Морфологическая характеристика репаративной регенерации фетальной печени крыс

Ельчанинов, Андрей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Морфологическая характеристика репаративной регенерации фетальной печени крыс
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Морфологическая характеристика репаративной регенерации фетальной печени крыс"

На правах рукописи

4844971

ЕЛЬЧАНИНОВ АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ ФЕТАЛЬНОЙ ПЕЧЕНИ КРЫС

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 2 МАЙ 2011

Москва - 2011

4844971

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте морфологии человека РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Большакова Галина Борисовна

Яглов Валентин Васильевич Боронихина Татьяна Владимировна

Ведущее учреждение: ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Защита диссертации состоится «26»_мая_2011 года в _12.00_часов на заседании

диссертационного совета Д 001.004.01 при Учреждении Российской академии наук Научно-исследовательском институте морфологии человека РАМН по адресу: 117418, г. Москва, ул. Цюрупы, д.З

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ морфологии человека РАМН Автореферат разослан «_» апреля 2011 г.

Учепын секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Л.П. Михайлова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Репаративная регенерация печени млекопитающих в разные периоды постнатальной жизни подробно изучена [Сидорова В.Ф, 1976]. В частности, показано, что у новорожденных млекопитающих печень после резекции хорошо регенерирует. При этом масса органа восстанавливается за счет размножения и гипертрофии гепатоцитов, а отрастания значительного количества паренхимы от раневой поверхности не происходит, что характерно для регенерационной гипертрофии [Сидорова В.Ф., Рябинина З А., Лейкина Е.М., 1966, Michalopoulos G.K., DeFrances М.С., 1997]. Следовательно, способность печени к регенерации формируется во время органогенеза в пренатальном периоде. Однако сведения о восстановительном росте печени плодов млекопитающих отсутствуют.

С самого начала изучения феномена регенерации многие исследователи отмечали некоторое сходство между этим процессом и эмбриональным развитием органов. Особенно это заметно при развитии и регенерации конечности амфибий [Лиознер Л.Д., 1982]. Сходные черты между эмбриональным развитием и регенерацией можно обнаружить и при восстановлении паренхиматозных органов. Например, после удаления части печени у взрослых млекопитающих гепатоциты начинают активно размножаться и синтезировать а-фетопротеин - маркер гепатобластов, чего не отмечается в печени взрослых особей в норме [Michalopoulos G.K., DeFrances М.С., 1997]. Однако между эмбриональным развитием и регенерацией органов есть коренные различия. При регенерации печени в постнатальном периоде удаленные доли не формируются вновь [Сидорова В.Ф., Рябинина З.А., Лейкина Е.М., 1966].

В регенерирующих фетальных органах млекопитающих восстановительный процесс сочетается с органогенезом. В связи с этим неизвестно, будут ли наносимая травма и последующая регенерация изменять дальнейший ход развития данного органа.

Помимо фундаментальной значимости, изучение регенерации в пренатальном периоде у млекопитающих имеет и практическую ценность. В конце 90-х годов XX века в клиническую практику внедрен ряд операций на плодах человека, поэтому выяснение восстановительной способности органов млекопитающих в пренатальном периоде после механической травмы является актуальным [Rychik J. et al., 2004].

Врожденные опухоли печени человека характеризуются крайне тяжелой клинической картиной и высокой смертностью пациентов. Клиническое течение таких опухолей часто осложняется водянкой плода, респираторным дистресс синдромом новорожденных, сердечной недостаточностью. Наиболее часто среди врожденных

опухолей печени встречается гемаппюма, мезенхимальная пшартрома, геиатобластома [Isaacs II. Jr., 2007]. Разработка экспериментальных моделей повреждения печени плодов млекопитающих, а также »пучение закономерностей регенерации фетальной печени позволит обосновать и внедрить в клиническую практику раннее хирургическое лечение врожденных опухолей печени человека.

Цель исследования — изучить особенности репаратшшой регенерации печени плода крысы после резекции,

Задачи исследования:

1. Разработать воспроизводимую модель резекции фетальной печени крысы;

2. Проследить динамику восстановления массы оперированной фетальной печени через 1,2, 3,7, 10, 14 и 25 сут после резекции;

3. Изучить изменение объемной доли тепатоцитов и гемопоэтичеекпх клеток и печени плодов крысы в ответ на резекцию через 3 ч. 1,2, 3 и 7 сут после операции;

4. Исследовать пролиферацию гепатоштгов с помощыо определения их митотического индекса, а также с использованием иммуногистохимического маркера пролиферации Ki67 через 6 ч, 1, 2,3,7,10 и 14 сут после резекции печени плодов крысы;

5. Изучить суточную динамику митогической активности гепатонитов в течение 48 ч после резекции в печени плодов крысы;

6. С помощью определения соотношения митотнческнх фаз оценить стабильность времени митоза гепатонитов в оперированной печени плодов крысы;

7. Проследить динамику изменения плошали гепашцито» н их ядер в оперированной и интактной печени плодов крысы через I, 2, 3, 7, 10, 14 и 25 сут после резекции, и таким образом, оценить вклад гипертрофии гепатонитов в регенерацию печеик плода крысы;

S. С помощыо гистологических методов исследовать процессы роста в области резекции печени плодов крысы, оценить в перираневой зоне пролиферацию гепатонитов с помощыо определения их мн готического индекса, а также с использованием иммуногистохимического маркера пролиферации Ki67, на основании полученных результатов определить способ регенерации печени плода крысы.

Научная новизна

Разработана оригинальная воспроизводимая модель резекнин печени плода крысы со стандартным объемом повреждения (22±3,7% массы органа)

Впервые показано, что печень плода крысы способна к регенерации в очень короткий срок. Масса печени плодов, оперированных на 17-ые сут развития, восстанавливается уже через 2 сут после резекции.

С помощью морфометрического анализа показано, что наносимая травма и регенерация не вызывают изменения соотношения гепатоцитов и гемопоэтических клеток печени плода, что свидетельствует об отсутствии ускоренного угасания гемопоэза в печени плодов крысы.

Выявлено, что гипертрофия гепатоцитов не играет существенной роли в восстановлении массы фетальной печени крысы, регенерация осуществляется практически только за счет митотического размножения гепатоцитов.

При исследовании пролиферации гепатоцитов установлено, что резекция фетальной печени крысы стимулирует размножение клеток как в перираневой зоне, так и на расстоянии от нее. Это свидетельствует о равномерном росте печени, и о способе ее регенерации - регенерационной гипертрофии.

Показано, что наносимая травма не вызывает нарушения прохождения гепатоцитами стадий митотического цикла. Об этом свидетельствуют незначительные изменения соотношения фаз митоза на разных сроках после операции, сильная положительная корреляция между индексом метафаз и митотическим индексом в опыте и контроле, а также предшествование многократного увеличение количества К.167-положительных гепатоцитов пику митотического индекса.

На основании того, что после резекции печени плода крысы сохраняется динамика увеличения массы органа, соотношение гепатоцитов и гемопоэтических клеток, прохождение гепатоцитами митотического цикла, сроки возрастной гипертрофии гепатоцитов не изменяются в оперированной печени, можно заключить, что резекция 22±3,7% массы не нарушает общего хода развития печени плода крысы.

Научно-практическая значимость

В результате проведенного исследования получены новые данные, которые теоретически обосновывают возможность операции на печени плода при определенных видах врожденной патологии (гепатобластома и др. опухоли) и высокую вероятность благоприятного исхода.

Полученные данные могут быть использованы в процессе преподавания в вузах медицинского и биологического профиля по специальностям гистология, эмбриология, цитология и патологическая анатомия.

Оригинальная модель повреждения печени в пренатальном возрасте может быть использована в научно-исследовательских разработках.

Положения, выносимые на защиту

Печень плода после удаления части паренхимы способна к регенерации, которая осуществляется так же, как и у взрослых животных, по способу регенерационной гипертрофии. Однако имеются возрастные особенности: регенерация печени плодов осуществляется без участия гипертрофии гепатоцитов. Масса оперированной печени увеличивается за счет митотического размножения гепатоцитов, распределенных равномерно по всему органу. Суточная периодичность пролиферации гепатоцитов как в регенерирующей, так и интактной печени плодов крысы не выявлена.

После резекции фетальной печени и в ходе последующей регенерации соотношение гепатоцитов и гемопоэтических клеток оперированной печени плодов крыс не отличается от таковых у одновозрастных интактных животных, то есть регенерация протекает органотипически.

Наносимая травма не вызывает изменения общего хода развития фетальной печени крысы по сравнению с контролем, что проявляется в динамике увеличения массы оперированной печени, в отсутствии ускоренного угасания гемопоэза и гипертрофии гепатоцитов.

Апробация работы

Результаты исследований и основные положения работы доложены и обсуждены на конференциях «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (г. Москва, 2010), на VII Всероссийской конференции по патологии клетки (г. Москва, 2010), на межлабораторных конференциях НИИ морфологии человека РАМН (март, апрель 2011).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, общей характеристики материала и методов исследования, главы собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы.

Объем диссертации составляет 126 страниц компьютерного текста и включает 10 таблиц и 31 рисунка. Список литературы включает 161 источников, из которых 33 отечественных и 128 зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Объект исследования

В работе использовали 17-суточные плоды крыс Вистар от самок с датированной беременностью. Срок гестации устанавливали по обнаружению сперматозоидов во влагалищном мазке крысы (нулевые сутки). Всего было исследовано 229 плодов в возрасте 17, 18, 19 сут внутриутробного развития, 56 крысы в возрасте 3-21 сут.

Методы исследования

Методика повреждения печени и ее воспроизводимость были предварительно отработаны на 120 плодах. Оперирование и вывод животных из эксперимента осуществляли под эфирным наркозом. При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г. На проведение эксперимента получено разрешение биоэтической комиссии УРАМН НИИ морфологии человека РАМН (протокол № 6 от 18.05.2009).

Выбор срока беременности, на котором производили операцию, обусловливался несколькими причинами. Во-первых, 17-суточные плоды имеют достаточные размеры для манипуляций; во-вторых, после операции на этом сроке развития остается достаточно времени для развертывания репаративого процесса именно во внутриутробном периоде.

Методика операции

Под эфирным наркозом разрезали переднюю брюшную стенку крысы, в рану выводили рог матки с плодами, при этом печень плода была хорошо видна. Разрезали стенку матки и плодные оболочки, делали небольшой (3-4 мм) надрез кожи плода в середине проекции печени справа.

После надреза кожи плода с помощью препаровальной иглы в рану выводили свободный край печени и отсекали его, проводили термокоагуляцию раневой поверхности. Далее ушивали кожу плода и стенку матки. Потерю амниотической жидкости восполняли теплым физиологическим раствором. Рог матки возвращали в брюшную полость. У каждой самки оперировали 5-6 плодов, остальные служили контролем. Всего прооперировано 528 плодов, из них выжило 254. Таким образом, смертность оперированных плодов составила примерно 50 %.

Все оперированные самки и контрольные плоды выжили.

Проводили две серии опытов. В первой серии изучали влияние резекции плода крысы на общее развитие печени в пренатальном и раннем постнатальном периоде.

Животных усыпляли эфиром и выводили из эксперимента через 3 ч, 6 ч, 1, 2, 3, 7, 10, 14, 25 сут после операции.

Печень взвешивали, фиксировали в жидкости Карнуа, обезвоживали в этиловом спирте, проводили через хлороформ, заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином с докраской эозином и по Маллори. Опытные и контрольные группы состояли из 7-10 животных. Всего в I серии исследовано 134 животных.

Для оценки клеточного состава фетальной печени определяли объемную плотность гепатоцитов, гемопоэтических клеток. Морфометрический анализ проводили методом «полей» с помощью сетки из 10 узлов, свободно передвигаемой по всей области на нескольких срезах (200 тест-точек на печень) при общем увеличении светового микроскопа 1500.

Для исследования митотической активности гепатоцитов определяли митотический индекс (МИ), выраженный в промилле (%о) Чтобы установить способ регенерации фетальной печени необходимо оценить процессы роста в области травмы. Для этого мы определяли МИ гепатоцитов отдельно для перираневой области и зоны вне ее.

Перираневой зоной мы считали неповрежденные ткани печени, находящиеся в пределах 100 мкм от края раневой поверхности. Ткани, расположенные дальше, чем 100 мкм от края раневой поверхности обозначим отдаленными.

На препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, подсчитывали митозы гепатоцитов на 6000 клеток для каждого животного. При подсчете митозов учитывали их фазу, определяли процентную долю каждой фазы ко всем митозам и ее индекс по отношению ко всем просчитанным гепатоцитам, выраженный в %о, что давало возможность оценить стабильность времени прохождения митоза гепатоцитами.

Во второй серии опытов изучали суточную динамику митотической активности гепатоцитов регенерирующей печени пода крысы. Животных выводили из эксперимента с интервалом 3 ч через 3 - 48 ч после операции. Опытные и контрольные группы состояли из 7-10 животных. Митотическую активность гепатоцитов печени плодов крысы определяли так же, как и в первой серии опытов. Всего во 2 серии исследовано 200 плодов.

Для изучения ядерно-цитоплазматических отношений гепатоцитов готовили мазки-отпечатки печени, фиксировали абсолютным этиловым спиртом, окрашивали гематоксилином и эозином. На цифровых микрофотографиях, сделанных при увеличении х1500, с помощью планшета, обводили контуры гепатоцитов и их ядер (100 гепатоцитов

на каждое животное). Площадь ядра и цитоплазмы определяли в программе Image Scope М.

Чтобы оценить объем популяции размножающихся гепатоцитов в оперированной печени, мы использовали поликлональные антитела к ядерному белку Ki67, который выявляется в клетках в позднем Gr, G-з, S-периодах, а также в хромосомах делящихся клеток (в Go- и раннем Gi-периоде Ki67 не обнаруживается) [Lindboe С.F., Torp S.H., 2002].

Иммуногистохимическое исследование печени проводили через 12, 15, 24, 36, 48 ч и 7, 10, 14 суток после операции (по 3 оперированных и контрольных животных на каждый срок). Материал фиксировали в жидкости Карнуа, заливали в парафин, готовили срезы толщиной 4 мкм на предметных стеклах Menzel-Glaser® SuperFrost® Plus GOLD.

Иммуногистохимическая реакция включала следующие этапы: (1) депарафинирование срезов и доведение их до воды через ряд спиртов нисходящей концентрации; (2) демаскировка антигена путем кипячения срезов в цитратном буфере (pH 6.0) - 30 мин, с последующим охлаждением при комнатной температуре в течение 20 мин; (3) инкубация срезов с блокатором эндогенной пероксидазы - 15 мин; (4) инкубация срезов с протеиновым блокатором - 10 мин; (5) инкубация срезов с первичными кроличьими антикрысиными антителами к Ki 67 (prediluted, Abeam, UK) -2ч при комнатной температуре или к каспазе 3 (разведение 1:100, Abeam, UK) -12 ч при 4°; (6) инкубация срезов с биотинизированными овечьим антикроличьими вторичными антителами (Abeam, UK) - 15 мин; (7) инкубация срезов со стрептовидином, конъюгированным с пероксидазой (Abeam, UK); (8) инкубация срезов с раствором DAB (Abeam, UK) - 2 мин. После каждого этапа срезы споласкивали в PBS (pH 7.4).

Подмышечный лимфоузел взрослой крысы использовали как положительный контроль. Негативным контролем служили срезы, при постановке

иммуногистохимической реакции с которыми первичные антитела не использовали.

Все срезы докрашивали гематоксилином Караччи. На препаратах подсчитывали меченые клетки, затем вычисляли индекс Ki67 на 2000 просмотренных гепатоцитов в процентах.

Для показателей площади и массы вычисляли средние значения и стандартное отклонение, для долей - среднее значение и стандартную ошибку среднего по формулам для долей. Границы 95%-ных доверительных интервалов для долей рассчитывали с помощью ф-трансформацнн. Абсолютные показатели при нормальном распределении сравнивали с помощью /-критерия Стьюдента. При распределении, отличающемся от нормального, использовали тест Манна-Уитни. Сравнение двух выборочных долей

■проводили с помощью z-критерия. Соотношение фаз митозов сравнивали с помощью критерия %2. Для выявления корреляционных отношеннй использовали коэффициент корреляции Спирмена. Сравнение показателей ядерио-цитоплазматических отношений и отношения массы печени к массе тела животного проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа. [Юнкеров В.И., Григорьев С.Г., 2002]. Различия считали значимыми при 5% уровне достоверности. Данные были проанализированы с помощью программы Sigma Stat 3.5 (Systat Software, Inc.).

Результаты исследования и их обсуждение

Морфологические особенности нормальной и поврежденной фетальноЦ печени

На 17-е сут печень плодов крысы состояла из плотной сети трабекул, образованных крупными гепатоцитами полигональной формы, подавляющее большинство которых содержало одно большое светлое ядро с одним крупным ядрышком. Эпителий желчных протоков при окраске гематоксилином и эозином не обнаруживался. Среди гепатоцитов и гемопоэтических клеток часто наблюдались фигуры митоза.

Через 3 ч после операции ткань в печени формировалась зона некроза, в которой преобладали округлые клетки с пикнотичным ядром и ярко оксифильной цитоплазмой. Строение печени вне зоны резекции визуально не отличалось от внутренней структуры печени контрольных плодов. Сходная картина наблюдалась через 6ч, I и 2-е сут после операции.

Через 3-е сут (возраст плодов - 20 сут) в области травмы погибающих клеток и форменных элементов крови становилось заметно меньше. Между нормальной паренхимой и зоной некроза была видна граница, в области которой при окрашивании по Маллори выявлялись единичные коллагеновые волокна. На расстоянии от раневой поверхности в периваскулярной соединительной ткани появлялись первые желчные протоки. Как у оперированных, так и у интактных плодов в синусоидах уменьшалось количество гемопоэтических клеток.

На 7-е сут после операции (2 сут после рождения) в печени оперированных и контрольных животных происходило значительное угасание гемопоэза. В области периваскулярной соединительной ткани обособлялись желчные протоки. В области повреждения количество соединительной ткани увеличивалось.

На 10-е и 14-е сутки после операции (6 и 10 сут постнатальной жизни соответственно) строение печени оперированных животных вдали от области травмы не отличалось от такового у неоперированного контроля. Паренхима состояла из

гепатоцитов, организованных в трабекулы, которые вблизи сосудов приобретали радиальное направление. Среди гепатоцитов иногда встречались двуядерные. В синусоидах обнаруживались немногочисленные скопления гемопоэтических клеток. Выявлялись портальные триады с хорошо дифференцированными желчными протоками.

Через 25 сут после операции (21сут постнатальной жизни) в печени контрольных животных гепатоциты были организованы в дольки, гемопоэтические клетки полностью отсутствовали. Паренхима печени экспериментальных животных вне области травмы не отличалась от контрольной. По сравнению с предыдущими сроками в области резекции в соединительной ткани происходило увеличение плотности коллагеновых волокон.

Таким образом, при резекции печени 17-суточных плодов крысы отрастания паренхимы печени от раневой поверхности не происходило. В области травмы наблюдалось образование соединительной ткани.

Восстановление массы печени

Массу оперированной печени определяли через Зч, 6ч, 1, 2, 3, 7, 10, 14 и 25 сут после операции (Рис. 1).

500,0 450,0 400.0 350,0 300,0 250,0 200,0 150,0 100,0 50.0 0,0

Зч 6 ч 1Sf/1 Ш2 21 f/3 3post/7

Рис. 1. Масса печени оперированных (непрерывная линия) и контрольных животных (пунктирная линия).

f — фетальный период, post - постнатальный период. По оси абсцисс -возраст/сутки после операции, по оси ординат - масса печени в мг.

♦,**,*** — статистически значимые различия по сравнению с одновозрастным контролем (р<0,0 5).

Масса печени подопытных плодов через 3 ч после операции составила 99±9,7 мг, масса печени контрольных плодов - 127,1±15,7 мг. Исходя из полученных данных, можно

заключить, что разработанный способ операции позволил удалить 22,0±3,7% массы печени. Масса оперированной печени плодов была достоверно меньше, чем у одновозрастных интактных животных через 3 ч, 6 ч и 1 сут после операции (/><0,05). Через 2-е сут и далее до 25 сут включительно после частичной гепатэктомии масса печени не отличалась от контрольной (р>0,05).

Таким образом, масса фетальной печени крыс после 20% резекции восстанавливалась через 2 сут после частичной гепатэктомии, то есть еще в пренатальном периоде. Полученные данные подтверждают общую возрастную закономерность регенерации печени - зависимость скорости регенерации от возраста животных, то есть чем моложе животные, тем быстрее у него регенерирует печень [Сидорова В.Ф., 1969; Bûcher N.R., Swaffield M.N., 1964]. Масса печени оперированных животных положительно коррелирует с массой печени контрольных животных (/=0,97; /><0,05), следовательно, нанесенная травма не вызывает изменения характера дальнейшего роста печени.

Клеточный состав печени после гепатэктомии в пренатальном периоде

Соотношение гепатоцитов и гемопоэтических клеток в печени определяли через 3 ч, 1, 2, 3 и 7 сут после операции. Более половины объема печени 17-ти суточных плодов крысы занимали гепатоциты и гемопоэтические клетки. С возрастом объемная доля кроветворных клеток постепенно снижалась, а гепатоцитов нарастала (Рис.2, 3), что согласуется с данными литературы [Greengard О., Federman M., Knox W.E., 1972; Vassy J. et al., 1988]. Сходная динамика клеточного состава наблюдалась и в печени оперированных плодов. По сравнению с одновозрастным контролем объемная плотность гепатоцитов и гемопоэтических клеток в оперированной печени через 3 часа после операции не отличалась от контрольных значений, через 2, 3 и 7 сут, когда масса печени восстанавливалась, различий также не было (Рис.2, 3). Полученные данные свидетельствуют об отсутствии отека печени в ответ на травму, а также об отсутствии преждевременного угасания гемопоэза в оперированной печени плодов крысы Подобный тип восстановительного процесса можно рассматривать как органотипический [Бабаева А.Г., 2009].

По некоторым представлениям, регенерация в постнатальном периоде вызывает ускорение возрастного созревания данного органа [Сидорова В.Ф., 1969]. Однако, пренатальная травма и последующая регенерация не вызывают ускорения развития печени в позднем пренатальном и раннем постнатальном периоде, так как преждевременное угасание гемопоэза в оперированной печени плодов крысы отсутствовало.

100,0

80,0 60.0 40,0 20.0 0,0

34 1Sf/1 19Г/2 2И/3 3post/7

Рис.2. Объемная плотность гепатоцитов в печени оперированных (непрерывная линия) и контрольных животных (пунктирная линия)

По оси абсцисс - возраст/сутки после операции, по оси ординат - объемная плотность (%).

f-фетальный период, post - постнатальный период.

* — статистически значимые различия по сравнению с одновозрастным контролем (рО,05).

Рис 3. Объемная плотность гемопоэтических клеток в печени оперированных (непрерывная линия) и контрольных животных (пунктирная линия)

По оси абсцисс - возраст/сутки после операции, по оси ординат - объемная плотность (%).

f- фетапьный период, post - постнатальный период.

* — статистически значимые различия по сравнению с одновозрастным контролем (Р< 0,05).

Митотическнй индекс гепатоцитов вне зоны повреждения в пре- н постнаталыюм периодах после резекции печени плодов крыс

Митотическнй индекс определяли через 6 ч, 1, 2, 3, 7, 10 и 14 сут после операции (Рис.4.). В печени оперированных подов по сравнению с одновозрастным контролем

через 6 ч после операции МИ гепатоцитов статистически значимо снижался, а через 1 сут происходил статистически значимый подъем МИ гепатоцитов (р<0,05). Динамика МИ гепатоцитов в оперированной печени схожа с таковой в печени контрольных животных, что подтверждается наличием сильной положительной корреляции между МИ в опытных и контрольных группах (г= 0,79, р= 0,015). В печени оперированных и контрольных плодов митотическое размножение гепатоцитов к концу пренатальном периода практически прекращалось. В течение первых суток постнатальной жизни пролиферация гепатоцитов вновь активировалась и далее с возрастом постепенно угасала. Эти результаты согласуются с литературными данными [А\уас1 М.М. е1 а1, 1997; 51§а1 8.И й. а1., 1999] Поскольку повышение МИ гепатоцитов в оперированной печени предшествовало по времени восстановлению массы печени, то усиление митотической активности гепатоцитов, скорее всего, связано с восстановительным ростом печени.

Рис. 4. Митотический индекс гепатоцитов в пренатальном и раннем постнатальном периоде в печени оперированных (непрерывная линия) и контрольных животных (пунктирная линия)

По оси абсцисс - возраст/сутки после операции, по оси ординат - митотический индекс гепатоцитов (%о).

Г - фетальный период, роэ! - постнатальный период, планки погрешности -доверительные интервалы. *— статистически значимые различия (/т<0,05)

Суточная динамика митотической активности гепатоцитов вне зоны повреждения в печени плодов крыс после резекции

При изучении суточной динамики митотической активности гепатоцитов отмечено, что МИ через 6 ч после операции в опыте был достоверно ниже (р<0,05), чем в контроле, что, видимо, связано с операционным стрессом (Рис.5). Далее МИ гепатоцитов

статистически значимо увеличивался по сравнению с предыдущим сроком, и через 9 ч после операции МИ в опыте и контроле не различались (р>0,05). Через 12 ч и далее, вплоть до 36 ч после операции включительно, а также через 42 ч после операции, у подопытных животных МИ был достоверно выше, чем в контроле (р<0,05).

Сравнивая полученные данные о пролиферации гепатоцитов в регенерирующей печени плода крысы с полученными ранее данными о пролиферации в регенерирующей печени в постнатальном периоде [Романова Л.К., 1984, Bûcher N.R., Swaffield M.N., DiTroia A.F., 1964], можно заключить, что в пренатальном периоде пролиферация гепатоцитов активируется раньше.

Рис 5. Митотический индекс гепатоцитов вне зоны резекции в печени оперированных (непрерывная линия) и контрольных животных (пунктирная линия) в течение 48 ч после резекции печени плода

По оси абсцисс верхняя шкапа - часы после операции, нижняя шкала - время суток, по оси ординат - митотический индекс гепатоцитов (%о).

Планки погрешности - доверительные интервалы.

Наибольшего значения МИ достигал через 12 ч (14±0,6%о) после операции и через 24 ч (16,1±0,6%о). Как известно, пик митозов гепатоцитов в постнатальном периоде возникает только при достаточно обширных резекциях печени, при этом, чем моложе животное, тем меньшее количество паренхимы печени необходимо резецировать [Bûcher N.R., Swaffield M.N., DiTroia A.F., 1964; Lambotte L. et al., 1997]. Таким образом, резекция примерно 20% массы печени 17-суточных плодов крысы является достаточно сильным регенерационным стимулом для органа.

Циркадный ритм митотической активности гепатоцитов как в оперированной, так и в контрольной печени плодов не был выявлен. Это, видимо, связано с тем, что

установление суточной активности, так называемых генов биологических часов в печени (Bmal-1, Clock, Perl-2, Cry 1-2) происходит лишь в постнаталъном периоде [Sládek М. et al., 2006, Yamazaki S. et al., 2009],

Оценка стабильности времени митоза гепатоцитов вне перираневой зоны после резекции печени плодов крыс

Косвенно оценить прохождение клетками митоза можно с помощью определения соотношение митотических фаз [Алов И.А., 1972; Доброхотов В Н., Валвас B.C., 1981, Большакова Г.Б., 2008]. Соотношение фаз митозов гепатоцитов изучали через 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 39, 42 ч, а также через 2, 7 и 10 сут (Рис.6).

60% 50% 40% 50% 20% 10%

н л А ь Л л ь ■Ú ь л ь X н ь h h л Н А ь л

2 <=1 Г 2 ^ 2 с; 3 2 2 2

с 0 0 О О о С О с о с о с О о о с о с О с О

О г 0 F о F о F о F о F О э о F о р о F О F о F О р о F

X X г I X I X X Г X X X X X

о о о о о О о о о о о о о о

х X X X * X X X X X s: X X X

бч 9 ч 12 ч 15 ч 18 ч 24 ч 27 ч 30 ч 36 ч 39 ч 42 ч 48 ч 7 сут 10 сут

□ профаза Ометафаза Я анафаза 1телофаза

Рис.6 Соотношение фаз митоза гепатоцитов печени вне зоны резекции и в контроле

По оси абсцисс - время после операции, по оси ординат - доля митотических фаз.

Чаще всего среди делящихся гепатоцитов в опыте и контроле встречались метафазы (Рис. 6), их доля на разных сроках после операции колебалась в пределах 5070%. Следовательно, длительность деления гепатоцитов плодной печени зависит главным образом от времени метафазы. Поскольку достоверных различий между долями метафаз в опыте и контроле на большинстве сроков не было обнаружено (Рис. 7), то можно предположить, что и длительность всего митоза в опыте и контроле не различалась.

Уменьшение доли метафаз по сравнению с контролем через 36 ч после вмешательства является отражением, на наш взгляд, завершения периода активной пролиферации гепатоцитов в регенерирующей печени плодов крысы, поскольку совпадало со значительным снижением митотической активности гепатоцитов на этом сроке.

Корреляционный анализ выявил сильную положительную корреляцию между митотическим индексом гепатоцитов и индексом метафаз в опытных и контрольных группах (»=0,96, р<0,05 и /=0,90, р<0,05 соответственно), что исключает наличие блока митоза.

100 ■

ПТ

12ч 15ч 18ч 24ч

36ч 39ч 42ч 48ч 7суг

Рис. 7. Доля метафаз гепатоцитов в перираневой области, вне ее и в контроле

По оси абсцисс - время после операции, по оси ординат - доля метафаз (%), планки погрешности - доверительные интервалы.

Белые столбики - доля метафаз гепатоцитов в перираневой области, серые столбики - доля метафаз вдали от области повреждения, черные столбики - доля метафаз гепатоцитов в контроле. * — статистически значимые различия (р<0,05).

Иммуногистохимическое исследование пролиферации гепатоцитов вне зоны повреждения

Иммуногистохимичекое исследование печени оперированных и интактных животных проводили через 12 , 15, 24, 36, 48 ч, а также через 7, 10 и 14 сут после операции. Индекс Кт67 гепатоцитов регенерирующей печени плода через 12 ч, 15 ч и 24 ч после операции (Рис. 8) был статистически значимо выше, чем в контроле (р<0,05). Наибольшего значения индекса Кл67 гепатоцитов в опыте достигал через 15 ч после операции (8,4±0,3%). Таким образом, при восстановлении массы фетальной печени пролиферация охватывала большее количество гепатоцитов, чем предполагалось на основании данных о митотической активности. Через 7 сут после операции (3 сут

постнатальной жизни) индекс Кл67 в опытной группе был статистически значимо выше, чем в контроле (р <0,05). Возможно, это объясняется тем, что у подопытных плодов из-за дополнительного операционного стресса пролиферация гепатоцитов после родов возобновилась с некоторым опозданием по сравнению с одновозрастным контролем, в котором она уже начала снижаться.

Клетки, в которых началась экспрессия К167, в дальнейшем с большой вероятностью вступают в митоз [1Лпс1Ьое СБ., Тогр Б.Н., 2002], поэтому данный маркер в совокупности с подсчетом митозов можно также использовать для оценки прохождения стадий митотического цикла. Пик индекса К167 наблюдался на 9 ч раньше наибольшего подъема МИ гепатоцитов, то есть можно утверждать, что пролиферирующие фетальные гепатоциты быстро проходили стадии клеточного цикла, предшествующие делению, и без

Рис. 8 Индекс Ю67 гепатоцитов вне зоны резекции в печени оперированных (непрерывная линия) и контрольных животных (пунктирная линия)

По оси абсцисс - время после операции, по оси ординат - индекс К167 гепатоцитов

(%).

Планки погрешности - доверительные интервалы.

*— статистически значимые различия по сравнению с одновозрастным контролем (¿><0,05)

Характеристика пролиферации гепатоцитов в перираневой области

Митотическую активность гепатоцитов в перираневой зоне регенерирующей печени плода крысы изучали через 6, 9, 12, 15, 18,24, 27, 30,33, 36, 39,42,45,48ч, а также через 7 и 10 сут. МИ в околораневой зоне ни на одном из сроков после операции не превышал МИ вне области резекции (Рис. 9). Через 6, 9, 12, 18 и 24 ч он был статистически значимо меньше чем МИ на расстоянии от места повреждения (р<0,05). По

сравнению с интактным контролем МИ гепатоцитов перираневой зоны через 6 после операции был достоверно ниже (р<0,05), а через 24, 30, 36, и через 42 ч достоверно выше (р<0,05). Через 7 и 10 суток после операции различий между МИ гепатоцитов в перираневой области, вне нее и в контроле не было. Обнаружена сильная положительная корреляция между МИ гепатоцитов вблизи от места травмы и на расстоянии от нее (/-=0,78, р<0,005).

сут

Рис. 9. Митотический индекс гепатоцитов перираневой зоны (непрерывная линия) и на расстоянии от нее (пунктирная линия) в печени оперированных животных

По оси абсцисс - время после операции, по оси ординат - митотический индекс гепатоцитов (%о).

Планки погрешности - доверительные интервалы. *— статистически значимые различия (р<0,05)

Чаще всего среди делящихся гепатоцитов в перираневой области, как и на отдалении от нее и в контроле встречались метафазы (Рис.7, Рис.10). Корреляционный анализ выявил сильную положительную корреляцию между митотическим индексом гепатоцитов и индексом метафаз вблизи от зоны повреждения (>-0,97, р<0,05), что свидетельствует о стабильности течения и отсутствии блока митоза гепатоцитов в перираневой зоне.

100% 90»

5054 40%

4> | О

1111

15Н

24Н

ОП ОМ НА 1Т

10<1ау

Рис. 10. Соотношение фаз митоза гепатоцитов в перираневой области и в контроле

По оси абсцисс - время после операции, по оси ординат - доля митотических фаз.

Индекс К.167 гепатоцитов в перираневой области определяли через 12 , 15, 24, 36, 48 ч, а также через 7 и 10 сут после операции (Рнс. 11). Индекс Кл67 гепатоцитов перираневой области был статистически значимо меньше чем на расстоянии от области травмы через 12 ч и 15 ч после операции, а через 10 сут после вмешательства (7 сут постнатальной жизни) достоверно выше (/?<0,05). По сравнению с одновозрастным контролем через 15, 24 ч и 10 сут после вмешательства индекс Кл67 гепатоцитов в зоне повреждения был достоверно больше (р<0,05), а через 36 ч ниже, чем в контроле (/><0,05). Индекс Кл67 в перираневой области положительно коррелирует с индексом Кл67 вне зоны резекции (г=0,857,р=0,006).

Таким образом, активность пролиферация гепатоцитов в перираневой области ни на одном из сроков исследования достоверно не превышал активность пролиферации гепатоцитов на расстоянии от зоны резекции. Полученные данные свидетельствуют о том, что значительного отрастания паренхимы от раневой поверхности при регенерации печени плодов крыс не происходит, го есть способ регенерации фетальной печени -регенерацнонная гипертрофия [Сидорова В.Ф, Рябинина З.А., Лейкина Е.М., 1966; Бабаева А.Г.,2009].

12ч

15ч

24 ч

36 ч

48 ч

7 сут Юсут

Рис. 11 Индекс Кл 67 гепатоцитов оперированной печени в перираневой области (непрерывная линия) и на расстоянии от нее (пунктирная линия)

По оси абсцисс - время после операции, по оси ординат - индекс Кл 67 гепатоцитов

Планки погрешности - доверительные интервалы.

* — статистически значимые различия (р<0,05)

Площадь гепатоцитов и их ядер в пре- и постиаталыюм периодах после резекции печени плодов крыс

Площадь гепатоцитов и их ядер определяли через 1, 2, 3, 7, 10, 14 и 25 сут после операции (Рис. 12, 13). С возрастом площадь гепатоцитов и их ядер в оперированной и интактной печени статистически значимо снижалась (р><0,05). Площадь одноядерных гепатоцитов и их ядер, ядерно-цитоплазматические отношения гепатоцитов в опытных группах ни на одном из сроков исследования не отличались от контроля (р>0,05). Гепатоциты печени плодов крысы представлены практически полностью одноядерными клетками [Бродский В.Я., Урываева И.В., 1981; Gupta S., 2000; Margall-Ducos G. et al., 2007], что согласуется с нашими данными. Образование двуядерных клеток в результате ацитокинетического митоза является ключевым этапом в процессе полиплоидизации гепатоцитов [Nada! С, Zajdela F., 1966; Бродский В Я, Урываева И.В., 1981; Gupta S., 2000]. Двуядерные гепатоцитов обнаруживались в небольшом количестве в мазках-отпечатках печени оперированных и контрольных животных только через 25 сут после резекции (21 сут постнатальной жизни), а увеличения площади ядер регенерирующей печени плода не выявлено. Следовательно, можно предположить, что в ходе регенерации фетальной печени повышения плоидности гепатоцитов не происходило.

Полиплоиднзация и гипертрофия гепатоцитов является адаптивной реакцией печени на рабочее напряжение, вызванное удалением части паренхимы органа. Печень в

пренатальном периоде не несет большой функциональной нагрузки (вио У. е1 а1., 2009). Резекция фетальной печени в объеме около 20% также, видимо, не приводило к резкому рабочему напряжению органа. Вероятно, поэтому гипертрофия тепатоцитов и повышение плоидности их ядер не наблюдалось.

120

40 ■ 20 ■

о --г--.-.-.-.-.

18f/1 19ff2 21f/3 3post/7 6post/10 10post/14 21post/25

Рис. 12 Площадь ядер гепатоцитов оперированных (непрерывная линия) и контрольных (пунктирная линия) животных.

По оси абсцисс - возраст/сутки после операции, по оси ординат - площадь гепатоцитов в мкм 2.

f- фетальный период, post - постнатальный период

Рис. 13. Площадь гепатоцитов оперированных (непрерывная линия) и контрольных (пунктирная линия) животных.

По оси абсцисс - возраст/сутки после операции, по оси ординат - площадь гепатоцитов в мкм2.

f- фетальный период, post - постнатальный период

Таким образом, разработана оригинальная воспроизводимая модель резекции 22,0±3,7% массы печени 17-суточного плода крысы. Печень плодов крыс способна к органотипической регенерации, ее масса полностью восстанавливалась уже через 2 суток после операции. Восстановление массы печени плодов после резекции осуществлялась за счет митотического размножения гепатоцнтов, а их гипертрофия отсутствовала. После частичной гепатэктомии печени плодов пролиферация гепатоцитов активизировалась через 9-12 ч, наибольшего значения митотический индекс достигал через 24 ч после операции. Суточная периодичность пролиферации гепатоцитов как в регенерирующей, так и интактной печени плодов крысы не выявлена. В области раневой поверхности отрастания паренхимы не происходило. Таким образом, печень плодов крыс регенерировала по способу регенерационной гипертрофии.

ВЫВОДЫ

1. Фетапьная печень крыс способна к органотипической регенерации. Масса печени плодов, оперированных на 17-ые сут развития, восстанавливается через 2 сут после резекции 22,0±3,7% массы органа.

2. Печень плодов крыс регенерирует по способу регенерационной гипертрофия, отрастания паренхимы от раневой поверхности не происходит.

3. Регенерация печени плодов крысы происходит за счет усиления митотической активности гепатоцитов, поскольку гипертрофия гепатоцитов отсутствует.

4. В печени плодов крысы пролиферация гепатоцитов активируется через 9-12 часов после резекции. Максимальный уровень пролиферации гепатоцитов (16,02±0,61%о) наблюдается через 24 ч после повреждения печени плодов крысы.

5. Суточная периодичность пролиферации гепатоцитов как в регенерирующей, так и интактной печени плодов крысы не выявлена.

6. Резекция 22,0±3,7% массы печени не нарушает общего хода развития печени плода крысы по сравнению с одновозрастным контролем: сохраняется динамика увеличения массы органа, соотношение гепатоцитов и гемопоэтических клеток, прохождение митотического цикла гепатоцитами, отсутствует гипертрофия гепатоцитов.

7. Впервые разработанная воспроизводимая модель регенерации печени плодов крысы позволяет изучать восстановление паренхиматозных органов плодов млекопитающих.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ельчанинов A.B., Большакова Г.Б. Модель регенерации печени плодов крыс II В сб.: Актуальные проблемы морфогенеза в норме и патологии. М,: 2010, с.66-67.

2. Ельчанинов A.B., Большакова Г.Б. Реакция гепатоцитов на пренатальную травму печени // VIII Всероссийская конференция по патологии клетки. Москва, 2010, с.98-99

3. Ельчанинов A.B., Большакова Г.Б. Репаративная регенерация печени плодов крыс после частично» гепатэктомаи // Бюлл. зксперим. биол. и мед.— 2010.— т. 150, № 9.— с.352-355

4. Ельчанинов A.B.. Большакова Г.Б. Динамика пролиферации гепатоцитов регенерирующей печени плода крысы //Бюлл. экспертп. биол. имед.— 2011.— т.151,№ 3.— с.352-355

5. Ельчанинов A.B., Большакова Г.Б. Размер гепатоцитов и ta ядер в регенерирующей фетальной печени крыс // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П.Павлова.— 2011,—№ 2,— с.8-12.

"Курсивом выделены работы, опубликованные в журналах, входящих в список ВАК РФ

Соискатель: A.B. Ельчанинов

Подписано в печать i8.04.il Формат 60х84/16. Бумага офисная «$угПоСору». Тираж 100 экз. Заказ №395 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Ельчанинов, Андрей Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Регенерация и возраст.

1.2. Регенерация органов млекопитающих в пренатальном периоде.

1.3 Развитие печени крысы в эмбриональный и ранний постнатальный периоды.

1.4. Восстановление массы печени после частичной гепатэктомии как модель регенерации паренхиматозных органов млекопитающих.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Морфологические особенности нормальной и поврежденной фетальной печени

3.2. Доказательства воспроизводимости.

3.3 Восстановление массы печени.

3.4. Клеточный состав печени после гепатэктомии в пренатальном периоде.

3.5. Митотический индекс гепатоцитов вне зоны повреждения в пре- и постнатальном периодах после резекции печени плодов крыс.

3.6. Суточная динамика митотической активности гепатоцитов вне зоны повреждения в печени плодов крыс после резекции.

3.7. Оценка стабильности времени митоза гепатоцитов вне перираневой зоны после резекции печени плодов крыс.

3.8. Иммуногистохимическое исследование пролиферации гепатоцитов вне зоны повреждения.

3.9. Характеристика пролиферации гепатоцитов в перираневой области.

3.10. Площадь гепатоцитов и их ядер в пре- и постнатальном периодах после резекции печени плодов крыс.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Морфологическая характеристика репаративной регенерации фетальной печени крыс"

Актуальность

Репаративная регенерация печени млекопитающих в разные периоды постнатальной жизни подробно изучена [Сидорова В.Ф., 1976]. В частности, показано, что даже у новорожденных млекопитающих печень после резекции хорошо регенерирует. При этом масса органа ^ восстанавливается за счет размножения и гипертрофии гепатоцитов, а отрастания значительного количества паренхимы от раневой поверхности не происходит, что характерно для регенерационной гипертрофии [Сидорова В.Ф., Рябинина З.А., Лейкина Е.М., 1966; Michalopoulos G.K., DeFrances М.С., 1997]. Следовательно, способность печени к регенерации формируется во время органогенеза в пренатальном периоде. Однако сведения о восстановительном росте печени плодов млекопитающих отсутствуют.

С самого начала изучения феномена регенерации многие исследователи отмечали некоторое сходство между этим процессом^ и эмбриональным развитием органов. Особенно это заметно при развитии и регенерации, конечности амфибий [Лиознер Л.Д., 1982], Сходные черты между эмбриональным развитием^ и регенерацией можно обнаружить и при восстановлении паренхиматозных органов. Например, после удаления части, печени у взрослых млекопитающих гепатоциты. начинают активно размножаться и синтезировать а-фетопротеин — маркер гепатобластов, чего не отмечается в печени взрослых особей в. норме [Michalopoulos G.K., DeFrances М.С., 1997]. Однако между эмбриональным развитием и регенерацией органов есть - коренные различия. Например, после повреждения часто регенерирует орган значительно отличающийся от удаленного, так при регенерации печени в постнатальном периоде удаленные доли не формируются вновь [Сидорова В.Ф., Рябинина З.А., Лейкина Е.М., 1966].

Врожденные опухоли печени человека1 характеризуются крайне тяжелой клинической картиной и высокой смертностью пациентов. Течение таких опухолей часто осложняется водянкой плода, респираторным дистресс синдромом новорожденных, врожденной сердечной недостаточностью. Наиболее часто среди врожденных опухолей печени встречается гемангиома, мезенхимальная гамартрома, гепатобластома [Isaacs Н. Jr., 2007]. Разработка экспериментальных моделей повреждения печени плодов млекопитающих, а также изучение закономерностей регенерации фетальной печени позволит обосновать и внедрить в клиническую практику раннее хирургическое лечение врожденных опухолей печени человека.

Цель и задачи исследования

Цель: изучить особенности репаративной регенерации печени плода крысы после резекции.

Задачи исследования:

1. Разработать воспроизводимую модель резекции фетальной печени крысы;

2. Проследить динамику восстановления массы оперированной фетальной печени через 1, 2, 3, 7, 10, 14 и 25 сут после резекции;

3. Изучить изменение объемной доли гепатоцитов и гемопоэтических клеток в печени плодов крысы в ответ на резекцию через 3 ч, 1, 2, 3 и 7 сут после операции;

4. Исследовать пролиферацию гепатоцитов с помощью определения их митотического индекса, а таюке с использованием иммуногистохимического маркера пролиферации Кл67 через 6 ч, 1, 2, 3, 7, 10 и 14 сут после резекции печени плодов крысы;

5. Изучить суточную динамику митотической активности гепатоцитов в течение 48 ч после резекции в печени плодов крысы;

6. С помощью определения соотношения митотических фаз оценить стабильность времени митоза гепатоцитов в оперированной печени плодов крысы;

7. Проследить динамику изменения площади гепатоцитов и их ядер в оперированной и интактной печени плодов крысы через 1, 2, 3, 7, 10, 14 и 25 сут после резекции, и таким образом, оценить вклад гипертрофии гепатоцитов в регенерацию печени плода крысы;

8. С помощью гистологических методов исследовать процессы роста в области резекции печени плодов крысы, оценить в перираневой. зоне пролиферацию гепатоцитов с помощью определения их митотического индекса, а также с использованием иммуногистохимического маркера пролиферации Кл67, на основании полученных результатов определить способ регенерации печени плода крысы.

Научная новизна )

Разработана оригинальная воспроизводимая модель резекции печени плода крысы со стандартным объемом повреждения (22±3,7% массы органа).

Впервые показано, что печень плода крысы способна к регенерации в очень короткий срок. Масса, печени- плодов, оперированных на 17-ые сут развития, восстанавливается уже через 2 сут после резекции.

С помощью морфометрического анализа показано, что наносимая травма и регенерация не вызывают изменения соотношения- гепатоцитов и гемопоэтических клеток печени плода, что свидетельствует об отсутствии ускоренного угасания гемопоэза в печени плодов крысы.

При исследовании пролиферации гепатоцитов установлено, что резекция фетальной печени крысы, стимулирует размножение клеток как в перираневой зоне, так и на расстоянии от нее. Это свидетельствует о равномерном росте печени, и о* способе ее регенерации - регенерационной гипертрофии.

Показано, что наносимая травма не вызывает нарушения прохождения гепатоцитами стадий митотического цикла. Об этом свидетельствуют незначительные изменения соотношения фаз- митоза на разных сроках после операции, сильная положительная корреляция между индексом метафаз и митотическим индексом в опыте и контроле; 'а также предшествование многократного увеличение количества Кл67-положительных гепатоцитов пику митотического индекса.

На основании того, что после резекции печени плода- крысы сохраняется динамика увеличения массы, органа, соотношение гепатоцитов и гемопоэтических клеток, прохождение гепатоцитами- митотического цикла, сроки возрастной гипертрофии гепатоцитов не изменяются в оперированной печени, можно заключить, что резекция 22±3,7% "-массы не нарушает общего хода развития печени плода крысы.

Научно-практическая значимость

Внедрение

Результаты исследования по восстановлению массы фетальной печени используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии лечебного факультета ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет».

Степень личного вклада автора в результаты исследования

Автор непосредственно участвовал в проведении всех экспериментальных исследований, самостоятельно проводил сбор материала, обработку и анализ полученных экспериментальных данных, формулирование основных положения диссертации сделал под руководством Большаковой Г.Б. '

Основные положения, выносимые на защиту

Апробация работы

Результаты исследований и основные положения работы доложены и обсуждены на конференциях «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (г. Москва, 2010), на VII Всероссийской конференции по патологии клетки (г. Москва, 2010), на межлабораторной конференции НИИМЧ РАМН (март, апрель 2011).

Публикации.

Основные положения диссертации отражены в 5 публикациях, из них -3 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Ельчанинов, Андрей Владимирович

выводы

1. Фетальная печень крыс способна к органотипической регенерации. Масса печени плодов^ оперированных на 17-ые сут развития, восстанавливается уже через 2 сут после резекции 22,0±3,7% массы органа.

4. В печени плодов крысы пролиферация гепатоцитов активируется через 9-12= часов после резекции. Максимальный уровень пролиферации гепатоцитов (16,02±0;61%о) наблюдается через 24 ч после повреждения печени плодов крысы. !

6. Резекция 22,0±3,7% массы печени не нарушает общего хода развития печени плода крысы по сравнению с одновозрастным контролем: сохраняется динамика увеличения массы органа* соотношение гепатоцитов и гемопоэтических клеток, прохождение митотического; цикла гепатоцитами, отсутствует гипертрофия гепатоцитов. ;

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Регенерации паренхиматозных органов в пренатальном периоде посвящено крайне мало исследований. Однако выяснение репаративных возможностей фетальных органов млекопитающих представляет значительный интерес для биологии и медицины. Особенности регенерации фетальной печени млекопитающих изучали на модели восстановления печени плода крысы после резекции.

Разработана оригинальная методика операции на печени 17-суточного плода крысы. Объем резекции составил примерно 20%, была доказана воспроизводимость такого повреждения.

Совокупность полученных данных дает основание утверждать, что проявляющийся практически у всех классов позвоночных способ регенерации паренхиматозных органов в виде регенерационной гипертрофии проявляется уже в эмбриональном периоде. Печень плодов крыс обладает регенерационной способностью, так как i ее масса полностью восстанавливается уже через 2 суток после операции.

В регенерации печени в пре- и постнатальном периодах есть много общих черт, но есть и различия. К числу общих черт относится то, что печень восстанавливает массу за счет пролиферации гепатоцитов, сохраняет специфическую гистоструктуру. Морфометрический анализ, проведенный с помощью метода полей, показал, что после резекции в печени плода отсутствует значительный отек. Кроме того в регенерировавшей печени объемная доля гепатоцитов и гемопоэтических клеток не отличалась от соответствующего контроля. Таким образом, восстановление массы носил истинный характер, а регенерация протекала органотипически. еще не сформировался, как и не сформировались генетические механизмы организации суточного ритма пролиферации. Нам не удалось обнаружить суточный ритм митотического индекса гепатоцитов. Однако, вероятно, пролиферативная активность органов у плодов подвержена влиянию неких факторов со стороны матери, так как мы наблюдали синхронное падение митотического индекса как у оперированных, так и интактных плодов.

Соотношение фаз митоза в регенерирующей и интактной печени практически не различался, что свидетельствует о стабильном течении митоза гепатоцитов в оперированном органе. При сопоставлении динамики митотического индекса и количества гепатоцитов, в которых определяется ядерный белок К167 (клетки на различных стадиях митотического цикла), было обнаружено, что гепатоциты в регенерирующей печени плода крысы без задержки проходят стадии клеточного цикла,¡предшествующие делению и далее вступают в митоз. То есть прохождение гепатоцитами митотического цикла не нарушено.

В целом можно заключить, что регенерационный процесс, являясь, ответом органа травму, не влияет на общий ход его развития, поскольку сохраняется динамика увеличения массы органа, соотношения гепатоцитов и гемопоэтических клеток, прохождения митотического цикла, не изменяются сроки возрастной гипертрофии гепатоцитов в оперированной печени.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Ельчанинов, Андрей Владимирович, Москва

1. Алов И.А. Цитофизиология и патология митоза: М.: Медицина, 1972. 263 с. ' . .

2. Бабаева A.F. Регенерация: факты и перспективы. М.: Издательство РАМН., 2009. 336 с.3. . Большакова Г.Б. Способность к восстановлению миокарда плодов крыс // Онтогенез. — 1990. — Т.21, № 4. — С.409-415.

3. Большакова Г.Б. Пролиферация кардиомиоцитов у плодов крыс в норме и после повреждения сердца //Бюл. экспер. биол. — 2008. — Т.145, №4. — С. 471-^74.

4. Большакова Г.Б. Молекулярные механизмы репарации в пренатальном периоде //Архив патологии . — 2008. — № 6. — С. 53-56.

5. Механизм прямых межклеточных взаимодействий. Самоорганизация ритма синтеза белка / Бродский В.Я. и др. // Онтогенез. — 2006. — Т. 37, №5. — С. 384-393

6. Быстренина Н.Г. Суточный ритм митотической активности в эпидермисе и- печени крыс на ранних стадиях их постиатального развития // Суточные ритмы физиологических процессов организма под общ. ред. Доброхотова В.Н.Даболина В.А.. — M.,il972 — С. 14-18.

7. Верин В.К. Дифференцировка гепатоцитов и холангиоцитов в эмбриональном и постнатальном периодах онтогенеза крысы // Арх. анат. —1982. — №3. — С. 19-23.

8. Воронцова М.А. Регенерация органов у животных. М.: Сов. наука,1111949. 268 с.

9. Воронцова М.А. Восстановление утраченных органов у животных и человека. М.: Сов. наука, 1953. 122 с.

10. Грачева Н.Д. Авторадиографическое изучение пролиферативных процессов в гистогенезе печени крыс // Арх. анат. — 1966. — Т. 50, №5. — С. 38-47

11. Григорьев Н.И. Строение и регенерация печени после ее местного повреждения. М.: Медицина, 1975. 192 с.

12. Доброхотов В.Н. О некоторых закономерностях суточного ритма пролиферативных процессов // Суточные ритмы физиологических процессов организма под общ. ред. Доброхотова В.Н., Таболина В.А.. — М., 1972 — С. 5-8.

13. Доброхотов В.Н., Валвас B.C. Динамика фаз митоза и относительная продолжительность клеточного деления // Бюл. экспер. биол. — 1981. — Т.92, № 8. — С.76-78

14. Заварзин A.A. Синтез ДНК и кинетика клеточных популяций в онтогенезе млекопитающих. JL: Наука, 1967. 219 с.

15. Зайцев Т.Н. Гистологическое исследование печени линейных, нелинейных и гнотобиотических крыс: автореф., канд. мед. наук. М., 1975. 12 с.

16. Лиознер Л.Д. О различных способах регенерации // Онтогенез. — 1972. — Т.3,№ 1. —С.3-9.

17. Лиознер Л.Д. Основные проблемы учения о регенерации. М.: Наука, 1975. 102 с.

18. Лиознер Л.Д. Регенерация и развитие. М.: Наука, 1982. 167 с.

19. Левина С.Е. Некоторые виды хирургического и фармакологического воздействия на эндокринную систему высших позвоночных // Методы биологии развития под общ. ред. Т.А. Детлаф. М: Наука, 1974. — С 246

20. Романова JI.К. Регенерация легких в эксперименте и клинике. М.: Медицина, 1971. 198 с.

21. О роли функции в восстановлении поврежденных паренхиматозных внутренних органов / Романова JI.K. и др. // Онтогенез. — 1971 — Т.2, №5. — С. 3-10.

22. Романова JI.K. Регуляция восстановительных процессов. М.: Изд-во Моск. Ун-та, 1984. 176 с.

23. Рябинина З.А., Бенюш В.А. Полиплоидия и гипертрофия клеток в процессах роста и восстановления. М.: Медицина, 1973. 207 с.

24. Сидорова В.Ф. Гистогенетические и структурные изменения в печени крыс при ее регенерации после нанесения сквозных и краевых ранений // Бюлл. экспер. биол. и мед. — 1960. — №3. — С. 97-101.

25. Сидорова В.Ф., Рябинина З.А., Лейкина Е.М. Регенерация печени у млекопитающих. М.: Медицина, 1966. 205 с.

26. Сидорова В.Ф. Постнатальный рост и восстановление внутренних органов у позвоночных. М.: Наука, 1969. 189 с.

27. Сидорова В.Ф. Возраст и восстановительная способность органов у млекопитающих. М.: Медицина, 1976. 199 с.

28. Студитский А.Н. Экспериментальная хирургия мышц. М.: Издательство Академии наук СССР, 1959. 338 с. :

29. Юнкеров В.И., Григорьев С.Г. Математико-статистическая обработка данных медицинский исследований. СПб., 2002. 267с.

30. Яшина И.Н. Об образовании печеночных долек в регенерирующей печени // Бюлл. экспер. биол. и мед. — 1970. — №10. — с. 95-97.

31. Agata K., Saito Y., Nakajima E. Unifying principles of regeneration I: Epimorphosis versus morphallaxis // Develop. Growth. Differ. — 2007. — № 49. — P. 73-78. . ~

32. Adzick N.S., Lorenz H.P. Cells, Matrix, Growth Factors, and the Surgeon. The Biology of Scarless Fetal Wound Repair // Annals of Surgery—1994. —Vol. 220, №. 1.-10-18.

33. Involvement of p21 and p27 in the regulation of CDK activity and cell cycle progression in the regenerating liver / Albrecht:: J.H. et al. // Oncogene —1998;—№ 16.—P. 2141-2150.

34. Tissue response and Msxl expression after human fetal digit tip amputation in vitro / Allan e.H: et al. // Wound Repair Regen.—2006.—Vol.14, №4. —P. 398-404 . ^ .: ■ , • •

35. Alvarado A.S. Regeneration in. the metazoans: why does it happen? // BioEssays—2000. —Vol.22, №6. — P. 578-590

36. Awad M.M., Gruppuso Ph.A., Bienieki T.C. Modulation of mitogen-independent hepatocyte proliferation;during the perinatal period; in the rat;// In Vitro Cell! & Dev.Biol-,- Anim. — 1997. — Vol: 33^№ 7. — P. 562-568.

37. Awad! M. M., Gruppuso Ph. A. Cell Cycle Control during Liver Development in the Rat: Evidence Indicating! a Role for Cyclin D1 Posttranscriptional Regulation- // Cell Growth & Differentiation — 2000. — Vol.11.—P.325-334.

38. Role; of oxidative/nitrosative: stress-mediated Bcl-2 regulation in apoptosisand malignant transformation / Azad N. et al. // Ann. N.-Y. Acad. Sei.—2010.— Vol.1203.— P. 1-6.

39. Growth retardation, polyploidy, and multinucleation induced by clast3, a novel cell cycle-regulated protein / Bahar R. et al. // The Journal of biological chemistry—2002.— Vol.277, №.42. — P; 40012-40019.

40. Barbason H., Fourré F., Focan C. Synchronizing effect of corticosterone's circadian rhythm on the DNA synthesis rate in the liver of the young rat // Pathol. Biol. (Paris). —2003. —Vol.51, №4. —P. 210-211.

41. Bely A.E., Nyberg K.G. Evolution of animal regeneration: re-emergence of a field// Trends Ecol. Evol.— 2009. — Vol.25, №3.,-r- P. 161-170.

42. Regenerative healing of incisional wounds in murine fetal lungs maintained in organ culture / BlewettC J. et al. // J. Pediatr. Surg. — 1995. —Vol.30, №7. —P. 945-948. I

43. Regenerative healing of incisional wounds in midgestational murine hearts in organ culture / Blewett C.J. et al. // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. —1997. —Vol. 113, №5.—P. 880-885.

44. Bras M., Queenan B., Susiin S.A. Programmed cell death via mitochondria: different'modes of dying // Biochemistry (Mose.). —2005. —Vol.70, №2. —P. 231-239.

45. Brito D.A., Yang Z., Ricder C.L. Microtubules do not promote mitotic slippage when the spindle assembly checkpoint cannot be satisfied // J. Cell Biol. — 2008—Vol.182, № 4 —p. 623-629.

46. Brockes J.P., Kumar A., Vellöso C.P. Regeneration as an evolutionary variable // J. Anat. — 2001. —Vol.199. — P. 3-11. :t

47. Brockes J.P., Kumar A. Comparative Aspects of . Animal Regeneration // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. —2008. — №24. —P. 525-549.55 ; Bucher N.R., Glinos A.D. The Effect of Age on Regeneration of Rat Liver // Cancer Research—1950. — Vol.10, №5—Pi 324-332.

48. Bucher N.R., Swaffield M.N., DiTroia A.F. The influence of age upon the incorporation of thymidine-2-C14 into the DNA of regenerating rat liver // Cancer Research—1964.—Vol.24. — P. 509-512.

49. Bucher N.R., Swaffield M.N. The rate of incorporation of labeled thymidine into the deoxyribonucleic acid of regenerating rat liver inrelation to the amount of liver excised // Cancer Research — 1964. —Vol.24. —P. 1611-1625

50. Celton-Morizur S., Desdouets C. Polyploidization of liver cells // Adv Exp Med Biol. —2010. —Vol. 676. —P. 123-135.

51. Columbano A., Shinozuka H. Liver regeneration versus direct hyperplasia the FASEB Journal — 1996. — Vol.10. — P. 1118-1128.

52. Structural and functional? differentiation of sinusoidal endothelial cells during liver organogenesis in humans / Couvelard A. et al. // Blood — 1996. — Vol. 87, № 11. — P. 4568-4580.

53. Colwell A.S., Longaker M.T., Lorenz H.P. Mammalian fetal organ regeneration// Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. —2005. — Vol. 93. — P. 83100. • ' '

54. Influence of aminoguanidine on parameters of: liver injury and regeneration induced in rats by a necrogenic dose of thioacetamidé / Diez-Fernandez C. et al. // Br. J. Pharmacol. — 1998. — Vol.125. — P. 102-108.

55. Fetal airway wound repair: a new frontier / Dohar J.E. et al. // Arch Otolaryngol. Head: Neck Surg. — 1998. — Vol 124, №1 — P. 25-29.

56. Compensatory Renal Growth after Unilateral Nephrectomy in the Ovine Fetus / Douglas-Denton R. et al. //J. Am. Soc. Nepihrol. — 2002. — №13. —P.406.410.

57. Development of hepatic sinusoidal structure with special reference to the Ito cells / Enzan H. et al. // Microscopy research and technique.—1997. — №39. — P. 336-349

58. Fabrikant J.I. The kinetics of cellular proliferation in regenerating liver // The Journal of cell biology. — 1968. — Vol 36. — P. 551-565.

59. Fausto N., Laird A.D., Webber E.M. Role of growth factors and cytokines in hepatic regeneration // The FASEB J. — 1995. — Vol. 9. — P. 1527-1536.

60. Fausto N. Liver regeneration // Journal of Hepotology.— 2000. —Vol. 32 (suppl. 1). —P. 19-31.

61. Fausto N. Knocking out genes to study liver regeneration: present and future // Am. J Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. — 1999. — Vol. 277. —P. 917-921.

62. Ferguson M.W.J., O'Kane Sh. Scar-free healing: from embryonic mechanisms to adult therapeutic intervention // The Royal Society. — 2004. — Vol. 359.—P. 839-850.

63. Characterization of Cell Types During Rat Liver Development / Fiegel H.C. et al. // Hepatology. — 2003. — Vol. 37, № 1 — P.148-154.

64. Immunocytochemical determination of' ploidy class-dependent bromodeoxyuridine incorporation! in rat liver parenchymal cells after partial hepatectomy / Frederiks W.M. et al. // Histochemistry. — 1990. — Vol. 93, №6. —P. 627-630.

65. Hepatocyte ploidy in regenerating livers after partial hepatectomy, drug-induced necrosis, and cirrhosis / Gandilleta A. et al. // Eur. Surg. Res. — 2003. — Vol.35, №3. —P. 148-160.

66. Hepatocyte ploidy in normal young rat / Gandilleta A. et al. // Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol. — 2003.: — Vol.134, №3. —P. 665673.

67. Binucleation and polyploidization patterns in developmental andregenerative rat liver growth / Gerlyng P. et al. // Cell. Prolif. — 1993. — Vol. 26, №6. —P. 557-565.

68. Pregnancy restores the regenerative capacity of the aged liver via activation of an mTORCl-controlled hyperplasia/hypertrophy switch / Gielchinsky Y. et al. // Genes & Development. —2010. —Vol.24. —P. 543-548.

69. Liver development in the rat and in man during the embryonic period (Carnegie stages 11—23) / Godlewski G. et al.,// Microscopy research andtechnique.—1997. — № 39. — P. 314-327.i

70. Liver development in the rat during the embryonic period (Carnegie stages 15-23) / Godlewski G. et al. // Acta anatómica. — 1997. — №3, Vol. 160. — P. 172-178.

71. Gorla G.R., Malhi H., Gupta S. Polyploidy associated with oxidative injury attenuates proliferative potential of cells // Journal of Cell Science. — 2001. — Vol.114.—P. 2943-2951.

72. Goss R.J., Walker M.J. Compensatory renal hypertrophy in fetal rats // J. Urol. — 1971. — Vol.106, №3. —P. 360-362.

73. Greengard O., Federman M., Knox W.E. Cytomorphometry of developing rat liver and its application to enzymic differentiation // The Journal Of Cell Biology. — 1972. — Vol. 52. — P. 261-272.

74. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes / Guidotti J.-E. et al. // The journal of biological chemistry. — 2003. — Vol. 278, №.21. —P. 19095-19101.

75. Relationships between hematopoiesis and hepatogenesis in the midtrimester fetal liver characterized by dynamic transcriptomic and proteomic profiles / Guo Y. et al. // PLoS ONE. — 2009. — Vol. 4, №10. — e7641. doi:10.1371/journal.pone.0007641.

76. Gupta S. Hepatic polyploidy and liver growth control // Seminar in Cancer biology. — 2000. — Vol. 10.— P.161-171.

77. Digit regeneration is regulated by Msxl and BMP4 in fetal mice / Han M. et al. //Development. — 2003. — Vol. 130. — P. 5123-5132.

78. Hata Sh., Namae M., Nishina H. Liver development and regeneration: From laboratory study to clinic therapy // Develop: Growth Differ. — 2007. — Vol. 49.1. P. 163-170.

79. Development and Regeneration of the Neonatal Digit Tip in Mice / Han M. et al. //Dev Biol. — 2008. — Vol.315, №1. —P. 125-135.

80. Iakova P., Awad S.S., Timchenko N.A. Aging reduces proliferative capacities of liver by switching pathways of C/EBPa growth arrest // Cell. — 2003.1. Vol.113. —P. 495-506.

81. Isaacs H. Jr. Fetal and neonatal hepatic tumors // J. Pediatr.Surg. — 2007. — Vol.42. —P. 1797-1803.

82. Expression of matrix' mettalloproteinases and their inhibitors during hepatic tissue repair in the rat / Knittel T. et al. // Histochem. Cell Biol. — 2000. — Vol. 113. —P. 443-453.

83. Plasticity and expanding complexity of the hepatic transcription factor network during liver development / Kyrmizi I. et al:. // Genes & Dev. — 2006. — Vol. 20 — P. 2293-2305.

84. Cellular Liver Regeneration after Extended Hepatic Resection in* Pigs / Ladurner R. et al. // HPB Surgery. — 2009. — Article ID 306740, 7 pages.

85. Control of rate and extent of the proliferative response after partial hepatectomy /Lambotte L. et al. // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. — 1997. — Vol.273. — P. 905-912.

86. Lemaigre F.P. Mechanisms of liver development: concepts for understanding liver disorders and design of novel therapies // Gastroenterology. — 2009. — Vol. 137. — P. 62-79.

87. Fetal diaphragmatic wounds heal with scar formation / Longaker M.T. et al. // J. Surg. Res. — 1991. — Vol.50, №4. —P. 375-385.

88. Lindboe C.F., Torp S.H. Comparison of Ki-67 equivalent antibodies // J. Clin. Pathol. — 2002. — № 55. — P. 467-^71

89. Liver tetraploidization is controlled by a hew process of incomplete cytokinesis / Margall-Ducos G. et al. // Journal of Cell Science. — 2007 — Vol. 120 — P. 3633-3639.

90. Mast B.A., Albanese C.T., Kapadia S. Tissue repair in the fetal intestinal tract occurs with adhesions, fibrosis, and neovascularization // Ann. Plast. Surg. — 1998. — Vol.41, №2. — P. 140-144.

91. Ploidy and nuclearity of rat hepatocytes after compensatory regeneration or mitogen-induced liver growth / Melchiorri C. et al. //Carcinogenesis. 1993 — Vol.14, №9. — P. 1825-1830.

92. Scar formation in the fetal alimentary tract / Meuli M. et al. // Journal of Pediatric Surgery. — 1995. — Vol.30, № 3. — P. 392-395.

93. Michalopoulos G.K. Liver regeneration // J. Cell. Physiol. — 2007. — Vol.213, №2. — P. 286-300.

94. Michalopoulos G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy. critical analysis of mechanistic dilemmas // The American Journal of Pathology. — 2010. — Vol. 176, №.1 — P. 2-13.

95. Michalopoulos. G.K., DeFrances M.C. Liverl regeneration // Science. — 1997— Vol.276. — P. 60-65.

96. Michalopoulos G.K., Khan Z. Liver regeneration, growth factors, and amphiregulin // Gastroenterology. — 2005. — Vol.128, №2. —P. 503-506.

97. Hepatocytes undergo phenotypic transformation to biliary epithelium in organoid cultures / Michalopoulos G.K. et al. // Hepatology. —2002. — Vol. 36, №. 2. —P. 278-283.

98. Michalopoulos G.K., L. Barua, Bowen W.C. Transdifferentiation of rat hepatocytes into biliary cells after bile duct ligation and toxic biliary injury // Hepatology. —2005. —Vol. 41, №.3 —P. 535-544.

99. Compensatory renal hypertrophy in fetal lambs / Moore E.S. et al. // Pediatr Res. — 1979. — Vol.13, №10 — P.l 125-1128.

100. Mammalian regeneration and regenerative medicine / Muneoka K. et al. // Birth Defects Res. C. Embryo. Today. — 2008. — Vol.84, №4. — P. 265-280.

101. Nadal C., Zajdela F. Polyploïdie somatique dans le foie de rat I. Le rôle des cellules binucléées dans la genèse des cellules polyploïdes // Experimental Cell Research. — 1966. — Vol.42. — P. 99-116.

102. Naito M., Hasegawa G., Takahashi K. Development, differentiation, and maturation of Kupffer cells // Microscopy Research And Technique — 1997 — Vol.39 — P.3 50-364.

103. Nagy P., Bisgaard H.C., Snorri S.Th. Expression of hepatic transcription factors during liver development and oval cell differentiation // The Journal of Cell Biology. — 1994. — Vol. 126 — P. 223-233.

104. Reconstitution of liver mass via cellular hypertrophy in the rat / Nagy P. et al. // Hepatology. — 2001. — Vol.33, №2. — P. 339-345.

105. Nakatani T., Inouye M., Mirochnitchenko O. Overexpression of antioxidant enzymes in transgenic mice decreases cellular ploidy during liver regeneration // Exp. Cell Res. — 1997. — Vol. 236. — P. 137-146.

106. Ngo-Muller V., Muneoka K. Exo utero surgery // Development Biology Protocols.— 2000. — Vol 1. — P. 481-491.

107. Ngo-Muller V., Muneoka K. In utero and" exo utero surgery on rodent embryos // Methods Enzymol. — 2010. —Vol. 476.—P. 205-226.

108. Restoration of liver mass after injury requires proliferative and not embryonic transcriptional patterns / Otu H.H. et al.'. //The Journal of Biological Chemistry. — 2007.— Vol. 282, №.15. — P. 11197-11204.

109. Palmes D., Spiegel H.-U. Animal models of liver regeneration // Biomaterials. — 2004. — Vol.25. -^-P. 1601-1611.

110. Prometheus' challenge: molecular, cellular and systemic aspects of liverregeneration / Pahlavan P.S. et al. //Journal of Surgical Research. — 2006; —Vol. 134.—P. 238-251.

111. Hepatic resection in the fetal rabbit. Histologic comparison of tissue regeneration in the fetus versus the adult / Patricolo M. et al'.// Minerva Chir. — 1996. — Vol. 51, №11. —P. 971-977.

112. In utero partial liver resection in the rabbit model: a study on fetal tissue regeneration / Patricolo M. et al. // Fetal .Diagn. Ther. —1997. — Vol. 12, №4. —P. 232-235.

113. Acute cardiovascular effects of fetal surgery in the human / Rychik J. et al. ; // Circulation. — 2004. — Vol. 110, №. 12. — 1549-1556.

114. Fetal bladder wall regeneration with a collagen biomatrix and histological evaluation of bladder exstrophy in a fetal sheep model / Roelofs L.A.J: et al. // Fetal Diagnosis and Therapy. — 2008. — №24. — P. 7-14.

115. Roskams T., Desmet V. Embryology of extra- and intrahepatic bile ducts, the ductal plate // The Anatomical Record. — 2008. — Vol.291. — P. 628-635.

116. Liver, regeneration in transiently impaired in urokinase-deficienfr mice / Roselli H.T. et al.//Am. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol. —1998. — Vol. 275. —P. 1472-1479.

117. Shiojiri N. Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver // Microscopy research and technique—1997. — № 39. — P. 328-335.

118. Evidence for a terminal differentiation process in the rat liver / Sigal S.H. et al. // Differentiation. — 1995. — Vol.59,№1. —P. 35-42.

119. Partial hepatectomy-induced polyploidy attenuates hepatocyte replication and activates cell aging events / Sigal S.H. et al. // American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. — 1999. — Vol. 276. — P. 1260-1272.

120. Sirica A.E., Cole S.L., Williams T. A unique rat model of bile ductular hyperplasia in which liver is almost totally replaced with well differentiated bile ductules. // Am. J. Pathol. — 1994. — Vol. 144, №. 6. —.P. 1257-1268.

121. Sirica A.E., Gainey T.W., Mumaw V.R. Ductular hepatocytes evidence for a bile ductular cell origin in furan-treated rats // Am. J. Pathol. —.1994. —.Vol. 145, №. 2. —.P. 375-383

122. Sirica A.E. Ductular hepatocytes // Histol. Histopathol. —. 1995. —.Vol. 10, №. 2. —.P. 433-456.

123. Sirica A.E., Williams T. Appearance of ductular hepatocytes in rat liver after bile duct ligation and subsequent zone 3 necrosis by carbon tetrachloride. // Am. J. Pathol. — 1992. — Vol. 140, №. 1. — P.129-136.

124. Si-Tayeb K., Lemaigre F.P., Duncanet S.A. Organogenesis and development of the liver // Developmental cell. — 2010. —№18. —P. 175-189.

125. Postnatal ontogenesis of the circadian clock within the rat liver / Sladek M. et al. // Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. — 2006. —Vol. 292. —P. 1224-1229.

126. Fetal tibial bone healing in utero: the effects of miniplate fixation / Slate R.K. et al. // Plast. Reconstr. Surg. — 1993. —Vol. 92(5):874-83

127. Steer C.J. Liver regeneration // The FASEB J. —1995. — Vol. 9. — P.1397-1400.

128. Morphogenesis of chicken liver: identification of localized growth zones and the role of beta-catenin/Wnt in size regulation / Suksaweang S. et al.// Developmental Biology. — 2004. — Vol.266. — P. 109 122.

129. Experimental models of hepatectomy and liver regeneration using newborn and weaning rats / Tannuri A.C.A. et al. // Clinics. — 2007. — Vol. 62, №6. — P. 757-762

130. Terada T., Kitamura Y., Nakanuma Y. Expression of matrix proteinases during human intrahepatic bile duct development. A possible role in biliary cell migration // American Journal of Pathology — 1995. — Vol. 147, №. 5 — P.1207-1212.

131. Terada T., Kitamura Y., Nakanuma Y. Normal and abnormal development of the human intrahepatic biliary system: a review // Tohoku J. Exp. Med. — 1997. — № 181. — P. 19-32.

132. CCAAT/enhancer binding protein alpha regulates p21 protein and hepatocyte proliferation in newborn mice / Timchenko N.A. et al. // Mol. Cell Biol. — 1997. — Vol.17,№12. — 7353-7361.

133. Timchenko N.A., Wilde M., Darlington G.J. C/EBPalpha regulates formation of S-phase-specific E2F-pl07 complexes in livers of newborn mice // Mol. Cell Biol. — 1999. — Vol.19; №4.— P. 2936-2945.

134. Timchenko N.A. Aging and liver regeneration / Timchenko N.A. et al.// Trends in Endocrinology & Metabolism. — 2009. — №4, Vol.20. —P. 171-176.

135. Thyroid hormone regulation of rat hepatocyte proliferation and polyploidization / Torres S. et al. // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 276:155-163, 1999.

136. Vakifahmetoglu H., Olsson M. Zhivotovsky B. Death through a tragedy: mitotic catastrophe // Cell Death and Differentiation — 2008. — №15. — P. 11531162.

137. Development of the fetal rat liver: ultrastructural and stereological study of hepatocytes / Vassy J. et al. // Cell Differentiation. — 1988. — Vol. 24 — P. 924.

138. Wandzioch E., Zaret K.S. Dynamic signaling network for the specification of embryonic pancreas and liver progenitors // Science. — 2009. — Vol. 324, №5935. —P. 1707-1710.

139. Wilgus T.A. regenerative healing in fetal skin: a review of the literature // Ostom. Wound Manag. — 2007. — Vol. 53, № 6. — P. 16-33.

140. Wong C., Stearns T. Mammalian cells lack checkpoints for tetraploidy, aberrant centrosome number, and cytokinesis failure // BMC Cell Biol. — 2005. —№ 6. —P. 6-17.

141. Ontogeny of circadian organization in the rat / Yamazaki S. et al.// Biol. Rhythms. — 2009. — Vol. 24, №1. P. 55-63.

142. Yannas I.V., Kwan M.D., Longaker M.T. Early fetal healing as a model for adult organ regeneration // Tissue Engineering. — 2007. — Vol. 13, № 8. — P. 1789-1798. i

143. Zhang W. Hepatic non-parenchymal cells and extracellular matrix participate in-oval cell-mediated liver regeneration // World'J. Gastroenterol. — 2009. — Vol. 15, №5. — P. 552-560.

144. Yannas Is.V. Similarities and differences between induced organ regeneration in adults and early foetal regeneration.// J. Royal Society Interface. ■— 2005. — №2. —P. 403-417.

145. BMP signaling induces digit regeneration in neonatal mice / Yu L. et al.// Development. — 2010.— Vol.137, №4— P. 551-559.

146. Zhao R., Duncan S.A. Embryonic development of the liver // Hepatology. — 2005. — Vol. 41, № 5. — P. 956-967.

147. Zorn A.M. Liver development (October 31, 2008), StemBook, ed. The Stem Cell Research Community, StemBook, doi/10.3824/stembook.l.25.1,http ://www. stembook. or g

Информация о работе

Ельчанинов, Андрей Владимирович
кандидата медицинских наук
Москва, 2011
ВАК 03.03.04

Диссертация

Морфологическая характеристика репаративной регенерации фетальной печени крыс - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы