Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние ксенотрансплантации эмбриональной ткани на гистоструктуру печени крыс при стрессе и интоксикации этиленгликолем

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние ксенотрансплантации эмбриональной ткани на гистоструктуру печени крыс при стрессе и интоксикации этиленгликолем"

На правах рукописи

ВЫБОРОВА Ирина Сергеевна

ВЛИЯНИЕ КСЕНОТРАИСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ТКАНИ НА ГИСТОСТРУКТУРУ ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ СТРЕССЕ И ИНТОКСИКАЦИИ ЭТИЛЕНГЛИКОЛЕМ (экспериментальное исследование)

03.00.25 - гистология, цитология и клеточная биология.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

□ □3 1Т4015

Иркутск, 2ии /

003174015

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет МЗ и СР РФ».

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Васильева Людмила Сергеевна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Бенеманский Виктор Викторович Ангарский Институт Биофизики

доктор медицинских наук, профессор Семинский Игорь Жанович

ГОУ ВПО Иркутский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова МЗ и СР РФ

Защита диссертации состоится « » <#£>..? ¿>/гЛ-_2007 года в 9 часов

на заседании диссертационного Совета Д.001.054.01 при ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН» по адресу: 664003, г.Иркутск, ул.Тимирязева,]6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН».

Автореферат разослан « <Г »£¡¿^13'_2007г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Несмотря на устойчивый интерес к эмбриогистотерапии с начала прошлого века и по настоящее время, накопленный многолетний клинический опыт и широкий спектр применения клеточной терапии (В.Г Бруслик, 1975; ВС. Репин, 1998, ГЕ Островерхое, 1982 и др), многие закономерности ее влияния на организм реципиента остались мало изученными Об этом свидетельствуют неоднородность клинических данных при использовании эмбриогистотерапии, неодинаковые, иногда противоположные результаты клинической эффективности При этом не вызывает сомнения необходимость использования эмбриогистотерапии и как самостоятельного метода лечения, и, особенно, в трансплантологии, как метода, предшествующего трансплантации органов

Применение трансплантации эмбриональных тканей в трансплантологии обусловлено тем, что она эффективно корригирует метаболические дефекты, а также является "мостом" к пересадке печени (IJ. Fox et al, 1998, S P Horslen et al, 2003; R R Mitry et al, 2004) Фетальные ткани обладают высоким пластическим потенциалом, связанным с большим содержанием бластных клеток, способных к росту, миграции и образованию новых межклеточных связей В эмбриональных тканях значительно снижено количество зрелых иммунокомпетентных клеток, отсутствует видовая специфичность, так как в 1 и 2 триместрах гестации еще не экспрессированы белки гистосовместимости I и II класса (А С Брюховецкий, 1993, А.П Милованов с соавт, 2006). Они содержат большое количество регуляторных веществ, стимулирующих и ограничивающих пролиферацию клеток (Д В Бузник, 1992, М Gieissner et all, 1997, Ю Н Лебедева, 2001)

Установлено, что ростовые факторы фетальных тканей способны обеспечивать выживание и (или) стимуляцию регенерации поврежденных тканей рецепиента, стимулируют функции аналогичного органа реципиента (В И Шумаков, 1981, AM Stefan, 1999, N Kobayashi, 2000, BE Рябинин, 2002; H Nagata, 2003, А А Рунович, 2005) Сейчас разработаны биомедицинские технологии лечения с помощью трансплантации эмбриональной ткани печени (ЭТП) таких заболеваний как атеросклероз, онкозаболевания печени (А М Esch et al, 2005), ферментопатии (IJ Fox et al., 1998, M Muraca et al, 2002 E M. Sokal et al, 2003, S P Horslen et al, 2003; R R Mitry et al, 2004, G Ambrosmo et al , 2005), острая печеночная недостаточность (В Е Рябинин, 2002, A Dhawan et al, 2004, A A Khan et al, 2004), а также экспериментальный цирроз печени (А М Stefan et al, 1999, N Kobayashi, 2000, H Nagata, 2003)

Исследование корригирующего влияния трансплантации ЭТП при различных типах поражения печени открывают возможности для сравнительного анализа общих и специфических закономерностей влияния ЭТП на структуру печени Учитывая, что ЭТП содержит как стимуляторы, так и ингибиторы пролиферации, необходимо выяснение вопроса, в каких условиях проявляется преимущественно тот или иной эффект Подобных работ в литературе не обнаружено, хотя это имеет решающее значение для определения сроков и режимов проведения эмбриогистотерапии и получения максимального клинического эффекта

j

Цель работы. Выявить гепатотропные корригирующие эффекты ксенотрансплантации эмбриональной ткани печени в условиях иммобилизационного стресса и интоксикации этиленгликолем

Задачи;

1) Определить структурные критерии и отличительные особенности альтерации и процессов репарации печени при иммобилизационном стрессе и интоксикации этиленгликолем.

2) Исследовать влияние ранней ксенотрансплантации эмбриональной ткани на структуру печени крыс при интоксикации этиленгликолем и при иммобилизационном стрессе.

3) Выявить гепатотропные корригирующие эффекты ксенотрансплантации эмбриональной ткани печени, проведенной в поздние сроки интоксикации этиленгликолем и иммобилизационного стресса

Научная новизна. Установлено негативное влияние на структуру печени ранней эмбриогистотерапии, проведенной в период действия альтерирующих факторов - через 6 часов после интоксикации этиленгликолем и через 2 часа после окончания иммобилизации Показано, что ранняя трансплантация эмбриональной ткани печени усиливает осмотическое повреждение и некротизацию гепатоцитов, ослабляет их способность к выживанию и восстановлению, что приводит к усугублению альтерации печени и замедлению репаративных процессов

Доказано гепатотропное корригирующее влияние отсроченной трансплантации эмбриональной ткани печени, проведенной в конце вторых суток после иммобилизации и интоксикации этиленгликолем, которое проявляется уменьшением некротизации паренхимы печени, стимуляцией коллагеногенеза и пролиферации гепатоцитов

Выявлены основные гепатотропные корригирующие эффекты отсроченной трансплантации эмбриональной ткани печени в условиях иммобилизационного стресса и интоксикации этиленгликолем, которые выражаются в мембранопротекторном и вазопротекторном действии, стимуляции пролиферации гепатоцитов, сохранении функциональной активности клеток Купфера и активации коллагеногенеза

Сравнительный анализ гепатотропного влияния ксенотрансплантации эмбриональной ткани, проведенной в разные сроки развития иммобилизационного стресса и интоксикации этиленгликолем, доказал, что эффективность корригирующего действия эмбриональной ткани печени определяется преимущественно сроками проведения трансплантации и, в меньшей мере, типом повреждения

Теоретическая и практическая значимость На основе экпериментальных данных доказано гепатотропное корригирующее действие и выявлен ряд протекторных и стимулирующих эффектов отсроченной трансплантации эмбриональной ткани печени в условиях иммобилизационного стресса и интоксикации этиленгликолем Определен оптимальный срок проведения трансплантации эмбриональной ткани печени, которым является временной период патологического процесса, характеризующийся прекращением или ослаблением

действия альтерирующих факторов и началом естественной активации восстанови гельных процессов

Полученные результаты дают основание рекомендовать применение трансплантации эмбриональной ткани с целью коррекции нарушений печени, вызванных стрессом и интоксикацией этиленгликолем, после ослабления острых явлений альтерации

ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1 Основным типом альтерации печени при стрессе является диффузное осмотическое повреждение гепатоцитов (гидропическая и баллонная дистрофия), а при интоксикации этиленгликолем преобладают метаболические нарушения, проявляющиеся диспротеинозом, гиалиново-капельной дистрофией, формированием очагов матово-стекловидных гепатоцитов.

2 Ксенотрансплантация эмбриональной ткани печени, совпадающая по времени с альтерирующим действием стресса и токсическими эффектами этиленгликоля, усиливает дистрофические и некротические процессы, снижает репаративный потенциал гепатоцитов, усугубляя нарушение структуры печени и замедляя ее восстановление

3 Отсроченная ксенотрансплантация эмбриональной ткани печени, проведенная в период ослабления острых явлений повреждения и начала репаративных процессов, оказывает эффективное корригирующее воздействие, проявляет мембранопротекторный и вазопротекторный эффекты, сохраняет функциональную активность клеток Купфера, стимулирует пролиферацию гепатоцитов, активирует коллагеногенез, таким образом, ускоряет восстановление паренхимы и стромы печени

Апробация полученных результатов. Результаты исследований опубликованы в 5 работах, 3 из них в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, и доложены на VII конгрессе с международным участием «Паллиативная медицина и реабилитация» (Красноярск, 2005), на расширенном заседании кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ИГМУ (2007), на заседании проблемной комиссии ИГМУ «Морфология, физиология и общая патология» (2007)

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 158 страницах по традиционному плану, включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложение собственных результатов, обсуждение результатов, выводы, список литературы из 251 источников (149 на русском языке, 102 иностранных) Полученные результаты представлены в 5 таблицах и иллюстрированы 104 рисунками в виде графиков, диаграмм, микрофотографий

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Исследование выполнено с использованием двух экспериментальных моделей иммобилизационного стресса и острой интоксикации этиленгликолем (ЭГ) После моделирования патологического состояния крысам проводили ксенотрансплантацию эмбриональной ткани печени (ЭТП) в дв>х режимах 1 -

ранняя трансплантация, через несколько часов, после моделирования патологического состояния, в период активного повреждающего действия патогенных факторов, 2 - отсроченная трансплантация, в период активации репаративяых процессов

1. Экспериментальная модель острого отравления этиленгликолем и сроки наблюдения.

Острую интоксикацию ЭГ моделировали путем однократного введения 60% водного раствора этиленгликоля (ЭГ) в желудок через зонд в дозе 8 г/кг (каждой крысе вводили 3-3,3 мл раствора, в зависимости от массы тела)

Доза ЭГ подбиралась экспериментально По данным литературы, ЛД50 составляет от 6,6 г/кг до 11 г/кг (Б Ф Почебыт, 1975, ЦИ Коркач, 1990, Е Ю Бокитенко, 2003 и др) При дозе 8 г/кг клинические проявления острого отравления соответствовали описанным в литературе

Сроки исследования выбраны исходя из токсикодинамики ЭГ и клинической картины при острой интоксикации ЭГ Быстро всасываясь из желудочно-кишечного тракта (за 1 ч), ЭГ поступает в кровь, выделяется в неизменном виде почками (20-30%), около 60% окисляется в печени Максимальная концентрация этиленгликоля в крови при пероральных отравлениях определяется в первые 6 ч после приема яда, а длительность его циркуляции составляет от 24 до 48 ч (Т М Буравская, 1967, БД Комаров, 1973, СН Голиков, 1980) По клиническим наблюдениям в первые сутки острого отравления ЭГ циркулирует в крови в неизменном виде, преобладают симптомы поражения ЦНС по типу алкогольного опьянения (В И Буряк, 1992, ЮВ Буров, 1994) К 3-5 суткам развивается гепатопатия и нефропатия вплоть до острой печеночно-почечной недостаточности (БД Комаров 1973, СН Голиков, 1986) Стадия истощения наступает на 14-16 сутки (О Н Шашкова, 2000) Исходя из представленных данных литературы, животных выводили из эксперимента через 1,3,5, 15 суток после введения ЭГ

2. Экспериментальная модель стресса и сроки наблюдения.

В качестве стрессора применяли апробированную Н 8е1уе (1936) модель нервно-мышечного напряжения - иммобилизация ненаркотизированных крыс в горизонтальном положении на спине в течение 6 часов однократно Известно, что после 6-часовой иммобилизации крыс на спине на протяжении 36 часов развивается стадия тревоги стресса, характеризующаяся максимальной вторичной альтерацией органов и тканей (В В Малышев с соавт, 1985, Л С Васильева, 1995, ОМ Ощепкова, 1995 и др) Переход стадии тревоги в стадию резистентности регистрируется через 36-39 часов после окончания иммобилизации В стадию резистентности постепенно восстанавливается гомеостаз и нормализуется структурно-функциональное состояние органов (ПД Горизонтов, 1974, ФЗ Меерсон, 1981 и др ) В соответствии с данными литературы, животных выводили из опыта через 36-39 часов - в период перехода стадии тревоги в стадию резистентности, когда повреждения органов максимальны, а затем в стадию резистеитости — на 4 и 7 сутки, что позволило оценить активность восстановительных процессов

3. Ксенотрансплантация эмбриональной ткани печени.

Эмбриональную ткань печени человека получали при выполнении медицинских абортов (срок гестации 8-12 недель) в специализированном лечебном учреждении Абортную массу собирали в стерильный лоток, затем фильтровали через сито из медицинской нержавеющей стали с диаметром отверстий 0,5 см для отделения жидкой фракции абортной массы, которую помещали в раствор питательной среды «ИГЛА» с гентамицином и транспортировали в контейнере с сухим льдом. В условиях стерильного бокса фрагменты эмбриональной ткани отмывали в растворе «ИГЛА» от сгустков и клеточных элементов крови 3-4 раза, затем в стерильной чашке Петри под бинокулярной лупой из них извлекали печень, взвешивали ее, рассекали на мелкие фрагменты (1x1 мм), повторно отмывали в растворе «ИГЛА» 4-5 раз, гомогенизировали в ручном стеклянном гомогенизаторе Поттера Гомогенат ЭТП отмывали от клеточных элементов крови, центрифугировали и ресуспензировали в соотношении 1/5 в растворе «ИГЛА» Проводили цитологическую верификацию полученной ЭТП путем приготовления нативного мазка и исследования под микроскопом Жизнеспособность клеток определялась методом витальной окраски трипановым синим Гепатоциты, как правило, располагались группами и конгломератами с элементами кроветворной гкани, разрушенные клетки с вакуолизацией цитоплазмы составляли 30 - 50% Среди клеток ЭТП 75-80% составляли клетки гемопоэза, 20-25% - гепатоциты, что соответствует клеточному составу печени эмбриона человека в срок 8-12 недель гестации (А.П Милованов с соавт, 2006) Концентрация клеток в 1 мл клеточной суспензии составляла 134><104

Полученная суспензия ЭТП в растворе «ИГЛА» вводилась крысам в подкожную ткань спины (Л С Васильева, 2002) из расчета 50 мг/кг Одной крысе вводили 0,5 мл суспензии, содержащей 10 мг ЭТП (67><104 клеток)

4. Условия эксперимента и распределение животных на группы

Опыты проведены на 150 беспородных крысах-самцах массой 170-190 г в осенне-зимний период Животные содержались в стандартных условиях вивария, на полнорационной сбалансированной по содержанию питательных веществ диете для лабораторных животных (ГОСТ Р50258-92) Экспериментальные исследования проводились согласно правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000 3-96 и 51000 4-96)

Все подопытные животные были разделены на 7 групп, соответствующих следующим сериям экспериментов

1 группу составили 10 животных, которые оставались интактными

2 группа (35 животных) подвергалась острой интоксикации этиленгликолем (ЭГ)

3 группа (14 животных) подвергалась острой интоксикации ЭГ, через 6 часов после

которой проводилась «ранняя» ксенотрансплантация ЭТП

4 группа (21 животных) подвергалась острой интоксикации ЭГ, через 48 часов

после которой проводилась «отсроченная» ксенотрансплантация ЭТП

5 группа (35 крыс) подвергалась иммобилизационному стрессу

6 группа (21 крыса) подвергалась 6-ти часовой иммобилизации, после окончания

которой через 2 часа (начало стадии тревоги стресса) им проводилась «ранняя» ксеногрансплантация ЭТИ

7 группа (14 животных), подвергалась 6-ти часовой иммобилизации, после которой

через 39 часов (окончание стадии тревоги стресса) им проводилась «отсроченная» ксенотрансплантация ЭТП Крысам контрольных групп (2 и 5-ой) в соответствующие сроки вводили 0,5 мл раствора «ИГЛА» в подкожную ткань спины

6. Материал для исследований.

В указанные сроки после окончания стрессорного воздействия крыс декапитировали, а затем извлекали печень и иссекали из нее кусочек размером 1 кв см для морфологических исследований Для каждого срока наблюдений брали материал от 7 животных

7. Морфологические, гистохимические и морфометрические методы исследования.

Ткань печени фиксировали в 10 % нейтральном формалине и заливали в парафин Срезы толщиной 7 мкм окрашивали следующими методами

1) гематоксилин-эозином для морфометрических исследований,

2) пикрофуксином по Ван-Гизону для выявления новообразованного коллагена,

3) по Маллори в модификации Слинченко для верификации коллагена,

4) выявление кислой фосфатазы по методу Гомори для регистрации активных макрофагов (клеток Купфера),

5) ШИК-реакция по Шабадаш> с контролем амилазой для выявления гликогена в гепатоцитах (Г А Меркулов, 1969)

Морфометрию срезов проводили на световом микроскопе МБИ-15 с применением окулярной сетки и окулярной линейки (Г Г Автандилов, 1990) В паренхиме печени определяли объемную долю синусоидных капилляров, дистрофически измененных гепатоцитов, клеток в состоянии некробиоза, очагов некроза, клеток Купфера, коллагеновых волокон (новообразованных и зрелых), а также подсчитывали процентное количество двуядерных гепатоцитов, измеряли размер гепатоцитов По размеру все гепатоциты были разделены на три группы мелкие -— меньше 16 мкм в диаметре, средние — от 16 до 24 мкм, крупные больше 24 мкм Мелкие клетки оценивали как новообразованные (в фазе в] митотического цикла) на основании высокой положительной корреляции (г=0,9) между количеством мелких гепатоцитов и митотическим индексом, расчет которого был проведен в группах животных с интоксикацией ЭГ (Л О Гуцол, 2006) Количество гликогена оценивали в баллах по четырехбальной шкале, затем высчитывали гистохимический индекс по общепринятой формуле Гхи=(0*п,+1*п2+2^3*п4)/1:(п1+п2+пз+п4), где П] п2 п3 п4 - количество клеток

8. Методы статистической обработки результатов

Полученные цифровые данные имели нормальное распределение, обработаны статистически сындартными параметрическими методами с использованием критерия Стьюдента (Э Лтойд, У Ледерман, 1989) Данные

считались статистически значимыми при р<0,05. Все результаты исследований представлены в виде графиков, диаграмм и таблиц в тексте диссертации

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка гепатопротекторного действия ксенотрансплантации ЭТО проведена на двух экспериментальных моделях1 экзогенная интоксикация ЭГ и иммобилизационный стресс, провоцирующий вторичную альтерацию органов и, соответственно, эндогенную интоксикацию. Выбор этих моделей обусловлен данными многих авторов о поражении печени как при интоксикации ЭГ (В.П. Кутлунин, 1984, Л Н Зимина, 1977, Е Ю Бонитенко, 2003 и др ), так и при стресс-реакции (Л С. Васильева, 1995, ФЗ Меерсон, 1981, В В Малышев, 1985 и др) Механизмы нарушений структуры и функции печени при указанных воздействиях различны Именно это обстоятельство дает возможность с помощью сравнительного анализа определить оптимальные условия для получения максимального клинического эффекта эмбриогистотерапии и раскрыть закономерности ее корригирующего влияния при разных типах повреждения

Отравление этиленгликолем характеризуется развитием синдромов цитолиза и печеночно-югеточной недостаточности (Р В Бережной, 1980, LH Pottenger et al, 2001, Е Ю Бонитенко, 2003) Важным звеном патогенеза отравления ЭГ являются декомпенсированный метаболический ацидоз, развивающийся вследствие накопления эндогенных недоокисленных соединений и кислых продуктов метаболизма яда (ЕЮ Бонитенко, 2003, G Cruzan, 2004, ЕМ Caravati, 2005) Вследствие сильного ацидоза развивается глубокое нарушение микроциркуляции, проявляющееся венозной гиперемией и стазом, повреждением эндотелия артериол и капилляров (ИВ Маркова, 1999, ОН Шашкова, 2002. G Cruzan, 2004) Расстройства микроциркуляции усугубляют поражение клеток (ЛФ Кравченко, 1978, РВ Бережной, 1980) В процессе развития интоксикации ЭГ снижается синтез гликогена вследствие угнетения активности гликогенсинтетазы, гексокиназы и стимуляции фосфорилазы, что приводит к повышению уровня глюкозы (В П Кутлунин, 1983, ЕЮ Бонитенко, 2003)

По результатам проведенного исследования, представленным в таблице 1, для интоксикации ЭГ характерны изменения гепатоцитов, описанные в литературе при хронической алкогольной интоксикации (А С Логинов, Л И Аруин, 1985), но, в отличие от последней, они развиваются в течение нескольких суток после отравления Основная форма повреждения гепатоцитов определяется диспротеинозом, который проявляется необратимыми изменениями гиалиново-капельной дистрофией, быстро трансформирующей клетки в состояние некробиоза (матово-стекловидные клетки, клетки с кариопикнозом и кариолизисом) (рис 1) Исходом этих нарушений является формирование очагов коагуляционного некроза (рис 2), а также появление признаков апоптоза (апоптотически измененных клеток и телец Каунсельмана) Неизмененную структуру сохраняли 13-15% гепатоцитов (рис 4) Некротизация и некробиоз гепатоцитов до 5 суток оставались на высоком уровне, кроме того, на 5 сутки интоксикации развивалась ба^чонная дистрофия гепатоцитов, по-видимому, под действием осмотически активных метаболитов ЭГ

(рис.3). Лишь к 15 суткам наблюдения очаги некроза ликвидируются (рис.2), снижается и количество клеток с баллонной дистрофией (рис.3), но некробиоз уменьшается незначительно (рис.1). Половина гепатоцитов восстанавливает нормальную структуру (рис.4).

70 60 50 40 30 20 10 0

Зс 5с 15с ЗШЭГ+ЭТП48Ч -»-ЭГ

Рис. 1 Объемная доля некробиоза при интоксикации ЭГ и трансплантации ЭТП.

инт 1с ЭГ+ЭТПбч

■Срок

3с 5 с 15с ЭГ+ЭТП48Ч -*-ЭГ

Рис. 2. Объемная доля некроза при интоксикации ЭГ и трансплантации ЭТП.

срок

инт 1с Зс 5с 15с ЭГ+ЭТПбч ЕЭЭГ+ЭТП48Ч —»-ЭГ

70 60

инт 1с 3 ЭГ+ЭТПбч

Зс 5с I'.. •."! ЭГ+ЭТП48Ч

Рис. 3. Объемная доля клеток с баллонной Рис.4. Объемная доля неизмененных клеток при дистрофией при интоксикации ЭГ и интоксикации ЭГ и трансплантации ЭТИ.

трансплантации ЭТП.

Ранняя трансплантация ЭТП (через 6 ч. после интоксикации ЭГ) не уменьшала суммарную долю некроза и некробиоза (рис.1, 2, табл.2), но существенно увеличивала количество гепатоцитов с гидропической и баллонной дистрофией (рис.3), усугубляя токсическое поражение печени. Нормальную структуру сохраняли лишь 2% гепатоцитов (рис.4). По-видимому, трансплантация ЭТП, совпадающая по времени с образованием высокотоксичных метаболитов ЭГ, существенно ослабляет способность организма к детоксикации, что приводит к увеличению концентрации ЭГ и его метаболитов в печени и, как следствие, увеличивает ее токсическое поражение.

При отсроченной трансплантации ЭТП к концу 3 суток наблюдения (т.е. через 1 сутки после трансплантации) объемная доля некроза и некробиоза существенно снижалась (рис 1, 2), но нарастала доля гепатоцитов с гидропической и баллонной дисгрофией (рис 3) Тем не менее, количество гепатоцитов с нормальной структурой увеличивалось вдвое (рис 4) Из этого следует, что введение ЭТП не защищает гепатоциты от осмотического повреждения ЭГ, но препятствует их распаду К 5 суткам наблюдения (т.е через 3 суток после трансплантации) остаются единичные очаги некроза, хотя некробиоз не уменьшается К концу наблюдения очаги некроза практически отсутствуют (рис 2), признаки некробиоза имеют лишь 6% гепатоцитов (рис 1), а клетки с нормальной структурой составляют большую часть паренхимы (рис 4)

25 г%-

3 гаи.уе

инт 1с 3с 5с ! ЭГ+ЭТПбч ЭГ+ЭТП48ч

инт 1с Зс 5с ВВ ЭГ+ЭТП6 С13ЭГ+ЭТП48

-ЭГ

Рис 5 Полнокровие синусоидных капилляров при интоксикации ЭГ и трансплантации ЭТП

Рис 6 Количество гликогена при интоксикации ЭГ и трансплантации ЭТП

Интоксикация ЭГ существенно нарушала микроциркуляцию крови в паренхиме печени и, соответственно, трофику гепатоцитов С 1-х по 5-е сутки в печени развивалось венозное полнокровие и застойные явления в синусоидных капиллярах (рис 5), которые уменьшались до физиологического уровня лишь к 15 суткам При этом нарушались процессы гликогенолиза и ресинтеза гликогена в 1-е сутки интоксикации способность гепатоцитов утилизировать гликоген утрачивалась, в последующие сроки - восстанавливалась, но ресинтез гликогена становился адекватным его расходу лишь с 5 суток интоксикации (рис 6) Ранняя трансплантация ЭТП уменьшала полнокровие сосудистого русла в 1 сутки интоксикации (рис.5), но не влияла на обмен гликогена (рис 6) Отсроченная трансплантация ЭТП не оказывала влияния на кровоток в печени (рис 5), но увеличивала расход гликогена, не восполняемый его ресинтезом (рис 6)

Сразу после отравления ЭГ и в последующие 15 суток наблюдения в печени существенно уменьшалось количество активных клеток Купфера с выявляемой в них кислой фосфатазой (табл 1), что еще больше снижало дезинтоксикационную функцию печени Ранняя трансплантация ЭТП не изменяла этот показатель (табл 2) Отсроченная трансплантация ЭТП к 15 суткам наблюдения приводила к нормализации количества активных клеток Купфера (табт 2) Этот эффект ЭТП предварялся выраженной периваскулярной, преимущественно монон>клеарной,

инфильтрацией, что позволяет предполагать, как один из вариантов, восстановление численности активных клеток Купфера за счет их дифференцировки из моноцитов крови

Таблица №1

Соотношение тканевых структур в печени у интактных крыс и в динамике _ острой интоксикации ЭГ._

Группа крыс Интакт-ные Сроки интоксикации

Показатели 1сут Зс 5с 15с

Синусоиды, %Ч без крови 17,5±0,9 11,4±1,0* 7,5±0,9*/* 5,8±3,8* 13,3±1,6*

с кровью 3,8±0,3 18,4±1,5* 17,5±1,3*/* 17,8±4,1* 6,0±1,9*

Некроз, %У центр дольки 0±0 22,5±2,7 14,9±1,3* 14,8±3,1 2,0±0,6*

периферия 0±0 17,9±2,7 17,9±0,7 9,9±1,1* 1,9±0,6*

Некробиоз, %У центр дольки 0±0 11,3±1,0 11,6±0,9 10,0±0,72 7,9±0,6*

периферия. 0±0 12,1±1,3 11,2±0,7 10,0±0,74 7,5±0,5*

Баллон дистрофия, % V 0±0 0±0 0±0 12,2±0,6*/* 1,9±0,8*/*

Гидропич дистрофия % V 3,8±2,4 8,7±0,7* 17,3±0,8*/' 23,3±1,8*Л 22,3±1,7*

Жировая дистрофия % V 40,8±4,7 15,0±0,7* 12,4±1,0* 13,6±1,7* 8,4±1,1*/*

Нормальные кл, % V 55,4±4,3 12,6±1,1* 14,7±0,7* 6,2±1,0*/* 48,1±1,4*

Гликоген (ГХИ, уел ед) 1,4±0,2 2,2±0,1* 0,6±0,2*/* 1,9±0,2* 2,3±0,2*

Клетки<16мкм, % V 14,4±1,0 4,6±0,4* 10,7±1,1*/* 10,5±1,2* 12,4±0,55

Клетки 16-24мкм,% V 66,8±2,4 23,7±0,8* 26,6±1,4* 30,3±1,1* 53,4±1*/'

Клетки>24мкм,% V 18,8±2,9 8,0±1,0* 7,0±0,7* 14,5±1,1" 14,8±1,3

Двуядер- ные кл% центр дольки 9,5±0,4 3,5±0,4* 3,5±0,5* 4,9±0,6* 8,7±0,7*

периферия 11,0±1,0 5,2±0,8* 4,7±0,3* 5,4±1,4* 9,7±0,7*

Кл Купфера с КФ, %У 18±2,4 7,2±2,0* 10,4±1,6* 4,6±1,3 */' 3,6±1,0*

Весь коллаген, % V 19,9±1,2 17,8±0,9 23,4±1,1* 15,0±1,9* 15,6±1,7

Незрелый коллаген, % V 4,2±0,3 3,4±0,5 3,8±0,4 4,1 ±0,7 5,5±0,5

Примечания *-отличие от интактных, р<0,05 , '-отличие между сроками, р<0,05

Таблица №2

Соотношение тканевых структур в печени у интактных крыс н в условиях ранней и отсроченной ксенотрансплантации ЭТП при интоксикации ЭГ.

Группа крыс Интакт-ные Сроки интоксикации при ксенотрансплантации ЭТП

ранняя отсроченная

Показатели 1с Зс. 5с 15с

Синусоиды, %У без крови 17,5±0,9 7,4±0,5 */' 9,9±1,3* 5,9±2,3* 10,4±0,8*

с кровью 3,8±0,3 12,3±1,0 *Г 12,7±2,2* 19,5±3,5* 11,2±1*/*

Некроз, % V центр дольки 0±0 22,9±0,8 7,5±0,8*/* 3,7±1,2*/* 1,5±0,2

периферия 0±0 21,9±2,0 4,4±1,0*/* 1,9±0,6* 1,1 ±0,2

Некробиоз, % V центр дольки 0±0 11,5±0,3 8,3±0,9 7,8±1,4 3,5±0,2*

периферия 0±0 9,3±0,7 8,7±0,5* 9,7±1,3 2,7±0,3*

Баллонная дистрофия, %У 0±0 7,1±0,2*/* 17,5±1,0*/* 13,3±1,3* 5,6±0,2 */'

Гидропич дистрофия %Ч 3,8±2,4 13,3±1,9* 8,0±2,6* 8,8±2,1* 9,0±1,0*

Жировая дистрофия, %У 40,8±4,7 11,8±1,8* 22,3±3,3*/* 15,6±2,7* 14,1±1,8*/*

Нормальные клетки, %У 55,4±4,3 2,2±0,4*/' 23,2±4,3* 38,9±3,7*/* 62,6±2,0*

Гликоген (ГХИ, уел ед) 1,4±0,2 1,8±0,2 0,8±0,4 0,57±0,18* 0,62±0,22*

Кпетки<16мкм, % V 14,4±1,0 0,8±0,5*/* 10,2±1,6 16,3±2,05* 7,5±1,1*/*

Клетки 16-24мкм,% V 66,8±2,4 29,0±1*/* 50,9±2,6*Л 57,2±2,4*Л 77±1,3*/*

Клетки>24мкм,% V 18,8±2,9 14,<5±1,3* 9,95±1,4* 3,4±1,4*/* 8,7±1,3*/*

Двуядер-ные кл, % V центр дольки 9,5±0,4 3,3±0,2* 4,8±0,8* 4,7±0,5* 6,6±0,6*/*

периферия П,0±1,0 5,1±0,3* 7,2±09*/* 4,8±0,6* 8,9±0,4

Кл Купфера с КФ, % V 18±2,4 9,2±2,6 10,4±2,0 4,6±1,3 3,6±1,0

Весь коллаген, % V 19,9±1,2 11,5±2,0*/* 17,5±2,0* 20,4±0,5* 18,6±0,5

Незрелый коллаген, % V 4,2±0,3 2,6±0,4* 1,5±0,6*/' 2,8±0,3* 3,1±0,2*/'

Примечание *-отличие от интактных животных, р<0,05,

'-отличие от показателя при интоксикации, р<0,05

Восстановительные процессы, которые оценивались по нарастанию объемной доли двуядерных (рис 8) и мелких гепатоцитов (рис.7), а также клеток с нормальной структурой (рис.4), при интоксикации ЭГ активировались лишь после 5 суток наблюдения При ранней трансплантации ЭТП к концу 1 суток интоксикации гепатоциты с нормальной структурой составляли всего 2,3%, двуядерные - 8%, мелкие - 1%, следовательно, камбиальный резерв практически отсутствовал, резервные возможности печени для восстановления паренхимы были настолько малы, что процесс восстановления, по-видимому, был невозможен. Все животные этой серии эксперимента погибли в течение вторых суток после интоксикации ЭГ При отсроченной трансплантации ЭТП уже на 3 сутки наблюдения увеличивалась доля двуядерных гепатоцитов (рис 8), а на 5 сутки возрастало количество мелких гепатоцитов (рис 7), что дает основание говорить о более ранней активации восстановительных процессов Об этом же свидетельствует прогрессивное увеличение, начиная с 3 суток наблюдения, числа гепатоцитов с нормальной структурой (рис.4) Это позволяет говорить об активации не только пролиферации, но и созревания функционально полноценных гепатоцитов

Рис 7 Количество мелких клеток при Рис 8 Количество двуядерных клеток при

интоксикации ЭГ и трансплантации ЭТП интоксикации ЭГ и трансплантации ЭТП

Токсическое действие ЭГ отражается на структуре не только паренхимы, но и междольковой стромы, в которой волнообразно изменяется количество коллагеновых волокон, в 1 сутки снижается, на 3 сутки увеличивается, на 5 сутки вновь снижается и до 15 суток держится на низком уровне (рис 9), хотя колчество новообразованного коллагена на протяжении всего эксперимента остается в диапазоне нормы (рис 10) Ранняя трансплантация ЭТП приводит к еще большему уменьшению объемной доли коллагеновых структур, вероятно, вследствие их разрушения Отсроченная трансплантации ЭТП способствует сохранению коллагеновых волокон и уменьшает активность коллагеногенеза, что, по-видимому, связано с меньшей потребностью в его активации

Рис 9 Общее количество коллагена при Рис 10 Количество новообразованного коллагена интоксикации ЭГ и трансплантации ЭТП при интоксикации ЭГ и трансплантации ЭТП

Подводя итог сравнительного анализа полученных данных, следует подчеркнуть, что в условиях острой интоксикации этиленгликолем ранняя трансплантация ЭТП оказывает негативное действие на способность гепатоцитов к выживанию и восстановлению

Обсуждая представленные выше факты, необходимо принять во внимание, что трансплантированная ЭТП выделяет, по данным литературы (А А Рунович, 2005, А П Милованов и соавт, 2006 и др), ряд ростовых факторов (роста нервов, макрофагальных и эритроидных колоний, инсулиноподобный и эндотелиотропный), а также антипролиферативные цитокины По данным О В Колбасеевой (2006), ранняя трансплантация ЭТП в условиях отравления ЭГ снижает пролиферативную активность клеток гемопоэза и ускоряет старение нейтрофилов, снижая способность нейтрофильного звена к детоксикации Кроме того, можно предположить, что действие ростовых факторов, выделяемых ЭТП, перестраивает гепатоциты на программу пролиферации, лишая клетки способности реализовать внутриклеточную программу защиты от действия токсинов Следствием этого является высокая смертность животных в 1-2 сутки интоксикации ЭГ. Анализ данных литературы и собственных результатов свидетельствует о нецелесообразности проведения эмбриогистотерапии в ранние сроки отравления ЭГ

Отсроченная ксенотрансплантация ЭТП при интоксикации ЭГ оказывает существенное корригирующее гепатотропное действие Это выражается в уменьшении некротизации паренхимы печени и стимуляции восстановительных процессов Отсроченная трансплантация ЭТП значительно уменьшала разрушение гепатоцитов с баллонной дистрофией, а также выраженность диспротеиноза гепатоцитов, о чем свидетельствует меньшее количество матово-стекловидных клеток, клеток с тельцами Маллори и отсутствие гиалиновых отложений на стенках синусоидных капилляров При отсроченной трансплантации ЭТП отчетливо выражена стимуляция пролиферации гепатоцитов, во все сроки наблюдения увеличивалось количество мелких клеток Кроме того, значительно л\чше сохранялась междольковая строма Перечисленные гепатопротекторные эффекты

отсроченной трансплантации ЭТИ связаны, вероятно, с действием ростовых факторов, секретируемых клетками трансплантата, а также с его гемопоэтической и цитокиновой активностью. В литературе приводятся данные (О В Колбасеева, 2006) о том, что отсроченная эмбриогистотерапия в условиях интоксикации ЭГ активирует и неспецифические, и специфические защитные механизмы. Это отражается в развитии нейтрофильного лейкоцитоза, эозинофилии, моноцитоза, активации естественных киллеров, а также в стимуляции костномозгового и периферического лимфопоэза, что обеспечивает более эффективную детоксикацию ЭГ и его метаболитов, способствует сохранению функциональной полноценности гепатоцитов и уменьшению общего повреждения паренхимы печени Наряду с этим, отмеченная автором стимуляция лимфопоэза позволяет предположить активацию восстановительных процессов в печени со стороны иммунной системы, с помощью цитокинов Учитывая, что в паренхиме печени присутствуют р^-клетки (МК-лимфоциты) и формируются, в условиях отсроченной трансплантации ЭТП, мононуклеарные периваскулярные инфильтраты, цитокиновая стимуляция пролиферации представляется вполне вероятной Кроме того, отличительной особенностью отсроченной эмбриогистотерапии, по нашим данным, была эозинофильная инфильтрация соединительной ткани печени, что свидетельствует об активации звена эозинофильной клеточной защиты Некоторые авторы рассматривают эозинофилы как регуляторы, понижающие интенсивность воспаления за счет содержащихся в их гранулах антимедиаторов фосфолипаз В и Д, разрушающих фактор активации тромбоцитов, гистаминазы, инактивирующей гистамин, ариилсульфатазы В, пероксидазы и перекиси водорода, разрушающей лейкотриены (А Ш Зайчик, Л Г1 Чурилов, 2002, А Б Кей, 1978) Таким образом, отсроченная трансплантация ЭТП оказывает гепатопротекторное действие при этиленгликолевой интоксикации

Иммобнлизационный стресс, по данным литературы, индуцирует альтерацию паренхимы печени, механизмами которой являются гиперактивация процессов перекисного окисления мембранных липидов (ПОЛ) и действие на клетки избыточной концентрации катехоламинов и глюкокортикоидов Известно, что продукты метаболизма катехоламинов активируют мобилизацию депонированных жиров и ПОЛ (Ф 3 Меерсон, 1981, НА Удинцов с соавт, 1984, В.А Барабой, 1989) Следствием гиперактивации ПОЛ является гибель клеток или нарушение их функции В результате в органах развиваются расстройства микроциркуляторного русла, возникают множественные очаги ишемии, кровоизлияний, искажаются пролиферативные процессы (разрывы и сшивки нуклеиновых кислот и т п) (А А Кричевская с соавт, 1980, В Ю Куликов, В В Ляхович, 1980, АД Браун, ТП Моженок, 1987 и др) Важно отметить, что динамика изменения активности процессов ПОЛ при иммобилизационном стрессе соответствует по времени фазам развития стресс-реакции, причем, наиболее выраженная активация ПОЛ наблюдается в момент перехода стадии тревоги стресса в стадию резистентности, когда уровень продуктов ПОЛ превышает контрольный в 3,6-3,7 раза (Т И Белова с соавт , 1992, Ф 3 Меерсон с соавт , 1989, 1990, 1993 и др ) К повреждающему действию продуктов ПОЛ присоединяются

катаболические эффекты избыточных доз глюкокортикоидных гормонов (ГК), которые активируют глюконеогенез, параллельно стимулируя катаболизм белков (Ф.З Меерсон, 1981, ЛЕ. Панин, 1983; А Агшопо ег а1, 1986; В.В Малышев, 1988) ГК и КА усиливают метаболическое и мембранотропное действие друг друга, создавая, в избыточной концентрации, основу для формирования стрессорных повреждений

По нашим данным, представленным в таблице 3, закономерностью поражения печени при иммобилизационном стрессе является развитие в гепатоцитах к концу стадии тревоги гидропической (23%), а затем баллонной дистрофии (40%, рис.11) с последующей некротизацией клеток (23%, рис 12) Нормальную структуру сохраняли лишь около 9% гепатоцитов (рис 13) В начальный период стадии резистентности дистрофические нарушения остаются на прежнем уровне, но объемная доля очагов некроза уменьшается до 20% Через 7 суток наблюдения существенно снижаются и дистрофические (рис 11), и некротические (рис.12) явления

Ранняя ксенотрансплантация ЭТП (через 2 часа после иммобилизации) к концу стадии тревоги стресс-реакции почти вдвое уменьшает количество клеток с баллонной дистрофией (рис 11, табл4), но в 1,5 раза увеличивает некротизацию гепатоцитов (рис 12), вероятно, ускорив разрушение клеток с баллонной дистрофией Несмотря на это, в стадию резистентности повреждение печени значительно уменьшается, особенно число клеток с баллонной дистрофией, но к 7 суткам наблюдения доля очагов некроза остается втрое больше, чем у животных без трансплантации ЭТП Это может быть связано продолжающимся распадом клеток с баллонной дистрофией

Отсроченная трансплантация ЭТП значительно уменьшает повреждение паренхимы печени В начальный период стадии резистентности в 2,5-3 раза снижалась объемная доля очагов некроза (рис 12), а также баллонной дистрофии (рис 13) К 7 суткам эксперимента наблюдались остаточные явления

Рис 11 Объемная дотя гепаюцитов с бат гонной Рис 12 Объемная до т некроза при стрессе дистрофией при стрессе и трансплантации ЭТП и трансплантации ЭТП

тя +ЭТП2ч Г~ч +ЭТП39ч -♦-стресс в8 +ЭТП2ч +ЭТП39ч -»-стресс

Рис 13. Объемная доля неизмененных Рис 14 Полнокровие синусоидных капилляров

гепатоцитов при стрессе и трансплантации ЭТО при стрессе и трансплантации ЭТП

Развитие дистрофических и некротических изменений при стрессе, вероятно, обусловлено лабилизацией мембран гепатоцитов и снижением их осмотической устойчивости под действием повышенной концентрации продуктов ПОЛ (В. А Шкурупий, 1986, 1988). Другой причиной может быть нарушение микроциркуляции в системе внутридольковых капилляров и развитие стаза, которые зарегистрированы в наших экспериментах

К концу стадии тревоги синусойдные капилляры расширялись, большинство из них (65%) были полнокровными (рис 14), в стадию резистентности застойные явления нарастали и распространялись на венозное русло притока (междольковые вены) и оггока крови (центральные вены) При ранней трансплантации ЭТП наблюдались аналогичные изменения, но на 4 сутки они были менее выражены Отсроченная трансплантация ЭТП устраняла застойные явления в стадию резистентности иммобилизационного стресса, что, вероятно, способствовало восстановлению трофики паренхимы печени и, соответственно, снижало дистрофию клеток

Изменения в сосудистом русле оказывали влияние на обмен гликогена Застойные явления в печени стрессированных животных, наряду с другими повреждающими факторами (накопление продуктов ПОЛ, катаболическое действие ГК), снижают способность гепатоцитов к утилизации гликогена, количество которого к концу стадии тревоги и в начальный период стадии резистентности оставалось высоким (рис 15) Эти факты не противоречат данным других авторов, которые указывают на развитие ферментемии при стрессе, снижение активности ферментов гликогенолиза, гликолиза и гликогенсинтетазы (ЛЕ Панин, 1978, И А Перез Apee, М Зулуета Пердомо, 1985, В С Стрижков, О А Паденко, 1985 и др)

При ранней трансплантации ЭТП количество гликогена тоже оставалось на уровне интактных животных и лишь к 7 суткам снижалось, что, по-видимому, свидетельствует о восстановлении способности гепатоцитов утилизировать гликоген После отсроченной трансплантации ЭТП количество гликогена в паренхиме печени резко уменьшалось Вероятно, это связано с повышенным расходом гликогена на энергетические н^жды гепатоцитов, сохраняющих способность его утилизировать Эти данные сочетаются с менее выраженными

дистрофическими и некротическими изменениями гепатоцитов, с увеличением количества мелких (новообразованных) клеток и клеток с нормальной структурой.

О частичной инактивации ферментных систем в клетках печени в стадию тревоги иммобилизационного стресса свидетельствует и выявленное нами 15-кратное уменьшение количества клеток Купфера с активной кислой фосфатазой (рис. 16). В стадию резистентности их число возрастает, но даже через 7 суток наблюдения остается значительно ниже, чем у интактных животных. Ранняя трансплантация ЭТИ существенно увеличивает количество активных клеток Купфера у стрессированных животных, особенно, на 7 сутки наблюдения. Аналогичное действие, но более выраженное, оказывает отсроченная трансплантация ЭТП. Этот эффект трансплантации ЭТП представляется важным для защитных и восстановительных реакций в печени, в регуляции которых, по современным представлениям, участвуют непаренхиматозные клетки (Г. Зейц, 2001; Л.Е. Панин с соавт., 1994; Д.Н. Маянский с соавт., 1992), в том числе и клетки Купфера.

ГХИ, усп.ед.

Е2П +ЭТП2ч Г~П +ЭТП39ч -«—стресс

0

Инт 39ч 4с

ге^ДД +ЭТП2ч +ЭТП39ч

-стресс

инт. 39ч

Рис. 15. Количество гликогена при стрессе и Рис.16. Объемная доля клеток Купфера с КФ

трансплантации ЭТП. при стрессе и трансплантации ЭТП.

Восстановление паренхимы оценивалось по количеству двуядерных и мелких одноядерных гепатоцитов, образующихся, соответственно, незавершенным и завершенным митозом (В.Я. Бродский, И.В. Урываева, 1981; А.И. Струков, 1990; В.Б. Розен, 1991). К концу стадии тревоги иммобилизационного стресса часть двуядерных клеток разрушалась, и их число уменьшалось (рис.17). В стадию резистентности пролиферация гепатоцитов активировалась, и к концу наблюдения количество двуядерных клеток восстанавливалось, а мелких клеток становилось вдвое больше (рис.18), чем у интактных животных. Параллельно нарастало до 33% и количество гепатоцитов с нормальной-структурой (рис.13).

При ранней трансплантации ЭТП количество двуядерных гепатоцитов в стадию тревоги уменьшалось более значительно, в начальный период стадии резистентности увеличивалось (рис.17), но к 7 суткам вновь уменьшалось. Количество мелких гепатоцитов существенно увеличилось (в 2,6 раза) уже к концу стадии тревоги и оставалось на этом уровне до конца наблюдений. Из этих данных следует, что ЭТП сразу после трансплантации стимулирует восстановление

численности гепатоцитов, преимущественно, завершенным митозом. Аналогичное, но более выраженное, действие оказывает и отсроченная трансплантация ЭТП, после которой численность двуядерных клеток не восстанавливается (рис.17), но мелких гепатоцитов к 7 суткам становится втрое больше (50%), чем у интактных животных (рис.18)

НЦ::;: ! и

Рис. 17. Количество двуядерных гепатоцитов при стрессе и трансплантации ЭТП

18. Количество мелких гепатоцитов при стрессе и трансплантации ЭТП

Альтерирующее действие иммобилизационного стресса отражается и на структуре междольковой стромы, в которой в стадию тревоги происходит разрушение коллагеновых волокон (рис. 19) на фоне торможения коллагеногенеза (рис.20). В стадию резистентности коллагеногенез активируется, но созревание коллагеновых волокон идет медленно, почти все волокна стромы на 4 сутки незрелые. Возможно, это связано с застойными явлениями в сосудистом русле печени и недостаточным количеством кислорода, который необходим для внеклеточного фибриллогенеза (В.В. Серов, А.Б. Шехтер, 1981). Лишь к 7 суткам соотношение зрелого и незрелого коллагена становится как у интактных животных.

25 20 15 10 5

о

Инт 39ч 4с 7с

ШШ +ЭТП2ч Г~~! +ЭТП39Ч —в—стресс

Инт 39ч 4с 7с

+ЭТП2 ЕЗ +ЭТП39 -»-стресс

Рис. 19. Объемная доля коллагеновых волокон Рис.20. Объемная доля новообразованных при стрессе и трансплантации ЭТП коллагеновых волокон ппи стрессе

и трансплантации ЭТП.

Ранняя трансплантация ЭТП стимулирует коллагеногенез (рис 20) в стадию тревоги стресса, что обеспечивает сохранение коллагеновых волокон в междольковой соединительной ткани в том же объеме, как у интактных животных, во все сроки наблюдения (рис 19) Такой же эффект оказывает и отсроченная трансплантация ЭТП Полученные результаты позволяют считать, что стимулирующее действие ЭТП не ограничивается пролиферативной активностью гепатоцитов, а распространяется и на синтетическую активность фибробластов.

Таблица №3

Соотношение тканевых структур в печени у интактных крыс и в динамике иммобилизационного стресса.

Группа крыс Интакт-ные Сроки после иммобилизации

Показатели 39 ч 4с. 7с

Синусоидь % V без крови 17,5*0,9 8±0,7 * 3,0±0,4*/* 5,5±0,5*7*

с кровью 3,8±0,3 17,6±1,2 * 24,8±1 */' 18,9±0,6 */'

Некроз, % V центр дольки 0±0 12,05±0,8 * 11,7±1,2 * 2,7±0,2 */'

периферия 0±0 10,95±0,6 * 8,4±1,4 * 1,8±0,4 */'

Баллонная дистрофия, % V 0±0 40,3±3,8 * 32,8±2,6 * 14,1±3,6 */'

Гидропич дистрофия, 3,8±2,4 17,9±3,5 * 22,0±2,6 * 18,1±2,2 *

Жировая дистрофия, °/оУ 40,8±4,7 9,9±2,7 * 11,8±1,0* 30,3±6,3 *

Нормальные клетки, %У 55,4±4,3 9,1 ±0,7* 13,4±1,4*/* 32,9±2,0 */'

Гликоген (ГХИ, уел ед ) 1,4±0,2 2,09±0,06 * 2,1±0,2* 1,0±0,1 '

Клетки < 16 мкм, % V 14,4±1,0 9,6±2,0 12,0±1,9 26,7±1,3 */'

Клетки 16-24мкм, % V 66,8±2,4 48,3±1,4 * 55±2,3*/* 51,8±2,15 *

Клетки > 24 мкм,% V 18,8±2,9 19,1±1,4 13,2±1,4 * 17,0±2,2

Двуядер- центр дольки 9,5±0,4 5,96±0,7 * 6,0±0,9 * 9,1 ±0,7 */'

ные кл %У периферия 11,0±1,0 4,2±0,6 * 7,4±0,3 */' 10,0±0,5 *

Кл Купфера с КФ,% V 18±2,4 1,2±0,6* 4,4±1,9* 4,8±1,5*

Весь коллаген, % V 19,9±1,2 4,4±0,4 9,1 ±0,7 18,5±1,7

Незрелый коллаген, %У 4,2±0,3 2,8±0,2 8,0±0,65 5,2±0,6

Примечания * - отличие от интактных животных, р<0,05

* - отличия от предыдущего срока наблюдения, р<0,05

Таблица №4

Соотношение тканевых структур в печени у интактных крыс и в условиях стресса при ранней и отсроченной ксенотрансплантации ЭТП.

Группа крыс Интакт-ные Сроки после иммобилизации при ксенотрансплантации ЭТП

ранняя отсроченная

Показатели 39ч 4с 7с 4с 7с.

Синусоиды, %У без крови 17,5±0,9 8,9±5,4 10,0±0,7 *Г 7,5±0,5 *Г 19,5±0,6 */* 18,1±0,9 •

с кровью 3,8±0,3 16,4±6,9 * 16,0±1,6 */' 20,0±0,6 * 7,4±0,7 • 5,1±0,4 •

Некроз, % V центр дольки 0±0 15,2±1,0 4,8±0,8 3,7±0,5 # 3,1±0,6 * 0,2±0,1 •

периферия 0±0 18,9±1,2 11,9±2,1 * 11,1±0,5 *г 4,2±0,3 1,3±0,1 *г

Баллонная дистроф, %У 0±0 22,0±1,1 12,0±1,6 9,1 ±2,1 * 14,5+2,5 * 7,1*2,3 *

Гидропич дистроф., %У 3,8±2,4 21,1±2,2 * 25,8±3,8 * 20,4±1,2 * 24,7±2,8 * 14,8±1,6

Жировая дистрофия, %У 40,8±4,7 11,1±1,0 * 29,8±3,4 е 39,5±2,0 32,9±4,7 39,6±2,8

Нормальные клетки, %У 55,4±4,3 11,7±1,4 * 15,7±3,9 * 16,2±3,7 20,5±1,3 * 37,0±1,6

Гликоген (ГХИ, уел ед.) 1,4±0,2 1,3±0,1 • 1,5±0,3 0,4±0,2 0,2±00,2 0,5±0,12 */•

Клетки<1 бмкм, %У 14,4±1,0 24,9±1,4 */' 23,2±2,3 19,3±2,4 • 34,6±2,8 50,2±1,9 *Г

Клетки 16-24мкм, %У 66,8±2,4 34,3±1,0 49,15±1,3 * 56,2±4,4 49,4±2,3 * 48,3±1,9 *

Клетки>24мкм, %У 18,8±2,9 6,7±1,0 11,0±2,7 9,7±2,4 8,6±0,8 0±0

Двуядер-ные клетки, % центр дольки 9,5±0,4 1,6±0,7 */• 6,2±0,7 * 3,0±0,5 • 5,6±1,18 * 6,9±1,6

периферия 11,0±1,0 4,6±0,6 * 7,1±1,1 * 3,8±1 • 5,8±1,16 * 6,8±1,2 •

Кл КупферасКФ, %У 18±2,4 10,3±1,75 */• 10,0±1,8 * 20,5±3,0 16,6±1,4 • 17,5±2,1

Весь коллаген, %У 19,9±1,2 19,4±1,4 • 21,7±0,35 • 17,3±1,2 16,0±0,7 */• 20,4±1,3

Незрелый коллаген, Ув V 4,2±0,3 10,3±0,4 15,1±1,2 15,3±1,8 11,5±0,6 12,5±1,15

Примечание *-отличиеот интактных животных,

'-отличие от показателя при стрессе, р<0,05

Представленные данные свидетельствуют о том, что при иммобилизационном стрессе к концу стадии тревоги альтерация печени достигает максимума Это проявляется расширением синусоидных капилляров и застойными явлениями в них, образованием очагов некроза, вследствие распада части дистрофически измененных гепатоцитов, значительным разрушением соединительнотканной стромы К началу стадии резистентности деструктивные изменения печени уменьшаются, активизируются восстановительные процессы, выражающиеся в пролиферации сохранившихся гепатоцитов и активном коллагеногенезе. Через 7 суток после окончания иммобилизации соединительнотканная строма нормализуется, но сохраняются полнокровие, мелкие очаги некроза, клетки с баллонной дистрофией, запасы гликогена не восстанавливаются

Корригирующее действие ранней трансплантации ЭТП при иммобилизационном стрессе неоднозначно. Так, в стадию тревоги в условиях введения ЭТП альтерирующее действие стресса усилилось, аналогичный эффект ранней трансплантации ЭТП наблюдался и при отравлении этиленгликолем Вероятно, трансплантация ЭТП в период действия альтерирующих факторов, независимо от их природы, ослабляет естественные защитные механизмы клеток и тем самым способствует углублению альтерации Следует отметить, что усиливалась лишь альтерация паренхимы, тогда как соединительнотканная строма разрешалась в 5-6 раз меньше В начальный период стадии резистентности при ранней трансплантации ЭТП коллагеногенез в строме печени был в 1,5 раза активнее, репаративный потенциал гепатоцитов также существенно усиливался, возрастала активность их пролиферации и дифференцировки, но в более поздние сроки стадии резистентности (7 суток) корригирующие эффекты ЭТП отсутствовали. По-видимому, в течение 4 суток трансплантат сохранял высокую активность, а затем подвергался инволюции (резорбции), поэтому через 7 суток его эффекты не проявлялись Более того, у стрессированных животных, не получавших ЭТП, к концу наблюдения было значительно больше зрелого коллагена в строме и гепатоцитов с нормальной структурой, что указывает на более сбалансированную регуляцию репаративных процессов В условиях ранней трансплантации ЭТП у стрессированных животных активация репаративных процессов была вызвана, вероятно, прямым действием на гепатоциты биологически активных веществ, выделяемых трансплантатом, что, препятствовало мобилизации естественных факторов, активирующих восстановление печени

Корригирующее влияние отсроченной трансплантации ЭТП при иммобилизационном стрессе на восстановительные процессы, развивающиеся в стадию резистентности, более наглядно В конце стадии тревоги альтерирующие эффекты стресса уже реализовались, и происходит естественная активация репаративных процессов Трансплантация ЭТП в этот период, по-видимому, действием ростовых факторов усиливает восстановительный потенциал печени По результатам, полученным в предыдущей серии экспериментов, можно считать, что трансплантат ЭТП сохраняет жизнеспособность не менее 4-х суток, что согласуется с данными литературы (Л С Васильева и др, 2002), поэтому при отсроченной транстантации ЭТП ее корригирующее действие сохраняется до 7 суток эксперимента На протяжении стадии резистентности стресс-реакции (4 и 7 сутки)

под влиянием трансплантата значительно активнее проходит восстановление и стромы, и паренхимы печени. Это иллюстрируется высокой скоростью нарастания количества новообразованного коллагена в междольковой строме и количества мелких гепатоцитов, достигающего к 7 суткам 50% Необходимо подчеркнуть, что в условиях отсроченной трансплантации ЭТП у стрессирсванных животных быстро восстанавливается внутридодьковый кровоток, что, вероятно, тоже способствует ускорению восстановительных процессов

На основании анализа полученных данных можно сделать следующее заключение При патологических состояниях, сопровождающихся альтерацией паренхимы и стромы печени, ранняя трансплантация ЭТП, совпадающая по времени с действием повреждающих факторов, усиливает дистрофические и некротические процессы, поэтому проведение ранней эмбриогистотерапии представляется нецелесообразным Отсроченная трансплантация ЭТП, проведенная в период естественной активации репаративных процессов, оказывает эффективное корригирующее воздействие, ускоряя восстановление паренхимы и стромы печени Результаты исследования позволили выявить пять основных корригирующих гепатопротекторных эффектов отсроченной трансплантации ЭТП при альтерации печени в условиях иммобилизационного стресса и интоксикации ЭГ мембранопротекторный, вазопротекториый, стимуляция пролиферации гепатоцитов, сохранение функциональной активности клеток Купфера и активация коллагеногенеза

Мембранопротекторный эффект проявляется в торможении некротизации клеток с баллонной дистрофией, а также в сохранении метаболической активности гепатоцитов (способность утилизировать глиюнен), клеток Купфера (сохранение активности кислой фосфатазы) и фибробластов (сохранение активности синтеза коллагена)

Вазопротекториый эффект выражается в сохранении целостности микрососудистого русла и уменьшении застойных явлений, что возможно, тоже связано с мембранотропным действием ЭТП

Стимуляция пролиферации гепатоцитов проявлялась в быстром нарастании числа мелких (новообразованных) клеток и клеток с нормальной структурой

Сохранение функциональной активности клеток Купфера обеспечивается, вероятно, мембранопротекторным действием ЭТП и, возможно, стимуляцией дифференцировки клеток Купфера из моноцитов крови

Активация коллагеногенеза, по-видимому, связана также с мембранопротекторным действием ЭТП обеспечивающим сохранение достаточно высокой активности ферментов синтеза коллагена

Перечисленные эффекты проявлялись и при иммобилизационном стрессе, и при интоксикации ЭГ, однако при стрессе они были выражены в большей степени Вероятно, это можно объяснить более кратковременным периодом альтерирующего действия стресса, продолжительность которого ограничена стадией тревоги (39 часов после иммобилизации), тогда как при интоксикации ЭГ его повреждающее действие усиливается и пролонгируется до 5 суток за счет образования токсических метаболитов Кроме того, разная степень проявлений

корригирующих эффектов ЭТП связана, вероятно, и с различным типом повреждения клеток

При стрессе пусковым механизмом повреждения клеток является увеличение проницаемости мембран для воды, а преобладающим типом повреждения -гидропическая и баллонная дистрофия с исходом, преимущественно, в колликвационный некроз.

При интоксикации ЭГ пусковым механизмом повреждения был диспротеиноз, а основным типом повреждения - гиалиново-капельная дистрофия и матово-стекловидные клетки с последующей их некротизацией

Несмотря на различные по своей сути механизмы повреждения -осмотический и метаболический, корригирующие эффекты отсроченной трансплантации ЭТП проявлялись и в том, и в другом случае достаточно ярко Из этого можно сделать вывод о том, что эффективность корригирующего действия ЭТП определяется преимущественно сроками проведения трансплантации ЭТП и, в меньшей мере, типом повреждения

Оптимальными сроками проведения трансплантации ЭТП является временной период патологического процесса, в который прекращается или ослабляется действие альтерирующих факторов, и начинаются восстановительные процессы

ВЫВОДЫ:

1 При интоксикации этиленгликолем структурными критериями альтерации печени в первые сутки являются развитие гиалиново-капельной дистрофии и некробиоза (матово-стекловидные клетки, пикноз и лизис ядра) (23,4±1,1%У), формирование очагов некроза (40,4±2,7%У), полнокровие сосудистого русла (18,4±1,5%У). К 15 суткам появляются апоптозные тельца, но очаги некроза ликвидируются, явления некробиоза уменьшаются в 1,5 раза, количество двуядерных и мелких гепатоцитов возрастает в 2,1 и 2,7 раза, соответственно, в результате активной пролиферации, а нормальная структура определяется у 48,1±1,4% гепатоцитов

2. При стрессе структурными критериями альтерации печени в конце стадии тревоги являются развитие гвдропической и баллонной дистрофии (40,3±3,8%У), образование очагов некроза (23±0,7%У), разрушение 77% соединительнотканной стромы, застойные явления в сосудистом русле печени (24,8±1,0%У). В стадию резистентности (7 сутки) очаги некроза устраняются, явления дистрофии снижаются в 3 раза, суммарное количество двуядерных и мелких гепатоцитов возрастает в 1,9 раза и 2,8 раза соответственно, нормальная структура определяется у 32,9±2,0% гепатоцитов, содержание коллагеновых волокон в строме нормализуется

3 Под действием ранней трансплантации эмбриональной ткани печени в первые сутки интоксикации этиленгликолем появляются гепатоциты с баллонной дистрофией (7,1±0,2 %У), уменьшается в 5,8 раза количество мелких гепатоцитов и в 5.7 раза - клеток с неизмененной структурой, что свидетельствует о сокращении камбиального резерва гепатоцитов и завершается гибелью всех животных в течение 2 суток после интоксикации

4 Ранняя трансплантация эмбриональной ткани печени при иммобилизационном стрессе приводит к ускорению некротизации гепатоцитов с баллонной дистрофией и увеличению объемной доли очагов некроза в 1,5 раза на фоне стимуляции пролиферации жизнеспособных гепатоцитов и коллагеногенеза в строме В результате одновременного развития альтеративных и пролиферативных процессов восстановление структуры печени осуществляется медленно, и к 7 суткам наблюдения в паренхиме остаются очаги некроза, а нормальная структура определяется лишь у 16,2±3,7 % гепатоцитов

5. Отсроченная трансплантация эмбриональной ткани печени стимулирует восстановительные процессы в печени, что выражается в снижении объемной доли некроза при интоксикации этиленгликолем к 3 суткам наблюдения в 2,4 раза, при стрессе к 4 суткам наблюдения в 3 раза, в полной ликвидации застойных явлений при стрессе и уменьшении в 1,4 раза полнокровия при интоксикации этиленгликолем, в стимуляции в течение всего восстановительного периода коллагеногенеза и пролиферации гепатоцитов, особенно при стрессе Результатом этого является увеличение числа гепатоцитов с нормальной структурой к 15 суткам интоксикации этиленгликолем до 62,6=2% и к 7 суткам стресса до 37±1,6%

Список работ опубликованных по теме диссертации.

1. Хаджав, У. Структура печени при стрессе и введении арабиногалактана / Л.С.Васильева, У. Хаджав, И.С. Выборова // Сибирский медицинский журнал. -2004. - №7. - С.22.

2. Васильева, Л.С. Арабиногалактан уменьшает стресс-индуцированную альтерацию печени / Л.С.Васильева, У. Хаджав, И.С. Выборова, Е.В. Рахвалова II Ж. Современные наукоёмкие технологии. Медицинские науки. — 2004. - №6. -С.82-83.

3. Выборова, И.С. Структура печени у крыс в динамике иммобилизационного стресса / И.С. Выборова, У. Хаджав, Л.С. Васильева, Н.Г. Макарова.// Сибирский медицинский журнал. - 2005. - №.3. - С.31-35.

4. Хаджав, У. Стресс-индуцированная альтерация печени у крыс / У. Хаджав, И.С. Выборова, Л.С. Васильева // Науч.практ. Ж. Паллиативная медицина и реабилитация: 7 конгресс с международным участием - 2005. - №2. - С.96.

5. Выборова, И.С. Гепатотропные эффекты ранней гетеротрансплантации эмбриональной ткани печени при интоксикации этиленгликолем / И.С. Выборова, Л.С. Васильева, Н.Г. Макарова // Сибирский медицинский журнал. -2007. -№.3,-С.

Список сокращений.

1ЧК - натуральный киллер

ГК — глюкокортикоиды

ГХИ - гистохимический индекс

КА - катехоламины

КФ - кислая фосфатаза

НА - норадреналин

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ШИК — реакция с ШИФФ йодной кислотой

ЭГ - этиленгликоль

ЭТП - эмбриональная ткань печени

Отпечатано на Rizo ООО «Фирма Сантай» По адресу: г. Иркутск, ул. Красноармейская, 4Б Формат бумаги 60*84 1/16. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 109 Сдано в печать 4 октября 2007 г.