ СКОРОСТИ ПЕРЕХОДОВ КЛЕТОК В ПЕЧЕНИ ЧЕЛОВЕКА В РАЗНЫЕ ПЕРИОДЫ ЖИЗНИ

Возрастной Относительные скорости переходов а а

период, лет 2с-2с 2с-2с*2 2с-4с 2с«2-4с '/.

0 1.10 0.12 0. 00 0. 04

5 0. 98 0.11 0. 00 0. 04 0 1. 10 9. 5

10 0.77 0. 08 0. 00 0. 03

15 0. 46 0. 05 0. 00 0. 02

21- 50 0. 012 0. 008 0. 000 0. 040 0. 005 0. 50 1. 6

51- 92 0. 022 0. 028 0. 012 0. 041 0.100 1. 25 3. 1

Примечание: Скорости переходов даны в расчете на период 5 лет. См. также примечание к табл.2.

следует отметить, что скорость перехода 2с--2с в периоде интенсивного роста печени почти на порядок превышает скорости всех других переходов между клетками в это время. При стабилизации роста печени, в интервале от 21 до 50 лет, скорости митотического размножения ОД-гепатоцитов и образования ДД-гепатоцитов резко падают. В ходе старения, когда резко возрастает гибель клеток, наблюдается некоторая активизация 2с--2с и 2с--2с*2-переходов. Скорость перехода 2с--4с в печени стареющего человека остается примерно на том же уровне, но появляется прямой переход 2с--4с. Во-вторых, ^процесс полиплоидизации гепатоцитов в печени человека в целом следует общепринятым схемам полиплоидизации, описанным для печени грызунов (Nadal, Zajdela, 1966; Brodsky, Uryvaeva, 1977, 1985).

В то же время процесс полиплоидизации в печени человека характеризуется рядом особенностей: (1).В периоде развития, когда происходит быстрое увеличение веса печени, характеристики процесса полиплоидизации приближаются к тем, которые описаны для печени крысы. Так же, как и у крысы, ОД-гепатоциты, прежде чем вступить на путь увеличения числа геномов в клетке, способны несколько раз пройти цикл самовоспроизведения. Однако, если у крысы после рождения на один полиплоидизируюшийся гепатоцит приходится примерно 3 гепатоцита, делящихся обычным митозом, у человека в это время лишь каждый десятый гепатоцит вступает на путь полиплоидизации; (2). В периоде зрелости, когда ростовые процессы стабилизируются, гепатоциты человека, начавшие синтез ДНК, с равной вероятностью делятся обычным митозом и вступают на путь полиплоидизации; (3). Сдвиг в сторону преобладания процессов полиплоидизации становится еще более заметным в стареющей печени. ,В этом периоде на одну клетку, делящуюся обычным митозом, приходится 2-3 полиплоидизирующиеся клетки. Особенностью полиплоидизации клеток в периоде старения человека является также появление нового перехода, который прямо превращает ОД-гепатоцит в тетраплоидный, минуя стадию двуядерности.

3. КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕПАРАТИВН0Г0 РОСТА ПЕЧЕНИ КРЫС В ХОДЕ РАЗВИТИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЦИРРОЗА ПЕЧЕНИ, ВЫЗВАННОГО ДЕЙСТВИЕМ

cci4.

Наиболее заметное и важное место среди многочисленных заболеваний печени занимают хронические поражения этого органа. Их значимость обусловлена в первую очередь тем, что целый ряд заболеваний, таких как цирроз, рак и другие, развивающиеся обычно в течение длительного периода времени, являются одной из наиболее

частых причин смертности населения. Хронические гепатиты особенно часто встречающиеся поражения печени. Хронический гепатит - это длящееся более 6 мес воспалительное заболевание печени, развивавшееся обычно на базе острого гепатита и способное эволюировать в конечную стадию своего развития - цирроз.

Существует большое количество экспериментальных моделей получения цирроза печени у животных. В нашей работе мы использовали затравку животных парами четыреххпористого углерода (сс14) в специальной камере 2 раза в неделю. Через 6 мес такого воздействия у крыс развивался типичный цирроз печени.

3.1. Морфофункциональные изменения в печени крыс в процессе развития цирроза печени при действии сс14

У крыс, подвергавшихся в течение 6 мес воздействию сс14, гистологическое строение печени резко изменено: паренхима разделена тяжами соединительной ткани на так называемые ложные дольки. Внутри ложных долек трабекулы гепатоцитов расположены беспорядочно, а центральные вены отсутствуют. Содержание соединительной ткани в циррозной печени, которую мы определяли морфометрически на препаратах, окрашенных по Ван-Гизону, увеличивалось в среднем в 5 раз. При этом у отдельных животных доля соединительной ткани варьировала от 1.1'/. (в норме она составляла в среднем 1.4%) до 15. V/.. Площадь, занятая кровеносными сосудами, также увеличивалась в циррозной печени.

Наряду с морфологическими изменениями в печени при развитии цирроза происходят и значительные изменения в Функции гепатоцитов. Одной из важнейших функций печени в организме является ее участие в поддержании постоянного уровня глюкозы в крови. Существенным показателем состояния этой функции является содержание гликогена в гепатоцитах. Можно предположить, что любое поражение печени будет в той или иной степени затрагивать процессы синтеза и расшепления гликогена и тем самым отражаться на его уровне в клетках.

Быстрое падение уровня гликогена в печени в результате острого воздействия токсических агентов или проведения хирургической операции - хорошо установленный факт. Содержание гликогена в гепатоцитах через 6 ч после перорального введения смеси сс14 в касторовом масле из расчета 0.2 мл на 100 г веса тела снижалось, по нашим данным, в 170 раз и далее оставалось на низком уровне в течение 5 сут.

В отличие от острого воздействия гепатотропным ядом

хроническое его воздействие в течение 6 мес приводило у крыс к повышению содержания гликогена в гепатоцитах в среднем на 807. по сравнению с контролем. Поскольку содержание гликогена в гепатоцитах при прочих равных условиях определяется их размерами (Ньюсхолм, Старт, 1977), в данном случае учтено влияние полиплоидии и клеточной гипертрофии, которые приводят к увеличению размеров клеток.

Вышеприведенные данные показьвают, что при хроническом воздействии повреждающего агента в печени происходят серьезные изменения в структуре и Функции клеток. Что же происходит в клеточной популяции паренхимы печени в ответ на эти изменения и потерю клеток? Какими путями происходит восстановление массы и Функции печени? Чем отличаются клеточные механизмы репаративного роста печени от таковых нормального постнатального роста? Какие качественные различия в соотношении клеточных механизмов наблюдаются в ходе нормального и репаративного роста печени? Все эти вопросы остаются до сих пор плохо разработанными.

3.2. Кинетика полиплоидизации гепатоцитов в ходе развития экспериментального цирроза печени у крыс.

Изменения уровней плоидности гепатоцитов в ходе развития экспериментального цирроза изучались на двух группах крыс, одна из которых подвергалась хроническому воздействию сс14, а другая служила одновозрастным контролем. У каждого из животных контрольной и опытной групп последовательно получали биопсии печени в начале эксперимента и затем через 3 и 6 мес после начала опыта. Таким образом, имелась возможность оценить изменения в клеточной популяции печени у разных особей.

У контрольных крыс за 6 мес эксперимента происходили лишь небольшие изменения в клеточной популяции, касающиеся главным образом ДД-гепатоцитов, доля которых в целом снижалась. Наблюдались, однако, заметные индивидуальные колебания по этому параметру. Среднее число геномов на гепатоцит составляло в начале опыта 4.17-0. 07с, через 6 мес - 4. 26^0. 06с.

У животных опытной группы общее число двуядерных клеток резко сокращалось уже через 3 мес после начала воздействия сс14, причем наиболее заметные изменения происходили в количестве ДД-гепатоцитов. У некоторых животных в это время, несмотря на достаточно представительную выборку (более 1000 клеток), не удавалось обнаружить ДД-клеток в популяции. Вместе с тем в печени появляются 8с»2-, 16с«2- и 32с-гепатоциты, которых не было у животных

контрольной группы. Колебания в составе клеток разных классов плоидности у разных особей гораздо более заметны по сравнению с контрольной группой крыс. Наиболее значительные изменения в клеточной популяции паренхимы печени приходятся на первую половину эксперимента, когда наблюдается резкое снижение числа ОД- и ДД-гепатоцитов и повышение среднего уровня плоиднности клеток на 297. по сравнению с исходным уровнем. В дальнейшем происходит лишь небольшое увеличение уровней плоидности клеток, в среднем на 17. по сравнению с тем, что наблюдается через 3 мес.

Клеточная популяция гепатоцитов при хроническом воздействии на животных сс14 характеризуется не только усилением полиплоидизации паренхимы, но и увеличением ее гетерогенности в разных микроучастках одной и той же доли печени. Специальное исследование показало, что частота встречаемости гепатоцитов различных классов плоидности в разных участках циррозной печени сильно варьирует по сравнению с нормальной печенью, особенно ОД-гепатоцитов, доля которых в разных участках колебалась от 1.87. до 16. 27..

3.3. Изменение сухого веса гепатоцитов при хроническом воздействии на крыс гепатотропным ядом сс14

Результаты определения сухого веса клеток с помощью интерференционной микроскопии свидетельствуют, что у контрольных крыс за 6 мес эксперимента вес гепатоцитов увеличился лишь на 11%, причем основной вклад (около 807.) в прирост сухого веса клеток вносит рост их цитоплазмы (клеточная гипертрофия). Хроническая интоксикация крыс сс14 уже через 3 мес приводит к значительному (на 397.) увеличению сухого веса клеток по сравнению с первоначальным уровнем. Увеличение сухого веса клеток становится еще более заметным через 6 мес после начала воздействия сс14, когда у животных наблюдается картина цирроза печени. В среднем, у животных опытной группы сухой вес гепатоцитов через 6 мес увеличивался на 637. по сравнению с исходным уровнем. У большинства животных при воздействии сс14 происходит постоянное нарастание веса клеток. В то же время у некоторых животных увеличение сухого веса гепатоцитов, зарегистрированное через 3 мес после начала опыта, в дальнейшем оставалось на одном уровне. В отличие от контрольных животных при отравлении крыс сс14 сухая масса гепатоцитов увеличивается главным образом (на 70-807.) за счет увеличения плоидности клеток.

Следует отметить, что при воздействии на животных сс14 не наблюдается какой-либо синхронности в ответе на повреждение ткани

между полиплоидизацией и гипертрофией клеток. У одних животных сухой вес гепатоцитов увеличивался более чем вдвое по сравнению с первоначальным уровнем, в то время как у других он оставался примерно на исходном уровне или возрастал незначительно, свидетельствуя тем самым, что общее увеличение сухого веса гепатоцитов у этих животных определяется в основном или целиком увеличением плоидности клеток. Таким образом, полученные данные свидетельствуют об отсутствии взаимосвязи между клеточной гипертрофией и полиплоидизацией клеток при репаративном росте печени и позволяют предположить, что механизмы запуска этих процессов в клеточной популяции различны.

3.4. Относительный вклад процессов пролиферации, полиплоидизации и гипертрофии клеток в репаративный рост печени в ходе развития экспериментального цирроза у крыс

Используя методику, кратко описанную в разделе 1.3, исследован относительный вклад процессов пролиферации, полиплоидизации и клеточной гипертрофии в увеличение веса печени, наблюдающееся как у крыс контрольной группы, которая не подвергалась воздействие сс14, так и у крыс, отравлявшихся в течение 6 мес сс14. У животных контрольной группы вес печени за 6 мес с начала эксперимента увеличивался в среднем на 11.9%. Цирроз печени, вызванный воздействием на животных сс14, приводит к увеличению как абсолютного, так и относительного веса печени. Вес печени увеличивался в этом случае примерно в 1.4 раза.

Полученные результаты свидетельствуют, что у контрольных животных число гепатоцитов в печени практически не изменяется. Относительный вклад клеточной пролиферации в увеличение веса печени составил у животных контрольной группы всего 6.4%. Рост печени контрольных крыс в течение 6 мес осуществляется главным образом за счет увеличения размеров цитоплазмы клеток (75.3%). Относительный вклад полиплидии в увеличение веса печени составил величину 18.3%.

Результаты расчетов позволили также сделать заключение, что в печени крыс, подвергавшихся в течение длительного времени отравлению сс14, происходит заметная гибель клеток. По сравнению с исходным уровнем число гепатоцитов в циррозной печени уменьшалось примерно на 20%. Несмотря на потерю части клеток, вес цирроти-ческой печени увеличен как по сравнению с одновозрастным контролем, так и по сравнению с весом печени крыс в начале эксперимента. Увеличение веса печени достигается в этом случае

главным образом за счет укрупнения размеров гепатоцитов. Основной вклад в увеличение размеров клеток паренхимы вносит полиплоидия, несколько меньший - клеточная гипертрофия. Таким образом, два процесса - полиплоидизация клеток и рост клеточной цитоплазмы не только компенсируют потерю части клеток в процессе хронического повреждения печени сс14, но и приводят к значительному увеличению веса печени.

4. СОСТОЯНИЕ ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКОИ ФУНКЦИИ И КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕПАРАТИВНОГО РОСТА ПЕЧЕНИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ И ЦИРРОЗЕ Хронические заболевания печени человека являются одной из наиболее частых и опасных патологий этого органа. Самым распространенным хроническим заболеванием печени у человека является хронический гепатит, частота которого составляет 40-507. от всех хронических поражений этого органа (Блюгер, 1978). Частота встречаемости и хорошо прослеживающаяся связь хронического гепатита с циррозом и раком ставят это заболевание на одно из центральных мест среди различных гепатопатологий.

В настоящее время достаточно подробно исследованы структурные изменения в ткани и клетках печени на световом и электронно-микроскопическом уровнях при хронических поражениях печени. В то же время особенности метаболизма ткани и, в частности, состояние многочисленных тканеспецифических функций гепатоцитов при хроническом гепатите и циррозе у человека изучены явно недостаточно.

Одной из ключевых тканеспецифичных функций печени является глюкостатическая функция. Уровни гликогена в гепатоцитах являются важным показателем состояния этой функции. В настоящей работе проведено исследование содержания гликогена и его легкодоступной и труднодоступной фракций в гепатоцитах при хроническом гепатите и циррозе различной этиологии и при различной степени тяжести поражения печени у человека.

4.1. Цитофлуориметрия общего гликогена и его фракций в гепатоцитах при хронических поражениях печени у человека Сведения о содержании гликогена в печени при xpoничecкo^ гепатите противоречивы. Долгое время, основываясь главным образо» на результатах адреналиновой пробы, считали, что содержание гликогена в печени больных хроническим гепатитом находится Не низком уровне. Позже, при использовании биопсийного материала был< установлено, что, за исключением некротизированных клеток,

остальные гепатоциты содержат на начальных стадиях дистрофии заметное количество гликогена (Блюгер, 1964; Мансуров, Кутчак, 1964). Важно, однако, иметь не только визуальные данные о присутствии гликогена в клетках печени, но и точную количественную характеристику его динамики на различных этапах развития патологического процесса.

Исследование содержания гликогена и его фракций в гепатоцитах, проведенное на более чем 300 больных хроническим гепатитом и циррозом с помощью цитофлуориметрического метода (2, 4), позволило установить следующее. Во-первых, содержание гликогена в клетках печени больных хроническим гепатитом нарастает по мере усиления тяжести поражения печени. В гепатоцитах больных с тяжелыми формами хронического гепатита и в циррозной печени уровни гликогена увеличены в среднем более чем в 3 раза по сравнению с уровнями, наблюдаемыми в печени здоровых людей. При этом на зависимость уровней гликогена в гепатоцитах от тяжести поражения печени не влияет этиология гепатита. Этот Факт был использован нами для разработки способа диагностики хронического гепатита (35). Во-вторых, показано, что гликогеноз в печени больных особенно выражен при алкогольном гепатите и при сочетании последнего с вирусным. В-третьих, можно отметить, что наиболее заметные изменения во Фракционном составе гликогена происходят также в печени больных алкогольным гепатитом и при сочетании последнего с вирусным гепатитом. Доля легкодоступной фракции гликогена в этих случаях снижалась до 65-707.. В норме ее относительное содержание составляло величину порядка 90-95/С.

В отличие от хронического гепатита, вызванного продолжительным воздействием агентов токсической и вирусной природы, содержание гликогена не увеличивается в случае эндотоксикоза, вызванного тяжелой механической травмой. Тяжелая механическая травма ,как известно, во многих случаях приводит к развитию эндотоксикоза, источниками которого являются продукты, образующиеся при разрушении тканей в момент травмы и в дальнейшем при возбуждении воспалительного процесса в организме, а также в связи с гипоксией, нарушениями метаболизма и дискоординацией функций различных органов и систем. Показано, что содержание гликогена в гепатоцитах пациентов с травматической болезнью как в случаях благоприятного течения болезни, так и при развитии эндотоксикоза находится на уровне близком к норме. Таким образом, увеличение содержания гликогена в гепатоцитах при хроническом гепатите является характерной чертой этого заболевания.

Причины гликогеноза гепатоцитов, развивающегося у крыс при длительном хроническом воздействии СС14 и у человека при хроническом гепатите различной этиологии, во многом неясны. Исследование активности ключевых ферментов гликогенолиза в нормальной и циррозной печени крыс и человека показало, что активность глюкозо-6-фосфатазы в циррозной печени крыс и человека резко сниженаСрис.3).

л и и о

(О

005

Г-6-Фаза

ГФаза

"И

160

120

и о

X со £ н

,<в

Г-6-Фаза

ГФаза

Рис.3. Активность глюкозо-6-йос#атазы и гликоген-фосйорилазы а в печени крысы (а) и человека (б).

В отличие от глюкозо-6-фосфатазы, уровни гликоген-фосфорилазы как общей, так и активной формы, заметно снижены только в печена человека, в то время как в печени крысы активность этого ферменте почти не измняется. Возможно этим можно объяснить большу» выраженность гликогеноза в печени человека по сравнению с печень» крысы при хроническом гепатите и циррозе.

Наряду со значительными функциональными перестройками в печень при хроническом гепатите и циррозе, которьк, в частности, проявляются в серьезных изменениях метаболизма гликогена в гепатоцита» заметные сдвиги отмечаются и в кинетике клеточной популяции паренхимы печени человека.

4.2. Кинетика клеточной популяции паренхимы печени человека п[ хроническом гепатите и циррозе.

По сравнению с лабораторными животными, сведения о кинетике

клеточной популяции печени человека при хронических поражениях печени гораздо менее многочисленны. В большинстве своем они так же, как и в случае нормальной печени человека, получены при исследовании срезов ткани или изолированных ядер гепатоцитов с помощью ка-риометрических методов. Возможно, именно этими причинами объясняется противоречивость результатов, полученных разными авторами.

Пролиферативная активность гепатоцитов человека при хронических поражениях печени так же, как и в нормальном органе, находится на очень низком уровне. В ряде работ показано (Ashihara, Fujita, 1975; Takehara et al. , 1975), что число клеток меченных 3н-тимидином, и число митозов увеличивается лишь при остром гепатите, когда на фоне массовых некрозов клеток Формируется регенераторный ответ ткани. Однако количество ДНК-синтезирующих клеток, достигающих в максимуме нескольких процентов, быстро падает после этого. Поэтому и в печени больных гепатитом основным подходом при исследовании кинетики клеточной популяции остается изучение процесса полиплоидизации клеток на разных этапах развития заболевания.

Исследования кинетики клеточной популяции печени больных хроническим гепатитом и циррозом проведены примерно на 200 пациентах. Уже в первых наших работах (17, 20) было показано, что уровни плоидности гепатоцитов в печени больных хроническим гепатитом не претерпевают сильных изменений. Основным классом плоидности при хроническом гепатите остается класс ОД-гепатоцитов. Даже при тяжелых формах гепатита доля ОД-гепатоцитов не падает ниже 50%. Хотя относительное количество ОТ-, ДТ- и 00-гепатоцитов и возрастает при гепатите, абсолютное их число остается на очень низком уровне. Средний уровень плоидности гепатоцитов у больных с тяжелыми Формами гепатита возрастал лишь на 16% по сравнению с нормой. Из этого следует, что полиплоидия не играет значительной роли в реларативном росте печени человека. Так же, как и в ходе постнатального роста, репаративный рост печени человека осуществляется главным образом путем полных митотических делений ОД-гепатоцитов.

Более четкие изменения наблюдались в числе ДД-гепатоцитов, относительное количество которых заметно увеличивалось по мере усиления тяжести хронического гепатита. У некоторых больных, возможно в особенно тяжелых случаях, относительная доля этих клеток в печени может возрастать до 50%.

Таким образом, при хроническом гепатите различной степени тяжести динамика клеточной популяции паренхимы печени человека в

целом имеет тенденцию, сходную с тоя, которая наблюдается П| длительном хроническом отравлении крыс сс14. Это сходство проя: ляется несмотря на резкие различия в степени участия процесс! полиплоидизации в репаративном росте печени и разницу в ТИ1 повреждающих агентов. В печени человека и крысы в услови хронического повреждения органа наблюдается заметный сдвиг сторону увеличения частоты полиплоидных клеток. В то же вре следует отметить и некоторые особенности кинетики клеточн популяции в печени крыс по сравнению с изменениями, происходящи в печени больных хроническим гепатитом. Во-первых, по сравнению нормой плоидность гепатоцитов в циррозной печени крыс повышает более заметно (в среднем примерно на 36%), чем у человека подобных условиях, где происходит лишь 16%-ное повышение средне уровня плоидности клеток печени. Во-вторых, кардинальная разни наблюдается в динамике ДД-гепатоцитов: у крыс при хроническ отравлении сс14 происходит резкое снижение относительного чис этих клеток, тогда как у человека число ДД-гепатоцитов увелич вается по мере усиления тяжести хронического гепатита.

Дальнейшие исследования на больных с четко выраженнь формами вирусного, алкогольного и алкогольно-вирусного хрониче кого гепатита и цирроза полностью подтвердили эти выводы. Крс того, было обнаружено, что при разных формах хронического гепа^ и цирроза не наблюдается каких-либо специфических отличий динамике клеточной популяции паренхимы печени. Независимо этиологии хронического гепатита и цирроза в печени больных пpo^ ходят относительно небольшие сдвиги в уровнях полиплоидизации г патоцитов по сравнению с нормой. Лишь в печени отдельных болы наблюдались резкие отклонения в частоте встречаемости 0Д-ДД-гепатоцитов в клеточной популяции по сравнению с нор| (Рис.4).

Исследования материала повторных биопсий печени, получении) пациентов через разные интервалы времени после первой биопа подтвердили низкие темпы полиплоидизации гепатоцитов человека I хроническом гепатите и циррозе. Данные, представленные в табш 5, позволяют отметить следующее: (1). сдвиги в уровнях плоидно! гепатоцитов в повторных биоптатах невелики- Возможно, что эт Факт отражает низкую пролиферативную активность гепатоцитов I этом заболевании; (2). в повторном биоптате, как прави, наблюдается сдвиг в сторону усиления полиплоидизаци популя гепатоцитов. Однако, в некоторых случаях заметных изменений относительном числе гепатоцитов различных классов плоидности

19 24 29- . 34 39 44 49

.103

lililí

! 1 ' 1 ' I 1 1 1 1 I ' ' ' 1 I 1 1 ' 1 I 1 1

С -

93 -

73 г

63 -

, i , . , ■ I . , t

23 28 33 38 43 48 53

Рис.4. Доля ОД-гепатоцитов в печени человека при хроническом вирусном (а), хроническом алкогольном (6) гепатитах и при циррозе (с). Сплошная линия - кривая регрессии ОД-гепатоцитов в постнатальном онтогенезе. Пунктир - границы нормы при 957.-Н0М уровне значимости.

по ,о си абсцисс-возраст . [годы)

по о,си. 'ординат-доля ОД- .

гепатоцитов ( в '/•'/.) небольшой сдвиг в сторону

происходит или даже наблюдается уменьшения плоидности клеток.

Таким образом, результаты исследования кинетики клеточной популяции в печени больных хроническим гепатитом и циррозом позволяют сделать следующие выводы:

1. Несмотря на то, что репаративный рост печени человека осуществляется в основном за счет размножения ОД-гепатоцитов, у некоторых больных полиплоидизация гепатоцитов может играть заметную роль в репаративной регенерации печени.

2. При репаративном росте печени человека скорость накопления ДД-гепатоцитов в клеточной популяции заметно выше, чем в печени здоровых людей того же возраста.

ШЛИЦА 5 ОТНОСИТЕЛЬНОЕ ЧИСЛО ГЕПАТ011ИТ0В РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ ШЮИЛНОСТИ В БИОПТАТАХ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ

Первая биопсия Повторная биопсия

Нозр. Классы плоидности, '/. Степ. Инт. Классы плоидности, 7. Степ,

б-иых 2с 2с 2 4с 4с.2 8с тя*. врем. 2с 2с«2 4с 4с-2 8с 8с>2 тя*. лет мес

23 83. 6 10. 0 6. 4 - - I 18 83. 1 10. 9 5. 7 0. 2 0. 1 I

26 00. 7 2. 4 С. 9 - - I 49 76. 3 13. 7 8. 7 0. 3 1.0 - I

40 84. 0 12. 5 3.0 0. 5 - I 50 80. 0 14. 4 4. 4 1.2 - I

38 82.0 10. 0 6.1 1. 4 0.5 II 9 76.1 14. 6 7.1 1.0 1.2 - II

32 92. 8 4. 6 1.5 0. 5 0. 6 II 12 91. 0 6. 0 3.0 - - II

37 91. 3 4. 6 2. С 0. 5 1. 0 II 21 82. 1 9. 3 6. 0 1. 0 1.3 0.3 II

39 63. 7 24. 0 11. 7 0. 6 - II 51 67. 6 20. 8 8. 0 2.0 1.6 - III

38 80. Э 15. 5 3. 0 0. 6 - II 12 81. 0 9. 8 6. 3 2. 3 0. 6 - IV

23 86. 8 10. 2 2. 0 1. 0 - III 86 96. 0 2. 5 1. 0 0.5 - ш

29 87. С 7. 4 2. 5 0. 5 2. 0 III 16 87. 3 И. 7 1.0 - - - ш

40 91. 1 С. 9 1.5 - 0. 5 III 12 91. 5 7. 5 0.5 0.5 - IV

25 89. 8 9. 7 0. 5 - - IV 16 81. 3 9. Б 6. 3 - - IV

22 со. С 10. 6 1.4 - - I 108 67. 3 23. 3 5. 3 3. 3 0.7 - IV

При хроническом гепатите и циррозе многие авторы отмеч; повышение числа крупных клеток в печени, которое связывают основном с полиплоидией. Действительно, мы показали, что ко; чество полиплоидных клеток при этих заболеваниях нескол! увеличивается. При этом максимальные уровни плоидности составл) 16с, но это были единичные клетки. Можно предположить, одна! что, как и у крыс при отравлении ССЦ, клеточная гипертрофия печени человека также может играть определенную роль репаративном росте этого органа.

4.3. Уровни гипертрофии гепатоцитов человека при хроничеа

гепатите и циррозе Результаты наших исследований показали, что как в нормалы

печени, так и при гепатите, несмотря на значительные различия

сухом весе между отдельными клетками печени человека, в сред:

соблюдается четкая пропорциональность между сухим весом гепа-тоцитов и уровнем их плоидности как в нормальной, так и в патологически измененной печени (28).

Исследования сухого веса гепатоцитов при хроническом гепатите у человека показывают, что вес клеток постепенно возрастает по мере усиления тяжести поражения печени, увеличиваясь у больных с наиболее тяжелыми Формами хронического гепатита и цирроза в среднем на 50 У. по сравнению с нормой. При этом основной вклад в это увеличение веса клеток вносит клеточная гипертрофия (70 7.). Это соотношение между гипертрофией и полиплоидией обратно тому, что наблюдалось в печени крысы при хроническом воздействии СС1д. Подобный результат свидетельствует о том, что клеточную гипертрофию следует рассматривать как важный Фактор восстановительного роста печени у человека при хроническом гепатите и циррозе. Покрайней мере, можно определенно сказать, что клеточная гипертрофия вносит при репаративном росте печени человека больший вклад, чем полиплоидия.

5. КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГЕНЕРАТОРНОГО РОСТА ПЕЧЕНИ КРЫС ПОСЛЕ ЧАСТИЧНОЙ ГЕПАТЭКТОМИИ НОРМАЛЬНОГО И ПАТОЛОГИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННОГО ОРГАНА Финалом всех типов цирроза является псевдодольковая трансформация паренхимы, расширение портальных полей, портальный и внутридольковый фиброз. Прогноз цирроза в значительной мере зависит от его этиологии и степени компенсации. Однако в большинстве случаев продолжительность жизни циррозных больных не превышает нескольких лет. Как правило, цирроз заканчивается печеночной комой или кровотечениями из верхних отделов желудочно-кишечного тракта (Блюгер, Новицкий, 1984).

Хронический гепатит и цирроз трудно поддаются лечению. Эксперименты на животных показали, однако, возможность обратимости циррозных изменений и продемонстрировали важную роль частичной гепатэктомии (ЧГ) в ускорении нормализации паренхимы (Rabinovici, wiener, 1964; Солопаев, 1980). При этом отмечается, что в процессе регенерации цирротически измененной печени исчезает избыточно разросшаяся соединительная ткань и печень утрачивает признаки цирроза. ЧГ как метод лечения цирроза достаточно активно используется и в клинической практике как в нашей стране, так и за рубежом, причем благоприятность исхода подобной операции во многом зависит от типа цирроза и интенсивности регенераторных процессов, протекающих в органе (Солопаев, 1979; Галеев и др., 1983).

В нашей работе мы провели исследование морфологических Функциональных изменений, а также кинетики клеточной популяции паренхиме у крыс через 1 мес после ЧГ нормального и патологичес измененного органа.

5.1. Морфофункциональные изменения в печени крыс после части ной гепатэктомии нормального и цирротического органа.

Результаты морфологического исследования печени показали, ч паренхима печени после ЧГ патологически измененного органа п прежнему разделена тяжами соединительной ткани на ложные дольк они становятся лишь шире. Вместе с тем наблюдается некотор нормализация паренхимы: большинство гепатоцитов имеет нормальн строение, резко уменьшается число липидных вакуолей в ни происходят и другие изменения, свидетельствующие о нормализаи структуры гепатоцитов. Определение содержания гликогена гепатоцитах до и после операции показало, что уровень гликогена циррозной прооперированной печени снижается до уровня нормы.

Морфометрия соединительной ткани и кровеносных сосу* показала, что объем, занимаемый соединительной тканью в патолог чески измененной печени, после проведения операции практически изменяется. До ЧГ доля соединительной ткани в циррозной пече составляла 7.3 -1.6 '/., после ЧГ - 6.0 - 1.7 %. (индивидуалы колебания - от 2,5 - 0,3 '/. до 14.9 - 1,6 '/.). Увеличение относ тельной площади, занимаемой кровеносными сосудами, после ЧГ с 1 - 0.27. до 1,7 - + 0,4 '/. также не достоверно.

Таким образом, проведенное исследование позволяет заключи: что ЧГ патологически измененной печени, несмотря на некото| благоприятные моменты, все же не приводит к существенным сдвига! гистологической картине печени через 1 мес после операции.

Каким же образом реагирует в этой ситуации клеточ! популяция паренхимы печени?

5.2. Кинетика полиплоидизации гепатоцитов при регенера! нормального и патологически измененного органа

После ЧГ нормальной печени крыс полиплоидия гепатоци' несколько возрастает, причем особенно заметно увеличивае' количество 00-гепатоцитов. Однако среднее число геномов на кле-после операции (4.39с) достоверно не отличается от дооперационш уровня (4.26с).

Резекция 2/3 цирротически измененного органа через 1 1 после операции приводит, по нашим данным, к снижению количес

полиплоидных клеток в популяции гепатоцитов. В результате этого среднее число геномов на клетку уменьшается по сравнению с дооперационным уровнем, но остается все же на 25% выше, чем в норме. Снижение уровня плоидности гепатоцитов в циррозной печени после ее ЧГ связано, по-видимому, с преимущественной пролиферацией низкоплоидных клеток, главным образом, диплоидных гепатоцитов.

5.3. Исследование сухого веса гепатоцитов после частичной

гепатэктомии нормального и цирротического органа

Выше было отмечено, что в ходе хронического повреждения печени СС14 вес каждой клетки, независимо от ее плоидности в циррозной печени, увеличивается по сравнению с контролем в среднем на 207., свидетельствуя тем самым о важной роли клеточной гипертрофии в репаративном росте печени животного. Определение сухого веса гепатоцитов показало, что через 1 мес после ЧГ нормального и патологически измененного органа происходит дальнейшее увеличение веса клеток. При этом почти весь прирост сухой массы клеток обусловлен в том и другом случае клеточной гипертрофией, поскольку уровни полиплоидии клеток после операции не увеличиваются или даже снижаются.

5.4. Оценка относительного вклада пролиферации, полиплоидиза-ции и клеточной гипертрофии в регенерацию нормальной и

цирротически измененной печени после ее частичной резекции

Увеличение массы печени после частичной гепатэктомии нормального и патологически измененного органа имеет ряд общих черт. Главную роль в увеличении веса печени после проведения операции играет клеточная пролиферация, приводящая к увеличению числа гепатоцитов в органе. Другим важным цитологическим механизмом роста нормального и циррозного органа является гипертрофия клеток, ее вклад составляет соответственно 23 и 287.. В то же время полиплоидия как фактор роста нормального и патологически измененного органа после проведения резекции печени не играет заметной роли.

В специальной литературе достаточно интенсивно обсуждается вопрос о сходстве и различиях клеточных механизмов нормального постнатального роста печени с механизмами физиологической и репаративной регенерации в этом органе. Имеющиеся в нашем распоряжении данные позволяют, как нам кажется, с хорошей степенью определенности ответить на поставленный вопрос. Из данных, представленных в таблице 3, следует, что интенсивный постнатальный

рост печени крысы, который продолжается примерно до 2 мес в равн< степени обусловлен пролиферацией, полиплоидизацией и гипертрофи< клеток. Однако в разные периоды этого временного интервала, вкл< каждого из этих процессов может быть различным. После 2 мес, коп ростовые процессы в печени стабилизируются и уровни митотическс активность клеток падает почти до нуля, медленное нарастание ве< печени, которое в значительной степени определяется уровж физиологической регенерации в органе, связано, главным образом, клеточной пролиферацией. Удельный вес остальных клеточных мех. низмов роста в это время незначителен. Данные, представленные табл.3 и табл.7, свидетельствуют, что репаративный рост нормально и циррозной печени после ЧГ очень сходен по своим характеристик; с физиологической регенерацией.

6. О БИОЛОГИЧЕСКОЙ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ РОЛИ КЛЕТОЧН ПОЛИПЛОИДИИ В ПЕЧЕНИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

Результаты исследования клеточных механизмов нормального репаративного роста печени человека и крысы позволяют сдела вывод, что процессы репродукции клеток играют здесь ведущую рол Один из вариантов клеточной пролиферации - полиплоидизация клето Процесс полиплоидизации в печени млекопитающих, как правил приводит не только к увеличению числа геномов в клетке, но и увеличению числа клеток в популяции. В этом случае, однако, отличие от обычного митоза, две клетки образуются не за один pay синтеза ДНК, а за два.

Какова биологическая и физиологическая роль соматическ полиплоидии? Каково значение полиплоидизации клеток для Функц органа? Приводит ли образование полиплоидных клеток к интенс фикации функции органа или наоборот, это явление связано ухудшением его Функции? Явялется ли полиплоидия защитной реакци в ответ на повреждение? Делает ли полиплоидное состояние клет более устойчивой к действию повреждающих агентов? Все эти вопро обсуждались достаточно широко (Evans, 1976; Gahan, 1977; Baric 1978; Ван Безойен, 1972; Урываева, 1979, 1981).

6.1. Функциональные свойства диплоидных и полиплоидны

гепатоцитов

Вопрос о функциональной полноценности полиплоидных клет рассматривался многими исследователями (Бродский, Урываева, 1981 При этом отмечали, что полиплоидные клетки выполняют больший объ работы, Функционируют более интенсивно, чем диплоидные. Важне

однако, знать, существуют ли качественные различия по функциональным параметрам между диплоидными и полиплоидными клетками. Вопрос этот принципиальный, однако имеющиеся на этот счет сведения противоречивы.

Сравнительное исследование Функциональной активности одноядерных и двуядерных гепатоцитов различных классов плоидности, проведенное в нашей работе, показало, что:

1. среднее содержание РНК в гепатоцитах изменяется пропорционально числу геномов в клетках, причем одноядерные и двуядерные гепатоциты с равным суммарным геномом не отличаются по содержанию РНК (41);

Н. интенсивность включения 3Н-аргинина, 3Н-лейцина и 3Н-фенилаланина в гепатоциты разной степени плоидности пропорциональна дозе генов (26);

3. среднее содержание гликогена в гепатоцитах разной степени плоидности также изменяется пропорционально дозе генов и также не наблюдается различий между одноядерными и двуядерными клетками равной плоидности по этому показателю (9).

Таким образом, в расчете на геном функциональные показатели полиплоидных клеток не отличиаются от соответствующих показателей диплоидных гепатоцитов. Однако, все эти показатели функции клеток в гепатоцитах разных классов плоидности сравнивались у взрослых животных, в условиях, когда Функциональное состояние было достаточно стабильным, когда трудно было ожидать каких-либо резких Функциональных сдвигов. Можно было предположить, что качественные различия между диплоидными и полиплоидными клетками обнаружатся, если резко изменить Функциональный статус организма, когда произойдет усиление Функциональной нагрузки на орган и его клетки.

В связи с вышесказанным проведено исследование содержания гликогена в синтезирующих и не синтезирующих ДНК гепатоцитах различной плоидности на разных стадиях постнатального развития крыс, когда происходят большие перестройки метаболизма организма и печени (11,15), и в регенерирующей печени, когда на оставшиеся после резекции части печени клетки падает дополнительная Функциональная нагрузка (29). В результате этих исследований показано, во-первых, что содержание гликогена в гепатоцитах разной плоидности, не синтезирующих ДНК, изменяется в соответствии с дозой генов. Во-вторых, уровни гликогена в гепатоцитах разной плоидности, находящихся в фазе синтеза ДНК, снижаются примерно на одну и ту же относительную величину порядка 267- В-третьих, несмотря на то, что синтез ДНК в гепатоцитах на одних сроках

постнатального развития (7 сут) заканчивался обычным митотичвски делением клеток, а на других (21, 30 сут) приводил, главнь образом, к образованию полиплоидных клеток, снижение уровне гликогена в э-фазе было одинаковым. Полученные данные позволят заключить, что: (1) клетки разной плоидности, по-видимому, н отличаются друг от друга по событиям, происходящим в Б-фазе и (2 "момент истины", когда клетка принимает решение - делиться ли е обычным митозом, или проходить через полиплоидизирующий митоз находится не в Б-фазе.

Таким образом, вышеприведенные данные позволяют сделат вывод, что функциональная активность полиплоидных гепатоцитов расчете на геном полностью равноценна диплоидным гепатоцитам.

6.2. Исследование устойчивости диплоидных и полиплоидных клеток действию повреждающих агентов

Если на уровне организма полиплоидия, благодаря возможное! повышения гетерозиготности, является мощным фактором видооС разования, способствует через процесс эволюции завоеванию новы» видами разнообразных мест обитания, ранее недоступных их диплс идным предкам, то роль полиплоидии на тканевом уровне во многс остается неизвестной. Существует лишь несколько гипотез, основа! ных, к тому же, на очень ограниченном количестве фактов.

Наиболее распространенной и наиболее обоснованной являете гипотеза о том, что полиплоидия в соматических тканях представлж собой особый механизм зашиты против действия повреждающ Факторов. Полиплоидное состояние является как бы своеобразж способом понижения вредных последствий хромосомных повреждений рецессивных мутаций, обеспечивая тем самым генетическую защи: клеток и поддержание жизнеспособных клеток в популяции (Урываев< 1979, 1981). Предложенная гипотеза аргументируется: (1) сущес: вованием прямой корреляции между числом хромосомных перестроек клетках печени и свойственным виду уровнем полиплоидизащ гепатоцитов. Хромосомные аберрации в делящихся клетках являются данном случае мерой накопления повреждений генома и происход) вследствие его особой подверженности действию генотоксическ! соединений или дефектности генетического материала. (2) постулатом генетики о защищенности полиплоидного генома результате существующей в нем избыточности генетически материала.

Важным доказательством в пользу предложенной гипоте: считались данные, опубликованные в известной работе Харта и Сетл!

(Hart, setlow, 1974), в которой исследовались уровни внепланового репаративного синтеза ДНК в фибробластах различных видов млекопитающих. Исходя из данных этой работы и данных литературы, был сделан вывод о том, что уровни внепланового синтеза ДНК у различных видов млекопитающих изменяются, повидимому, в обратном порядке нежели уровни полиплоидии в печени тех же видов. Отсюда был сделан вывод, что виды с низкими уровнями полиплоидии в печени защищаются против повреждений генома повышением уровня активности систем репарации ДНК, в то время как у видов с высоким уровнем полиплоидии в печени, само полиплоидное состояние генома, в силу избыточности генетического материала, служит основным механизмом защиты клеток.

В нашей работе проверку этого предположения проводипи на разных видах млекопитающих, различающихся по устойчивости к действию гепатотропного яда. Кратко остановимся на основных результатах наших исследований в этом направлении.

Заключение о том, что между уровнем плоидности клеток печени у разных видов млекопитающих и уровнем репарации ДНК в клетках существует обратная зависимость, которое и послужило одним из доказательств в пользу рассматриваемой гипотезы (Урываева,1979), было сделано на основании опытов, проведенных на разных типах клеток. Уровни плоидности определяли в гепатоцитах, а уровни внепланового синтеза ДНК - на фибробластах, что могло привести к неверным выводам. В связи с этим мы провели исследование уровней репарации ДНК по активности Фермента репарации ДНК урацил-ДНК-гликозилазы (УДГ) в печени 13 видов млекопитающих, принадлежащих к четырем отрядам (31). Оказалось, что активность УДГ увеличивается с увеличением среднего уровня плоидности клеток паренхимы печени у тех же животных. При возрастании среднего уровня плоидности гепатоцитов у разных видов от диплоидного до тетраплоидного уровня активность УДГ возрастала примерно в 20 раз.

Таким образом, корреляция между уровнями репарации ДНК и полиплоидией в печени является обратной той, которая предполагалась на основании косвенных данных, полученных на клетках разных типов. В то же время следует отметить, что уровни Фермента репарации ДНК в данной работе исследовались не на клетках разной плоидности, а в ткани печени с разным уровнем плоидности клеточной популяции. В связи с этим в следующей работе (52) мы провели прямую оценку репаративной активности клеток, различающихся по уровню плоидности. Для этой цели мы использовали клеточные культуры, состоящие из клеток разной плоидности. Уровни репарации

ДНК исследовали путем определения активности УДГ и внеплановс УФ-индуцированного синтеза ДНК.

ТАБЛИЦА 6. Уровень УФ-индуцированного внепланового (ВС)синтеза I и активность урацил-ДНК-гликозилазы (УДГ) в клетка диплоидной (ХС-Д) и тетраплоидной (ХС-Т) культур

№ Культура ВС ДНК, число Активность УДГ, имп. опыта зерен на ядро за 1 мин на 1г белка

1 ХС-Д 15.8 + 0.5 940 + 24

ХС-Т 29.8 + 0.6 1980 + 196

2 ХС-Д 14.3 + 0. 6 475 + 146

ХС-Т 29.5 + 0.7 1335 + 170

Из данных, представленных в таблице 6, следует, что урое внепланового синтеза ДНК и активности УДГ пропорционал! плоидности клеток. Таким образом, уровни систем репарации ДНК клетках возрастают пропорционально дозе генов и следователе активность систем репарации ДНК в полиплоидных клетках - не нт чем в диплоидных.

Известно, что ключевое значение для стабильности генома имс активность системы биотрансформации, связанной с образованием выведением из клеток различных вредных эндогенных и экзоген! веществ. Эта система, наряду с процессами репарации ДНК полиплоидией, снижающей вредные последствия мутаций, играет важ> роль в выживаемости клеток и организмов в условиях постояннс действия факторов внешней среды. Полагают, что чем выше активное ферментов, участвующих в биотрансформации чужеродных веществ неактивные, нейтральные соединения, тем менее должен б! поврежден генетический аппарат клетки.

В нашей работе мерой активности системы детоксикации в пече служила устойчивость животных к действию СС14. Устойчиво« животных к гепатотропному яду увеличивалась в ряду: полевки хомяки - мыши - крысы. Представленные в табл.7 данные позвол» предположить, что у полевок активность ферментов, участвующих метаболизме СС14, выше чем у крыс и мышей. Эти различия в стеш подверженности токсическому действию СС14 у разных видов животн! по-видимому, обусловлены генетически определенными различиями активности монооксигеназ в печени.

Исходя из результатов определения уровней Фермента репара1 ДНК - урацил-ДНК-гликозилзы у этих же видов можно та!

Таблица 7. Соотношение между средней эффективной дозой (ЛДэо), активностью УДГ и средним уровнем плоидности гепатоцитов

Вид ЛД30, мг/кг Активность УДГ, Средний уровень

имп/мин на 1мкг ДНК плоидности, с

Крыса б/п 1980-112 522. 9-74.1 4. 40-0. 35

Мышь б/п 1580-184 287. 0±0. 36 7. 46-0. 19

Хомяк 108-8 - 2. 50-0. 03

Полевка 63±6 70. 6-5. 5 3. 09-0. 13

предположить, что у грызунов, вероятно, существует обратная корреляция между уровнями репарации ДНК и уровнями детоксикации в клетках печени.

Определение уровней плоидности гепатоцитов у этих видов грызунов показало, что наиболее высокие средние уровни плоидности наблюдаются в печени мышей и крыс. Уровни плоидности в печени сирийских хомячков и восточно-европейских полевок значительно ниже.

Таким образом, результаты данной работы позволяют заключить, что виды с более высоким уровнем плоидности клеток печени имеют более низкую активность ферментов детоксикации и, наоборот, виды с более низким уровнем плоидности гепатоцитов имеют более активную систему этих ферментов. Возможно, однако, что уровни полиплоидии в печени разных видов млекопитающих связаны не с большей , или меньшей активностью ферментов детоксикации, а межвидовыми различиями по каким-то иным показателям и таким образом обнаруженная корреляция может носить случайный характер. В связи с этим было проведено исследование взаимосвязи уровней полиплоидии с активностью системы детоксикации в печени мышей разных линий, различающихся по устойчивости к действию СС14.

Известно, что наиболь- шим токсическим действием СС14 обладает в тех тканях, в которых уровень активности Ферментов микросомальной Фракции, связанной с системой цитохрома Р-450, наиболее высок. Сам четырех хлористый углерод - малотоксичное соединение. Высокой токсичностью обладают продукты его биотрансформации радикалы типа СС1Э и СС12, которые собственно и вызывают повреждение гепатоцитов и их некрозы, поскольку именно в этих клетках расположена система детоксикации, являющаяся тканеспеци-фичной функцией этих клеток. Представленные в табл.8 данные показали, что уровень Ферментов, участвующих в биотрансформации

СС14, у мышей линий вЛл/з и ва1в/с выше, чем у мышей лш С57В1/6. Сходные результаты были получены и при определеь активности системы детоксикации с помощью гексеналового теста.

Несмотря на различия в уровнях детоксикации в печени мьш линий ва1ь/с и С57В1/6 частота спонтанных хромосомных аберраций гепатоцитах этих линий достоверно не различалась и составляла среднем 3.17. и 4.07. соответственно. Примерно одинаковые уров хромосомных аберраций у мышей, которые значительно различаются уровню активности системы детоксикации, могут быть обусловле различиями в уровнях репарации ДНК.

Действительно, исследование активности УДГ показало, ч активность этого фермента репарации ДНК примерно вдвое выше печени мышей линии С57В1/6, чем у мышейлинии ва1Ь/с. Из полученн данных следует, что уровень хромосомных аберраций, характерный д данного вида, по-видимому, устанавливается за счет взаимодейств систем детоксикации и репарации ДНК. Полученные результат показывают также, что уровень полиплоидии гепатоцитов не обнар живает какой-либо связи с уровнем хромосомных аберраций. Среди уровни плоидности гепатоцитов у мышей разных линий обнаружива Таблица 8. Соотношение между средней эффективной дозой (ЛДао) дл сс14, продолжительностью гексеналового сна и активностью УДГ у мышей разных линий

Линия ЛД50, мг/кг Гексеналовый сон, Активность УДГ

мин имп/мин на 1 г белк.

БЗЬ/З 740-49 - 5625-444

ВАЬВ/С 1480-133 5. 5-1. 7 4333-341

сзн 1900-147 - 4200-492

С57В1/6 3500-253 17. 0^.2 8008-361

прямую корреляцию с активностью ферментов биотрансформации СС14 обратную с активностью фермента репарации ДНК в клетках печени.

Согласно гипотезе о роли полиплоидии как механизм биологической зашиты генома клетки, умножение генома дает возмо» ность полиплоидной клетке выжить в тех условиях, где диплоидна клетка погибла бы СУрываева, 1979).

В связи с этим была исследована выживаемость диплоидных полиплоидных гепатоцитов со следами аберрантного митоза в вид микроядер,образовавшихся в результате рентгеновского облучения

Исследования проводились на крысах, печень которых представлена главным образом полиплоидными клетками и сирийских хомячках, печень которых состоит преимущественно из диплоидных клеток. Основные результаты этой работы следующие:

1. Рентгеновское облучение не приводит к избирательной гибели диплоидных гепатоцитов, поскольку частоты распределения клеток по классам плоидности у облученных и необлученных (контрольных) животных после проведения ЧГ были очень близки.

2. МетаФазные пластинки с аберрациями хромосом были найдены как среди полиплоидных клеток, так и среди диплоидных, причем среди полиплоидных клеток доля клеток с хромосомными аберрациями была примерно в 4 раза больше, чем среди диплоидных. Однако, это связано не с селективной гибелью диплоидных гепатоцитов, а обусловлено их гораздо более высокой пролиФеративной активностью по сравнению с полиплоидными клетками.

Полученные данные показьюают, что гибель клеток не определяется уровнем их плоидности. Из популяции элиминируются и диплоидные и полиплоидные гепатоциты , однако скорость элиминации определяется тяжестью повреждения клеток и их пролиФеративной активностью.

Результаты, приведенные выше, свидетельствуют, что полиплоидное состояние не является наиболее существенным механизмом зашиты клеток против действия повреждающих Факторов. Другие системы клетки, такие как детоксикация экзо- и эндогенных вредных веществ и репарация ДНК, определяют уровень повреждения генома и, на наш взгляд, вносят главный вклад в защиту . клеток против генотоксического действия различных агентов.

Таким образом результаты данной работы позволяют заключить, что функциональные показатели в расчете на геном у полиплоидных и диплоидных клеток одинаковы и , следовательно, в функциональном отношении полиплоидный гепатоцит является полным аналогом соответствующему числу диплоидных гепатоцитов. Результаты нашей работы показывают, что полиплоидное состояние per se не является, по-крайней мере, существенным механизмом защиты клеток против генотоксического действия повреждающих агентов. Основной вклад в защиту клеток против повреждающего действия различных Факторов вносят системы детоксикации и репарации ЛНК. Последний вывод подтверждается также фактом существования большого числа долгоживущих видов млекопитающих с преимущественно диплоидной организацией печени. Этот факт дополнительно подтверждает, что наиболее надежным способом нейтрализации нерепарируемых повреж-

Каков же биологический смысл полиплоидии в печени млеко питающих? Корректна ли вообще постановка этого вопроса, есл качественные различия между диплоидными и полиплоидным гепатоцитами отсутствуют? В настоящее время на эти вопросы трудн найти ответ. Несомненно одно, - полиплоидные клетки присутствуют по-видимому, в печени у всех млекопитающих.

6.3. Распространенность полиплоидных клеток в печен

различных видов млекопитающих.

Исследование уровней плоидности гепатоцитов,проведенное на>* на печени примерно 50 видов млекопитающих, принадлежащих к отрядам: Insectívora, Primates, Carnivora, Perissodactyle Artiodactyla, Rodentia, Lagomorpha, Hyracoidea и Tylopoc позволило сделать следующие выводы

1. Хотя полиплоидные клетки присутствуют в печени все исследованных видов млекопитающих, частота их встречаемости 04eF различна. Большинство видов имеет в печени не более 10"/. клеток полиплоидными ядрами. 2. Доля ДД-гепатоцитов и вариабельность > встречаемости в печени различных видов млекопитающих, по крайне мере, не меньше, чем клеток с полиплоидными ядрами. 3. Гепатоцит высоких степеней плоидности встречались в печени лишь оче! немногих видов отряда грызунов, относящихся, главным образом, сем. Muridae и Cricetidae. Максимальные уровни плоиднос: гепатоцитов составляли у этих видов 32с. У подавляющего бол1 шинства видов млекопитающих максимальные уровни плоиднос-гепатоцитов не превышали 8с.

В чем же причины столь сильной вариабельности чис. полиплоидных клеток в печени различных видов млекопитающих? С 4i связано появление полиплоидных клеток в печени в тех или hhi условиях?

6.4. 0 причинах вариабельности числа полиплоидных клеток

печени различных видов млекопитающих.

Несомненно, полиплоидия в соматических тканях являет! результатом Функциональных событий в организме. Конкурентн: взаимоотношения между пролиферативной и тканеспецифически; Функциями клетки за общие источники энергии, рибосомы, субстрат кофакторы и т.д. являются, по-видимому, первопричиной образован полиплоидных клеток на соматическом уровне. Особенно тесными э взаимоотношения должны быть для таких полифункциональных клет какими являются гепатоциты. В таблице 9 представлены данные

интенсивности включения 3Н-глюкозы в гликоген синтезирующих и не синтезирующих ДНК гепатоцитов. Видно, что одна из основных тканеспецифических Функций гепатоцитов - гликогенсинтетическая -заметно ослабляется в ходе синтеза ДНК, свидетельствуя о конкурентных взаимоотношениях с функцией клеточного деления.

Таблица 9. Интенсивность включения эН-глюкозы в гликоген синтезирующих ( 3Н-Т+) и не синтезирующих (3Н-Т~) ДНК гепатоцитов ( число зерен серебра, х - эа )

№ животного 3Н-Т" ' Н-Т+

1 2 24. 01 26. 40 - 0. 50 ( ^ 1.28 ( 530 ) 280 ) 18. 97 8.96 ± 1.77 { - 0. 80 ( 31 ) 280 )

Примечание: в скобках указано число измеренных клеток.

Уровень конкуренции между пролиферативной и тканеспецифи-ческими функциями может зависеть от целого ряда факторов, среди которых можно назвать темпы размножения, продолжительность развития, ритм питания, состав пищи и т.д. Одним из самых общих и фундаментальных факторов, оказывающих громадное влияние на метаболизм животного в целом и интенсивность обмена в органах и тканях, является размер животного.

Исследованию связи общего уровня метаболизма животных с размерами их тела посвящено огромное количество работ (Шмидт-Ниельсен, 1987). В настоящее время установлено, что наклон линии регрессии для удельной интенсивности метаболизма тела животных в зависимости от их размеров составляет для млекопитающих величину примерно -0. 25.

В отличие от уровня общего метаболизма тела животного, характер взаимосвязи интенсивности обмена в тканях и особенно в клетках с размерами животного почти не исследован. Остается неясным, изменяется ли интенсивность метаболизма на уровне клетки при увеличении размеров животного с той же закономерностью, что и общий метаболизм тела животного, или же на клеточном уровне следует ожидать иных закономерностей.

В нашей работе проведено исследование уровней энергетического метаболизма в гепатоцитах млекопитающих в зависимости от

размеров тела животных и средних уровней плоидности клеток печени тех же животных. Работа проведена на 10 вида млекопитающих, размер тела которых различался примерно в 10^ ра: Для оценки уровня энергетического обмена клеток использовалс метод морфометрии митохондрий на электронограммах. При этом » определенной постоянной площади определяли следующие параметр! относительную площадь, занимаемую митохондриями в цитоплазме, I число и общую протяженность внутренних мембран митохондрий, » которых, как известно, располагаются ферменты дыхательной цеш окислительного фосфорилирования и различные цитохромы. Общ; длина внутренних мембран митохондрий (ь) вычислялась по формуле:

Ь = ( 21п +р ) N , где 1 - длина крист, п - их количество, р - периметр митохондр» и N - количество митохондрий на постоянной площади.

Оказалось, что относительная площадь, занятая митохондрия! и их число в гепатоцитах слабо зависят от размера тела животноп В то же время протяженность внутренних мембран митохондрий гепатоцитах снижается при увеличении размеров тела млекопитающи) причем наклон линии регрессии в этом случае составил -0.: (Рис.5).

Полученные данные позволяют сделать следующие вывод| ------------ 0.91

ч.г

3-в 3.6

Рис.5. Заисимость длины внутренних мембран митохондрий гепатоцитов от веса тела у различных видов млекопитающих. По оси абсцисс - 1д веса тела, по оси ординат - 1д общей длины внутренних мембран митохондрий на единицу площади клетки.

Рис.6. Зависимость средней уровня плоидности гепатоци тов от веса тела у разных видов млекопитающих. По оа абсцисс - 1д веса тела, по оси ординат - 1д среднего уровня плоидности клеток.

Во-первых, учитывая, что относительный вес печени у разных видов млекопитающих снижается по мере увеличения веса их тела с наклоном линии регрессии примерно -0.13 (stahl, 1965), уровень Функции целого органа будет снижаться с наклоном примерно - 0.27, что хорошо соответствует значению, полученному при исследовании общего метаболизма тела млекопитающих. Другими словами, поскольку размеры гепатоцитов у разных видов млекопитающих одинаковы, падение обмена целого органа при увеличении размеров тела животных достигается двумя путями: за счет относительного уменьшения числа клеток в печени и путем снижения их функциональной активности. Во-вторых, полученные данные свидетельствуют об изменении характера конкурентных отношений между тканеспециФическими и пролиФеративной функциями в гепатоцитах у животных с разным размером тела. Снижение функциональной активности гепатоцитов по мере увеличения веса тела животных предполагает снижение антагонизма между тканеспециФическими и лролиферативными синтезами, вследствие чего осуществление митоза гепатоцитами облегчается. Не случайно полиплоидные клетки встречаются с гораздо большей частотой у мелких животных, чем у крупных (Рис.6).

Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что различные уровни полиплоидии в паренхиме печени у разных видов млекопитающих определяются уровнем конкурентных отношений между тканеспециФическими и пролиФеративной Функциями в клетке. Именно напряженность этих отношений (а не какие-то особые свойства полиплоидных клеток), возникающая на какой-либо стадии нормального развития, в условиях повреждающего воздействия на орган или общего ухудшения функции органа, является, повидимому, первопричиной появления полиплоидных клеток в печени и дальнейшего повышения степени их плоидности.

ВЫВОДЫ

1. Нормальный и репаративный рост печени человека осуществляется главным образом путем митотических делений одноядерных диплоидных гепатоцитов. Полиплоидия клеток печени играет в этих процессах небольшую роль.

2. Пролиферативная активность гепатоцитов в печени человека находится на значительно более низком уровне по сравнению с той, которая наблюдается в печени крыс в сравнимые периоды жизни. Уровни пролиферации гепатоцитов в первые годы постнатальной жизни

человека в 60 раз превышают таковые у взрослого человека, периоде старения уровни ДНК-синтетической активности клеток печени человека в 3 раза превышают таковые в печени человека период зрелости.

3. Клеточная гипертрофия, обусловленная увеличением размере цитоплазмы клеток, является важным фактором нормального репаративного роста печени млекопитающих. Особенно весом вклг этого клеточного механизма роста органов в увеличение мас< печени человека при хроническом гепатите и регенерацию нормал! ного и патологически измененного органа после ЧГ у крыс.

4. Процесс полиплоидизации в печени человека в различи периоды его жизни в целом развивается по известным схема! описанным для лабораторных животных, однако имеет ряд особе! ностей. Они состоят прежде всего в том, что переход клеток ! путь полиплоидизации осуществляется в печени человека с гораз, меньшей вероятностью, чем в печени грызунов. Вероятное вступления диплоидных гепатоцитов человека на путь умножен! генома усиливается в периоде старения, когда наряду полиплоидизацией гепатоцитов по схеме 2с-2с*2-4с появляет прямой переход 2с-4с , сразу превращающий диплоидный гепатоцит тетраплоидный.

5. Полиплоидизация гепатоцитов человека при хроническ гепатите возрастает по мере усиления тяжести поражения печен Характерной чертой этого процесса,в отличие от печени крыс является ускоренное накопление двуядерных клеток с диплоидны ядрами.

6. При длительном хроническом повреждении печени кр четыреххлористым углеродом, заканчивающимся циррозом, и п хроническом гепатите и циррозе печени у человека происход усиленное накопление гликогена в гепатоцитах. Степень гликогено зависит от тяжести поражения печени.

7. Частичная резекция циррозного органа у крыс не приводит измнению морфологической картины печени через 1 мес пос операции, однако содержание гликогена в гепатоцитах при эт снижается до уровня нормы.

8. Ведущую роль при регенерации нормальной и патологичес измененной печени после проведения частичной гепатэктомии игра митотические деления гепатоцитов. Роль полиплоидии как факте роста печени в этом случае незначительна.

9. Функциональная активность полиплоидных гепатоцитов расчете на геном идентична активности диплоидных гепат

цитов. Одноядерные и двуядерные гепатоциты с равным суммарным геномом, в функциональном отношении, являются равноценными клетками.

10. Полиплоидное состояние per se не является существенным механизмом защиты клеток против генотоксического действия повреждающих агентов. Ведущую роль в защите клеток против повреждающего дествия различных «акторов играют процессы детоксикации и репарации ДНК.

11. Размер тела животного, регулируя уровень конкурентных отношений между пролиФеративными и тканеспецифическими синтезами в гепатоцитах , оказывает существенное влияние на межвидовые различия в числе полиплоидных клеток в печени.В целом уровни полиплоидии в печени млекопитающих снижаются при увеличении веса тела животных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Розанов Ю. М. , Кудрявцев Б.Н. Метод флуоресцентной цитофото-метрии для количественного определения ДНК // Цитология. 1967. Т. 9, N5 3. С. 361-367.

2. Кудрявцева М. В., Кудрявцев Б.Н., Розанов Ю. М. Определение количества гликогена в клетках печени крыс с использованием флуоресцентного красителя аурамина 00 // Цитология. 1970. Т. 12, N* 8. С. 1060-1068.

3. Кудрявцев Б. Н., Розанов Ю. М. ЦитоФлуорометрия. Общие принципы // Методы биологии развития. М. : Наука, 1974. С. 497-500.

4. Кудрявцева М. В., Кудрявцев Б. Н., Розанов Ю. М. 0 двух фракциях гликогена в клетках печени крысы (цитоФлуориметрическое исследование) // Цитология. 1974. Т.16, N7. С. 851-858.

5. Кудрявцев Б.Н. ЦитоФлуорометрия ДНК // Автореферат канд.дисс. Л., 1974. 23 с.

6. Кудрявцева М. В. , Иалахметова Т. М. , Кудрявцев Б.Н. Исследование условий сохранения гликогена на мазках изолированных клеток. 1.ЦитоФлуорометрический анализ содержания гликогена в клетках, полученных различными методами изоляции // Цитология. 1977. Т.19, IF9. С. 978-984.

7. Кудрявцев Б.Н., Кудрявцева М. В., Шалахметова Т. М., Завадская Е.Э. Содержание гликогена в клетках печени различной плоидности // Матер. 11 Всесоюзн.симп. по соматической полиплоидии. Ереван, 1977. С. 61-63.

8. Кудрявцев Б. Н., Кудрявцева М. В., Завадская Е.Э., Шалахмето Т. М., Комаров С.А., Комарова Н.И. Метод определения в одной и т же клетке содержания гликогена, ДНК, 3Н-тимидиновой метки сухого веса // Цитология. 1979. Т. 21, №1. С. 74-83.

9. Кудрявцев Б.Н.,Кудрявцева М. В. ,Шалахметова Т. М., Завадск Е.Э.,Ио««е В.А..Барский И.Я., Папаян Г. В. Цитофлуориметрическ исследование содержания гликогена в гепатоцитах различной плои ности у взрослых крыс // Цитология. 1979. Т.21, N* 2. С.218-221.

10. Кудрявцева М. В., Завадская Е.Э., Смирнова С.А., Скорина А.I Кудрявцев Б.Н. Цитофлуорометрическое исследование содержан гликогена в клетках паренхимы печени больных гепатитом Цитология. 1980. Т.22, N4. С.428-433.

11. Кудрявцев Б.Н., Шалахметова Т. М., Кудрявцева М. В., Комаре Н. И., Завадская Е.Э., Комаров С.А. Содержание гликогена синтезирующих и не синтезирущих ДНК гепатоцитах недельных крыс // Цитология. 1980. Т. 22, N5 Б. С. 658-665.

12. Кудрявцев Б.Н., Кудрявцева М. В., Завадская Е.Э., Шалахметс Т. М. Способ определения состава изолированных клеток гистологическом препарате. 1980. Авторское свидетельство N7897'

13. Шалахметова Т. М. , Кудрявцева М. В., Завадская Е.Э., Кудряв! Б.Н. Синтез ДНК и содержание гликогена в гепатоцитах неделы крысят // Тез. докл. vii Всесоюзн.симпоз. "Структура и #унк| клеточного ядра". Харьков, 1980. С.190-191.

14. Смирнова С.А., Евдокимова Т.В., Скорина А. Д., Кудрявщ М. В., Завадская Е.3., Кудрявцев Б.Н. Значение люминесцент! гистохимического исследования гликогена гепатоцитов в диагност; различных форм поражения печени // Труды ЛСГМИ. Т.132. С.75-79

15. Шалахметова Т. М., Кудрявцева М. В., Завадская Е.3., Комар Н.И., Комаров С.А., Кудрявцев Б.Н. Содержание гликогена синтезирующих и не синтезирующих ДНК гепатоцитов крыс разн возраста // Цитология. 1981. Т.23, №5. С.539-544.

16. Шалахметова Т. М. , Кудрявцева М. В., Кудрявцев Б.Н. Содержа белка в гепатоцитах разной степени плоидности у крыс постнатальный период развития // Цитология. 1981. Т.23, N* С. 674-680.

17. Кудрявцев Б.Н., Кудрявцева М. В. , Завадская Е.3., Смирн С.А., Скорина А.Д., Гневашева Г.И. Цитофлуориметрия ДНК изолированных гепатоцитах человека в норме и при заболева хроническим гепатитом // Тез. докл. Всесоюзн. совещания "Люми сцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратур обеспечение". Рига, 1981. С.59-61.

18. Кудрявцева М. В., Завадская Е.Э., Кудрявцев Б.Н.,Смирнова С.А., Скорина А.Л., Гневашева Г. И. Применение цитофлуориметрии флуоресцентной PAS-реакции для определения содержания гликогена и его фракций в гепатоцитах при диагностике различных форм хронического гепатита // Тез.докл. Всесоюзн. совещания "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение". Рига, 1981. С.60-61.

19. Кудрявцев Б.Н., Шалахметова Т. М., Кудрявцева М. В., Завадская Е.Э. Пролиферация и функция гепатоцитов в течение постнатального развития // Тез. докл. vi Всесоюзн. совещания эмбриологов. М., 1981. С. 98.

20. Кудрявцев Б.Н., Кудрявцева М. В. ,Завадская Е.Э., Смирнова С.А., Скорина А.Д. Полиплоидия в печени человека в норме и при заболевании гепатитом // Цитология. 1982. Т. 24, N* 4. С. 436-444.

21. Kudryavtsev B.N. A method for determination of glycogen, DNA, 3 H-thymidine marker and dry weigth in one and same cell // Acta histochem. 1982. Suppl. Bd.26. S.121-123.

22.Кудрявцева M. В., Завадская E.Э., Скорина А.Д., Смирнова С.А., Кудрявцев Б.Н. Метод получения изолированных клеток печени из материала прижизненных пункционных биопсий // Лаб. дело. 1983. N® 9. С. 21-22.

23. Барский И.Я., Кудрявцев Б.Н., Папаян Г.В. Методы и аппаратура люминесцентной цитохимии и гистохимии // Морфология и люминесцентная гистохимия. Чебоксары, 1983. С. 3-11.

24. Кудрявцева М. В., Завадская Е.Э., Кудрявцев Б.Н. Люминесцентная цитофотометрия гликогена и ДНК в клетках печени человека // Морфология и люминесцентная гистохимия. Чебоксары, 1983. С.3-11.

25. Смирнова С. А. , Скорина А. Д., Кудрявцева М. В., Кудрявцев Б.Н. Диагностическое и прогностическое значение количественного определения гликогена в гепатоцитах больных хроническим вирусным гепатитом // Хронический гепатит и циррозы печени. Л.: ЛСГМИ. 1983. С. 19-22.

26. Кудрявцев Б. Н., Майтесян Е. С., Кудрявцева М. В. Интенсивность включения 'Н-аргинина, 3Н-лейцина и 'Н-Фенилаланина в гепатоциты разной степени плоидности // Цитология. 1983. Т. 25, № 4. С. 441-445.

27. Кудрявцева М. В., Кудрявцев Б. Н., Завадская Е.Э., Смирнова С. А., Скорина А.Д. ЦитоФлуорометрическое исследование содержания гликогена и ДНК в изолированных гепатоцитах // Экспериментальная патология печени. Рига: Зинатне. 1983. С. 35-40.

28. Завадская Е.Э., Кудрявцева М. В., Кудрявцев Б.Н., Смирнова

С.А., Скорина А.Д. Сухой вес изолированных гепатоцитов человека норме и при хроническом гепатите // Цитология. 1983. Т.25, № С. 4-47-451.

29. Майтесян Е.С., Кудрявцева М. В., Кудрявцев Б. Цитофлуорометрическое исследование содержания гликогена синтезирующих и не синтезирующих ДНК гепатоцитах регенерируют печени // Цитология. 1983. Т. 25, №5. С. 546-550.

30. Кудрявцев Б.Н., Полянский Ю. И. Рецензия на книгу В.Я.Брс ского и И. В, Урываевой "Клеточная полиплоидия. Пролиферация дифференцировка". М. : Наука, 259 с. // Цитология. 1983. Т.25, 10. С.1223-1225.

31. Кудрявцев Б.Н., Томилин Н.В., Апреликова 0.Н., Майтесян Е.( Туроверова Л.В. Активность фермента репарации ДНК урацил-Д1 гликогилазы у видов млекопитающих, различающихся по продол> тельности жизни и уровню плоидности клеток печени // Цитолоп 1984. Т. 26, К- 1. С. 83-90.

32. Штейн Г.И., Кудрявцева М. В., Кудрявцев Б.Н. Цитофо: метрический анализ диплоидных и полиплоидных ядер гепатоцитов разных долях печени крысы // Структура и функции клеточного яд| Тез. докл. vin Всес. симп. Пущино, 1984. С. 37-38.

33. Кудрявцева М. В., Смирнова С.А., Завадская Е.Э., Кудряв] Б.Н. Фракционный состав гликогена в клетках печени : хроническом вирусном и алкогольном гепатите // Тез. vu науч) практической конференции патологоанатомов Латв.ССР "Пато-морфогенез хронических заболеваний". Рига, 1984. С. 96-97.

34. Кудрявцева М. В. , Завадская Е.Э., Кудрявцев Б.Н. Цитофлуо] метрическое исследование содержания гликогена в клетках печ1 крыс при остром и хроническом отравлении // Тез. vu науч практической конференции патологоанатомов Латв.ССР "Пато-морфогенез хронических заболеваний". Рига, 1984. С.95-96.

35. Кудрявцева М. В. , Завадская Е.Э., Кудрявцев Б.Н., Смирн С.А., Скорина А.Д. Способ диагностики хронического гепати 1984. Авторское свидетельство № 1115722.

36. Кудрявцева М. В., Завадская Е.Э., Иванов В.А., Кудрявцев Б Исследование содержания гликогена в гепатоцитах при хроничес отравлении крыс cci4 и последующей регенерации, вызван частичной гепатэктомией цирротического органа // Тез. Всесоюзн. конференции по регенерации и клеточному размноже "Сравнительные аспекты изучения регенерации и клеточ пролиферации". М., 1985. С.155-158.

37. Кудрявцев Б.Н., Кудрявцева М. В., Завадская Е. Э. 0 моно-

мультипараметрическом анализе гетерогенных клеточных популяций // Научн. труды XI семинара "Автоматизация цитологических исследований". Киев, 1985. С. 67-72.

38. Кудрявцев Б. Н., Штейн Г. И., Терешин Г. Г. Анализ кинетики полиплоидизации клеток паренхимы печени крысы // Цитология. 1986. Т. 28, №8. С. 828-836.

39. Кудрявцева М. В., Завадская Е.Э., Иванов В.А., Кудрявцев Б.Н. Влияние хронической интоксикации крыс cci4 и частичной гепатэктомии патологически измененного органа на уровень гликогена в гепатоцитах // Цитология. 1986. Т.28, №6. С.607-611.

40. Кудрявцева М. В. , Завадская Е. Э. , Кудрявцев Б. Н. Цитофлуориметрическое исследование содержания гликогена в клетках печени при хронической интоксикации крыс cci4 и послечастичной гепатэктомии патологически измененного органа // Компенсаторно-приспособительные процессы в патологии. Рига: Зинатне, 1987. С. 107-111.

41. Ни В. В. , Штейн Г. И. , Майтесян Е. С., Кудрявцев Б. Н. Содержание РНК в гепатоцитах различной плоидности // Цитология. 1988. Т.30, № 3. С. 354-358.

42. Штейн Г.И., Кудрявцев Б.Н. Одновременная Фотометрия ДНК и числа зерен серебра в клетках печени, меченных 3Н-тимидином или 3Н-лейцином // Цитология. 1988. Т.30, №12. С.1472-1477.

43. Кудрявцева М. В., Шашков Б.В., Белоцерковская Э. А., Федоров JI. Ю., Кудрявцев Б.Н. Содержание гликогена и его Фракций в гепатоцитах человека при травматической болезни // Цитология. 1988. Т. 30, №12. С. 1449-1453.

44. Кудрявцева М. В. , Скорина А. Д., Кудрявцев Б.Н., Дейнека 3.Г. Сравнительное цитоФлуорометрическое исследование содержания гликогена в гепатоцитах больных с различными формами алкогольного поражения печени // Матер. ш Всесоюзн. совещания "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение". Рига, 1988. С.114-115.

45. СлепцоваЛ. А., Кудрявцева М. В., Федоров Л. Ю. , Сакута Г. А., Кудрявцев Б.Н. Исследование уровня глюкозо-б-фосфатазы в печени крыс при хроническом отравлении cci4 // Тез. докл.научн. конференции "Биохимия - медицине". Л., 1988. С.176-177.

46. Кудрявцева М. В., Скорина А. Д., Смирнова O.A., Дейнека 3.Г., Кудрявцев Б.Н. ЦитоФлуориметрическое исследование фракций гликогена в клетках печени больных хроническим вирусным и алкогольным гепатитами // Цитология. 1988. Т.30, №6. С. 705-709.

47. Кудрявцева М. В., Скорина А. Д., Сакута Г. А., Дейнека 3. Г.,

Кудрявцев Б. Н. Цитофлуориметрическое исследование coflepiicat гликогена в гепатоцитах больных при различных формах алкогольнс поражения печени // Цитология. 1989. Т. 31, №9. С. 1044-1049.

48. Завадская Е.Э., Кудрявцева М. В., Кудрявцев Б.Н. Измене1 сухого веса гепатоцитов в ходе хронической интоксикации к{ СС14. // Цитология. 1989. Т. 31, W А. С. 419-425.

49. Богданова М. С., Кудрявцева М. В., Кузнецова И. М., Шалахметс Т. М., Завадская Е. 3., Сакута Г. А., Кудрявцев Б. Н. Оце! относительного вклада процессов пролиферации, полиплоидизации гипертрофии клеток в увеличение массы печени на разных стад| постнатального развития крыс // Цитология. 1990. Т.32, N* 7. 695-703.

50. Кудрявцева М. В., Слепцова Э.А., Емельянов A.B., Сакута Г./ Кудрявцев Б.Н. Адаптивные изменения гликогенной Функции гепа' цитов в условиях острого и хронического воздействия факто| окружающей среды на организм // Цитология. 1991. Т.33, N* С. 110.

51. Штейн Г.И., Малев В.В., Кудрявцев Б.Н. Изменение количес 3Н-тимидиновой метки в гепатоцитах разной ппоидности в онтоген! крыс после однократного введения изотопа // Цитология. 19: Т. 33, N* 5. С. 31-38.

52. Кудрявцев Б.Н., Апреликова 0.Н., Ни В.В., Семенова Е. Сухих Т.Р. Исследование уровней репарации ДНК в клет диплоидных и тетраплоидных клеточных культур // Цитология. 19 Т. 33, N5 4. С. 77-84.

53. Кудрявцев Б.Н., Кудрявцева М. В., Сакута Г. А., Штейн Г Кинетика клеточной популяции паренхимы печени человека в тече постнатального развития, в период стабилизации роста и старении // Цитология. 1991. Т. 33, №8. С. 95-107.

Информация о работе

Кудрявцев, Борис Николаевич
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 1991
ВАК 03.00.25

Автореферат

Похожие работы