Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нейротрофическая регуляция жизнеспособности и дифференцировки трансгенных клеток

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Нейротрофическая регуляция жизнеспособности и дифференцировки трансгенных клеток"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА

На правах рукописи

ПАВЛОВА ГАЛИНА ВАЛЕРИЕВНА

Нейротрофическая регуляция жизнеспособности и дифференцировки трансгенных клеток.

Специальность 03 00 26 - "молекулярная генетика"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

0030591Ю

Москва 2007

003059110

Работа выполнена в Институте биологии гена РАН в лаборатории нейрогенетики и генетики развития

Научные консультанты

член- корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор

Корочкин Л И

академик РАН,

доктор биологических наук,

профессор Георгиев Г П

Официальные оппоненты

академик РАН и РАМН, доктор биологических наук,

профессор Ткачук В А

доктор медицинских наук,

профессор Альтштейн А Д

доктор биологических наук,

профессор Лимборская С А

Ведущая организация Институт биологии развития им Н К Кольцова РАН

Защита диссертации состоится «29» мая 2007 года в «10» часов на заседании Диссертационного совета Д 002 037 01 при Институте биологии гена РАН по адресу 119334, г Москва, ул Вавилова, д 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН, по адресу 119991, г Москва, ул Вавилова, д 32

Автореферат разослан« 27 » апреля 2007 года

Ученый секретарь Диссертационного совета канд фарм наук

Актуальность темы

Известно, что нейродегенеративные заболевания - паркинсонизм, ишемический инсульт и др - важнейшие социальные заболевания, одни из существенных причин инвалидности и смертности людей в трудоспособном и пожилом возрасте Широкое распространение при лечении этих заболеваний приобретают методы клеточной и генной терапии с использованием клеток, с модифицированными генами, обеспечивающими терапевтический эффект Особенно перспективна возможность использования региональных стволовых клеток самого пациента, индуцированных к развитию в нужном направлении Наилучшим трансплантационным материалом служат собственные стволовые клетки из красного костного мозга и других тканей, содержащих мезенхимальные стволовые клетки Однако, так как у интактных региональных стволовых клеток существуют ограничения потенциала дифференцировок, существенное значение имеет разработка способов управления специализацией трансплантируемых клеток и повышения их жизнеспособности, а также способов предотвращения образования рубцовой ткани в местах трансплантации

Главными факторами, определяющими природу и рост афферентных и эфферентных волокон трансплантатов, являются среда, в которой находятся трансплантаты мозга, ростовые способности трансплантата, наличие или отсутствие рубца на границе между трансплантатом и мозгом хозяина Однако уже в течение первой недели после операции астроциты реципиента начинают мигрировать в трансплантат и замещать раневой канал глиальным рубцом При этом в глиальных септах и в участках глиального рубца густота врастающих в имплантат капилляров существенно ниже таковой в окружающей ткани мозга реципиента Это может привести к весьма недолгому переживанию трансплантата и его полному отмиранию в результате нехватки питательных веществ уже в течение нескольких месяцев после операции, что, в конечном итоге, сводит эффект к нулю Для достижения лучшей эффективности нейротрансплантации необходима максимальная интеграция трансплантата с мозгом реципиента, что возможно только при отсутствии глио-мезодермальной капсулы (Корочкин, 2000)

Для достижения максимального клеточно- и генно-терапевтического эффекта и обеспечения безопасности для пациента необходим поиск генетических регуляторных элементов, способных трансформировать стволовые клетки в нужном для лечения направлении В случае удачного подбора таких элементов появляется возможность повышения эффективности генной и клеточной терапии при лечении многих заболеваний, требующих использования метода трансплантации тканей В разрабатываемых

конструкциях следует предусмотреть возможность управления экспрессией трансгенов В состав этих конструкций не должны входить неприменимые в настоящее время в клинике вирусные элементы

Разработка генных конструкций, сдвигающих дифференцировку стволовых и прогениторных клеток в нейральном направлении, и благоприятно влияющих на приживляемость трансплантата, а также исследование функционирования полученных конструкций в трансфицированных клетках в культуре до и после трансплантации имеют решающее значение для развития клеточной и генной терапии Этому и посвящена настоящая работа

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является поиск путей управления дифференцировкой стволовых клеток, использование трансгенных клеток для трансплантаций в мозг млекопитающих, а также улучшения приживляемости трансплантата Центральным был вопрос исследования с помощью методов молекулярной генетики и клеточной биологии, возможных способов предотвращения формирования рубцовой ткани при нейрохирургических операциях Образование рубца в этих случаях является бичом нейрохирургии и зачастую сводит на нет усилия хирургов по лечению пациентов, страдающих, например, болезнью Паркинсона, хореей Гентингтона, болезнью Альцгеймера и др

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи

1 Получить трансгенные линии дрозофилы, экспрессирующие нейротрофические факторы человека и мыши N0?, ВГЮТ и 01ЖР и провести молекулярно-генетический анализ полученных линий

2 Изучить влияние экспрессии чужеродного нейрального гена на трансгенные клетки дрозофилы

3 Исследовать воздействие полученных трансгенных клеток на клетки или ткани млекопитающих при кокультивации

4 Провести ксенотрансплантацию и проанализировать влияние трансгенных клеток, экспрессирующих нейротрофические факторы, на приживляемость трансплантата и на образование глиального рубца

5 Изучить возможность использования промотора гена белка теплового шока дрозофилы кчр70 в клетках млекопитающих

6 Получить трансгенные линии НЕК293, экспрессирующие нейротрофические факторы человека и мыши ЫОР, ЕГОЭТ и вЭОТ и провести молекулярно-генетический анализ полученных линий

7 Провести трансплантацию клеток трансгенной линии НЕК293 в мозг крысы Проанализировать влияние нейротрофического фактора на образование глиального рубца Научная новизна и практическая ценность работы Несмотря на обилие в мировой литературе экспериментальных данных, показывающих перспективность применения аутологичных стволовых клеток для лечения нейродегенеративных заболеваний мозга, публикации, посвященные практическим вопросам подготовки и клинического применения этих клеток немногочисленны Данная работа поможет перевести клиническое применение новых клеточных технологий при лечении нейродегенеративных заболеваний на систематическую научную основу Нейродегенеративные заболевания - паркинсонизм, ишемический инсульт и др -важнейшие социальные заболевания, одни из главных причин инвалидности и смертности людей в трудоспособном и пожилом возрасте В данной работе предлагается новый подход к лечению нейродегенеративных заболеваний посредством трансплантации клеток носителей нейротрофических факторов Были разработаны различные способы генноинженерных манипуляций с клетками и последующей трансплантацией полученного материала в мозг

1 Создана оригинальная модель доставки нейротрофического фактора в поврежденный участок мозга млекопитающих с помощью клеток трансгенных линий дрозофилы Экспрессия чужеродного гена, проходит лишь в промежутке времени, определенном укороченным жизненным ресурсом клеток дрозофилы в чужеродной ткани млекопитающих При этом данные клетки -носители не склонны к делению В результате был разработан метод трансплантации смеси стволовых клеток человека и дифференцированных нервных клеток трансгенных линий дрозофилы, несущих ген фактора роста под контролем промотора гена теплового шока

2 Обнаружено, что присутствие в ко-трансплантанте нейральных эмбриональных клеток дрозофилы, продуцирующих нейротрофический фактор, противодействует образованию глиального рубца. Данный результат имеет значение для разработки терапевтических методов борьбы с глиозом - одной из основных проблем при нейрохирургических операциях

3 Перед мировой практикой стоит серьезная проблема в связи с использованием вирусных векторов Исследователи пытаются заменить данные вектора более безопасными для человека носителями В нашей лаборатории разрабатывается применение плазмидных векторов для трансфекции Также предложен новый промотор для регуляции экспрессии гена введенного в клетки реципиента. Данный промотор имеет невирусное происхождение и является регулируемой структурой, что позволяет управлять активацией чужеродного гена в клетках Возможность использовшшя невирусных регулируемых структур позволяет включать активность

чужеродных генов лишь в определенные необходимые промежутки времени, что важно для безопасности их клинического применения

4 Для ряда заболеваний необходима постоянная экспрессия определенного гена Для таких случаев была создана модель на основе родственных человеку трансгенных клеток, способных экспрессировать чужеродный ген постоянно Данная модель обладает рядом преимуществ Использование человеческих клеток обеспечивает длительное их переживание и постоянное продуцирование терапевтического бежа.

Полученные результаты имеют практическое и теоретическое значение Появляется возможность повышения эффективности генной и клеточной терапии при лечении многих заболеваний, требующих использования метода трансплантации тканей В связи с данной работой открывается возможность выработки ряда практических рекомендаций по применению стволовых и прогениторных клеток в хирургии и трансплантологии

Предлагаемые подходы к фундаментальным исследованиям стволовых клеток являются оригинальными и основываются на предложении новой техники анализа и управления поведением стволовых клеток

Апробация работы

Основные результаты докладывались на различных отечественных и международных конференциях, рабочих совещаниях, семинарах, в том числе на 16th European Drosophila Research Conference Zurich, 1999, 41th Annual Drosophila Research Conference Pittsburgh, 2000, ó^East European Conference of the International Society of Invertebrate Neurobiology, Moscow-Puschino, 2000, Conference on bioinformatics of genome regulation and structure, BGRS, Novosibirsk, 2000, Progress m biotechnology and neurobiology - Integrative medicine, Egypt, Hurtada, 2004r, ELSO, Nice, 2004, Научные Труды 1-го съезда физиологов СНГ, Сочи-Дагомыс, 2005

Публикации

По теме диссертации опубликовано 36 печатных работ

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 268 страницах машинописного текста и состоит из следующих частей введение, обзор литературы, материалов и методов, результатов и обсуждений, выводов и списка литературы Библиография включает в себя 289 источников Работа иллюстрирована 99 рисунками и 6 таблицами

Результаты исследований и их обсуждение

1. Создание трансгенных линий Drosophila melanogaster гомозиготных по иейралыюму гену человека

Ранее нами было показано, что эмбриональные, нервные клетки дрозофилы переживают и дифференцируются после трансплантации в мозг развивающихся амфибий В связи с этим возникла идея использования ксенотрансплантатов для продукции нейротрофических факторов, способствующих переживанию и развитию трансплантированной нервной ткани Для исследования были использованы три нейротрофических гена gdnf bdnf и ngf, физиологическое действие которых на нервную ткань основательно исследовано Известно, например, что инъекция GDNF в желудочки мозга вызывает значительное увеличение тирозингидроксилазной активности в нейронах черной субстанции и стриатума у старых крыс Совместное введение GDNF и NGF приводит к повышению холинацетилтрансферазной активности в септуме, гиппокампе, стриатуме и коре и вызывает повышение локомоторной активности у старых крыс (Lapchak,1997) Большой интерес вызывает влияние на нейротрансплантаты таких нейротрофических факторов как фактор роста нервов (NGF) и мозгопроизводный нейротрофический фактор (BDNF) Их роли в развитии нервной системы посвящено множество работ (Семченко, 2000, Alexi, 2000)

Поскольку длительное инъецирование фактора в область повреждения чрезвычайно травматично для ткани мозга, то работа была направлена на создание генно-инженерными методами клеток, способных экспрессировать нейротрофический фактор Трансплантаты, содержащие такие клетки, пригодны для длительного экзогенного выделения фактора в области повреждения мозга

Для введения генно-инженерных конструкций используют различные популяции соматических или нервных клеток млекопитающих (Tseng, 1997, Emench, 1996, Mohajen, 1999) Предложенная нами модель выгодно отличается тем, что промотор гена белка теплового шока дрозофилы hsp70 может автоматически активироваться в условиях температуры тела млекопитающих, обеспечивая тем самым постоянно высокий уровень синтеза продукта, кодируемого геном, «поставленным» в генно-инженерной конструкции под этим промотором

Надлежало выяснить, будут ли активироваться и функционировать нейротрофические гены млекопитающих в клетках и тканях дрозофилы Для этого были получены три генно-инженерные конструкции на основе вектора CaSper (рис 1,2,3), содержащие соответственно один из исследуемых нейротрофических генов млекопитающих (gdnf, bdnf, ngf) В каждой конструкции нейротрофические гены были

поставлены под промотор гена белка теплового шока дрозофилы, благодаря которому активируется транскрипция этих генов при температуре 37"С (температура теплового шока насекомых). Данные конструкции были инъецированы ь эмбрионы дрозофилы линии Df(l)w67cMp', которая содержала ген white, обуславливающий фепогии «белые глаза» у взрослых мух. Конструкции же содержали ген mini-while, который позволяет идентифицировать трансформаптпв в поколении F1.

Ряс 1 . Схема полученной конструкция на базе вектора pCaSper, содержащей ген gilnf человека под промотором юна белка теплового шока Msp70.

GDNF-ген фактора роста первое hsp7Q prom. - промотор гена белка тепло но го шока Hsp70 mint white - ген, ответственный за красную окраску глаз трансгенных мух

Рнс 2, Схема полученной конструкции на 6a:ie вектора pCaSper, содержащей ген ngf мыши иод промотором ГШ белка теплового шока Hsp70,

NGF - ген фактора роста нервов

hsp70 prom - промотор гена белка теплового шока I Isp70

i'iie 3. ¡Схема полученной конструкции на базе вектора pCaSper, содержащей гея hdnf человека под промотором гена белка теплового шока ltsp7U

BDNF - l'en (фактора роста нервов

hsp70 proin. - промотор гена белка теплового шока Hsp7Q

Из трансформантов поколения F1 были выведены гомозиготные линии. В результате мы получили три линии: СЗ- содержащая в гомозиготе ген человека gdnf, G8- содержащая ген ngf мыши и G7- содержащая ген bdnf человека. Каждая из этих линий была скрещена с ранее полученной линией, несущей ген бактериальной галактоз ид алы locZ и мутацию Delta, которая вызывает трансформацию вентральной иейроэктодермы в нейральном направлении. Полученные линии СЗ-1М, G8-1M и G7-1M содержали lacZ и Delta, а также гены млекопитающих gdnf, ngf, bdnf соответственно. Полученные линии были проанализированы молекулярными методами. Методом блот-гибридизации по Саузерну были подтверждены вставки в геном дрозофилы. Контроль экспессии встроенных генов был осуществлен методом блот-гибридизации по Ноэерну. ГС опыте была выявлена индуцированная экспрессия мРПК. Мы не наблюдали экспрессии мРНК нёЙротрофичееких факторов млекопитающих без воздействия стрессовой температуры (3711 С), Известно, однако, что промотор гена белка теплового шока дрозофилы hsp70 "подтекает" и при более низких температурах и в раде гибридизаций мы иногда наблюдали слабый сигнал. Аналогичный анализ на экспрессию мРНК был проделан и для конечных линий G7-I M.G8-IM и СЗ-1М. Перечисленные выше линии были исследованы на предмет активации гена при воздействии хит-шоковой температуры и без данного воздействия. Результаты б;ют-гибридизации по Нозерну для линий G7-IM,G8-IM и СЗ-1М показаны на рисунках 4, 5 и 6.

Phi 4, Молекулярный анализ трансгенных линии пух СЗ-1М, содержащих в геноме ген GDM-' под контролем промотора гена белка теплового шока hsp70 (СЗ) Нозерн-блот гибридизация с зондами ДНК к гену gdnf I - PI-IK, из эмбрионов мух трансгенной линии без теплового шока;

2- РНК, из эмбрионов мух трансгенной лшшн после теплового шока;

3- РНК, из эмбрионом мух линии Df (1) w67ci'<:) после теплового шока (контроль);

1 2 3

18S

— Рис 5, Молекулярный анализ трансгенных линии мук С 8-1М, содержащих в геноме ген ¡ЧСР под контролем промотора гена белка теплового шока Алу170

.Нозерн-бдот гибридизация с зондами ДНК к гену

!- РНК, из эмбрионов мух линии ОГ' (1) \у6;сВ(г:' без теплового В тока (контроль);

I 2- РНК, из эмбрионов мух линии ОС (11 \уЮс23<г> после теплового шока (контроль);

3- РНК, из эмбрионов мух трансгенной линии без теплового шока;

4- РНК, из эмбрионов мух трансгеннои линии после теплового

шока;

Ptt( 6. Молекул Я рв ыи анализ ] рянсгеяных ли яя ¡1 .мух G7-IM, содержащих о геноме reu BDNF под контролем промотора гёвя белка теплового шока hsp 70

I! озер! 1-6 л от гибридизация с зондами Д] !К к гену bänf

1- РНК, из эмбрионов мук линии Df(!) w6 ® после теплового шока (контроль);

2- РНК, из эмбрионов мук трансгенной линии после тс пл оно го шока;

3- РНК, из эмбрионов мук трансгенной лилии без теплового шока;

В данном эксперименте не было обнаружено гибридизации с РНК клеток контрольной линии (контролем служила исходная линия, а также трансгенная линия без тепловой обработки), В опыте мы наблюдали индуцированную эскпрессию мРНК при воздействии на эмбрионы шоковой температурой (37°С).

Для эмбрионов линии 08-IM, содержащей ген ngf, был проведен анализ синтез белка с помощью иммуноблотинга. На эмбрионы воздействовали температурой теплового шока. В результате иммуноблотинга был обнаружен соответствующий белковый продукт (рис. 7).

I g

Рис 7. Вестерм-б.чoí анализ. Результаты прямого иммуноблотинга е антителами к белку NGF

з контроль - искодиая линия, подвергнутая тепловому шоку

MGF - траистенная линия мух, содержащая в геноме ngf под контролем промотора гена белка теплового шока hsp70, подвергнутая нагреванию до 3 ТС

Таким образом, гены исследуемых нейротрофических факторов млекопитающих успешно экспрессируются в клетка?г дрозофилы.

Определение локализации экспрессии мРНК трапсфицированнше. генов gdnf, bdnf и ngf н тканях объекта и ее активности под данным промотором было проведено методом гибридизации in situ на целых эмбрионах.

После воздействия теплового шока на эмбрионы трансгенной линии C3-IM была обнаружена транскрипция человеческого gdnf на всех стадиях эмбрионального развития данной линии, как у гегерозигот D//+, так и у гомозиготных Dl/Dl особей.

IIa стадии синцитиальпой и клеточной бластодермы реакция была умеренно положительной, равномерно распределенной по поверхности эмбриона. По ходу сегментации повышенная экспрессия гена gdnf была отмечена по парасегментам, в результате чего формировался характерный тигровый рисунок окраски.

С развитием нейральиых элементов областью преимущественной локализации мРМК гена gdnf явилась центральная нервная система эмбрионов. Соответствующие транскрипты были Выявлены как в головном, так и в торакальных ганглиях (рис, 8). У исходной линии реакции гибридизации in situ обнаружено не было.

Рис 8. 'Экс и |> и ее и н гена 8<!п/ в эмбрионах травегёввых .иу* й.те/апо^аМег. \Vhole-mount -1 в брнд и ¡;п| и я с и снол ьзиван нс.ч и качес 1вс .'III 1.1ДНК к си ;1 £(1п/человека.

а,б, Эмбрион линии трансгенных мух в разных положениях. Масштаб 0,1 мм

После воздействия теплового шока на эмбрионы линии 08-1М была обнаружена мРНК введенного гена (рис.9) на неех стадиях эмбриинапытю разви тия, а также у личинок.

Рис 9. 'Экспрессия гена в

эмбрионах трансгеиных мух О.те1а»ода!1ег. \Vliole-mount -гкбрнди&швя с использованием в качестве зонда ДНК" гена л&Г человека.

а - эмбрион исходной линии

б, в. г, д- Эмбрионы линии трансгенных мух на разных стадиях развития е - личинка мухи трансгснной линии. Масштаб 0,1 мм

Как и а случае с геном gdnf, на стадии синцитнальной и клеточной бластодермы наблюдали умеренную реакцию, равномерно распределенную по всей поверхности эмбриона. По мере сегментации повышенная экспрессия генов наблюдалась в иарасегментах, ч то давало характерный тигровый рисунок. С развитием нейральиых элементов у эмбрионов линии G8-1M (ngf) была обнаружена интенсивная окраска в области головного ганглия.

При анализе экспрессии bdnf в линии G7-IM (метод гибридизации in situ на целых эмбрионах) окраска наблюдалась практически во всех областях эмбриона (рисунок не

представлен) У исходной линии реакции гибридизации in situ с ДНК ngf (рис 9) и bdnf не наблюдалась

2 Влияние экспрессии нейротрофического фактора млекопитающих на трапсгенные клетки

Создание линий-носителей нейротрофических факторов для ксенотрансплантации в мозг млекопитающих и кокультивации с эмбриональными клетками поставило следующие вопросы 1 каким образом будет влиять нейротрофический фактор на сами трансгенные клетки, 2 будут ли клетки выживать в условиях пригодных для клеток млекопитающих при температуре теплового шока и продуцировать трансгенный белок

Для изучения влияния гена ngf человека на фенотип трансгеиных клеток была получена культура клеток эмбриона линии G8-1M В культуре клеток дрозофилы, трансфицированной геном ngf была обнаружена атипичность Было замечено большое количество игловидных клеток, не встречавшихся в контрольных культурах не содержащих трансген Наблюдались также сильно распластанные клетки, по форме напоминающие листок полиэтилена, прилипший к поверхности культуральной чашки В трансгенной не обнаружены наблюдаемые в контрольной культуре сетеподобные образования, которые, по всей видимости, имеют отношение к выработке хитина Данное отличие говорит о том, в культуре, экспрессирующей нейротрофический фактор млекопитающих, подавляется дифференцировка клеток в иных направлениях, кроме нейрального Особенности данной культуры, по-видимому, объясняются тем, что даже без теплового воздействия на клетки наблюдается подтекание промотора гена белка теплового шока дрозофилы, вследствие чего наблюдается слабое воздействие нейротрофического фактора на трансгенные клетки

Значительно более ощутимое воздействие нейротрофического фактора на трансгенные культуральные клетки наблюдали после повышения температуры до уровня теплового шока 37°С (температура теплового шока насекомых) Было обнаружено резкое изменение строения клеток в культуре Наблюдалось большое количество клеток с длинными отростками (более 50%), похожими на отростки нервных клеток насекомых (рис 10)

Рис 10. Культура клеток дрозофилы, 1'ис 11, Органополобные структуры и несущих ген после культуре клеток дрозофилы, несущих ген

температурного воздействии 37°С после температурного воздействия 37"С

Клетки в модифицированной культуре теряли способность делиться. После обработки температурой теплового шока контрольной культуры клеток дрозофилы появление такого типа клеток не наблюдалось (или около 5%). Также в исследуемой культуре трансгенных клеток были обнаружены характерные округлые клеточные скопления. Тела клеток располагались по краям, в то время как отростки занимали внутреннюю часть скопления. Такая структура напоминает строение нервного ганглия беспозвоночных, где тела нейронов расположены на наружной поверхности, а переплетение отроегков - нейропиль с Синаптокомплексами, внутри ганглия. Таким образом, температурное воздействие, активирующее ген не только стимулирует дифференцировку клеток дрозофилы в нейральном направлении, но и провоцирует образование органотипических структур, сходных с эмбриональным головным мозгом дрозофилы (рис 11).

Рис. 12 Нервная клетка дрозофилы е генам человека

При длительном (6 дней) культивировании клеток трансгенной линии дрозофилы при температуре 37°С были обнаружены нервные клетки аномальной величины (5%), в контроле такого размера нервные клетки не наблюдались (рис.12).

Было установлено, что экспрессия нейротрофического фактора влияет на природу трансгенной тетки и стимулирует ее дифференцировку в нейральном направлении.

3. Влияние экспрессии неВротрофического фактора на окружающие клетки при кокульгивацни^

Фактор роста нервов является фактором, выделяемым ИЗ клеток в межклеточную среду, поэтому клетки, экспрссснрующие этот фактор могут оказывать неЙротрофиое воздействие на окружающие клетки в культуре и, после трансплантации, на клетки тканей реципиента.

В экспериментах, проведенных совместно с Кафедрой отоларингологии Каролинского госпиталя (Стокгольм, Швеция) была исследована способность клеток дрозофилы, содержащих трансгены нейрогрофичсских факторов, влиять клетки оргакотвпической культуры нерп ной ткани млекопитающих in vitro. С этой целью фрагменты нейроэктодермы эмбрионов селектированных нами линий дрозофил, содержащих трансгены нейротрофических факторов, ко-культи в и ров ал и с эмбриональными спииальнымн ганглиями крыс (11-й день эмбриогенеза), которые были помечены зеленым белком, В контрольных культурах отростки нервных клеток, выходящие из слипамьного ганглия, появляются на 3-й день и позднее, При добавлении н культуру нейроэктодермы эмбриона трансгенной линии дрозофилы, содержащей геи человека, наблюдается бурный рост отростков нервных клеток спинального ганглия но направлению к ко-культи вирус мой ткани дрозофилы (рис.13,14). Этот процесс начинается уже спустя час после начала ко-культивирования.

f'nc. 13 Врастание отростков дифференцирующихся нервных клеток эмбриональных социальных ганглиев крысы в эмбриональную вейроэктодерму линии дрозофил, и геном которой бы.] введен ген g'1'if человека. Ф.иоореснен гВия микроскопия. Масштаб (1,05 мм

Рнс.14 Врастание отростков дифференцирующихся нервных клеток эмбриональны* спннальных ганглиев крысы в эмбриональную ненрожтодерму линии дрозофил, в геном которой был введен ген gdnf человека. Люминесцентная микроскопия. Масштаб 0,1 мм

Еще более четкая картина была получена

при ко-культивировании клеток эмбриональных спинальных ганглиев крысы с клетками линии дрозофилы, содержащей трансген, кодирующий бедок ВОЫР человека. Эффект сказывался гак же быстро, как и в предыдущем случае, но можно было отчетливее проследить путь нервных волокон ог клеток эмбриональных спинальных ганглиев к нейроэктодерме или к фрагменту трансгенного эмбриона дрозофилы. В некоторых случаях видно как эти волокна «окутывают» фрагмент эмбриона дрозофилы (рис. 15).

Рнс.15 Нервные волокна эмбрионального спинального ганглия крысы образованные в определенном направлении (в сторону эмбриона дрозофилы эксвресенрующего ЬЛп/). Масштаб 0,1 мм

Несколько менее отчетлив эффект клеток дрозофилы линии, несущей ген, кодирующий фактор роста нервов (ЫСИ). В этом аду чае дифференцировка эмбриональных нейральных элементов епидального ганглия крысы начинается под влиянием не йроэкто дермы дрозофилы так же ра[ю, однако рост отроегков нервных клеток не столь интенсивен, как в случае ЕШЫР (рис. 16).

Поскольку положительный эффект наблюдался во всех случаях, можно было

предположить, чго он обусловлен неепецифяческим эффектом ткани дрозофилы и не

связан с явлением трансгеноза. Однако в контрольных экспериментах, когда ткань

эмбриональных спинальных ганглиев (меченных красным белком) крысы ко-

культивировали с нейроэктодермой «нативных» линий дрозофилы без грансгсна, эффекта

не наблюдалось,

Рис.16 Рост аксонов дифференцирующихся нервных клеток эмбриональных спинальных ганглиев крысы ио направлению к нейроэктодерме эмбриона дрозофилы, не су шеи ген пц}. Флюоресцентная микроскопия. Масштаб 0,1 мм

Различия в эффекте клеток, несущих ВЭИР и N0?, возможно, связаны с тем, что первый стимулирует дифференцировку в первую очередь

проприоиептивных нейронов, а второй - ноцицептивных.

Нельзя не отметить и то обстоятельство, что опыты по ко-культивированию продемонстрировали выраженное родство нервных тканей даже у столь отдаленных таксонов как насекомые и млекопитающие Нейробласты дрозофилы мигрировали в эмбриональный спинальный ганглий крысы.

Па основании изложенных результатов можно сделать вывод, что экспрессия нейрогрофического фактора млекопитающих не только влияет на дифференцировку трансгенных клеток, но и меняет свойства других клеток, находящихся в непосредственной близости от них. Показано, что нейротрофический фактор, высвобождаясь в среду, стимулирует образование отростков у окружающих нервных клеток.

Известно, что при культивации эмбрионального шинального ганглия крысы, отростки появляются на третьи сутки и имеют звездчатую структуру. При добавлении в среду нейротрофических факторов, отростки образуются значительно быстрее, но имеют также звездчатую структуру (т.е. не имеют направленности). В данной работе была опробована новая модель для тестирования стимуляции образования отростков эмбрионального спинального ганглия в определенном направлении (по градиенту концентрации). Данная модель может быть использована в дальнейших экспериментах по исследованию факторов, стимулирующих направленный рост нервных волокон.

Непосредственно в нашей лаборатории был повторен данный эксперимент, с целью изучить изменение в стимуляции при увеличении расстояния между спинальньгм ганглием и эмбриональной тканью дрозофилы, экспрессирующей нейротрофический фактор. Было обнаружено, что при увеличении расстояния между исследуемыми объектами уменьшается количество образующихся отростков, однако, даже на значительном расстоянии стимуляция все равно происходит. При этом на рисунке 17 хорошо видно, что образование отростков идет в направлении эмбриональной ткани дрозофилы, продуцирующей нейротрофический фактор.

■ " . * .

, '¿е' \ . / ■■-

* ¿N . ,* 1

Рис.17 Ко-культивация спинального ганглия новорожденной крысы н нервной ткани »1 Ориона дрозофилы, экспрессирующей Ьйп(, Масштаб 50 микрометров

4. lijHHinie нейрозктодермы грансгеииых линий на окружающие клетки при ксенотрансплаитацнн.

Возможность выделения трансгенных нейротрофических факторов из трансфицированных клеток в окружающую среду делает логичным эксперименты по выявлению влияния клеток трансгенных линий дрозофилы на окружающие клетки в условиях трансплантации в мозг млекопитающих

Для этой цели мы использовали трансгенные линии дрозофилы, в геном которых введен ген человека, кодирующий глия-производный нейротрофический фактор (GDNF)

GDNF, член суперсемейства TGF-beta, известен своим трофическим влиянием на развивающиеся дофаминэргические нейроны Этот фактор предохраняет от дегенерации дофаминэргические нейроны и в мозге взрослых животных (Sauer,1995) В то же время, GDNF оказывает трофическое влияние и на другие популяции нейронов мозга Его введение в желудочки или паренхиму мозга у животных после ишемии способствует восстановлению дегенерирующих нейронов неокортекса (Wang, 1997)

Целью экспериментов было исследование приживления и развития ксенотрансплантатов нейральных закладок дрозофилы линии C3-\M{gdnj) при их котрансплантации с тканью неокортекса крысиных эмбрионов в мозг взрослых крыс и влияния клеток дрозофилы, экспрессирующих глияпроизводный трофический фактор (GDNF), на приживление и рост контрансплантируемого аллотарнсплантанта

Было исследовано влияние эмбриональных, нервных клеток линии Ci-XMigdnf) на аллотрансплантат мозга крыс при совместной трансплантации Для этого было выделено две группы крыс В затылочную кору мозга первой (контрольной) группы крыс трансплантировали неокортекс 15-ти дневных крысиных эмбрионов (Э-15) Животным второй группы в затылочную кору мозга вводили котрансплантат неокортикальной ткани от эмбрионов Э-15 с нейральной закладкой дрозофилы линии СЗ-1М(gdnj) В качестве маркерного гена в клетках линии C3-lM(gafa/) содержался ген lacZ Животных первой и второй групп фиксировали через 33 дня после операции

Во всех случаях в мозге крыс первой и второй группы были обнаружены трансплантированные ткани Ксенотрансплантируемые клетки дрозофилы во второй группе были легко идентифицируемы Иммуногистохимическая реакция на lacZ, проведенная на срезах мозга, подтвердила наличие вставки Методом гибридизации in situ на срезах было установлено, что белок GDNF синтезируется в эмбриональных, нервных клетках дрозофилы при их совместной трансплантации с неокортексом 15-ти дневных крысиных эмбрионов в мозг взрослых крыс (рис 18) Нервные клетки дрозофилы при трансплантации в мозг не только не погибают, но и образуют отростки, направленные к клеткам мозга реципиента

У первой (контрольной) группы животных трансплантаты были небольших размеров и имели нормальную плотность васкуляризации. Ткань трансплантатов состояла из компартмектов нервных клеток, которые объединялись гпиальньайи образованиями. Во второй (опытной) группе крыс ткань котрапеплантатов была пронизана множеством сосудов, плотность которых была много выше (более, чем в 2 раза), чем в контроле. Выраженной иммунной реакции не наблюдалось. Котрансплантаты состояли из крупных участков, содержащих нейроны эмбрионального крысиного мозга, связанных глиальными мостами, среди которых располагались группы клеток нейральных закладок дрозофилы. Большинство клеток дрозофилы (5-6 мкм в диаметре), красящихся на ¡ас2. были вполне

жизнеспособны, хотя часть проявляла признаки дегенерации. А * • * '

ш шетшт

Рис 18. Результаты в м муногнетохн ч и ческого исследования срезов мозга крыс, трансгыантнронянных клетками трансгенной липни мух гомозиготных по человеческому гену GDNF а иммуногистохимическая реакция на iacZ, б. in situ гибридизация с биотиновым Д1 I К-зондом к гену gdnf. Масштаб 20 микрометров

Клетки дрозофилы никогда не отделялись от остальных тканей глиальиым барьером, а

напротив, чзето наблюдалось множественное образование отростков между нейронами

эмбрионального крысиного мозга и клетками иейральиой закладки дрозофилы (рис. 19).

Рве 19, fi.m я мне ксенотрансплантата эмбриональной, периной * ' "л ткани дрозофилы на развитие гом о трансплантата п мозге Ч^ взрослой крысы. Наблюдается торможение формирования

К

ШШШШШШЖ 5

рубцовон тканн на границе зранеплантат/ткань хозяина (стрелка} при аобав-ченнв к томотраневлангату эмбриональной, и ер ив ой тканн дрозофилы. Масштаб 20 микрометров

Нммуногистохимическое исследование срезов мозга крыс из первой (контрольной) группы показало наличие четко выраженного глиального рубца на границе ксенотрансплантат - ткань хозяина. При исследовании второй - опытной - группы крыс, в головной мозг которых трансплантировали неокортекс из 15-ти дневных крысиных эмбрионов вмеете с эмбриональными, нервными клетками дрозофилы линии СЗ-1М(§с/яЛ было обнаружено значительные отличия. Было обнаружено отсутствие образования глиальногб рубца на границе ткани реципиента с трансплантатом, при этом наличие эмбриональных, нервных клеток дрозофилы в ксенотраисплантате было подтверждено 18

иммуногистохимической реакцией иа маркер lacZ, а экспрессия gdnf человека -гибридизацией in situ (рис 19)

Полученные результаты свидетельствуют об успешном развитии котрансплантатов, состоящих из эмбриональных клеток неокортекса крыс и нейральных закладок дрозофилы, экспрессирующих GDNF, при их пересадке в мозг взрослых млекопитающих В мозге реципиентов с котрансплантатами не наблюдалась иммунная реакция Морфологическое изучение показало, что в случаях котрансплантации наблюдается усиление роста трансплантированных неокортикальных эмбриональных тканей Вероятно, хорошее приживление эмбриональных тканей происходит под влиянием трофического воздействия GDNF, выделяемого клетками дрозофилы Это предположение подтверждается литературными данными, говорящими о том, что GDNF улучшает приживление трансплантатов дофаминэргических клеток и клеток спинного мозга (Trok,1996, Price, 1996) Можно предполагать, что хорошее приживление и нормальный размер трансплантата может быть отражением нейропротективной функции GDNF, в результате чего сохраняется значительная часть клеток, которые погибли бы в результате некроза или путем апоптоза Котрансплантаты отличались тем, что содержали множество крупных сосудов, не типичных для окружающих трансплантат тканей Вероято, глиальный нейротрофический фактор может влиять и на развитие сосудов, способствуя их усиленному росту

Наше исследование показало также, что ткани нейральных закладок дрозофилы не отделяются от окружающих крысиных клеток глиальным барьером Более того, видны тесные сплетения нервных отростков клеток дрозофилы и клеток крысы, свидетельствующие об отсутствии межвидового антагонизма, хотя их природа не совсем понятна По морфологическим критериям, значительная часть клеток нейральных закладок дрозофилы сохраняется в жизнеспособном состоянии в течение двух недель, с последующим уменьшением количества нервных клеток дрозофилы в ксенотрансплантате При этом клетки экспрессируют тирозингидроксилазу при всех исследованных сроках переживания экспериментальных животных - до 1 месяца

Известно, что в эмбриональной коре кошек (Sawada, 2000) и в коре эмбрионов и ранних постнатальных крыс (Chun, 1987) имеется популяция временно существующих дофаминэргических (DA) нейронов, которые отсутствуют у взрослых животных При этом неизвестно, какие факторы влияют на специфику развития данной популяции кортикальных нейронов Результаты настоящего исследования позволяют высказать предположение, что одним из факторов, ответственных за судьбу транзиторных DA в неокортексе может быть GDNF В пользу этого свидетельствовало наличие большого

числа DA нейронов в контрольных трансплантатах неокортекса и их отсутствие в котрансплантатах Вероятно, GDNF в котрансплантатах оказывает регулирующее действие на ход дифференцировки этой популяции нейронов, ускоряя прохождение транзиторной фазы или вообще «снимая» ее Во взрослой коре этот фактор не экспрессируется (Berger, 1985, Trupp, 1997), и поэтому DA нейроны длительно сохранялись в неокортикальных аллотрансплантатах у животных контрольной группы

Полученный нами препарат трансгенных клеток дрозофилы оказался обладающим выгодной комбинацией влияния нейротрофического фактора млекопитающих и факторов эмбриональных, нервных тканей дрозофилы на приживляемость трансплантатов Эта комбинация препятствует образованию глиалыюго рубца и улучшает приживляемость трансплантата В результате наших исследований обнаружено, что нейротрофические факторы и ряд белков, экспрессирующихся в тканях дрозофилы играют позитивную роль в блокаде образования глиального рубца вокруг ксенотрансплантата Так как при ксенотрансплантации клетки дрозофилы попадают не только в нестандартную среду, но и под воздействие нехарактерной для них температуры (37°С), можно предположить, что данный температурный барьер активирует белки теплового шока дрозофилы (Анализ воздействия белков теплового шока дрозофилы на образование рубцовой ткани будет описано в следующем разделе ) Возможно, сочетание экспрессии нейротрофического фактора с белком теплового шока дрозофилы дает самый выгодный результат при трансплантациях Именно блокада образования глиального рубца вокруг трансплантата, по всей вероятности, играет решающую роль в обеспечении лучшей его приживляемости

Из вышесказанного уже сейчас очевидно, что эмбриональные, нервные клетки дрозофилы, продуцирующие GDNF человека, блокируют пролиферацию глии и образование глиального рубца Это влияет, в свою очередь, на приживаемость трансплантата В отсутствие клеток дрозофилы, экспрессирующих GDNF, трансплантат окружается плотным глиальным рубцом, что создает условия, несовместимые с его выживанием Выделяемый нейротрофический фактор и, возможно, белок теплового шока, выделяемый клетками дрозофилы, положительно влияют на приживаемость котрансплантата, стимулируя образование связей между клетками

Количество эмбриональных, нервных клеток дрозофилы в трансплантате постепенно снижается с течением времени Через один месяц после трансплантации обнаруживаются лишь единичные клетки дрозофилы в районе введения Вероятно, это связано с тем, что клетки дрозофилы не могут долго существовать при повышенной температуре (37°С) Непродолжительность переживания клеток дрозофилы после трансплантации их в ткани млекопитающих может иметь положительное значение для применения этих клеток в

качестве носителя терапевтического фактора, так как при этом ограничивается длительность воздействия препарата и снижается вероя тность кеоплазии.

Направления развития работы

лшяшшж

влияние белка HSP70 дрозофилы на образование рубца при трансплантация* Использование 1 регулируемого [ промотора для t введения генов £ в клетей млекопитающих Введение нейральнык генов в клетки млекопитающих

5. II. I mi и и с белка теплового шока Hsp70 дро iliiJiH 11.1 на ибрнкование рубна при трансплантациях.

Как изложено выше, эмбркоиальййе, нервные «.четки дрозофилы способны переживать и дифференцироваться после их ксенотрансплантации в мозг млекопитающих. Более того, при добавлении к аллотрансплаитату эти клетки, экспрессирующие нейротрофический фактор, блокируют образование рубцовой ткани на границе трансплантат - ткань хозяина. Мы предположили, что в блокировании глнапьного рубца участвует не только трансгенный фактор, но белки, вырабатываемые непосредственно клетками дрозофилы. Поскольку при температуре тела млекопитающих клетки дрозофилы активно синтезируют белки теплового шока, имеющие важное адаптивное значение, мы предположили, что именно с этими белками связано торможение пролиферации глин и формирования рубцовой ткани.

Для подтверждения данного предположения были проведены две серии экспериментов. В первой серии в затылочную область мозга взрослых крыс трансплантировали эмбриональные, нервные клетки Drosophila melanogaster трансгенной линии Oregon, меченой геном бактериальной галактоз и дазьг lacZ. Во второй серии опытов для ксенотрансплантации использовали аналогичный материал, ко от мутантной линии ts403. утратившей способность к синтезу главного белка теплового шока Hsp70.

Через неделю после операции животных забивали, мозг фиксировали в 4% нейтральном формалине. Срезы окрашивали по Нисслго, на бактериальную галакгизидазу (Х-гал) для идентификации клеток дрозофилы, иммуногистохимически

iiii кислый глиальный фибриллярный белок (GFAP) для выявления глиальных клеток и рубцов™ ткани и на индуцируемый главный белок теплового шока для обнаружения соответствующего продукта - IIsp70,

Ксенотрансплантаты были легко идентифицированы в обеих сериях опытов гю четкой позитивной Х-гал реакции. Нервные клетки дрозофилы можно идентифицировать так же и с помощью обычной гистологической окраски крезиловым фиолетовым.

Клетки ксенотрансплантагга линии Oregon активно синтезируют белок теплового шока flsp70, о чем свидетельствует интенсивная имmyногнетохимнчейкая реакция на данный белок (рис, представлен в диссертации). Особенно сильно окрашивается периферия ксено трансплантата, где клеток дрозофилы особенно много. Также наблюдалась экстраклеточная позитивная реакция па белок теплового шока дрозофилы, демонстрирующая его секрецию клетками дрозофилы в окружающие ткани. В этой серии опытов глиальный рубоц вокруг ксенотрансплантата был значительно меньше, чем во второй серии (рнс. 20а).

Во второй серии экспериментов с мутантной линией ts403 иммуногистохимичеекая реакция ксенотрансплантата на Hsp70 белок была отрицательной, В то же время па границе коенотрансплантат - ткань хозяина формировался четко выраженный глиальный рубец (рнс. 206).

Рис. 20. Результаты гистологического исследования, а. Глиальный рубец не формируется на Гранине ксспотрансплантат клеток линии Oregon - ткань хозяина Окраска на кислый Глиальный фибриллярный белок (GFAP). б. Формирование глнапьного рубца на границе ксспотрансплантат клеток мутанта ts403 дроэофилы-ткань хозяина. Окраска на GFAP. в Клетки мутанта ts403 в ксеиотрансплантате (стрелка) Окраска крезилвиолетом. Масштаб 10 микрометров

Полученные результаты указывают на возможную роль именно белка теплового шока Hsp70 в снижении образования глиального рубца вокруг ксенотрансплантата. По всей вероятности этот процесс играет значимую роль в обеспечении лучшей приживаемости аллотрапеплантата в том случае, если он пересаживается в комбинации с

ксенотрансплантатом эмбриональных, нервных клеток дрозофилы Известно, что белок Hsp70 способен вызывать деградацию и выведение из клетки измененных белков, а также "активировать" митохондрии и препятствовать апоптозу В связи с этим его благоприятный эффект, выявленный в наших экспериментах, не является случайным Таким образом, экспрессия белка Hsp70 в трансплантируемых клетках ведет к уменьшению посггравматического глиофибриллярного рубца

6 Использование промоторно-регуляторной (п/р) области гена белка теплового шока дрозофилы (Hsp70), в качестве регуляторного элемента при введении чужеродных генов в клетки млекопитающих

Широкое распространение при лечении различных заболеваний приобретают методы клеточной и генной терапии с использованием стволовых клеток, которые обладают большим потенциалом к развитию в различных направлениях Существенное значение при этом имеет разработка способов повышения их жизнеспособности и управления путями их специализации при операциях трансплантации Для этого необходим поиск генетических регуляторных элементов, способных трансформировать стволовые клетки в направлении, нужном для успешного осуществления клеточно- и генно-терапевтического лечения Нами предлагаются регуляторные элементы генома дрозофилы, которые имеют определенные преимущества перед ретровирусными элементами в силу большей безопасности для терапевтического применения В случае удачного подбора таких элементов появляется возможность повышения эффективности генной н клеточной терапии при лечении многих заболеваний, требующих использования метода трансплантации тканей

Результаты опытов, изложенных в 2-4-х главах показали, что нейрогены, введенные в геном дрозофилы, будучи соединенными с п/р областью гена hsp70 дрозофилы активируются под влиянием теплового шока Они автоматически активируются также в ксенотрансплантатах эмбриональной, нервной ткани дрозофилы в мозгу взрослой крысы Этот факт говорит о возможности использования п/р области гена hsp70 дрозофилы для трансформации нужным генетическим материалом клеток млекопитающих и человека, подлежащих трансплантации пациентам, страдающим тем или иным неврологическим заболеванием Температура тела человека должна быть опознана промотором дрозофилы как хит-шоковая и соответственно может обусловить активацию соединенного с ним гена Для исследования функционирования этой п/р области в качестве управляющего элемента трансгенеза в клетках млекопитающих были созданы две конструкции Одна, из них, содержала флюоресцентный ген Cyan находящийся под промотором CMV, другая содержала

аналогичный ген под управлением п/р области гена Ыр70 дрозофилы. Обе конструкции были приготовлены на основе вектора рсОМЛ 3,1+ (рис.21),

а б

Е'нс*21 Схем я полученных конструкции н:] бате вектора pcl)NA3.t, содержащей ген днанового флуоресцентного бедка (CFP) под нролюгора.нн гена человеческого ннтомегало вируса (СМ V) (а) и пол при мотором hsp 70 (б).

а Cyan-ген флуоресцентного белка (CFP). Рг\п - промотор гена иитомегаловируса человека б. Cyan-ген флуоресцентного белка (CFP). hsp - promotor - промотор гена белка теплового шока Hsp7Q дрозофилы

В работе использовали эмбриональные стволовые (ЭС) клетки мыши линии RI, полученные от доктора Наги (A.Nagy, Mount Sinai Hospital, Toronto, Canada). Эти клетки были выделены из бластоцист мышей линии {129/Sv~o 129/SvJ) Fl, имеющих окраску агути. Трансфекцию ЭС клеток R1 осуществляли с помощью электропора ими Клетки R1, трансфипированные плазм идо й pSV2neo, служили контролем.

В результате получили две культуры одна из которых, должна была содержать Cyan-reft под промотором гена ни то мегало вируса человека (Pcmv), другая - аналогичный ген под контролем п/р области гена hsp 70 дрозофилы, С помощью f (озери блот-гибридизационного анализа было показано, что в клетках первой культуры синтезируется мРНК для цветного белка и, следовательно, соответствующий транс геи активируется. При исследовании трансформированных культур ЭСК па флюоресцентном микроскопе было обнаружено, что клетки, которые трансформированы геном CFP под промотором CMV, светятся голубым светом, что свидетельствует о синтезе белка в этих клетках (рис. 226).

Клетки, транефицировапные геном CFP под контролем п/р области гена hsp70 дрозофилы в обычных условиях не светятся. Однако после предварительного температурного шока, полученного прогреванием культуры ЭСК при 42°С в течение 30 минут трансформированные клетки обнаруживали выраженное голубое свечение.

В обычной ситуации, мри температуре теплового шока фактор транскрипции теплового шока (Hsf) высвобождается из комплекса HsffHsp90 млекопитающих или комплекса Hsf7Hsp83 дрозофилы, образует тример и транспортируется в таком виде в ядро, где взаимодействует с гт/р областью гена hsp70 дрозофилы и активирует промотор, В отсутствие предварительного нагревания клетки мыши, содержащие трансген СГР под контролем п/р области гена hsp70 дрозофилы, не могут синтезировать CFP, поскольку комплекс Hsf/HspyO мышей, в отличие от комплекса Hsf/Hsp83 дрозофилы, не реагирует на нормальную температуру тела млекопитающих. Воздействие температуры 42°С разрушает комплекс Hsf/Hsp90, и Hsf транспортируется в ядро. Полученные данные свидетельствует о том, что Hsf млекопитающих способен взаимодействовать с п/р областью гена hsp70 Дрозофилы и активировать стоящий под ним трансгеп, но это происходит только после нагревания клеток до температуры теплового шока млекопитающих.

с. d.

Рис 22, Флуоресценция эмбриональных стволовых клеток мыши линии

(12!>/$у~о инъецированных полученными конструкциями, а-культура клеток под

световым микроскопом, Ь-флюоресценция клеток, транефнциронанных конструкцией, несущей ген СГР под промотором СМ\', с- флюоресценция клеток, трансфицированных конструкцией, несущей ген СГР под промотором Иир70, инкубации при ЗТС, флюоресценция клеток, трансфицированных конструкцией, несущей ген СГР под промотором Изр70 инкубация при 42" С Масштаб 30 микрометров

Для решения задачи, поставленной в начале этой работы (т.е. включение промотора при температуре 37°С) нами была сделана конструкция, содержащая аналог гена И$р90 млекопитающих ген 1ир83, необходимый для активации промотора к$р?0 дрозофилы при температуре 37°С. Данная конструкция методом электропорации была введена в культуру,

содержащую ранее наеденный ген CFP под промотором hsp70 дрозофилы. LI результате была получена культура, несущая ген белка теплового шока [!s[)83 дрозофилы под CMV-вромотором, и ген CFP иод котролем п/р области гена hsp70 дрозофилы. Мы наблюдали активное свечение данной культуры при нормальной температуре культивации клеток млекопитающих, т.е. был достигнут тот эффект, которого мы добивались (рис. 23)

1'нс.23 Флуоресценции эмбриональных стволовых клеток мыши лнннп (12l>.'Sv~o !29/SvJ), инъецированных полученными конструкциями, несущими ген cfp под контролем nfp области теиа (is;>70 дрозофилы u ven hsp83 дрозофилы (инкубация при 37 С). Масштаб 30микрометров

Следовательно, регуляторная система дрозофилы, распознающая температуру теплового шока способна функционировать в клетках млекопитающих. Разработанная методика может быть использована для трансфекции стволовых и прогеюгшрных клеток млекопитающих и человека генами нейротрофических факторов и другими генами, полезными для использования в клеточной терапии.

Возможно создание в культуре стволовых клеток системы, реагирующей на температуру юла млекопитающих включением нужных трансгенов, полезных при лечении некоторых, в частности, нейродегенеративных, заболеваний.

Таким образом, в изложенных выше экспериментах была показана возможность использования n/р области гена hsp70 дрозофилы для регуляции экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих.

7. Использование полученного вектора 1Р1, содержащего н/р область гена hsp70 дрозофилы и маркерный ген gfp, в культурах клеток и в целых организмах

На основании данных результатов был получен вектор LPI для введения чужеродных генов в клетки млекопитающих под контролем нового регулируемого промотора и несущий ген флуоресцентного белка на N-конце для контроля вставки. Данный вектор обладает рядом преимуществ. Во-первых, он содержит промотор невирусной природы, что крайне выгодно при его возможном использовании в терапии. Во-вторых, экспрессию гена, находящегося под контролем данной последовательности, можно регулировать: максимально увеличить экспрессию или же выключить контролируемый ген.

Данный вектор для тестирования методом липофекции был введен о линию клеток эмбриональной почки человека НЕК 293. Для исследования функционирования введенной

конструкции трансфицированиые клетки были обработаны температурой теплового шока 42'С. В клетках человека мы наблюдали экспрессию маркерного гена не через 2-3 часа, как наблюдается у насекомых, а через 24 часа (рис.24). Свечение было активным и наблюдалось в течение двух суток. При дальнейшем изучении температурного интервала 37°С-42°С, было обнаружено, что активация промотора начинается при более низкой температуре - 39°С, что является выгодным условием использования данного промотора (39°С для млекопитающих менее травматична и не является температурой теплового шока). Через сутки было проведено повторное воздействие на культуру высокой температурой. Через 24 часа мы наблюдали вновь появившееся свечение. Таким образом, был получен новый вектор для введения чужеродных генов в клетки млекопитающих под контролем регулируемого промотора. Данный вектор можно активизировать

температурой 39°С и включение промотора может быть многократным.

Рис.24 Результаты введения вектора LP1 в линию клеток 1ILK293. Активное свечение клеток черет 24 член после

ЛИпофекцн н.

Это свойство полученной конструкции представляет большой интерес для возможного применения в генно-клеточкой терапии. Задержка экспрессии терапевтического трансгена дает время для предварительно прогретых клеток адаптироваться к условиям ткани реципиента и более эффективно наработать трансгенный белок.

Нами были предприняты попытки введения полученной конструкции в клетки первичных культур клеток человека и животных различного происхождения. В экспериментах использовались различные методы введения конструкции r клетки, такие как липофекция, эле ктро по рация или инъекция в ооциты рыб, однако оказалось, Что нелинейные клетки плохо принимают любые конструкции, медленно делятся и быстро уходят в лифференцировку при введении в них любой конструкции. Мы попробовали, что произойдет, если ввести конструкцию в смеси с реактивом для липофекции непосредственно в иеоетриатум мозга взрослой мыши.

Рис.25 Введение вектора I I'' непосредственно в мозг мыши. Масштаб 30 микрометров.

11 результате мы наблюдали внедрение конструкции с СР1> п клетки мозга, локализованные в герминативной области - субвентрикулярной зоне боковых желудочков (рие25).

Незначительное количество светящихся клеток, объясняется тем, что в мозгу взрослой мыши деление клеток происходит крайне редко. По всей видимости, конструкция встраивалась только при делении клеток. Таким образом, был обнаружен еще один способ введения конструкций в етромальные клетки, при этом маркироваться будут только гс клетки, которые делились в момент инъекции конструкции в мозг. Данный метод имеет еще один положительный момент: встраивание чужеродного гена происходит в собственные клетки реципиента, имеющие лучшие перспективы длительного переживания и интеграции в мозге, чем трансплантированные экзогенные клетки при аил о- или ксеио-трансштантации,

8. Получение конструкции для экспрессии пц/ в клетках млекопитающих

Модель, изученная на эмбриональной, нервной ткани дрозофилы во многом одна из самых удобных моделей, однако, необходимо попытаться заменить клетки дрозофилы на клетки более близкие человеку. Необходимо проверить, как будет влиять гиперэкспрессия нейротрофического фактора на окружающие клетки при ко-культивации и позволят ли трансгенные клетки столь интенсивную экспрессию введенного гена. Для анализа влияния гиперэкспрессии нейротрофического фактора на окружающие клетки при кокультивации был использован ген «^/'(фактор роста нервов млекопитающих).

Для транедукции генов нейротрофических факторов в клетки млекопитающих нами была получена генно-инженерная конструкция И' 19 на основе вектора ЕОРР-Ш, в которой ген фактора роста нервов стоит в одной рамке считывания с геном зеленого флуоресцентного белка под цитомегаловирусным промотором человека (СМ V). Контроль наличия вставки был осуществлен методом блот-гибридизации по Саузерну. Секвинирование участка полилинкера показало наличие последовательност и гена фактора роста нервов млекопитающих. Для анализа активации гена в клетках данная

конструкция была трансфицирована в эмбриональные стволовые клетки мыши линии {!29/5\'~о 1,29/ЗуЗ) методом электропорации. А также конструкция ЬР19 была трансфицирована в клетки линии 11ЕК293 (линия эмбриональных клеток почки чело«ска), методом липофекции. (Рис, 26)

Наличие экспрессии >1%/' и линии ЕЙ и в НЕК293 проверяли с помощью метода блот-гибридизации но Позсрпу (Рис. 27).

1 2 3 4 5

оказался различным. У контрольных эмбриональных стволовых клеток мыши была обнаружена экспрессия собственного ><£/'. В то же время экспрессия этого фактора н трансгенной линии была гораздо более ярко выражения. Нозерн-блот гибридизация показала наличие в этих клетках двух мРНК различной подвижности. Одна из них соответствовала собственно хозяйской, тогда как другая была значительно тяжелее. Данный результат объясняется тем, что трансфицированные клетки кроме РНК нормального фактора содержат РНК химерного белка, л состав которого кроме фактора входит «зеленый хвост», который утяжеляет молекулу. Таким образом, трансгенные клетки содержат помимо собственного NGF также химерный белок ЫОР. Клетки линии НЕК293 не содержат собственного белка, тогда как трансгенная линия обладала белком ожидаемой подвижности. В результате для дальнейшего исследования была использована трансгенная линия НЕК293.

Была проведена имуноцитохнмическая окраска полученной линии антителами к N0?, в результате которой были обнаружены - позитивные клетки. Это свидетельствует о наличии белка ЙОГ в трансфицированных клетках. Для выявления белка использовали

Рис. 26 Конструкция 1.Р19 в лнннн НЕК 293.

Спечение зеленого флуоресцентного белка в культуре клеток с ЬР19 (№Р-СРР)

Рис. 27 Блот-гнбрнднзация но Позерку конструкции ЬР!9 в Пек 293 и 1 N (щГннминщии на фрагмент М. [ I

!- РНК из клеток линии Е5, трансфиаировавных ЬР!9

2- РНК из клеток линии Й5, трансфицированных ЕвРР-Н!

3- РНК из клеток линии Е5

4- РНК из клеток линии НЕК293

5- РНК из клеток линии НЕЮ 93, трансфици рованных 1-Р19

Результат Нозерн-блог гибридизации для линий Ев и НЕК293

антитела фирмы R&D и вторичные антитела меченые флуоресцентным красителем Texas red. Клеточную культуру рассматривали иод флуоресцентным микроскопом при освещении зеленым светом через красный светофильтр. Ядра клеток были покрашены с помощью биебензимида (Hoechst 33342). (Рис, 28)

Рис. 28 Ииу и о ц ито х и м и ч е с кап окраска

линии tick 293/ LP3T.

Окраска на антитела NGP, ядра клеток покрашены бисбензимидом

Таким образом, была получена линия Нск293, продуцирующая трансгенный белок NOP,

9. Изучение влияния гиперэкспрессии ngf при ко-культи вацн и.

В дальнейших экспериментах было исследовано влияние выделяемого траисфициронаиными клетками нсйрогрофнческого фактора па другие клетки, находящиеся п соседстве с трансгенными.

Рнс.29 Ко-культн нация снинального ганглия крысы с трамсгенвой ливней НЕК293, экспрессиругсщей /<£/". Масштаб 100 микрометров.

В этих экспериментах была исследована способность клеток линии НЕК293, содержащих трансгены нейротрофи чески х факторов, влиять на нервные клетки млекопитающих тканеспецифическоЙ культуры млекопи тающих. С этой целью колонии селектированной нами трансгенной по линии Н!-«293, ко-культивировали с эмбриональными сиинальпыми ганглиями плода человека (11-я неделя эмбриогенеза), Трансгенние колонии НЕК293 были помечены зеленым белком. В контрольных культурах отростки нервных клеток появляются на 3-й день и позднее. При добавлении в культуру колоний клеток трансгенной линии, содержащей ген мыши, наблюдается бурная реакция клеток спинального ганглия, выражающаяся в интенсивном росте отростков нервныл клеток но направлению к ко-культивируемой колонии трансгенной линии (рис.29).

Было обнаружено, что нейротрофнчесий фактор, высвобождаясь в среду, стимулирует образование отростков ко-культивируемых нервных клеток Таким образом, была получена еще одна модель стимуляции образования отростков эмбриональных, нервных клеток в определенном направлении Также как и предыдущая модель, она представляет интерес в связи с частой необходимостью выращивания нервных отростков в определенном заданном направлении Однако в данном протоколе не используются чужеродные для млекопитающих клетки-носители нейротрофического фактора Второй вариант модели имеет и свои недостатки, так как, не являясь чужеродными для тканей человека, клетки линии НЕК293 не исчезают со временем Поэтому данный подход может использоваться, когда появляется необходимость в постоянной поставке недостающего нейротрофического фактора или другого белка Таким образом, оба протокола имеют право на существование при различных целях При нейродегенеративных заболеваниях может появиться необходимость, как в том, так и в другом подходе В одних случаях нужно кратковременно стимулировать дифференцировку клеток трансплантата, в других -восстановить продукцию недостающего белка

10 Получение конструкции для экспрессии gdnf в клетках млекопитающих

В изложенных выше экспериментах было показано позитивное влияние эмбриональных, нервных клеток дрозофилы, продуцирующих СБЫТ человека, на процессы постгравматического заживления в мозге млекопитающих В дальнейших экспериментах мы исследовали влияние трансдукции гена этого фактора в линейные клетки человека на трансфицированные клетки и их окружение при кокультивации Для данной работы была получена конструкция Ьр14 Генно-инженерная конструкция для введения человеческого гена gdnf была синтезирована на основе вектора рЕОГР-Ш, содержащего СМУ промотор и маркерный ген флуоресцентного белка ОРР (зеленый) на N конце В этот вектор был встроен нейральный человеческий ген gdnf В результате была получена конструкция размером в 5,3 кЬ несущая гены gdnf и под общим СМУ промотором

Клетки НЕК293 были трансфицированы плазмидой Ьр14, содержащей химерный ген gdnf/gfp и ген устойчивости к неомицину (пео) Для получения стабильно трансфицированных клеток проводили селекцию на среде содержащей неомицин (500 мкг/мл) Наблюдалось активное флуоресцентное свечение зеленого белка в культурах (рис 30)

рве. 30 Наблюдаемое свечение зеленого флуоресцентного белка в линии HEK29J носле введения конструкции LPI4 (gdnf/gfp).

Анализ полученных культур проводили методом Саузерн-блот анализа (рис.31). Для дальнейшей работы были отобраны клоны, полученные путем независимом трансформации, содержащие химерный ген gdnf/gfp по данным Саузерн-блот анализа и по активности свечения.

1 2 3 4 5 6

рис. 31 Сяузерн- блот гибридизации линии эмбриональных почечных клеток человека (НЕК293), несущей химерный ген gdnf/gfp. 1-6 ДНК' выделив паи нз клеток различных клонов и о. ¡ученных после трансфекцни плазм и дон несущей gihif и огоПранных на (i-41S.

Для проверки нормальной транскрипции РНК был проведен Нозерн-блот анализ. Анализ показал, что геи нормально работает в отобранных клонах, полученных после транефёкции плазмидой несущем £[1п/ и отобранных на 0-418.(рис. 32)

рнс. 32 Нозерн-блот гибридизация с РНК' нз клеток лииии эмбриональных почечных клеток человека ___ (НЕК293), несущих химерный ген К-

• ЛШЛ. контроль (исходные клетки). 3-5-выбранные варианты

ЦI ^^^^ культур, содержащих конструкцию 1.1* 14.

Наличие нужной вставки в плазмиде 1.Р14 было также подтверждено с помощью секвиннрования. При сравнении полученной последовательности с последовательностями, имеющимися в базе (жпеВапк, было установлено, что вставка соответствует гену Синтез химерного белка ОПЫГ-ЕСРР клетками,

трансфицированными 1,р14, был подтвержден при помощи Вестерн-блот гибридизации (рнс.ЗЗ).

М\\'. кЛз

1'ис.ЗЗ Вестерн-блот гибридизация. I - лизат клеток линии МЕК293. трансфицировал и ых pEGFP-N \, 2 — лизат клеток линии НЕК293, трапсфипированных Lp 14. Цнфрши отмечены молекулярные массы белков, входящих в состав маркера

Полоса, присутствующая на дорожке 1 рис.3.6, соответствует молекулярной массе 34,5 кДа, а полосы, прел ставленные на дорожке 2 - молекулярным массам 34.5 и 58,4 кДа, Можно сделать вывод, что в клетках линии IIEK293 экепрессируется собственный GDNF, имеющий молекулярную массу 34,5 кДа, что согласуется с литературными данными (Lin, 1993). Однако крайне незначительное количество собственного белка можно приравнять к следовому. Полоса с массой 58,4 кДа соответствует химерному белку GDNF-EGFP, который экепрессируется с введенной конструкции Lp]4. Также можно заключить, что концентрация химерного белка GDNF/GFP превышает концентрацию GDNF, 11. Исследование влияния гиперпродукции белка GDNF на трансгенные клетки Для изучения влияния гиперэкспрессии gdnf на клетки конструкция, содержащая химерный ген gdnfi'gfp, была введена методом липофекции в культуру фетальных, нервных клеток мозга человека (культура любезно предоставлена исследовательской фирмой ИРИКГ). Наблюдалось активное образование отростков у нервных клеток, что говорит о стимуляции дифференцнровки трансгенным белком GDNF в культуре (рис 34).

Все клетки, получившие химерный ген gdnf/gfp, дифференцировались в нейральном направлении, при этом клетки теряли способность к делению.

■ V

V.

I'hc.34 Фета ль h ыс нервные клетки мозга человека, содержащие химерный белок GDNF/GFP, Масштаб 50 микрометров

Культура была проанализирована на нейрональные маркеры, маркеры стволовых нейральных клеток. Также была проведена окраска на белок ОПЫР и глиальный фибриллярный кислый белок (рис,35,3б).

Остальные, нервные клетки мозга человека.

Окраска на нейрон-специфическую iHo.iaiy

Фстальиые, нервные клетки мозга человека Окраска на нестин

рвС.35 Специфические окраски полученной трансгенной культуры феталъиых, нервны* клеток человека, гнперэксврессирующих gdnf, Масштаб 50 микрометров

К 4 ki

i

Ik. •

Фетальные, нервные клетки мозга человека. Специфическая окраска на GDNF

нервные фетальные клетки мозга человека.

Окраска на GFAP -гпиальный фибриллярный кислый белок..

рис.36 Специфические окраски полученной трансгенной культуры фетальных, нервных клеток человека, гнлерэкс премирующих gdnf. Масштаб 50 микрометров.

Было обнаружено, что GDNE влияет на дифференцнровку трансгенных клеток в нейральном направлении. Данный результат выглядит достаточно привлекательным, если использовать регулируемый промотор при введении нейротрофичеекого фактора. При трансплантации появится возможность активировать нейротрофичеекий фактор непосредственно уже в мозгу и стимулировать дифферепцировку трансплантата в нейральном направлении.

Также конструкция, содержащая gdnf, была введена в эмбриональные стволовые клетки мыши линии (129/Sv-o 129/SvJ). Для этого клетки вышеупомянутой линии мышей трап сф и пировал и Lpl 4 (опыт) и pEGFP-N I (контроль). Экспрессию EGEP и химерного белка GDNF-GFP детектировали через 48-72 часа по зеленому свечению клеток. При культивации в присутствии G418 (200 мкг/мл) были получены стабильно трапсфицировапные клетки. Для подтверждения экспрессии введенного гена gdnf клетками линии RI использовали метод Нозерн - блот гибридизации. Получали

эмбриоидные тела, при культивировании которых в отсутствии фидера и LIF наблюдали дифференцировку клеток. При окрашивании клеток па |ЯИ-губулип была заметна разница в окрашивании контрольных и опытных препаратов. И в контроле и в опыте наблюдали дифференцирующиеся клетки пейралыюго типа. Однако в контроле такие клетки единичны. В Опытных клетках с введенным химерный геном gdnf/gfp, напротив, наблюдалось преобладание дифференцирующихся клеток с многочисленными короткими отростками и одним длинным отростком, по-видимому, аксоном. Таким образом, в этих экспериментах отчетливо проявляется стимулирующее влияние трансгсиа на дифференцировку стволовых и прогениторных клеток мозга плода человека.

Однако, данные типы клеточных культур не подходили для изучения влияния трапегенного GDNF на образования нервных отростков in vivo и in vitro, в связи с наличием собственного GDNF. Для дальнейших исследований были использованы клетки линии НЕК293, не показавшие значительного синтеза собственного белка.

12. Изучение влияния i иперэкспрессни gdnf ври ко-ку льтинации

Рис. 37 Ко-культнваиня фрагмента зачатка спинного мозга эмбриона человека с клетками трансгеаяоМ лнннн 11 ii К29 J, экс премирующей gdnf. Масштаб SO микрометров

Были проведены эксперименты по проверке способности клеток трансгенной линии НВК293, экспрессирующей неиротрофическии фактор, стимулировать образование нейральных отростков в уже практически готовой и дифференцированной нервной структуре, которая была предварительно повреждена. С этой целью клетки трансгенной линии, продуцирующей нейротрофический фактор ко-ку л ьти в провал и с фрагментом зачатка спинного мозга эмбриона человека. В контрольных культурах нейральные отростки не появлялись. При добавлении в культуру клеток, экспрессирукмцих gdnf человека, наблюдается активное образование нервных отростков прорастающих по направлению к ко-культивируемым клеткам 'фане геи ной линии (рис. 37). Этот процесс начинается уже и течение первых суток от начала ко-культивирования.

Таким образом, было обнаружено, что Экспрессия неиротрофического фактора gdnj не только способствует дифференцировке эмбриональных стволовых клеток, но и стимулирует образование нервных отростков у уже сформировавшихся, но травмированных нервных образований.

Данный результат может быть использован в клинике, так как очень часто появляется необходимость в образовании новых нейральных отростков у поврежденных нервных структур (например, при повреждении нервов конечностей или при спинномозговых повреждениях)

13 Изучение влияния гиперэкспрессин gdnf на образование глиалыюй ткани при трансплантациях

Для экспериментов на животных также была использована конструкция Lpl4, содержащая ген химерного белка GDNF/GFP, экспрессия которого была подтверждена иммуногистохимически Клетки трансплантировали взрослым (2 мес) мышам линии СБА В мозг животных подопытных групп вводили клетки, продуцирующие химерный белок GDNF/GFP, а животным контрольных групп - клетки, содержащие белок GFP (рис 37) Анализ проводили через 6, 14 и 18 дней Срезы окрашивали иммуногистохимически на маркеры рубцовой ткани с помощью антител на глиальный кислый фибриллярный белок (GFAP) в разведении 1 100 (Sigma), актин, фибронектин, коллаген типа IV После обработки в растворе первичных антител срезы промывали в фосфатном буфере и помещали в раствор вторичных антител, конъюгированных с флуоресцентными красителями Наиболее ощутимые результаты наблюдались через 18 дней после трансплантации клеток

Во всех случаях на срезах переднего мозга были найдены клетки, содержащие GFP Клетки располагались плотной группой в средней части полосатого тела Иногда область инъекции затрагивала также и дорзальную часть обонятельных бугорков Сколько-нибудь значительной миграции трансплантированных клеток из места введения не наблюдали Были найдены лишь единичные клетки, расположенные в более чем 50 миркометрах от границы трансплантата Во всех экспериментах наблюдали глиальную реакцию в ткани мозга реципиента, непосредственно примыкающей к области инъекции Глиальная реакция представляла увеличение количества клеток, экспрессирующих GFAP (глиальный кислый фибриллярный белок является маркером астроцитов, которые в первую очередь участвуют в формировании глиального рубца) а также увеличение экспрессии фибронектина и коллагена типа IV У животных контрольных групп, в мозг которых были трансплантированы клетки, не содержащие трансгенного белка GDNF, глиальная реакция существенно нарастала с течением времени У животных опытных групп, получивших трансплантаты, содержащие трангенный GDNF, не наблюдали существенного нарастания глиальной реакции Таким образом, в эксперименте (через 18 дней после трансплантации) глиальная реакция в контрольной группе намного превышала реакцию в опытной группе (рис 38)

контроль

СР___Гп С РЛ Р С РР+Рп+СГАР

' ш ' ■

4 "у.':'.

Опыт (ОБМ^

Рис.38 Травс илявтя п н и клеток НЕК 293, содержащих (СВРЯТЫТ), п полосатое тело

моп а крысы (13 суток после трансплантации). Масштаб 50 микрометров.

Обнаружено, что при трансплантации в полосатое тело клеток линии НЕК293, экспрсссирукэщи!; химерный белок (ЮЫР/СгРР. количество астроцитов. участвующих в образования глиальиого рубца, значительно меньше, чем при трансплантации клеток той же линии, экспрсссирующих ОРР. Также в опыте по сравнению с контролем образуется меньше ассоциированного с рубцом внеклеточного матрикса. выявляемого окраской на фибр о пектин, коллаген типа IV и актин.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности переживания в мозгу мышей реципиентов клеток линии НЕК293, содержащих чужеродные гены (18 дней), причем их количество в трансплантате не уменьшалось. Отсутствие миграции трансплантированных клеток может быть следствием значительных фенотипических различий между трансат актированными клетками человека линии НЕК293 и окружающей тканью мозга реципиента. Не найдено также признаков трансформации фенотипа трансплантированных клеток в мозгу реципиента.

В данной работе было получено подтверждение нейропрогективного действия белка 00№. Несмотря на отсутствие нейральных отростков между трансплантированными клетками и мозгом реципиента (в связи с чужеродностью эмбриональных почечных клеток в мозговом окружении), выделяемый клетками трансгенный СОЫР оказывает зрофическое влияние на окружающую ткань. Это влияние может проявляться в уменьшении гибели клеток, обусловленной травмированием мозга инъекционной иглой и сдавленней ткани от введения массы чужеродных клеток. Также

было обнаружено значительное снижение образования глиального рубца (см таблицу в диссертации) Результаты подтверждают перспективность применения клеток млекопитающих, продуцирующих ОООТ в качестве нейропротектора в тканевой терапии

Однако, совокупность результатов предыдущих экспериментов позволяет предположить что оптимальным вариантом факторов для предотвращения образования глиального рубца при трансплантациях, является сочетание белка теплового шока и нейротрофического фактора

Обсуждение

Открытие стволовых клеток в нервной ткани стало важным событием в современной неврологии Оно вызвало переоценку целого ряда устоявшихся представлений, особенно для восстановительных процессов в центральной нервной системе Стволовая клетка в нервной ткани характеризуется теми же основными свойствами, что и стволовая клетка вообще, а именно сохранением способности к делению, которая утрачивается на стации нейробласга, и плюрипотенгностью, т е возможностью дифференцироваться в различных направлениях (вероятно не только в нейральном) Стволовые нервные клетки можно идентифицировать по молекулярным маркерам, которые отражают последовательные стадии их развития это нестин -для стволовой клетки, виментин - для клетки-предшественника, бета-тубулин - для нейробласта, СБ АР (кислый глиальный фибриллярный белок) - для клетки, развивающейся по глиальному направлению и ряд других маркеров Наличие таких маркеров позволило выявить популяционную гетерогенность стволовых клеток Например, типичное процентное распределение специфических иммуногистохимических маркеров в популяции фетальных стволовых нервных клеток человека следующее нестин - 43,1 %, виментин - 63,2 %, бета-тубулин - 70,1 %, вРАР - 3,2 %, КГСАМ - 12,0 %, С034 -1,3 %, СБ45 - 0,5 % Подобная гетерогенность в какой-то степени определяет специфику реакции стволовых клеток на различного рода внешние воздействия - в частности, изменение соотношения клеток с различным потенциалом отражается на характере их дифференцировки при попадании в различную микросреду Например, повышенное содержание нестин-содержащих клеток будет способствовать повышению эффективности воздействия микроокружения на их дифференцировку Кроме того, программа дифференцировки стволовых нервных клеток достаточно консервативна для разных таксонов, например, стволовые клетки человека способны мигрировать и развиваться в случае их трансплантации в мозг крысы

Одной из задач работы являлся поиск генетического способа управления дифференцировкой нейральных стволовых клеток в условиях их культивирования и трансплантации Эта проблема важна в теоретическом плане, поскольку приближает нас к

пониманию сущности клеточной дифференцировки Кроме того, решение этой проблемы важно для прикладных работ, поскольку позволит получать популяции клеток, дифференцирующихся в нужном для клеточной терапии направлении (Корочкин, 2002)

Существуют три способа воздействия на дифференцировку клеток в культуре ткани 1 -добавление кондиционной среды, 2 - добавление к культуральной среде активирующих специфическую дифференцировку факторов, и 3 - трансфекция культивируемых клеток генами, которые кодируют факторы, индуцирующие клеточную дифференцировку В случае нервной ткани этими факторами являются нейротрофические факторы (Perez-Navarro,2000, Тпаса,2003)

В данной работе детально изучается третий способ воздействия Критическое значение для экспрессии трансфицированного гена имеет правильный выбор промотора Желательно, чтобы он был регулируемым, например, мог бы активироваться при температуре тела человека или активироваться только при более высокой тепературе не выходящей за физиологические пределы

При создании наших базовых генетических конструкций в качестве управляющего элемента мы применили п/р область гена hsp70 дрозофилы В приведенных выше исследованиях нами были выяснены основные вопросы, касающиеся функционирования полученных нами конструкций, содержащих нейротрофические факторы под контролем упомянутой п/р области в клетках и тканях дрозофилы и млекопитающих, включая человека

При исследовашти полученных нами трансгенных линий дрозофилы, содержащих гены нейротрофических факторов человека - NGF, GDNF и BDNF под контролем п/р области гена hsp70 дрозофилы бьио показано, что нейротрофические гены млекопитающих экспрессируются в тканях дрозофилы находясь под неродственным промотором Как и предполагалось, экспрессия данных генов оказалась температурно-зависимой Полученные трансгенные линии дрозофилы характеризуются высокой транскрипционной активностью человеческих генов gdnf, ngf и bdnf в условиях теплового шока - при 37°С Наличие экспрессии чужеродных белков подтверждена гибридизацией in situ, методом иммуноблотинга (Reinshagen, 2000) Действие этих белков на окружающие клетки и ткани исследованы при трансплантации клеток дрозофилы в мтог крыс и при кокультивации их с клетками и органотипическими культурами нервных тканей животных и человека В этих экспериментах во фрагментах эмбриональной эктодермы трансгенных линий дрозофилы активировался синтез трансдуцированных нейротрофических факторов и маркерных белков, обусловленный температурным воздействием среды по сути хит-шоковым для тканей насекомых Продуцируемые факторы оказывали нейротрофное воздействие на окружающие ткани млекопитающих

В результате исследований по ко-культивации, была получена модель, в которой эмбриональные, нервные клетки дрозофилы, будучи источниками синтеза нейротрофического фактора, стимулируют рост нейральных отростков у ко-культивированных эмбриональных, нервных клеток в строго заданном направлении Интересно, что волокна млекопитающих не просто росли, но и вступали в контакт с нейральными тканями такого отдаленного таксона как дрозофила. Разработанная экспериментальная модель может быть полезна для дальнейших исследований действия трансдуцированных белковых факторов и сигнальных молекул на ткани и клетки подопытных животных и человека.

Опыты с ксенотрансплантацией в мозг крысы нейральной ткани эмбриона трансгенной дрозофилы линии СЗ-1М в смеси с нервной тканью эмбриона крысы

показали, что экспрессирующийся в ткани мухи тарнсдуцированный фактор выделяется в окружающюю ткань и оказывает трофическое воздействие на ткань реципиентного мозга и котрансплантированные фетальные клетки крыс Полученные результаты свидетельствуют об успешном развитии котрансплантатов, состоящих из эмбриональных клеток неокортекса крыс и нейральных закладок дрозофилы, экспрессирующих СГЖГ, при их пересадке в мозг взрослых млекопитающих

Морфологическое изучение показало, что в случаях такой ко-трансплантации наблюдается хорошая приживляемость трансплантата и резкое снижение гибели ко-трансплантированных фетальных клеток крыс Хорошая выживаемость клеток трансплантата может быть отражением нейропротективной функции выделяемого тканью мухи СПЫР, в результате чего сохраняется значительная часть тех клеток, которые погибли бы вследствие апоптоза Помимо хорошей выживаемости ко-трансплантаты отличались тем, что содержали множество крупных сосудов, не типичных для окружающего трансплантат неокортекса крысы Интересно отметить, что такой интенсивной васкуляризации не наблюдается в обычных аллотрансплангатах фетальной, нервной ткани в кору крыс На этом основании можно предположить, что ангиогенный эффект обусловлен присутствием в трансплантате ксеногенной ткани дрозофилы Усиленную васкуляризацию могут вызывать факторы, выделяемые ксеногенными клетками, в том числе возможно и трансдуцированный СОЫР

Было показало, что ткани трансгенных нейральных закладок дрозофилы не отделяются от окружающих крысиных клеток глиальным барьером Более того, в ряде случаев видны тесные межклеточные взаимодействия, свидетельствующие об отсутствии межвидового антогонизма, хотя их природа не совсем понятна По морфологическим критериям значительная часть клеток нейральных закладок трансгенной дрозофилы сохраняется в жизнеспособном состоянии и экспрессирует тирозингидроксилазу в течение всего времени эксперимента, хотя некоторые из них проявляют признаки дегенерации

Полное подавление глиалыюго рубца в случае присутствия в трансплантате клеток дрозофилы с трансгенным GDNF может означать, что не только экспрессия трансгенного нейротрофического фактора столь положительно влияет на приживляемость По всей видимости, и другие белки дрозофилы также принимают активное участие в процессе приживления Одним из таких белков является белок теплового шока HSP70 дрозофилы Этот факт бы подтвержден в экспериментах по ксенотрансплантации в мозг крыс эмбриональных, нервных клеток дрозофилы линии Oregon, меченой lacZ и эмбриональной, нервной ткани мутанта ts403, утратившего способность к синтезу HSP70 В этих экспериментах показано, что белок теплового шока Hsp70 снижает образование рубцовой ткани вокруг ксенотрансплантата эмбриональных, нервных клеток дрозофилы

Важно отметить, что раздельное действие белка теплового шока (в экспериментах с мутантами ts403) и нейротрофического фактора (в экспериментах с клетками трансфицированными НЕК293) приводило лишь к ослаблению рубцевания, в то время как совместное действие GDNF и HSP70 (в экспериментах с трансгенными линиями мух) приводило к полной редукции рубца Так как при трансплантации клетки дрозофилы попадают в среду поддерживающую температуру теплового шока для дрозофилы, то вероятно, что именно комбинация экспрессии нейротрофического фактора и активированного белка теплового шока дает столь положительную динамику приживления трансплантата и обуловленное этим подавление глиоза

Наши исследования показали, что присутствие трансгенных клеток дрозофилы в составе клеточного терапевтического препарата может оказывать протективное, трофическое и антиглиозное действие на трансплантируемые клетки и на клетки окружающие ткани мозга реципиента Перспективность использования клеточных препаратов с добавлением трансгенных клеток дрозофилы обусловлена на наш взгляд сочетанием нескольких факторов, принципиально недоступным в чистых алло- или аутотрансплантатах В настоящее время получение клеточных препаратов носителей трансгенных белков на основе клеток млекопитающих возможно только с использованием линейных клеток или при помощи вирусных конструкций Применение и тех и других в клинике опасно Аутологичные или аллогенные клеточные препараты в сочетании с клетками дрозофилы в качестве носителя трансгена не несут вирусных генетических конструкций Клетки дрозофилы обеспечивают эффективную доставку и экспрессию терапевтического трансгена в сочетании с протективным белком теплового шока Hsp70, действие которого показано в нашей работе Продолжительность этого действия, как и действия трансгена, ограничена продолжительностью жизни клеток дрозофилы в

условиях тканей реципиента и составляет 1 месяц Этого времени во многих случаях будет достаточно для действия факторов, выживания и интеграции котрансплантированных аутологичных или аллогенных клеток в ткань мозга реципиента и для возможного замещения дегенерировавших нейронов Такой сценарий терапевтического воздействия может быть оптимален для лечения многих патологических процессов

Результаты исследования тканей линий дрозофилы содержащих гены нейротрофических факторов млекопитающих под контролем п/р области гена 1г.чр70 дрозофилы показали целесообразность использования этого промотора для трансформации стволовых клеток человека, которые в дальнейшем могут быть использованы в экспериментах по нейротрансплантации, а возможно и в нейрохирургических операциях

Также в нашей работе были получены конструкции, несущие гены нейротрофических факторов, для использования их непосредственно в клетках млекопитающих Полученные нами генные конструкции, содержащие гены нейротрофических факторов, были трансдуцированы в клетки человека линии НЕК293, в эмбриональные клетки мышей и в клетки фетального мозга человека

При исследовании полученных трансгенных клеточных препаратов было обнаружено, что ко-культивация эмбриональной, нервной ткани фрагмента зачатка спинного мозга, получившей повреждения, с клетками линии НЕК293, экспрессирующими N01', стимулирует образование нервных отростков у поврежденной ткани При ко-культивации клеток линии НЕК293, продуцирующих СШЫГ, со спинальным ганглием новорожденного крысенка наблюдалось активное образование нервных отростков клеток спинального ганглия в сторону трансгенных клеток уже в течение первых двух часов в отличие от контроля, где отростки образовывались через 2-3 суток и в разных направлениях

Также было показано, что при трансплантации эмбриональных НЕК293 клеток, трансфицированных генами gdnf в мозг крысы, присутствие ООЫР снижают образование рубцовой ткани В отличие от модели с клетками дрозофилы, клетки НЕК293, являясь клетками человека, в мозге млекопитающих находятся в более комфортных условиях В результате мы не наблюдали исчезновения данных клеток с течением времени Однако, в отличие от разрастания данной трансгенной культуры при культивации, при трансплантации трансплантат оставался нормальных размеров, что подтверждает известный факт отсутствия туморигенности у клеток линии НЕК293

Полученные результаты свидетельствуют о возможности длительного переживания в мозгу мышей реципиентов клеток линии НЕК293, содержащих чужеродные гены Отсутствие миграции трансплантированных клеток может быть следствием значительных фенотипических различий между трансплантированными клетками линии НЕК293, которая была получена из клеток эмбриональной почки человека, и окружающей тканью мозга реципиента Не найдено также признаков трансформации фенотипа трансплантированных клеток в мозгу реципиента

Результаты подтверждают перспективность применения трансгенного СБОТ в качестве нейропротектора в тканевой терапии Дальнейшее совершенствование техники невирусной трансдукции терапевтических генов в клетки млекопитающих позволят создавать эффективные клеточные препараты для лечения нейродегенеративных заболеваний

При исследовании клеток млекопитающих, трансфицированных конструкциями с маркерными белками под управлением п/р области гена /г5/?70 дрозофилы было обнаружено, что п/р область способна активировать чужеродный ген в клетках млекопитающих Данная п/р область выгодно отличается от ранее известных, так как обладает высокой активностью, не имеет вирусной природы и ее активность можно регулировать, то есть можно вызвать гиперактивность, подтекание или полную блокировку активности При этом активность п/р области можно регулировать двумя разными способами температурным воздействием (39°С) и с помощью белка №р83 Таким образом, получена модель для регулирования активности чужеродного гена в клетках млекопитающих Также было обнаружено, что при введении голой ДНК вектора Ьр 1, несущего комплекс в мозг мыши, наблюдалась трансфекция клеток мозга

причем активация вводимого гена ^р под контроле промотора обнаруживалась при температуре тела млекопитающих (37°С) По всей видимости, в данном случае наблюдается воспалительный процесс, обсловленный травмированием инъекционной иглой, который и запускает активацию исследуемого промотора

Использование п/р области гена 1ир70 дрозофилы в качестве элемента управления экспрессией терапевтического трансгена дает возможность регулировать экспрессию чужеродного гена в трансплантате При введении гена нейротрофического фактора можно стимулировать гиперэкспрессию, а затем снижение продуцирования трансгенного фактора Мы уверены, что последующие эксперименты с клетками, несущими трансгенные факторы под контролем п/р области гена к$р70 дрозофилы покажут эффективность терапевтического действия подобных клеточных препаратов

Таким образом, в результате данной работы были разработаны две клеточные системы экспрессии нейротрофических факторов для трансплантации трансгенных клеток или тканей в мозг млекопитающих Для первой из них донорами факторов являются клетки дрозофилы, эта система обладает рядом преимуществ, а именно трансгенные клетки дрозофилы быстро образуют связи с клетками мозга реципиента, крайне привлекательным является отсутствие глиапьного рубца на границе тканей трансплантат -реципиент и короткий срок жизни трансгенных клеток (менее месяца) Данная система крайне привлекательна для терапии многих заболеваний требующих локального и направленного кратковременного действия нейротрофных факторов

Вторая клеточная система на основе трансгенных линий клеток человека способна снабжать поврежденный участок мозга млекопитающих нейротрофным фактором длительное время, поскольку они жизнеспособны в участке трансплантации И в данном случае, при экспрессии клетками нейротрофического фактора было обнаружено резкое снижение (но не полное отсутствие как для первой системы) образования глиальной ткани По-видимому, обладая ярко выраженными ксеногенными свойствами трансгенные эмбриональные, нервные клетки дрозофилы, в отличие от клеток человека, не вызывают межклеточной реакции на границе двух тканей при трансплантации

Таким образом, обнаружено, что сочетание белка теплового шока и нейротрофического фактора блокирует образование глиапьного рубца, повышая при этом приживаемость трансплантата и его васкуляризацию

На основании полученных данных напрашиваются некоторые практические рекомендации для использования в нейрохирургической практике Суть их заключается в предложении изыскать способы мобилизации Нэр70 белка и введения нейротрофических генов при нейротрансплантациях Таких способов несколько 1 можно добавлять белок Нзр70 и нейротрофический фактор к трансплантату перед операцией, 2 можно активировать синтез белка в трансплантате посредством предварительного прогревания трансплантата при температуре, вызывающей тепловой шок, и при этом добавлять нейротрофический фактор с трансплантацией, 3 можно трансформировать используемую для трансплантации культуру, введя в ее геном гены, кодирующие Нзр70 белок и нейротрофический фактор

Выводы

1 Показана функциональная активность генов, кодирующих нейротрофические факторы человека (Ьс1пgdnf) и мыши (ng/) в геноме дрозофилы

2 Установлено, что нейроэктодерма трансгенных эмбрионов дрозофилы, продуцирующая нейротрофические факторы, способна стимулировать дифференцировку нервных клеток млекопитающих при их совместном культивировании на искусственных средах При этом происходит направленное образование отростков у эмбриональных спинальных ганглиев, что является необходимым условием при трансплантации

3 Разработан метод смешанных ксенотрансплантаций эмбриональных клеток крысы и нервных тканей трансгенных линий дрозофилы с геном gdnf под контролем промотора гена Й5р70 дрозофилы и его регуляторной области Обнаружено, что трансгенные клетки дрозофилы дифференцировались в нейральном направлении на границе трансплантат -мозг реципиента При этом они формировали контакты с окружающими нервными клетками, усиливали васкуляризацию области трансплантата

4 Продемонстрировано, что ксенотрансплантанты с трансгенными, эмбриональными, нервными тканями дрозофилы, экспрессирующими нейротрофические факторы человека, блокируют образование глиального рубца на границе трансплантат - ткани мозга реципиента

5 Показана позитивная роль белков теплового шока ШР70 в снижении образования глиального рубца при трансплантациях Обнаружено, что оптимальной для блокирования образования глиального рубца при трансплантациях является комбинация белков теплового шока ШР70 и нейротрофических факторов

6 Получена трансгенная культура клеток дрозофилы, экспрессирующая нейротрофический фактор N0? млекопитающих Данная культура может быть использована в качестве донора чужеродного нейротрофического фактора при трансплантациях в мозг млекопитающих

7 Показано, что прочоторно-регуляторная область гена /г$р70 дрозофилы запускается сигнальным каскадом млекопитающих На основании этого был получен вектор Ьр1 для трансфекции клеток млекопитающих, в котором трансгены регулируются повышением температуры до 39°С, при этом появление продукта наблюдается лишь через сутки

8 Разработан метод введения чужеродных генов встроенных в плазмиду, непосредственно в мозг млекопитающих, путем инъецирования голой ДНК Данный метод наименее травматичен для тканей мозга

9 Для клеточной трансплантации в мозг млекопитающих разработан метод клеточной доставки генов, в котором в качестве донора нейротрофического фактора были использованы трансгенные по gdnf клетки человека линии НЕК293, существенно снижающие образование рубцовой ткани при их трансплантации в мозг крыс

10 Обнаружена возможность стимулировать рост отростков у поврежденной нервной ткани (фрагмент зачатка спинного мозга эмбриона человека) млекопитающих посредством совместного культивирования его с трансгенным клетками, экспрессирующими gdnf

11 Для изучения действия нейротрофических факторов т vitro и in vivo разработаны два типа клеточно-органных моделей, которые позволяют обеспечить как временное, так и постоянное действие этих факторов

Публикации

1 Корочкин Л И ,СергеевП В , Башкиров В Н, Панин В М , Габитова Л Б , Мартине К , Копанцева М Р , Шостак Н Г, Павлова Г В , Барский В Е , Дзитоева С Г , Голубева М В , Аслануков А Р Тканеспецифическая экспрессия гена estS у трансгенных дрозофил ДАН (1995), т 340, стр 433-436

2 Александрова М А , Павлова Г.В , Ревищин А В , Башкиров В Н, Модестова Е А , Евгеньев М Б , Сабурина И И , Мерцалов И Б , Венгрова С П, Корочкин Л И, Влияние чужеродного гена GDNF на развитие трансплантата и ксенотрансплантата в мозге крыс Генетика (2000), т 36, стр 1553-1560

3 Павлова Г.В , Модестова Е А, Венгрова С Н, Ефанова А А , Рыбцова Н Н, Корочкин Л И Экспрессия человеческого гена gdnf в трансгенной линии Drosophila melanogaster ДАН (2001), т 376, стр 694-696

4 Корочкин Л И, Александрова М А , Ревищин А В , Павлова Г В , Башкиров В Н, Алексенко О А , Евгеньев М Б Эффект белка теплового шока HSP70 на формирование глиального рубца при нейротрансплантации ДАН (2001), т 383, №3, стр 113-5

5 Корочкин Л И, Александрова М А , Павлова Г.В , Башкиров В Н , Ревищин А В , Алексенко О А, Евгеньев М Б Влияние семейства HSP70 белков при алло- и ксенотрансплантации в мозг крысы Цитология (2001), т 40, стр 803-806

6 Павлова Г В , Ефанов А А , Башкиров В Н , Модестова Е А , Мерцалов И В , Корочкин Л И Экспрессия генов ngf и bdnf человека в трансгенных линиях Drosophila melanogaster Цитология (2002), №44 (11), стр 1104-8

7 Корочкин Л И, Александрова М А , Башкиров В Н , Трухачева А А, Дзитоева С Г , Павлова Г.В, Муркин Е А, Евгеньев М Б, Ревищин А В, Модестова Е А

Ксенотрансплантация эмбриональной нервной ткани нейромутанта Drosophila стимулирует развитие трансплантата в мозгу крысы в нейральном направлении и блокирует образование глиального рубца Цитология (2002), №44 (12), стр 1181-5

8 Pavlova G., Enblom А , Revishchm А, Sandelm M , Korochkm L, Kozlova E The influence of donor Drosophila cells on survival of peripherally grafted embryonic or fetal rat dorsal root ganglia Cell Transplantation (2003), V 12, p 705-715

9 Павлова Г.В., Мануйлова E С , Арсеньева Е А , Гривенников И А , Муркин Е В , Канайкина H В , Ревищин А В , В H Тарантул, Корочкин Л И Регуляция экспрессии белка BFP в эмбриональных клетках Бюлл Эксперим Медицины 2005, Т 139 №4 С 514-516

10 Маркитанова Ю В , Макарьев Е О , Павлова Г.В , Зиновьева Р Д , Миташев В И Локализация экспрессии гена Proxl при регенерации хрусталика и сетчатки у тритонов ДАН (2003), №391, стр 361-4

11 Pavlova G.V , Manuilova E S , Arseneva E L, Grivennikov IA , Murkin E V, Kanaïkma N V , Revishchm A V , Tarantul V N , Korochkm L I BFP Regulation of Protein Expression in Transfected Embiyonic Stem Cells Cell Biol Med (2005), т 1, №2, стр 99-102

12 Павлова Г.В , Ревищин А В , Мирошникова О А , Муркин Е В , Харлампиева Д Д, Рыбалкина Е Ю , Корочкин Л И Влияние чужеродного гена gdnf в ксенотрансплантатах на посттравматические процессы в мозге мышей Молекулярная медицина (2006), №2, стр 44-48

13 Андреева Л Е , Хайдарова H В , Родригес-Бланко А В , Канайкина H H, Ревищин А В , Тарантул В 3 , Корочкин Л И , Павлова Г В Экспрессия репортерных генов под контролем регуляторных элементов гена теплового шока дрозофилы в трансгенных эмбрионах вьюна Misgurnus fossilis L Клеточная трансплантология и тканевая инженерия (2006), Том 4 (6), стр 39-44

14 Павлова ГВ, Зарайский ЕИ, Ревищин АВ, Полтавцева РА, Рыбалкина ЕЮ, Корочкин Л И , Эрнст Л К (2007) Способ предифференцировки стромальных стволовых клеток костного мозга в тирозингидроксилаза-позитивные клетки Заявка на патент №2007113908 От 13 04 2007

Главы в книгах

15 Korochkm LI, Pavlova G., Alexandrova A Genetic Engineering Methods of the Regulation of Stem Cells Differentiation Biotechnology and Medicine, Nova Science Publishers (2004), p 121-136

16 Korochkm LI, Pavlova G., Alexandrova A Protein Hsp70 Blocks The Glial Scar

Formation Around The Neurotransplant Biotechnology and Medicine, Nova Science Publishers (2004), p 137-141

17 Shegelskaya E A, Mikuhnskn Y E, Revishchm A V, Pavlova G V. and Korochkin LI Differentiation of Stem Cells in the Culture In book Genes, Gene Families, and Isozymes Medimond, Berlin (2003), p 69-73

Тезисы конференций

18 Pavlova G., Titova E , Bragina T , Mirochnikova О , Murkin E , Gnvennikov I, Manuilova E , Narantul V , Revishchm A , Korochkin L Activation of foreign protein synthesis in stem cells ELSO Nice 2004, p 178-181

19 Korochkin LI, Gnvennikov I A , Manuilova E S , Tarantul V N , Revishchm A V , Titova E V , Miroshmkova О A , Bragina T V , Murkin E V , Kanaikina N V , Pavlova G V Transformation stem cells culture by genes of human neurotrophic J of Biotechnology (2005), V l,p 64-66

20 Титова E A , Павлова Г.В., Мирошникова О A , Муркин E В , Канайкина Н Н , Ревищин А В , Корочкин Л И Экспрессия чужеродных человеческих NGF и GDNF в трансгенных линиях Drosophila В кн Системная биология и биоинженерия М, Макс Пресс, 2005, стр 78-81

21 Титова ЕА, Брагина ОВ, Мирошникова OA, Корочкин ЛИ, Павлова Г В Создание модельных генетических систем для изучения нейротрофических факторов и флуоресцентных белков В кн Системная биология и биоинженерия М, Макс Пресс, 2005, стр 81-82

22 Харлампиева Д Д , Павлова Г.В., Ревищин А В , Рыбалкина Е В , Корочкин Л И Влияние трансгенного нейротрофического фактора GDNF на дифференцировку стволовых клеток и посттравматические процессы в мозге млекопитающих В кн Системная биология и биоинженерия М, Макс Пресс, 2005, стр 82-83

23 Павлова Г.В, Корочкин Л И Новые подходы к регуляции дифференцировки стволовых клеток В кн Системная биология и биоинженерия М, Макс Пресс, 2005, стр 100-101

24 Харлампиева Д Д, Павлова Г.В , Мирошникова О А , Ревищин А В , Рыбалкина Е В , Корочкин Л И Влияние трансфекции нейротрофического фактора GDNF на дифференцировку стволовых клеток и посттравматические процессы в мозге млекопитающих В кн Системная биология и биоинженерия М, Макс Пресс, 2005, стр 123-124

25 Корочкин Л И, Гривенников И А ,Мануйлова Е С , Тарантул В 3 , Ревищин А В , Титова Е В , Муркин Е В , Канайкина Н А, Павлова Г.В Трансформация стволовых клеток генами нейротрофических факторов В кн Биотехнология Состояние и перспективы развития 2005 стр 64-66

26 Муркин Е В , Павлова Г.В , Титова Е В , Гривенников И А , Мануйлова Е С , Ревищин А В , Тарантул В С , Корочкин JIИ Активация чужеродных белков в стволовых клетках В кн Системная биология и биоинженерия М , Макс Пресс, 2005, стр 149-150

27 Павлова Г.В , Ревищин А В , Зарайский Е И, Титова Е В , Рыбалкина Е А , Брагина Т А , Мирошникова О В , Муркин Е В , Пономарь С Н , Канайкина Н А , Корочкин JI И Индукция специфической дифференцировки в региональных стволовых клетках человека Научные Труды 1-го съезда физиологов СНГ Т 2, Сочи-Дагомыс, 2005,

стр 126

28 Korochkin L, Alexandrova М , Bashkirov V , Pavlova G., Trukhatchava A , Evgeniev M , Modestova E Grosman A Xenotransplantation of Drosophila embryonic cells into mammalian bram Proc of 2nd Internat Conference on biomformatics of genome regulation and structure V 3, BGRS, Novosibirsk, 2000, p 2728-2729

29 Korochkin L , Alexandrova M, Bashkirov V , Dzytoeva S , Pavlova G , Trukhatcheva A , Evgeniev M, Grossman A Xenotransplantation of Drosophila nerve cells into mammalian brain molecular genetical and clinical aspects 16th European Drosophila Research Conference Zurich, 1999, p 76

30 Korochkin L , Alexandrova M , Bashkirov V , Dzytoeva S , Pavlova G , Trukhatcheva A , Evgeniev M , Grossman A Embryonic nerve cells from Drosophila melanogaster stimulate development of neural homografts in rat brain and blocked of glial scar formation 41th Annual Drosophila Research Conference Pittsburgh, 2000, p 704a

31 Korochkin L ,Alexandrova M, Bashkirov V ,Dsitoeva S ,Pavlova G ,Trukhatcheva A, Evgeniev M Xenotransplantation of Drosophila embryonic nerve cells into mammalian brain molecular genetic and clinical aspects e^East European Conference of the International Society of Invertebrate Neurobiology Moscow-Puschmo, 2000, p 68-69

32 Korochkin L , Alexandrova M , Bashkirov V , Dzitoeva S , Pavlova G., Trukhatcheva A , Evgenev M, Modestova A, Xenotransplantation of Drosophila nerve cells into mammalian brain molecular genetic and embryological aspects International Symposium on X-chromosome inactivation in mammals Novosibirsk, 1999, p 29

33 Mirochnikova О, Pavlova G , Murkm E, Titova E, Bragma T, Korochkm L The synthesis of genetieal constructs to transform the humam stem cells Progress m biotechnology and neurobiology - Integrative medicine Egypt, Hurgada, 2004, pill

34 Павлова Г В , Мануйлова Е С , Гривенников И А , Мирошникова О А , Титова Е А , Брагина Т В , Муркин Е В , Модестова Е А , Корочкин JIИ Активация синтеза чужеродного белка в культуре клеток Прогресс в биотехнологии и нейробиологии -интегративная медицина Украина, Судак, июнь 2004 г

35 Титова Е А , Павлова Г.В , Мирошникова О А , Брагина Т В , Муркин Е В , Модестова Е А , Корочкин Л И Селекция линии дрозофилы, несущей ген красного белка Прогресс в биотехнологии и нейробиологии — интегративная медицина Украина, Судак, июнь 2004 г

36 Pavlova G , Revischin, Miroschmkova О , Titova Е , Murkin Е, Enblom А , Sandelm М, Kozlova Е , Korochkin L The influence of donor age, nerve growth factor and cografting with Drosophila cells on survival of peripherically grafted embryonic or fetal rat dorsal root ganglia Progress in biotechnology and neurobiology - Integrative medicine Egypt, Hurgada, p 121

Заказ № 220/04/07 Подписано в печать 24 04 2007 Тираж 100 экз Уел пл 3

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 \vw\v с/г ги , е-тай т/о@с/г ги