Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые особенности метаболизма гликогена в гепатоцитах при хронических поражениях печени

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Некоторые особенности метаболизма гликогена в гепатоцитах при хронических поражениях печени"

На правах рукописи 9 НЮ Л 1ПС'7 УДК 577.124.5/8:616.36-004-02:615.9

ЕМЕЛЬЯНОВ Александр Васильевич

НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА ГЛИКОГЕНА В ГЕПАТОЦИТАХ ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ПОРАЖЕНИЯХ ПЕЧЕНИ

03.00.25 - клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1997

Работа выполнена в лаборатории клеточной патологии Института цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Б.Н.Кудрявцев Институт цитологии РАН, С.-Петербург

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук И.М.Константинова

Институт цитологии РАН, С.-Петербург

Ведущее учреждение:

доктор медицинских наук ♦

М.М.(Павловский

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, С.-Петербург

Военно-медицинская академия им. С.М Кирова, С -Петербург

Защита состоится " " 1997 года в

на заседании диссертационного совета Д 002 73 01 Институга цитологии РАН по адресу. 194064. С.-Петербург, Тихорецкий пр.. А

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан

26:

мая 1997 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологически» наук

Л Н Писарева

■/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Хронические гепатиты и циррозы различной этиологии являются в настоящее воемя наиболее частыми и тяжелыми патологиями печени, нередко приводящими к летальному исходу (Блюгер, 1978; Серов и др., 1979). Причиной этих заболеваний могут быть различные агенты как вирусной, так и химической природы.

; Морфологически, как на светооптическом, так и на ультраструктурном уровнях, патогенез хронического гепатита и цирроза изучен достаточно подробно (Sherlock, 1974; De Groóte et al., 1978; Логинов, Аруин, 1985). Значительно слабее при хроническом гепатите и трансформации его в цирроз исследован метаболизм в печени, уровень ее тканеспецйфических функций. Одна из важных функций печени связана с ее участием в поддержании постоянного уровня глюкозы в крови. В регуляцию глюкостатической функции Печени вовлекается большое число различных факторов, среди которых особое место занимает мётаболическая гетерогенность гепатоцитов в разных зонах Долек печени (Teutsch, 1988; Jungermann. Katz, 1986, 1989; Lawrence et al.. 1986; Bartels et al„ 1988), которые подвергаются значительным деструктивным изменениям при хроническом гепатите и особенно при циррозе. Хронические поражений печени неизбежно отражаются на состоянии глюкостатической функции, приводя в Тяжелых случаях хронического гепатита и цирроза к снижению концентрации глюкозы 6 крови, появлению в ней значительных количеств недоокисленных продуктов Метаболизма, "диабетическому" сдвигу углеводного обмена в организме и другим нарушениям (Marcheslnl et al., 1981; Stewart et al., 1983; Kruszynska, Mclntyre, 1991).

Ранее было показано, что при хронических поражениях печени содержание гликогена в гепатоцитах увеличивается по сравнению с нормой. При этом было обнаружено, что повышение уровней гликогена в клетках не зависит от этиологии хронического гепатита или цирроза, а определяется тяжестью поражения печени (Кудрявцева и др., 1980, 1987, 1988, 1989). Механизмы, лежащие в основе такого накопления гликогена в гепатоцитах, неясны. Известно, однако, что после устранения повреждающего воздействия на печень, содержание гликогена в гепаюцитах снижается до уровня нормы (Кудрявцева и др., 1994, 1996).

£

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в том, чтобы исследовать причины повышения уровней гликогена в гепатоцитах при хронических заболеваниях печени и роль нарушений дольковой структуры печени в этом явлении. Исходя из этого были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать активность ключевых ферментов углеводного обмена и уровни гликогена в нормальной печени крыс и в печени крыс, подвергавшихся хроническому воздействию четыреххлористого углерода (ССЦ). при голодании и после введения животным глюкозы или фруктозы; .

2. Привести сравнительное исследование скорости накопления гликогена в гепатоцитах разных зон печеночной дольки в нормальной печени крыс И в печени крыс, подвергавшихся хроническому воздействию ССЦ;

3. Исследовать уровни гликогена в разных зонах печеночной дольки у больных хроническим гепатитом различной этиологии;

4. Провести сравнительное исследование содержания гликогена в гепатоцитах больных циррозом различной этиологии и в гепатоцитах крыс при экспериментальном циррозе печени;

5. Исследовать активность ключевых ферментов углеводного обмена в печени больных хроническим гепатитом и циррозом различной этиологии й у крыс при экспериментальном циррозе.

Научная ноаизна. Впервые показано, что хроническое повреждение печени ССЦ в течение 3 мес, не приводящее еще к значительным нарушениям ее дольковой структуры, вызывает резкое снижение активности глюкокиназы и повышение активности фосфофруктокиназы и фруктозо-1,6-дифосфзтазы. а также снижает скорость накопления гликогена в клетках портальной зоны дольки печени. В отличие от крыс, при хроническом гепатите у человека активность глйкогенфосфорилззы и глюкозо-6-фосфатазы падает. Отношение уровней гликогена между клетками портальной и центральной зон дольки печени при хроническом гепатите различной этиологии у человека снижено по сравнению с нормой. При циррозе как у крыс, так и у человека, нарушения углеводного обмена в печени усиливаются, приводя к накоплению гликогена в гепатоцитах и дальнейшему снижению активности гликоген-фосфорилазы и особенно глюкозо-С-фосфатазы.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в работе результаты важны для понимания основных механизмов нарушения углеводного обмена в печени при хроническом гепатите и циррозе. Уровни глюкокиназы и фосфофруктокиназы в печени, а также величина отношения содержания гликогена между клетками портальной и центральной зон дольки печени могут служить ранними маркерами хронических поражений печени разной этиологии. Величины снижения активности глюкозо-6-фосфатазы и гликогенфосфорилазы могут служить показателем уровня поражения печени при циррозе, степени его компенсации и быть использованы для прогнозирования заболевания. Полученные в работе данные могут быть использованы в курсах лекций для студентов медицинских институтов.

Апробация работы. Основные положения.работы были доложены и обсуждены на: III Всесоюзном совещании "Клеточные механизмы адаптации" (Чернигов, 1991), XV Международном биохимическом конгрессе (Иерусалим, 1991) и на совместном семинаре лаборатории клеточной патологии, лаборатории морфологии клетки и Лаборатории биохимической цитологии И цитохимии Института цитологии РАН.

По материалам Диссертации опубликовано В печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных и Их обсуждения, заключения,, выводов, списка литературы, включающего отечественный и ^•'¿'зарубежных источников. Текст изложен на /\ -Страницах. Работа содержит 24 рисунка и 15 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. Исследования проведены на материале печени 87 взрослых крыс-самцов, подвергавшихся хроническому ингаляционному воздействию ССЦ по 20 мин 3 раза в неделю в специальной камере (7 мл на 100 л объема) в течение 3 и 6 мес. В качестве контроля использовали интактных животных того же возраста и веса. При исследовании скорости накопления гликогена в печени и гепатоцитах крыс, подвергавшихся воздействию CCU в течение 3 мес, материал получали от животных, голодавших 48 ч, и затем через 10, 20, 30 и 60 мин после ["ведения перорально 30% растворов фруктозы или глюкозы (4 г/кг веса). Помимо

материала печени крыс, 8 работе использовался бирпсийный материал печени больных хроническим вирусным гепатитом В (30 чел.), алкогольным гепатитом (28 чел.), и циррозом печени различной этиологии (39 чел.). В качестве контроля была использована группа доноров, печень которых по клиническим и гистологическим показателям не отличалась от нормы.

Методы приготовления препаратов. Для цитофотометрии приготавливали мазки изолированных гепатоцитов, используя методику М.В.Кудрявцевой с соавт. (1972, 1983) или гистологические срезы печени. Субклеточные фракции печени для биохимического исследования активности ферментов выделяли методом дифференциального центрифугирования.

Цитохимические методы. При определении содержания гликогена и его фракций - легкодоступной (растворимой в ТХУ) и труднодоступной (нерастворимой в ТХУ и извлекаемой только с помощью крепкой щелочи) - в гепатоцитах крыс использовали окрашивание препаратов с помощью флуоресцентного варианта PAS-реакции (Кудрявцева и др., 1970, 1974). В качестве контроля использовали препараты гепатоцитов, обработанные а-амилазой (Rosa and Johnson, 1967). При измерении уровней гликогена в гепатоцитах на срезах печени крыс и человека применяли окрашивание препаратов, используя обычную PAS-реакцию в модификации М.В.Кудрявцевой с соавт. (1970, 1974). Окраску гепатоцитов нафтоловым желтым S на общий белок проводили по стандартной методике (Deitch, 1955, 1965). Для гистологического контроля степени поражения печени срезы окрашивали гематоксилин-эозином по Романовскому и пикрофуксином по Ван-Гизону (Пирс, 1962).

Пиохимические методы. Активность глюкокиназы, фосфофруктокиназы и фруктозо-1,6-дифосфатазы определяли спектрофотометрически по прибыли или убыли количества окисленных и восстановленных форм НАД и НАДФ (Ucda et al , 1974; Uyeda, 1979; Tejwani el al.. 1976). Активность гликогенфосфорилазы. гликогенсинтазы и глюкозо-6-фосфатаэы определяли с использованием меченмыл субстратов (Vardanis, 1991; Berteloot el al., 1991) Общий белок определяли по методу Бредфорда (Eradlord, 1976) Количество гликогена в печени определяли, используя глюкозооксидазный меюд (Huijing, 1970).

Методы измерений. Содержание гликогена в гепатоцитах измеряли с помощью импульсного цитофлуориметра РИФ-1 (Папаян и др., 1974; Кудрявцев и др., 1979), используя для выделения возбуждающего флуоресценцию света (436 нм) светофильтры ФС-1 (в мм) и СЗС-24 (4 мм). Для выделения света флуоресценции (Хигкс=52б нм) использовались светофильтры ЖС-18 (1 мм) и ЖЗС-19 (1 мм).

Для определения содержания белка в гепатоцитах использовали анализатор микроизображений "Морфоквант" (К.Цейсс-Йена), работающий в режиме сканирующего цитофотометра (Agadshahjan et ai.„ 1977). Измерения проводили в монохроматическом свете длиной волны 475 нм.

Измерение содержания гликогена В гепатоцитах разных зон дольки печени проводили на срезах, окрашенных PAS-рёакцией, используя анализатор изображений (ИСТА, С.-Петербург) на базе персонального компьютера IBM. В интерактивном режиме измерений на изображении срезо? выделяли гепатоциты, расположенные вокруг портальных или центральных вен печени в радиусе не более 5 клеток и измеряли в них содержание гликогена в монохроматическом свете с длиной волны 545 нм, используя интерференционный светофильтр.

Статистическую обработку результатов, полученных в данной работе, проводили, используя стандартные пакеты программ для персонального компьютера IBM - Statgraphics 5.0 и SigmaPlot for Windows 1.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Созрнитольное морфо-фуншиональное исследование печени ^нтактных крыс ixs'Ll^-fch

Исследование морфологических изменений в печени крыс, подвергавшихся хроническому воздействию ССЦ в течение 3 мес. Результаты морфологического исследования показали, что у опытной группы животных долько-вая структура паренхимы в основном сохраняется. В отличие от крыс контрольной группы количество соединительной ткани в паренхиме печени, локализующейся в основном вокруг портальных сосудов, заметно увеличено. Сами сосуды расширены

и их стенки несколько утолщены. Видны небольшие очаги лейкоцитарных инфильтратов. Часть гепатоцитов вакуолйзирована.

Исследование динамики накопления гликогена в печени голодавших крыс контрольной и опытной групп после введения глюкозы или фруктозы. Биохимическое исследование динамики накопления гликогена в печени голодавших крыс после введения им глюкозы или фруктозы показало, что различия в динамике накопления гликогена в печени Между животными опытной и контрольной групп отсутствовали. Количество гликогена в Печени крыс контрольной и опытной групп через 1 ч после введения глюкозы увеличивалось в 3.5 и 3.3 раза соответственно, а при введении фруктозы - в 3.7 и 3.9 раза соответственно. Различия между глюкозой и фруктозой в отношении их влияния на скорость накопления гликогена в печени крыс как контрольной, так и опытной группы отсутствовали.

• . «

время поело введений гтжом [мим I времо гюгле впеле»«*я 1

Рис, 1 Динамика накопления гликогена в гепатоцитах крыс контрольной и опытной групп после введения растворов глюкозы (а) или фруктозы (б).

Во избежание ошибок, связанных с гетерогенностью клеточной популяции, проведено цитофотометрическое определение содержания гликогена в гепатоцитах на различных этапах его ресинтеза. Кроме того, поскольку способность клеток запасать гликоген ограничивается при прочих равных условиях пространством, которое он может занимать в цитоплазме, гипертрофия клеток, обычно

сопровождающая повреждение печени, и изменение размеров клеток в ходе ресинтеза гликогена могут быть причинами изменения содержания гликогена в клетках. Для того, чтобы исключить влияние этого фактора, содержание гликогена р гепатоцитах выражали в расчете на единицу общего белка в клетках. Данные, представленные на рис.1, свидетельствуют о том, что скорость накопления гликогена после введения глюкозы в гепатоцитах крыс опытной группы несколько ниже (р<0.05), чем у интактных животных. В отличие от глюкозы, после введения фруктозы достоверных различий между контрольной и опытной группами животных по содержанию гликогена в клетках печени не обнаружено. Относительное содержание гликогена в гепатоцитах крыс контрольной и опытной групп за 1 ч после введения глюкозы увеличивалось в 3.6 И 2.7 раза, а в случае введения фруктозы - в 3.4 и 3.2 раза соответственно.

Исследования активности ферментов углеводного обмена в печени крыс

Исследование активности гликогенфосфорилазы и гликогенсинтазы. Результаты определения общей активности гликогенфосфорилазы и ее активной а-формы в печени крыс контрольной И опытной групп через различные интервалы времени после введения глюкозы или фруктозы (рис.2) свидетельствуют о том, что уже через 10 мин активность гликогенфосфорилазы а падает примерно на 25-28% (р<0.05). Через 60 мин после Введения моносахаров активность фермента снижалась примерно в 2.5 раза (р<0.01). В целом динамика и степень инактивации гликогенфосфорилазы а после введения животным фруктозы не отличались от характера инактивации фермента после введения глюкозы. Общая активность гликогенфосфорилазы в течение эксперимента в обеих группах животных оставалась на одном уровне.

Активность гликогенсинтазы в печени крыс контрольной и опытной групп через 10 мин после введения глюкозы возрастала в 2 раза (рис.3). После введения фруктозы уровни гликогенсинтазы в печени крыс контрольной и опытной групп через 10 мин увеличивались в 2.6 раза и были достоверно выше, чем после введения глюкозы (р<0 01), свидетельствуя о более ранней ее активации. Активация

«

время после введения глюкозы (мин.) время после введения фруктозы (мин.)

Рис.2 Активность гликогенфосфорилазы (нмоль/мг белкэ/мин) в печени крыс контрольной и опытной групп через разные интервалы времени после введения растворов глюкозы (а) или фруктозы (б).

время после введения г люкозы 1мим) время после введения фоуктози 1ми»)

Рис.3 Активность гликогенсинтазы (нмоль/мг белка/мин) в печени крыс контрольной и опытной групп через разные интервалы времени после введения растворов глюкозы (а) или фруктозы (б).

гликогенсинтазы происходила на фоне высоких уровней гликогенфосфорилазы а. Уровни гликогенсинтетазы через I ч после введения глюкозы возрастали в печени

крыс контрольной группы в 3.1 раза, а в печени крыс опытной группы - в 3.3 раза. Активность гликогенсинтазы за 130 мин после введения фруктозы крысам увеличилась: у животных контрольной группы в 3.2 раза, у животных опытной группы в 3.6 раза. Достоверных различий в активности гликогенсинтазы Между животными контрольной и опытной групп не обнаружено.

Исследование активности глюкокиназы и глюкозо-б-фосфатазы. Результаты определения глюкокиназной активности, представленные на рис.4, свидетельствуют о том, что при голоданий активность фермента в печени крыс, подвергавшихся воздействию ССи, составляет примерно треть от ее активности в печени крыс контрольной Группы. После введения глюкозы или фруктозы активность

• в

14

гг-20 18 1В 14 12 10 8 5

4 -

2 -0

Т-1-1—Г

20 30 - 4(1 50

24

22 20 1» 16 14 ■ 12 100 -9 4

а .................а

.д- -

А а'' * о контроле

а

Э мес. отрмленм!

время после введения глюкозы (мин).

О 10 20 30 40 50 60 вре«ч после введения фруктозы (мин)

Рис.4 Активность глюкокиназы (нмоль/мг белка/мин) 6 печени крыс контрольной и опытной групп через разные интервалы времени после введения растворов глюкозы (а) или фруктозы (б).

глюкокиназы в Течение 60 мин в печени крыс контрольной группы возрастает в 2.0 раза, а в печени крыс опытной группы - в 3.2 и 2.6 раза соответственно. Динамика глюкокиназной активности после введения глюкозы или фруктозы у контрольных крыс не отличалась. В то же время, необходимо отметить, что в печени животных опытной группы активность глюкокиназы после введения глюкозы возрастала в большей степени (в среднем на 19.4%), чем после введения фруктозы (р<0.05) Тем не менпе, активность глюкокиназы в печени крыс опытной группы оставалась

значительно более низкой, чем в печени контрольных животных. Через 60 мин после введения моносахаров активность глюкокиназы в печени крыс опытной группы составляла примерно 50% от контрольных значений (р<0.01).

Исследование активности глюкозо-6-фосфатазы В печени крыс контрольной и опытной групп показало (рис.5), что в течение 20 мин после введения глюкозы или фруктозы голодавшим животным ее активность возрастает на 10-15% (р<0.05). Однако, в дальнейшем ее активность остается неизменной. Достоверных различий в активности этого фермента в печени крыс контрольной и опытной групп в течение всех исследованных временных интервалов не обнаружено.

80 3 70

п

•I 60 •

I-

А

О

Д

О 10 го 30 40 50 60 время после введения глюком {мин|

"1-1-1-1-1-1-Г

О 10 » 30 40 50 60

ерем« после введения фруктозы (мим(

Рис.5 Активность глюкозо-6-фосфатазы (нмоль/мг белка/мин) в печени крыс контрольной и опытной групп через разные интервалы времени после введения растворов глюкозы (а) или фруктозы (б).

Отношение активности глюкозо-6-фоефатазы к активности глюкокиназы отражает уровень поглощения глюкозы печенью (ВеШоге е1 а!.. 1989) и дает возможность в определенной мере оценить баланс между абсорбцией и продукцией глюкозы печенью. Результаты свидетельствуют о том, что уровень продукции глюкозы у крыс опытной группы более, чем в 3 раза превышает уровень ее продукции у контрольных животных. Введение моносахаров не приводило к полному подавлению продукции глюкозы у крыс ни контрольной, ни опытной групп

Исследование активности фосфофруктокиназы и фруктозо-1,6-дифосфатазы. Результаты исследования уровней фруктозо-1,6-дифосфатазы, представленные на рис.6, свидетельствуют о том, что как при голодании, так и при последующем введении глюкозы или фруктозы активность фермента у крыс опытной группы оставалась примерно на 20% выше, чем у крыс контрольной группы (р<0.05).

9 -

в -5

4 -

3 -

г -

а ? N ........... 5 -О

о (ОМТрОГЪ

А

ю

I

го

I г 30 40 50 60

10

I •

| в | 7

■А. 6 1 5 !;

12 о

время после введения ГЛЮ*ОЗЫ (мим|

время после введения фруктозы (мин)

Рис.6 Активность фруктозо-1,6-дифосфатазы (нмоль/мг белка/мин) в печени крыс контрольной и опытной групп через разные интервалы времени после введения растворов глюкозы (а) или фруктозы (б).

Данные, представленные на рис.7, свидетельствуют о том, что активность фосфофруктокиназы в печени голодавших крыс контрольной и опытной групп после введения глюкозы или фруктозы в течение 1 ч увеличивалась в 2.2-2.3 раза ив 1.61.7 раза соответственно. Активность фосфофруктокиназы после введения глюкозы или фруктозы была значительно выше (в среднем на 50%) в печени животных опитнои группы, чем в нормальной печени (р<0.01).

Исследование синтеза гликогена в портальной и центральной зонах ')!>.! 1ки печени крыс контрольной и опытной групп после введения глюкозы ii.ni »фруктозы. Результаты, представленные на рис.8 и 9, свидетельствуют о том, чю о течение первых 10 мин содержание гликогена в печени контрольных крыс в

о

время после введения глюкозы (мин) время после введения фруктозы (мин)

Рис.7 Активность фосфофруктокиназы (нмоль/мг белка/мин) в печени крыс контрольной и опытной групп через разные интервалы времени после введения растворов глюкозы (а) или фруктозы (б).

случае введения им глюкозы увеличивается примерно на 33% в портальной зоне и на 31% й центральной зоне дольки. После введения фруктозы содержание гликогена увеличивается в портальной и центральной зонах дольки на 34 и 28% соответственно. Необходимо отметить, что у контрольных крыс В этом интервале времени как после введения глюкозы, так и фруктозы скорость накопления гликогена в гепатоцитах портальной зоны Дольки печени Достоверно Превышает таковую в гепатоцитах центральной зоны (р<0.01).

На всех дальнейших сроках наблюдения, независимо от введенного сахара, уровни гликогена в клетках паренхимы печени животных контрольной группы нарастают. При этом достоверные различия в содержании гликогена Между клетками портальной и центральной зонами дольки сохраняются. В итоге, за 60 мин уровни гликогена в гепатоцитах контрольных животных после введения глюкозы или фруктозы в портальной зоне дольки печени возрастали примерно в 2.9 раза, а в центральной зоне - в 2.7 и 2.5 раза соответственно. Достоверных различий в скорости накопления гликогена в разных зонах дольки печени между глюкозой и фруктозой, при использовании их в качестве субстратов, не обнаружено.

центральная зона дольки печени

портальная зона дольки печени

■А / Л

° о контроль

А Э ме отраичи»«

время после введения глюкозы (мин)

О 10 20 30 40 50 60 время после введения глюкозы (мин)

Рис.В Динамика накопления гликогена в разных зонах дольки печени крыс контрольной и опытной групп после введения раствора глюкозы.

центральная зона дольки печени

порталшая зона дольки печени

кк>мя после гк'Л'-н.'и фр>ктоэы (мин) время после введения фруктозы (мин)

Рис 9 Динамика накопления гликогена в разных зонах дольки печени крыс контрольной и опытной групп после введения раствора фруктозы.

Результаты измерения уровней гликогена в гепатоцитах портальной и центральной зон дольки печени крыс опытной группы, представленные на рис.8 и 9 свидетельствуют о том, что уровни гликогена в гепатоцитах портальной зоны как после введения глюкозы, так и фруктозы значительно ниже, чем его уровни в

клетках центральной зоны на всех исследований временных интервалах (р<0.01). Уровни гликогена в гепатоцитах центральной зоны дольки печени у крыс опытной и контрольной групп практически одинаковы. Таким образом, различия в уровнях гликогена между гепатоцитами портальной и центральной зон у крыс опытной группы после введения им глюкозы или фруктозы обусловлены главным образом снижением скорости его накопления в клетках портальной зоны дольки печени.

Количественный анализ содержания гликогена в гепатоцитах разных зон дольки

печени у здоровых пациентов и у больных хроническим гепатитом различной

этиологии

Результаты измерения содержания гликогена в гепатоцитах портальной и центральной зон дольки печени в норме и у больных хроническим гепатитом различной этиологии представлены на рис.10. Содержание гликогена в гепатоцитах портальной зоны дольки нормальной йечени человека оказалось выше, чем в гепатоцитах центральной зоны дольки, причем среднее отношение между содержанием гликогена в гепатоцитах этих зон составляло .1.13. Это отношение

1.20 1.15 -I 10 -1 05 -

Рис.10 Отношение уровней гликогена между гепатоцитами портальной и центральной зон »4 дольки печени человека в норме (Н), у больных

хроническим вирусным гепатитом (ХВГ) и '. хроническим алкогольным гепатитом (ХАГ).

варьировало у отдельных пациентов от 1.073 до 1.246. У больных хроническим вирусным гепатитом В отношение между содержанием гликогена в гепатоцитах портальной и центральной зон дольки печени было меньше, чем в нормальной печени - 1.06 (р<0.05) и варьировало от 1.033 до 1.146 у разных больных. Относительное содержание гликогена в гепатоцитах центральной зоны дольки печени при хроническом алкогольном гепатите было выше, чем в клетках портппьной зоны у всех пациентов. Отношение уровней гликогена между 'гепатоцитами портальной и центральной зон колеблется от 0.882 до 0 964.

составляя в среднем 0.930. Эта величина достоверно ниже аналогичных значений для нормальной печени (р<0.01) и печени больных хроническим вирусным гепатитом (р<0.05).

Исследование активности гликогенфосфорилазы и глюкозо-6-фосфатаэы в печени больных хроническим гепатитом показало, что активность гликогенфосфорилазы снижается в 1.5 раза (р<0.05); в то время как активность глюкозо-6-фосфатазы - в 1.2 раза (р<0.05) по сравнению с нормой (рис.11).

; печени крыс и

Исследование морфологических изменений печени крыс при экспериментальном циррозе печени. В результате хронического воздействия на крыс ССГ4 в течение 6 мес у них развивается типичный цирроз печени. Дольковая структура печени нарушается, тяжи соединительной ткани пронизывают паренхиму печени, Деля ее на ложные дольки, в центре которых нередко отсутствует просвет центральной вены. В паренхиме появляются обширные лейкоцитарные инфильтраты и большое количество клеток Купфера. Хроническое отравление крыс ССЦ вызывает значительные изменения в структуре самих гепатоцитов, которые увеличиваются в размерах, вакуоЛизируются и часто имеют явные признаки дистрофии.

Оценка содержания суммарного гликогена и его фракций в ' гепатоцитах нормальной и цирротически измененной печени крыс. Содержание гликогена в клетках нормальной печени колеблется в довольно узких границах, составляя в среднем 37.6 усл. ед. Содержание суммарного гликогена в гепатоцитах цирротически изменной печени крыс превышало исходный нормальный уропень у разных животных в 1.6-3.0 раза (р<0.01). Исследование состава гликогена показало, что содержание легкодоступной (ЛД) фракции гликогена снижается, в то время как доля его труднодоступной (ТД) фракции возрастает по сравнению с содержанием этих фракций в клетках паренхимы печени крыс контрольной группы. В нормальной печени доля ЛД-фракции гликогена составляет величину 85%, а доля ТД-фракции около 15% от суммарного гликогена. В гепатоцитах цирротически

1'6

измененной печени относительное содержание эТих фракций составляет в среднем величины 61% и 39% соответственно. .

Исследование активности глюкозо-б-фосфатазы, гликогенфосфорилазы и гликогенсинтазы. Определение активности глюкозо-б-фосфатазы в цирроти-чески измененной печени крыс показало, что ее уровень снижен в 4.3 раза по сравнению с нормальной печенью. При циррозе печени активность гликогенфосфорилазы а снижена на 15% (р<0.05) по сравнению с контролем. Общая активность гликогенфосфорилазы в патологически измененной печейи крыс изменяется не столь существенно, но тем не менее она оказалась на 26% ниже, чем в контроле (р<0.05). Исследование активности гликогенсинтазы в цирротически измененной печени крыс показало, что уровни этого фермента достоверно не отличались от значений, характерных для нормальной печени крыс,

Морфо-функчионапьноо исследование печени здоровых пациентов и бояьныа циррозом печени различной этиологии

Исследование морфологии печени человека в норме и при циррозе печени. Характерными признаками цирротического перерождения печени у человека, как и у крыс, являются замещение клеток паренхимы соединительной тканью, нарушение дольковой структуры Печени, утолщение стенок сосудов портальных трактов. В случае вирусного поражения в печени часто присутствуют лейкоцитарные инфильтраты, а в случаях алкогольного й алкогольно-вирусного имррозов - обширные области гепатоцитов с жировыми включениями.

Определение общего содержания гликогена и его фракций в клетках печени человека в норме и у больных циррозом печени различной этиологии. Результаты определения содержания суммарного гликогена в клетках Паренхимы печени больных циррозом вирусного, алкогольного и смешанного алкогольно-вирусного происхождения свидетельствуют о том, что его содержание в гепатоцитах больных циррозом печени в среднем в 3 раза превосходит таковое в норме (р<0.01). Исследование фракционного состава гликогена в клетках паренхимы печени больных циррозом показало, что увеличение содержания суммарного

Рис. 11 Активность глюкозо-6-фосфатазы (Г6Ф) и гликогенфосфорилазы (ГФ) в печени человека в норме, у больных хроническим персистирующим гепатитом (ХПГ) и циррозом печени смешанной этиологии.

гликогена в клетках сопровождается снижением доли ЛД-фракции до 66.8% (в норме 92.8%) и увеличением ТД-фракции до 33.2% (в норме 7.2%). Относительное содержание этих фракций гликогена в гепатоцитах больных циррозом алкогольной и вирусной этиологии также отличается. У больных циррозом печени вирусного происхождения доля ТД-фракции гликогена составляет в среднем 30.1%, в то время как у больных циррозом алкогольной этиологии она несколько выше - 36.6% (р<0.01). Полученные на печени человека результаты в целом согласуются с приведенными выше результатами исследования фракционного состава гликогена в гепатоцитах крыс при экспериментальном циррозе печени.

Исследование активности гликогенфосфорилазы и глюкозо-б-фосфатазы в нормальной печени человека и у больных циррозом печени различной этиологии. Результаты, представленные на рис. 11 свидетельствуют о том, что при циррозе печени, по сравнению с хроническим гепатитом, наблюдается дальнейшее снижение активности глюкозо-6-фосфатаэы и гликогенфосфорилазы. Общая активность г ликогенфосфорилазы и активность ее а-формы снижаются в 3.1 раза, в то время как активность глюкоэо-б-фосфатазы - в 4.4 раза (р<0.05) по сравнению с нормальной печенью.

Таким образом, полученные результаты свидетельс", уют, что хроническое попрежление печени крыс в течение 3 мес, не приводящее еще к значительным изменениям се долькопой структуры, вызывает существенную перестройку углеводного обмена в органе, приводя, в частности, к возрастанию активности фрукгозо-1 ,6-дифосфатазы и особенно фосфофруктокиназы, а также к резкому

снижению активности глюкокиназы. Потеря клеток в центральных зонах печеночных долек при действии ССЦ способствует увеличению функциональной нагрузки на перипортальные гепатоциты. В результате этих изменений в клетках портальных зон, по-видимому, усиливается скорость глюконеогенеза и Гликогенолиза, приводя к уменьшению накопления в них гликогена, а в перицентрапьных гепатоцитах возрастают скорости гликолиза и липогенеза. Полученные данные позволяют также предположить, что усиленное отложение гликогена в гепатоцитах при хроническом гепатите и циррозе печени у человека связано с резким снижением активности глюкозо-6-фосфатазы И гликогенфосфорилазы. Сопоставляя данные полученные для циррозной печени человека и крыс, можно отметить, что активность гликогенфосфорилазы при циррозе печени человека снижается значительно сильнее, чем в цирротически измененной Печени крыс. Возможно, это обстоятельство определяет значительно более высокий уровень накопления гликогена в гепатоцитах больных циррозом печени по сравнению с клетками паренхимы Цирротически измененной Печени крыс.

ВЫВОДЫ

1. Хроническое воздействие на крыс ССЦ в течение 3 мес приводит к снижению (более чем в 2 раза) активности глюкокиназы, увеличению примерно вдвое активности фосфофруктокиназы и увеличению активности фруктозо-1,6-дифосфатазы (На 20%) по срайнению с нормальной печенью. Активность гликогенсинтазы, гликогенфосфорилазы и глюкозо-6-фосфатазы в печени крыс, подвергавшихся воздействию ССЦ, по сравнению с нормальной печенью, не изменяются.

2. Введение глюкозы или фруктозы после 48 ч голодания интактным крысам И крысам, подвергавшимся в течение 3 мес воздействию ССЦ, вызывает сходные изменения углеводного обмена в печени, за исключением несколько более быстрой активации гликогенсинтазы фруктозой.

3. Хроническое воздействие На крыс в течение 3 мес ССЦ вызывает снижение Скорости накопления гликогена в гепатоцитах, преимущественно в портальных зонах долек печени. ■

4. При хроническом вирусном гепатите В и алкогольном гепатите у человека в печени наблюдается снижение активности гликогенфосфорилазы и глюкозо-6-фосфатазы в 1.5 и 1.2 раза соответственно.

5. Отношение уровней гликогена между клетками портальной и центральной зон долек в нормальной печени человека составляет натощак величину 1.13. При хронических гепатитах различной этиологии у человека это отношение снижается и составляет для хронического вирусного гепатита В величину 1.06, а для алкогольного гепатита - 0.93.

6. При экспериментальном циррозе печени, вызванном хроническим воздействием CCI« в течение 6 мес, уровни гликогена в гепатоцитах возрастают по сравнению с нормальной печенью в 2.3 раза. Активность гликогенфосфорилазы и особенно глюкозо-6-фосфатазЫ снижаются по сравнению с нормальной печенью на 26% И 77% соответственно.

7. При циррозе печени у человека натощак уровни гликогена в гепатоцитах увеличиваются в 3 раза, а активность гликогенфосфорилазы и глюкозо-б-фосфатазы снижаются в 3.1 и 4.4 раза соответственно.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Emelyanov A.V., Kudryavtseva M.V., Sakuta G.A., Kudryavtsev B.N. Activity of enzymes of glycogen metabolism and contents of total glycogen and its fractions in hepatocytes of human with cirrhosis of the liver // Symposium on Advances in Regulation of Carbohydrate Metabolism. Jerusalem, Israel. Abstracts. 1991. P.61.

2. Кудрявцева M.B., Слепцова Э.А.. Емельянов A.B., Сакута Г.А., Кудрявцев Б.Н. Адаптивные изменения гликогенной функции гепатоцитов крыс при действии на животных факторов окружающей среды // Клеточные механизмы адаптации. Тез. докл. Всезоюзного совещания. Чернигов, 1991. Цитология. 1991. Т.33. С.110.

3. Кулрчнцепп М В., Емельянов A.B., Сакута Г.А., Скорина А.Д., Слепцова Л.А., Куярпоцгзв б.Н. Цитофлуорометрическое исследование содержания гликогена и ого фракций в гепатоцитах больных циррозом печени различной этиологии // Цитология. 1992. Т.34. №11-12. С.102-109.

4 Кудрявцева M B., Сакута Г.А., Емельянов A.B., Слепцова Л.А., Скорина А.Д., Кудрявцев Б Н. Цитофлуорометрическое исследование содержания гликогена и активности некоторых ферментов его метаболизма 0 гепатоцитах человека и

животных при циррозе печени и в условиях реабилитации // Цитология. 1994. Т.36. С.200-210.

5. Кудрявцева М.В., Емельянов А.В., Сакута Г.А., Кудрявцев Б.Н. Гликогено-обраэовательная функции гепатоцитов в условиях регенерации циррозной печени крыс после частичной гепатэктомИи// Цитология. 1996.Т.38. С.934-948.

6. Kudryavtseva M.V., Sakuta Q.A., Skorina A.D., Stein O.I., femelyanov A.V., Kudryavtsev B.N. Quantitative analysis of glycogen content in hepatocytes of portal and central lobule zones of normal human liver and In patients with chronic hepatitis of different etiology // Tissue and Cell. i996. Vol.28. P.279-285.

Tun.&fiCUl&to, A AC. W. ncp iCC