Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Стимуляция роста нервных волокон стромальными клетками жировой ткани и дифференцировка этих клеток в нейральном направлении

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Стимуляция роста нервных волокон стромальными клетками жировой ткани и дифференцировка этих клеток в нейральном направлении"

На правах рукописи

ии^-

ЛОПАТИНА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

СТИМУЛЯЦИЯ РОСТА НЕРВНЫХ ВОЛОКОН СТРОМАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ ЖИРОВОЙ ТКАНИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ЭТИХ КЛЕТОК В НЕЙРАЛЬНОМ

НАПРАВЛЕНИИ

03.00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология 03.00.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук ^

Москва - 2009 г.

003476054

Работа выполнена на кафедре биологической и медицинской химии факультета фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В .Ломоносова

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

кандидат биологических наук, доцент

Парфенова Елена Викторовна Калинина Наталья Игоревна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Александрова Мария Анатольевна

доктор биологических наук,

профессор Ширинский Владимир Павлович

Ведущая организация:

ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П. А.Герцена Росздрава

Защита диссертации состоится _ _ 2009 года на заседании

диссертационного совета Д 208.073.01 по присуждению ученой степени доктора и кандидата биологических наук в ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ и СР РФ (121552 Москва, ул. 3-я Черепковская, д. 15а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ РКНПК МЗ и СР РФ. Автореферат разослан__2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

В. Е. Синицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследованиями последних лет установлено, что физиологическое обновление тканей животных и человека, в том числе и нервной ткани, происходит в значительной степени благодаря пролиферации и дифференцировке резидентных стволовых клеток (Torella D. et al. 2007; Iarygin K.N. 2008; Bruno S. et al. 2009). Однако при обширных повреждениях мозга в результате инсультов и травм, при нейродегенеративных заболеваниях, а также при утрате значительной части нерва активности нейральных стволовых клеток оказывается не достаточно для полноценного восстановления нервной ткани. Так, повреждения нервного волокна протяженностью более 3 см индуцируют его дегенерацию, поэтому в таких случаях восстановления иннервации ткани-мишени не происходит (Kocppcn А.Н. 2004). В свою очередь ткань, не получающая нервные импульсы в течение длительного времени, также подвергается дегенерации, поэтому скорость восстановления нервного волокна играет решающую роль в сохранении функциональной ткани (Tomanek R.J. and Lund D.D. 1973).

Поскольку в настоящее время в медицинской практике нет технологий, с помощью которых можно было бы эффективно стимулировать рост нервных волокон и восстановление нервной ткани, поиск новых подходов к активации роста нервов и репарации нервной системы является актуальной задачей в биологии и медицине. Перспективным подходом к лечению неврологических заболеваний может оказаться трансплантация клеток, способных выполнять функцию необходимых для репарации нервов шванновских клеток (Gucnard V. et al. 1992). Это определяет актуальность поиска типов аутологичных клеток, которые могли бы стимулировать репарацию нервной ткани как путем секреции нейротрофических факторов роста, так и путем дифференцировки в нейральном направлении, в частности, в шванновские клетки.

Перспективным источником аутологичных прогениторных клеток оказалась жировая ткань. Ее строма содержит клетки по своему иммунофенотипу, профилю экспрессии генов и дифференцировочным способностям сходные с хорошо изученными мезенхимными прогениторными клетками костного мозга. Но в отличие от клеток костного мозга, стромальные (мезенхимные) клетки жировой ткани практически для каждого пациента можно получить в достаточном количестве. Показано, что стромальные клетки жировой ткани (СЮКТ) способны дифференцироваться во многие типы клеток: в остеогенном, хондрогенном, адипогенном направлениях (Zuk P.A. et al. 2001), в клетки нервной ткани (Fujimura J. et al. 2005) и кардиомиоциты (Planat-Benard V. et al. 2004);

кроме этого, СКЖТ секретируют ангиогенные и антиапоптотические факторы (Rehman J. ct al. 2004; Парфенова E.B. с соавт. 2006; Rubina К.А. et al. 2009), нейротрофические (Peeraully M.R., Jenkins J.R. and Trayhurn P. 2004; Wei X. et al. 2008) и другие факторы роста (Nambu М., et al., 2009). На различных моделях ангиогенеза in vitro и in vivo было показано, что эти клетки эффективно стимулируют рост сосудов при их введении в ишемизированные ткани (Rehman J. et al. 2004; Трактуев Д. с соав. 2005; Парфенова Е.В. с соав. 2006; Rubina К., et. al, 2009). Стимулирующий эффект СКЖТ на рост сосудов опосредован в основном их секреторной активностью, а также способностью встраиваться в новообразованные сосуды (Miranville et al., 2004; Planat-Benard et al.,2004).

Хорошо известно, что рост сосудов сопряжен с ростом нервов. Процессы ангиогенеза и нейрогенеза имеют общие сигнальные молекулы и механизмы регуляции (Carmeliet Р. 2003). Клетки эндотелия секретируют нейротрофический фактор BDNF и привлекают растущие нервные окончания (Louissaint A., Jr. et al. 2002), а шванновские клетки периферических нервов секретируют основной стимулятор ангиогенеза - VEGF (Mukouyama Y.S. et al. 2002). Сопряженность нервов и сосудов подтверждается и тем фактом, что все крупные сосуды иннервируются, а нервные волокна кровоснабжаются. Поэтому способность СКЖТ эффективно стимулировать ангиогенез дает основания предполагать, что эти клетки могут стимулировать и рост нервов. В то же время, есть данные, что эти клетки могут дифференцироваться в нейральном направлении (Ashjian Р.Н. et al. 2003; Safford К.М. et al. 2004; Ning H. et al. 2006) и способствуют репарации повреждений спинного мозга (Kang S.K. et al. 2006).

Цель данной работы заключалась в исследовании способности стромальных клеток жировой ткани стимулировать рост нервных волокон, экспрессировать нейротрофические факторы и их рецепторы, а также дифференцироваться в нейральном направлении.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:

1. Проанализировать влияние стромальных клеток жировой ткани на рост нервных волокон in vivo в матригеле.

2. Оценить экспрессию нейротрофических факторов роста стромальными клетками жировой ткани при культивировании в условиях нормального и сниженного содержания кислорода.

3. Изучить экспрессию рецепторов нейротрофических факторов роста стромальными клетками жировой ткани при культивировании в условиях нормального и сниженного содержания кислорода.

4. Подобрать условия индукции нейралыюй дифференцировки стромальных клеток жировой ткани in vitro.

5. Оценить влияние нейральной дифференцировки на экспрессию нейротрофических факторов роста in vitro, их способность стимулировать рост нервных волокон в матригеле in vivo и жизнеспособность этих клеток при трансплантации в нервную ткань.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В представленной работе впервые показано, что стромальные клетки жировой ткани способны стимулировать рост нервных волокон in vivo в подкожном имплантате матригеля, изучены механизмы такой стимуляции. Установлено, что СКЖТ секретируют нейротрофические факторы BDNF, GDNF и NGF, необходимые для поддержания жизнеспособности нейронов, роста и репарации нервных окончаний. При культивировании СКЖТ в условиях пониженного содержания кислорода (1%) экспрессия нейротрофических факторов повышается. Впервые показано, что популяция СКЖТ содержит клетки, экспрессирующие рецепторы к нейротрофическим факторам. Получены данные, свидетельствующие о присутствии в популяции СКЖТ клеток, способных дифференцироваться в нейральном направлении как спонтанно, так и под влиянием индукторов. Подобраны эффективные индукторы нейральной дифференцировки СКЖТ, которыми оказались сочетания ретиноевой кислоты или BDNF с ДНК-деметилирующим агентом 5-азацитидином. Впервые установлено, что индукция нейральной дифференцировки СКЖТ повышает их способность стимулировать рост нервных волокон

при трансплантации в матригеле под кожу мыши и повышает жизнеспособность СКЖТ после трансплантации в головной мозг мыши. Активная продукция нейротрофических факторов роста стромальными клетками жировой ткани и их способность дифференцироваться в нейральном направлении открывает перспективы их использования для клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний и повреждений периферических нервов и ткани головного мозга.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на конференции «Молодые ученые в медицине-2008», Казань, 23-26 апреля 2006 г., на V конференции молодых ученых России с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 19-22 мая 2008 г, на всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения», Москва 9-11 июня 2008г., на международном форуме аспирантов Тихоокеанского региона, Омаха, США, 2-6 июня 2008г., на шестом собрании международного общества по изучению стволовых клеток (6th ISSCR Annual Meeting), Филадельфия, США, 11-14 июня 2008г., на втором международном конгрессе по стволовым клеткам и формированию ткани Дрезден, Германия, 6-9 июля 2008г. Апробация работы состоялась 12 мая на кафедральном семинаре на факультете фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломоносова

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 тезисов докладов, 3 статьи в рецензируемых журналах, 1 статья отправлена в печать.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 97 страниц машинописного текста, таблицы и 17 рисунков. Список литературы включает 161 источник.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клетки. В работе использовали клетки, выделенные из подкожной жировой клетчатки 18 пациентов, взятой при полостных (неонкологических) операциях. Среди пациентов были мужчины и женщины, возраст от 41 до 62 лет. СКЖТ мыши были выделены подкожного жира брюшной области мышей линий Ыаскб и Ыаскб-GFP.

Реактивы и Ферменты. Для выделения СКЖТ из ткани использовали ферменты протеазу

(«Gibco», США), коллагеназу («Invitrogen», США); для культивирования клеток

использовали среду DMEM («Invitrogen», США), эмбриональную сыворотку быка

(«Gibco», США), антибиотик и антимикотик («Invitrogen», США). Индукцию

дифференцировки проводили следующими веществами: (З-меркаптоэтанол («Helicon»,

6

Россия), BDNF («PeproTcch», США), GDNF («Clontech», США), ретиноевая кислота, IBMX , 5-азацитидин («Sigma», США).

Для анализа генной экспрессии в СКЖТ методами ОТ-ПЦР из клеток выделяли РНК при помощи набора реагентов «RNcasy Miny Kit (50)» («QIAGEN», США), затем на матрице РНК строили кДНК, используя набор для обратной транскрипции «First Strand cDNA Synthesis Kit» («Fermentas» Латвия). Далее при помощи набора реактивов для проведения ПЦР в реальном времени в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I («Синтол», Россия) проводили ПЦР в реальном времени.

В работе были использованы следующие первичные антитела: против маркерного белка растущих нервных окончаний GAP43 (Abeam, кат. № аЬ12274), против нестина (Chemicon, кат. № АВ5922), бета 3 тубулина (Chemicon, кат. № МАВ5544), рецептора TrkB (Abeam, кат. № аЬ51190), BDNF (Abeam, ab6201), NGF (Abeam, 52918), GDNF (Santa Cruz, sc-328), нейропилин-l (Abeam, ab 16786). Вторичные антитела, конъюгированные с флуорохромом AlexaFluor594 или AlexaFluor488 были фирмы Molecular Probes («Invitrogen», США).

Выделение » культивирование СКЖТ. Выделение СКЖТ из жировой ткани проводили согласно опубликованному протоколу (Zuk P.A. et al. 2001). Ткань измельчали ножницами, затем образцы «гомогенизированной» ткани подвергали ферментативной обработке: добавляли протеазу (30 ед/мл) и коллагеназу (200ед/мл) в течении 45 минут при 37°С. К полученной суспензии добавляли равный объем среды DMEM, 10% ЭБС и центрифугировали при 200g 10 минут. Осадочную фракцию, содержащую клетки стромы жировой ткани, сосудов и крови, освобождали от эритроцитов и фильтровали через мембранный фильтр («BD Falcon», США), клетки ресуспендировали в среде роста (DMEM, 10% ЭБС), высаживали в чашки Петри в количестве 5х103/см2 и инкубировали при 37°С, 5% СС>2. На следующий день в чашках меняли среду для удаления неприкрепившихся клеток. Выделенные клетки культивировали на необработанном белками клеточного матрикса пластике в среде DMEM, 10 % ЭБС, при 37°С, 5% СО2. При достижении 80% конфлюента клетки пассировали: монослой клеток обрабатывали раствором 0,25% трипсина/0,02%ЭДТА. Для имитации условий гипоксии СКЖТ в течение 48 часов культивировали в среде DMEM, 0 % ЭБС при пониженном содержании кислорода (1% О2). По прошествии этого времени кондиционированную среду с клеток собирали для качественного и количественного анализа белка, а сами клетки - для анализа экспрессии генов на уровне мРНК методом ПЦР в реальном времени. Индукция нейральной дифференцировки СКЖТ. Для индукции дифференцировки СКЖТ высаживали на чашки Петри в плотности 10x103/см2 в среду DMEM, 10 % ЭБС.

7

На следующий день среду меняли на DMEM, 3% ЭБС и добавляли индукторы: 5-азацитидин (1 цМ), p-меркаптоэтанол (1 цМ), BDNF (20 нг/мл), GDNF (20 нг/мл), IBMX (500 рМ), ретиноевую кислоту (1 цМ), а также комбинации этих индукторов (5-азацитидин (1 рМ) с BDNF (20 нг/мл), 5-азацитидин (1 рМ) с GDNF (20 нг/мл), 5-азацитидин (1 рМ) с ретиноевой кислотой (1 рМ), 5-азацитидин (1 цМ) со смесью BDNF (20 нг/мл), GDNF (20 нг/мл) и ретиноевой кислоты (1 рМ). В качестве контроля были использованы клетки, культивированные в DMEM, 3% ЭБС. Через 3 дня клетки собирали для анализа уровня экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени. Анализ экспрессии факторов роста и маркерных генов. Содержание мРНК исследуемых факторов роста и маркерных белков нейральной дифференцировки оценивали с помощью ПЦР в реальном времени. Содержание нейротрофических факторов роста и маркерных белков нейральной дифференцировки в СКЖТ определяли с помощью иммуноблоттинга и иммуноцитохимии.

Имплантация СКЖТ в матригеле. Оценку влияния СКЖТ на рост нервных волокон in

vivo проводили на модели ангиогенеза в подкожных имплантатах матригеля (Growth

Factor Reduced Matrigel, BD Biosciences) (Rubina К. et al. 2007). Для этих экспериментов

были использованы СКЖТ мышей линии Ыаскб-GFP второго пассажа. Инъекцию

холодного раствора матригеля делали подкожно в боковую область мышам линии Ыаскб.

Для проведения эксперимента мыши были разделены на семь групп, в каждой из которых

животные получили инъекцию 400 мкл матригеля, смешанного с одним из следующих

растворов: 1) контрольная группа - 50 мкл DMEM, 10% ЭБС; 2) 250 мкг/мл bFGF; 3) 50

мкл 10Х смеси факторов роста В27 («Invitrogen», кат. № 17504-044); 4) СКЖТ (0,7х10б

клеток) в 50 мкл DMEM, 10% ЭБС; 5) СКЖТ (0,7х10б клеток), культивируемые при 1% СЬ

48 часов, в 50 мкл DMEM, 10% ЭБС; 6) СКЖТ, индуцированные к дифференцировке при

помощи BDNF (20 нг/мл) и 5-азацитидина (1 цМ); 7) СКЖТ, индуцированные к

дифференцировке при помощи ретиноевой кислоты (1 рМ) и 5-азацитидина (1 рМ). Через

10 дней после начала эксперимента имплантанты матригеля были извлечены и

зафиксированы в 4 % растворе параформальдегида. Затем они были помещены в кюветы

со средой О.С.Т. Tissue-Tek (Sakura, Япония) и заморожены в жидком азоте. Для анализа

количества нервных волокон в имплантатах были приготовлены замороженные срезы, на

которых были выявлены нервные волокна с помощью иммунофлуоресцентного

окрашивания антителами против GAP43- маркерного белка растущих нервных окончаний.

Оценка выживаемости и миграции СКЖТ при трансплантации. Для оценки

способности СКЖТ выживать и мигрировать внутри нервной ткани была проведена их

инъекция в головной мозг мышам. СКЖТ трансгенных мышей, стабильно

8

экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок, были индуцированы в течение двух дней в среде DMEM, 10% ЭБС, 1цМ 5-азацитидина с добавлением BDNF (20нг/мл) или 1цМ ретиноевой кислоты. В качестве контроля использовали СКЖТ, культивированные в обычных условиях. lxl06GFP -меченых клеток в 2 мкл раствора Хенкса локально вводили в стриатум мозга мышей. Через 6, 9 и 11 дней после инъекции клеток мышей перфузировали 4 % раствором парафомальдегида, мозг извлекали и замораживали при -20°С. Затем готовили срезы в 40 мкм. Выживаемость и миграцию трансплантированных СКЖТ оценивали под микроскопом по зеленой флуоресценции экспрессируемого ими белка GFP.

Подсчет нервных волокон в матригеле. Для оценки роста нервных волокон в матригеле под влиянием СКЖТ или растворов bFGF и В27 при помощи цифровой фотокамеры делали более 10 снимков срезов каждого имплантата. Затем проводили подсчет количества и длины GAP43+ структур с использованием компьютерной программы Metamorph (MetaMorph Offline, version 7.1.7.0, Molecular devices).

Статистическая обработка данных. Статистический анализ данных проводили с использованием программы SigmaStat9.0. При подтверждении нормальности распределения признака методами Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилксона для сравнения групп использовали t- критерий Стьюдента, для маленьких групп и ненормальных распределений - U-критерий Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Влияние СКЖТ на рост нервных волокон в матпигеле

Как было установлено ранее, СКЖТ стимулируют рост кровеносных сосудов в имплантате матригеля (Трактуев Д. с соав. 2005; Парфенова Е.В. с соавт.2006; Rubina К. et.al.2009). Такое действие клеток обусловлено их способностью секретировать факторы роста, в частности, VEGF, HGF и bFGF, которые стимулируют миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток и их предшественников. Культивирование СКЖТ при пониженном содержании кислорода (1 %) повышает секреторную активность этих клеток и их способность стимулировать рост кровеносных сосудов в имплантатах матригеля (Rehman et.al. 2004; Парфенова E.B. с соав. 2006; Rubina ct. al, 2009). Поскольку рост кровеносных сосудов сопряжен с ростом нервных волокон (Taylor G.I., Gianoutsos М.Р. and Morris S.F. 1994; Bates D., Taylor G.I. and Newgreen D.F. 2002), а факторы роста, стимулирующие ангиогенез, в частности, VEGF и HGF, также активируют и рост нервных волокон (Bates D., Taylor G.I. and Newgreen D.F. 2002), можно предположить, что введение СКЖТ будет также стимулировать и рост нервных окончаний. Чтобы проверить это предположение, СКЖТ мыши, культивированные в обычных условиях (при 21 % Ог) или при пониженном содержании кислорода (1 % О2), были введены в матригеле под кожу мышам. Через 10 дней в имплантатах оценивали содержание нервных волокон с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания замороженных срезов матригеля антителами против маркерного белка растущих периферических нервных окончаний GAP43 и последующего морфометрического анализа.

В контрольных имплантатах, содержащих вместо клеток среду роста СКЖТ (DMEM, 10 % ЭБС), количество нервных волокон не превышало 12 (в среднем 8 ± 4) в поле зрения (рисунок 1 А, Д). В имплантатах, содержащих вместо клеток известные стимуляторы роста нейральных клеток: смесь факторов роста В27 («Invitrogen», США) или bFGF (50 нг/мл), было обнаружено до 27 (в среднем 16 ± 11) ОАР43-позитивных структур в поле зрения (рисунок 1 Б, Д). В то же время, при введении в матригель СКЖТ количество нервных волокон достигало 40 и более (в среднем 30 ± 10) в поле зрения (рисунок 1 В, Г,

Д)-

I ,

Рисунок 1. Рост нервных волокон в матригеле под влиянием СКЖТ.

А-Г Срезы матригеля, окрашенные антителами против белка периферических нервных окончаний йАР43 (красная флуоресценция). А - срез контрольного матригеля (с добавлением ОМЕМ, 10 % ЭБС), Б - срез матригеля с добавлением смеси факторов роста В27; В - срез матригеля, содержащего СКЖТ, культивированных при 21 % О2 (СКЖТ_норм); Г - срез матригеля, содержащего СКЖТ, культивированных при 1 % О2 (СКЖТ_гип). Д - среднее количество САР43-позитивных структур на срез (п=15, * -р<0,05 по сравнению с контролем); Е - суммарная длина нервных волокон (п=100, * -р<0,05 по сравнению с контролем и остальными группами).

И

:________________________________________________________________)

А Б

100 мкм I 100 мкм

В : ■■}.'У ** '/ Г

100 мкм 100 мкм

При введении СКЖТ увеличивалось не только количество прораставших нервных волокон, но и их длина (рисунок 1, Е). На срезах матригелей, содержащих СКЖТ, культивированных при нормальном содержании (21 %) кислорода, максимальная длина нервных волокон была в 3 раза больше, чем в контрольных (средняя длина 35±5 пикселей). В случае, когда матригель содержали СКЖТ, культивированные при 1 % кислорода, были обнаружены ОАР43-позитивные структуры, длина которых была в 5 раз больше (средняя длина 50±7 пикселей), чем максимально длинные такие же структуры в контрольных матригелях.

Эти данные свидетельствуют о том, что введение СКЖТ стимулирует прорастание нервных волокон в матригель, а инкубация этих клеток в условиях пониженного содержания кислорода повышает их стимулирующий эффект.

Ранее было установлено, что индуцирующее действие СКЖТ нарост кровеносных сосудов обусловлено как секреторной активностью этих клеток, так и их способностью встраиваться в стенку формирующихся сосудов (Rubina К. et al. 2009). Возможно, что стимуляция роста нервных волокон при введении СКЖТ также обусловлена способностью этих клеток продуцировать нейротрофические факторы роста и дифференцироваться в нейральном направлении.

Экспрессия и секреция нейротрофических факторов роста СКЖТ

При анализе содержания мРНК основных нейротрофических факторов ВО№, N0? и ОООТ в СКЖТ с помощью ПЦР с обратной транскрипцией было установлено, что эти клетки содержат мРНК всех вышеперечисленных факторов (рисунок 2 А), что указывает на активную транскрипцию соответствующих генов. При анализе содержания ВО№, вБМ7 и ЫОБ в среде культивирования СКЖТ с помощью иммуноблоттинга, было установлено наличие в ней этих белков (рисунок 2 Б).

BDNF NGF GDNF 122п.н. 185п.н. 112п.н.

1

Б.

<- BDNF, 26kD

NGF, 23kD <- GDNF, 24kD

Рисунок 2. Содержание мРНК и белков нейротрофических факторов в СКЖТ. А. Амплификация участков сДНК генов BDNF, NGF и GDNF в СКЖТ. Б. Иммуноблоттинг с антителами против белков BDNF, NGF, GDNF: 1 - среда культивирования клеток НЕК 293Т; 2 - среда культивирования СКЖТ; 3 - среда культивирования трансгенных клеток НЕК 293Т, сверхэкспрессирующих анализируемые белки.

Это свидетельствует о способности СКЖТ экспрессировать и продуцировать основные нейротрофические факторы роста.

Культивирование СКЖТ при пониженном содержании кислорода вызывает повышение экспрессии факторов роста ЕЮОТ более чем в 1,5 раза, а нейротрофического фактора ^Р на 25 %. Достоверного увеличения экспрессии фактора 00№ не было обнаружено (рисунок 3).

Рисунок 3. Увеличение содержания мРНК факторов роста при культивировании СКЖТ в условиях пониженного содержания кислорода.

Анализ проводили методом ПЦР в реальном времени, уровень мРНК анализируемых генов выравнивали по отношению к двум генам неизменного уровня экспрессии (house keeping genes) (GAPDH, fí-acíin). (n=3, * - p<0.05 по сравнению с СКЖТ_норм).

Чтобы проверить потенциальную способность СКЖТ реагировать по аутокринному механизму на воздействие нейротрофических факторов, мы проанализировали экспрессию рецепторов к ним и обнаружили, что эти клетки содержат р75, общий низкоаффинный рецептор нейротрофических факторов; TrkA специфический высокоаффиниый рецептор нейротрофического фактора NGF, TrkB -специфический рецептор фактора рецептор BDNF; TrkC - рецептор нейротрофического фактора 3/4; а также Delta (рецептор белка Notch), активирующий нейрогенез в пронейральных клетках, и Neuropilinl (NP1, рецептор фактора VEGF), участвующий в стимуляции роста сосудов и нервов при онтогенезе (Bates D. et al. 2003). Культивирование СКЖТ при пониженном содержании кислорода повышало экспрессию рецепторов р75, TrkA, Delta, NP1 в этих клетках (рисунок 4).

■ СКЖТ_норм □ СКЖТ гип

GDNF NGF VEGF BDNF

□ СКЖТнорм

□ СКЖТгип

p7S TrkA TrkB TrkC Delta NP1

Рисунок 4. Стимуляция экспрессии рецепторов нейротрофических факторов при культивировании СКЖТ в условиях пониженного содержания кислорода.

Р75 - общий рецептор нейротрофическпх факторов BDNF, NGF и нейротрофического фактора 3/4: TrkA - специфический рецептор NGF; TrkB - специфический рецептор BDNF; TrkC - специфический peifenmop нейротрофического фактора 3/4; Delta -рецептор Notch; NP1- рецептор VEGF, принимающий участие в росте нервов и сосудов. (п=3, * -р<0,05 по сравнению с СКЖТ_норм).

Хотя рецепторы нейротрофическпх факторов экспрессируются преимущественно на нейральных клетках, они также присутствуют на клетках, участвующих в ангиогенезе: предшественниках эндотелиальных клеток, клетках красного костного мозга, гладкомышечных клетках (Kermani P. et al. 2005).

Для того чтобы выяснить, вся ли популяция СКЖТ или какая-то ее часть экспрессирует рецепторы нейротрофических факторов, эти клетки были проинкубированы с мечеными антителами против рецептора TrkB, а затем при помощи проточного сортинга была выделена TrkB-позитивная популяция клеток. Оказалось, что около 10 % от общей популяции СКЖТ экспрессирует рецептор TrkB. Сравнительный анализ TrkB+ и ТгкВ~ субпопуляций СКЖТ показал, что TrkB+ клетки экспрессируют значительно больше других рецепторов к нейротрофическим факторам - р75 и NP1 | (рисунок 5). Для оценки возможной предрасположенности этой субпопуляции СКЖТ к нейральной дифференцировке была исследована экспрессия нейральных маркерных генов в TrkB+ и TrkB" субпопуляциях. В качестве маркерных генов были выбраны следующие:

нестин (nestin) - цитоплазматический белок, маркер ранних нейральных предшественников; бета 3 тубулин (tubulin-bcta3, TUBB) - белок цитоскелета, маркер нейральных клеток; нейрон-специфическая енолаза (enolase type 2, Eno2) - маркер нейрональных предшественников; ассоциированный с микротрубочками белок 2 (microtubule associated protein 2, МАР2) - маркер нейрональных предшественников. Оказалось, что в ТгкВ+-популяции в три раза сильнее экспрессируется нестин, почти в два раза бета 3 тубулин, остальные нейральные маркеры также больше экспрессируются в ТгкВ+-клетках (рисунок 5).

16 -,

TrkB р75 NP1 nestin TUBB Eno2 МАР2

Рисунок 5. Сравнительный анализ генной экспрессии в TrkB+ и ТгкВ" субпопуляциях СКЖТ. А. Экспрессия рецепторов факторов. Б. Экспрессия нейральных маркеров. Анализ проводился методом ПЦР в реальном времени, уровень мРНК анализируемых генов выравнивали по отношению к двум генам неизменного уровня экспрессии (house keeping genes) (GAPDH, /З-actin). (n=13, *- p<0,05 по сравнению с TrkB-).

Недавно было показано участие рецепторов TrkB и NP1 в регуляции роста сосудов и нервных волокон (Kerraani Р. et al. 2005). Эти рецепторы экспрессируются на поверхности прогениторных клеток, формирующих нервные волокна и сосуды. Экспрессия NP1 и TrkB на поверхности СКЖТ указывает на возможность встраивания этих клеток (возможно, TrkB+ субпопуляции) в растущие нервы.

Это предположение подтверждается тем, что при введении в матригель СКЖТ, меченых зеленым флуоресцентным белком (GFP, зеленая флуоресценция, рисунок 9), и

окрашивании срезов антителами против бежа растущих нервных окончаний вАР43 кроме ОАР43-позитивных клеток (красная флуоресценция, рисунок 6) были обнаружены единичные двойные позитивные клетки, то есть СКЖТ-ОРР, экспрессировавшие вАР43. Эти наблюдения могут свидетельствовать о возможности спонтанной дифференцировки СКЖТ в нейральном направлении.

Ж

Ж

? ^р

*

Рисунок 6. САР43 и СРР-позитивные клетки.

Иммуноцитохимическиы анализ срезов матригеля. Красным г\ветом светятся Сар43-позитивные клетки, зеленым - СРР-позитивные, трансплантированные СКЖТ. Желтый цвет находится в местах солокализации йАР43 и СРР (показано стрелками). Синим цветом окрашены ядра клеток.

Индукция нейральной дифференцировки СКЖТ

Чтобы проверить возможность нейральной дифференцировки СКЖТ, мы выбрали несколько описанных ранее индукторов, а также добавили новые способы воздействия: ретиноевая кислота, нейротрофические факторы ЕШ№ и и

комбинации этих факторов с деметилирующим агентом 5-азацитидином. 5-азацитидин является аналогом нуклеотидного основания цитидина, который не подвержен метилированию. За счет того, что он встраивается в ДНК, происходит частичное неспецифическое деметилирование промоторов, что в свою очередь меняет структуру хроматина и делает некоторые участки ДНК более доступными для факторов транскрипции. В сочетании с определенными регуляторами генной экспрессии, какими являются ретиноевая кислота и нейротрофические факторы, можно усилить экспрессию специфических генов.

Для выбора наиболее эффективных индукторов были проанализированы более 10 различных описанных в литературе способов индукции (Ав1у'1ап Р.Н. е1 а1. 2003; Н. е1 а1. 2006). После воздействия индукторами изменение экспрессии маркерных генов нейральной дифференцировки анализировали методом ПЦР в реальном времени.

Добавление нейротрофического фактора ВООТ или ретиноевой кислоты совместно с 5-азацитидином привело к значительному повышению уровня мРНК нестина

16

(пеэйп), бета 3 тубулина (ТиВВ), нейрон-специфической енолазы (Епо2) и белка микротрубочек 2 (МАР2). Влияние и ретиноевой кислоты на уровень мРНК

маркерных генов было подтверждено на образцах СЮКТ, полученных от 8 пациентов (рисунок 7).

Рисунок 7. Относительная экспрессия нейральных маркерных генов при индукции СКЖТ ретиноевой кислотой или BDNF в присутствии 5-азацитидина.

Анализ проводили методом ПЦР в реальном времени, уровень мРНК анализируемых генов выравнивали по отношению к двум генам неизменного уровня экспрессии (house keeping genes) (GAPDH, fi-actin) (n=12, * - p<0,05 по сравнению с контролем и СКЖТ, обработанными 5-азацитидином, aza).

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что ретиноевая кислота стимулирует экспрессию нестина и бета 3 тубулина в СКЖТ, тогда как BDNF активирует все маркерные гены, включая Епо2 и МАР2. Экспрессия маркеров нейральной дифференцировки была подтверждена и на уровне белка при окрашивании клеток, проинкубированных в течение 3-х дней в присутствии BDNF и ретиноевой кислоты с 5-азацитидином антителами против нестина или бета 3 тубулина (рисунок 8).

100 мкм

1.00 мкм

100 мкм

Рисунок 8. Экспрессия нейральных маркерных генов нестина (А) и бета 3 тубулина (Б) при индукции СКЖТ ретипоевой кислотой или в присутствии 5-

азацитидина.

Иммуноцитохимическое окрашивание при помощи кроличьих антител против нестина (красное окрашивание) и оета 3 тубулина (зеленое окрашивание).

Таким образом, индукция нейротрофическим фактором ВОЫР и ретиноевой кислотой повышает экспрессию нейральных маркеров в СКЖТ, а значит, направляет дифференцировку этих клеток в нейральном направлении.

Влияние индукции нейральной дифференцировки на экспрессию цейротрофических факторов СКЖТ

Чтобы проверить функциональную роль индукции нейральной дифференцировки СКЖТ, была проведена оценка экспрессии нейротрофических факторов в этих клетках после добавления индукторов.

Оказалось, что индукция нейральной дифференцировки посредством повышает содержание мРНК ОООТ примерно в 2 раза, N0? - почти в 2,5 раза, а самого ВБИЕ на 30 %, а воздействие ретиноевой кислотой увеличивает в 2 раза уровень мРНК ООМГ и N0?, не влияя на мРНК ВВОТ. В то же время экспрессия УЕвТ остается неизменной. Полученные данные могут свидетельствовать о том, что в этой популяции есть клетки, имеющие потенциал развития в нейральном направлении или собственно нейральные предшественники. Чтобы проверить, как влияет индукция нейральной дифференцировки на способность СКЖТ стимулировать рост нервных волокон, была использована модель подкожной имплантации матригеля.

Стимуляция прорастания нервов в матригель СКЖТ, индуцированными к

нейральной дифференцнровке

Для того, чтобы оценить влияние индукции нейральной дифференцировки СКЖТ на их способность стимулировать прорастание нервов в матригель, было проведено сравнение количества нервных волокон в имплататах, содержащих неиндуцированные в нейральном направлении СКЖТ, культивированные при 21 % кислорода (СКЖТ_норм.) и при 1 % кислорода (СКЖТ_гипокс.) и СКЖТ, индуцированные нейротрофическим фактором ЕШИР (СКЖТ_ЕШЫР) или ретиноевой кислотой (СКЖТ_ЯА) в присутствии 5-азацитидина.

При введении имплантатов матригеля с индуцированными СКЖТ, рост нервных волокон усиливался по отношению к стимуляции неиндуцированными СКЖТ, культивированными в условиях нормального или сниженного содержания кислорода (рисунок 9). Это выражалось как в увеличении количества, так и в увеличении длинны нервных волокон на срезах матригелей, содержащих индуцированные СКЖТ, по сравнению с величиной этих показателей в матригелях, содержащих неиндуцированные

клетки (рисунок 9).

90

| 70

60

| 50

о 40

30

20

10

Вколичество I длина

контроль СКЖТнорм СКЖТ_П1П СКЖТ_ВОЫР СКЖТ_РК

Рисунок 9. Индукция нейральной дифференцировки СКЖТ усиливает их стимулирующий эффект на рост нервных волокон в матригеле.

Серым цветом отмечено среднее количество ОАР43-позитивных структур, штриховкой - суммарная длина нервных волокон на поле зрения (п=15, * - р<0,05 по отношению к контролю и группам с неиндуцированными СКЖТ).

Полученные данные об экспрессии нейротрофических факторов и их рецепторов в СКЖТ, а также о способности этих клеток дифференцироваться в нейральном направлении и стимулировать рост нервных волокон, свидетельствуют о том, что в популяции СКЖТ содержатся клетки, потенциально способные участвовать в нейрогенезе как путем стимуляции роста нервных окончаний за счет секреции нейротрофических факторов, так и за счет дифференцировки и непосредственного участия в построении нервных волокон. Это указывает на перспективность разработки подходов к использованию СКЖТ для регенерации нервной ткани.

Влияние индукции нейральной дифференцировки на выживаемость СКЖТ при трансплантации в нервную ткань

Поскольку воздействие ВБОТ и ретиноевой кислоты вместе с 5-азацитидином усиливает экспрессию нейральных маркеров и нейротрофических факторов роста в СКЖТ, это может влиять на выживаемость этих клеток при их трансплантации в нервную ткань. Для проверки этого предположения мышиные СКЖТ, выделенные из самцов линии Ыаекб-ОРР, были подвергнуты индукции в течение 3-х дней, а затем введены в головной мозг (в стриатум) мышей линии Ыаскб. Контрольной группе животных вводили неиндуцированные клетки. Экспрессия зеленого флуоресцентного белка ОРР позволяет визуализировать клетки под ультрафиолетовым излучением. Через 6, 9 и 11 дней мы анализировали срезы мозга на предмет наличия живых ОРР-меченых клеток. На шестой день в контрольной и двух опытных группах (индукция ЕШ№+5-азацитидином и ретиноевой кислотой с 5-азацитидином) было примерно равное количество клеток, но индуцированные СКЖТ мигрировали из области введения в окружающую ткань мозга, тогда как контрольные клетки оставались в области введения (рисунок 10).

ч Ч

■ ■ X X

\

< А Б в

Рисунок 10. Срезы мозга мыши с введенными СКЖТ мыши, мечеными вЕР. Анализ проводился на 6 день после трансплантации. А - контрольные СКЖТ, белыми стрелками отмечена граница между введенными клетками и тканью реципиента; Б - СКЖТ, индуцированные ВОИР и 5-азацитидином, В - СКЖТ, индуцированные ретиноевой кислотой и 5-азацитидином, розовыми стрелками отмечены трансплантированные СКЖТ, мигрирующие из области введения в ткань реципиента.

На 9-й день после трансплантации количество СРР+ клеток в контрольной группе было меньше, чем в опытных, но различие не достигало статистической достоверности. К 11-ому дшо вЕР+ клетки на срезах мозга контрольных мышей отсутствовали, тогда как в опытных группах, где вводились индуцированные СКЖТ, присутствовали ОРР+ клетки, хотя их количество уменьшалось примерно втрое по сравнению с 6-м днем после трансплантации (рисунок И).

6 дней 9 дней 11 дней

Рисунок 11. Относительное количество СКР-позитивных СКЖТ мыши, трансплантированных в мозг мыши на 6,9 п 11 день после трансплантации.

Средняя площадь СГР-позшпивной области на поле зрения, посчитанная по уровню зеленой флуоресценции (п-15, * - р<0,05 по сравнению с контролем).

Таким образом, индукция нейральной дифференцировки СКЖТ путем воздействия на эти клетки ЕЮ№ и ретиноевой кислотой на фоне 5-азацитидина улучшает выживаемость клеток после их трансплантации в нервную ткань. Повышение выживаемости может быть обусловлено не столько нейральной дифференцировкой этих клеток, сколько повышением в них экспрессии нейротрофических факторов при индукции этой дифференцировки. Эти результаты указывают на перспективность разработки методов предтрансплантационной подготовки СКЖТ путем их культивирования в присутствии ретиноевой кислоты и 5-азацитидина для улучшения выживаемости

клеток при их трансплантации в нервную ткань с целью лечения неврологических заболеваний.

В результате проведенного исследования установлено, что СКЖТ экспрессируют и секретируют нейротрофические факторы роста BDNF, NGF и GDNF и эта экспрессия увеличивается при культивировании клеток в условиях пониженного содержания кислорода. СКЖТ экспрессируют также рецепторы нейротрофических факторов: р75, TrkA, TrkB и TrkC, а также нейропилин (NP1), передающий ангиогенный и нейрогенный сигналы от VEGF. В общей популяции СКЖТ выявлена субпопуляция клеток (примерно 10%), несущая рецептор к нейротрофическим факторам TrkB, которая экспрессирует значительно больше, чем остальные клетки (TrkB негативные) других рецепторов к нейротрофическим факторам, а также экспрессирует нейральные маркерные гены (такие как нестин, бета 3 тубулин, МАР2 и Епо2). Это может указывать на нейральную природу этой субпопуляции СКЖТ. Можно предположить, что эта популяция представляет собой региональные нейральные прогениторные клетки, способные дифференцироваться в шванновские клетки. На срезах матригеля мы обнаружили единичные СКЖТ, окрашивающиеся антителами на маркерный белок предшественников шванновских клеток GAP43 (Curtis R. et al. 1992). При изучении механизмов репарации нервов установлено, что шванновские клетки являются главными аттрактантами для растущего нервного окончания. Возможно, среди СКЖТ есть предшественники шванновских клеток, которые могут привлекать растущие аксоны и способствовать формированию нервного волокна,

Ретиноевая кислота или BDNF на фоне деметилирующего агента 5-азацитидина индуцируют начальные этапы нейральной дифференцировки СКЖТ, проявляющиеся экспрессией нейральных маркерных белков - нестина, бета 3 тубулина, нейрон-специфической енолазы. Индукция нейральной дифференцировки СКЖТ увеличивает в них экспрессию нейротрофических факторов, повышает их способность стимулировать рост нервных окончаний в подкожном имплантате матригеля и увеличивает выживаемость СКЖТ при трансплантации в головной мозг мыши. Нейротрофическая секреторная активность СКЖТ и способность к нейральной дифференцировке делает эти клетки потенциальным клеточным материалом для трансплантации в нервную ткань с целью восстановления ткани мозга и периферических нервных волокон.

выводы

1. Впервые обнаружено, что стромальные клетки жировой ткани (СКЖТ), известные активаторы ангиогенеза, стимулируют также рост нервных волокон.

2. Показано, что СКЖТ секретируют как ангиогенные, так и нейротрофические (ВЭЫР, N0?, СБЫР) факторы, причем гипоксия активирует как экспрессию этих факторов, так и стимулирующее влияние этих клеток на рост нервных волокон.

3. Выявлена субпопуляция СКЖТ, экспрессирующих маркерные гены нейральной дифференцировки. Эти клетки имеют на поверхности рецепторы к ряду нейротрофических факторов.

4. Культивирование СКЖТ с ВООТ или ретиноевой кислотой в сочетании с ДНК-деметилирующим агентом 5-азацитидином повышает экспрессию маркеров нейральной дифференцировки в этих клетках.

5. Индукция нейральной дифференцировки СКЖТ, вызываемая этими факторами, повышает экспрессию нейротрофических факторов (ВООТ, N0?, ОЭЖ), а также увеличивает жизнеспособность СКЖТ при трансплантации в головной мозг.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОТ-ПЦР полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией ПЦР полимеразная цепная реакция

СКЖТ стромальные клетки жировой ткани

СКЖТ гип стромальные клетки жировой ткани, культивируемые при 1 % кислорода СКЖТ_норм стромальные клетки жировой ткани, культивируемые при 21 % кислорода СКЖТ РК стромальные клетки жировой ткани, культивируемые с добавлением 5-азацитидина и ретиноевой кислоты

СКЖТ_ВООТ стромальные клетки жировой ткани, культивируемые с

добавлением 5-азацитидина и BDNF ФСБ фосфатно-солевой буфер

ЭСБ эмбриональная сыворотка быка

BDNF brain derived neurotrophic factor, мозговой нейротрофический фактор

GAP43 growth associated protein 43, белок растущих нервных окончаний GDNF glial cell-derived neurotrophic factor, глиальный нейротрофический фактор

GFP green fluorescent protein, зеленый флюоресцентный белок

NGF nerve growth factor, фактор роста нервов

VEGF vascular endothelian growth factor, фактор роста эндотелиальных клеток

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Лопатина Т.В., Калинина Н.И., Беме А.А., Ревищин А.В., Павлова Г.В., Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Индукция нейральной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани нейротрофическими факторами и ретиноевой кислотой. Сборник тезисов конференции «Молодые ученые в медицине-2008», стр.204, Казань, 23 - 26 апреля 2006 г.

2. Lopatina T.V., Kalinina N.I., Revischin A.V., Pavlova G.V., Parfyonova Y.V., Tkachuk V.A. DNA Dcmethylation Markedly Promotes Neural Differentiation of Adipose Stromal Cells Induced by Brain Derived Neurotrophic Factor or Retinoic Acid. Сборник тезисов международного форума аспирантов Тихоокеанского региона, стр. 70-71. Омаха, США, 2-6 июня 2008г.

3. Лопатина Т.В., Калинина Н.И., Беме А.А., Ревищин А.В., Павлова Г.В., Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Индукция нейральной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани нейротрофическими факторами и ретиноевой кислотой. Сборник тезисов всероссийской школы-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения», стр. 44. Москва 9-11 июня 2008г.

4. Lopatina T.V., Kalinina N.I., Revischin A.V., Pavlova G.V., Parfyonova Y.V., Tkachuk V.A. DNA Demethylation Markedly Promotes Neural Differentiation of Adipose Stromal Cells Induced by Brain Derived Neurotrophic Factor or Retinoic Acid. Сборник тезисов шестого собрания международного общества по изучению стволовых клеток (6th ISSCR Annual Meeting), стр. 81. Филадельфия, США, 11-14 июня 2008г.

5. Lopatina T.V., Kalinina N.I., Revischin A.V., Pavlova G.V., Parfyonova Y.V., Tkachuk V.A. DNA Demethylation Markedly Promotes Neural Differentiation of Adipose Stromal Cells Induced by Brain Derived Neurotrophic Factor or Retinoic Acid. Сборник тезисов второго международного конгресса по стволовым клеткам и формированию ткани (2nd International Congress on Stem Cells and Tissue Formation), стр. 144. Дрезден, Германия, 6-9 июля 2008г.

6. Лопатина Т.В., Калинина Н.И., Ревищин А.В., Беме А.А., Спирова И.А., Павлова Г.В., Парфенова Е.В. Индукция нейральной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2008, том III, 4, стр. 50-54.

7. Rubina K.A., Kalinina N.I., Efimenko A.Y., Lopatina T.V., Mclikhova V.A., Tsokolacva Z.N., Sysocva V.Y., Tkachuk V.A., Parfyonova Ye.V. Adipose Stromal Cells Stimulate Angiogenesis via Promoting Progenitor Cell Differentiation, Secretion of Angiogenic Factors, and Enhancing Vessel Maturation. Tissue Eng (Part A). 2009 Apr 9., p. 1-12.

8. Лопатина T.B., Калинина Н.И., Парфенова E.B. Опыт невирусной трансфекции стромальных клеток жировой ткани. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2009 № 2, стр 73-77.

Подписано в печать:

26.08.2009

Заказ № 2403 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лопатина, Татьяна Владимировна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Физиологическое обновление нервной ткани: механизмы регуляции нейрогенеза

Генетические механизмы, запускающие нейрогенез

Пронейральные гены

Нейротрофические факторы

Рецепторы нейротрофических факторов

Рост и регенерация нервных окончаний

Рост периферических нервов

Регенерация нервного волокна.

Стромальные клетки жировой ткани как материал для стимуляции роста нервов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение стромальных клеток из жировой ткани

Культивирование СКЖТ

Моделирование гипоксии

Индукция нейральной дифференцировки СКЖТ

Выделение РНК из клеток

Синтез первой цепи ДНК на матрице РНК и ПЦР в реальном времени

Анализ содержания факторов роста в среде культивирования с помощью иммуноблоттинга

Имплантация СКЖТ в матригеле

Иммунофлуоресцентный анализ

Анализ содержания ТгкВ на СКЖТ с помощью проточной цитометрии

Оценка плотности нервных волокон в матригеле

Оценка выживаемости и миграции СКЖТ при трансплантации

Статистическая обработка данных

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

СКЖТ стимулируют рост нервных волокон в Матригеле

СКЖТ секретируют нейротрофические факторы роста

Индукция нейральной дифференцировки СКЖТ

Индукция нейральной дифференцировки повышает экспрессию нейротрофических факторов в СКЖТ

Индукция нейральной дифференцировки СКЖТ повышает их способность стимулировать рост нервных волокон в матригеле

Индукция СКЖТ повышает выживаемость этих клеток при трансплантации в нервную ткань

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Нейральная дифференцировка СКЖТ

Наличие в популяции СКЖТ нейральных предшественников

Секреторная активность СКЖТ регулирует дифференцировку нейральных и эндотелиальных предшественников, стимулирует рост нервных окончаний

Возможность применения СКЖТ для репарации нервной ткани

Планируемое развитие данного исследования

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Стимуляция роста нервных волокон стромальными клетками жировой ткани и дифференцировка этих клеток в нейральном направлении"

Физиологическое обновление нервной ткани взрослого организма происходит благодаря пролиферации и дифференцировке нейральных стволовых клеток в центральной и периферической нервной системе. Однако при обширных повреждениях мозга в результате инсультов и травм, при нейродегенеративных заболеваниях, а также при утрате значительной части нерва, активности нейральных стволовых клеток оказывается недостаточно для полноценного восстановления нервной ткани. Так, повреждения нервного волокна протяженностью более 3 см индуцируют его дегенерацию [1], поэтому в таких случаях восстановления иннервации ткани-мишени не происходит. В свою очередь ткань, не получающая нервные импульсы в течение длительного времени, также подвергается дегенерации [2], поэтому скорость восстановления нервного волокна играет решающую роль в сохранении функциональной ткани. Поскольку существующие методы медикаментозной терапии и классической нейрохирургии не приносят желаемых результатов, а использование донорских нервных трансплантатов ограничено в связи с иммунологическими реакциями на чужеродные ткани, поиск подходов для стимуляции роста нервных волокон и восстановления клеток центральной нервной системы является актуальной темой в медицинской биологии.

Эффективным подходом для лечения неврологических заболеваний может оказаться трансплантация клеток, которые способны не только встроиться в поврежденную ткань, по и долговременно стимулировать репарацию этой ткани путем секреции нейротрофических и других факторов роста. В начале 80-х годов для леченияневрологических заболеваний была предложена клеточная терапия. В частности, для репарации поврежденного спинного мозга была использована трансплантация эмбриональных стволовых клеток, мезенхимальных клеток костного мозга, нейральных стволовых клеток [36]. Однако применение аллогенных клеток для трансплантации может приводить к переносу инфекций от донора реципиенту, а также вызывать реакцию отторжения со стороны иммунной системы реципиента. Поэтому возможно, более эффективной станет трансплантация аутологичных клеток. Терапия собственными (аутологичными) клетками уже находит применение для лечения ишемических заболеваний [7], невропатий [8], для замещения костных и хрящевых дефектов, а также для восстановления кожного покрова после ожогов. Исследования последних лет показали огромный потенциал клеточной трансплантологии для восстановления иннервации после повреждения периферических нервов [9]. Немаловажное значение иннервация имеет для ишемизированных тканей, так как известно, что рост сосудов зависит от роста нервов [10].

С точки зрения регенерации поврежденных нервных окончаний наиболее изученными в клеточной терапии являются эмбриональные стволовые клетки [11], гемопоэтические стволовые клетки [12], нейральные предшественники [13-15], мезенхимальные клетки костного мозга [16-18] и культивированные предшественники эндотелиальных клеток [19-21].

Несмотря на воодушевляющие эффекты применения этих клеток сложность и болезненность их получения в достаточном количестве, а также препятствии их использования по этическим причинам (в случаеэмбриональных стволовых клеток) приводят к необходимости поиска других источников мультипотентных клеток.

Доступным источником аутологичных прогениторных клеток оказалась жировая ткань. Ее строма содержит клетки по своему фенотипу, экспрессии генов и дифференцировочным способностям сходные с хорошо изученными мезенхимальными прогениторными клетками костного мозга. Но в отличие от клеток костного мозга, стромальные клетки жировой ткани (СКЖТ) возможно получить в достаточном количестве с помощью ферментативной обработки жировой ткани и последующего фракционирования полученной суспензии практически для каждого пациента. Полученные таким образом СКЖТ способны адгезировать на пластик и пролиферировать в культуре, а значит могут быть наращены а количестве, необходимом для трансплантации.

Стромальные клетки жировой ткани способны дифференцироваться во многие типы клеток и секретировать ангиогенные и антиапоптотические факторы [22], а также нейротрофические [23, 24] и другие факторы роста [25]. На различных моделях ангиогенеза in vitro и in vivo было показано, что эти клетки стимулируют рост сосудов [26]. Стимулирующий эффект СКЖТ на рост сосудов опосредован их секреторной активностью, а также способностью этих клеток встраиваться в периэндотелиальное пространство новообразованных сосудов [26].

В то же время, известно, что рост сосудов сопряжен с ростом нервов; эти процессы имеют общие сигнальные молекулы и механизмы регуляции [27]. Клетки эндотелия секретируют нейротрофический фактор BDNF и привлекают растущие нервные окончания [28], а шванновские клетки периферических нервов секретируют VEGF, тем самымактивизируя ангиогенез [29]. Сопряженность нервов и сосудов подтверждается и тем фактом, что все крупные сосуды иннервируются, а нервные волокна кровоснабжаются. Поэтому способность СКЖТ стимулировать ангиогенез дает основания предполагать, что эти клетки могут стимулировать и рост нервов.

В то же время, есть данные, что эти клетки могут дифференцироваться в нейральном направлении и способствуют репарации повреждений спинного мозга [30-32].

Цель данной работы заключалась в исследовании способности стромальных клеток жировой ткани стимулировать рост нервных волокон, экспрессировать нейротрофические факторы и их рецепторы, а также дифференцироваться в нейральном направлении.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:1. Проанализировать влияние стромальных клеток жировой ткани на рост нервных волокон in vivo в матригеле.

2. Оценить экспрессию нейротрофических факторов роста стромальными клетками жировой ткани при культивировании в условиях нормального и сниженного содержания кислорода.

3. Изучить экспрессию рецепторов нейротрофических факторов роста стромальными клетками жировой ткани при культивировании в условиях нормального и сниженного содержания кислорода.

4. Подобрать условия индукции нейральной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани in vitro.

5. Оценить влияние нейральной дифференцировки на экспрессию нейротрофических факторов роста in vitro, их способностьстимулировать рост нервных волокон в матригеле in vivo и жизнеспособность этих клеток при трансплантации в нервную ткань.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Лопатина, Татьяна Владимировна

выводы

1. Впервые обнаружено, что стромальные клетки жировой ткани (СКЖТ), известные активаторы ангиогенеза, стимулируют также рост нервных волокон.

2. Показано, что СКЖТ секретируют как ангиогенные, так и нейротрофические (ВБ№, N0?, СО№) факторы, причем гипоксия активирует как экспрессию этих факторов, так и стимулирующее влияние этих клеток на рост нервных волокон.

3. Выявлена субпопуляция СКЖТ, экспрессирующих маркерные гены нейральной дифференцировки. Эти клетки имеют на поверхности рецепторы к ряду нейротрофических факторов.

4. Культивирование СКЖТ с ВБОТ или ретиноевой кислотой в сочетании с ДНК-деметилируюгцим агентом 5-азацитидином повышает экспрессию маркеров нейральной дифференцировки в этих клетках.

5. Индукция нейральной дифференцировки СКЖТ, вызываемая этими факторами, повышает экспрессию нейротрофических факторов (ВОКР, N0?, ООИР), а также увеличивает жизнеспособность СКЖТ при трансплантации в головной мозг.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лопатина, Татьяна Владимировна, Москва

1. Koeppen, A.H., Wallerian degeneration: history and clinical significance. J Neurol Sci, 2004. 220(1-2): p. 115-7.

2. Padilla, F., et al., Upregulalion and redistribution of cadherins reveal specific glial and muscle cell phenotypes during wallerian degeneration and muscle denervation in the mouse. JNeurosci Res, 1999. 58(2): p. 270-83.

3. Meng, X.T., et al., Co-transplantation of bFGF-expressing amniotic epithelial cells and neural stem cells promotes functional recovery in spinal cord-injured rats. Cell Biol Int, 2008. 32(12): p. 1546-58.

4. Deda, H., et al., Treatment of chronic spinal cord injured patients with autologous bone marrow-derived hematopoietic stem cell transplantation: 1-year follow-up. Cytotherapy, 2008. 10(6): p. 565-74.

5. Kim, K.N., et al., Effect of human mesenchymal stem cell transplantation combined with growth factor infusion in the repair of injured spinal cord. Acta Neurochir Suppl, 2006. 99: p. 133-6.

6. Howard, M.J., et al., Transplantation of apoptosis-resistant embryonic stem cells into the injured rat spinal cord. Somatosens Mot Res, 2005. 22(1-2): p. 37-44.

7. De Vriese, A.S., et al., Autologous transplantation of bone marrow mononuclear cells for limb ischemia in a caucasian population with atherosclerosis obliterans. J Intern Med, 2008. 263(4): p. 395-403.

8. Burt, R.K., et al., T cell-depleted autologous hematopoietic stem cell transplantation for multiple sclerosis: report on the first three patients. Bone Marrow Transplant, 1998. 21(6): p. 537-41.

9. Guenard, V., et al., Syngeneic Schwann cells derived from adult nerves seeded in semipermeable guidance channels enhance peripheral nerve regeneration. J Neurosci, 1992. 12(9): p. 3310-20.

10. Taylor, G.I., M.P. Gianoutsos, and S.F. Morris, The neurovascular territories of the skin and muscles: anatomic study and clinical implications. Plast Reconstr Surg, 1994. 94(1): p. 1-36.

11. Cui, L., et al., Transplantation of embryonic stem cells improves nerve repair and functional recovery after severe sciatic nerve axotomy in rats. Stem Cells, 2008. 26(5): p. 1356-65.

12. Schalow, G., Stem cell therapy and coordination dynamics therapy to improve spinal cord injury. Electromyogr Clin Neurophysiol, 2008. 48(5): p. 233-53.

13. Shi, Y., et al., Transplantation of neural stem cells overexpressing glia-derived neurotrophic factor promotes facial nerve regeneration. Acta Otolaryngol, 2008: p. 19.

14. Nogradi, A. and A. Szabo, Transplantation of embryonic neurones to replace missing spinal motoneurones. Restor Neurol Neurosci, 2008. 26(2-3): p. 215-23.

15. Kulbatski, I., et al., Glial precursor cell transplantation therapy for neurotrauma and multiple sclerosis. Prog Histochem Cytochem, 2008. 43(3): p. 123-76.

16. Tohill, M., et al., Rat bone marrow mesenchymal stem cells express glial markers and stimulate nerve regeneration. Neurosci Lett, 2004. 362(3): p. 200-3.17.18.19.20.21.22.23.24.25.26.27.28.29.30.31.32.33,34.35.36,

17. Dezawa, M., et al., Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells. Eur J Neurosci, 2001.14(11): p. 17716.

18. Dezawa, M., Central and peripheral nerve regeneration by transplantation of Schwann cells and transdifferentiated bone marrow stromal cells. Anat Sci Int, 2002. 77(1): p. 12-25.

19. Assmus, B., et al., Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction (TOPCARE-AMI). Circulation, 2002. 106(24): p. 3009-17.

20. Rehman, J., et al., Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation, 2004. 109(10): p. 1292-8.

21. Nambu, M., et al., Accelerated wound healing in healing-impaired db/db mice by autologous adipose tissue-derived stromal cells combined with atelocollagen matrix. Ann Plast Surg, 2009. 62(3): p. 317-21.

22. Rubina, K., et al., Adipose Stromal Cells Stimulate Angiogenesis via Promoting Progenitor Cell Differentiation, Secretion of Angiogenic Factors, and Enhancing Vessel Maturation. Tissue Eng Part A, 2009.

23. Altman, J. and G.D. Das, Post-natal origin of microneurones in the rat brain. Nature, 1965. 207(5000): p. 953-6.

24. Reynolds, B.A. and S. Weiss, Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science, 1992. 255(5052): p. 1707-10.

25. Kocsis, J.D. and S.G. Waxman, Schwann cells and their precursors for repair of central nervous system myelin. Brain, 2007. 130(Pt 8): p. 1978-80.37.38.39.40.41.42.43.44.45,46,47.4849