Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клетки дермальной папиллы из нервного гребня в морфогенезе волосяного фолликула

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Клетки дермальной папиллы из нервного гребня в морфогенезе волосяного фолликула"

005007525

Гнедева Ксения Юрьевна

Клетки дермальной папиллы из нервного гребня в морфогенезе волосяного фолликула

Специальности 03.03.04. - клеточная биология, цитология, гистология;

03.03.05. - биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2ЯН0 2О'|2

Москва-2012

005007525

Работа выполнена в лаборатории проблем клеточной пролиферации Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН и в лаборатории нейрогенеза Sanford-Burnham Medical Research Institute (La Jolla, Калифорния, США),

Научные руководители: кандидат биологических наук

Воротеляк Екатерина Андреевна (ИБР РАН) кандидат биологических наук Терских Алексей Васильевич (Sanford-Burnham)

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Александрова Мария Анатольевна (ИБР РАН) доктор биологических наук, профессор, Гривенников Игорь Анатольевич (ИМГ РАН)

Ведущая организация: Московский государственный университет

имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра эмбриологии.

Защита диссертации состоится «18» января 2012 г. в Í4-00 часов на заседании

диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Сайт: http://idbras.conicor.ru/: e-mail: idbras@bk.ru

Автореферат разослан ««т » декабря 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук ele0806@yandex.ru ^ У

Абрамова Е.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Волосяной фолликул является уникальной структурой и играет важную роль в процессе роста волос и поддержании гомеостаза эпидермиса. В морфогенезе волосяные фолликулы формируются из клеток эпидермиса и подлежащей мезенхимы. Популяцией мезенхимных клеток, расположенных в основании волосяного фолликула, являются клетки дермальной папиллы (ДП). Эти клетки играют важную роль в регуляции цикла роста волос и участвуют в регенерации кожи при травмах. Также клетки ДП способны дифференцироваться в адипо-, остео- и хондрогенном направлениях in vitro, что делает их изучение важной и актуальной задачей. Наряду с широким спектром мезенхимных дифференцировок клетки ДП способны дифференцироваться в нейроны и глию периферической нервной системы. Подобные данные существуют для ДП мыши и человека, но исследований потенциала к нейральной дифференцировке у клеток ДП крысы проведено не было. Между тем, это могло бы показать универсальность феномена нейральной дифференцировки клеток ДП для млекопитающих.

Способность к нейральной дифференцировке может быть объяснена происхождением клеток ДП. Генетическое маркирование показало, что ДП вибрисс мыши происходят от клеток нервного гребня, однако, детально роль клеток нервного гребня на ранних этапах морфогенеза вибрисс мыши не была исследована. Неизвестно, принимают ли клетки нервного гребня участие в формировании дермальных конденсатов или мигрируют в дермальную папиллу вибрисс на более поздних этапах.

Изучение происхождения дермы и ДП волосяного покрова головы у человека - еще одна актуальная задача. Подходом к её решению является культура эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека. На данный момент возможно получение клеток нервного гребня из ЭСК. Исследование

з

потенциала этих клеток к дифференцировке в клетки дермы и ДП могло бы стать альтернативным подходом к изучению процессов фолликулогенеза у человека. Более того, клетки ДП способны индуцировать формирование волосяных фолликулов при подкожных трансплантациях. Использование этих клеток является перспективным направлением в биомедицине. Применение клеток ДП может со временем решить проблемы восстановления волосяного покрова головы у людей с заболеваниями волосяного фолликула или потерей его функции.

Цель и задачи исследования. Целью работы стало изучение роли клеток дермальной папиллы из нервного гребня в морфогенезе волосяного фолликула. В работе предстояло решить следующие задачи:

1. Проследить судьбу клеток, производных нервного гребня, в морфогенезе вибрисс мыши.

2. Изучить потенциал к нейральной дифференцировке клеток ДП крысы.

3. Охарактеризовать дифференцировку ЭСК клеток человека в клетки нервного гребня и ДП.

4. Изучить способность клеток ДП, полученных из ЭСК, индуцировать рост волосяных фолликулов при подкожных пересадках in vivo.

5. Изучить роль сигнального пути BMP в формировании клеток ДП человека.

6. Изучить роль факторов роста в начальных этапах формирования волосяных фолликулов на модели морфогенеза кератиноцитов человека in vitro.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые было показано, что на стадии 12-и суток эмбрионального развития в дерме головы мыши могут быть найдены производные клеток нервного гребня, которые дают начало дермальным конденсатам, предшественникам ДП волосяных фолликулов вибрисс.

У клеток ДП вибрисс крысы впервые выявлен потенциал к нейрапьной дифференцировке. Нейроны и глия периферической нервной системы, полученные из клеток ДП, являются альтернативным источником нейральных клеток для лечения нейродегенеративных заболеваний.

Впервые разработан метод получения клеток ДП человека из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК-ДП). С помощью разработанного метода показано, что формирование клеток нервного гребня является необходимым промежуточным этапом дифференцировки ЭСК в клетки дермальной папиллы. ЭСК-ДП способны индуцировать волосяные фолликулы при подкожных пересадках бестимусным мышам и могут быть получены в неограниченных количествах, в отличие от культивируемых клеток ДП человека. Использование ЭСК-ДП может стать первым шагом в решении проблем потери волос и дисфункции волосяного фолликула у человека.

Впервые показано, что сигнальный путь BMP играет важную роль в формировании клеток ДП человека и поддержании их морфогенетического потенциала. Использование ЭСК позволяет изучать сигнальные пути дифференцировки клеток нервного гребня в клетки ДП. Такая возможность уникальна, поскольку доступ к эмбриональным тканям человека ограничен.

На модели морфогенеза кератиноцитов впервые выявлены ростовые факторы, которые стимулируют начальные этапы фолликулогенеза у человека. Моделирование процессов эпителиального морфогенеза в культуре является актуальным направлением современной клеточной биологии, которое пока слабо развито.

Вклад автора. Автором были спланированы и выполнены все эксперименты, описанные в диссертационной работе, за исключением проточной флуориметрии, которая была выполнена Giulio С. (сотрудником лаборатории нейрогенеза Sanford-Burnham Medical Research Institute). Автором также был проведен анализ всех полученных данных, включая данные проточной флуориметрии.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представленны на конференциях: Международный симпозиум «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза» (Москва, 2007); 2009 Cold Spring Harbor Laboratory Meeting on Stem Cell Biology (Cold Spring Harbor, 2009); VI международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009); в двух различных докладах на 4th Annual Stem Cell Meeting on the Mesa (La Jolla, 2009); 5th Annual Stem Cell Meeting on the Mesa (La Jolla, 2010); Конференция молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова (Москва, 2008, 2009 гг.); Stem Cells in Development, Tissue Homeostasis, and Disease (Santa Fe, 2011); 2nd Annual Development and Aging Program Retreat (La Jolla, 2011) (Премия за лучший доклад); III конференция «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты», памяти Н.Г. Хрущова (Москва, 2011).

Публикации. По материалам работы опубликовано 14 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих перечню ВАК - 2, статей в иностранных рецензируемых журналах - 2, тезисов докладов и материалов конференций - 10.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 134 страницах, содержит 45 рисунков, 2 таблицы и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список литературы, включающий 145 цитируемых источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Генномодифицированные мыши. Для получения генотипа WntlCre/ZEG скрещивали мышей двух линий. У первых под промотором Wntl экспрессируется фермент - Сге-рекомбиназа, способный узнавать и вырезать из генома участки ДНК, фланкированные LoxP сайтами. У вторых, линии ZEG мышей, имеется двойной репортерный ген под CMV-p-actin промотором, и экспрессия GFP блокирована фланкированным LoxP сайтами участком ДНК. При скрещивании этих линий в потомстве мы получали животных, у которых только в клетках нервного гребня (под Wntl промотором) экспрессируется Сге-рекомбиназа, а, следовательно, и GFP.

Получение первичных кератиноцитов и фибробластов из кожи мыши и человека. Фрагменты кожи промывали в растворе Хэнкса, содержащем 80мкг/мл гентамицина, и помещали в 0,2%-ный раствор диспазы (Sigma) в среде DMEM на 14-16 ч при +4°С. После этого эпидермис пинцетом отделяли от дермы по линии базальной мембраны и помещали в смесь растворов PBS + 0,25% трипсин (1:1) при 37°С на 7-10 мин. Действие трипсина ингибировали добавлением 5% сыворотки крупного рогатого скота. Пипетированием получали суспензию кератиноцитов, которую осаждали центрифугированием при 1000 об/мин (200g) в течение 5 мин. Дерму гомогенизировали с помощью глазных ножниц и помещали в 0.1% р-р трипсина при 37°С на 30-40 мин., затем культивировали в смеси сред DMEM:F12 (1:1) с добавлением 10% сыворотки плода коровы (Биолот), 4мМ L-глутамина (Sigma).

Индукция нейральной дифференцировки клеток ДП крысы. ДП крысы 2-3 пассажа культивировали на покрытой матригелем пластиковой посуде в концентрации 100 тыс клеток/см2 в нейрализующей среде следующего состава: среды DMEM, F12 и Glutamax-neurobasal (Gibco) в соотношении 1:1:2, 10% BIT 9500 (StemCell Technologies), 1 мМ глутамин

(Gibco), 100 нг/ил bFGF and 100нг/мл BDNF (оба Sigma). Дифференцировку проводили в течение 12-14 дней.

Получение клеток нервного гребня из эмбриональных стволовых клеток. Колонии ЭСК человека механически разделяли на 200-500 клеточные кластеры и культивировали 5 дней в чашках Петри низкой адгезии (Ted Pella, Redding, СА) в нейрализующей среде следующего состава: среды DMEM, F12 и Glutamax-neurobasal (Gibco) в соотношении 1:1:2, 10% BIT 9500 (StemCell Technologies), 1 мМ глутамин (Gibco), 20нг/мл EGF (Chemicon), 20нг/мл bFGF, 5 мкг/мл инсулин (Sigma) и 5 мМ никотинамид (Sigma). На б-ой день нейросферы переносили в пластиковую посуду, покрытую матригелем (BD Biosciences).

Иммуногистохимическое исследование. Клетки фиксировали 4% параформальдегидом 10 мин при 20°С или 12-14 часов при 4°С для кусочков ткани и эмбрионов мыши. Криосрезы промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и инкубировали 1 час при 20°С в блоковом р-ре (PBS, 0-0,3% Triton Х-100 (Sigma), 5% бычий сывороточный альбумин (БСА). Первичные антитела наносили в рекомендованной производителем концентрации при 4°С на 12-16 часов. После промывки в PBS наносили разведенные 1:500 вторые антитела, конъюгированные с флуорохромом (F1TC, Alexa), на 1 час при 20°С. Для окрашивания ядер использовали DAPI.

Количественный ПЦР в реальном времени. Клеточную РНК изолировали с помощью Quantitect набора (Qiagen). Для синтеза ДНК использовали 1 мкг РНК для каждой реакции. ДНК синтезировали с помощью набора для ретротранскрипции (Qiagen). Количественный ПЦР в реальном времени проводили с использованием SyberGreen (Invitrogen).

Трансплантация клеток иммунодефицитным мышам. Трансплантацию проводили методом «patch». Клетки мезенхимного происхождения (5млн /50мкл среды DMEM с добавлением 10% сыворотки плодов коровы) смешивали с суспензией первичных кератиноцитов мыши

(5млн/50мкл) и инъецировали подкожно иммунодефицитным мышам линии NUDE. Анализ трансплантатов проводили через 2-4 недели после инъекций.

Культивирование кератиноцитов в коллагеновом геле. Первичные кератиноциты помещали в подготовленные в коллагеновом геле «колодцы» объёмом 100 мкл. После прикрепления клеток (через 20-30 мин) добавляли среду DMEM:F12 (1:1) с добавлением 10% сыворотки плода коровы (Биолот), 4мМ L-глутамина (Sigma), 5мкг/мл инсулина (Sigma), 10-6 М изопротеренола (Sigma) и Юнг/мл EGF (Sigma).

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов, полученных на основе данных иммуногистохимии и трансплантаций, проводили в программе Excel (Microsoft). При обработке результатов оценивали значения средней величины и стандартного отклонения. При оценке достоверности различий показателей использовали t-критерий Стьюдента. Различие считали статистически достоверным, если уровень значимости был р<0,05, что является мерой достаточной надежности результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Происхождение дермалышй папиллы в морфогенезе вибрисс мыши. На мышах линии \VntlCreZZEG проследили судьбу клеток нервного гребня в формировании ДП вибрисс. У линии этих мышей производные клеток нервного гребня экспрессируют зеленый флуоресцентный белок (ОРР). Анализ начинали на стадии 12.5 суток развития, когда у эмбрионов мыши появляются первые дермальные конденсаты - будущие ДП вибрисс. Экспрессию СРР наблюдали в клетках дермы и дермальных конденсатах. На стадии 13.5 суток развития дермальные конденсаты формировали ДП, клетки которых экспрессировали ОРР (Рис. 1). На стадиях 16-18 суток развития и у взрослых животных 30-ого постнатального дня развития изучали расположение производных нервного гребня клеток, в вибриссах на криосрезах. ДП и дермальная капсула волосяных фолликулов вибрисс состояли из ОРР-положительных клеток. Таким образом, полученные нами данные показали, что клетки нервного гребня дают начало дерме головы, дермальным конденсатам, дермальной капсуле и ДП вибрисс мыши. Ранее было показано, что производные клеток нервного гребня входят в состав ДП вибрисс мыши (На£0з1н е1 а1., 2008), однако детальное исследования роли клеток нервного гребня на ранних этапах морфогенеза вибрисс мыши нами было проведено впервые.

Потенциал к нейральиой дифференцировке у клеток ДП вибрисс крысы. Происхождение клеток ДП из нервного гребня подтверждали, демонстрируя потенциал к нейральной дифференцировке. Для этого использовали ДП вибрисс крысы. Крупный размер вибрисс этого животного позволяет микрохирургически выделять ДП, что исключает возможность присутствия клеток другого происхождения и дает возможность судить об истинности трансдифференцировки. Гомогенность культуры клеток ДП подтверждали с помощью иммуногистохимического окрашивания

Сутки эмбрионального развития

Рис. 1. Вибриссы мыши линии \\^пиСге/гЕС на разных стадиях развития. Расположение ОРР-положительных производных нервного гребня клеток. Флуоресцентная микроскопия. Ядра окрашены 1)АР1. Масштабные отрезки для рядов вибрисс 250 мкм, для срезов вибрисс 50 мкм. ПН - постнатальный день

ЩФ Версикан SMA

Рис. 2. Клетки ДП крысы 2-ого пассажа в культуре. Иммуно-флуоресцентное окрашивание на маркеры ДП: щелочную фосфатазу (ЩФ), версикан и актин гладкомышечной мускулатуры (SMA). Ядра окрашены DAPI. Масштабные отрезки 100 мкм.

и

Глия

Нейроны

Рис. 3. Нейральная дифферен-цировка клеток ДП крысы 2-ого пассажа. Клетки с морфологией глии и нейронов. Фазово-контрастная микроскопия. Иммуногостохимическое окрашивание на маркеры глии (кислый глиальный фибрилярный белок, вРАР) и нейронов (белок ассоциированный с микротрубочками 2, МАР-2). Ядра окрашены ВАР1. Масштабные отрезки 100 мкм.

Рис. 4. Клетки ЭСК-НГ, ДП человека, ЭСК-ДП в культуре. Иммуногистохимическое окрашивание на маркеры ДП человека. Ядра окрашены ОАР1. Масштабные отрезки ЮОмкм.

кератиноциты

МДК

*w- ' V ___

ДП человека ЭСК-ДП

1 J** •

150-1

Рис. 6. Трансплантация клеток методом «patch». Фазово-контрастная микроскопия. Масштабные отрезки 1 мм.

График демонстрирует статистические данные по числу волос, образованных при трансплантациях разных видов клеток. Р<0.01 (**), Р<0.001 (***).

ЭСК 14 дней

ЭСК-НГ

ЭСК-НГ 7 дней

120п

80-

5 40"

ЭСК 14 дней ЭСК-НГ ТГК-НГ 7 дней ЭСК-ДП

0 "Г 10

Дни пиЛЛеоенииоовки

Рис. 7. Трансплантация клеток методом «patch». Фазово-контрастная микроскопия. Масштабные отрезки 1 мм.

График демонстрирует возрастание числа волос в трансплантатах со временем дифференцировки. Р<0.05 (*), Р<0.001 (***).

GFP/ФК

Версикан GFP/ФК

GFP ФК ЩФ GFP/ФК

Рис. 8. Волосяные фолликулы из трансплантатов ЭСК-ДП, трансдуцированных СГР. Фазово-контрастная (ФК) и флуоресцентная микроскопия. Иммуногисто-химическое окрашивание на маркеры ДП. Масштабные отрезки 100 мкм.

ЭСК-ДП

Ингибитор BMP

Ф 0.5

ЭСК-ДП Ингибитор BMP

Вереи Corin Nexin Р-75 Вимен SMA кан тин

Рис. 9. Клетки ЭСК-ДП, полученные в отсутствии или присутствии дорсоморфина в среде для дифференцировки. Трансплантация методом «patch». Фазово-контрастная микроскопия. Масштабные отрезки 0.5 мм.

Изменение уровня экспрессии генов-маркеров ДП. Количественный ПЦР в реальном времени.

антителами против версикана, актина гладкомышечной мускулатуры (SMA) и окраски на щелочную фосфатазу (Рис. 2).

Индукцию нейральной дифференцировки проводили на культуре клеток ДП крысы 2-3 пассажа. Через 12-14 суток в культуре наблюдали появление клеток с морфологией глии (паукообразные клетки с ветвящимися отростками) и нейронов (небольшое тело и длинные биполярные отростки) (Рис. 3). Нейрализацию подтверждали с помощью иммуногистохимического окрашивания антителами против специфичных маркеров глии (GFAP -кислый глиальный фибриллярный белок) и нейронов (MAP 2 -ассоциированный с микротрубочками белок 2). Известно, что потенциал к нейральной дифференцировке является свойством клеток ДП мыши и человека, однако нейральная дифференцировка клеток ДП вибрисс крысы была получена нами впервые.

Дифференцировка клеток нервного гребня человека в клетки ДП. На модели получения клеток нервного гребня из ЭСК (Curchoe, Maurer et al. 2010), исследовали происхождение клеток ДП человека. Для получения клеток ДП из нервного гребня разработали оригинальный протокол. Культуры клеток нервного гребня первого пассажа дифференцировали в течение двух недель в среде следующего состава: среды DMEM/F12 в соотношении 1/1, 10% фетальной телячьей сыворотки, 2мМ L-глютамин, IX антибиотики/антимикотики. После 3-х дней дифференцировки, клетки пассировали на непокрытую матригелем пластиковую посуду и удаляли клетки, неспособные адгезировать к пластику в течение 8 часов. Около 20% клеток оставались в культуре и пролиферировали, давая начало ДП-подобным клеткам (ЭСК-ДП).

Гистохимический анализ экспрессии ДП маркеров в культурах ЭСК-ДП. Для подтверждения дифференцировки клеток нервного гребня в клетки ДП проводили иммунногистохимическое окрашивание клеток нервного гребня, полученных из ЭСК (ЭСК-НГ); дифференцированных в ДП клеток нервного гребня (ЭСК-ДП) и культивируемых клеток ДП человека (для подтверждения специфичности маркеров). ЭСК-ДП, как и культивируемые ДП человека, экспрессировали маркеры клеток нервного гребня: р-75 и КеБ^п; маркеры клеток ДП: версикан, актин гладкомышечной мускулатуры (БМА) и проявляли активность щелочной фосфатазы (свойство ДП клеток) (Рис. 4). В культурах клеток ЭСК-НГ выявляли окрашивание только на маркеры клеток нервного гребня. Для подтверждения данных иммуногистохимии применяли количественный ПЦР в реальном времени. Для этого ежедневно выделяли РНК из дифференцирующихся в ДП клеток ЭСК-НГ, начиная с 1-ого дня, и заканчивая двумя неделями дифференцировки. Уровни матричной РНК тестированных генов - маркеров ДП человека (р-75, пехт-1, вгрсшана, БМА, и вшентина), прогрессивно росли в культурах ЭСК-НГ при их дифференцировке в ДП-подобные клетки (Рис. 5).

Р-75

4 • 1

о ■

Nexin-1

S 3

Б У 2

4 2.9

2 П 1-Т-Г-, 0

О 2 5 7 13

Версикан У*

О 2 5 7 13

О 2 5 7 13

Виментин

О 2 S 7 13

О 2 5 7 13

Рис. 5. Уровень экспрессии генов - маркеров ДП в клетках нервного гребня при их дифференцировке в клетки ДП. Количественный ПЦР в реальном времени. По оси х показаны дни дифференцировки, по оси у показан log изменения уровня экспрессии генов. Прерывистой линией отмечены значения уровней экспрессии генов в культуре клеток ДП человека.

Данные иммуногистохимического исследования и количественного ПЦР в реальном времени доказывают дифференцировки полученных из ЭСК клеток нервного гребня в клетки ДП. Клетки ДП человека были впервые получены из ЭСК.

Потенциал ЭСК-ДП клеток к индукции волосяных фолликулов.

Способность ЭСК-ДП индуцировать волосяные фолликулы изучали, используя «patch» метод трансплантации. Для этого полученные из эпидермиса новорожденных мышей кератиноциты, трансплантировали вместе с мезенхимными клетками. Использовали следующие типы мезенхимных клеток: ЭСК-ДП, мышиные неонатальные дермальные клетки (МДК) и изолированные из кожи человека клетки ДП. Также трансплантировали кератиноциты мыши без мезенхимных клеток (отрицательный контроль). Через 14 дней животных усыпляли, и проводили анализ подкожных трансплантатов под бинокуляром. Способность мезенхимных клеток к индукции оценивали по числу волосяных фолликулов, сформированных в трансплантатах. В случае трансплантации кератиноцитов мыши наблюдали образование незначительного количества волосяных фолликулов (Рис. 6). При трансплантации МДК, наблюдали статистически значимое (Р=0.0282) увеличение числа волос. При пересадке ДП человека, статически значимого увеличения числа фолликулов в трансплантатах (по сравнению с отрицательным контролем) не наблюдали. При пересадке ЭСК-ДП, наблюдали формирование большого количества волосяных фолликулов в трансплантатах. Их число было статистически (Р=0.0002) больше числа волосяных фолликулов, полученных при пересадке всех тестируемых типов клеток. Индукция формирования волосяных фолликулов - одна из главных характеристик клеток ДП. Однако к настоящему моменту не существует данных о способности культивируемых клеток ДП человека к индукции большого количества волосяных фолликулов при трансплантациях бестимусным мышам (Yang and Cotsarelis

2010). Впервые полученные из ЭСК человека клетки ДП обладают этой способностью.

Роль клеток нервного гребня, как стадии дифференцировки ЭСК в клетки ДП. Для выявления важности индукции клеток нервного гребня, трансплантировали ЭСК, дифференцированные в клетки ДП, без ЭСК-НГ, как промежуточного этапа дифференцировки. Также трансплантировали ЭСК-НГ и ЭСК-НГ, частично дифференцированные в ДП (7 дней дифференцировки). Трансплантаты изолировали и анализировали 14 дней после пересадки. Появление индуцирующих свойств оценивали по числу волос, сформированных в трансплантатах. При пересадке ЭСК-НГ и ЭСК, дифференцированных в ДП, без промежуточной индукции клеток нервного гребня, не наблюдали появления волосяных фолликулов в трансплантатах (Рис. 7). При трансплантации частично дифференцированных в ДП клеток нервного гребня, наблюдали появление небольшого количества волосяных фолликулов в трансплантатах. Полученные данные показывают, что полученные из ЭСК клетки нервного гребня, приобретают способность индуцировать волосяные фолликулы при их дифференцировке в ДП и, что индукция клеток нервного гребня является необходимым этапом дифференцировки ЭСК в клетки ДП.

Локализация ЭСК-ДП в волосяных фолликулах из трансплантатов. Клетки ЭСК-ДП маркировали зелёным флуоресцентным белком (GFP), что позволяло определить их локализацию in situ. Через две недели после пересадки клеток методом «patch», проводили анализ трансплантатов под бинокуляром в флуоресцентном освещении. ДП и дермальные капсулы волосяных фолликулов в трансплантатах содержали GFP-положительные клетки (Рис. 8). Целые препараты волос иммуногистохимически окрашивали на версикан и проводили реакцию по выявлению активности щелочной фосфатазы. При изучении под конфокальный микроскопом, выявляли положительное окрашивание на оба

маркера в GFP-положительных ДП волосяных фолликулов. Полученные данные доказывают участие клеток ЭСК-ДП в формировании ДП волосяных фолликулов, формирующихся в трансплантатах.

Роль сигнального пути BMP в дифференцировке клеток ЭСК-НГ в ДП. Ингибитор ВМР-4 - дорсоморфин добавляли в среду для дифференцировки на этапе ЭСК-НГ. Культивированные с дорсоморфином клетки полностью теряли способность индуцировать волосяные фолликулы при подкожных трансплантациях бестимусным мышам (Рис. 9). Результаты количественного ПЦР в реальном времени показали, что уровни экспрессии генов-маркеров (верстана, corin, nexin-1 и виментина) в культивируемых с дорсоморфином клетках, значительно снизились по сравнению с ЭСК-ДП. Уровень экспрессии гена-маркера клеток нервного гребня - р-75 - остался неизменным, а уровень экспрессии актина гладкомышечной ткани SMA вырос. Сигнальный путь BMP играет одну из ведущих ролей в поддержании индукционных свойств клеток ДП кожи спины мыши в культуре, продлевая их способность индуцировать волосяные фолликулы при подкожных пересадках (Rendí et al. 2008). Полученные нами данные показывают, что сигнальный путь BMP играет важную роль в формировании клеток ДП человека и поддержании их морфогенетических потенций.

Влияние факторов роста на индукцию волосяных фолликулов на модели тубулогенеза кератиноцитов in vitro. Конгломераты кератиноцитов культивировали в коллагеновом геле на бессывороточных средах с добавлением факторов роста: инсулиноподобного фактора роста (IGF) (50 нг/мл), фактора роста фибробластов (FGF) (40 нг/мл), фактора роста гепатоцитов (HGF) (50 нг/мл), эпидермального фактора роста (EGF) (20 нг/мл), фактора роста кератиноцитов (KGF) (50 нг/мл). В контрольной среде, не содержащей ни одного фактора, рост тубулярных структур не был отмечен. При добавлении в среду EGF и KGF, отмечали активный рост эпидермальных выростов. IGF и FGF индуцировали незначительное число

вырастов. При добавлении HGF в среду культивирования наблюдали самые протяженные и ветвящиеся выросты. Известно, что HGF индуцирует инвазию кератиноцитов в дерму и участвует в морфогенезе и регуляции роста волосяного фолликула в органотипической культуре клеток мыши (Lindner et al., 2000), однако индукция морфогенеза кератиноцитов человека с помощью HGF была показана впервые.

ВЫВОДЫ

1. Клетки дермы головы, дермальные конденсаты и ДП вибрисс мыши происходят из клеток нервного гребня.

2. Культивированные клетки ДП крысы могут быть дифференцированы в производные клеток нервного гребня: периферические нейроны и глию.

3. Клетки нервного гребня, полученные из ЭСК человека, могут быть дифференцированы в клетки ДП in vitro. ЭСК-ДП экспрессируют характерные для ДП и клеток нервного гребня маркеры.

4. ЭСК-ДП индуцируют фолликулогенез при подкожных пересадках бестимусным мышам и встраиваются в ДП волосяных фолликулов, образованных в трансплантатах.

5. Сигнальный путь BMP играет важную роль в дифференцировке полученных из ЭСК клеток нервного гребня в клетки ДП.

6. Факторы роста HGF, EGF, KGF стимулируют начальные этапы формирования волосяных фолликулов на модели морфогенеза кератиноцитов человека in vitro.

Статьи в зкурналах, соответствующих Перечню ВАК и рецензируемых иностранных изданиях:

1. Гнедева К.Ю., Чермных Э.С., Воротеляк Е., Васильев А.В., Терских В.В. Эффект факторов роста на морфогенез кератиноцитов человека in vitro //Известия РАН. Серия Биологическая. 2009. Т. 36(3). С. 307-310.

2. Chermnykh E.S., Vorotelyak Е.А., Gnedeva K.Y., Moldaver M.V., Yegorov Y.E., Vasiliev A.V., Terskikh V.V. Dermal papilla cells induce keratinocyte tubulogenesis in culture // Histochemistry and Cell Biology. 2010. V. 133(5). P. 567-576.

3. Cimadamore F., Fishwick K., Giusto E., Gnedeva K., Catarossi G., Miller

A., Pluchino S., Brill L.M., Bronner-Fraser M., Terskikh A.V. Human ESC-derived neural crest model reveals a key role for SOX2 in sensory neurogenesis // Cell Stem Cell. 2011. V. 8(5). P. 538-551.

4. Гнедева К.Ю., Воротеляк E.A., Терских А.В., Васильев А.В., Терских

B.В. Дифференцировочный и морфогенетический потенциал клеток дермальной папиллы крысы // Известия РАН. Серия Биологическая. 2011. Т. 6. С. 1-6

Тезисы конференций:

1. Воротеляк Е.А., Чермных Э.С., Гнедева К.Ю., Васильев А.В., Терских В.В. Морфогенетический потенциал кератиноцитов человека в культуре // Конференция «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза». 2007. С. 27.

2. Cimadamore F., Giusto Е., Cattarossi G., Gnedeva К., Miller A., Terskikh, A.V. Dual role of Sox2 in neural crest and peripheral neurogenesis // Poster session presented at: 2009 Cold Spring Harbor Laboratory Meeting on Stem Cell Biology. 2009. P. 48.

3. Гнедева К.Ю., Чермных Э.С., Воротеляк E., Васильев A.B., Терских А.В. Терских В.В. Роль клеток нервного гребня в формировании

волосяного покрова головы // Конференция молодых ученых Института Биологии Развития им. Н.К.Кольцова РАН. 2008. С. 17.

4. Gnedeva К., Elliott J., Vorotelyak Е„ Terskikh V.V., Terskikh A.V. Role of neural crest in hair follicle formation and function // Poster session presented at: 4th Annual Stem Cell Meeting on the Mesa. 2009. P. 32.

5. Cimadamore F., Giusto E., Cattarossi G., Gnedeva K., Miller A., Terskikh, A.V. Dual role of Sox2 in neural crest and peripheral neurogenesis // Poster session presented at: 4th Annual Stem Cell Meeting on the Mesa. 2009. P. 54.

6. Гнедева К.Ю., Чермных Э.С., Воротеляк E., Васильев A.B., Терских

A.В. и Терских В.В. Роль клеток нервного гребня в формировании волосяного покрова головы // Конференция молодых ученых Института Биологии Развития им. Н.К.Кольцова РАН. 2009. С. 17

7. Воротеляк Е.А., Чермных Э.С., Гнедева К.Ю., Васильев А.В., Терских

B.В. Стволовые клетки волосяного фолликула // VI международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность». 2009. С.

8. Gnedeva К., Vorotelyak Е., Terskikh V.V., Terskikh A.V. Growing hair from human embryonic stem cells // Poster session presented at: 5th Annual Stem Cell Meeting on the Mesa. 2010. P. 18.

9. Gnedeva K., Elliott J., Vorotelyak E., Terskikh V.V., Terskikh, A.V. Role of primary cilia in vibrissae formation // Poster session presented at: Stem Cells in Development, Tissue Homeostasis, and Disease. 2011. P. 34.

10. Воротеляк E.A., Гнедева К.Ю. Стволовые клетки волосяного фолликула // III конференция «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты», памяти Н.Г. Хрущова. 2011. С. 43

Заказ № 36-АЛ2/2011 Подписано в печать 09.12.2011 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,0

, ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

Ц ) ] ипмк ф ги ; е-таИ::ак@,с/г. ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гнедева, Ксения Юрьевна

Список сокращений.

Введение.

Цель.

Задачи.

I. Обзор Литературы.

1.1. Волосяной фолликул - производное кожи.

1.1.2. Эпидермальные стволовые клетки волосяного фолликула.

1.2. Эмбриогенез и цикл роста волосяного фолликула.

1.2.1. Стадии эмбрионального развития волосяного фолликула.

1.2.2. Цикл роста волоса.

1.3. Тубулогенез.

1.3.1. Типы тубулогенеза.

1.3.2. Модели эпителиального тубулогенеза.

1.4. Мезенхимные клетки волосяного фолликула.

1.4.1 Индукция волосяных фолликулов клетками ДП при подкожных пересадках бестимусным мышам.

1.4.2 Характеристика клеток ДП в культуре.

1.4.3. Происхождение мезенхимных клеток волосяного фолликула в эмбриогенезе.

1.5. Клетки нервного гребня.

1.5.1. Четвертый зародышевый листок.

1.5.2. Отделы нервного гребня.

1.6. Плюрипотентные стволовые клетки человека и их дифференцировочный потенциал.

II. Материалы и Методы.

11.1. Материалы.

II. 1.1 Клеточные культуры.

II. 1.2. Химические реактивы.

11.2. Методы.

Ы.2.1. Выделение коллагена I типа.:.

11.2.2. Приготовление коллагенового геля.

11.2.3. Выделение первичных кератиноцитов человека.

11.2.4. Культивирование кератиноцитов в коллагеновом геле.

11.2.5. Изучение влияния различных факторов на морфогенез кератиноцитов человека.

11.2.6. Выделение ранних постнатальных первичных кератиноцитов мыши.

11.2.7. Выделение клеток ДП человека.

11.2.8. Выделение клеток ДП вибрисс взрослой крысы и эмбриона мыши

11.2.9. Выделение и культивирование постнатальных фибробластов мыши.

11.2.10. Выделение и культивирование эмбриональных фибробластов мыши.

11.2.11. Культивирование эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и индуцированных плюрипотентныхстволовых клеток (ИПСК) человека

11.2.12. Получение и культивация клеток нервного гребня из ЭСК и ИПСК человека.

11.2.13. Индукция нейро- и глиогенной дифференцировок клеток ДП.

11.2.14. Иммуногистохимическое исследование.

11.2.15. Выявление активности щелочной фосфатазы.

11.2.16. Количественный ПЦР в реальном времени.

11.2.17. Анализ клеточных популяций с помощью проточного флуоресцентного клеточного сортинга - FACS.

11.2.18. Мечение клеток лентивирусом.

11.2.19. Трансплантация клеток иммунодефицитным мышам.

11.2.20. Статистическая обработка результатов.

III. Результаты и Обсуждение.

111.1. Изучение эмбрионального происхождения дп волос головы мыши с использованием генномодифицированных мышей.

111.2. Изучение потенциала к нейральной дифференцировке клеток ДП вибрисс крысы.

111.3. Дифференцировка ЭСК человека в клетки нервного гребня.

111.4. Разработка протокола дифференцировки ЭСК-НГ в клетки ДП

111.5. Характеристика ЭСК-ДП клеток in vitro.

111.6. Получение ДП-подобных клеток из индуцированных плюрипотентных клеток человека.

III.7. Потенциал к индукции волосяных фолликулов у ЭСК-ДП клеток

111.8. Клетки ЭСК-ДП приобретают способность индуцировать формирование волосяных фолликулов вследствие их дифференцировки из ЭСК-НГ.

111.9. ЭСК-ДП и ИПСК-ДП входят в состав ДП образованных в трансплантатах волосяных фолликулов.

111.10. Изучение роли сигнального пути BMP в дифференцировке клеток ЭСК-НГ в ДП.

111.11. Изучение влияния факторов роста на начальные этапы развития волосяных фолликулов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клетки дермальной папиллы из нервного гребня в морфогенезе волосяного фолликула"

Волосяной фолликул является уникальной структурой и играет важнейшую роль в процессе роста волос и поддержании гомеостаза эпидермиса. В эмбриогенезе волосяные фолликулы формируются из клеток эпидермиса и подлежащей дермы. Постнатально, волосяные фолликулы подвержены циклическим изменениям, в ходе которых они проходят этапы активного роста (анаген), регрессии (катаген) и покоя (телоген). При переходе от стадии телогена к стадии анагена волосяной фолликул полностью регенерирует. Основы такой регенерации лежат в особенностях эпителиального и мезенхимного компонентов фолликула. Как и в развитии, в цикле роста волоса реорганизация волосяного фолликула происходит в результате серии индукционных взаимодействий между клетками мезенхимы и эпителия. Популяцией мезенхимных клеток, обладающих индукционной способностью, являются клетки дермальной папиллы (ДП). Они индуцируют переход от стадии телогена к стадии анагена и закладку волосяных фолликулов de novo при подкожных пересадках. Также клетки ДП способны дифференцироваться в адипо-, остео- и хондрогенном направлениях in vitro, что делает их изучение важной и актуальной задачей. Наряду с широким спектром мезенхимных дифференцировок клетки ДП способны дифференцироваться в нейроны и глию периферической нервной системы. Подобные данные существуют для ДП мыши и человека, но исследований потенциала к нейральной дифференцировке у клеток ДП крысы проведено не было. Между тем, это могло бы показать универсальность феномена нейральной дифференцировки клеток ДП для млекопитающих.

Мезенхимные клетки ДП разных участков тела имеют различное происхождение в эмбриогенезе. Так, долго было известно, что дерма и ДП волосяного покрова дорсальной и вентральной стороны туловища имеют мезодермальное происхождение. Дорзальная часть происходит от дерматома сомитов, вентральная - от висцерального листка спланхнотома. В тоже время, происхождение ДП волосяного покрова головы у млекопитающих в эмбриогенезе не было изучено до последнего времени.

Нервный гребень — транзиторная клеточная популяция, мигрирующая из дорсальной части нервной трубки и дающая начало самым разнообразным тканям в развитии. Такими тканями являются нейроны и глия периферической нервной системы, гладкомышечные клетки и клетки проводящей системы сердца, а также, мезенхимные компоненты головного отдела, включая костную, хрящевую и жировую ткани. Недавние исследования с использованием генетического маркирования показали, что клетки нервного гребня дают начало дерме и ДП волосяного покрова головы. Однако неизвестно, принимают ли клетки нервного гребня участие в формировании дермальных конденсатов или мигрируют в дермальную папиллу вибрисс на более поздних этапах. Изучение механизмов, вовлеченных в формировании волосяного покрова головы, и роли клеток нервного гребня в этом процессе - актуальная задача. Подходом к её решению в применении к человеку является культура эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). На данный момент возможно получение клеток нервного гребня из ЭСК. Исследование потенциала этих клеток к дифференцировке в клетки дермы и ДП могло бы стать альтернативным подходом к изучению процессов фолликулогенеза у человека. Более того, клетки ДП способны индуцировать формирование волосяных фолликулов при подкожных трансплантациях. Использование этих клеток является перспективным направлением в биомедицине. Применение клеток ДП может со временем решить проблемы восстановления волосяного покрова головы у людей с заболеваниями волосяного фолликула или потерей его функции.

Цель

Целью работы стало изучение роли клеток дермальной папиллы из нервного гребня в морфогенезе волосяного фолликула.

Задачи

1. Проследить судьбу клеток, производных нервного гребня, в морфогенезе вибрисс мыши.

2. Изучить потенциал к нейральной дифференцировке клеток ДП крысы.

3. Охарактеризовать дифференцировку ЭСК клеток человека в клетки нервного гребня и ДП.

4. Изучить способность клеток ДП, полученных из ЭСК, индуцировать рост волосяных фолликулов при подкожных пересадках in vivo.

5. Изучить роль сигнального пути BMP в формировании клеток ДП человека.

6. Изучить роль факторов роста в начальных этапах формирования волосяных фолликулов на модели морфогенеза кератиноцитов человека in vitro. расположенной в толще кожи (Рис.1). Утолщенное основание корня волоса называют волосяной луковицей. Корень волоса вместе с луковицей заключен в волосяной фолликул. Фолликул волоса (за исключением фолликула щетинистых волос) снабжен пучком гладких мышц, обеспечивающих пиломоторную реакцию. При сокращении мышечных волокон происходит выделение кожного сала, которое смазывает кожу и способствует сохранению Teroia(Poblet, Jimenez et al. 2004).

Волосяной фолликул образован внутренним и наружным корневыми влагалищами (Рис. 1). В волосяной луковице объединяются корневые влагалища, эту область называют матриксом волоса, здесь происходит постоянное размножение клеток, из которых формируется волос. В волосяную луковицу вдается соединительно-тканный сосочек, или дермальная папилла (ДП), снабженная кровеносными сосудами и нервными волокнами (Рис. 1). Волосяной фолликул окружен соединительно-тканной оболочкой - дермальной капсулой волоса. ДП и дермальная капсула связаны друг с другом, и их клетки имеют сходные свойства (Chiu, Chang et al. 1996; Jahoda and Reynolds 2001; McElwee, Kissling et al. 2003).

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Гнедева, Ксения Юрьевна

Заключение

Волосяной фолликул - уникальный объект, позволяющий исследовать биологические процессы, являющиеся основой формирования многих органов. Его эпителиальный и мезенхимный компоненты служат источником стволовых клеток. В культуре, выделенные из ДП мезенхимные стволовые клетки человека способны индуцировать морфогенез кератиноцитов в коллагеновом геле, а при трансплантациях ДП мыши и крысы способны индуцировать de novo формирование волосяных фолликулов. В клинической практике применение клеток ДП -перспективное решением проблем потери волосяного покрова у людей с заболеваниями волосяного фолликула и потерей его функции. Также, клетки ДП обладают широким дифференцировочным потенциалом. Возможно их применение в тканевой инженерии для восстановления мезенхимных и нейральных тканей. Изучение факторов роста и сигнальных путей, принимающих участие в начальные этапы развития волосяных фолликулов, а также поиск методов получения клеток ДП в культуре с использованием ЭСК представляют как фундаментальный, так и прикладной интерес.

С использованием WntlCre/ZEG мышей мы проследили судьбу клеток нервного гребня и их производных в морфогенезе вибрисс мыши. Впервые показали, что клетки нервного гребня дают начало дерме лица мыши и могут быть найдены в дермальных конденсатах - предшественниках ДП с начала их формирования на 12-ти сутках эмбрионального развития.

При изучении нейрального дифференцировочного потенциала клеток ДП вибрисс крысы, мы показали, что они способны дифференцироваться в нейроны и глию периферической нервной системы. Потенциал к нейральной дифференцировке клеток ДП мыши и человека ранее был продемонстрирован. В совокупности эти данные подтверждают нейральное происхождении клеток ДП волосяного покрова головы, поскольку клетки периферической нервной системы - потомки клеток нервного гребня в развитии.

Практическое применение клеток ДП ограничено сложностью их выделения и потерей индукционных свойств в культуре. Разработанный нами протокол с использованием ЭСК-НГ человека позволяет получать большое количество клеток ДП человека, что решает проблему ограниченного доступа к нативным ДП. Более того, ЭСК-ДП способны индуцировать формирование волосяных фолликулов при пересадках бестимусным мышам, а значит, являются первым шагом в решении проблем облысения. Мы показали, что получение ДП клеток возможно при дифференцировке ИПСК, которые могут быть специфичны для пациента. Модель дифференцировки клеток нервного гребня в клетки ДП в культуре позволяет изучать сигнальные пути спецификации ДП. Такая возможность уникальна, поскольку доступ к нативным эмбриональным тканям человека весьма ограничен.

Совместное культивирование в составе эпителио-мезенхимного эквивалента клеток ДП волосяного фолликула и эпидермальных кератиноцитов позволяет моделировать процессы межклеточного взаимодействия при формировании и циклировании волосяных фолликулов. Моделирование процессов эпителиального морфогенеза в культуре является актуальным направлением современной клеточной биологии, которое пока слабо развито. Использование разработанной нами модели морфогенеза кератиноцитов человека позволило нам выявить ростовые факторы, положительно стимулирующие этот процесс.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гнедева, Ксения Юрьевна, Москва

1. Васильев A.B., Волошин A.B., Воротеляк Е.А., Терских В.В. (1993). Миграция колоний эпидермальных кератиноцитов человека в культуре. Докл. РАН, 329, 2, 232-235.

2. Воротеляк Е.А., Шихвердиева А.Ш., Васильев A.B., Терских В.В. (2002). Фибробласты стимулируют эпителизацию коллагенового геля. Известия РАН, 4, 421-426.

3. Терских В.В., Васильев А.В. (1995). Эпидермальные кератиноциты человека и животных: проблемы культивирования и трансплантации. М.: Наука,. 103.

4. Терских В.В., Васильев А.В., Воротеляк Е.А. (2003). Структурно-функциональные единицы эпидермиса. Известия АН. Сер. Биол., 6, 645-649.

5. Терских В.В., Васильев А.В., Воротеляк Е.А. (2007). Ниши стволовых клеток. Известия АН Сер Биол 3, 261-272.

6. Bockman, D. E. and M. L. Kirby (1984). "Dependence of thymus development on derivatives of the neural crest." Science 223(4635): 498500.

7. Borghese, E. (1950). "The development in vitro of the submandibular and sublingual glands of Mus musculus." J Anat 84(3): 287-302.

8. Botchkarev, V. A. and J. Kishimoto (2003). "Molecular control of epithelial-mesenchymal interactions during hair follicle cycling." J Investig Dermatol Svmp Proc 8(1): 46-55.

9. Botchkarev, V. A. and R. Paus (2003). "Molecular biology of hair morphogenesis: development and cycling." J Exp Zool B Mol Dev Evol 298(1): 164-180.

10. Bronner-Fraser, M. (1986). "Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1." Dev Biol 115(1): 44-55.

11. Chambers, S. M., C. A. Fasano, et al. (2009). "Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling." Nat Biotechnol 27(3): 275-280.

12. Chermnykh, E. S., E. A. Vorotelyak, et al. (2010). "Dermal papilla cells induce keratinocyte tubulogenesis in culture." Histochem Cell Biol 133(5): 567-576.

13. Chiu, H. C., C. H. Chang, et al. (1996). "Human hair follicle dermal papilla cell, dermal sheath cell and interstitial dermal fibroblast characteristics." J Formos Med Assoc 95(9): 667-674.

14. Cimadamore, F., K. Fishwick, et al. (2011). "Human ESC-derived neural crest model reveals a key role for SOX2 in sensory neurogenesis." Cell Stem Cell 8(5): 538-551.

15. Colas, J. F. and G. C. Schoenwolf (2001). "Towards a cellular and molecular understanding of neurulation." Dev Dvn 221(2): 117-145.

16. Curchoe, C. L., J. Maurer, et al. (2010). "Early acquisition of neural crest competence during hESCs neuralization." PLoS One 5(11): el3890.

17. Danielian, P. S., D. Muccino, et al. (1998). "Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase." Curr Biol 8(24): 1323-1326.

18. DasGupta, R. and E. Fuchs (1999). "Multiple roles for activated LEF/TCF transcription complexes during hair follicle development and differentiation." Development 126(20): 4557-4568.

19. Dhouailly, D. (1973). "Dermo-epidermal interactions between birds and mammals: differentiation of cutaneous appendages." J Embryo 1 Exp Morphol 30(3): 587-603.

20. Dugina, V., A. Alexandrova, et al. (1998). "Rat fibroblasts cultured from various organs exhibit differences in alpha-smooth muscle actin expression, cytoskeletal pattern, and adhesive structure organization." Exp Cell Res 238(2): 481-490.

21. Erickson, C. A., T. D. Duong, et al. (1992). "Descriptive and experimental analysis of the dispersion of neural crest cells along the dorsolateral path and their entry into ectoderm in the chick embryo." Dev Biol 151(1): 251-272.

22. Fernandes, K. J., N. R. Kobayashi, et al. (2006). "Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors." Exp Neurol 201(1): 32-48.

23. Fernandes, K. J., I. A. McKenzie, et al. (2004). "A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells." Nat Cell Biol 6(11): 10821093.

24. Galbraith, C. G. and M. P. Sheetz (1998). "Forces on adhesive contacts affect cell function." Curr Opin Cell Biol 10(5): 566-571.

25. Graham, A., P. Francis-West, et al. (1994). "The signalling molecule BMP4 mediates apoptosis in the rhombencephalic neural crest." Nature 372(6507): 684-686.

26. Graham, A., I. Heyman, et al. (1993). "Even-numbered rhombomeres control the apoptotic elimination of neural crest cells from odd-numbered rhombomeres in the chick hindbrain." Development 119(1): 233-245.

27. Greco, V., T. Chen, et al. (2009). "A two-step mechanism for stem cell activation during hair regeneration." Cell Stem Cell 4(2): 155-169.

28. Guenther, M. G., G. M. Frampton, et al. (2010). "Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells." Cell Stem Cell 7(2): 249-257.

29. Hardy, M. H. (1992). "The secret life of the hair follicle." Trends Genet 8(2): 55-61.

30. Helbling, P. M., C. T. Tran, et al. (1998). "Requirement for EphA receptor signaling in the segregation of Xenopus third and fourth arch neural crest cells." MechDev 78(1-2): 63-79.

31. Hood, L. C. and T. H. Rosenquist (1992). "Coronary artery development in the chick: origin and deployment of smooth muscle cells, and the effects of neural crest ablation." Anat Rec 234(2): 291-300.

32. Hoogduijn, M. J., E. Gorjup, et al. (2006). "Comparative characterization of hair follicle dermal stem cells and bone marrow mesenchymal stem cells." Stem Cells Dev 15(1): 49-60.

33. Home, K. A., C. A. Jahoda, et al. (1986). "Whisker growth induced by implantation of cultured vibrissa dermal papilla cells in the adult rat." J Embryo 1 Exp Morphol 97: 111-124.

34. Huelsken, J., R. Vogel, et al. (2001). "beta-Catenin controls hair follicle morphogenesis and stem cell differentiation in the skin." Cell 105(4): 533545.

35. Ito, M., Y. Liu, et al. (2005). "Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis." Nat Med 11(12): 1351-1354.

36. Jahoda, C. A. (1992). "Induction of follicle formation and hair growth by vibrissa dermal papillae implanted into rat ear wounds: vibrissa-type fibres are specified." Development 115(4): 1103-1109.

37. Jahoda, C. A., K. A. Home, et al. (1984). "Induction of hair growth by implantation of cultured dermal papilla cells." Nature 311(5986): 560-562.

38. Jahoda, C. A., R. F. Oliver, et al. (2001). "Trans-species hair growth induction by human hair follicle dermal papillae." Exp Dermatol 10(4): 229-237.

39. Jahoda, C. A. and A. J. Reynolds (2001). "Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing." Lancet 358(9291): 1445-1448.

40. Jamora, C., R. DasGupta, et al. (2003). "Links between signal transduction, transcription and adhesion in epithelial bud development." Nature 422(6929): 317-322.

41. Jandial, R. and M. L. Levy (2011). "Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory." World Neurosurg 75(1): 5-6.

42. Jiang, T. X., H. S. Jung, et al. (1999). "Self-organization of periodic patterns by dissociated feather mesenchymal cells and the regulation of size, number and spacing of primordia." Development 126(22): 4997-5009.

43. Jinno, H., O. Morozova, et al. (2010). "Convergent genesis of an adult neural crest-like dermal stem cell from distinct developmental origins." Stem Cells 28(11): 2027-2040.

44. Johnston, M. C. (1966). "A radioautographic study of the migration and fate of cranial neural crest cells in the chick embryo." Anat Ree 156(2): 143-155.

45. Kaufman, D. S., E. T. Hanson, et al. (2001). "Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells." Proc Natl Acad Sei US A 98(19): 10716-10721.

46. Kehat, I., A. Gepstein, et al. (2002). "High-resolution electrophysiological assessment of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: a novel in vitro model for the study of conduction." Circ Res 91(8): 659-661.

47. Kim, K., A. Doi, et al. (2010). "Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells." Nature 467(7313): 285-290.

48. Kirby, M. L. (1989). "Plasticity and predetermination of mesencephalic and trunk neural crest transplanted into the region of the cardiac neural crest." Dev Biol 134(2): 402-412.

49. Kirby, M. L. and K. L. Waldo (1990). "Role of neural crest in congenital heart disease." Circulation 82(2): 332-340.

50. Kishimoto, J., R. E. Burgeson, et al. (2000). "Wnt signaling maintains the hair-inducing activity of the dermal papilla." Genes Dev 14(10): 11811185.

51. Kodaira, K., M. Imada, et al. (2006). "Purification and identification of a BMP-like factor from bovine serum." Biochem Biophvs Res Commun 345(3): 1224-1231.

52. Kuratani, S. C. and M. L. Kirby (1992). "Migration and distribution of circumpharyngeal crest cells in the chick embryo. Formation of thecircumpharyngeal ridge and E/C8+ crest cells in the vertebrate head region." Anat Rec 234(2): 263-280.

53. Lako, M., L. Armstrong, et al. (2002). "Hair follicle dermal cells repopulate the mouse haematopoietic system." J Cell Sci 115(Pt 20): 3967-3974.

54. Lavoie, J. F., J. A. Biernaskie, et al. (2009). "Skin-derived precursors differentiate into skeletogenic cell types and contribute to bone repair." Stem Cells Dev 18(6): 893-906.

55. Le Lievre, C. S. and N. M. Le Douarin (1975). "Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos." J Embryo 1 Exp Morphol 34(1): 125-154.

56. Lee, G., H. Kim, et al. (2007). "Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells." Nat Biotechnol 25(12): 1468-1475.

57. Lee, J., A. Ishihara, et al. (1993). "How do cells move along surfaces?" Trends Cell Biol 3(1 IV 366-370.

58. Lichti, U., W. C. Weinberg, et al. (1993). "In vivo regulation of murine hair growth: insights from grafting defined cell populations onto nude mice." J Invest Dermatol 101(1 Suppl): 124S-129S.

59. Liu, G. H., B. Z. Barkho, et al. (2011). "Recapitulation of premature ageing with iPSCs from Hutchinson-Gilford progeria syndrome." Nature.

60. Loring, J. F. and C. A. Erickson (1987). "Neural crest cell migratory pathways in the trunk of the chick embryo." Dev Biol 121(1): 220-236.

61. Lumsden, A. and S. Guthrie (1991). "Alternating patterns of cell surface properties and neural crest cell migration during segmentation of the chick hindbrain." Development Suppl 2: 9-15.

62. Mayer, T. C. (1973). "The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos." Dev Biol 34(1): 39-46.

63. McElwee, K. J., S. Kissling, et al. (2003). "Cultured peribulbar dermal sheath cells can induce hair follicle development and contribute to the dermal sheath and dermal papilla." J Invest Dermatol 121(6): 1267-1275.

64. McKenzie, I. A., J. Biernaskie, et al. (2006). "Skin-derived precursors generate myelinating Schwann cells for the injured and dysmyelinated nervous system." J Neurosci 26(24): 6651-6660.

65. Mecklenburg, L., M. Nakamura, et al. (2001). "The nude mouse skin phenotype: the role of Foxnl in hair follicle development and cycling." Exp Mol Pathol 71(2Y. 171-178.

66. Melnick, M. and T. Jaskoll (2000). "Mouse submandibular gland morphogenesis: a paradigm for embryonic signal processing." Crit Rev Oral Biol Med 11(2): 199-215.

67. Messenger, A. G. (1985). "Hair follicle tissue culture." Br J Dermatol 113(6): 639-640.

68. Messenger, A. G., H. J. Senior, et al. (1986). "The in vitro properties of dermal papilla cell lines established from human hair follicles." Br J Dermatol 114(4): 425-430.

69. Metzger, R. J. and M. A. Krasnow (1999). "Genetic control of branching morphogenesis." Science 284(5420): 1635-1639.

70. Mishina, Y., A. Suzuki, et al. (1995). "Bmpr encodes a type I bone morphogenetic protein receptor that is essential for gastrulation during mouse embryogenesis." Genes Dev 9(24): 3027-3037.

71. Mizuseki, K., T. Sakamoto, et al. (2003). "Generation of neural crest-derived peripheral neurons and floor plate cells from mouse and primate embryonic stem cells." Proc Natl Acad Sci U S A 100(10): 5828-5833.

72. Montesano, R., K. Matsumoto, et al. (1991). "Identification of a fibroblast-derived epithelial morphogen as hepatocyte growth factor." Cell 67(5): 901908.

73. Morris, R. J. and C. S. Potten (1999). "Highly persistent label-retaining cells in the hair follicles of mice and their fate following induction of anagen." J Invest Dermatol 112(4): 470-475.

74. Mould, A. P., J. A. Askari, et al. (1994). "Integrin alpha 4 beta 1-mediated melanoma cell adhesion and migration on vascular cell adhesion molecule1 (VCAM-1) and the alternatively spliced IIICS region of fibronectin." J Biol Chem 269(44): 27224-27230.

75. Murphy, G. and J. Gavrilovic (1999). "Proteolysis and cell migration: creating a path?" Curr Opin Cell Biol 11(5): 614-621.

76. Nagoshi, N., S. Shibata, et al. (2008). "Ontogeny and multipotency of neural crest-derived stem cells in mouse bone marrow, dorsal root ganglia, and whisker pad." Cell Stem Cell 2(4): 392-403.

77. Nanba, D., Y. Hieda, et al. (2000). "Remodeling of desmosomal and hemidesmosomal adhesion systems during early morphogenesis of mouse pelage hair follicles." J Invest Dermatol 114(1): 171-177.

78. Noden, D. M. (1983). "The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues." Dev Biol 96(1): 144-165.

79. Ohyama, M., Y. Zheng, et al. (2010). "The mesenchymal component of hair follicle neogenesis: background, methods and molecular characterization." Exp Dermatol 19(2): 89-99.

80. Oliver, R. F. (1966). "Whisker growth after removal of the dermal papilla and lengths of follicle in the hooded rat." J Embryol Exp Morphol 15(3): 331-347.

81. Oliver, R. F. (1967). "The experimental induction of whisker growth in the hooded rat by implantation of dermal papillae." J Embryol Exp Morphol 18(1): 43-51.

82. Paus, R. and G. Cotsarelis (1999). "The biology of hair follicles." N Engl J Med 341(7): 491-497.

83. Paus, R., S. Muller-Rover, et al. (1999). "A comprehensive guide for the recognition and classification of distinct stages of hair follicle morphogenesis." J Invest Dermatol 113(4): 523-532.

84. Pittenger, M. F., A. M. Mackay, et al. (1999). "Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells." Science 284(5411): 143-147.

85. Poblet, E., F. Jimenez, et al. (2004). "The contribution of the arrector pili muscle and sebaceous glands to the follicular unit structure." J Am Acad Dermatol 51(2): 217-222.

86. Pomp, O., I. Brokhman, et al. (2005). "Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells." Stem Cells 23(7): 923-930.

87. Rawles, M. E. (1948). "Origin of melanophores and their role in development of color patterns in vertebrates." Physiol Rev 28(4): 383-408.

88. Rendl, M., L. Lewis, et al. (2005). "Molecular dissection of mesenchymal-epithelial interactions in the hair follicle." PLoS Biol 3(11): e331.

89. Rendl, M., L. Polak, et al. (2008). "BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties." Genes Dev 22(4): 543-557.

90. Reubinoff, B. E., M. F. Pera, et al. (2000). "Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro." Nat Biotechnol 18(4): 399-404.

91. Reynolds, A. J. and C. A. Jahoda (1991). "Hair follicle stem cells? A distinct germinative epidermal cell population is activated in vitro by the presence of hair dermal papilla cells." J Cell Sci 99 ( Pt 2): 373-385.

92. Rickmann, M., J. W. Fawcett, et al. (1985). "The migration of neural crest cells and the growth of motor axons through the rostral half of the chick somite." J Embryol Exp Morphol 90: 437-455.

93. Rinn, J. L., J. K. Wang, et al. (2008). "A dermal HOX transcriptional program regulates site-specific epidermal fate." Genes Dev 22(3): 303-307.

94. Ronfard, V., J. M. Rives, et al. (2000). "Long-term regeneration of human epidermis on third degree burns transplanted with autologous cultured epithelium grown on a fibrin matrix." Transplantation 70(11): 1588-1598.

95. Rufaut, N. W., N. T. Goldthorpe, et al. (2006). "Myogenic differentiation of dermal papilla cells from bovine skin." J Cell Physiol 209(3): 959-966.

96. Sariola, H. and K. Sainio (1997). "The tip-top branching ureter." Curr Opin Cell Biol 9(6): 877-884.

97. Sauer, B. (1987). "Functional expression of the cre-lox site-specific recombination system in the yeast Saccharomyces cerevisiae." Mol Cell Biol 7(6): 2087-2096.

98. Sauer, B. and N. Henderson (1988). "Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage PI." Proc Natl Acad Sci U S A 85(14): 5166-5170.

99. Sauka-Spengler, T. and M. Bronner-Fraser (2006). "Development and evolution of the migratory neural crest: a gene regulatory perspective." Curr Opin Genet Dev 16(4): 360-366.

100. Schneider, M. R., R. Schmidt-Ullrich, et al. (2009). "The hair follicle as a dynamic miniorgan." Curr Biol 19(3): R132-142.

101. Schulz, T. C., G. M. Palmarini, et al. (2003). "Directed neuronal differentiation of human embryonic stem cells." BMC Neurosci 4: 27.

102. Sechrist, J., G. N. Serbedzija, et al. (1993). "Segmental migration of the hindbrain neural crest does not arise from its segmental generation." Development 118(3): 691-703.

103. Sieber-Blum, M. and M. Grim (2004). "The adult hair follicle: cradle for pluripotent neural crest stem cells." Birth Defects Res C Embryo Today 72(2): 162-172.

104. Smith, A., V. Robinson, et al. (1997). "The EphA4 and EphBl receptor tyrosine kinases and ephrin-B2 ligand regulate targeted migration of branchial neural crest cells." Curr Biol 7(8): 561-570.

105. Smith, A. G. (2001). "Embryo-derived stem cells: of mice and men." AnnuRev Cell Dev Biol 17: 435-462.

106. Song, H. K. and R. H. Sawyer (1996). "Dorsal dermis of the scaleless (sc/sc) embryo directs normal feather pattern formation until day 8 of development." DevDyn 205(1): 82-91.

107. St-Jacques, B., H. R. Dassule, et al. (1998). "Sonic hedgehog signaling is essential for hair development." Curr Biol 8(19): 1058-1068.

108. Stojkovic, M., M. Lako, et al. (2004). "Derivation, growth and applications of human embryonic stem cells." Reproduction 128(3): 259267.

109. Stossel, T. P. (1993). "On the crawling of animal cells." Science 260(5111): 1086-1094.

110. Takahashi, K., K. Tanabe, et al. (2007). "Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors." Cell 131(5): 861-872.

111. Takahashi, K. and S. Yamanaka (2006). "Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors." Cell 126(4): 663-676.

112. Tan, S. S. and G. Morriss-Kay (1985). "The development and distribution of the cranial neural crest in the rat embryo." Cell Tissue Res 240(2): 403-416.

113. Taylor, L. A., M. J. Harris, et al. (2000). "Whiskers amiss, a new vibrissae and hair mutation near the Krtl cluster on mouse chromosome 11." Mamm Genome 11(4): 255-259.

114. Teillet, M. A., C. Kalcheim, et al. (1987). "Formation of the dorsal root ganglia in the avian embryo: segmental origin and migratory behavior of neural crest progenitor cells." Dev Biol 120(2): 329-347.

115. Thiery, J. P. and B. Boyer (1992). "The junction between cytokines and cell adhesion." Curr Opin Cell Biol 4(5): 782-792.

116. Thomson, J. A., J. Itskovitz-Eldor, et al. (1998). "Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts." Science 282(5391): 1145-1147.

117. Thorogood, P. (1989). "The Neural Crest. Including a Facsimile Reprint of The Neural Crest by Sven Horstadius. Brian K. Hall. Oxford University Press, New York, 1988. viii, 303 pp., illus. $60." Science 246(4936): 1503.

118. Toma, J. G., M. Akhavan, et al. (2001). "Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin." Nat Cell Biol 3(9): 778-784.

119. Weinberg, W. C., L. V. Goodman, et al. (1993). "Reconstitution of hair follicle development in vivo: determination of follicle formation, hair growth, and hair quality by dermal cells." J Invest Dermatol 100(3): 229236.

120. Wessells, N. K. and K. D. Roessner (1965). "Nonproliferation in dermal condensations of mouse vibrissae and pelage hairs." Dev Biol 12(3): 419-433.

121. Weston, J. A. (1963). "A radioautographic analysis of the migration and localization of trunk neural crest cells in the chick." Dev Biol 6: 279310.

122. Winnier, G., M. Blessing, et al. (1995). "Bone morphogenetic protein-4 is required for mesoderm formation and patterning in the mouse." GenesDev9(17): 2105-2116.

123. Wolff, J. R. and T. Bar (1972). '"Seamless' endothelia in brain capillaries during development of the rat's cerebral cortex." Brain Res 41(1): 17-24.

124. Wong, C. E., C. Paratore, et al. (2006). "Neural crest-derived cells with stem cell features can be traced back to multiple lineages in the adult skin." J Cell Biol 175(6): 1005-1015.

125. Wu, J. J., R. Q. Liu, et al. (2005). "Enzyme digestion to isolate and culture human scalp dermal papilla cells: a more efficient method." Arch Dermatol Res 297(2): 60-67.

126. Xu, C., M. S. Inokuma, et al. (2001). "Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells." Nat Biotechnol 19(10): 971974.

127. Yang, C. C. and G. Cotsarelis (2010). "Review of hair follicle dermal cells." J Dermatol Sci 57(1): 2-11.

128. Yu, P. B., C. C. Hong, et al. (2008). "Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism." Nat Chem Biol 4(1): 33-41.

129. Zhang, P., J. Li, et al. (2008). "Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells." Blood 111(4): 19331941.

130. Zuk, P. A., M. Zhu, et al. (2001). "Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies." Tissue Eng 7(2): 2112281. Благодарности