Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние трансгенного фактора роста нервов (НГФ) млекопитающих на рост и морфологию клеточных систем

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние трансгенного фактора роста нервов (НГФ) млекопитающих на рост и морфологию клеточных систем"

На правах рукописи УДК 612.036:576.314.547.915.5

Муркин Евгений Васильевич

Влияние трансгенного фактора роста нервов (НГФ) млекопитающих на рост и морфологию клеточных систем

Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

003057733

Работа выполнена в лаборатории нейрогенетики и генети Института биологии гена РАН

ш развития

Научные руководители:

чл - корр. РАН, доктор медицинских наук.

профессор |Л.И.Корочкин| кандидат биологических наук Г.В.|Тавлова Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Л.П.Сащенко доктор биологических наук, профессор Ю.К.Доронин

Ведущая организация' Институт общей генетики им. Н.И.Ва зилова РАН

Защита диссертации состоится «12» апреля 2007 года, в 10 диссертационного совета Д 002.037.01 при Институте биологии гена Р. г.Москва, ул.Вавилова д.34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института мо; екулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г.Москва, ул.Вавилова д 3 2

Автореферат разослан «у » марта 2007 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат фармацевтических наук.

часов на заседании 'А|Н по адресу: 119334,

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Трансплантация эмбриональной нервной ткани или клеток является одним из способов улучшения функционального дефицита, возникающего в результате гибели нейронов в центральной нервной системе (ЦНС).

Существенное значение при этом имеет жизнеспособность трансплантированных нейронов - часть пересаженных клеток отмирает в течение раннего посттрансплантационного периода. На этот процесс влияют многие факторы: неполный обмен кислорода и углекислого газа, питательных веществ и метаболитов вследствие отека, отсутствия васкуляризации и последующего дефицита трофической поддержки и ростовых факторов, а так же влияния клеточного стресса и воздействия свободных радикалов и иммунных медиаторов.

Один из возможных путей усилить жизнеспособность и дифференцировку пересаженных клеток состоит в воздействии на ткани нейротрофическими факторами, такими, например, как КйР (фактор роста нервов). Одна из возможностей экспериментального исследования этого пути состоит в использовании модельной системы - кокультивации клеток плодовой мушки И те1апо$а51ег, трансфицированной геном со срезом мозга. Более предпочтителен метод, заключающийся в использовании для ксенотрансплантации клеток D.melanogaster, несущих в своем геноме гены нейротрофических факторов, находящихся под контролем регуляторных элементов генома D.me/íJиogaí«r. Наиболее подходящим из них является промотор белка теплового шока Н8Р70, который позволяет влиять на экспрессию гена, стоящего под контролем этого промотора, повышением температуры до 37° С.

В этом случае нейротрофические факторы должны будут автоматически эксирессироваться в трансплантате, т.к. температура тела млекопитающих (около 37° С)

будет являться активатором регуляторных элементов D.melanogaster и контролируемых ими генов.

Цель работы и задачи исследования Целью данной работы было изучение возможности, п нейротрофических факторов под контролем регуляторных э £) melanogaster для улучшения приживаемости ксенотрансплантата. всего, необходимо было установить, будут ли жизнеспособны клет< пересаживаемые млекопитающим и как долго они смогут экспрессии для них белки в нетипичных для них условиях. В связи с этим, в э были поставлены следующие задачи: получить линию мух О melanog в геноме ген флуоресцентного белка ВяЛес! под контролем промотор шока Н8Р70 и проверить выживание её клеток при кокультиваци млекопитающих. После чего вывести линию мух О melanogaster, сод ген фактора роста нервов лод тем же промотором, и пров экспрессирующегося гена п^ на ксенотранстплантат при кокульти мозга крыс.

Научная новизна и практическая ценность раб

В данной работе были получены линии мух Б melanogaste^ красного флуоресцентного белка (ОяКесГ) и ген фактора роста контролем промотора белка теплового шока НБР70 D.melanogaster. при кокультивации со срезом мозга крыс клетки этих линий выжив трансгенный белок как минимум два дня. N0?, экспрессируемый клс линии О те1ап(^а$1ег, некультивированными со срезом мозга крыс изменяет морфологию нейральной ткани (в том числе ускоряет с между нервным клетками хозяина и кокультивированными клети

шменения генов 'цементов генома При этом, прежде си D.melanogaster, овать чужеродные |]гом исследовании, aster, содержащую а белка теплового i со срезом мозга :ржагцую в геноме грить воздействие :ции их со срезом

, содержащих ген нервов {ngf) под 13ыло показано, что >т и продуцируют тками трансгенной усиливает рост и бразование связей ами). Кроме того,

трансгенный NGF изменяет морфологию самих клеток D.melanogaster, в которых он экспрессируется.

Работа предлагает новый метод для улучшения выживания ксенотрансплантата и образования связей между клетками донора и реципиента.

Апробация работы

Материалы работы были представлены на международных конференциях «Genes, Genes Families and Isozimes» (Берлин, Германия, 2003r); «Прогресс научной технологии для здоровья человека» (Кара-Даг, Украина, 2003г); «Progress in biotechnology and neurobiology - Integrative medicine» (Хургада, Египет, 2004г); «Прогресс в биотехнологии и нейробиологии - интегративная медицина» (Судак, Украина, 2004г.); «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2005г) и на международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Звенигород, Россия, 2005г). Публикации, на тему диссертации опубликованы две статьи в научных журналах и глава в книге.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение результатов, выводы, список литературы. Работа изложена на 103 страницах машинописного текста и содержит 27 рисунков. Библиография включает 170 источников

Материалы и методы, используемые в работе

В данной работе были использованы полученные нами генно-инженерные конструкции на основе вектора pCaSper-hs/act/, содержащие ген флуоресцентного белка (DsRed) и ген фактора роста нервов (ngf) под контролем промотора белка теплового шока D.melanogaster (Рис. 1).

Рис. 1 Схема полученных конструкций на базе иск-юра pCaSper, содержащих гены Ds&ed н ngf под промотором белка теплового шока hsp70. üsRed - ген красного флуоресцентного белка; ngf ~ ген фактора роста нервов; hsp?0 promoter -промотор белка теплового шока HSP70; mini white — i ответственный за красную окраску глаз трансгенных мух; pUC - последовательность вектора pUC-19, содержащая ген устойчивости к ампициллину, 5'Р, З'У последовательности Я-элемента, ответственные за встраивание последовательностей, расположенных между ними, в геном мух, Act5C polyA -сайт полиаденилирования гена актина

Линии мух выводились по стандартным генетическим схемам (Рис, 2, Рис. 3). Для этого использовали линню Dt(l) {содержащая делению гена white в X-

хромосоме) и линию, несущую доминантные летали Curly {Су-загнутые вверх крылья), Dichaete {D-Расставленные крылья), Lobe (L-Маленькие глаза), Stubble (Sb-Корогкие щетинки)

Контроль наличия вставки осуществлялся методом Саузерц-блот гибридизации, контроль экспрессии осуществлялся методом Нозерн-блот гибридизации, Whole-mount - гибридизацией и Всстсрн-блот гибридизацией Флюоресценция белков DsRcd и GFP наблюдалась с иимощыо флуоресцентно!-о микроскопа Olympus СХ 4] при длине волны возбуждения 485 нм

pp P[w+Al 1 w w Oy+ + D

? + w * +T Sb +

Окраиюнныв таза J,

CyD v

^ w P[w+fai ] + yy P[w+/<k ] +

1 9 Cy + "d- Cy + ~D~ {

Окрашенные таза

w P [w+ Ins ] + w P [w+fai I +

F,: О IZZ^Z X d" ^--

* w P[w+r„ l + w Ptw+й» I +

I

Рис. 2 Схема выведения линий, несущих гены DsRed и ngf под контролем промотора белка теплового шока HSP70. Ins - вставка (DsRed или ngf).

pp. w P[w+ngf] ,

• 9— - x о

W Ptw+e^f]

w Die

T№, e

окрашенные глаза. dl e+

w Plw+ngf] dl e „ w P[w*ngf] dl e

9= — x cf

1 W ----

TM3, e

TM3, e

В линию

Рис. 3 Схема выведения линии, несущей гены ngf и lac Z, а также мутацию Delta, которая вызывает трансформацию вентральной нейроэктодермы в нейральном направлении.

efl,

йротрофических яовить, будут ли |цим и как долго ичных для них pCaSper-hs /act/, промотора белка с ним гена при их, тем самым

гэ

Результаты исследований

Исследование выживания теток мух D.melanogaster, кокулъп ивированных со срезом мозга млекопитающих с помощью флуоресцентного б^1ка ОгКес!. Для изучения возможности использования человеческих н факторов при ксенотрансплантации, прежде всего, необходимо, уста жизнеспособны клетки D.melanogaster, пересаживаемые млекопитаю они смогут экспрессировать чужеродные для них белки в нетии: условиях. Для этого была создана конструкция на основе вектора несущая ген красного флуоресцентного белка ДгЛег/ под контролем теплового шока Промотор А¿р70 активирует экспрессию сцепленно: 37° С, являющейся нормальной температурой тела млекопитаюц] наработка чужеродного белка должна активироваться в пересаженных клетках трансплантата, тогда как в самих мухах (культивируемых при 25° С) т^ансгенный белок не должен экспрессироваться Таким образом, клетки, перес! млекопитающих должны экспрессировать флуоресцентный белок, детектировать. Кроме того, наличие экспрессии флуоресцентного трат ксенотрансплантате, будет свидетельствовать о жизнеспособное! клеток.

Полученная конструкция методом микроинъекции была введен;, линии БГ (1) ™67с23(2) и были выведены гомозиготная линия трансгенная по гену красного флуоресцентного белка под кон+р

белка теплового шока ШР70

С помощью Саузерн-блот и Нозерн-блот гибридизаций (Рис. А) было показано, что в эмбрионах трансфицированных мух содержится конструкция с геном флуоресцентного белка и с этого гена при температуре 37° С идет транскрипция мРНК

мух

т]>;

:аженные в мозг что позволит их сгенного белка в и пересаженных

в эмбрионы мух D.melanogaster, галем промотора

Из пяти выведенных трансгснных линий, была взята для дальнейшей работы линия 5 (дорожка 6).

« V

л в

Рис. 4 Молекулярный аналнг трансгснных линий мух, содержащие в геноме ген DsRed под контролем промотора белка теплового шока hsp7Q. (А) Саузерн-блот гибридизация с ДНК-зондом к гену DsRed. (!) хромосомная ДНК из мух исходной линии Df (1) w6,c2JI2); (2) хромосомная ДНК из мух линии, трансгснной но гену DsRed, (3) положительный контроль - плазмида pDsRedl-Nl, несущая ген DsRed (В). Нозерн-блот гибридизация с ДНК-зондом к гену DsRed. тотальная РНК из инкубированных 1 час при 37° С мух исходной линии Df (l) w67ü23<2) (1) и мух линий, трансгснных по гену DsRed(2)-(6).

При температуре 37° С (которая является для мух D.melanogaster тепловым

шоком), в эмбрионах трансгенной линии, происходит экспрессия белка DsRed,

флуоресценцию которого детектировали с помощью флуоресцентного микроскопа

Olympus СХ 41 при длине волны возбуждения 485 нм (Рис. 5).

В эмбрионе трансгснной линии видна четко выраженная флуоресценция красного

белка, локализованная преимущественно в мидгуте. Возможно, это связанно с тем, что

клетки этого отдела обладают повышенной чувствительностью к тепловому

воздействию, и в этих плетках идет интенсивная наработка белка HSP70. В эмбрионах

9

контрольной линии I )\\<,7сг№> присутствует слабая, не сильно выраженная и приближающаяся по яркости к фону флуоресценция, равномерно распределенная по эмбриону

Рис. 5 Экспрессия белка ЭШес! в развивающемся чмбрноне трансгенной линии 1).те1апо/>а.мег, инкубированном при температуре 37° С. (А) Контроль -исходная линия М[1)#й'в; (В) Эмбрионы линии, несущей ген под промотором

кчр70

Таким образом, была получена линия, трансгснная по гену ОзНес! под контролем промотора белка теплового шока. Показано, что клетки этой линии при тепловом шоке (37° С) экспрессируют трансгенный белок ОбЛс^

В качестве модели пересадки клеток мух П.те1апо%аыег в мозг млекопитающих была использована ко культивация этих клеток со срезом мозга крыс

При кокультивировании эмбриональной ней роз ктодерм ы полученной линии с клетками мозга крысы на второй день культивации при 37°С наблюдалась флуоресценция, свидетельствующая о синтезе белка DsR.ec! (Рис. 6) Таким образом, транс генные клетки !)тс1апо%а$1ег, культивированные в нетипичных для них условиях, жизнеспособны и в них происходит экспрессия чужеродного флуоресцентного белка.

Рис. 6 Флуоресценция эмбриональной нейроэктодермы мух D.metanogaster, грансгенной по гену Ds Red. кокультивируемой со срезом головного мозга крысы. Второй день кокультивации.

Таким образом, была получена линия, трансгенная по гену DsRed под контролем промотора белка теплового шока. Показано, что клетки этой линии, кокультивированные со срезом мозга млекопитающих выживают и продуцируют чужеродный белок DsRed как минимум два дня. Этот результат позволяет создать систему доставки нужного белка (в нашем случае нейротрофического фактора) в определённое место при ксенотрансплантации.

Исследование возможности применения фактора роста первой, репрессирующегося в клетках D.mehnogaster, для улучшения выживания

ксен отрансплантата. По методике, аналогичной получению DiJW-трансгенной линии, была выведена линия D. melanogaster, содержащая ген ngf человека лсд промотором белка теплового шока HSP70. Для того чтобы получить большое количество нервных клепок, продуцирующих белок NGF человека, полученная линия мух была скрещена с линией,

Содержащей мутацию по гену Delia, у гомозиготных эмбрионов которой эктодерма трансформируется в нсйральном направлении.

t помощью Саузерн-биот и Нозерн-блот гибридизаций (Рис. 7) было показано, что в эмбрионах ipa неф ициро ванных мух содержится конструкция с геном нейротрофического фактора и с этого гена при температуре 37° С идет транскрипция kí'hk

Z-i

_— 4

--И

--i

--IS

IKS

I

А В

Рис. 7 Молекулярный анализ трансгенных линий мух, содержащих к геноме ген под контролем промотора белка геллоного шока Н5Р70. (А) Саузсрн-блот гибридизация с ДНК-зоилом к тепу (1) тотальная ДНК нз мух трансгенной линии; (2) тотальная ДНК из мух линии ОГ (1) (В) Нозерн-блот гибридизация с ДНК-

зондом к гену пц(- Тотальная РНК. выделенная нз эмбрионов мух исходной линии О Г (!) \¥67с23(2) (]) без теплового шока, (2) после теплового шока. Тотальная РНК, выделенная нз эмбрионов мух трансгенной линии (3) без теплового шока, ($) после тештвого шока.

С помощью Вестерн-блота была показана экспрессия человеческого ЮР при тепловом шоко клетками мух трансгеннон линии (Рис, 8). Кроме трех линий, соответствующих собственному ЫСгР О.появилась полоса, отсутствующая

в контроле к соответствующая массе 32 кПа. Данная полоса соответствует NGK человека, индуцированному тепловым шоком.

I

— «—32

kDa

Рис. 8 Результаты Вестерн-О лот аналича тран стен ной линии с Ишггшка к белку NGF человека. Контроль - к.:с.очным лкэат, полученный из исходной линии, подвергнутой теêновому шоку; NGF - клеточный шоах, полученный из линии, трансгенной но гену ngf человека.

Рис 9. Экспрессии гена ngf в эмбриона* трэисгенных мух D.melanogaster при тепловом шоке. Wholc-mount - гибршеизация с не пользован нем в качестве зонда ДНК гена ngf' человека, (а) эмбрион исходной линии Df (1) w'l'c!î® на 10-й стадии эмбриогенеза; (6)-(л) эмбрион линии трансгенных мух на 10-й (б), 7-й (в), S-й (г), 12-й (д) стадиях эмбриогенеза; (е) личинка мух трансгенной линии.

С помощью Whole-mount гибридизации была определена локализация мРНК гена ngf в эмбрионах мух трансгенной линии на разной стадии развития при температуре 37° С (Рис. 9). На стадии синцнтиальной и клеточной бластодермы окраска была умеренно положительной, равномерно распределённой по поверхности эмбриона. По ходу сегментации повышенная транскрипция генов была отмечена по парасегментам с формированием «тигрового» рисунка окраски. С развитием нейральных элементов у эмбрионов была обнаружена интенсивная окраска в области головного ганглия. В контрольной линии Dfl;l)w61c2i(2) не была обнаружена гибридизация с мРНК гена ngf.

В культуре эмбриональных нервных клеток полученной линии D.melanogaster, трансгеннон по гену ngf человека, обнаружена аномально большая нервная клетка с активно ветвящимся аксоном (Рис. 10).

Рис. 10 Нервная клетка транс ген ной по ngf линии D.melanogaster под световым микроскопом. Культура эмбриональных нервных клеток D.melanogaster, содержащих м\тацию гена Delta я ген ng/ человека под промотором hsp70. Инкубация при 37° С

По-видимому, это связанно с влиянием гиперэкспрессии человеческого фактора роста нервов, экс премирующегося в клетке трансгенной линии при тепловом шоке, на саму хозяйскую клетку.

ь

Культура трансгенных по гену ngf клеток D.melanogaster, инкубированная при 37° С, проявляла характерные для нервных клеток свойства (Рис. 11). Было видно явное образование отростков и связей между клетками. Клетки трансгенной линии имеют четко выраженную кеиральную морфологию и активно образуют связи своими отростками с соседними клетками, тогда как в контроле (исходная линия Df(l)w6'cS3^ Рис. II я) клетки остаются недифференцированными и связи друг с другом не образуют Вместе с предыдущим фактом (появление аномально большой нервной клетки с активно ветвящимся аксоном Рис. 10) это показывает, что чужеродный ген ngf, экс премирующийся в клетках трансгснной линии, оказывает нейротрофический эффект на хозяйские клетки

V*

*»

а. б.

Рнс. 11 Культура клеток линии D.melanogaster, трансгенных по гену ngf при

37° С. (а) контроль - исходная линия Dfi( I hv67'23'21; (б) линия D meianogaster трансгенная по гену ngj человека

В результате кокультивации эмбриона мух D.melanogaster, трансгенньгх по гену человека, со срезом мозга эмбрионов крыс было обнаружено быстрое (через 1 час) врастание отростков нервных клеток мыши в нейроэктодерму D.melanogaster,

продуцирующую белок МОР. В контроле (с добавлением эмбриона ОА( !)л67сгз<2>) врастание отростков нервных клеток обнаруживается на 6-7-й день культивирования (Рис 12)

С.

Рис. 12 Прорастание сенсорных волокон клеток крысы в эмбриональную ней роэкто дерму эмбриона линии мух О.те/апо^аМег, трансгенной по гену (А), (В) Кокультивация эмбриона /3 те1апо%ая!ег, трансгенного по гену со срезом мозга крыс, клетки которого экспрессируют ОРР, I час культивирования; (А) при длине волны возбуждения 396 им; (В) при длине волны возбуждения 476 нм добавляется авто флуоресценция (голубое свечение) клеток эмбриона транс ген кой линии Ите/апо^ахГег: (С) кокультивация с эмбрионом мух исходной линии ])№67с!31"' Третий день культивирования.

На основании полученных данных мы можем сказать, что клетки D.melanogaster> инкубированные при температуре тела млекопитающих, нормально продуцируют чужеродный белок под контролем промотора белка теплового шока ШР70 О. те1апо%аз1ег как в культуре, так и в ксенотрансплантате

Таким образом, было показано, белок NGF человека, экспрессирующийся в клетками О.те1опо%аз1ег, оказывает активное нейротрофическое влияние на собственные клетки и на клетки окружения, усиливая рост и изменяя морфологию нейральной ткани

Полученная линия и.тгкпо^а^ег, трансгенная по гену может использоваться при ксенотрансплантации для улучшения приживаемости трансплантата.

Выводы

1. Показано, что клетки £> melanogaster1 инкубированные I стрессовых для них условиях, выживают как минимум два дня, при этом, чужеродный ген, находящийся под контролем промотора белка теплового шок: Dmelanogaster, может активироваться при температуре тела млекопитающих (37° О).

2. Показано, что в культуре эмбриональных клеток D.melanogaster, трансгенных по гену фактора роста нервов млекопитающих (ЛОР) под контролем промотора белка теплового шока ШР70 дрозофиллы, при т( мпературе 37° С экспрессируется трансгенный белок, оказывающий влияние на рост и морфологию клеток, в которых он экспрессируется,

3. Показано, что N0? млекопитающих, экспрессируюикийся в клетках эмбриональной нервной ткани трансгенной линии й.п elanogaster при инкубировании в условиях для культивации клеток млекопитающих, оказывает влияние на окружающие нервные клетки млекопитающих, инкуби эованные вместе с эмбрионом трансгенной линии. При этом оказываемый эффект заключается в направленном росте отростков нейронов млекопитающих в сторо ¡у эмбриональной нервной ткани О melanogaster с образованием контактов мея ду отростками и клетками эмбриональной нервной ткани трансгенной линии

4. Клетки полученной линии £> melanogaster, трансгенной по гену могут быть использованы при ксенотрансплантации для улучшения приживаемости трансплантата.

Список статей, опубликованных по теме диссертации

1. Г.В. Павлова, Е.В. Муркин, А.В. Ревищин, М.А. Александрова, Е.А. Модестова, Л.И. Корочкин (2003). Активность нейрогенов человека в стволовых клетках трансгенных линий дрозофилы. Цитология, т. 45, № 9, с. 909.

2. Pavlova G V., Manuilova E.S., Arsen'eva E.L., Grivennikov I.A., Murkin E.V., Kanaikina N.N., Revischin A.V., Tarantul V.N., Korochkin L.I. (2005) BFP protein expression in transfected embryonic stem cells Bull. Exp. Med., Apr., 139 (4) 514-516

Глава в книге:

3. L.I Korochkin, М.А. Alexandrova, G.V. Pavlova, A.V. Revischin, E.A. Modestova, O.P. Mirochnikova, T.V. Bragina, E.V. Murkin, M.B. Evgeniev, E.A. Zelentzova, E.A. Nikitina, E.V. Tokmacheva, A.V. Medvedeva, A.V. Popov, E.V. Sawateeva-Popova (2004). Genetic engineering methods of the regulation of stem cells differentiation. Biotechnology and Medicine, Nova Science Publishers, ch.17, p. 119-134.

Тезисы в конференциях по теме диссертации:

4. G. Pavlova, L. Korochkin, М. Aleksandrova, V. Bashkirov, A. Revischin, О. Alexenko, Е. Murkin, М. Evgeniev (2003). Hsp70 family proteins seem to facilitate alio- and xenotransplantation in the rat brain. i/Genes, Genes Families and Isozimes, Berlin, p. 61.

5 Г.В. Павлова, Е.В. Муркин, А.В. Ревищин, М.А. Александрова, Е.А. Модестова, Л.И. Корочкин (2003). Активность генов человека в стволовых клетках трансгенных линий дрозофилы. //Прогресс научной технологии для здоровья человека, Феодосия, Украина, с. 113.

6. О. Mirochnikova, G. Pavlova, Е. Murkin, Е. Titova, Т. Bragina, L. Korochkin (2004) The synthesis of genetical constructs to transform the human stem cells. //Progress in biotechnology and neurobiology - Integrative medicine, Hurtada, Egypt, p. Ill.

7. G. Pavlova, Revischin, O. Miroschnikova, E. Titova, E. Murkin, A. Enblom, M. Sandelin, E. Kozlova, L. Korochkin (2004). The influence of donor age, nerve growth

factor and cografting with Drosophila cells on survival of peripherically grafted embryonic or fetal rat dorsal root ganglia. 11 Progress in biotechnology and neurobiology - Integrative medicine, Hurtada, Egypt, p. 121. Л.И. Корочкин, И.А. Гривенников, E.C. Мануйлова, В.З. Тарантуг, А.В. Ревищин, Е.А. Титова, О.А. Мирошникова, Т.В. Брагина, Е.В. Муркин, Н.Н. Канайкина, Г В. Павлова (2005). //Трансформация стволовых клеток генами не йротрофических факторов. Биотехнология• состояние и перспективы развития, Москва, Россия, с. 64.

Отпечатано в копицентре «СТ ПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус www.stprint.ru e-mail, zakaz@stprint.ru тел.: 939-33-38 Тираж 70 экз. Подписано в печать 06.03.2007 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Муркин, Евгений Васильевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Трансгенные животные как экспериментальная модель.

Нейрогенные гены.

Белковые продукты генов Notch и Delta.

Нейротрофические факторы.

Классификация нейротрофических факторов.

Фактор роста нервов.

Характеристика фактора роста нервов.

Сигнальные каскады, вызываемые NGF.

Характеристика сигнальных каскадов, вызываемых NGF.

Ras-MAPK киназный путь.

Генная экспрессия: немедленно ранние гены.

Экспрессия задержанно-ранних генов.

Фосфолипазный путь.

Ras - независимые сигнальные пути.

Нейротрофиновый рецептор р75.

Использование нейротрофических факторов для лечения некоторых нейродегенеративных болезней.

Белки теплового шока (HSP).

Регуляция экспрессии белков семейств HSP.

ГЛАВА 2.

Материалы и методы.

Ферменты и реактивы.

Конструкции.

Рестрикция.

Лигирование.

Приготовление компетентных клеток.

Трансформация бактерий Е. Coli плазмидами.

Выделение плазмидной ДНК из Е. coli.

Электрофорез в агарозном геле.

Метод инъекций.

Выведение гомозиготных линий мух.

Контроль наличия вставки (блот-гибридизация по Саузерну).

Выделение хромосомной ДНК.

Рестрикция хромосомной ДНК.

Гель-электрофорез ДНК.

Перенос ДНК на нейлоновую мембрану.

Приготовление меченого зонда.

Гибридизация.

Контроль экспрессии ( Нозерн блот-гибридизация).

Выделение тотальной РНК.

Гель - электрофорез РНК.

Перенос РНК на нейлоновую мембрану.

Гибридизация.

Гибридизация in situ на целых эмбрионах.

Приготовление меченого зонда.

Сбор и фиксация эмбрионов.

Подготовка эмбрионов к гибридизации.

Гибридизация.

Предадсорбция антител.

Отмывка гибридизации и обработка антителами.

Окрашивание.

Вестерн - блот гибридизация(иммуноблотинг).

Получение белковых лизатов.

Фракционирование белков в полиакриламидном геле.

Перенос на нитроцелюлозную мембрану.

Имуннодетекция.

Получение первичной культуры клеток D.melanogaster, трансгенных по гену ngf.

ГЛАВА 3.

Результаты.

Исследование жизнеспособности клеток мух D.melanogaster, кокультивированных со срезом мозга млекопитающих с помощью GFP -подобного флуоресцентного белка DsRed.

Исследование влияния фактора роста нервов на клетки D.melanogaster, используемые при ксенотрансплантации.

ГЛАВА 4.

Обсуждение результатов.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Список сокращений

ADF - аденозиндифосфат AMP - аденозинмонофосфат ARTN - артемин, АТР - аденозинтрифосфат

BDNF - Нейротрофический фактор головного мозга, сАМР - циклоаденозинмонофосфат

CDP - цитозиндифосфат

СМР - цитозинмонофосфат

СТР - цитозинтрифосфат

ДАБ- диаминобензидин

DEPC - диэтилпирокарбонат

DRG - задержанно ранние гены,

EGF - эпидермальный фактор роста

FRET - флуоресцентный резонансный перенос энергии

GDNF - глиальный нейротрофический фактор роста,

GDP - гуанидиндифосфат

GFP - зелёный флуоресцентный белок

GMP - гуанидинмонофосфат

GTP - гуанидинтрифосфат

HSE - элемент теплового шока

HSF, HSTF - фактор транскрипции теплового шока,

Hsp, БТШ - белок теплового шока,

IEG - немедленно ранне гены

МГЭ мобильные генетические элементы

МНС - комплекс гистосовместимости

NGF, ФРН - фактор роста нервов,

NRTN - ньюртурин,

NT - нейротрофин, п.н. - пара нуклеотидов, PBS - фосфатно-солевой буфер, PSPN - персефин,

DsRed - красный флуоресцентный белок,

SDS додецил сульфат натрия,

TGF-P - трансформирующий фактор роста, т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов,

Trk - тирозинкиназа,

ЭДТА - Этилен-диамидтетрауксусная кислота.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние трансгенного фактора роста нервов (НГФ) млекопитающих на рост и морфологию клеточных систем"

В последние годы всё больше внимания уделяется лечению нейродегенеративных заболеваний, связанных с отмиранием нервных клеток в ЦНС, что приводит к функциональному дефициту.

Для восстановления функционального состояния применяют или трансплантацию незрелой нервной ткани или клеток, или инъекции непосредственно в мозг нейротрофического фактора, стимулирующего рост и дифференцировку нервных клеток. Это является потенциальной возможностью улучшения состояния, возникающего в результате отмирания нейронов.

Критической при трансплантации незрелой нервной ткани или клеток является приживляемость (выживание в новых условиях и образование связей между пересаженными клетками и клетками реципиента) трансплантированных нейронов. Большинство пересаженных клеток отмирают в течение раннего посттрансплантационного периода (Brundin, Р et all, 2000.). На этот процесс влияют многие факторы: неполный обмен кислорода и углекислого газа, питательных веществ и метаболитов вследствие отека, отсутствия васкуляризации и последующего дефицита трофической поддержки и ростовых факторов, а так же влияния клеточного стресса и воздействия свободных радикалов и иммунных медиаторов. Так, при репарации повреждения дорсальных корешков спинального ганглия крыс, аксоны поврежденных дорсальных корешков легко растут в периферический отдел корешков, но сразу останавливаются, когда встречаются с окружением промежуточной зоны. При этом человеческие эмбриональные или фетальные ганглии дорсальных корешков, пересаженные на место нативных, приживаются, протягивают аксоны через спинной мозг взрослых крыс-реципиентов и создают там функциональные связи (Kozlova et all 1995, 1997). Кроме того, клетки из трансплантата так же приживаются и отправляют аксоны через дорсальные корешки и периферическую нервную систему. Однако, при этом, большая часть пересаженных клеток отмирает, скорее всего, в результате недостаточного кровоснабжения, так как вокруг участка трансплантанта образуется глиальный рубец, блокирующий его васкуляризацию и образование связей с хозяйскими нейронами.

Таким образом, метод, состоящий в пересадке эмбриональной нервной ткани имеет низкий процент излечения и требует переодического повторения трансплантации.

Инъекция нейротрофического фактора применяется для стимуляции оставшихся нервных клеток к делению и росту, что замещает отмершие нейроны. Однако данная процедура является травматической для пациента. Кроме того, так как нейротрофический фактор нестоек, этот метод так же требует периодического повторения инъекции.

В последнее время планируется использование трансплантации эмбриональных стволовых клеток для восстановления функционального дефицита нейронов при нейродегенеративных болезнях. Однако, известно, что пересаженные эмбриональные стволовые клетки дают до 30% случаев перерождения в опухолевую ткань, следовательно, преимущества подобного метода так же сомнительны.

Более перспективен метод трансплантации аллогеных (собственных) стволовых клеток. При этом не возникает иммунный ответ на пересаженные клетки, практически не образуется глиальный рубец, однако сохраняется онкологический риск.

В 1990 году Л.И.Корочкин и С.В.Савельев показали, что нервные клетки плодовой мушки D.melanogaster, пересаженные в нервную трубку зародышей амфибий, выживают и образуют связи с нервными клетками реципиента, при этом не образуется глиальный рубец, блокирующий их васкуляризацию {Савельев С.В и др. 1990). Позднее, в опытах Л.И.Корочкина (Korochkin, 2000.) было показанно, что при ксенотрансплантации в мозг крыс нервные клетки D.melanogaster так же выживали в течение минимум месяца и блокировали образование глиального 9 рубца, что способствовало васкуляризации трансплантата и образованию связей с хозяйскими клетками.

Это даёт возможность применить новый метод ксенотрансплантации клеток плодовой мухи D.melanogaster для восстановления функционального состояния повреждённых участков мозга (Лосева Е.В. 2001). Кроме того, предпочтительнее будет использование при пересадке клеток D.melanogaster в качестве носителей чужеродных нейротрофических факторов, например, фактора роста нервов человека. Так как в геном плодовой мушки можно легко ввести чужеродные гены, то можно использовать для ксенотрансплантации клетки, трансгенные по гену нейротрофического фактора. При этом перспективно будет поставить экспрессию трансгенного гена под контроль регуляторных элементов генома D.melanogaster с целью активировать её только при ксенотрансплантации. Самым предпочтительным из регуляторных элементов генома D.melanogaster является промотор белка теплового шока HSP70. Данный промотор активирует транскрипцию находящегося под его контролем гена при повышении температуры до 37° С, т.е., при нормальной температуре тела млекопитающих, следовательно активация нейротрофинов в клетках ксенотрансплантата будет возможна только в мозге реципиента (Korochkin et all 2002).

Однако, не ясно, будет ли осуществляться экспрессия гена, контролируемого промотором теплового шока в условиях ксенотрансплантации, т.е. в мозге млекопитающих. И будет ли влиять экспрессирующийся нейротрофический фактор на окружающие клетки в условиях ксенотрансплантации. Данная работа была призвана дать ответ на часть этих вопросов.

Целью данной работы было исследование возможности применения клеток D.melanogaster, экспрессирующих при ксенотрансплантации чужеродный фактор роста нервов для восстановления повреждённых участков в мозге млекопитающих.

Для достижения поставленной цели были поставленны следующие задачи:

• исследовать возможность экспрессии гена, находящегося под контролем промотора белка теплового шока в клетках генома D.melanogaster в условиях ксенотрансплантации в мозг млекопитающих

• исследовать возможность применения фактора роста нервов для улучшения приживаемости ксенотрансплантата и стимуляции образования связей между ним и клетками реципиента.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Муркин, Евгений Васильевич

Выводы

1. Показано, что клетки D.melanogaster, инкубированные в стрессовых для них условиях, выживают как минимум два дня, при этом, чужеродный ген, находящийся под контролем промотора белка теплового шока D.melanogaster, может активироваться при температуре тела млекопитающих (37° С).

2. Показано, что в культуре эмбриональных клеток D.melanogaster, трансгенных по гену фактора роста нервов млекопитающих (NGF) под контролем промотора белка теплового шока HSP70 дрозофиллы, при температуре 37° С экспрессируется трансгенный белок, оказывающий влияние на рост и морфологию клеток, в которых он экспрессируется.

3. Показано, что NGF млекопитающих, экспрессирующийся в клетках эмбриональной нервной ткани трансгенной линии D.melanogaster при инкубировании в условиях для культивации клеток млекопитающих, оказывает влияние на окружающие нервные клетки млекопитающих, инкубированные вместе с эмбрионом трансгенной линии. При этом оказываемый эффект заключается в направленном росте отростков нейронов млекопитающих в сторону эмбриональной нервной ткани D.melanogaster с образованием контактов между отростками и клетками эмбриональной нервной ткани трансгенной линии.

4. Клетки полученной линии D.melanogaster, трансгенной по гену ngf, могут быть использованы при ксенотрансплантации для улучшения приживаемости трансплантата.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Муркин, Евгений Васильевич, Москва

1. Иванов А.И., Фролова И.П., Захаров И.К., Корочкин Л.И. 1993. Анализ нарушений развития мозга у нового Notch мутанта Drosophila melanogaster. Доклады Академии наук. т. 331. № 6.

2. Корочкин Л.И. 1989. Генетическая регуляция процессов нейрогенеза. Онтогенез, т. 20.№ 6. стр 593-606.

3. Корочкин Л.И., Михайлов А.Т. 2000. Введение в нейрогенетику. Москва «Наука».

4. Красильников М.А. 2000. Сигнальные пути, регулируемые фосфатидилинозит-3-киназой и их значение для роста, выживаемости и злокачественной трансформации клеток. Биохимия. 65(1). 68-78.

5. Лозовская Е.Р., Евгеньев М.Б. 1984. Тепловой шок у дрозофилы и регуляция активности генома. Молекулярная биология. 20:142-185

6. Лосева Е.В. 2001. Нейротрансплантация фетальных тканей и компенсаторно-восстановительные процессы в центральной нервной системе реципиентов. Успехи Физиол. Наук. Т. 12. N 1. С. 19-37.

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. 1984. Молекулярное клонирование. Москва «Мир».

8. Маргулис Б.А., Гужова И.В. 2000. Белки стресса в эукариотической клетке. Цитология. 42(4):323-342.

9. Ю.Потеряев Д.А., Саарма М. 2001. Семейство GDNF: от нейротрофических факторов к онкогенезу. Молекулярная биология. 35(2). 309-320.

10. П.Родионов И.М. 1996. "Фактор роста нервов"; Соросовскийобразовательный журнал, №3. П.Савельев С.В., Корочкин Л.И., Иванов А.И., Евгеньев М.Б., Бесова

11. H.В., Гулимова В.И. 1990. Трансплантация нейральной закладки дрозофилы в нервную трубку зародышей амфибий. Доклады Академии наук СССР. Генетика. Том 313 №6 стр 1491-1493.

12. Степанов В.М. 1996. Молекулярная биология. Москва «Высшая школа».

13. Татосян А.Г., Мизенина О.А. 2000. Киназы семейства Srs: структура и функции. Биохимия. 65(1) 57-67

14. Alessi D.R., Saito Y., Campbell DG., Cohen P., Sithanandam G. 1994. Identification of the sites in MAP kinase kinase-1 phosphorylated dy p74raf1.EMBO J. 13.1610-1619.

15. Aloe L., Vigneti E. 1992. In vivo and in vitro NGF studies on developing cerebellar cells. Developmental Neuroscience.

16. Andres D.A., Rudolph J.L., Sendoku T. Shi G.X. 2005. Analysis of rit signaling and biological activity. Methods Enzymol. 407:499-512.

17. Anton E., Weskamp G., Reichardt L., Matthew W. 1994. Nerve growgh factor and its low affinity receptor promote Schwann cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91. 2795-2799

18. Auger K., Serunian L., Soltoff S., Libby P., Cantey L. 1989. PDGF-dependent tyrosine phosphorylation stimulates production of novel phosphoinositides in intact cells. Cell. 57. 167-175.

19. Bar-Sagi D., Feramisco J.R. 1985. Microinjection of the ras oncogene protein into PC 12 induces morfologic differentiation. Cell 42. 841-848

20. Behrens M.M., Strasser U., Lobner D., Dugan L.L. 1999. Neurotrophin-mediated potentiation of neuronal injury. Microsc. Res. Tech. May 15-Jun l;45(4-5):276-84.

21. Berk G., Munno D.W., Levy Z., Dissel H.M., Van-Minnen J., Syed N.I., Fainzilber M. 2004. Neurotrophic activities of trk receptors conserved over 600 million years of evolution. J.Neurobiol. Jul; 60(1): 12-20

22. Berkowitz L., Riabowal K., Gilman M. 1989. Multiple sequence elements of a single functional class are required for cyclin AMP responsiveness of the mouse c-fos promoter. Mol.Cell. Boil. 9. 4272-4281.

23. Berninger В., Garcia D.E., Inadaki N., Hahnel C., Lindholm D. 1993. BDNFand NT-3 induce intracellular Ca elevation in hippocampal neurons. NeuroReport. 4. 1303-1306.

24. Bingham P.M., Kidwell M.G., Rubin G.M. 1982. The molecular basis of P-M hybrid dysgenesis: the role of the P element, a P-strain-specific transposonfamily.Cell. 1982 Jul;29(3):995-1004.

25. Blenis J. 1993. Signal transduction via the MAP kinases: proceed at your ownRSK. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 90.5889-5892.

26. Bonni A., Ginty D., Dudek H., Greenberg M. 1995. Serine 133-phosphorylated CREB induces transcription via a cooperative mechanism that may confer specificity to neurotrophin signals. Mol.Cell Neurosci. 6. 168-183.

27. Boydston W.R., Sohal G.S. 1979. Grafting of additional periphery reduces embryonic loss of neurons. Brain Res. Dec 14;178(2-3):403-10.

28. Brundin, P.; Karlsson, J.; Emgard, M.; Schierle, G. S.; Hansson, 0.; Petersen, A.; Castilho, R. F. 2000.1mproving the survival of grafted dopaminergic neurons: A review of current approaches. Cell Transplant. 9:179-195.

29. Casey P. 1995 Protein lipidation in cell signaling. Science. 268. 221-224

30. Castro J.R. Carareto C.M. 2004 Drosophila melanogaster P transposable elements: mechanisms of transposition and regulation. Genetica. Jun;121(2):107-18.

31. СЬао M.V. 2000. Trophic factors: An evolutionary cul-de-sac or door into higher neuronal function? J Neurosci Res. Feb l;59(3):353-5. Review.

32. Chen R.H., Tung R.R., Abate C., Blenis J. 1992. Nuclear localization and regulation of erk- and rsk- encoded protein kinases. Mol. Cell. Biol. 12. 915927.

33. Chen R.H., Sarnecki C., Blentis J. 1993. Citoplasmic to nuclear signal transduction by mitogen-activated protein kinase and 90 kDa ribosomal S6 kinase. Biochem. Soc. Trans. 21. 895-900.

34. Cohen G., Ren R., Baltimore D. 1995. Modular binding domains in signal transduction proteins. Cell. 80. 237-248.

35. Conover J.C., Yancopoulos G.D. 1997 Neurotrophin regulation of the developing nervous system: analyses of knockout mice. Rev Neurosci. 1997 Jan-Mar;8(l):13-27.

36. Cowley S., Paterson H., Kemp P., Marshall C. 1994. Activation of MAP kinase kinase is necessary and sufficient for PC 12 differenciation and for transformation of NIH 3T3 cells. Cell. 77.841-852

37. Curran Т., Franza B. 1988. Fos and Jun: the AP-1 connection. Cell. 55. 395397.

38. Davies A.M., Lee K.F., Jaenisch R. 1993. p75-deficient trigeminal sensory neurons have an altered response to NGF but not to other neurotrophins. Neuron. 11.565-574.

39. Diederich R.J., Matsuno К., Hing H., Artavins-Tsakonas S. 1990. Citolic interaction between deltex and Notch ankirin repeats implicates deltex in the Notch signaling pathway. Development. 120. 473-481.

40. Dobrowsky R., Werner M., Castellino A., Chao M., Hannun Y. 1994. Activation of the cphingomyelin cicle through the low affinity neurotrophin receptor. Science. 265.1596-1599.

41. Echalier G. 1997. Drosophila cells in culture. Academic Press. San Diego. CA.

42. Edwards R.H., Rutter W.J.,Hanahan D. 1989. Directed expression of NGF to pancreatic beta cells in transgenic mice leads to selective hyperinnervation of the islets. Cell. Jul 14;58(1): 161-70.

43. Gershon M. 1997. Genes and lineages in the formation of the enteric nervous system // Curr. Opin. Neurobiol. V. 7. P. 101-109.

44. Ginty D.D., Bonni A., Greenberg M.E. 1994. Nerve growth factor activates a ras-dependent protein kinase that stimulates c-fos transcription via phosphorylation of CREB. Cell. 77. 713-725.

45. Greene L., Tischler A. 1982. PC 12 pheochromocytoma cultures in neurobiological research. Adv. Cell. Neurobiol. 3. 373-414.

46. Hagag N., Halegoua S., Viola M. 1986. Inhibition of growth factor induced differentiation of PC12 cells by microinjection of antibodies to ras p21. Nature. 319. 680-682.

47. Haider S.A., Thaller V.T. 1992. Lid melanoma and parkinsonism. Brit. J. Ophtalmol. 76. 246 247.

48. Hayashi I., Perez-Magallanes M., Rossi G.M. 1992. Neurotrophic factor-like activity in Drosophila. Biochem Biophys Res Commun. Apr 15;184(l):73-9.

49. Hill С., Treisman R. 1995. Transcriptional regulation by extracellular signals: mechanisms and specifity. Cell. 80. 199-211.

50. Jaaro H., Beck G., Conticello S.G., Fainzilber M. 2001 Evolving better brains: a need for neurotrophins? Trends Neurosci. 24(2):79-85.

51. Jachansan Amin, Ruben Nestril, Paul Schiller, Michel Dreano and Richard Voellmy. Organization of the Drosophila melanogaster hsp70 heat shock regulation unit. Mol. Cell. Biol., 1987, 7 (3): 1055 1062

52. Jianq H., Zhanq J., Zhu H., Zhanq X. 2007. Nerve growth factor prevents the apoptosis-associated increase in acetylcholinesterase activity after hydrogen peroxide treatment by activating Akt. Jan;39(l):46-56.

53. Jing S., Tapley P., Barbacid M. 1992. Nerve growth factor mediates signal transduction through trk homodimer receptors. Neuron. 9. 1067-1079

54. Kaplan D.R.,Hempstead B.L., Martin-Zanca D., Chao M.V. Parada L.F. 1991. The trk protooncogene product: a signal transducing receptor for nerve growth factor. Science. 252. 558-561.

55. Kawamoto Y., Nakamura S., Kawamato Т., Akiguchi I. Kimura J. 1999. Cellular localization of brain derived neurotrophic factor like immunoreactivity in adult monkey brain. Brain research. 381. 341-349.

56. Kolch W., Heidecker G., Kochs G., Hummel R., Vahidi H., Mischak H., Finkenzeller G., Marme D., Rapp U.R. 1993. Protein kinase Ca activates RAF-1 by direct phosphorylation. Nature. 364. 249-252.

57. Korochkin, L. I. 2000. New approaches in developmental genetics and gene therapy: Xenotransplantation of Drosophila embryonic nerve cells into the brain of vertebrate animals. Genetika 36:1436-1442. (in Russian, English abstract).

58. Korochkin, L. I.; Alexsandrova, M. A.; Pavlova, G. V.; Bashkirov, V. N.; Revischin, A. V.; Alexenko, 0. A.; Evgen'ev, M. B. 2002. Hsp70 family proteins seem to facilitate alio- and Xenotransplantation in the rat brain. Tsitologia 44:803-806.

59. Levi Montalchini R. 1987. The nerve growth factor: five years later. EMBOJ. 6. 1145-1154.

60. Lindquist S. 1986. The heat-shock response. Ann. Rev. Biochem. 55, 11511191.

61. Loeb D., Maragos J., Martin-Zanca D., Chao M., Parada L., Greene L. 1991. The trk protooncogene rescues NGF responsiveness in mutant NGF-responsive PC 12 cell lines. Cell. 66. 961-966.

62. Lowenstein E., Daly R., Batzer A., Li W., Margolis B. 1992. The SH2 and SH3 domain-conteining protein GRB2 links receptor tyrosine kinases to Ras signaling. Cell. 70. 431-442

63. March H.M., Scholz W.K., Lamballe F., Klein R., Nanduri V. 1993. Signal transduction events mediated dy the BDNF receptor gp 145(trkB) in primary hyppocampal pyramidal cell culture. J.Neurosci. 13. 4281-4292.

64. Middlemas D.S., Meisenhelder J., Hunter T. 1994. Identification of TrkB autophosphorylation sites and evidence that phospholipase C-gamma 1 is a substrate of the TrkB receptor. J. Biol. Chem. 269. 5458-5466

65. Miranti C., Gunti D., Huang G., Chatila Т., Greenberg M.E. 1995. Calcium activates serum response factor-dependent transcription by a Ras- and Elk-1-independent mechanism that involves a Ca2+/Calmodulin-dependent kinase. Mol. Cell. Biol. 15.3672-3684.

66. Panin V.M., Papayannopoulos V., Wilson R., Irvin K.D. 1997. Fringe modulates Notch ligand interactions. Nature. Jun 26;387(6636):908-12.

67. Panin V.M., Irvin K.D. 1998. Modulators of Notch signaling. Cell and developmental biology. 9 609-617.

68. Payne D., Rossamondo A., Martino P., Erickson A., Her J. 1991. Indentification of the regulatory phosphorylation sites in pp42/Mitogen-activated protein kinase (MAP Kinase). EMBO J. 10.885-892.

69. Pelham H.R. 1986. Speculations on the functions of the major heat shock and glucose-regulated proteins. Cell, 46(7), 959-961.

70. Pradat P.F. 2003. Treatment of peripheral neuropathies with neurotrophic factors: animal models and clinical trials 2003 Rev Neurol (Paris). Feb; 159(2): 147-61.

71. Rabizaden S., Oh J., Zhong L.T., Yang J., Butler C.M. 1993. Induction of apoptosis by the low-affinity NGF receptor. Science. 261. 345-348.

72. Ritossa F. 1962. A new puffing pattern induced by heat shock and DNP in Drosophila. Experientia, 18, 571-573.

73. Rodriguez-Tebar A., Dechant G., Barde Y.A. 1990. Binding of brain derived neurotrophic factor hin-3 to nerve growth factor receptor. Neuron. 4. 487492.

74. Rodriguez-Tebar A., Dechant G., Gotz R., Barde Y.A. 1992. Binding of neurotrophin-3 to its neuronal receptors and interactions with nerve growgh factors and brain-derived neurotrophic factor. EMBO J. 11. 917-922.

75. Rubin G.M., Kidwell M.G., Bingham P.M. 1982. The molecular basis of P-M hybrid dysgenesis: the nature of induced mutations. Cell. Jul; 29(3). 987-94.

76. Rubin G.M., Spradling A.C. 1982. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. Oct 22. 218(4570). 348-53.

77. Ryder E., Russell S. 2003. Transposable elements as tools for genomics and genetics in Drosophila. Brief Funct Genomic Proteomic. 2003 Apr; 2(1). 5771.

78. Schlessinger J. 1994. SH2/SH3 signaling proteins. Curr. Opin Genet. Dev. 4. 25-30

79. SpradlingA.C., Rubin G.M. 1982. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes.

80. Thummel C.S., Boulet A.M. 1988. Vectors for Drosophila P-element-mediated transformation and tissue culture transfection. Gene. Dec. 30. 74(2). 445-56.

81. Tissieres A, Mitchell H.K, Tracy U.M. 1974. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs. J. Mol. Biol., 84(3), 389-398.

82. Treisman R. 1992. The serum response element. Trends Biochem.Sci. 17. 423-426.

83. Treisman R. 1994. Ternari complex factors: growth regulated transcriptional activators. Curr. Opin. Genet. Dev. 4. 694-701.

84. Так же хочу выразить благодарность всем, кто принял живое участие в подготовке данной работы в печать и помогал при этом своими ценными советами и замечаниями.