Клетки волосяного фолликула in vitro

Чермных, Элина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клетки волосяного фолликула in vitro
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Клетки волосяного фолликула in vitro"

Учреждение Российской академии наук Институт Биологии Развития им Н. К. Кольцова РАН

На правах рукописи

Чермных Элина Сергеевна КЛЕТКИ ВОЛОСЯНОГО ФОЛЛИКУЛА IN VITRO

Специальность 03 00 25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2008

003446891

Работа выполнена в лаборатории проблем клеточной пролиферации Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им Н К Кольцова РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Воротеляк Екатерина Андреевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Григорян Элеонора Норайровна

доктор биологических наук Романов Юрий Аскольдович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Защита состоится 1 октября 2008 года в 16 часов на заседании Диссертационного совета Д 002 238 01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им Н К Кольцова РАН по адресу 119334, Москва, ул Вавилова, д 26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им Н К Кольцова РАН (Москва, ул Вавилова, 26)

Автореферат разослан « 28 » августа 2008 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

ЕБ Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Волосяной фолликул представляет собой структуру, сформированную из клеток эпителиальной и мезенхимной ткани Волосяной фолликул формируется в эмбриогенезе в результате сложных морфогенетических процессов, важнейшими из которых являются взаимные обмены сигналами между эпителием и мезенхимой Факторы роста, продуцируемые клетками дермальной папиллы (ДП) играют ключевую роль в морфогенезе волосяного фолликула (Schmidt-Ullrich & Paus, 2005)

Существует несколько экспериментальных моделей изучения эпителиального морфогенеза Большая их часть основана на использовании коллагенового геля, который по сравнению с пластиком является более физиологичным субстратом для клеток, что позволяет изучать их поведение в условиях, близких к таковым ш vivo (Assouline et al, 1992, Mourra et al, 1998) Репрезентативной моделью служит модель морфогенеза эпидермальных клеток человека в коллагеновом геле (Шинин и др , 2002) Однако используемые в данной модели эмбриональные фибробласты (ФЭЧ) не являются естественным индуктором морфогенеза волосяного фолликула Использование в исследованиях in vitro популяции клеток ДП позволит создать условия, более приближенные к ситуации in vivo

В морфогенезе эпидермиса главную роль играют стволовые эпидермальные клетки Несмотря на большое число исследований в области биологии эпидермальных стволовых клеток, строгих маркеров для их выявления до сих пор не обнаружено В частности, многое остается неясным и в отношении экспрессии предполагаемого маркера эпидермальных стволовых клеток - кератина 19

Мезенхимными клетками, обладающими высоким морфогенетическим потенциалом являются клетки ДП Исследование индукционной способности этих клеток, а также их практическое применение ограничены сложностью их выделения

Научное направление по исследованию межклеточных взаимодействий эпителиальных и мезенхимных клеток волосяного фолликула при их совместном культивировании в трехмерном матриксе является весьма перспективным С испочьзованием описанных клеточных систем возможно изучение фундаментальных морфогенетических процессов, протекающих в эпидермисе человека на разных этапах онтогенеза

Цели и задачи исследования. Целью нашего исследования явилось изучение морфо-функционального состояния клеток волосяного фолликула при разных условиях их культивирования

В работе были поставлены следующие задачи

1 Охарактеризовать кератин 19-положительные клетки эпидермиса человека в культуре,

2 Выделить и охарактеризовать клетки ДП,

3 Разработать модель формирования волосяного фолликула в культуре,

(

4 Изучить клеточные механизмы формирования тубулярных структур в культуре эпидермальных кератиноцитов человека,

5 Изучить способность клеток встраиваться в трехмерные структуры кожи т vivo,

6 Исследовать способность кератиноцитов к самоорганизации

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые продемонстрирована способность эпидермальных клеток человека взрослого организма сохранять морфогенетические потенции, которые проявляются под воздействием клеток ДП Совместное культивирование в составе эпителио-мезенхимного эквивалента клеток ДП и кератиноцитов позволяет моделировать процессы межклеточного взаимодействия на начальных этапах формирования волосяных фолликулов Моделирование процессов эпителиального морфогенеза в культуре является актуальным направлением современной клеточной биологии, которое пока слабо развито Данная модель in vitro отражает основные этапы морфогенеза in vivo Показано, что структура тубулярных выростов и характер их роста во многом схожи со структурой и морфогенезом волосяного фолликула живого организма. Разработанные модели могут использоваться для изучения молекулярных механизмов морфогенеза волосяного фолликула

Показано, что морфогенетический потенциал кератиноцитов может быть по-разному реализован в зависимости от типа кокультивируемых мезенхимных клеток Это означает, что взрослый эпидермис при соответствующем сигнале может формировать волосяные фолликулы Данное направление чрезвычайно перспективно в плане определения клеточных механизмов развития алопеции и разработки подходов к ее коррекции с использованием клеточных технологий

Изучена популяция кератин 19-положительных клеток в культуре, представляющая стволовые клетки волосяного фолликула. Показано, что в процессе культивирования происходит дополнительная индукция синтеза кератина 19 в клетках, где ранее этот белок не экспрессировался

Предложен оригинальный способ выделения клеток ДП человека, позволивший повысить эффективность выделения клеток

Изучена популяция мезенхимных клеток волосяного фолликула, располагающихся в ДП Подтверждена полипотентность клеток ДП в исследованиях по культивированию клеток в индукционных средах Исследована способность клеток ДП встраиваться в трехмерные структуры кожи в системе in vivo Показано, что эти клетки мигрируют в волосяной фолликул - естественную для них нишу Впервые показано, что клетки ДП вызывают усиленный ангиогенез Эти данные могут быть полезны для разработки технологии реконструкции волосяного фолликула с применением клеток ДП в клинической практике Модификация живых тканевых эквивалентов с использованием клеток ДП может разрешить проблему восстановления роста волос в местах трансплантаций

Кроме того, модель морфогенеза волосяного фолликула может служить тест-системой для изучения фармакологического действия лекарственных препаратов

Исследована структурно-функциональная организация кератиноцитов при культивировании их в различных условиях Показано, что кератиноциты в культуре сохраняют присущую им т vivo способность к формированию структурно-функциональных единиц Результаты данной работы вносят существенный вклад в развитие представлений о структурно-функциональной организации кератиноцитов в культуре и о их морфогенетических способностях в трехмерном матриксе

По результатам исследований, в которых было выявлено ангиогенное свойство клеток дермальной папиллы, была подана заявка на международный патент

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XIV школе-конференции «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии» (Звенигород, 2005г), 66th Meeting of Society for Investigating Dermatology (Boston, 2005), международной конференции «Биология стволовых клеток фундаментальные аспекты» (Москва, 2005г), симпозиуме «Клеточные технологии в медицине» (Москва, 2007г), симпозиуме с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза» (Москва, 2007г), II Съезде Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (С-Петербург, 2007г.), на конференциях молодых ученых Института биологии развития им Н К Кольцова (Москва, 2005, 2006, 2007гг ) и на V конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (Москва, 2008г)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ Из них статей — 5, тезисов докладов и материалов конференций -10

Структура и объем работы Диссертация изложена на 169 страницах, содержит 52 рисунка, состоит из следующих разделов введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 254 цитируемых источников

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Культивирование кератиноцитов человека Кератиноциты человека получали из фрагментов кожи лица, полученных в ходе хирургических операций, с помощью ферментативной обработки Суспензию кератиноцитов высевали в концентрации 300 тыс клеток/мл на пластик в смеси сред DMEM F12 (1 1) с добавлением 10% сыворотки плода коровы, 4мМ L-глутамина, 5мкг/мл инсулина, 10"6 М изопротеренола и Юнг/мл EGF, и культивировали при 37°С и 5% С02 Смену среды проводили через каждые 3-4 дня

Выделение клеток ДП человека Биоптаты кожи человека волосистой части головы, полученные в ходе хирургических операций, помещали в 0,2%-ный раствор диспазы в среде DMEM на 14-16 ч при +4°С После инкубации в диспазе отделяли подкожный жир, содержащий волосяные фолликулы, измельчали с

помощью глазных ножниц и помещали в 0,1% - раствор коллагеназы I типа на 37°С Через 1 ч, после того как волосяные фолликулы откреплялись от жировой ткани и опускались на дно флакона, жир отбирали с поверхности жидкости, раствор коллагеназы с волосяными фолликулами центрифугировали и производили замену раствора коллагеназы на свежий В новом растворе коллагеназы инкубировали в течение 5-6 ч при 37°С, после чего волосяные фолликулы пипетировали до открепления свободных ДП и отмывали раствором Хенкса от коллагеназы повторным центрифугированием при 1000 об/мин (200g) в течение 5 мин Осадок ресуспендировали средой DMEM с содержанием 10% сыворотки и проводили 3 повтора центрифугирования при 200 об/мин (8g) для удаления клеток соединительнотканной оболочки волоса Конечный осадок, содержащий ДП, ресуспендировали в среде DMEM с содержанием сыворотки 10% и помещали в 6-луночное плато ДП инкубировали в течение 5-6 дней, после чего замену среды проводили каждые 3-4 дня

Получение среды, кондиционированной клетками ДП Для получения кондиционированной среды конфлуентные культуры клеток ДП до 3 пассажа инкубировали в течение 3 суток в 7мл среды DMEM F12 (1 1) с добавлением 10% сыворотки плода коровы, 4тМЬ-глутамина, 5мкг/мл инсулина, изопротеренола и Юнг/мл EGF при 37°С в С02-инкубаторе Кондиционированную среду центрифугировали с целью удаления клеточного детрита в течение 10 мин при 1500 об/мин (440g), расфасовывали в стерильные флаконы, замораживали и хранили при -20°С

Индукция и детекция остео- и адипогенной дифференцировок Для

индукции остеогенной дифференцировки клетки ДП культивировали в течение 21 дня в среде следующего состава среда ДМЕМЛМ2, 10% сыворотки плода коровы, 0 01 мкМ 1,25-дигидрокси витамина Д?, 50 мкМ аскорбат-2-фосфата, 10 мМ p-глицерофосфата Кальцификацию внеклеточного матрикса определяли с помощью окраски ализариновым красным Кроме этого для детекции остеогенной дифференцировки клетки окрашивали щелочной фосфатазой и исследовали экспрессию маркеров костной ткани - остеонектина и остепонтина

Для выявления потенции клеток ДП дифференцироваться в адипоциты клетки культивировали в индукционной среде следующего состава, среда DMEM/F-12, 10% сыворотки плода коровы, 0 5 мМ изобутил-метилксантина, 1 мкМ дексаметазона, 10 мкМ инсулина, 200 мкМ индометацина Адипогенную дифференцировку выявляли с помощью маркера зрелых адипоцитов - лептина и красителя Oil red О

Приготовление коллагенового геля Стерильный 0,34М раствор NaOH объединяли с концентрированной (хЮ) питательной средой Игла или 199 в соотношении 1 2 и на каждые 100 мл смеси добавляли 100 мг глутамина и 9 мл 7,5% бикарбоната натрия Полученную смесь соединяли с охлажденным раствором коллагена в уксусной кислоте в соотношении 1 4, после чего помещали на лед для предотвращения быстрой желатинизации

Иммуногнстохимическое исследование Для иммуногистохимических исследований с использованием флуоресцентной метки клетки фиксировали 4% ПФА в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего клетки пермеабилизировали в 0,5%-ном растворе Triton Х-100 Затем промывали PBS и наносили сыворотку животных, из которых были получены вторые антитела, для уменьшения неспецифического связывания антител, либо БСА и инкубировали с первыми антителами в течение 18 ч при 4°С После промывки в PBS наносили вторые антитела, конъюгированные с флуорохромом (FITC, Alexa), и изучали препараты с помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии (Конфокальный микроскоп Leica TCS SP с программным обеспечением Leica LCS, флуоресцентный микроскоп Leica DM RXA2) Для окрашивания ядер использовали Hoechst 33342, DAPI или PI При использовании PI, клетки предварительно обрабатывали РНКазой В качестве отрицательного контроля использовали антитела, выработанные у неиммунизированных животных Проводили также контроль вторых антител в отсутствие первых

Культивирование кератиноцнтов в коллагеиовом геле Для культивирования кератиноцнтов в коллагеновом геле, первичные кератиноциты в высокой концентрации помещали в подготовленные в геле «колодцы» объёмом 100 мкл После прикрепления клеток (через 20-30 мин) пластиковое кольцо удаляли и добавляли среду DMEM F12 (1 1), с содержанием 10% сыворотки плода коровы, L-глутамина, инсулина, изопротеренола и EGF, и инкубировали при 37°С в С02-инкубаторе

Трансплантация клеток иммунодефицитным мышам Фрагменты кожи человека инкубировали в 2%-растворе EDTA на PBS (рН=8 0) в течение 2 ч при 37°С, затем промывали в среде С помощью иглы размером 30G локально отделяли эпидермис от дермы, формируя небольшой карман Донорские клетки человека (клетки ДП, базальные кератиноциты или их смесь) в объеме 50 мкл (10 млн/мл) инъецировали в образованный карман и инкубировали в течение 12 ч при 37°С На следующий день фрагменты кожи имплантировали под кожу в области лопаток бестимусным мышам, полученным в питомнике ФИБХ РАН г Пущино Гистологический и иммуногистохимический анализ проводили через 4 и 8 недель после имплантации Фрагменты кожи фиксировали в 4%-растворе ПФА в течение 1 ч После трехкратной промывки в PBS кусочки кожи пропитывали 20%-раствором сахарозы в течение 12 ч, затем замораживали в парах азота Срезы толщиной 10 мкн получали на криостате

Статистическая обработка результатов. При обработке результатов оценивали значение средней величины, стандартное отклонение от значения средней величины Построение графиков проводили в программе Excel (Microsoft) Различие считали статистически достоверным, если уровень значимости был р<0 05, что является мерой достаточной надежности результатов

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изучение популяции кератин 19 - положительных клеток в культуре

В настоящей работе мы исследовали клеточные популяции волосяного фолликула и их взаимодействия между собой Выявление стволовых эпидермальных клеток волосяного фолликула осложнено отсутствием специфических иммуногистохимических маркеров В настоящее время наиболее достоверным способом обнаружения стволовых клеток является изучение способности клеток длительно сохранять метку Кератин 19 может служить альтернативой для выявления стволовых клеток волосяного фолликула (Stasiak et al, 1989, Savtchenko et al, 1988, Bartek et al, 1985), потому и был использован в нашем исследовании Данные литературы по выявлению экспрессии кератина 19 в волосяном фолликуле противоречивы В некоторых исследованиях экспрессия кератина 19 была обнаружена только в области bulge* (Narisawa et al, 1994, Michel et al, 1996, Stasiak et al, 1989) Другие исследования обнаруживают две области экспрессии кератина 19 в верхней и нижней трети волосяного фолликула В нашей работе мы обнаружили экспрессию кератина 19 в двух областях волосяного фолликула на стадии анаген в области bulge и в матриксе волосяного фолликула (рис 1А, цветная вкладка) Мы придерживаемся гипотезы активации bulge (Cotsarelis et al, 1990, Lavker et al, 1991) и полагаем, что в раннем анагене стволовые клетки из области bulge (К19+-клетки) мигрируют в матрикс волоса, где пролиферируют и дают начало транзиторным клеткам, которые формируют волосяной фолликул При этом К19+-клетки матрикса, являющиеся потомками стволовых из области bulge, уже вступают на путь дифференцировки, а тот факт, что они продолжают экспрессировать кератин 19 может свидетельствовать об их способности к пролиферирации Исследование поперечного среза области bulge показало, что К19*-клетки располагаются в базальном слое наружного корневого влагалища (рис 1Б, цветная вкладка), что соответствует данным и других исследований (Narisawa et al, 1994, Michel et al, 1996)

Мы изучили распределение К19+-клеток в первичной культуре После ферментативной обработки эпидермиса в состав полученной суспензии клеток входят как кератиноциты интерфолликулярного эпидермиса, так и волосяного фолликула Волосяные фолликулы являются основным источником К19+-клеток при инициации первичной культуры Исследование первичной культуры на ранних сроках культивирования в среде с физиологичным содержанием Са2+ (2мМ) выявило единичные в составе агрегатов или располагающиеся поодиночке К19+-клетки Одиночные К19+-клетки характеризовались малым диаметром (10±2мкм) и высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением Количество таких клеток составляло менее 1% от общего числа клеток. Диаметр К19+-клеток, входящих в состав клеточных агрегатов, был несколько больше и составлял 12±3мкм Встречались также агрегаты, полностью сформированные из К19+-клеток При культивировании эпидермальных клеток в течение 6 дней доля К19+-

* bulge - утолщение волосяного фолликула в месте прикрепления мышцы, поднимающей волос

клеток в культуре возрастала до 20% Следует также отметить, что размер К19+-клеток увеличивался и достигал 30-50 мкм

Увеличение доли К19+-клеток могло происходить в результате нескольких событий во-первых, за счет их пролиферации, во-вторых, за счет их преимущественного выживания и, в-третьих, за счет инициации экспрессии кератина 19 К19"-клетками

Исследование пролиферативного статуса К19+-клеток с помощью антител к Ki67 показало, что через 24 часа культивирования, в то время, когда К19"-клетки пролиферировали (1% Ki-67-положительных клеток), К19+-кератиноциты находились в пролиферативном покое (рис 2А, цветная вкладка) Однако на 6-е сутки в культуре 15% К19+-кератиноцитов одновременно были позитивны по антигену Ki-67, что в среднем соответствовало доле пролиферирующих клеток среди К19"-клетки (рис 2Б, цветная вкладка) Это указывает на то, что пролиферативная активность К19+-клеток в культуре возрастает, что, возможно, приводит к увеличению их доли в популяции кератиноцитов

При исследовании популяции базальных кератиноцитов, полученных в результате открепления супрабазальных слоев, мы обнаружили группы К19+-клеток Изучение способности базальных кератиноцитов включать метку BrdU показало, что увеличение доли К19+-клеток происходило не за счет пролиферации клеток Поэтому мы предположили, что увеличение доли К19+-клеток могло происходить в результате индукции экспрессии кератина 19 в К19'-клетках Для проверки этого предположения, мы исследовали динамику изменения количества К19+-клеток при обработке культуры митомицином С, блокирующим пролиферацию В культуре, где клетки не пролиферировали, наблюдалось увеличение доли К19+-клеток, что может свидетельствовать об индукции синтеза кератина 19 в К19"-клетках Однако результаты данного эксперимента не исключают возможности преимущественной гибели К19"-клеток Исследование динамики экспрессии кератина 19 в культуре клеток интерфолликулярного эпидермиса подтвердило наше предположение об индукции синтеза кератина 19 в ранее негативных по этому маркеру клетках Согласно данным литературы в культивируемых эпидермальных кератиноцитах экспрессия кератинов простого эпителия может индуцироваться, а экспрессия специфических для дифференциации кератиноцитов - подавляться (Gazel et al, 2003) Можно предположить, что часть К19+-кератиноцитов в культуре является потомками клеток волосяного фолликула, а в процессе культивирования происходит дополнительная индукция синтеза кератина 19

Характеристика клеток ДП, изучение их индуктивных свойств Клетки ДП индуцируют морфогенез волосяных фолликулов in vivo Использование клеток ДП в культуре позволяет создать модель, отражающую процессы формирования волосяных фолликулов в эмбриогенезе и процессы реорганизации волосяного фолликула в цикле роста волоса во взрослом организме Небольшой размер ДП, а также расположение в середине волосяной луковицы создает некоторые трудности при выделении этих клеток и их изучении

Разработанный нами метод выделения клеток ДП позволяет упростить выделение клеток, а также повысить его эффективность. В нашем способе выделения используются ферменты диспаза, позволяющая разобщить эпителий и соединительнотканную капсулу волосяного фолликула, и коллагеназа, способствующая перевариванию соединительнотканной капсулы и выявлению ДП. Методика основывается на том, что ДП волосяных фолликулов человека (кожи лица) располагаются в жировой ткани, поэтому, отрезая жировую ткань с помощью скальпеля от примыкающей дермы и инкубируя в растворе коллагеназы, мы легко отделяем волосяные луковицы от жировой ткани: волосяные луковицы оказываются на дне культурального флакона, в то время как весь жир всплывает на поверхность жидкости. В процессе ферментативной обработки коллагеназой в течение 6 ч происходит полное переваривание соединительнотканной оболочки волосяного фолликула, тогда как ДП все еще сохраняет свою целостность (рис. 3). Использование коллагеназы приводит к разрушению внеклеточного матрикса ДП, что многократно увеличивает способность клеток прикрепляться к пластику, а также увеличивает скорость их роста (Wu et al., 2005). Время расщепления легко контролировать с помощью инвертированного микроскопа. Когда коллагеназа начинает расщеплять ДП, процесс должен быть остановлен. Повторное центрифугирование на низкой скорости позволяет отделить

разобщенные мезенхимные клетки соединительнотканной оболочки от ДП. Сопоставляя полученные нами результаты с опубликованными ранее (Warren et al, 1992; Chiu et al., 1993; Wu et a!., 2005), мы полагаем, что разработанный нами метод выделения клеток ДП человека позволяет выделять большое количество ДП, не требуя микрохирургических манипуляций.

ДП волосяного фолликула человека образована фибробластоподобными клетками, имеющими ряд морфологических и функциональных отличий от фибробластов дермы. Специфические свойства клеток ДП можно выявить с использованием гистохимических маркеров. Например, специфические компоненты внеклеточного матрикса, синтезируемые клетками ДП, такие как кислые и нейтральные мукополисахариды, могут быть выявлены красителями толуидиновым синим и альциановым синим. С помощью них мы окрасили клетки ДП in situ и in vitro. При обработке альциановым синим (рН=2.5) срезов кожи человека мы обнаружили голубое окрашивание как ДП, так и соединительнотканной оболочки волосяного фолликула (рис. 4А, цветная вкладка). Культура клеток ДП также окрашивалась в голубой цвет (рис. 4Б,

Рис. 3. Дермальная папилла при ферментативной обработке.

цветная вкладка) При использовании толуидинового синего (рН=2 0) ДП окрашивались в сиреневый цвет, проявляя, таким образом, метахроматические свойства (рис 4В, цветная вкладка) Культивируемые клетки ДП также имели сиреневую окраску (рис 4Г, цветная вкладка) Дермальные фибробласты этими красителями не окрашивались Данные результаты свидетельствуют о том, что клетки ДП в культуре все еще сохраняют способность синтезировать специфические компоненты внеклеточного матрикса. Эти данные соответствуют результатам других исследований (Wu et al, 2005) и подтверждают истинную принадлежность выделенных нами клеток ДП

Еще одним маркером может служить активность щелочной фосфатазы В настоящем исследовании активность щелочной фосфатазы была обнаружена в культивируемых клетках ДП, при этом активность сохранялась при пассировании культуры до 7 пассажа, однако по мере пассирования она ослаблялась В литературе существуют различные данные по выявлению активности щелочной фосфатазы в культуре клеток ДП Так в работе Рэндл и соавторов активность щелочной фосфатазы в клетках ДП снижалась ко второму пассажу (количество клеток, проявляющих высокую активность щелочной фосфатазы, составляло менее 5%) (Rendí et al, 2008) В других исследованиях активность щелочной фосфатазы снижалась после 3 пассажа (McElwee et al, 2003) Культивируемые клетки ДП (преимущественно клетки волосяных фолликулов шерстяного покрова мыши) теряют способность индуцировать рост волосяных фолликулов после прохождения 4 пассажей, в то время как культивируемые клетки вибриссы крысы теряют эту способность уже после нескольких пассажей (Weinberg et al, 1993) Сохранение активности щелочной фосфатазы в процессе культивирования до 7 пассажа в нашем экперименте можно объяснить другими условиями культивирования, либо использованием более чувствительного метода детекции активности щелочной фосфатазы (NBT/BCIP)

Волосяной фолликул является источником мезенхимных стволовых клеток, которые участвуют в восстановлении дермы при ее повреждении (Jahoda & Reynolds, 2001) Есть данные, что стволовые клетки ДП вибриссы крысы имеют пролиферативные характеристики и профиль экспрессии поверхностных маркеров, подобные стволовым клеткам из костного мозга крысы Клетки волосяного фолликула и стромальные клетки из костного мозга крысы обладают одинаковыми потенциями к адипо- и остеогенной дифференцировкам, но некоторые различия обнаруживаютя в случае хондро- и миогенеза (Hoogduijn et al, 2006) Эти данные позволяют предполагать, что клетки ДП волосяного фолликула человека также могут обладать дифференцировочными потенциями Проведенное нами исследование поверхностных маркеров клеток ДП выявило маркеры мезенхимных стволовых клеток жировой ткани CD49d, CD 105 и STRO-1 CD 105 и STRO-1 также являются маркерами мезенхимных стволовых клеток костного мозга, однако CD49d в этих клетках не выявляется (Zuk et al, 2002) Клетки ДП экспрессировали CD49d на том же уровне, что и клетки стромы жировой ткани, однако синтез маркеров CD105 и STRO-1 был менее выражен

(рис 5, цветная вкладка) Постнатальные фибробласты дермы имели низкий уровень экспрессии CD49d, единичные клетки в популяции экспрессировали STRO-1 и не экспрессировали CD 105 Таким образом, можно сказать, что клетки стромы жировой ткани и клетки ДП обладают сходным поверхностным фенотипом, значительно отличающимся от фенотипа популяции дермальных фибробластов

Мы исследовали потенции клеток ДП человека дифференцироваться в клетки костной и жировой ткани при культивировании в индукционных средах. Адипогенную дифференцировку выявляли с помощью окраски на нейтральные жиры красителем Oil Red О и исследовали экспрессию маркера зрелых адипоцитов - лептина. В качестве положительного контроля использовали индуцированные в адипогенез клетки стромы жировой ткани, которые обладают сходными характеристиками со стволовыми клетками костного мозга и вступают в адипо- и остеогенез (Zuk et al, 2001), в качестве негативного контроля использовали постнатальные фибробласты дермы и клетки ДП, культивируемые в стандартной среде DMEM, не содержащей индукторов дифференцировки На 14 сутки среди клеток ДП, подвергнутых дифференцировке, были обнаружены клетки с цитоплазматическими включениями, которые окрашивались Oil Red О Отложение липидных капель в цитоплазме и экпрессию лептина наблюдали только в 20-30% клеток ДП Сравнительный анализ окраски различных клеточных популяций показал, что адипогенная дифференцировка клеток ДП, как и постнатальных фибробластов дермы была менее выражена по сравнению с клетками стромы жировой ткани Спонтанную дифференцировку клеток ДП не наблюдали

Для определения способности клеток ДП дифференцироваться в клетки костной ткани при культивировании в индукционной среде исследовали уровень экспрессии молекулярных маркеров остеогенеза остеонектина и остеопонтина На 21 сутки в клетках ДП обнаруживали экспрессию этих маркеров на уровне, сопоставимом с клетками стромы жировой ткани Постнатальные фибробласты не обладали такими свойствами В контрольной среде небольшое количество клеток ДП спонтанно дифференцировались в клетки костной ткани Остеогенная дифференцировка подтверждалась окраской клеток ализариновым красным и гистохимической реакцией на щелочную фосфатазу

Таким образом, исследование адипогенной и остеогенной дифференцировки показало, что клетки ДП больше склонны к остеогенной дифференцировке, чем к адипогенной

Для изучения процессов регенерации волосяного фолликула клетки ДП трансплантируют иммунодефицитным мышам Для этого используют несколько подходов клетки ДП имплантируют под капсулу почки или непосредственно под эпидермис В результате помещения клеток в инактивированные волосяные фолликулы с последующей трансплантацией под капсулу почки происходит реорганизация волосяных фолликулов При трансплантации клеток под кожу происходит стимуляция роста и развития волосяных фолликулов

Кератин 19 Hoechst 33342

Рис. 1. Экспрессия кератина 19 в волосяном фолликуле на стадии анагена. А) Волосяной фолликул in situ. К19+-клетки (помечены стрелками)

располагаются в области bulge и в нижней части волосяного фолликула. Красное свечение стержня волоса-автофлуоресценция. Б) Поперечный срез волосяного фолликула в области bulge.

Кератин 19

Ki67 Hoechst 33342

Кератин 19

Ki67, Hoechst 33342

Рис. 2. Экспрессия К19 и ¥Л61 в первичной культуре кератиноцитов (ув. ок.: х 10, об.: х 40). А) Через 1 сутки культивирования. К19+-клетки (помечены короткими стрелками) не окрашиваются антителами против К1-67, т.е. находятся в пролиферативном покое, в то время как К19"-клетки пролиферируют (помечены длинными стрелками). Б) Через 6 суток культивирования. Часть К19+-клеток окрашиваются антителами против Кл67 (помечены стрелками), т.е. пролиферируют.

Алыдиановый синий

Толуидиновый синий

Рис. 4. Характеристика клеток дермальной папиллы в условиях in situ (А, В) (ув. ок.: х 10, об.: х 4) и in vitro (Б, Г). Окраска альциановым синим (А, Б) и толуидиновым синим (В, Г).

ч'Б, . : .'

CD49d

CD105

STRO-1

Клетки стромы жировой ткани

Клетки

дермальной

папиллы

Постнатальныс фибробласты

Рис. 5. Сравнение фенотипических параметров клеток ДП, клеток стромы жировой ткани и фибробластов дермы с помощью исследования эспрессии поверхностных маркеров клеток стромы жировой ткани CD49d, CD105 и STRO-1 (зеленое свечение). Ядра клеток окрашены DAP1.

Ki67 PI

Кератин 19

Hoechst 33342

500 um

Рис. 11. Пролиферация краевых Рис. 12. Тубулярный вырост,

клеток эпидермального выроста. окрашенный антителами к

Окраска антителами к К167 кератину 19 (зеленое свечение).

(зеленое свечение). Ядра клеток Ядра клеток окрашены Hoechst

окрашены Р1 (ув. ок.: х 10, об.: х 33342.

20).

Кератин 10 Кератин 14

* 1>ДР1 • . ^ / DA PI

, 200 pm

Рис. 13. Срез эпидермального Рис. 14. Краевой участок

выроста, окрашенного антителами эпидермального выроста,

к кератину 10 (зеленое свечение). окрашенного антителами к

Ядра клеток окрашены ОАР1. кератину 14 (красное свечение).

Конфокальная микроскопия (ув. Ядра клеток окрашены ОАР1 ок.: х 10, об.: х 40).

Рис. 17. Мечение клеток с помощью лентивирусной конструкции. А) Клетки ДП экспрессируют сор йРР. Б) Базальные кератиноциты экспрессируют ОвЯес!.

Рис. 18. Миграция инъецированных Рис. 19. Стимуляция

клеток ДП (зеленое свечение) в ангиогенеза клетками ДП в

волосяные фолликулы. коже человека через 1 месяц

после трансплантации.

Для формирования волосяных фолликулов de novo необходимо создание трехмерной модели и трансплантация клеток ДГТ в сочетании с эпителиальными стволовыми клетками (Kishimoto et al, 1999). В нашей работе мы показали, что in vitro способность эпидермальных клеток человека формировать трехмерные структуры с участием миграции и пролиферации клеток сохраняется. Индуктивные способности клеток ДП человека в культуре нами были выявлены впервые. Использование системы in vitro позволяет проводить исследования с клетками человека. Это является важным преимуществом, поскольку существуют многочисленные различия между клетками животных и человека, и результаты, получаемые на животных, могут быть неадекватными по отношению к человеку.

Разработанная нами модель морфогенеза кератиноцитов человека в коллагеновом геле обладает преимуществом по сравнению с ранее разработанными (Шинин, 2001), поскольку содержит естественный индуктор тубулогенеза - клетки ДП или выделяемые ими факторы. Использование в качестве индуктора этой клеточной популяции, а не ФЭЧ, позволяет исключить неспецифические сигналы эмбриональной дермы и, следовательно, получать результаты, приближенные к ситуации in vivo. Наша модель имеет и дополнительные преимущества, поскольку мы используем первичные эпидермальные кератиноциты и клетки ДП 1-3 пассажей. Использование первичных клеток более предпочтительно, так как применение опухолевых или трансформированных линий в биологических исследованиях непременно накладывает ограничения в интерпретации результатов.

Использование в эксперименте среды, кондиционированной клетками ДП, показало, что для индукции тубулогенеза достаточно веществ, секретируемых клетками ДП в среду, а присутствие самих клеток необязательно. То же самое было обнаружено и для ФЭЧ (Шинин, 2001). При сравнении индукционной способности клеток ДП и ФЭЧ были обнаружены различия в морфологии тубул (рис. 6 А, 6Б).

Рис. 6. Формирование тубулярных структур при культивировании кератиноцитов в среде,

кондиционированной клетками А)ДП, Б) ФЭЧ. Фазовый контраст.

Эпидермальные тубулы, сформированные при культивировании кератиноцитов в среде, кондиционированной ДП, как правило, имели расширенный ведущий край. Таким образом, можно предположить, что морфогенетический потенциал

кератиноцитов может быть по-разному реализован в зависимости от типа мезенхимных клеток.

В связи с исчезновением индуктивных свойств клеток ДП в процессе культивирования (Weinberg et al., 1993) представляет интерес разработка новых подходов, позволяющих наращивать большое количество клеток ДП без потери их индуктивной способности. Одним из возможных способов является иммортализация клеток. Мы исследовали способность иммортализованных клеток ДП индуцировать эпителиальный морфогенез в культуре и показали, что иммортализованные клетки ДП могут индуцировать тубулогенез даже на 40 пассаже. Те же результаты были получены и при использовании среды, кондиционированной такими клетками.

Согласно литературным источникам индуктором инвазии эпителиальных клеток является фактор роста гепатоцитов (HGF), или scatter factor (SF) (Montesano et al., 1991 b). В ряде работ было показано, что клетки ДП, как и ФЭЧ, способны синтезировать этот фактор in vivo и in vitro (Defrances et al., 1992; Harrison & Farzaneh, 2000). Мы изучили способность этого морфогена индуцировать тубулогенез в нашей системе. Оказалось, что эффект SF/HGF по сравнению с кондиционированной клетками ДП средой, менее выражен (рис. 7). Таким образом, индукционная способность клеток ДП не может быть обусловлена только синтезом SF/HGF.

Рис. 7. Диаграмма, отображающая длину выростов при различных вариантах культивирования кератиноцитов. Р<0.01.

■J -

¡щ

ШИШ

Контроль HGF Коей среда

Структуры, сформированные в нашей модели в течение 10 дней, достигали в длину 1-2 мм и представляли собой тубулы, заполненные клетками. Такие образования варьировали по форме, но, главным образом, имели утолщенный ведущий край. Клетки наиболее выступающего в гель дистального отдела тубулы характеризовались малым размером и плотным расположением относительно друг друга (рис. 8А). Внутренняя часть тубулы содержала мало клеток, между которыми просматривались полости (рис. 8Б). Морфологическое разнообразие отделов тубулярного выроста, а также наличие полостей указывают на динамический характер тубулогенеза. Однако в сравнении с полыми тубулами,

формируемыми клетками почки собаки MDCK или клетками молочной железы, полости тубулярных структур, получаемые на культуре кератиноцитов, заполнены клетками. Возможно, такое строение тубул обусловлено способностью кератиноцитов к формированию стратифицированного эпидермиса. В то же время следует отметить, что при формировании волосяного фолликула in vivo образования полости также не происходит. В эмбриогенезе примитивный эпидермис врастает в дерму в виде многоклеточного тяжа, не имеющего полости. При достижении его проксимальным концом ДП, которая на данном этапе развития представлена в виде скопления мезенхимных клеток, происходит инициация роста волоса (Blanpain & Fuchs, 2006). Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что при культивировании в коллагеновом геле кератиноциты способны к реализации программы, свойственной им in vivo.

Рис. 8, Структура эпидермальных тубул. Окраска: гематоксилин -эозин. А) дистальный конец тубулы; Б) срезы тубул.

С помощью электронно-микроскопического исследования мы обнаружили, что эпидермальные тубулы состоят из клеток различной степени дифференцировки. На срезе одного уровня можно найти молодые клетки, зрелые, содержащие кератогиалиновые зёрна в цитоплазме, и отмирающие, с разрушающимися ядром и клеточными мембранами. При этом наблюдалась закономерность распределения клеток, имеющих разную степень дифференцировки. Ближе к центру располагались молодые кератиноциты, а зрелые и отмирающие - на периферии. При панорамной реконструкции одного из срезов было отмечено необычное расположение клеток относительно друг друга: они наползали друг на друга длинными отростками по спирали (рис. 9). Наши результаты соотносятся с данными других исследований, согласно которым кератиноциты склонны двигаться в гелеобразном субстрате по спирали (КопГагс! й а1., 2000). Электронно-микроскопическое исследование подтвердило отсутствие внутренней полости в некоторых частях тубулы. В местах касания таких ворсинок или просто мембран соседних клеток формировались многочисленные контакты. При изучении этих контактов при больших увеличениях было выяснено, что это десмосомы (рис. 10). По крупным межклеточным пространствам и наличию

многочисленных ворсинок можно судить о том, что клетки находятся в движении. Этот факт подтверждает и большое количество формирующихся десмосом. Были обнаружены морфологические структуры полудесмосом в местах контакта клеток с внеклеточным матриксом.

1"..............

: 'м

Ш:

,- 1 V . 000 раз

~ '¿У ' * Л;-' ^'ЧА;:

"-.**- ■ г!

Рис. 9. Поперечный срез эпидермального выроста. Электронная микроскопия. Панорамная реконструкция.

Рис. 10. Межклеточные контакты типа десмосом. Электронная микроскопия.

Иммуногистохимические исследование тубулярных выростов с помощью антител к Кл67 и кератинам 10, 14 и 19 позволило выявить пролиферирующие клетки и клетки различной степени дифференцировки. Изучение маркера Кл67 показало, что при формировании тубул имеет место пролиферация краевых клеток (рис. И, цветная вкладка). Однако количества пролиферирующих клеток недостаточно для формирования таких многоклеточных структур, поэтому, скорее всего, формирование тубул происходит в результате не столько пролиферации, сколько миграции эпидермальных клеток. О миграции клеток может говорить их вытянутая форма и наличие длинных отростков, направленных в гель. По литературным данным процесс формирования тубулярных структур, индуцированных в культуре ФЭЧ, можно разделить на несколько стадий: формирование эпителиальных отростков, эпителиальных цепочек, формирование тяжа и последущая стратификация кератиноцитов с образованием многоклеточного тяжа (Шинин, 2001). Пролиферация играет важную роль на стадии формирования эпителиального тяжа, миграция же преобладает на этапе формирования эпителиального отростка и цепочки. Согласно литературным данным потенциями к тубулогенезу обладает только небольшая часть суспензии кератиноцитов, клетки которой при культивировании на пластике дают начало большим эпителиальным колониям (Шинин, 2001). Формирование таких колоний

предположительно происходит из стволовых клегок Исследование потенциального маркера стволовых клеток волосяных фолликулов - кератина 19 (К 19) - не выявило закономерности в распределении К19+- клеток (рис 12, цветная вкладка) Эпидермальные тубулы не гомогенны по объему Так, например, экспрессия кератина 14 (К 14) была выявлена в клетках ведущего края тубулы (рис 14, цветная вкладка) По-видимому, эти клетки обладают повышенной миграционной способностью Изучение экспрессии кератина 10 показало, что дифференцированные кератиноциты располагаются в средней части тубулы по периферии (рис 13, цветная вкладка), в растущем крае доля К10+-клеток мала Полученные данные иммуногистохимического исследования подтверждают данные электронной микроскопии Они демонстрируют закономерное распределение кератиноцитов разной степени дифференцировки внутри этих клеточных образований

Распределение клеток по степени дифференцировки в тубулярных выростах схоже с таковым в мигрирующем пласте на плоском субстрате (Васильев и др, 1993, Воротеляк и др, 1996) В растущем крае таких колоний располагаются низкодифференцированные клетки, окрашивающиеся антителами к кератину 14 Молодые клетки находятся и в центре колонии в базальном слое, в супрабазальном слое - дифференцированные (по неопубликованным данным Воротеляк) Расположение клеток по степени дифференцировки большинства эпителиальных тканей типична и в ситуации m vivo и обеспечивается механизмами, координирующими миграцию и пролиферацию клеток (Lavker & Sun, 2000, Watt, 2001, Porten & Loefíkr, 1987, Borthwick et al, 2001)

Способность кератиноцитов к самоорганизации При изучении самоорганизации клеток нас интересовало, как данные процессы будут реализовываться при разобщении клеток трипсином будут ли клетки контактировать между собой Для исследования этой проблемы была разработана следующая модельная система трипсинизированные базальные кератиноциты в концентрации 300 тыс клеток/мл высевали на стекла, предварительно обработанные коллагеном I типа и полилизином, и культивировали в полной питательной среде с факторами роста и митогенными добавками При внесении дезагрегированных клеток на плоский субстрат мы наблюдали первичные события морфогенеза базальные кератиноциты начинали формировать клеточные агрегаты Сформированные агрегаты включали от пяти до нескольких десятков клеток, располагающихся с различной плотностью Скопления были образованы клетками разного размера и разного пролиферативного статуса В процессе развития культуры отдельные агрегаты соединялись между собой длинными ламеллиподиями в един>ю сеть (рис 15) В культуре существовали и одиночные клетки, которые прикреплялись к субстрату и поддерживали жизнеспособность в течение некоторого времени, однако если такие клетки не присоединялись к колонии в результате миграции или не контактировали с другими клетками при помощи ламеллиподий, они погибали Формирование агрегатов и длинных ламеллиподий можно рассматривать как

начальные стадии морфогенеза. Эти события напоминают процесс образования длинных ламеллиподий при регенерации эпидермиса после повреждения. Можно заключить, что дезагрегированные эпидермальные кератиноциты сохраняют способность к формированию правильной трехмерной структуры. Мы полагаем, что в условиях культивирования на плоском субстрате такие агрегаты являются зачатками структурно-функциональных единиц.

При помещении дезагрегированных базальных кератиноцитов в коллагеновый гель, наблюдали объединение клеток в единые тубулярные структуры (рис. 16). Однако формирование таких структур происходило иначе, по сравнению с тубулами, полученными с использованием первичных кератиноцитов. Феномен сборки тубулярных структур из одиночных клеток нами обнаружен впервые. Основным процессом при формировании таких тубул

Рис. 15. Взаимодействие базальных кератиноцитов на плоском субстрате с помощью ламеллиподий (ув. ок.: х 10, об.: х 20).

Рис. 16. Формирование тубулярных структур при культивировании базальных кератиноцитов в коллагеновом геле (ув. ок.: х 10, об.: х 40).

Таким образом, базальные кератиноциты сохраняют способность к формированию трехмерной структуры, как на плоском субстрате, так и в коллагеновом матриксе. Это свидетельствует о сохранении способности кератиноцитов к самоорганизации. Мы полагаем, что способность кератиноцитов использовать различные механизмы для формирования эпидермальных тубул свидетельствует об общей программе тубулогенеза, которая может быть осуществлена различными путями.

Способность клеток встраиваться в трехмерные структуры кожи in vivo

Для того чтобы выяснить, способны ли выращенные в культуре эпидермальные и мезенхимные клетки правильно встраиваться в структуры кожи и сохранять свой морфогенетический потенциал в системе in vivo, мы инъецировали клеточные популяции волосяного фолликула под эпидермис кожи

человека с последующей трансплантацией бестимусным мышам Для идентификации инъецированных клеток использовали лентивирусную метку Мечение клеток с помощью лентивирусной конструкции было очень эффективным доля зараженных клеток составила более 95% от общего количества (рис 17 А, Б, цветная вкладка) Результаты эксперимента показали, что инъецированные клетки выживали и обнаруживались в соответствующих структурах кожи Эпидермальные кератиноциты были, главным образом, найдены в составе волосяных фолликулов и, частично, в зоне межфолликулярного эпидермиса, а клетки ДП - в папиллярной дерме (рис 18, цветная вкладка) Таким образом, культивированные клетки полностью сохраняют способность встраиваться в структуру кожи, находя там свою нишу Это явление получило название хоминга (от англ home - дом) Впервые оно было описано для способности трансплантированных гематопоэтических стволовых клеток восстанавливать функцию костного мозга (Springer, 1990) Проведенные нами опыты показывают, что выращенные эпидермальные и мезенхимные клетки могут быть использованы для реконструкции волосяных фолликулов

В ходе эксперимента было замечено, что инъецированные клетки ДП стимулировали ангиогенез (рис 19, цветная вкладка) Известно, что ДП содержит кровеносные сосуды, которые обеспечивают ее питанием, необходимым для деления эпителиальных клеток и роста волоса По всей видимости, клетки ДП синтезируют факторы, способствующие прорастанию сосудов Заключение

Волосяной фолликул - уникальный объект, позволяющий исследовать различные биологические процессы Его эпителиальный и мезенхимный компоненты служат источником стволовых клеток В культуре эпидермальные стволовые клетки участвуют в регенерации культивируемого эпителиальною пласта и в тубулогенезе кератиноцитов в коллагеновом геле

В настоящее время наиболее достоверным маркером стволовых клеток волосяного фолликула явтяется кератин 19 Мы изучили поведение популяции кератин 19+-клеток в культуре Результаты нашего исследования показывают, что популяция кератин 19+-клеток гетерогенна Среди К19+-клеток встречаются очень мелкие клетки, соответствующие по размерам стволовым, и крупные, которые могут соответствовать дифференцированным клеткам Доля К19+-клеток в культуре возрастает Мы показали, что в процессе культивирования происходит дополнительная индукция синтеза кератина 19 в клетках, где ранее этот белок не экспрессировался

Стволовые мезенхимные клетки волосяного фолликула располагаются в ДП Мы подтвердили их полипотентность в исследованиях по культивированию клеток в индукционных средах Часть клеток ДП дифференцировалась в адипогенном и остеогенном направлениях Однако этот процесс был менее выражен при сравнении с дифференцировкой клеток стромы жировой ткани

Практическое применение клеток ДП ограничено сложностью их выделения Разработанная нами методика оказалась очень эффективной и позволила

упростить процедуру выделения клеток, поскольку была полностью лишена микрохирургических манипуляций

Исследование клеток ДП в системе in vivo показало, что эти клетки остаются жизнеспособными по крайней мере в течение 2 месяцев При этом они обнаруживаются в волосяном фолликуле - естественной нише Мы также отметили, что клетки ДП вызывают усиленный ангиогенез.

В проведенном нами исследовании было впервые показано, что эпидермальные кератиноциты взрослого человека полностью сохраняют потенции к морфогенезу, в норме проходящему на раннем этапе эмбриогенеза при формировании волосяного фолликула, и проявляют их под воздействием клеток ДП Кроме того, мы показали, что морфогенетический потенциал может быть по-разному реализован в зависимости от типа кокультивируемых мезенхимных клеток

Структура тубул и характер их роста во многом схожи со структурой и морфогенезом волосяного фолликула живого организма Это доказывает адекватность предложенной нами модели

Учитывая данные литературы и полученные результаты, можно предположить, что модель морфогенеза волосяного фолликула отражает основные механизмы начальных этапов морфогенеза придатков кожи Предложенные нами модели оказались удобными для изучения индукционной способности клеток ДП, а также исследования характера роста тубул и их структурной организации Разработанные модели могут использоваться для изучения молекулярных механизмов морфогенеза волосяного фолликула

Работа поддержана Министерством образования и науки РФ (госконтракт №02512 11 2096) и грантом РФФИ (проект 08-04-00611-а)

Выводы

1 В культуре популяция К19+-кератиноцитов человека является обособленной популяцией, способной самоподдерживаться Доля К19+-клеток в культуре возрастает Часть К19+-клеток в культуре является потомками клеток волосяного фолликула, а при длительном культивировании происходит дополнительная индукция синтеза кератина 19 К19"-клетками

2 Клетки ДП имеют ряд отличий от клеток интерфолликулярной дермы Популяция клеток ДП человека содержит прогениторные клетки, способные дифференцироваться в клетки костной и жировой ткани Эти клетки индуцируют тубулогенез в культуре кератиноцитов, помещенных в коллагеновый гель

3 Структура тубулярных выростов и характер их морфогенеза во многом схожи с таковыми волосяного фолликула на его начальных этапах формирования, что указывает на адекватность предложенной модели

4 В тубулярных выростах наблюдается закономерное распределение кератиноцитов разной степени дифференцировки молодые клетки выявляются в ведущем крае тубулы, дифференцированные - располагаются в средней части тубулы по периферии Основной тип межклеточных соединений - адгезионные контакты типа десмосом

5 Агрегация кератиноцитов в условиях культуры отражает процессы формирования структурно-функциональных единиц т vivo Дезагрегированные кератиноциты сохраняют способность воссоздавать трехмерные структуры путем самосборки

6 Клетки ДП, инъецированные в кусочки кожи человека с последующей трансплантацией бестимусным мышам, способны встраиваться в трехмерные структуры кожи и стимулировать ангиогенез

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации Статьи:

1. Воротеляк Е А, Чермных Э С , Васильев А В , Терских В В «Организация популяции кератиноцитов в культуре in vitro» Известия Академии Наук 2005, 6, стр 645-649

2. Воротеляк Е А, Чермных Э С, Васильев А В , Терских В В «Экспрессия кератин 19 в культуре эпидермальных кератиноцитов человека» Доклады Академии Наук 2006,408, стр 835-837

3. Воротеляк Е А, Чермных Э С, Ткаченко С Б, Васильев А В, Терских В В «Экспрессия и функция гена рбЗ в эпителиальных клетках» Известия Академии Наук 2007, 4, стр 389-393

4. Чермных Э С , Воротеляк Е А , Ткаченко С Б , Васильев А В , Терских В В «Пролиферация К19-положительных клеток в культуре эпидермальных кератиноцитов человека» Доклады Академии Наук 2007, 416, стр 406-408

5. Киселева Е В , Чермных Э С , Воротеляк Е А, Воложин А И , Васильев А.В, Терских В В Сравнение дифференцировочных возможностей фибробластоподобных клеток стромы костного мозга, жировой ткани, дермальной папиллы и фибробластов дермы человека Цитология (в печати)

Тезисы конференций:

1 Чермных Э С, Воротеляк Е А , Васильев А В , Терских В В «Структурная организация в культуре эпидермальных кератиноцитов человека» Онтогенез 2005,36(5), стр 398-399

2 Vorotelyak Е А, Chermnykh Е S , Vasiliev А V , Tsitrin Е В , Terskikh V «Heterogeneity and structural arrangement of human keratmocytes in vitro» J Invest Dermatol 2005,124(4), p 60

3 Воротеляк E A, Чермных Э С, Васильев А В, Терских В.В «Моделирование процесса формирования придатков кожи in vitro» Конференция «Биология стволовых клеток фундаментальные аспекты», Москва, 2005, Сборник тезисов конференции, стр 21

4 Чермных Э С «Кератин 19-положительные клетки волосяного фолликула» Онтогенез 2006, 37(4), стр 319-320

5 Чермных Э С «Тубулогенез эпидермальных кератиноцитов» Онтогенез 2007, 38(4), стр 320

6 Чермных Э С, Воротеляк Е А, Васильев А В , Терских В В «Поведение стволовых клеток волосяного фолликула в культуре» Симпозиум «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза», Москва, 2007, Сборник тезисов конференции, стр 174

7 Воротеляк Е А, Чермных Э С , Васильев А В , Иванов А А, Терских В В «Моделирование морфогенетических процессов в тканевых эквивалентах in vitro» Сборник тезисов конференции, стр 149

8 Васильев А В , Воротеляк Е А, Роговая О С, Е В Киселева, Чермных Э С «Живые эквиваленты тканей и стволовые тканеспецифические клетки» Цитология 2007,49, стр 724

9 Чермных Э С «Характеристика клеток дермальной папиллы волосяного фолликула и их индукционные свойства в культуре» Онтогенез 2008, 39(4), стр 320

10 Чермных Э С, Киселева Е В , Воротеляк Е А, Васильев А В , Терских В В «Сравнение дифференцировочных потенций клеток дермальной папиллы волосяного фолликула и клеток стромы жировой ткани человека» V Конференция молодых ученых России "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", Москва, 2008, Электронный сборник тезисов конференции, стр 466

Подписано в печать 28 08 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 667 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чермных, Элина Сергеевна

Список сокращений.

Введение.

I. Обзор литературы.ю

1.1. Структура эпидермиса.

1.1.1. Эпидермальная пролиферативная единица.

1.1.2. Базальная мембрана.

1.1.3. Цитоквратины.

1.2. Клеточные контакты кератиноцитов.

1.2.1. Плотные контакты.

1.2.2. Заякоривающие контакты.

1.2.3. Коммуникационные контакты.

1.3. Волосяной фолликул как производное кожи.

1.4. Стволовая эпидермальная клетка.

1.4.1. Ниша стволовых клеток.

1.4.2. Характеристика стволовых клеток.

1.4.3. Кератин 19-положительные клетки.

1.5. Мезенхимные клетки волосяного фолликула.

1.6. Особенности культивирования клеток эпидермиса.

1.6.1. Формирование культуры кератиноцитов.

1.6.2. Адгезия кератиноцитов к субстрату.

1.6.3. Действие различных субстратов и их использование при культивировании кератиноцитов.

1.6.4. Трансплантация выращенных в культуре эпидермальных пластов.

1.6.5. Влияние факторов роста.

1.6.6. Сохранение стволовых клеток в культуре.

1.6.7. Использование трехмерных гелей в культивировании эпителиальных клеток

1.7. Взаимодействие кератиноцитов и фибробластов.

1.8. Морфогенез эпителия.

1.8.1. Тубулогенез как пример морфогенеза.

1.8.2. Механизм формирования тубулярных структур.

1.8.3. Влияние различных факторов на морфогенез.

1.8.4. Модель для изучения морфогенеза эпителиальных клеток.

П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

II. 1. МАТЕРИАЛЫ.

Ц.1.1. Клеточные культуры.

П.1.2. Химические реактивы.

II.2. МЕТОДЫ.

11.2.1. Выделение первичных кератиноцитов человека.

11.2.2. Культивирование кератиноцитов на пластике.

П.2,3. Получение базальных кератиноцитов.

11.2.4. Выделение клеток интерфолликулярного эпидермиса.

11.2.5. Выделение и культивирование постнатальных фибробластов человека.

JI.2.6. Выделение и культивирование эмбриональных фибробластов человека.

JJ.2.7. Выделение клеток дермальной папиллы человека.

П.2.8. Выделение клеток ДП вибрисс крысы.

JJ.2.9. Новый метод выделение клеток ДП.

11.2.10. Получение сред, кондиционированных фибробластами.

11.2.11. Гистохимическое окрашивание.

11.2.12. Индукция и детекция остео- и адипогенной дифференцировок.

11.2.13. Выделение коллагена из хвостов крыс.

11.2.14. Обработка стекол субстратами.

П.2.15. Обработка клеток митомицином С.

11.2.16. Приготовление коллагенового геля.

11.2.17. Иммуногистохимическое исследование.

11.2.18. Культивирование кератиноцитов на поверхности коллагенового геля.

11.2.19. Культивирование кератиноцитов в коллагеновом геле.

11.2.20. Электронная микроскопия.

11.2.21. Мечение клеток лентивирусом.

11.2.22. Трансплантация клеток иммунодефицитным мышам.

11.2.23. Выявление BrdU-меченных клеток.

IJ.2.24. Выявление активности щелочной фосфатазы.

11.2.25. Изучение влияния различных факторов на поведение базальных кератиноцитов.

11.2.26. Статистическая обработка результатов.

Ш. Результаты исследований.

III.1. Стволовые клетки.

111.1.1. Экспрессия кератина 19.

111.1.2. Влияние кальция на экспрессию кератина 19.

III. 1.3. Пролиферация К19+-клеток.

111.1.4. Экспрессия кератина 19 в базальных кератиноцитах.

111.1.5. Ингибирование пролиферации кератиноцитов митомицином С.

111.1.6. Культивирование клеток интерфолликулярного эпидермиса.

111.2. Культивирование и характеристика клеток ДП.

7/7.2. Л Разработка метода выделения клеток ДП.

III.2.2. Культивирование клеток ДП.

Ш.2.3. Идентификация клеток ДП,.

III.2.4. Активность щелочной фосфатазы в клетках ДП.

1П.2.5. Остео- и адипогенная дифференцировки клеток ДП.

III.2.6. Изучение индуктивных свойств клеток ДП.

Ш.2.7. Индуктивные свойства иммортализованных клеток ДП.

1П.2.8. HGF/SF- индуктор морфогенеза.

111.3. Структура эпидермальных выростов.

IU.3.1. Гистология тубулярных структур.

1П.3.2. Электронная микроскопия.

Ш.3.3. Флуоресцентная микроскопия.

111.4. Способность кератиноцитов к самоорганизации.

111.5. Изучение способности клеток встраиваться в трехмерные. структуры кожи in vivo.

IJI.S.1. Трансдукция клеток лентивирусными частицами in vitro.

IJI.S.2. Трансплантация клеток в систему in vivo.

IV. Обсуждение результатов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клетки волосяного фолликула in vitro"

Кожа представляет собой сложно организованную структуру, сформированную из клеток эпителиальной и соединительной ткани. Эпидермис - наружный эпителиальный слой кожи - состоит из клеток (кератиноцитов) различной степени дифференцировки. Кератиноциты базального слоя, примыкающие к дерме, за счет деления и последующей миграции в вышележащие слон, обеспечивают регенерацию эпителиальной ткани. Такая высокая регенеративная способность эпидермальной ткани обеспечивается благодаря делению стволовых клеток. Клетки в эпидермисе расположены упорядочено. Полагают, что эпидермис состоит из структурно-функциональных единиц, которые представляют собой колонки клеток, в основании которых располагается стволовая клетка, и вся колонка считается нишей для этой стволовой клетки.

Несмотря на большое число исследований в области биологии эпидермальных I стволовых клеток, строгих маркеров для их выявления до сих пор не обнаружено. Исследования экспрессии предложенных молекулярных маркеров показывают спорные результаты. В частности, многое остается неясным и в отношении экспрессии предполагаемого маркера эпидермальных стволовых клеток - кератина 19. Изучение стволовых клеток интересно не только с фундаментальной, но и с прикладной точки зрения, так как понимание проблемы сохранения и идентификации стволовых клеток в культуре кератиноцитов и их участия в регенераторных процессах позволяет совершенствовать живой эквивалент кожи, применяемый для восстановления кожного покрова в клинической практике.

Клетки эпидермиса под воздействием индукционных сигналов со стороны дермы формируют такие структуры как волосяные фолликулы, сальные и потовые железы.

Волосяной фолликул является резервуаром стволовых клеток эпидермиса, которые способны давать начало всем типам эпителиальных клеток волосяного фолликула в процессе его регенерации в цикле роста волоса, а также клеткам интерфолликулярного эпидермиса и клеткам сальной железы. Волосяной фолликул является уникальной структурой и играет важнейшую роль в процессе роста волос и поддержании гомеостаза эпидермиса. Фолликул подвержен циклическим изменениям, в ходе которых способен полностью регенерировать. Основы такой регенерации лежат в особенностях эпителиального и мезенхимного компонентов фолликула. В цикле роста волоса реорганизация волосяного фолликула происходит в результате серии индукционных взаимодействий между клетками мезенхимы и эпителия. Популяцией мезенхимных клеток, обладающих индукционной способностью, являются клетки дермальной папиллы (ДП), которые и инициируют рост волоса.

Исследования свойств клеток ДП in vivo показывают, что при помещении их под кожу бестимусных мышей происходит индукция формирования волосяных фолликулов. In vitro индукционные свойства клеток ДП не изучены. Однако известно, что кератиноциты при помещении в коллагеновый матрикс в присутствии эмбриональных фибробластов способны его инвазировать и формировать структуры, сходные с придатками кожи. Использование в исследованиях in vitro популяции клеток ДП позволит создать условия, более приближенные к ситуации in vivo, в то время как эмбриональные фибробласты могут давать ошибочные представление о процессах морфогенеза. Данное научное направление является весьма перспективным. С использованием описанных клеточных систем возможно изучение фундаментальных морфогенетических процессов, протекающих в эпидермисе человека на разных этапах онтогенеза. Эти клеточные системы представляют большой интерес для изучения процессов дифференциации клеток, эпителио - мезенхимных взаимодействий, поведения стволовых клеток, процессов апоптоза и др. Раскрытие механизмов межклеточного контактирования при формировании волосяного фолликула позволит 8 создавать подходы тканевой инженерии для восстановления функции волос у людей с заболеваниями волосяного фолликула или потерей его функции. С другой стороны, модификация живых тканевых эквивалентов с использованием клеток ДП может разрешить проблему восстановления роста волос в местах трансплантаций. Кроме того, модель морфогенеза волосяного фолликула может служить тест-системой для изучения фармакологического действия лекарственных препаратов.

Цель нашего исследования:

Целью нашего исследования явилось изучение морфо-функционального состояния клеток волосяного фолликула при разных условиях их культивирования. Задачи исследования:

1. Охарактеризовать кератин 19-положительные клетки эпидермиса человека в культуре.

2. Выделить и охарактеризовать клетки ДП.

3. Разработать модель формирования волосяного фолликула в культуре.

4. Изучить клеточные механизмы формирования тубулярных структур в культуре эпидермальных кератиноцитов человека.

5. Изучить способность клеток встраиваться в трехмерные структуры кожи in vivo.

6. Исследовать способность кератиноцитов к самоорганизации.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Чермных, Элина Сергеевна

Выводы

1. В культуре популяция К19+-кератиноцитов человека является обособленной популяцией, способной самоподдерживаться. Доля К19+-клеток в культуре возрастает. Часть К19+-клеток в культуре является потомками клеток волосяного фолликула, а при длительном культивировании происходит дополнительная индукция синтеза кератина 19 К19'-клетками.

2. Клетки ДП имеют ряд отличий от клеток интерфолликулярной дермы. Популяция клеток ДП человека содержит прогениторные клетки, способные дифференцироваться в клетки костной и жировой ткани. Эти клетки способны индуцировать морфогенез в культуре кератнноцитов, помещенных в коллагеновый гель.

3. Структура тубулярных выростов и характер их морфогенеза во многом схожи с таковыми волосяного фолликула на его начальных этапах формирования, что указывает на адекватность предложенной модели.

4. В тубулярных выростах наблюдается закономерное распределение кератиноцитов разной степени дифференцировки: молодые клетки выявляются в ведущем крае тубулы, дифференцированные - располагаются в средней части тубулы по периферии. Основной тип межклеточных соединений - адгезионные контакты типа десмосом.

5. Агрегация кератиноцитов в условиях культуры отражает процессы формирования структурно-функциональных единиц in vivo. Дезагрегированные кератиноциты сохраняют способность воссоздавать трехмерные структуры путем самосборки.

6. Клетки дермальной папиллы, инъецированные в кусочки кожи человека с последующей трансплантацией бестимусным мышам, способны встраиваться в трехмерные структуры кожи и стимулировать ангиогенез.

V. Заключение

Волосяной фолликул — уникальный объект, позволяющий исследовать различные биологические процессы. Его эпителиальный и мезенхимный компоненты служат источником стволовых клеток. В культуре эпидермальные стволовые клетки участвуют в регенерации культивируемого эпителиального пласта и в тубулогенезе кератиноцитов в коллагеновом геле. В клинической практике стволовые клетки эпидермиса используют для создания живого эквивалента кожи, применяющегося для восстановления кожного покрова. Поэтому идентификация и исследование стволовых клеток в культуре кератиноцитов представляют как фундаментальный, так и прикладной интерес.

В настоящее время наиболее достоверным маркером стволовых клеток волосяного фолликула является кератин 19. Мы изучили поведение популяции кератин 19+-клеток в культуре. Результаты нашего исследования показывают, что популяция кератин 19+-клеток гетерогенна. Среди К19+-клеток встречаются очень мелкие клетки, соответствующие по размерам стволовым, и крупные, которые могут соответствовать дифференцированным клеткам. Доля К19+-клеток в культуре возрастает. Мы показали, что в процессе культивирования происходит дополнительная индукция синтеза кератина 19 в клетках, где ранее этот белок не экспрессировался.

Стволовые мезенхимные клетки волосяного фолликула располагаются в ДП. Мы подтвердили их полипотентность в исследованиях по культивированию клеток в индукционных средах. Часть клеток ДП дифференцировалась в адипогенном и остеогенном направлениях. Однако этот процесс был менее выражен при сравнении с дифференцировкой клеток стромы жировой ткани.

Практическое применение клеток ДП ограничено сложностью их выделения. Разработанная нами методика оказалась очень эффективной и позволила упростить процедуру выделения клеток, поскольку была полностью лишена микрохирургических манипуляций. . ■ ■''.;. i'"

Исследование клеток ДП в системе in vivo показало, что эти клетки остаются жизнеспособными по крайней мере в течение 2 Месяцев. При этом они обнаруживаются в волосяном фолликуле - естественной нише. Мы также отметили, что клетки ДП вызывают усиленный ангиогенез.; Эти данные могут быть полезны для ■ разработки технологии с применением клеток ДП в клинической практике.

Совместное культивирование,,в составе эпителио-мезенхимного эквивалента клеток ДП волосяного фолликула и эпидермальных кератиноцитов позволяет моделировать процессы межклеточного взаимодействия при формировании и циклировании волосяных фолликулов. Моделирование процессов эпителиального морфогенеза в культуре является актуальным направлением современной клеточной биологии, которое пока слабо развито. В проведенном нами исследовании было впервые показано, что эпидермальные кератиноциты взрослого человека, под воздействием клеток ДП полностью сохраняют . морфогепетические потенции, в том числе способность к тубулогенезу, в норме проходящему на раннем этапе эмбриогенеза при формировании волосяного фолликула. Кроме того, мы показали; что морфогенетический потенциал может быть по-разному реализован в зависимости от типа ко культивируемых мезенхимных клеток. Это означает, что взрослый эпидермис при соответствующем сигнале может формировать волосяные фолликулы. Данное направление чрезвычайно перспективно в плане определения клеточных механизмов развития алопеции и разработки подходов к ее,коррекции с использованием клеточных технологий.

Структура выростов и характер их роста во многом схожи со структурой и морфогенезом волосяного фолликула живого организма. Это доказывает адекватность предложенной нами модели. Учитывая данные литературы и полученные результаты, можно ' '140 предположить, что модель морфогенеза волосяного фолликула отражает основные механизмы начальных этапов морфогенеза придатков кожи. Предложенная нами модель оказалась удобной для изучения индукционной способности клеток ДП, а также исследования характера роста выростов и их структурной организации. Разработанные модели могут использоваться для изучения молекулярных механизмов морфогенеза волосяного фолликула.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чермных, Элина Сергеевна, Москва

1. Васильев А.В., Волошин А.В., Воротеляк Е.А., Терских В.В. (1993). Миграция колоний эпидермальных кератиноцитов человека в культуре. Докл. РАН, 329, 2, 232235.

2. Воротеляк Е.К., Сатдыкова Г.П., Васильев А.В., Терских В.В. (1996). Электронно-микроскопическое исследование мигрирующих колоний кератиноцитов. Известия РАН, 4, 485-489.

3. Воротеляк Е.А., Шихвердиева А.Ш., Васильев А.В., Терских В.В. (2002). Фибробласты стимулируют эпителизацию коллагенового геля. Известия РАН, 4, 421426.

4. Терских В.В., Васильев А.В. (1995). Эпидермальные кератиноциты человека и животных: проблемы культивирования и трансплантации. М.: Наука,. 103.

5. Терских В.В., Васильев А.В., Воротеляк Е.А. (2003). Структурно-функциональные единицы эпидермиса. Известия АН. Сер. Биол., 6, 645-649.

6. Терских В.В., Васильев А.В., Воротеляк Е.А. (2007). Ниши стволовых клеток. Известия АН Сер Биол 3, 261-272.

7. Хрущов Г.К., Бродский В.Я. (1961). Орган и клетка (некоторые проблемы цитологии и гистологии). Успехи совр. биол. 52, 2, 181-207.

8. Шинин В.В. (2001). Морфогенетические процессы в культуре кератиноцитов человека. Автореферат. Канд. Дис. Москва

9. Шинин В.В. (2002). Роль пролиферации в тубулогенезе кератиноцитов человека. Известия АН Сер. Биол. 4, 407-420.

10. Adams, J.C., Watt, F.M. (1989). Fibronectin inhibits the terminal differentiation of human keratinocytes. Nature 340, 307-309.

11. Albert, M.R., Foster, R.A., Vogel, J.C. (2001). Murine epidermal label-retaining cells isolated by flow cytometry do not express the stem cells marker CD34, Sca-1, Flk-1. J. Invest. Dermatol 117, 943-948.

12. Alberts В., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. (2002). Molecular biology of the cell. Garland Science. Fourth edition.

13. Alonso L., Fuchs E. (2003). Stem cells in the skin: waste not, Wnt not. Genes Dev. 17, 11891200.

14. Assouline M., Chew S. J., Thompson H. W., Beuerman R. (1992). Effect of growth factors on collagen lattice contraction by human keratocytes. Invest. Ophthalmology and Visual Sci. 33, 1742-1755.

15. Aubin J.E., Liu F., Malaval L., Gupta A.K. (1995). Osteoblast and chondroblast differentiation. Bone 17 Suppl, 77S-83S.

16. Backienbach J.R. & Mackenzie I.C. (1984). Identification and localization of label-retaining cells in hamster epithelia. J Invest Dermatol. 82, 618-622.

17. Balkovetz D.F. (1998). Hepatocyte growth factor and Madin-Darby canine kidney cells: in viro models of epithelial cell movement and morphogenesis. Microsc. Res. Tech. 43, 456463.

18. Barrandon Y., Green H. (1987b). Cell Migration is essential for sustained growth of keratinocyte colonies: the roles of transforming growth factor a and epidermal growth factor. Cell, 50, 1131-1137.

19. Barrandon, Y., Green, H. (1985). Cell size as a determinant of the clone-forming ability of human keratinocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 5390-5394.

20. Barrandon, Y., Green, H. (1987a). Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2302-2306.

21. Bartek J., Durban E.M., Hallowes R.C., Taylor-Papadimitriou J. (1985). A subclass of luminal epithelial cells in the human mammary gland, defined by antibodies to cytokeratins. J Cell Sci. 75, 17-33.

22. Baxter M.A., Wynn R.F., Jowitt S.N., Wraith J.E., Fairbairn L.J., Bellantuono I. (2004). Study of telomere length reveals rapid aging of human marrow stromal cells following in vitro expansion. Stem cells 22, 675-682.

23. Bell E, Ehrlich HP, Buttle DJ, Nakatsuji T. (1981). Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. Science 211, 1052-1054.

24. Bell E., Ehrlich H. P., Sher S. (1981). Development and use of a living skin equivalent. J. Plastic and Reconstruct Surg. 67, 386-392.

25. Bell E., Parenteau N., Gay R., Nolte C., Kemp P., Bilbo P., Ekstein В., Johnson E. (1991). The living skin equivalent: its manufacture, its organotypic properties and its responses to irritants. Toxic. In Vitro 5, 591-596.

26. Berdichevsky, F., Alford, D., D'Souza, В., Taylor-Papadimitriou, J. (1994). Branching morphogenesis of human mammary epithelial cells in collagen gels. J. Cell Sci. 107, 35573568.

27. Bickenbach J.R., (1981). Identification of label-retaining cells in oral mucosa and skin. J. Dent. Res. 122, 1611-1620.

28. Blanpain C., Fuchs E. (2006). Epidermal stem cells of the skin. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 339-373.

29. Blumcke S., Morgenroth К. Jr. (1967). The stereo ultrastructure of the external and internal surface of the cornea. J Ultrastruct. Res. 18, 502-518.

30. Bohnert A., Hormung J., Mackenzie J. C., Fusenig N. E. (1986). Epithelial-mesenchymal interactions control basement membrane production and differentiation in cultured and transplanted mouse keratinocytes. Cell and Tissue Res. 244, 413-429.

31. Bol D.K., Kiguchi K., Gimenez-Conti I., Rupp Т., DiGiovanni J. (1997). Overexpression of insulin-like growth factor-I induces hyperplasia, dermal abnormalities, and spontaneous tumor formation in transgenic mice. Oncogene 14, 1725-1734.

32. Borthwick D.W., Shahbazian M., Krantz Q.T., Dorin J.R., Randell S.H. (2001). Evidence for stem-cell niches in the tracheal epithelium. Am J Re spir Cell Mol Biol. 24, 662-670.

33. Brinkmann V., Foroutan H., Sachs M., Weidner K.M., Birchmeier W. (1995). Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenetic programs in epithelial cells. J.Cell Biol. 131, 1573-1586.

34. Carter W. G., Wayner E. A., Bouchard T. S., Kaur P. (1990). The role of integrins a2 pi and аЗр 1 in cell-cell and cell-substrate adhesion of human epidermal cells. J. Cell Biol. 110, 1387-1404.

35. Caulin C., Salvesen G.S., Oshima R.G. (1997). Caspase cleavage of keratin 18 and reorganization of intermediate filaments during epithelial cell apoptosis. J Cell Biol. 138, 1379-1394.

36. Chiu H.C., Chang C.H., Wu Y.C. (1993). An efficient method for isolation of hair papilla and follicle epithelium from human hair specimens. Br. J. Dermatol. 129, 350-351.

37. Chodankar R., Chang C.H., Yue Z., Jiang T.X., Suksaweang S., Burrus L., Chuong C.M., Widelitz R. (2003). Shift of localized growth zones contributes to skin appendage morphogenesis: role of the Wnt/bcta-catenin pathway. J. Invest. Dermatol. 120, 20-26.

38. Clark E.A., Brugge J.S. (1995). Integrins and signal transduction pathways: the road taken. Science 268, 233-239.

39. Clark P. (1994). Modulation of scatter factor/hepatocyte growth factor activity bycell-substratum adhesion. J. Cell Sci. 107, 1265-1275.

40. Claudinot S., Nicolas M., Oshima H., Rochat A., Barrandon Y. (2005). Long-term renewal of hair follicles from clonogenic multipotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 102, 14677-14682.

41. Clayton E., Doupe D.P., Klein A.M., Winton D.J., Simons B.D., Jones P.H. (2007). A single type of progenitor cell maintains normal epidermis. Nature 446, 185-189.

42. Commo S., Gaillard O., Bernard B.A. (2000). The human hair follicle contains two distinct K19 positive compartments in the outer root sheath: a unifying hypothesis for stem cell reservoir? Differentiation. 66, 157-164.

43. Cotsarelis G., Sun T.-T., Lavker R.M. (1990). Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cell 61, 1329-1337.

44. Couchman J.R. (1986). Rat hair follicle dermal papillae have an extracellular matrix, containing basement membrane components. J. Invest. Dermatol. 87, 762-767.

45. Couchman J.R. (1993). Hair follicle proteoglycans. J. Invest. Dermatol. 101, 60S-64S.

46. Coulombe P.A. (1993). The cellular and molecular biology of keratins: beginning a new era. Curr Opin Cell Biol. 5, 17-29.

47. Cui W., Fowlis D.J., Cousins F.M., Duffie E., Bryson S., Balmain A., Akhurst R.J. (1995). Concerted action of TGF-P an dits type II receptor in control of homeostasis in transgenic mice. Genes Dev. 9, 945-955.

48. Defrances M.C., Wolf H.K., Michalopoulos G.K., Zarnegar R. (1992). The presence ofhepatocyte growth factor in the developing rat. Development 116, 387-95.147

49. Dover R., Potten C. S. (1988). Heterogeneity and cell cycle analyses from time-lapse studies of human keratinocytes in vitro. J. CellSci. 89, 359-364.

50. Dvorankova В., Motlik J., Holikova Z., Vacik J., Smetana K. Jr. (2002). Dolichos biflorusagglutinin-binding site expression in basal keratinocytes is associated with cell differentiation. Biol Cell. 94, 365-373.

51. Elder J.T., Fisher G.J., Lindquist P.B., Bennet G.L., Pittelkow M.R., Coffey RJ. Jr., Ellingsworth L., Derynk R., Voorhees J.J. (1989). Overexpression of transforming growth factor a in psoriatic epidermis. Science 243, 811-814.

52. Emerman J., Pitelka D. (1977). Maintenance and induction of morphological differentiation in dissociated mammary epithelium on floating collagen membranes. In Vitro 13, 316-322.V

53. Enomoto-lwamoto M., Menko A. S., Philip N. And Boettiger D. (1993). Evaluation of integrin molecules involved in substrate adhesion. Cell Adhes. Commun. 1, 191-202.

54. Fradette J., Germain L., Seshaiah P., Coulombe P.A. (1998). The type I keratin 19 possesses distinct and context-dependent assembly properties. J Biol Chem. 273, 35176-35184.

55. Friedl P., Hegerfeldt Y., Tusch M. (2004). Collective cell migration in morphogenesis and cancer. Int. J. Dev. Biol. 48, 441-449.

56. Fuchs (1997). Keith R. Porter Lecture, 1996. Of mice and men: genetic disorders of the cytoskeleton, MolBiol Cell. 8, 189-203.

57. Fuchs E., Byrne C. (1994). The epidermis: rising to the surface. Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 725-736.

58. Fuchs E., Green H. (1980). Regulation of terminal differentiation of the keratinocyte. Cell 19, 1033-1042.

59. Fujie Т., Katoh S., Oura H., Urano Y., Arase S. (2001). The chemotactic effect of a dermal papilla cell-derived factor on outer root sheath cells. J. Dermatol. Sci. 25, 206-212.

60. Galbraith C.G., Sheetz M.P. (1998). Forces on adhesive contacts affect cell function. Curr Opin Cell Biol. 10, 566-571.

61. Garrod D.R., Fleming S. (1990). Early expression of desmosomal components during kidneytubule morphogenesis in human and murine embryos. Development 108, 313-321.

62. Ghazizadeh S., Taichman L.B. (2005). Organization of stem cells and their progeny in human epidermis. J. Invest. Dermatol. 124, 367-372.

63. Goodman L., Ledbetter S. (1992). Secretion of stromelysin by cultured dermal papilla cells: differential regulation by growth factors and functional role in mitogen-induced cell proliferation. J. Cell. Physiol. 151, 41-49.

64. Green H. (1977). Terminal differentiation of cultured human epidermal cells. Cell 11, 405416.

65. Grief F., Soroff H.S., Setzer R.W., Taichman L.B. (1988). The effect of growth-promoting agents on replication and cell cycle withdrawal I cultures of epidermal keratinocytes. In Vitro Cell Dev. Biol 24, 985-989.

66. Grinnell F., Takashima A., Lamke-Seymour G. (1986). Morphological appearance of epidermal cells cultured on fibroblast-reorganized collagen gels. Cell and Tissue Res. 246, 13-21.

67. Gumbiner B.M. (2005). Regulation of cadherin-mediated adhesion in morphogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol 6, 622-634.

68. Habets J.M., Tank В., Vuzevski V.D., Breve J., Stolz E., van Joost T. (1988). Absence of cytokeratin 8 and inconsistent expression of cytokeratins 7 and 19 in human basal cell carcinoma. Anticancer Res. 8, 611-6.

69. Hahnel A.C., Rappolee D.A., Millan J.L., Manes Т., Ziomek C.A., Theodosiou N.G., Werb Z., Pedersen R.A., Schultz G.A. (1990). Two alkaline phosphatase genes are expressed during early development in the mouse embryo. Development 110, 555-564.

70. Hall P.A., Watt F.M. (1989). Stem cells: the generation and maintenance of cellular diversity. Development 106, 619-633.

71. Hamati H.F., Britton E.L., Carey D.J. (1989). Inhibition of proteoglycan synthesis alters extracellular matrix deposition, proliferation, and cytoskeletal organization of rat aortic smooth muscle cells in culture. J. Cell Biol. 108, 2495-2505.

72. Handjiski B.K., Eichmuller S., Hofmann U., Czarnetzki B.M., Paus R. (1994). Alkaline phosphatase activity and localization during the murine hair cycle. Br. J. Dermatol. 131, 303-10.

73. Hardy M.H. (1992). The secret life of the hair follicle. Trends Genet. 8, 55-61.

74. Harrison P.M., Farzaneh F. (2000). Regulation of HGF/SF gene expression in MRC-5 cellsby N-acetylcysteine. Biochem. Biophys. Res. Commun. 279, 108-15.150

75. Hashimoto К,, Shibazaki S. (1976). Ultrastructural study of differentiation and function of hair. In: Kobori, Montagna W. (eds.) Biology and disease of the hair. University of Tokyo press, Tokyo, Japan, 23-58.

76. Haskins J., Gu L., Wittchen E.S., Hibbard J., Stevenson B.R. (1998). ZO-3, a novel member of the MAGUK protein family found at the tight junction, interacts with ZO-1 and occludin. J. Cell Biol. 141, 199-208.

77. Hennings H., Michael D., Cheng C. (1980). Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell, 19, 245-254.

78. Higa K., Shimmura S., Miyashita H., Shimazaki J., Tsubota K. (2005). Melanocytes in the corneal limbus interact with K19-positive basal epithelial cells. Exp. Eye Res. 81, 218-223.

79. Hirai Y. (1993). Molecular cloning of human epimorphin: identification of isoforms andItheirunique properties. Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 1332-1337.

80. Hirai Y., Lochter A., Galosy S., Koshida S., Niwa S., Bissell M. J. (1998). Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells. J. Cell Biol. 140, 159-169.

81. Hoogduijn M.J., Gojup E., Genever P.G. (2006). Comparative characterization of hair follicle dermal stem cells and bone marrow mesenchymal stem cells. Stem Cell Dev. 15, 4960.

82. Home K.A., Jahoda C.A., Oliver R.F. (1986). Whisker growth induced by implantation of cultured vibrissa dermal papilla cells in the adult rat. J. Embryol. Exp. Morphol. 97, 111-124.

83. Hotchin N.A. & Watt F.M. (1992). Transcriptional and post-translational regulation of beta 1 integrin expression during keratinocyte terminal differentiation. J Biol Chem. 267, 1485214858.

84. Hudlicka O. (1998). Is physiological angiogenesis in skeletal muscle regulated by changes in microcirculation? Microcirculation 5, 5-23.

85. Iida M., Ihara S., Matsuzaki T. (2007). Hair cycle-dependent changes of alkaline phosphatase activity in the mesenchyme and epithelium in mouse vibrissal follicles. Develop. Growth Differ. 49, 185-195.

86. Inamatsu M., Matsuzaki Т., Iwanari H., Yoshizato K. (1998). Establishment of rat dermal papilla cell lines that sustain the potency to induce hair follicles from afollicular skin. J. Invest. Dermatol. Ill, 767-775.

87. Ito M,, Kizawa K., Toyoda M., Morohashi M. (2002). Label-retaining cells in the bulge region are directed to cell death after plucking, followed by healing from the surviving hair germ. J Invest Dermatol. 119, 1310-1316.

88. Ito M., Liu Y., Yang Z., Nguyen J., Liang F., Morris R.J., Cotsarelis G. (2005). Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis. Nat. Medicine 11, 1351-1354.

89. Jahoda C., Oliver R.F. (1981). The growth of vibrissa dermal papilla cells in vitro. Br. J. Dermatol. 105, 623-7.

90. Jahoda C.A., Home K.A., Oliver R.F. (1984). Induction of hair growth by implantation of cultured dermal papilla cells. Nature 311, 560-562.

91. Jahoda C.A., Oliver R.F. (1984). Vibrissa dermal papilla cell aggregative behaviour in vivo and in vitro. JEmbryol Exp Morphol 79, 211-224.

92. Jahoda C.A., Reynolds A.J. (2001). Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing. Lancet 358, 1445-1448.

93. Jahoda C.A., Whitehouse J., Reynolds A.J., Hole N. (2003). Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages. Exp. Dermatol. 12, 849-859.

94. Jahoda C.A.B. (1992). Induction of follicle formation and hair growth by vibrissa dermal papillae implanted into rat ear wounds: vibrissa-type fibres are specified. Development 115, 1103-1109.

95. Janes S.M., Lowell S., Hutter C. (2002). Epidermal stem cells. J. Pathol., 197, 479491.

96. Jensen P. K. A., Bolund L. (1988). Low Ca2+ stripping of differentiating cell layers in human epidermal cultures: an in vivo model of epidermal regeneration. Exp. Cell Res. 175, 63-73.

97. Jensen P. K. A., Pedersen S., Bolund L. (1985). Basal-cell subpopulations and cell-cycle kinetics in human epidermal explant cultures. Cell and Tissue Kinet. 18, 201-215.

98. Jones J., Sugiyama M., Watt F.M. (1993). Integrin expression in normal, hyperplastic, dysplastic and malignant oral ephitelium. J. Pathol. 169, 235-243.

99. Jones P.H., Harper S., Watt F. (1995). Stem-cell patterning and fate in human epidermis. Cell 80, 83-93.

100. Jones P.H., Watt F.M. (1993). Separation of human epidermal stem cells from transit-amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression. Cell 73,713-724.

101. Karasek M. A., Charlton E. (1971). Growth of postembryonic skin epithelial cells on collagen gels. Ibid. 56, 205-210.

102. Karihaloo A., Nickel C., Cantley L.G. (2005). Signals which build a tubule. Nephron. Exp. Nephrol. 100, 40-45.

103. Kishimoto J., Burgeson R.E., Morgan B.A. (2000). Wnt signaling maintains the hair-inducing activity of the dermal papilla. Genes Dev. 14, 1181-1185.

104. Kishimoto J., Ehama R., Wu L., Jiang S., Jiang N., Burgeson R.E. (1999). Selective activation of the versican promoter by epithelial- mesenchymal interactions during hair follicle development. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 7336-41.

105. Kitahara M., Ishiguro F., Takayma K., Isowa K., Nagai T. (1993). Evaluation of skin damage of cyclic monoterpenes, percutaneous absorption enhancers, by using culture human skin cells. Biol Pharm. Bull. 16, 912-916.

106. Kligman A.M. (1959). The human hair cycle. J Invest Dermatol. 33, 307-16.

107. Kobayashi K., Rochat A., Barrandon Y. (1993). Segregation of keratinocyte colony-forming cells in the bulge of the rat vibrissa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7391-7395.

108. Kolodka T.M., Garlick J.A., Taichman L.B. (1998). Evidence for keratinocyte stem cells in vitro: long term engraftment and persistence of transgene expression from retrovirus-transduced keratinocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 4356-4361.

109. Kopan R., Traska G., Fuchs E. (1987). Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examining keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization. J Cell Biol. 105, 427-440.

110. Kopf A.W. (1957). The distribution of alkaline phosphatase in normal and pathologic human skin. AMA Arch. Derm. 75, 1-37.

111. Koster M.I., Roop D.R. (2004). Genetic pathways required for epidermal morphogenesis. J Cell Biol. 83, 625-629.

112. Ku N.O., Liao J., Omary M.B. (1997). Apoptosis generates stable fragments of human type I keratins. J Biol Chem. 272, 33197-33203.

113. Kubo M., Kan M., Isemura M., Yamane I., Tagami H. (1987). Effects of extracellular matrices on human keratinocyte adhesion and growth and on its secretion and deposition of fibronectin in culture. J. Invest. Dermatol. 88, 594-601.

114. Lako M., Armstrong L., Cairns P.M., Harris S„ Hole N., Jahoda C.A. (2002). Hair follicle dermal cells repopulate the mouse haematopoietic system. J Cell Sci. 115, 3967-74.

115. Lavker R.M. & Sun T.T. (1983). Epidermal stem cells. J. Invest. Dermatol. 81, 121 s-127s.

116. Lavker R.M., Cotsarelis G., Wei Z.-G., Sun T.-T. (1991). Stem cells of pelage, vibrissae, and eyelash follicles: the hair cycle and tumor formation. Ann. N.Y. Acad. Sci. 642, 214-225.

117. Lavker R.M., Sun T.T. (1982). Heterogeneity in epidermal basal keratinocytes: morphological and functional correlations. Science 215, 1239-1241.

118. Lavker R.M., Sun T.T. (2000). Epidermal stem cells: properties, markers, and location. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 13473-13475.

119. Lechler Т., Fuchs E. (2005). Asymmetric cell divisions promote stratification and differentiation of mammalian skin. Nature 437, 275-280.

120. Lee J.,Ishihara A., Jacobson K. (1993). How do cells move along surfaces? Trends Cell Biol. 3, 366-70.

121. Lenoir M.C., Bernard B.A., Pautrat G., Darmon M., Shroot B. (1988). Outer root sheath cells of human hair follicle are able to regenerate a fully differentiated epidermis in vitro. Dev Biol. 130, 610-20.

122. Levy L., Broad S., Diekmann D., Evans R.D., Watt F.M. (2000). pi integrins regulate keratinocyte adhesion and differentiation by distinct mechanisms. Mol. Biol. Cell 11, 453-466.

123. Li A., Pouliot N., Redvers R., Kaur P. (2004). Extensive tissue regenerative capacity of neonatal human keratinocyte stem cells and their progeny. J. Clin. Invest., 113, 390-400.

124. Li A., Simmons P.J., Kaur P. (1998). Identification and isolation of candidate human keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3902-3907.

125. Liang L., Bickenbach J.R. (2002). Somatic epidermal stem cells can produce multiple cell lineages during development. Stem cells 20, 21-31.

126. Lichti U., Weinberg W.C., Goodman L., Ledbetter S., Dooley Т., Morgan D., Yuspa S.H. (1993). In vivo regulation of murine hair growth: insights from grafting defined cell population onto nude mice. J. Invest. Dermatol. 101, 124S-129S.

127. Lindner G., Menrad A., Gherardi E., Merlino G., Welker P., Handjiski В., Roloff В., Paus R. (2000). Involvement of hepatocyte growth factor/scatter factorand met receptor signaling in hair folliclemorphogenesis and cycling. FASEBJ. 14, 319-332.

128. Link R.E., Paus R., Stenn K.S., Kuklinska E., Moellmann G. (1990). Epithelial growth by rat vibrissae follicles in vitro requires mesenchymal contact via native extracellular matrix. J. Invest. Dermatol. 95, 202-207.

129. Lyle S., Christofidou-Solomidou M., Liu Y., Elder D.E., Albelda S., Costarelis G. (1998). The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells. J. Cell Sci. Ill, 3179-3188.

130. Ma D.R., Yang E.N., Lee S.T. (2004). The location, molecular characterisation, and multipotency of hair follicle epidermal stem cells. Ann. Acad. Med. 33, 784-788.

131. Maas-Szabowski N., Stark H.J., Fusenig N.E. (2000). Keratinocyte growth regulation in defined organotypic cultures through IL-l-induced keratinocyte growth factor expressionin resting fibroblasts. J. Invest. Dermatol. 114, 1075-1084.

132. Mackenzie I.C., Zimmerman К. (1981). The development of ordered structure in neonate rat epidermis. J. Invest. Dermatol. 77, 278-282.

133. Madri J.A., Pratt B.M., Tucker A.M. (1988). Phenotypic modulation of endothelial cells by transforming growth factor-p depends upon the composition and organization of the extracellular matrix. J.Cell Biol. 106, 1375-1381.

134. Magerl M., Kauser S., Paus R., Tobin D. (2002). Simple and rapid method to isolate and culture follicular papillae from human scalp hair follicles. Exp. Dermatol. 11, 381-5.

135. Marchese C., Chedid M., Dirsh O.R., Csaky K.G., Santanelli F., Latini C., LaRochelle W.J., Torrisi M.R., Aaronson S.A. (1995). Modulation of keratinocyte growth factor and its receptor in epithelializing human skin. J. Exp. Med. 182, 1369-1376.

136. McClean W.H., Lane E.B. (1995). Intermediate filaments in disease. Curr Opin Cell Biol. 7, 118-25.

137. McElwee K.J., Kissling S., Wenzel E., Huth A., Hoffman R. (2003). Cultured peribulbar dermal sheath cells can induce hair follicle development and contribute to the dermal sheath and dermal papilla. J. Invest. Dermatol. 121, 1267-1275.

138. Messenger A.G. (1985). Hair follicle tissue culture. Br J Dermatol 113, 639-640.

139. Messenger A.G., Jennifer H.Sr., Bleehen S.S. (1986). The in vitro properties of dermal papilla cell lines established from human hair follicles. Br J Dermatol 114, 425-430.

140. Michel M., L'Heureux N., Auger F.A., Germain L. (1997). From newborn to adult: phenotypic and functional properties of skin equivalent and human skin as a function of donor age. J. Cell. Physiol. 171, 179-189.

141. Mildner M., Echart L., Lengauer В., Tschachler E. (1999). Hepatocyte growth factor/scatter factor inhibits UVB induced apoptosis of human keratinocytes via the PI-3-kinase pathway. J. Invest. Dermatol. 113, 1136-1137.

142. Miller S.J., Lavker R.M., Sun T.-T. (1993). Keratinocyte stem cells of cornea, skin and hair follicle: common and distinguishing features. Semin. Dev. Biol. 4, 317-240.

143. Moll I. (1995). Proliferative potential of different keratinocytes of plucked human hair follicles. J Invest Dermatol. 105, 14-21.

144. Moll R., Franke W.W., Schiller D.L. (1982). The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumor and cultured cells. Cell 31, 11-24.

145. Montesano R., Matsumoto K., Nakamura Т., Orci L. (1991b). Identification of a fibroblast-derived epithelial morphogen as hepatocyte growth factor. Cell 67, 901-908.

146. Montesano R., Schaller G., Orci L. (1991a). Induction of epithelial tubular morphogenesis in vitro by fibroblast-derived soluble factors. Cell 66, 697-711.

147. Morris R.J., Liu Y., Maries L., Yang Z., Trempus C., Li S., Lin J.S., Sawicki J.A., Cotsarelis G. (2004). Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat. Biotech. 22, 411-417.

148. Morris R.J., Potten C.S. (1988). Slowly cycling (label-retaining) epidermal cellsbehave like clonogenic stem cells in vitro. Cell Proliferation 27, 279-289.

149. Morris R.J., Potten C.S. (1999). Highly persistent label-retaining cells in the hair follicle of mice and their fate following induction of anagen. J. Invest. Dermatol. 112, 470475.

150. Mourra N., Borderie V., Laroche L. (1998). Ultrastructural and immunohistochemical study of 3-dimensional cultures of human keratinocytes on a collagen gel. J. Fr. Ophtalmol. 21, 287-294.

151. Murphy G., Gavrilovic J. (1999). Proteolysis and cell migration: creating a path? Curr Opin Cell Biol. 11, 614-21.

152. Narisawa Y., Hashimoto K., Kohda H. (1994). Immunohistochemical demonstrationof keratin 19 expression in isolated human hair follicles. J Invest Dermatol. 103, 191-195.

153. Niessen C.M. (2007). Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. J. Invest. Dermatol. 127, 2525-2532.

154. Nigro J. M., Aldape K. D., Hess S. M., Tlsty T. D. (1997). Cellular adhesion regulates p53 protein levels in primary human keratinocytes. Cancer Res. 57, 3635-3639.

155. Nishikawa A., Taira Т., Yoshizato K. (1987). In vitro maturation of collagen fibrils modulates spreading, DNA synthesis, and collagenolysis of epidermal cells and fibroblasts. Exp. Cell Res. 171, 164-177.

156. O'Brien L.E., Zegers M.M., Mostov K.E. (2002). Opinion: Building epithelial architecture: insights from three-dimensional culture models. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 531537.

157. O'Keefe E.J., Woodley D. Т., Castillo G. (1984). Production of soluble and cell-associated fibronectin by cultured keratinocytes. J. Invest. Dermatol. 82, 150-155.

158. Oliver A.M. (1990). The cytokeratin expression of cultured human foetal keratinocytes. Br. J. Dermatol. 123, 707-716.

159. Oliver R.F. (1970). The induction of hair follicle formation in the adult hooded rat by vibrissa dermal papillae. J. Embryol. Exp. Morphol. 23, 219-236.

160. Oliver, R.F. (1966). Whisker growth after removal of the dermal papilla and lengths of follicle in the hooded rat. J. Embriol. Exp. Morphol. 15, 331-347.

161. Oshima H., Rochat A., Kedzia C., Kobayashi K., Barrandon Y., (2001). Morphogenesis and renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells. Cell 104, 233-245.

162. Patel V.N., Rebustini T.T., Matthew P. (2006). Salivary gland branching morphogenesis. Differentiation 74, 349-364.

163. Pavlova A., Stuart R.O., Pohl M., Nigam S.K. (1999). Evolution of gene expression patterns in a model of branching morphogenesis. Am. J. Physiol. Ill, 650-663.

164. Pearton D.J., Yang Y., Dhouailly D. (2005). Trarisdifferentiation of corneal epithelium into epidermis occurs by means of a multistep process triggered by dermal developmental signals. Proc Natl Acad Sci USA. 102, 3714-3719.

165. Pellegrini G., Dellambra E., Golisano O., Martinelli E, Fantozzi I., Bondanza S., Ponzin D., McKeon F., De Luca M. (2001). p63 identifies keratinocyte stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3156-3161.

166. Pinkus H. (1978). Epithelial-mesodermal interaction in normal hair growth, alopecia, and neoplasia. J Invest Dermatol. 5, 93-101.

167. Pittelkow M.R., Cook P.W., Shipley G.D., Derynck R., Coffey R.J. Jr. (1993). Autonomous growth of human keratinocytes requires epidermal growth factor receptor occupancy. Cell Growth Differ. 4, 513-521.

168. Pohl M., Sakurai H., Stuart R.O., Nigam S.K. (2000). Role of hyaluronan and CD44 in in vitro branching morphogenesis of ureteric bud cells. Dev. Biol. 224, 312-325.

169. Potten C.S. (1974). The epidermal proliferative unit: the possible role of the central basal cell. Cell tissue kinetics 7, 77-88.

170. Potten C.S., Hendry J.H. (1973). Clonogenic cells and stem cells in the epidermis. Int. J. Radiant. Biol. 24, 537-540.

171. Potten C.S., Loeffler M. (1987). A comprehensive model of the crypts of the small intestine of the mouse provides insight into the mechanisms of cell migration and the proliferation hierarchy. J. Theor. Biol. 127, 381-391.

172. Potten C.S., Wichmann H.E., Loeffler M., Dobek K., Major D. (1982). Evidence for discrete cell kinetic subpopulations in mouse epidermis based on mathematical analysis. Cell Tissue Kinet. 15, 305-329.

173. Reiss M., Sartorelli A.C. (1987). Regulation of growth and differentiation of human keratinocytes by type beta transforming growth factor and epidermal growth factor. Canser Res. 47, 6705-6709.

174. Rendl M., Polak L., Fuchs E. (2008). BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties. Genes Dev. 22, 543-557.

175. Reynolds A.J., Jahoda C.A.B. (1991). Hair follicle stem cells? A distinct germinative epidermal cell population is activated in vitro by the presence of hair dermal papilla cells. J. Cell Sci. 99, 373-385.

176. Rheinwald J.G., Beckett M. A. (1980). Defective terminal differentiation in culture as a consistent and selectable character of malignant human keratinocytes. Cell 22, 629-632.

177. Rheinwald J.G., Green H. (1975). Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: The formation of keratinizating colonies from single cells. Ibid. 6, 331 -344.

178. Rheinwald J.G., Green H. (1977). Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes. Nature 265, 421-424.

179. Riser B. L., Varani, Nickoloff BJ. (1990). Trombospondin binding by keratinocytes: Modulation under conditions which alter thrombospondin biosynthesis. Dermatologica (Basel), 180, 60-65.

180. Roberts G. P., Jenner L. (1983). Glycoproteins and glycosaminoglycans synthesized by human keratinocytes in culture. Their role in cell-substratum adhesion. Biochem J. 212, 355-363.

181. Rochat A., Kobayashi K., BarrandonY. (1994). Location of stem cells of human hair follicle by clonal analysis. Cell 76, 1063-73.

182. Rockwell G. A., Johnson G., Sibatani A. (1987). In vitro senescence of human kertatinocyte cultures. Cell Struct, and Fund. 12, 539-548.

183. Rodeck U., Jost M., DuHadaway J., Kari C., Jensen P.J., Risse В., Ewert D.L. (1997). Regulation of Bcl-xL expression in human keratinocytes by cell-substratum adhesion and the epidermal growth factor receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5067-5072.

184. Ronfard V., Rives J.M., Neveux Y., Carsin H., Barrandon Y. (2000). Long-term regeneration of human epidermis on third degree burns transplanted with autologous cultured epithelium grown on a fibrin matrix. Transplantation 70, 1588-1598.

185. Rosario M., Birchmeier W. (2003). How to make tubes: signaling by the Metreceptor tyrosine kinase. Trends Cell Biol. 13, 328-335.

186. Rufaut N.W., Goldthorpe N.T., Wildermoth J.E., Wallace O.A. (2006). Myogenic differentiation of dermal papilla cells from bovine skin. J Cell Physiol. 209, 959-66.

187. Saitoh A., Osada A., Kitajima Y., Furue M., Tamaki K. (1994). Interferon-gamma-induced HLA-DR, but not ICAM-1, expression of human keratinocytes is down-regulated by calmodulin antagonist. J. Dermatol. 21, 716-719.

188. Sakurai H., Barros E. J., Ysukamoto Т., Barasch J., Nigam S.K. (1997). An in vitro tubulogenesis system using cell lines derived from the embryonic kidney shows dependence on multiple soluble growth factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 6279-6284.

189. Santos O.F., Nigam S.K. (1993). HGF-induced tubulogenesis and branching of epithelial cells is modulated by extracellular matrix and TGF-beta. Dev. Biol. 160, 293-302.

190. Sariola H., Sainio K. (1997). The tip-top branching ureter. Curr. Opin. Cell Biol. 9, 877-884.

191. Savtchenko E.S., Schiff T.A., Jiang C.K., Freedberg I.M., Blumenberg M. (1988). Embryonic expression of the human 40-kD keratin: evidence from a processed pseudogene sequence. Am J Hum Genet. 43, 630-637.

192. Schmidt G.H., Blount M.A., Ponder B.A. (1987). Immunochemical demonstration of the clonal organization of chimeric mouse epidermis. Development 100, 535-541. .

193. Schmidt-Ullrich R., Paus R. (2005). Molecular principles of hair follicle induction and morphogenesis. Bioessays. 27, 247-261.

194. Schofield R. (1978). The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell. Blood cells 4, 7-25.

195. Schweizer J., Kinjo M., Farstenberger G., Winter FI. (1984). Sequental expression of mRNA-enconded keratin sets in neonatal mouse epidermis: Basal cells with properties of terminally differetiating cells. Cell 37, 159-170.

196. Slack J.M.W. (2000). Stem cells in epithelial tissues. Science 287, 1431-1433.

197. Smola H., Thiekotter G., Fusenig N. E. (1993). Mutual induction of growth factor gene expression by epidermal-dermal cell interaction. J. Cell Biol. 122, 417-429.

198. Sohl G., Eiberger J., Jung Y.T., Kozak C.A., Willecke K. (2001). The mouse gap junction gene connexin 29 is highly expressed in sciatic nerve and regulated during brain development. Biol Chem. 382, 973-978.

199. Springer T.A. (1990). Adhesion receptors of the immune system. Nature 346, 425434.

200. Stanley J. R., Foidart I. -M., Murray J. C. (1980). Epidermal cell which selectively adheres to a collagen substrate is the basal cell. J. Invest. Dermatol. 74, 54-58.

201. Stasiak P.C., Purkis P.E., Leigh I.M., Lane E.B. (1989). Keratin 19: predicted amino acid sequence and broad tissue distribution suggest it evolved from keratinocyte keratins. J. Invest. Dermatol. 92, 707-716.

202. Stein G.S., Lian J.B., Owen T.A. (1990). Relationship of cell growth to the regulation of tissue-specific gene expression during osteoblast differentiation. FASEB J4, 3111—3123.

203. Step M. A., Spurr-Michaud S., Tisdale A., Elwell J., Gipson I. K. (1990). аб |34 integrin heterodimer is a component of hemidesmosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8970-8974.

204. Stossel T.P. (1993). On the crawling of animal cells. Science 260, 1086-94.

205. Taylor G., Lehrer M.S., Jensen P.J., Sun T.T., Lavker R.M. (2000). Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis. Cell 102, 451461.

206. Thiery J.P., Boyer B. (1992). The junction between cytokines and cell adhesion. Curr. Opin. Cell Biol. 4, 782-792.

207. Tinkle C.L., Lechler Т., Pasolli HA., Fuchs E. (2004). Conditional targeting of E-cadherin in skin: insights into hyperproliferative and degerative responses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 552-557.

208. Trempus C.S., Morris R.J., Bortner C.D., Cotsarelis G., Faircloth R.S., Reece J.M.2003). Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34. J. Invest. Dermatol. 120, 501-511.

209. Troxell M.L., Loftus D.J., Nelson W.J., Marrs J.A. (2001). Mutant cadherin affects epithelial morphogenesis and invasion, but not transformation. J. Cell Sci. 114, 1237-1246.

210. Tsai R. J-F., Ho Y-S., Chen J-K. (1994). The effects of fibroblasts on the growth and differentiation of human bulbar conjunctival epithelial cells in an in vitro conjunctival equivalent. Invest. Ophthalmol. & Visual sci. 35, 2865-2875.

211. Tuan T.L., Keller L.C., Sun D., Nimni M.E., Cheung D. (1994). Dermal fibroblasts activate keratinocyte outgrowth on collagen gels. J. Cell Sci. 107, 2285-2289.

212. Tumbar Т., Guasch G., Greco V., Blanpain C., Lowry W.E., Rendl M., Fuchs E.2004). Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science 303, 359-363.

213. Turksen K., Choi Y., Fuchs E. (1991). Transforming growth factor alpha induces collagen degradation and cell migration in differentiating human epidermal raft cultures. Cell Regul. 2, 613-625.

214. Vainio S., Lehtonen E., Jalkanen M., Bernfield M., Saxen L. (1989). Epithelial-mesenchymal interactions regulate the stage-specific expression of a cell surface proteoglycan, syndecan, in the developing kidney. Dev. Biol. 134, 382-391.

215. Van Scott E.J., Ekel T.M., Auerbach R. (1963). Determinants of rate and kinetics of cell division in scalp hair. J Invest Dermatol. 41, 269-273.

216. Vasioukhin V., Bauer C., Degenstein L., Wise В., Fuchs E. (2001a). Hyperproliferation and defects in epithelial polarity upon conditional ablation of alpha-catenin in skin. Cell 104, 605-617.

217. Vasioukhin V., Bowers E., Bauer C., Degenstein L., Fuchs E. (2001b). Nat. Cell Biol. 3, 1076-1085.

218. Vaughan R.B., Trinkaus J.P. (1966). Movements of epithelial cell sheets in vitro. J Cell Sci. 1,407-13.

219. Vorotelyak E.A., Vasiliev A.V., Tsitrin E.B., Terskikh V.V. (2004). Human epidermal stem cells in culture. Cell Proliferation 37, 146.

220. Warren R., Chestnut M.H., Wong T.K, Otte Т.Е., banners K.M., Meili M.L. (1992). Improved method for the isolation and cultivation of human scalp dermal papilla cells. J Invest. Dermatol. 98, 693-9.

221. Waseem A., Dogan В., Tidman N., Alam Y., Purkis P., Jackson S., Lalli A., Machesney M., Leigh I.M. (1999). Keratin 15 expression in stratified epithelia: downregulation in activated keratinocytes. J. Invest. Dermatol. 112, 362-9.

222. Watt F.M. (2001). Stem cell fate and patterning in mammalian epidermis. Curr. Opin. Genet. Dev. 11, 410-7.

223. Watt F.M., and Hertle M.D. (1994). Keratinocyte integrins. In The keratinocyte Handbook. Leigh I.M., Lane E.B., Watt F.M, editors. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 153-164.

224. Watt F.M., Jones P.H. (1993). Expression and function of the keratinocyte integrins. Dev. Suppl., 185-192.

225. Weinberg С. В., Bell E. (1986). A blood vessel model constructed from collagen and cultured vascular cells. Science, 231, 397-400.

226. Weinberg W.C., Brown P.D., Stetler-Stevenson W.G., Yuspa S.H. (1990). Growth factors specifically alter hair follicle cell proliferation and collagenolytic activity alone or in combination. Differentiation 45, 168-178.

227. Wessells N.K., Roessner K.D. (1965). Nonproliferation in dermal condensations of mouse vibrissae and pelage hairs. Develop. Biol. 12, 419-433.

228. Wilke M. S., Furcht L. T. (1990). Human keratinocytes adhere to a unique heparin binding peptide sequence within the triple helical region of type IV collagen. J. Invest. Dermatol. 95, 264-270.

229. Wilke M. S., Skubitz A. P. (1991). Human keratinocytes adhere to multiple distinct peptide sequence of laminin. J. Invest. Dermatol. 97, 141-146.

230. Willecke K., Eiberger J., Degen J., Escardt D., Romualdi A., Guldenagel M., Deutsch U., Sohl G. (2002). Structural and functional diversity of connexin genes in the mouse and human genome. Biol Chem. 383, 725-37.

231. Wu J.J., Liu R.Q., Lu Y.G., Zhu T.Y., Cheng В., Men X. (2005). Arch. Dermatol. Res. 297, 60-67.

232. Yang A., Schweitzer R., Sun D., Kaghad M., Walker N., Bronson R„ Tabin C., Sharpe A., Caput D., Crum C., McKeon F. (1999). P63 is essential for regenerative proliferation in limb, craniofacial and epithelial developmet. Nature 398, 714-718.

233. Yang J.S., Lavker R.M., Sun T.-T. (1993). Upper human hair follicle contains a subpopulation of keratinocytes with superior in vitro proliferative potential, J. Invest, Dermatol. 101, 652-659.

234. Zegers M.M., O'Brien L.E., Yu W., Datta A., Mostov K.E. (2003). Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends Cell Biol. 13, 169-76.

235. Zeigler M.E., Dutcheshen N.T., Gibbs D.F., Varani J. (1996). Growth factor-induced epidermal invasion of the dermis in human skin organ culture: expression and role of matrix metalloproteinases. Invasion Metastasis 16, 11-18.

236. Zimmermann S., Voss M., Kaiser S., Kapp U., Waller C.F., Martens U.M. (2003). Lack of telomerase activity in human mesenchymal stem cells. Leukemia 17, 1146-1149.

237. Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P., De Ugarte D.A., Huang J.I., Mizuno H., Alfonso Z.C., Fraser J.K., Benhaim P., Hedrick M.H. (2002). Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295.

238. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H., Huang J., Futrell J.W., Katz A.J., Benhaim P., Lorenz H.P., Hedrick M.H. (2001). Multilineage cells from adipose tissue: implication for cell-based therapies. Tissue Eng. 7, 211-228.

Информация о работе

Чермных, Элина Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.25

Диссертация

Клетки волосяного фолликула in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Клетки волосяного фолликула in vitro ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Клетки волосяного фолликула in vitro"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чермных, Элина Сергеевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клетки волосяного фолликула in vitro"

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Чермных, Элина Сергеевна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чермных, Элина Сергеевна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клетки волосяного фолликула in vitro
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология