Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточные механизмы регенерации цирротически измененной печени

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Клеточные механизмы регенерации цирротически измененной печени"

На правах рукописи УДК 576.385.4:616.36-004-02.93

- 9 НЮП ,,:>-

САКУТА Галина Анатольевна

КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГЕНЕРАЦИИ ЦИРРОГИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННОЙ ПЕЧЕНИ

03.00.025 - клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1997

Работа выполнена в лаборатории клеточной патологии Института цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Б.Н.Кудрявцев

Институт цитологии РАН, С.-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

B.Ф.Пучков

Научно-исследовательский Институт экспериментальной медицины РАМН,

C.-Петербург

доктор биологических наук, профессор Ю.Б.Бахтин

Институт цитологии РАН, С.-Петербург'

Ведущее учреждение: Биолого-почвенный факультет

Санкт-Петербургского государственного университет, Санкт-Петербург

Защита состоится " " (Л^ФМ^Р 1997 года в /3 ч. на заседании Диссертационного совета Д 002 73 01 Институт цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург. Тихорецкий пр , д 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологи РАН.

"м.Т

Реферат разослан ." мая 1997 года Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук Л Н Писар'.чи

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Хронические поражения печени, среди которых 1ирроз является одной из наиболее тяжелых патологий, нередко переходящей I рак, полумают все большее распространение (Lieber, 1994; Matsuda et al., 995; Андреева и др., 1996). В связи с этим исследование регенераторных ютенций цирротически измененной печени и возможности обратного >аэаития патологических изменений этого органа представляет актуальную вдачу современной биологии и медицины.

В настоящее время изучены основные закономерности регенерации юрмальной печени после ее частичной резекции, известна юследоеательность морфологических, пролиферативных и биохимических ;обытий, выявлен ряд факторов, модулирующих ход регенераторного троцесса (Сидорова и др., 1966; Becker, Lane, 1968; Саркисов, 1970; Бабаева, I984; DuBois, 1990; LaBresqüe, 1994). однако потеря части печени в Результате механического удаления редко встречается в естественных условиях. Гораздо чаще приходится иметь дело с Диффузными поражениями течени, к которым, в частности, относится цирроз. Динамика и механизмы эепарации в этом случае могут быть совершенно отличными от таковых при регенерации после частичной гепатэктомии (Коваленко, 1970; Лиознер, 1974; Оолопаев, 1980; Chijiiwa et at., 1994).

Относительно недавНЬ цирроз печени считали необратимой патологией. Однако сейчас допускают возможность обратного развития цирротических изменений при условии устранения причины, вызвавшей их(Саркисов, РубеЦкой;1965; Солопаев,1980; Саркисов и др., 1995). Представления о репаратйвных процессах в циррозной печени основаны главным образом на морфологических и косвенных клинических показателях, тогда как уровень ткэнеспецифических функций клеток Паренхимы печени остается фактически не изученным. Как правило, критерием восстановления циррозной печени считают уменьшение количества соединительной ткани, не учитывая при этом

состояния клеточной популяции ее паренхимы, ответственной за выполнение многочисленных функций печени.

Известно, что исход й течение заболеваний печени во многом определяются уровнем регенераторных процессов в ее паренхиме (1_ееуу, 1967). Нормальный и репаративный рост любого органа, в том числе печени на клеточном уровне может осуществляться путем увеличения числа клеток (пролиферация), увеличения числа геномов в клетках (полиплоидизацип) и, наконец, за счет роста цитоплазмы клеток, не связанного с процессами пролиферации и полиплоидизации (гипертрофия) (Соэз, 1966). Как правило, при изучении клеточных механизмов репаративного роста печени ограничиваются исследованием ДНК-синтетичсских процессов -пролиферации и полиплоидизации. Значительно слабее исследована роль гипертрофии клеток. Практически отсутствуют данные о количественном вкладе различных клеточных механизмов роста в регенерацию патологическ измененной печени. Между тем различия в активности пролиферативных и гипертрофических процессов могут отражаться на степени восстановления органа и соответственно определять исход заболевания (Рибинина, Бенюш, 1973; Романооа, 1984).

Обычно пролиферативную активность клеток оценивают с помощью подсчета числа митозов и индекса меченых ядер. Однако, из-за низкой интенсивности пролиферации гепатоцитов при хронических повреждениях печени использование авторадиографического метода и определение митотического индекса не могут дать точного и полного представления о репаративной активности паренхимы. Альтернативным подходом для оценку уровня репродуктивных процессов в печени является исследование динамт гепатоцитов разных классов плоидности (Бродский. Урыоаеоа, 1981; Кудрявцев и др., 19В6; 51е1п, Кис1гуау|5еу.1992). Однако подавляющее большинство работ, посвященных исследованию плоидности гепатоцитов в патологически измененной печени проведено кариометрическими мигодат.ч на срезах ткани или на изолированных ядрах, что значительно снижает

достоверность информации о кинетике клеточной популяции в печени и не позволяет точно определить число двуядерных гепатоцитов, составляющих заметную часть клеточной популяции ее паренхимы (Carriere, Patterson, 1962; Wheatley, 1972). Между тем динамика одноядерных и двуядерных кпеток является важным аспектом гепатоцеллюлярного роста (Gerling et ai.. 1992).

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании морфологии, функции и клеточных механизмов репаративного роста цирротически измененной печени крыс в различных условиях после прекращения гепатотоксического воздействия на животных. В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Провести морфо-функциональный анализ и исследовать кинетику клеточной популяции паренхимы печени крыс при развитии экспериментального цирроза в результате хронического воздействия СС1д.

2. Исследовать морфо-функциональныо изменения и кинетику клеточной популяции паренхимы печени крыс на разных этапах после прекращения воздействия на животных ССЦ.

3. Исследовать морфо-функЦионалЬные изменения и кинетику клеточной популяции паренхимы печени крыс после прекращения воздействия на животных ССЦ и проведения частичной гепатэктомии.

4. Исследовать морфо-функциональные изменения и кинетику клеточной популяции паренхимы печени крыс, которых после прекращения воздействия CCU содержали на диетё,.обогащенной углеводами.

5. Исследовать Морфо-функциональные изменения и кинетику клеточной популяции паренхимы печени крыс, у которых репаративный рост печени после прекращения воздействия CCU стимулировали с помощью комплексного введения хорионического гонадотропина, АТФ \л коллализина.

Научная новизна. В результате проведенной работы впервые показано, что, помимо пролиферации и полиплоидизации клеток, заметный вклад в репаративный рост печени крыс в ходе развития цирроза и в реабилитационном периоде вносит гипертрофия гепатоцитов. Изменения в

распределении гепатоцитов по классам плоидности, происходящие при развитии цирроза, носят необратимый характер. Показано, что восстановление функции цирротически измененной печени происходит быстрее и более полно, чем структуры ее паренхимы. Уровень восстановлена функции цирротически измененного органа после прекращения гепатотоксического воздействия коррелирует с диьшмикой гепатоцитов разных классов плоидности. Показано, что регенераторный ответ паренхимы ' нормальной и циррозной печени на частичную гепатэктомию по кинетическим параметрам сходен. В отсутствии хирургического вмешательства динамика восстановления патологически измененного органа подчиняется другим закономерностям.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в настоящей работе результаты важны для понимания клеточных механизмов репаративного роста цирротически поврежденной печени, оценки ее компенсаторных потенций и степени обратимости цирротических изменений. Количественный анализ роли ДНК-синтетических и гипертрофических процессов в репаративном росте цирротически измененной печени в различных условиях ее восстановления позволил выявить основные закономерности ответа клеточной популяции паренхимы печени на патологическое воздействие и пути восстановления функции патологически измененного органа. Исследование состава популяции гепатоцитов на разных этапах в течение продолжительного периода позволило установить взаимосвязь исходного состояния клеточной популяции с направлением развития и исходом патологического процесса, что может иметь значение при разработке диагностических и прогностических тестов Полученные данные могут быть использованы о курсах лекций для студентов медицинских институтов и биолотических факультетов различных вузов

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на III Всесоюзном симпозиуме 'Клеточные мехпнизглы адаптации' (Чернигов. 1991), Всесоюзной конференции "Функциональная морфология

клетки" (С.Петербург. 1991), научных симпозиумах "Структура и функции клеточного ядра" (С.Петербург, 1993, 1996), научной конференции СПб Государственного Университета, посвященной 70-летию проф. А.А.Заварзина (С.Петербург, 1995), совместном семинаре лаборатории клеточной патологии, лаборатории морфологии клетки и лаборатории биохимической цитологии и цитохимии Института цитологии РАН.

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ (4 статьи и 7 тезисов).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, ■ обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, заключения, выводоз и списка литературы, содержащегс^-публикаций. Работа изложена на/^Ьтраницах машинописного текста, содержит 37 таблиц и 20 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. Исследования проведены на белых беспородных крысах-самцах, Вес которых в начале опыта составлял 150-200 г. Биопсийный материал печени у каждого животного получали непосредс гвенно перед началом опыта, после 6 мес воздействия CCU, и затем через 1, 3 и б мес после окончания токсического воздействия. После окончания воздействия . CCU животных разделили на 4 группы (по 7 крыс в каждой):

1-я группа крыс в течение 6 мес наблюдения Hé подвергалась каким-либо дополнительным воздействиям - группа БВ.

2тя группа была подвергнута операции частичной гепатэктомии (ЧГ) по Хиггинсу и Андерсону (Higgins, Anderson, 1931). Одновременно операции ЧГ была подвергнута группа интактных животных - группа ЧГ-К.

Крысы 3-ей группы ежедневно в течение 3 мес после окончания воздействия CCI4 кроме обычного пищевого рациона, получали водный раствор смеси фруктозы (15%) и глюкозы (5.5%) - группа УП.

Крысам 4-й группы вводили хорионический гоиадотропин (ХГ) и препарат коллализин по следующей схеме: 3 ежедневных инъекции ХГ - 170200 ЕД/животное + 1%-ный раствор АТФ по Юмг/кг веса, затем в течение 20 дней коллализин - по 5 КЕ на животное ежедневно - группа ХГ.

приготавливали, используя методику М.В.Кудрявцевой с соавт. (1972).

гепатоцитов использовали флуоресцентный вариант реакции Фельгена, в котором обычный реактив Шиффа заменой на флуоресцентный реактив типа Шиффа - аурамин-БОг (Kasten, 1961; Кудрявцев, Розанов, 1974).

Для определения содержания в гепатоцитах общего белка (ОБ) мазки окрашивали нафтоловым желтым S (Deutsch, 1955, 1965 ).

Содержание гликогена в гепатоцитах крыс выявляли с помощью флуоресцентного варианта PAS-реакции (Кудрявцева и др,, 1970; 1974; 1977). В зависимости от времени окрашивания данная методика позволяет выявлять количество в гепатоцитах легкодоступной (ЛД) фракции гликогена или суммарного гликогена (СГ).

Гистологические срезы окрашивали гематоксилин-эозином по Ромамопскому и пикрофуксином по Ван-Гизону (Пирс, 1962).

Биохимимеские.методы. Активность гликогенфосфорилазы. гликогенсинтазы и глюкозо-6-фосфатазы определяли с использованием меченных субстратов (Vnrdanis. 1991; Berteloot et al., 1991).

Мстоды.иэмерсиий и_статсти'.«ско1\обрабош1 Цитофлуориметрию ДНК в ядрах гепатоцитов производили с помощью импульсного микрофлуоримстра РИФ-1 (Папаям и др.. 1974; Кудрявцев и др.. 1979) На каждом препарате измеряли по 300 гепатоцитов Среднюю плоидность расчитывали по формуле о - Inj ■ 21 (Делоне и др , 1987). где П|-опюсительное число гепатоцитоп i-того класса плоилности (i~0- диплоидный класс, i= 1- тетраплойдный и т.д ).

L Препараты для цитофотометрии

Цтохишиесше-Меидьи Для определения количества ДНК в ядрах

Измерение содержания гликогена а гепатоцитах проводили цитофлуориметрически (Розанов, Кудрявцев, 1967; Кудрявцева и др., 1972). На каждый срок измеряли примерно по 500 клеток.

Для определения содержания общего белка (ОБ) в гепатоцитах, окрашенных нафтоловым желтым S, использовали анализатор микроизображений "Морфоквант" (Carl Zeiss, Jena), работающий в режиме сканирующего цитофотометра. Измерения проводили в монохроматическом свете длинчй волны 475 нм, используя объектив 25x0.50; шаг сканирования и диаметр зонда, приведенные к плоскости препарата, составляли 0.8 мкм. На каждом препарате измеряли по 300 клеток. Помимо содержания ОБ в среднем на клетку, рассчитывали содержание ОБ на диплоидный гепатоцит (2с-ОБ).

Фотографирование срезов печени проводили с помощью микроскопа Amplival (Carl Zeiss, Jena), а мазков клеток, окрашенных флуоресцентными красителями, с помощью микроскопа ЛЮМАМ И-1.'

Статистическую обработку результатов, полученных в данной работе, проводили, использу^ стандартные пакеты программ для персонального компьютера IBM - Statgraphics 5.0 и SigmaPlot for Windows 1.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Хроническое воздействие на крыс CCI4 в течение 6 мес вызывает фиброзное перерождение паренхимы печени и значительные изменения в структуре самих гепатоцитов, которые увеличиваются в размерах, вакуолизируются и часто имеют признаки жировой дистрофии. Эта картина типична, для цирроза печени, развивающегося в результате длительного воздействия на животных CCU (Солопаер, 1980; Верин, 1984; Michalopoulqs, 1990; Кудрявцева и др., 1994).

разшитшщвоза. В ходе развития экспериментального цирроза относительное количество в паренхиме печени 2с-гепатоцитов снижалось в среднем в 2.7 раза по сравнению с печенью до начала воздействия

гепатотоксином (табл.1). Доля гепатоцитов с диплоидными ядрами (2с и 2сх2) снижалась в 4.5 раза, а суммарное число двуядерных гепатоцитов всех типов - в 1.9 раза. Одновременно, более чем в 20 раз, возрастала доля клеток с ядрами, плоидность которых составляла 8с и выше. В клеточной популяции цирротически измененной печени появлялись гепатоциты, не характерные для нормальной печени крыс: 8сх2, 16с и даже 16сх2. Число геномов на гепатоцит в ходе развития экспериментального цирроза возрастало в среднем на 37%-(от 3.97с до 5.45с), в то время как в печени контрольных крыс за то же время число геномов на клетку увеличивалось в среднем на 11% (табл.1).

Содержание общего белка (ОБ) в гепатоцитах при циррозе возрастало в среднем на 53%, а в расчете на 2с-гепатоцит - на 14 % (табл.2).

Результаты определения уровней плоидности и гипертрофии гепатоцитов, а также массы печени позволили оценить относительный вклад различных клеточных механизмов в репаративныч рост печени крыс, подвергавшихся в течение 6 мес воздействию СС1«, а также в рост нормальной печени за этот же период. При расчетах использовали специальные формулы (Богданова и др., 1990). Результаты расчетов, свидетельствуют о том, что в отличие от нормальной печени, рост которой в течение первых 6 мес наблюдения происходит исключительно за счет ДНК-синтетических процессов (пролиферации и полиплоидизации), при развитии цирроза заметный вклад в увеличение массы органа вносит гипертрофия цитоплазмы клеток (13%).

Функциональные лараюерисижи печенп.крыс приниррозе^Содержание гликогена в клетках печени интактных крыс до начала воздействия СС14 равнялось в среднем 37.9 усл.ед , при этом его ЛД-фракция составляла 86%. В ходе развития цирроза, содержание гликогена в гепатоцитах увеличивалось почти п 2 раза, достигая 72 8 уел ед. Доля ЛД-фракции гликогена в этом случае снижалась до 65°£ (табл.3).

Таблица 1. Относительное содержание одноядерных и двуядерных гепатоцитов разных классов плоидности в печени крыс 1

Время Вари-

после ант Доля гепатоцитов разных классов плоидности, % М(с)

начала. опыта

опыта,

мес 2с 2сх2 4с 4ех2 ас 0сх2 1йс

О ¡б.5±1.9 20.7±1.6 55.6±2.2 6.110.7 1.2±0.3 0 0 4.0±0.1

6 К б.8±2Л 10.7+4.2 . б8.8±4.2 10.3±1.7 3.4±1.8 0 0 44+0Л

ц 7.Ш.4 3.0±0.8 56.4±3.2 13.0±1.2 16.9±2.6 2.9±0.8 0.6+0.3 5.5+0.2

К 3.5±0.9 б.9±1.9 7бЗ±1.7 10.5Ю.З 2.8±1.3 0 0 4.5+0.1

БВ 93±1.2 . 3.2±1Л 60.9+4.9 И.3±1.2 . 13.9±3.3 1.2+0.6 0.2+0.1 5.0±0.2

7 ЧГ 5.0±1.0 1.9±0.5 61.9±2.7 10.211.2 17.8±1.0 2.1 ±0.5 1.0±0.3 5.4+0.1

УП 10.112.1 5 Л ±1.7 57.9±3.4 9.8+1.2 ■ 15.0±3.9 1.4Ю.7 0.5±0.4 5.0+0.3

ХГ 9.0±3.0 2.4±0.7 56.Щ.О 12.1±1.2 18.1±1.8 1.2±0.7 1.1+0.4 5.3+0.2

К 4.1±1.0 9.7±3.4 73.6±1.8 10.7±1.5 2.0±1.1 0 0 4.4+0.1

БВ 8.0±1.9 2.5±1Л 65.1±2.9 1гз±о.б 10.8+2.1 1.2±03 0 4.9±0.1

9 ЧГ 5.9+2.2 1.0±0.4 58.2+3.1 14.9±1.4 ' • 16.7+2.2 1.9+0.6 1.1Ю.7 5.6±0.2

УП 6.5±2.6 4.6±2.4 67.7±2.6 10.8Ю.8 9.9+2.5 0.3±0.1 о-з±о.з 4.8±0.2

ХГ 4.4±2.2 1.8±0.9 67.б±1.1 12.2±1.4 13.5+1.6 0.4 ±0.1 0.1±0.1 5.0±0.2

К 7.б±2.б 4.8+1.2 73.9±23 12.4±1.8 1.3 ±0.4 0 0 4.4±0.1

БВ 13.6±2.0 2.6±0.4 60.0±2.б 10.0±1.1 12.9±2.0 0.7±0.3 0.2±0.1 4.7±0.2

12 ЧГ 14.9±3.5 4.5±23 51.1 ±5.6 9.4±2.0 12.9±1.5 0.6±0.1 0.1+0.1 4.7+0.1

УП 6.4±2.3 З.б±1.6 6б.9±2.5 12.Ш.2 10.4±6.9 0.4±0.2 0.2±0.1 4.9+0.1

ХГ 5.3 ±0.5 !.1±0.1 64.5±2.5 14.2+1.1 12.9±1.1 0.8±0.3 0.2+0.1 5.1 ±0.1

Примечание: К - контрольные крысы; Ц - крысы, подвергавшиеся в течение 6 мес воздействию СС14.

Увеличение содержания гликогена в клетках циррозной печени сопровождалось снижением активности глюкозо-6-фосфатазы до 36% от уровня фермента в нормальной печени крыс. Активность гликогенфосфорилазы при циррозе снижалась по сравнению С нормой примерно на 40%. Уровень гликогенсинтазы в циррозной печени достоверно не отличался от нормы.

П0сае.лтрекращс«иялаюдейе1вия^а_жив0тных Исследование гистологической структуры печени через 1, 3 и 6 мес после прекращения воздействия на крыс CCU и в условиях стимуляции восстановительных процессов с помощью ЧГ. диеты с повышенным содержанием углеводов и введения хориогонина показало, что уже через 1 мес во всех группах животных наблюдается определенная нормализация структуры органа: исчезают очаги воспаления и некрозов, характерные для цирроза печени, уменьшается число клеток Купфера. Фиброзные тяжи за счет разрастания паренхимы печени раздвигаются и утончаются. Однако даже через 6 мес после устранения патогенного воздействия полного восстановления структуры паренхимы печени не происходит и дольковая структура печени не восстанавливается. Преимущественного ускорения нормализации гистологической структуры печени В какой-либо группе животных не обнаружено.

Клеючныс. механизмы соссшновлснияциррознойпсчениксыс.после прекращения воздейстиияла них_ССЦ. После значительного снижения количества 2с-гепатоцитов в ходе развития цирроза, их доля через I мес после прекращения воздействия на животных СС1< в группах БВ, УП и ХГ повышалась на 30-40% (табл 1). В цирротически измененном органе, подвергнутом ЧГ. количество 2с-гепатоцитов, напротив, снижалось (табл 1). В дальнейшем количество 2с-гспатоцитов в группах УП и ХГ оставалось па низком уровне, а в группах БВ и ЧГ увеличивалось более, чем в 2 раза достоверно превышая контрольный уровень Отличающаяся динамика 2с-

гепатоцитов в разных группах крыс, по-видимому, отражает различные механизмы восстановления циррозной печени в исследованных условиях стимуляции репаративных процессов. Относительное количество клеток модального класса - 4с-гепатоцитов на протяжении 12 мес наблюдения у контрольных животных сохранялось на уровне приблизительно 70%, а у крыс с циррозом печеНи, во всех вариантах опыта, - на уровне 60% (табл.1). Увеличенная в ходе развития цирроза доля клеток с ядрами плоидностью 8с-и выше снижалась, однако даже через 6 мес после прекращения воздействия на животных CCI« оставалась на порядок выше контрольного уровня. Средний уровень плоидности гепатоцитов в патологически измененной печени снижался &о всех экспериментальных группах. При этом в группах БВ и ЧГ он через 6 мес реабилитации достоверно не отличался от контрольного, а в группах УП и ХГ оставался достоверно выше, чем у контрольных крыс того же возраста (р<0.05).

Через 1 мес после ЧГ нормальной печени количество 2с-гепатоцитов снижалось почти в 2 раза, а 2сх2-гепатоцитов - в 6.6 раз. Число 4с-гепатоцитов увеличивалось на 42%. а 4сх2 - в 2.2 раза. Доля 8с и 8сх2-гепатоцитов, которые до проведения ЧГ отсутствовали, составила 8.6 и 1.4% соответственно Суммарное количество двуядерных гепатоцитов уменьшалось в 2 раза (от 32.8 до 16.8%). Средний уровень, плоидности повышался на 25%. В дальнейшем, в течение 6 мес наблюдения уровни плоидности гепатоцитов и распределение клеток по классам плоидности в нормальной печени не Изменялись

Таким образом, хотя перед ЧГ состав клеточной популяции в паренхиме нормальной и циррозной печени значительно отличался, после ЧГ динамика гепатоцитов с диплоидными ядрами (2с и 2сх2) была сходной и через 6 мес распределение гепатоцитов по классам плоидности в нормальной и патологически измененной печени было практически одинаковым. Регенерация циррозной и нормальной печени после операции ЧГ осуществляется, видимо, в основном за счет пролиферации 2с-гепатоцитов,

поскольку их доля в популяции клеток паренхимы печени значительно возрастает в течение б мес.

Среднее содержание ОБ на клетку и содержание ОБ на 2с-гелатоцит во всех группах животных через 3-6 мес после прекращений воздействия СС14 достоверно не отличается от контрольных значений. При этом выравнивание уровней ОБ в гепатоцитах происходит за счет увеличения гипертрофии клеток контрольных животных, а не уменьшения содержания ОБ в гепатоцитах крыс, перенесших цирроз (табл.2).

Таблица 2

Количество общего белка (ОБ) в среднем на клетку и на диплоидный гепатоцит (2с-ОБ) в печени крыс

Время Количество белка в гепатоцитах крыс в

после разных вариантах опыта, усл.од.

начала

опыта» К ЧГ-К «В чг УП ХГ

мес

0 ОБ 2с-ОБ 182.8±4.4 94.3+1.1

6 ОБ 2с-ОБ 190.0±10.6 85.6±9.5 280.Ш6.2 107.8±4.1

7 ОБ 214.7± 265.2± 281.0± 327.5± 240.0± 292.0±

11.9 18.8 11.5 10.44 35.1 8.0

2С-ОБ 96.3±5.7 113.б±8.4 117.1± . 11.5 118.8±6.2 105.3± 17.8 110.6± 5.9

9 ОБ 233.0± 256.6± 265.8± 27$.4± 229.1± 272.9±

11.8 11.4 16.6 11.6 20.9 14.9

2с-ОБ 105.61 8.4 10В.0±3.4 108.0± 10.6 99.4±3.4 97.5±12.0 109.8± 7.5

12 ОБ 252.9± 319.9± 281.3± 301.6± 270.2± 292.6±

12.2 31.7 11.5 10.8 22.0 3.7

2с-ОБ 125.5± 9.6 137.7± 17.6 120.7± 10.5 129.2±3.3 111.8±9.8 116.2± 4.2

Количественная оценка вкладов процессов пролиферации, полиплоидизации и гипертрофии в рост печени показала, что у контрольных крыс в течение 6 мес, соответствующих 6 мес реабилитации у опытных животных, происходит постепенное затухание полиплоидизации клеток и усиление их гипертрофии. На последнем этапе эксперимента рост печени

контрольных крыс происходит исключительно за счет пролиферации гепатоцитов и гипертрофии их цитоплазмы.

После прекращения воздействия на крыс СС1< в клеточной популяции паренхимы циррозной печени крыс средний уровень плоидности гепатоцитов снижается (табл. 1), *<то происходит на фоне относительно небольших изменений содержания белка на гепатоцит (табл.2). Уменьшение уровня плоидности клеток может объясняться как преимущественным вовлечением в пролиферацию диплоидных, так и селективной гибелью полиплоидных гепатоцитов. Поскольку элиминации высокоплоидных клеток (8сх2,16с, 16сх2) из популяции не происходит даже через 6 мес после прекращения воздействия гепатотоксином (табл.1) первое предположение кажется более предпочтительным. Это предположение подтверждается как данными о более высокой пролиферативной активности диплоидных гепатоцитов по сравнению с полиплоидными (Урываева, Маршак, 1969; МЫапаЬе, 1970), так и данными о равной устойчивости полиплоидных гепатоцитов по сравнению с диплоидными к действию повреждающих факторов (Ни, 1989). Интересно, что в отличие от животных в группах БВ и ЧГ, у крыс, подвергавшихся терапевтическому воздействию (группы УП и ХГ), в последние 3 мес снижения среднего уровня плоидности клеток паренхимы печени не происходило. Во всех экспериментальных группах выад клеточной пролиферации в репаративный рост печени в периоде реабилитации являлся преобладающим. Роль гипертрофии клеток в восстановлении органа становилась заметной лишь в последние 3 мес наблюдения.

Соотношение интенсивности процессов пролиферации, полиплоидизаиии и гипертрофии клеток в ходе регенерации после ЧГ циррозного и интактного органа оказалось сходным. В отличие от групп БВ, УП и ХГ. полиплоидизация гепатоцитов в группе ЧГ продолжалась в течение первых трех месяцев (табл.1). Большинство авторов считает появление иысокоплоидных гепатоцитов характерным признаком регенерации паренхимы (Солопаев. 1975. Коваленко, 1970; Бродский, Урываева, 1980). По нашим

данным, снижение среднего уровня плоидности клеток паренхимы печени крыс после ЧГ нормального и циррозного органа происходило лишь в последние 3 мес наблюдения, причем этот процесс был более интенсивным в циррозной печени, что может свидетельствовать как о более выраженной гибели клеток, так и о преимущественной пролиферации в ней низкоплоидных гепатоцитов.

Во всех экспериментальных группах животных уже через 1 мес после прекращения воздействия СС14 происходит значительное снижение уровней гликогена в гепатоцитах, а спустг. 3-6 мес содержание гликогена и его фракционный" состав в клетках полностью нормализуются. Наиболее быстро это происходит в группе УП, где уже в течение первого мес после прекращения воздействия на животных гепатотропным ядом доля ЛД-фракции увеличивается до 88% (табл.3).

Исследование активности ферментов обмена гликогена в циррозной печени крыс после прекращения отравления ССЦ показало, что через 6 мес активность гликогенфосфорилазы во всех вариантах опыта восстанавливается полностью, в то время как активность глюкозо-6-фосфатазы в группах БВ и ЧГ остается примерно вдвое, а в группах УП и ХГ - на 25-30% ниже,чем в нормальной печени. Уровни гликогенсинтазы в исследованные нами сроки после прекращения токсического воздействия на животных во всех экспериментальных группах не отличались от нормальных.

Таким образом, полученные, результаты свидетельствуют о том, что распределение гепатоцитов по классам плоидности и уровню гипертрофии в циррозной печени даже через длительный период после устранения причины патологии, резко отличается от того, которое характерно для нормальной печени. Некоторое снижение среднего уровня плоидности клеток паренхимы в этот период отнюдь не означает возвращения системы гепатоцитов к состоянию нормы.

.Таблица 3

Содержание суммарного гликогена (СГ) и его легкодоступной фракции (ЛД) в • гепатоцитах крыс

Время После начала опыта, мес Тип глико -геНа Содержание гликогена в гепатоцитах крыс в разных вариантах опыта, усл.ел. К ЧГ-К БВ ЧГ УП ХГ

0 СГ ЛД 37.9+0.5 32.5±0.6 (86)

6 СГ ЛД 30.9+1.2 26.3±0.8 (85) 72.814.0 47.113.8 (65)

7 СГ ЛД 36.6±0.5 30.810.6 (84) - 44.713.3 33.813.6 (75) - 42.911.6 37.711.7 (88) 43.511.6 34.711.7 • (80)

Э СГ ЛД 32.211.2 26.110.5 (81) 27.910.8 24.310.9 (87) 33.7+1.9 27.111.7 (80) 46.712.8 36.811.5 (80) 43.512.9 38:212.8 (87) 34.712.9 29.212.8 (84)

12 СГ ЛД 30.311.2 25.310.6 (84) 28.110.8 23.910.9 (85) 32.412.6 24.712.2 (76) 40.511.3 35.411.6 (88) 41.011.6 35.612.9 (87) 36.1 + 1.6 28.912.9 • (80)

Примечание: в скобках - отношение ЛД/СГ (%).

Содержание в печени высокоплоидных клеток при всех исследованных условиях регенерации органа даже через 6 мес после устранения причины цирроза остается примерно на порядок выше, чем в печени контрольных крыс, Снижение среднего уровня плоидности клеток, наблюдающееся после прекращения воздействия СС^ , повидимому, происходит за счет более высокой пролиферативной активности низкоплоидных гелатоцитов. Усиленная пролиферация 2с-гепатоцитов несомненно свидетельствует о сохранении циррозным органом высокого регенераторного потенциала. Не исключено, однако, что повышенный уровень пролиферативной активности ниэкоплоидны» гелатоцитов на определенном этапе, когда достигнута достаточная длч нормального функционирования масса паренхимы печени, может стать процессом, тормозящим дальнейшую функциональную нормализацию из-за конкурентных отношений между тканеспецифическими и

пролифератиоными синтезами. Данные, представленные в работе, свидетельствуют о том, что более полное восстановление функции клеток паренхимы печени достигается в тех случаях, когда стимулированная патологическим процессом усиленная пролиферация низкоплоидных гепатоцитов тормозится в ходе реабилитационного периода и в паренхиме поддерживаются высокие уровни плоидности гепатоцитов (группы крыс с гормональной и углеводной стимуляцией регенераторного процесса). Частичная резекция печени, стимулируя мощный пролиферативный ответ гепатоцитов, напротив в определенной степени тормозит восстановление их функционального статуса.

ВЫВОДЫ

1. Хроническое отравление крыс ССи вызывает типичное цирротическое повреждение паренхимы печенй, сопровождающееся усиленным накоплением гликогена в гепатоцитах и снижением активности . ключевых ферментов его метаболизма - гликогенфосфорилазы и особенно глюкозо-6-фосфатазы.

2. Репаратйвный рост печени крыс в ходе развития экспериментального цирроза осуществляется не только за счет митотических делений клеток паренхимы и их полиплоидизации, но и за счет гипертрофии гепатоцитов.

3. Прекращение гепатотоксического воздействия на печень ослабляет некрогенные и воспалительные процессы, но не приводит к нормализации ее структуры: тяжи соединительной Ткани в паренхиме печени сохраняются в • течение 6 мес независимо от способа стимуляции регенерации печени.

4. В отличие от структуры, содержание гликогена и его фракций в гепатоцитах, а также активность гликогенфосфорилазы и глюкозо-6- • фосфатазы нормализуются быстрее.

5. Функциональная нормализация цирротически измененной печени происходит, полнее и быстрее у крыс, получавших усиленное углеводное . питание и хорионический гонадотропин, паренхима печени которых

характеризуется стабилизацией пролиферативных процессов в ходе восстановительного периода и высоким уровнем плоидности ее клеток.

6. Повышенный в ходе развития цирроза уровень гипертрофии гепатоцитов сохраняется после устранения патологического воздействия независимо от способа стимуляции регенерации печени.

7. Репаративные процессы в циррозной печени в течение первых трех месяцев после прекращения гепатотоксического воздействия обеспечиваются исключительно за счет пролиферации гепатоцитов. Вклад клеточной гипертрофии становится заметным лишь на последнем этапе эксперимента.

8. Полного восстановления исходной структуры печени и клеточного состава её паренхимы у крыс, перенесших цирроз, не происходит. Компенсация функции печени после цирроза обеспечивается за счет качественного Изменения состава популяции гепатоцитов.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Слепцова Л.А., Кудрявцева М.В., Федоров Л.Ю., Сакута Г.А., Кудрявцев Б.Н. Исследование уровня глюкозо-6-фосфатазы в печени крыс при хроническом отравлении СС1«//Тез.докл. научн. конфер. Молекулярные механизмы формирования патологических состояний. Л. 1988. С. 176-177.

2 Богданова М.С., Кудрявцева М.В., Кузнецова И.М., Шалахметова Т.М.. Завадская Е.Э., Сакута Г.А.. Кудрявцев Б.Н. Оценка относительного вклада процессов пролиферации, полиплоидизации и гипертрофии клеток в увеличение массы печени на разных стадиях постнатального развития крыс // Цитология. 1990. Т. 32. С.695-703.

З.Кудрявцева М.В., Слепцова Э.А., Емельянов А.В., Сакута Г.А., Кудрявцев Б Н. Адаптивные изменения гликогенной функции гепатоцитов крыс при действии на животных факторов окружающей среды // Тез. Всосоюлн симп Клет. механизмы адаптации. Цитология. 1991. Т.ЗЗ. С.110.

4 Сакута Г А., Кудрявцева М.В., Штейн Г.И., Кудрявцев Б.Н. Цитологические механизмы роста печени в условиях адаптации крыс к

хронической интоксикации CCI4 // Тез.Всесоюзн. симп. Клеточные механизмы адаптации. Цитология. 1991. Т.ЗЗ. С.132.

б.Сакута Г.А., Кудрявцева М.В., Кудрявцев Б.Н. Взаимосвязь полиплоидизации ядер гепатоцитов с синтетическими процессами в ходе регенерации циррозной печени крыс // Тез.докл.симпоэ, Структура и функции клеточного ядра. Цитология. 1993. Т.35. С,91.

6.Кудрявцева М.В., Сакута Г.А.. Емельянов A.B., Слепцова Я.А., Скорина А.Д., Кудрявцев Б.Н. Цитофлуориметрическое исследование содержания гликогена и активности ферментов его метаболизма в гепатоцитах человека и животных при циррозе печени и в условиях реабилитации// Цитология. 1994. Т.36. С.200-210. '

7.Кудрявцева М.В., Сакута Г.А., Кудрявцев Б.Н, Морфофункциональные аспекты метаболизма гликогена в печени человека и животных в норме, при циррозе и при реабилитации функции печени // Тез.Конгресса Морф, ассоциации (АГЭ). Журн,морфологии. 1994. N9-10. С. 102.

в.Сакута Г.А., Анацкая О.В., Кудрявцева М.В., Кудрявцев Б.Н. Клеточные механизмы морфогенеза печени при экспериментальном цирозе и последующей регенерации патологически измененного органа Ц Тез. Конгр. Морф.ассоциации (АГЭ). Журн.морфологии. 1994, N9-10. С.145-146.

Э.Кудрявцева М.В., Емельянов A.B., Сакута Г.А., Кудрявцев Б.Н. Гликогенообразовательная функции гепатоцитов в условиях регенерации циррозной печени крыс после частичной гепатэктомии// Цитология. 1996. Т.38. С.934-948.

10.Сакута Г.А., Кудрявцев Б.Н. Клеточные механизмы регенерации циррозной печени крыс. I. Соотношение процессов пролиферации, полиплоидизации и гипертрофии клеток после прекращения хронического воздействия CCI«// Цитология. .1996. Т.38. С.1158-1171.

11 .Сакута Г.А. Особенности полиплоидизации ядер гепатоцитов при регенерации циррозной печени крыс в условиях дополнительного углеводного питания//ЦитологИя. 1997. Т.39. С.99-100.

Tin-, bHutüifi. м: к Н1 г ¡СО Л'/»'--Я »