Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Феногенетический анализ эффектов мутантных генов we,wal,hr, нарушающих формирование шерстного покрова у мыши

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Феногенетический анализ эффектов мутантных генов we,wal,hr, нарушающих формирование шерстного покрова у мыши"

На правах рукописи

МАРТЫНОВА Марина Юрьевна

ФЕНОГЕНЕТИЧЕСКИИ АНАЛИЗ ЭФФЕКТОВ МУТАНТНЫХ ГЕНОВ п>е, кг, НАРУШАЮЩИХ ФОРМИРОВАНИЕ ШЕРСТНОГО ПОКРОВА У МЫШИ

03.00.15 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в лаборатории генетики развития Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Борис Владимирович Конюхов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Марлей Мкртычевич Асланян

кандидат биологических наук

Сергей Николаевич Каштанов

Ведущая организация: Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита диссертации состоится «_»_2004 года в_часов

на заседании Диссертационного совета Д002.214.01 при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д.З. Факс:(095)132-89-62

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Автореферат разослан «_»_2004 года

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Г.Н. Полухина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Изучение генетического контроля процессов развития волосяного покрова у млекопитающих является актуальной задачей генетики развития, имеющей также прикладное значение для сельского хозяйства (производство шерсти, пушное звероводство), косметической медицины и дерматологии. Несмотря на интенсивные исследования в этой области, место и особенности экспрессии многих генов, контролирующих развитие волос, ещё недостаточно изучены, что препятствует пониманию механизмов генетического контроля формирования и роста волоса. Четкая структура пространственной организации волосяного фолликула и существование мутаций, резко меняющих облик волосяного покрова или степень и характер окраски, делают волосяные фолликулы ценным модельным объектом для генетики развития.

Среди млекопитающих, используемых в экспериментальной биологии и медицине, важное место занимают лабораторные мыши, генетика которых наиболее изучена. Секвенирование генома мыши показало, что в геноме мыши содержится большое количество генов, имеющих ортологи в геноме человека: у мыши и человека примерно по 30 тыс. генов, из них только 1 тыс. генов являются различными, остальные одинаковые или сходные (Mouse genome, 2002). Особый интерес представляют мутантные линии мышей, являющиеся носителями той или иной наследственной аномалии. Многие из них являются моделью для изучения аналогичных наследственных аномалий у человека. Анализ эффектов таких генов у мыши представляет большой интерес для понимания генетического контроля процессов формирования волосяного покрова.

Известно более 40 мутантных генов, нарушающих развитие волос у мыши (Mouse Genome Database, http://www.infbrmatics.jax.org/). Эффекты многих из этих генов до настоящего времени недостаточно изучены. В их числе гены wellhaarig (we), waved alopecia (wal) и hairless (hr). Действие мутантного гена we приводит к. возникновению характерного волнистого шерстного покрова у гомозиготных мышей в ходе развития первой генерации волос. Мутантный ген wal в гомозиготном состоянии также приводит к формированию волнистого шерстного покрова с последующим облысением. И, наконец, мутантный ген hr обусловливает полное отсутствие волос у гомозигот.

Изучение механизма действия гена начинается с выяснения особенностей экспрессии и места его действия. В таких исследованиях часто используют химерных животных. Химерными животными называют организмы, состоящие из генетически различных клеточных популяций, происходящих более чем от одной оплодотворенной яйцеклетки (Мак-Ларен, 1979). Метод экспериментальных химер получил широкое распространение как инструмент для изучения особенностей экспрессии генов клеточных взаимодействий в онтогенезе

I С.Петербург UtЛ

1 Í 09 J00,

щит

экспериментальные химеры, полученные в результате агрегации бластомеров мышей мутантного и нормального генотипов, используются для определения места действия мутантных генов в тех или иных типах дифференцирующихся клеток (McLaren, Bowman, 1969; Конюхов и др., 1988).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы был феногенетический анализ, эффектов мутантных генов we, wal и hr, нарушающих формирование шерстного покрова у мыши. Исходя из цели исследования были поставлены следующие задачи:

1) Исследовать особенности проявления эффектов мутантных генов we, wal и hr в постнатальном развитии у химерных мышей we/we *-*+/+, wal/wal<->+/+ и hr/hr<->+/+.

2) Определить место действия мутантных генов we, wal и hr.

3) Изучить взаимодействие мутантного гена we с генами wal nhry мыши.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые

получены химерные мыши wa//Wa/«4H-/+, yveAve<-*+/Jr и hr/hr+++/+. Впервые показано, что местом действия гена wal является эктодермальный, а местом действия гена we - дермальный компонент волосяного фолликула. Подтверждены данные других авторов о том, что местом действия гена hr является эктодермальный компонент волосяного фолликула. С помощью анализа двойных гомозигот установлено, что ген we является модификатором гена wal у мыши так как он усиливает эффекты гена wal, что выражается в более раннем появлении алопеции и её больших размерах. Показано, что ген we не взаимодействует с геном hr при формировании шерстного покрова у мыши. Практическое значение работы состоит в том, что химерные животные контрастных по клеточным маркерам инбредных линий, могут быть использованы в качестве модельной системы для изучения особенностей генетического контроля формирования частных систем организма.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на конференции молодых ученых и аспирантов ИОГен РАН и кафедры генетики и селекции биологического факультета МГУ (10 декабря 2001 г.), на научной генетической конференции МСХА им. К.А. Тимирязева, 26-27 февраля 2002 года; на 2-й научной конференции МОГиС «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 20-21 февраля 2003), на межлабораторном семинаре «Генетика животных» ИОГен РАН 25 февраля 2004 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано и сдано в печать 8 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 94 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, состоящий из двух глав, экспериментальная часть, включающая главу «Материалы и методы», 4 главы, посвященные собственным исследованиям, обсуждение и выводы. Список литературы включает 99 источников, из которых 23 - отечественных и 76 иностранных авторов. В работе содержится 5 таблиц и 18 рисунков.

Автор выражает глубокую и искреннюю благодарность за практическую помощь и участие в обсуждении полученных результатов д.б.н., проф. Б.В. Конюхову, к.б.н. Д.А. Исаеву, к.б.н. Н.А. Малшной, О.В. Мироновой.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Животные. В работе были использованы контрастные по пигментации, структуре шерсти и изоферментам глюкозофосфатизомеразы (далее - ГФИ) мутантные и инбредные линии мышей. Мутантные линии wellhaarig (we), waved alopecia (wal) и hairless (hr) получены нами из Научно-исследовательской лаборатории экспериментально-биологических моделей РАМН. В качестве компонента нормального генотипа (+/+) при получении агрегационных химер использовали мышей инбредных линий СВА, BALB/c и C57BL/6.

Для получения агрегационных химер использовали мышей

мутантной линии C57BL/6-we/we (генотип we/we С/С а/а Gpi-lbb ) и мышей линии BALB/c (генотип +/+ с/с А/А Gpi-1"" ). Мыши C57BL/6-we/we имеют волнистый черный шерстный покров и электрофоретически быстрый вариант ГФИ (GPI-1B), а альбиносы BALB/c - электрофоретически медленный вариант GPI-1A и нормальный шерстный покров/

Для получения агрегационных химер wal/wal+/+ использовали мышей мутантной линии waved alopecia (генотип wal/wal с/с А/А Gpi-1<ш) иинбредной линии СВА (генотип +/+ С/С А/А Gpi-lbb). Мыши wal/wal белого окраса, имеют волнистый шерстный покров. После смены первой генерации волос, к 2-месячному возрасту, возникает облысение, которое распространяется от межлопаточной области к задней части спины. Мыши линии wal/wal имеют электрофоретически медленный вариант ГФИ (GPI-1A),. а мыши линии СВА имеют окрас агути и электрофоретически быстрый вариант ГФИ (GPI-1B).

Для получения химер использовали мышей мутантной линии

HRS/J (генотип hr/hr с/с А/А Gpi - Iм ) и мышей линии C57BL/6 (генотип +/+ С/С а/а Gpi - 1ЬЬ ). Мыши линии HRS/J - альбиносы, к 21 дню жизни полностью лишаются шерстного покрова и имеют электрофоретически медленный вариант ГФИ (GPI-1A), а мыши C57BL/6 имеют черную окраску нормального шерстного покрова и электрофоретически быстрый вариант ГФИ (GPI-1B).

В качестве реципиентов для трансплантации химерных эмбрионов были использованы гибридные самки (СВА X C57BL/6)

Для изучения взаимодействий мутантного гена we с генами wal и hr скрещивали между собой мышей генотипов we/we и wal/wal, а также мышей генотипов we/we и hr/hr(см. рис. 1).

Схема скрещиваний для получения мышей генотипа we/we wal/wal.

Р : 2 we/we +/+ X 6 +/+ wal/wal

I

Fi : we/+ wa!/+

ВС: 2,6 we/+wal/+ X 6, 2 +/+wal/wal

I

F2BC wal/wal we/+

wal/+ we/+ wal/wal +/+ wal/+ +/+

TC : ?, 6 wal/walwe/+ X 6, 2 we/we +/+

F зтс: wal/+ we/we

wal/+ we/+

F 2вс x F зтс : 2,6 wal/walwe/+ x. 6,2 wal/+ we/we

4

wal/wal we/we F 4: wal/wal we/+

wal/+ we/we wal/+ we/+

IS: 2,6 wal/walwe/+ X 6,2 wal/walwe/+

I

wal/wal we/+ wal/wal +/+

wal/wal we/we

Схема скрещиваний для получения мышей генотипа we/we hr/hr

Р : 9 we/we +/+ X 6 +/+ hr/hr

I

Fi : we/+ hr/+

ВС : 9, в we/+ hr/+ x 6,9 we/we +/+

I

?2BC '• +/+

we/+ wa/W we/we +/+

TC : 1) 9 we/we ?/+ x 6 +/+ hr/hr

i

we/+ hr/+ we/+ hr/hr

2) 9 +/+ hr/+ X 6 we/we ?/+

I

we/+ +/+ we/+ hr/+ we/+ hr/hr

F2 x F2: 9 we/we hr/-+ x 6 we/we hr/+

i

we/we +/+

F3 : ■we/we hr/+

we/we hr/hr

Рис.1. Схемы скрещиваний для получения мышей генотипа we/we wal/wal и v/e/we hr/hr.

Р - родители, F| - первое поколение, ВС - возвратное скрещивание, ТС - анализирующее скрещивание. IS - скрещивание между собой;

- конечный генотип.

Получение агрегационных химер. Самок мутантного и нормального генотипов, предназначенных для получения химер, в возрасте 6-8 недель подвергали гормональной стимуляции. Для суперовуляции использовали препараты «Folligon» (фолликулостимулирующий гормон) и «Chorulon» (хорионический гонадотропин) («Intervet»). Оба гормона вводили внутрибрюшинно: фолликулостимулирующий гормон из расчета 10 i.u. на мышь и, спустя 46 - 48 часов, хорионический гонадотропин в количестве 5 i.u. После инъекции второго гормона, самок ссаживали с самцами соответствующего генотипа и на следующее утро по обнаружению вагинальной (копулятивной) пробки судили о спаривании. День обнаружения копулятивной пробки считали первым днем беременности. На третий день беременности самок забивали и вымывали зародышей из яйцеводов. Для агрегации отбирались восьмиклеточные морулы. Парой к морулам мышей мутантного генотипа служили морулы нормального генотипа. Агрегацию восьмиклеточных эмбрионов мутантного и нормального генотипов в соотношении 1:1 производили по методу Минц (Mintz, 1971) в 0,01% растворе фитогемагглютинина-Р (Mintz et al., 1973) предварительно удалив zonae pellucidae в 0,5% растворе проназы-Е (li.uVmg) в фосфатно-солевом буфере Дульбекко. Агрегированные морулы культивировали в течение 1,5 суток в каплях модифицированной среды Виттена (Whitten,1971; Abramczuk et al., 1977) под парафиновым маслом (Paraffin oil «Fluka») в атмосфере трехгазовой смеси (5% СЬ; 5% СОг; 90% N2) при 37°С до стадии бластоцисты. Химерные

бластоцисты в количестве 6-7 штук с небольшим количеством культуральной среды трансплантировали в один рог матки ложнобеременных самок на третьи сутки ложной беременности после спаривания с вазэктомированным самцом.

Все описанные выше операции проводились в стерильном боксе при комнатной температуре.

Определение химеризма и процентного содержания клеток родительских генотипов в химерном организме. Химеризм родившихся мышей определяли по мозаичности окраса и структуры шерстного покрова и различным вариантам ГФИ в почках, печени и головном мозгу. Шерстный покров полученных химерных мышей и однокомпонентных мышей, используемых в качестве контроля, изучали визуально в возрасте 21 и 60 сут. Полностью сформировавшиеся волосы первой генерации выщипывали с медиальной части спины в передней, средней и задней областях туловища трехнедельных мышей, волосяные фолликулы которых находятся в стадии покоя. Волосы классифицировали под бинокуляром в слое глицерина. Анализируя пробы волос, подсчитывали число волос нормального и мутантного фенотипов, вместе с тем, в отраженном свете отмечая варианты их окраски.

У химерных мышей определяли процентное содержание мутантного компонента в почках, печени и головном мозгу путем электрофоретического анализа изоферментов глюкозофосфатизомеразы. Электрофорез проводили на ацетат-целлюлозных пластинках. После проведения фореза и окрашивания электрофореграммы высушивали и сканировали на денситометрической

приставке спектрофотометра «Gilford». При помощи полученных денситограмм определяли процентное содержание в пробе изофермента, соответствующего количеству мутантного компонента.

Статистическая обработка данных. Непараметрический корреляционный анализ Спирмена для изучения зависимостей содержания мутантного компонента в почках, печени, головном мозгу и шерстном покрове химер, а также проверка гипотезы о действии гена we в одной и той же клеточной системе при помощи таблицы сопряженности 2x2 были выполнены с использованием компьютерной программы «STATISTICA for Windows 5.1» (StatSoft, Inc., 1996).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ эффектов мутантного гена wellhaarig (we) у химер weAve<->+/+.

Для изучения особенностей проявления эффектов мутантного гена we нами было получено 10 химерных мышей в результате агрегации ранних зародышей C57BL/6-we/we и BALB/c. Пигментированные участки шерстного покрова (маркер меланобластов у полученных химер

составляли от 30 до 80% и располагались в виде поперечных полос и пятен. Начиная с десятидневного возраста, у всех химер шерстный покров был волнистым или почти нормальным, что зависело от процентного содержания в химерном организме мутантного компонента. При этом не было четких чередующихся поперечных полос или участков шерстного покрова, содержащих только прямые или только извитые волосы. Шерстный покров выглядел волнистым или «рыхлым» вне зависимости от пигментации (рис.2).

Рис. 2. Шерстный покров химер weAvei->+/+ с различным процентным содержанием пуховых волос мутантного фенотипа: а - 37% волос фенотипа we/we, б - 67% волос фенотипа we/we.

У полученных нами 10 химер у/еАне<->+/+ мы не наблюдали полос или участков шерстного покрова, состоящих только из волнистых либо только прямых волос. Анализ шерстного покрова первой генерации химерных животных в возрасте 21 сут. показал присутствие волос как мутантного, так и нормального фенотипов, что наиболее отчетливо было видно при изучении пуховых волос. Не было обнаружено пуховых волос промежуточного фенотипа. У всех химерных мышей пуховые волосы мутантного и нормального фенотипа были перемешаны между собой и имели 3 варианта окраса: агути, черные и непигментированные (табл. 1).

Таблица 1. Процент пуховых волос фенотипа we/we и +/+, различающихся по окрасу, у 21 -дневных химерных мышей we/we<-}+/+

№ химеры Число изученных волос Волосы фенотипа we/we Волосы фенотипа +/+

агути черные белые агути черные белые

1 519 9 4 24 И 1 51

2 493 4 6 32 6 3 49

3 522 4 34 12 3 11 36

4 332 2 58 3 4 15 18

5 429 3 44 9 5 12 27

6 465 4 27 32 5 4 28

7 525 3 36 21 4 7 29

8 396 2 46 6 3 9 34

9 513 1 83 2 2 8 4

10 590 - 81 5 1 4 9

Примечание. Химера №1 с минимальным, а химера №10 с максимальным процентом содержания мутантного компонента GPI-1B и пуховых волос фенотипа we/we.

Процент пуховых волос we/we черного окраса увеличивался по мере возрастания мутантного компонента GPI-1B в химерном организме, а процент пуховых волос we/we окраса агути и непигментированных (белых) волос уменьшался. Сходная картина изменения вариантов окраса отмечена и для волос нормального фенотипа. Эти данные свидетельствуют о том, что процент волос черного окраса (генотип а/а) находится в зависимости от процентного содержания мутантного компонента в химерном организме, процент волос окраса агути (генотип А/А) определяется количеством нормального компонента. Процент непигментированных (белых, генотип с/с) волос уменьшается с возрастанием мутантного компонента.

Электрофоретический анализ изоферментов ГФИ выявил у всех химер присутствие компонента we/we (GPI-1B) в почках, печени и головном мозгу (табл. 2). Чем больше был процент содержания мутантного компонента в

почках, печени и головном мозгу у химерных животных, тем больше был процент пуховых волос фенотипа ^в/^в.

Таким образом, по отсутствию четкой картины распределения волос мутантного и нормального фенотипа у химер у/еАюе<-)т/+ нельзя сказать, что ген wвllhaarig действует в эпидермальных клетках волосяного фолликула.

Таблица 2. Процент мутантного компонента (GPI-1B) во внутренних органах и пуховых волос фенотипа we/we у химер we/we<=->+/+

№ Содержание GPI-1B Пуховых волос

химеры в почках в печени в головном мозгу' фенотипа we/we

1 24 36 27 37

2 39 40 37 42

3 38 48 54 50

4 53 62 45 63

5 55 53 56 56

6 52 53 63 63

7 65 67 56 60

8 60 65 67 54

9 85 71 67 86

10 76 74 77 86

У мышей BALB/c (генотип +/+ с/с А/А), которые были использованы нами в качестве нормального компонента (+/+) для получения химерных мышей we/we 4-Э+/+, экспрессия гена agouti (А) эпистатически маскируется отсутствием пигментации (генотип с/с). Поэтому наблюдающаяся у полученных нами химер we/we С/С а/а <-> +/+ с/с А/А окраска агути прямых волос определяется присутствием клеток компонента BALB/c в дермальном сосочке и при наличии меланоцитов генотипа С/С (табл. 3).

Таблица 3. Межклеточные взаимодействия, приводящие к формированию определенного фенотипа волос у химер we/we <чм-/+

Генотип клеток дермалыюго сосочка we/we а/а +/+А/А

Генотип меланоцитов волосяного фолликула с/с С/С с/с С/С

Фенотип волоса Извитый белый Извитый черный Прямой белый Прямой агути

Наряду с указанными в таблице 3 фенотипами волос, в шерстном покрове химер присутствовали также волосы фенотипов прямой черный и извитый агути. Однако, число этих волос относительно невелико (табл.1). Такие редкие

фенотипы волос могли возникнуть при определенном соотношении клеток мутантного (we/we С/С а/а) и нормального (+/+ с/с А/А) компонентов в дермальном сосочке.

Если ген wellhaarig экспрессируется в дермальном сосочке, то должна существовать обратная зависимость между окраской агути и волнистостью шерсти, поскольку присутствие достаточного количества клеток BALB/c в дермальном сосочке приводит к развитию нормального волоса. Установленный нами коэффициент корреляции между процентом волос фенотипа we/we и процентом волос окраски агути в пробах г = -0,80 (р = 0,005). Это указывает на то, что гены локуса agouti и ген wellhaarig экспрессируются в клетках дермального сосочка.

Помимо отсутствия четкой картины распределения в шерстном покрове химерных мышей волос мутантного и нормального фенотипов (отсутствие четких поперечных полосок извитых и прямых волос), нам также не удалось обнаружить у химер пуховые волосы промежуточного по

структуре фенотипа. Возможно, индукционный сигнал из дермального сосочка работает по принципу «все или ничего», т.е. величина сигнала определенного порогового значения приводит к развитию волоса мутантного или нормального фенотипа.

Полученные нами данные указывают, что местом действия гена wellhaarig является не эпидермальный компонент волосяного фолликула, а клетки дермального сосочка.

Анализ эффектов мутантного гена waved alopecia (wal) у химерных

мышей wal/wal0+/+., Для определения места действия мутантного гена wal были получены 4 химеры wal/wal +/+. По своей структуре шерстный покров химерных мышей представлял чередование поперечных полос, состоящих из извитых (генотип wallwal) или прямых (генотип +/+) волос. Причем как извитые, так и прямые волосы были пигментированными или непигментированными. Полосы, состоящие из извитых или прямых волос, имели как унилатеральное, так и билатеральное распределение. Чем выше был процент родительского компонента wal/wal, тем сильнее была выражена волнистость волос и тем большую площадь они занимали (рис.3).

Рис.3. Химерные мыши wal/wal4-*+/+.

а. 10% клеток мутантного генотипа; б. 80% клеток мутантного генотипа.

Изучение волос, со средней области спины из «волнистых» полос у химер показало, что все типы волос (направляющие первого и второго порядка, остевые и пуховые) имеют такую же степень извитости, как у мышей генотипа wal/wal. Извитые волосы у химер так же, как и у мышей wal/wal были тоньше, чем в норме. В отличие от мышей wal/wal, у которых алопеция появляется в 2-месячном возрасте, у химер waI/wal4-*+/+, даже с 80%-ным содержанием клеток мутантного генотипа wal/wal не обнаружено каких-либо признаков облысения в «мутантных» полосках волос. Это объясняется межклеточными взаимодействиями: влиянием клеток нормального генотипа на клетки мутантного генотипа wal/wal

В ходе эмбриогенеза млекопитающих не происходит перемешивания клеточных клонов формирующегося эпидермиса (Schmidt et al., 1987). Анализ волосяного покрова химер wal/wal<r>+/+ показывает, что мутантный ген wal и его нормальный аллель действуют в эктодермальных клетках волосяных фолликулов. Об этом свидетельствует наличие у химер четко выраженных поперечных полос с извитыми (мутантного фенотипа) или прямыми (нормальными) волосами. Полученные данные подтверждают результаты других авторов о том, что клоны эпидермальных клеток мигрируют в латерально-вентральном направлении когерентно, не смешиваясь друг с другом.

Анализ эффектов мутантного гена hairless (hr) у химерных мышей hr/hr+*+/+. Установлено, что ген hr экспрессируется в эпидермальных клетках волосяного фолликула (Panteleyev et al, 2000), но не известно, является ли место экспрессии также и местом действия, а также ограничивается ли действие гена только этой клеточной системой или же распространяется и на другие подсистемы. С целью выяснения особенностей фенотипического проявления гена hr в химерном организме нами было получено 12 мышей hr/hr<^>+/+

Рис.4 Химеры hr/hr+->+/+, слева направо №№1-4

У всех химер до 12-дневного возраста развивался нормальный шерстный покров, состоявший из агути, черных и белых волос, перемешанных между собой. Пигментированные области шерстного покрова у полученных химер составляли от 15 до 95% и располагались в виде поперечных полос и пятен. Начиная с 12 дня, у химер наблюдали выпадение волос в кранио-каудальном направлении, так же как и у мышей кг/кг.

Электрофоретический анализ изоферментов ГФИ выявил у всех химер присутствие мутантного компонента кг/кг (ОР1-1Л) в почках, печени и головном мозгу. Причем наблюдалась прямая зависимость облысения от содержания в тканях мутантного компонента: чем больше был процент содержания мутантного компонента в почках, печени и головном мозгу, тем больше было облысение у химерных животных.

Таблица 4. Процентное содержание мутантного компонента у химерных мышей

№№ химер 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Почки 73 75 54 83 67 52 62 42 49 49 8 5

Печень 80 76 83 70 45 54 53 55 44 48 37 8

Головной мозг 76 68 72 52 50 47 36 53 55 46 27 33

Если бы проявление эффектов гена кг осуществлялось только в пределах эпидермальных клеток волосяного фолликула, то у химер должно быть четкое чередование поперечных полос с шерстью и без шерсти, как это наблюдается при экспрессии других мутантных генов в эпидермальных клетках волосяных фолликулов (Бердалиев, Конюхов 1991; Малинина и др., 1999). У некоторых химер (№ 6, 9 и 10) мы наблюдали такое чередование полос. Однако, у других полученных нами химерных мышей такая четкая картина отсутствовала: полоски с шерстью были прерывистыми, так как часто пересекались значительными зонами облысения.

Формирование волос первой генерации у мутантных мышей кг/кг свидетельствует, что мезодермальные и эпидермальные клетки у них способны к формированию полноценных волосяных фолликулов. Однако, при прохождении волосяными фолликулами кг/кг стадии катагена в период первой генерации эпидермальные клетки подвергаются сильно выраженному апоптозу, что приводит к деструкции и дегенерации трансформирующихся фолликулов. В результате этого волосы первой генерации выпадают, а нормальные волосяные фолликулы второй генерации не образуются.

Результаты настоящей работы указывают, что у химерных мышей имеют место взаимодействия между эпидермальными клетками мутантного и нормального генотипов. При высоком содержании мутантного компонента у химер №1, 2, 3 и 4 (68-76%) наблюдалось полное облысение, которое, как и у мышей кг/кг, развивалось в кранио-каудальном направлении, но начиналось и заканчивалось у химер на 2 дня позже. Это свидетельствует о

том, что эпидермальные клетки +/+ сформировавшихся нормальных волосяных фолликулов получают сигналы к интенсивному процессу апоптоза от эпидермальных клеток фолликулов мутантного генотипа. Запаздывание на 2 дня начала процесса облысения у химер этой группы по сравнению с мышами hr/hr может быть связано с. влиянием нормальных фолликулов (+/+) на мутантные (hr/hr) эпидермальные клетки или обусловлено временным ослаблением сигнала к интенсивному апоптозу от мутантных к нормальным эпидермальным клеткам в смешанной популяции волосяных фолликулов. Уровень сигнала к апоптозу, возможно, достигает необходимого значения на 2 дня позже, чем у гомозигот по гену hr и тогда у химер этой группы начинается интенсивная гибель эпидермальных клеток всех волосяных фолликулов.

У химер №11 и 12 с низким содержанием мутантного компонента (1524%) небольшие безволосые участки возникали в разных областях шерстного покрова. Это указывает на то, что даже небольшие участки мутантных волосяных фолликулов могут развиваться в окружении большой популяции нормальных фолликулов.

Четкое чередование поперечных полос с шерстью и без шерсти отмечено у 3 химер (№6,9и10), имеющих примерно равные соотношения мутантного и нормального компонентов (48-54%). У других 3 химер этой группы (№5, 7 и 8) полоски с шерстью не имели четких границ, были прерывистыми (пересекались зонами облысения), наблюдалось также возникновение безволосых участков с четкими границами на спинной и брюшной сторонах тела.

Анализ полученных результатов на химерных мышах hr/hr+->+/+ свидетельствует о том, что мутантный ген hr действует в эпидермальных клетках волосяных фолликулов. При этом на характер и степень экспрессии гена hr оказывают существенное влияние межклеточные взаимодействия, что приводит к искажению «эктодермального» паттерна шерстного покрова у химер.

Изучение взаимодействия мутантного гена wellhaarig с генами waved alopecia и hairless у мыши. С целью изучения взаимодействия мутантного гена we с мутантными генами wal и hr были получены двойные гомозиготы we/we wal/walи we/we hr/hry а также мыши генотипов we/we wal/+, we/+wal/wal и we/+hr/hr, we/we hr/+.

Мыши we/we wal/+ по своему фенотипу сходны с одинарными гомозиготами we/we+/+ с рождения до старости. Однако мыши we/+wal/wal по своему фенотипу отличаются от мышей +/+wal/wal и we/we+/+. Волосы у них окраса агути, волнистые и по своей структуре сходны с мышами +/+wal/wal. В раннем возрасте шерстный покров у мышей we/+wal/wal, сходен с таковым у мышей +/+wal/wal. Однако, к концу третьей недели у некоторых животных we/+wal/wal появляются первые признаки алопеции, а к концу первого месяца алопеция появляется у большинства животных (см. табл. 5).

У мышей we/+wal/wal в возрасте 30-37 дней появляются признаки второй алопеции (табл.5). По краям этой алопеции, иногда занимающей всю спину, растут волнистые волосы, переходя на бока.

Таким образом, у мышей we/+wal/wal время появления первых признаков алопеции сокращается, примерно, на 1,5 месяца по сравнению с мышами +/+wal/wal. Алопеция второй генерации волос у мышей we/+wal/wal наступает в сжатые сроки, имеет значительно большие размеры и носит более выраженный характер по сравнению с алопецией волос первой генерации.

Таблица 5. Появление алопеции у мышей генотипов +/+wal/wal, we/+wal/walи we/wewal/wal

Дни после рождения

Генотипы 14-16 17-21 22-24 27-29 30-37 38-45 46-60 61-75

(Gl) (Gl) (Gl) (Gl) (G2) (G2) (G2) (G3)

+/+wal/wal 0/36 0/36

we/+wal/wal 6/36 4/36 26/36 36/36

we/we wal/wal 14/36 22/36 28/36 8/36

we/we wal/+ 0/36 0/36 0/36

Примечание. G - генерация волос; в числителе - число мышей с признаком алопеции, в знаменателе - общее число исследованных мышей.

Мыши генотипа we/we wal/wal по своему фенотипу резко отличаются не только от мышей we/we+/+ и +/+wal/waly но также и от мышей генотипа we/+wal/wal. Вскоре после рождения, в 6-8 дневном возрасте, как только отрастают волосы, шерстный покров мышей we/we wal/wal имеет вид «замши» и состоит из коротких и очень извитых волос. Позднее волосы у них отрастают, но шерстный покров никогда не имеет такого вида, как у молодых мышей +/-bvalAval, we/we+/+, и we/+wal/wal, а уже к 14-16 дням после рождения у некоторых мышей we/we wal/wal появляются первые признаки алопеции в межлопаточной области (табл.5). У большинства мышей этого генотипа алопеция возникает до 21-дневного возраста. В течение четвертой недели после рождения мыши we/we wal/wal становятся практически голыми.

После выпадения волос первой генерации мыши некоторое время остаются голыми, а затем начинают отрастать волосы G2, и весь процесс роста и выпадения волос вновь повторяется. Сначала появляется «замшевая» шерсть, затем волосы немного отрастают и снова появляются признаки алопеции. Основной период выпадения волос G2 приходится на первую неделю второго месяца. Однако время появления второй алопеции, как и в случае первой, может быть растянуто, в результате чего у некоторых животных алопеция возникает в течение второй педели второго месяца (табл.5). Мыши we/we wal/wal вновь становятся голыми, в основном, в 1,5-месячном возрасте и остаются такими до старости.

У некоторых мышей we/we wal/wal отрастают короткие, извитые волосы G3 на разных участках туловища. Эти участки имеют различную форму и размеры: узкие поперечные и продольные полоски или овальные и круглые пятна, которые иногда имеют неправильную форму и занимают довольно большую область тела. Паттерн участков шерстного покрова, характерный для 2-месячных животных, сохраняется до конца жизни (рис.5).

Рис.5. 8-недельные двойные гомозготы we/wewal/wal из одного помета.

Морфологическое изучение волос 19-дневных мышей we/we wal/wal с начальными признаками алопеции показало, что у них присутствуют все 4 типа волос: направляющие первого и второго порядка, остевые и пуховые. Волосы двойных гомозигот отличаются от других исследованных генотипов сильной извитостью направляющих волос, которые напоминают спираль. Особенно сильная извитость наблюдается у направляющих первого порядка. Пуховые волосы двойных гомозигот по количеству сегментов не отличаются от таких же волос мышей we/we+/+, то есть у них имеется также только три сегмента, а не четыре, как в норме и у мышей +/+wal/wal.

В результате получения двойных гомозигот we/we hr/hr были выявлены и изучены мыши генотипов we/we hr/+ и we/+hr/hr. Мыши we/we hr/+ no своему фенотипу не отличаются от мышей we/we+/+: извитость шерстного покрова у них одинакова.

У мышей генотипа we/+hr/hr шерстный покров развивается так же, как и у гомозигот по гену hairless: до 10-дневного возраста формируется нормальный волосяной покров, затем волосы начинают выпадать. Сначала волосы выпадают на нижней челюсти и над глазами, отсюда процесс быстро распространяется в каудальном направлении на другие области тела. В течение 10 дней после начала этого процесса почти все волосы выпадают за исключением вибрисс и некоторых волос на пальцах и кончике хвоста. Примерно в 6-недельном возрасте, у мышей we/+hr/hr появляется небольшое

количество редких, тонких и извитых волос. Процесс появления новых волос распространяется также в кранио-каудальном направлении. Затем эти волосы вскоре также выпадют, и мыши в течение всей жизни остаются практически лишенными шерстного покрова.

Развитие шерстного покрова у двойных гомозигот we/we hr/hr отличается от формирования шерстного покрова мышей we/+hr/hr лишь тем, что до 10-дневного возраста шерстный покров мышей we/we hr/hr развивается по типу гомозигот we/we+/+ т.е. отрастающие волосы извиты, а после 10-дневного возраста у двойных гомозигот, как и у мышей +/+hr/hr, начинается процесс облысения. К 21-дню жизни мыши we/we hr/hr полностью лишены шерстного покрова (рис.6).

а. б. в. г.

Рис.6.8-недельные мыши четырех генотипов: a) we/we+/+ б) +/+hr/hr в) we/we hr/+ г) v/ehve f

Феногенетический анализ полученных нами двойных гомозигот we/wewal/wal и we/we hr/hr, а также мышей генотипов we/we wal/+, we/+wal/wal и we/+hr/hr, we/we hr/+ показал, что ген we в одинарной дозе значительно ускоряет сроки появления алопеции у мышей we/+walAval по сравнению с одинарными гомозиготами +/+wal/wal, а двойная доза гена we резко усиливает процесс алопеции и изменяет характер формирования шерстного покрова: волосы первой генерации у них сильнее извиты, чем у мышей +/+wal/wal, we/we+/+ и we/+walAval Напротив, ген we не взаимодействует с геном hr при формировании шерстного покрова у мыши.

Таким образом, полученные нами данные показывают, что ген we является модификатором гена wal, так как он усиливает эффекты гена wal, что выражается в более раннем появлении алопеции и её больших размерах, как у мышей генотипа we/+wal/wal, так и, особенно, у мышей we/we wal/wal.

В зависимости от природы фенотипического эффекта гены-модификаторы могут усиливать, ослаблять, формировать новые или приводить к нормализации фенотипы, которые контролируются мутантными генами. Анализ генных эффектов у человека и мыши показал много примеров влияния

генов-модификаторов на проявление фенотипических эффектов мутантных генов. Модификация эффектов генов-мишеней может затрагивать любую стадию становления признака - от транскрипции, через промежуточные фенотипы на молекулярном или клеточном уровнях, до фенотипов органов, систем тканей и органов или организменного уровня. В большинстве случаев генетическая основа модификации проявлений того или иного фенотипа не известна, и только в некоторых случаях идентифицированы гены-модификаторы (№ёеаи 2001).

выводы

1. С помощью метода агрегационных химер впервые установлено, что ген we действует в клетках дермального сосочка волосяного фолликула мыши.

2. Впервые установлено, что местом действия мутантного гена wal является эктодермальный компонент волосяного фолликула. Показано, что присутствие клеток нормального генотипа оказывает компенсирующее действие и подавляет развитие алопеции у химерных мышей даже со значительной долей (80%) мутантного компонента.

3. Установлено, что местом действия гена являются

эктодермальные клетки волосяного фолликула, что согласуется с данными, полученными другими авторами, о месте экспрессии этого гена. При этом показано, что на характер и степень экспрессии гена ^ в химерном организме оказывают существенное влияние межклеточные взаимодействия, что приводит к искажению «эктодермального» паттерна шерстного покрова у химерных мышей.

4. Впервые установлено, что ген we является модификатором гена wal. Ген we усиливает эффекты гена wal, что выражается в более раннем появлении алопеции и её больших размерах у двойных гомозигот we/we wa l/wa l и мышей генотипа we/+wa lAval.

5. Анализ эффектов мутантных генов we и hr у двойных гомозигот we/we hr/hr показал, что ген we не взаимодействует с геном hr при формировании шерстного покрова у мыши.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

/. Малинина Н.А., Мартынова М.Ю., Конюхов Б.В. Мутантный ген wal действует в клетках волосяных фолликулов мыши // Онтогенез. 1999. Т.ЗО. №5. С.362-365.

2Мартынова М.Ю., Исаев Д.А., Конюхов Б.В. Анализ действия мутантного гена wellhaarig у химерных мышей // Генетика. 2002. Т.З 8. №11. С. 1511-1517.

3.Мартынова М.Ю. Изучение эффектов мутантных генов waved alopecia и wellhaarig, нарушающих формирование шерстного покрова у мыши // Материалы Научной генетической конференции МСХА им. К.А. Тимирязева, 26-27 февраля 2002 года. М.: Изд-во МСХА, 2002. С. 386-387. (Тезисы)

4.Мартынова М.Ю., Исаев Д.А., Конюхов Б.В. Изучение места действия мутантного гена hairless у химерных мышей // Актуальные проблемы генетики: материалы 2-й Научной конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова, 20-21 февраля 2003 года. М.: Изд-во МСХА, 2003. С. 358-359. (Тезисы)

З.Мартынова М.Ю., Исаев Д.А., Конюхов Б.В. Анализ эффектов мутантного гена hairless у химерных мышей // Генетика. 2003. Т.39. №9. С.1252-1257.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 16.03.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,25. Тираж 80 экз. Заказ 282. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.

» 1045 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мартынова, Марина Юрьевна

Введение. ^

Часть I. Обзор литературы

Глава 1. Генетический контроль формирования волосяного покрова у млекопитающих.

1.1. Формирование и строение волосяного фолликула.

1.2. Типы волос и цикл роста.

1.3. Эпителиально-мезенхимные взаимодействия в цикле волосяного фолликула.

1.4. Гены, контролирующие циклическое развитие волосяного фолликула.

1.5. Мутации генов, нарушающие рост и развитие волосяного покрова у мыши.

1.5.1. Мутантный ген wellhaarig (we).

1.5.2. Мутантный ген waved alopecia (wal).

1.5.3. Мутантный ген hairless (hr).

Глава 2. Использование химерных животных в изучении эффектов генов, влияющих на формирование волосяного покрова.

2.1. Экспериментальные химеры.

2.2. Определение места действия мутантных генов с помощью химерных животных.

Часть II. Собственные исследования

Глава 3. Материалы и методы.

3.1. Животные.

3.2. Анестезия, умерщвление.

3.3. Вазэктомия.

3.4. Получение агрегационных химер.

3.5. Число химер, использованных для анализа эффектов мутантных генов we, wal, hr.

3.6. Изучение шерстного покрова химерных животных.

3.7. Электрофоретический анализ изоферментов глюкозофосфатизомеразы.

3.8. Получение двойных гомозигот.

3.9. Статистическая обработка данных.

Часть III. Результаты

Глава 4. Анализ эффектов мутантного гена wellhaarig (we) у химерных мышей we/we +/+.

Глава 5. Анализ эффектов мутантного гена waved alopecia (wal) у химерных мышей wal/wal*->+/+.

Глава 6. Анализ эффектов мутантного гена hairless (hr) у химерных мышей hr/hr +/+.

Глава 7. Изучение взаимодействия мутантного гена wellhaarig с генами waved alopecia и hairless у мыши.

Обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Феногенетический анализ эффектов мутантных генов we,wal,hr, нарушающих формирование шерстного покрова у мыши"

Актуальность проблемы. Фенотип высших организмов возникает в результате сложных взаимодействий многих тысяч генов в онтогенезе. У позвоночных и, в частности, млекопитающих важную роль играют взаимодействия эффектов неаллельных генов, работающих в разных клеточных системах. Такие взаимодействия определяют время активации, проявления эффектов и степень экспрессии взаимодействующих генов.

В зиготе млекопитающих гены не активны. На стадии 2-клеточного зародыша дерепрессируется первая группа генов (гены домашнего хозяйства), а на других, более поздних этапах эмбриогенеза имеет место селективная активация тканеспецифических генов в разных дифференцирующихся клеточных системах. Дерепрессия генов в определенной клеточной системе является результатом взаимодействия как ядра и цитоплазмы, так и различных тканевых закладок между собой. Межклеточные взаимодействия генных продуктов играют важную роль в регуляции дифференциальной транскрипции генома в разных клеточных системах. Определение места действия гена в конкретной клеточной системе представляет большой интерес для понимания генетического контроля развития (Конюхов, 1980).

Изучение генетического контроля процессов развития волосяного покрова у млекопитающих является актуальной задачей генетики развития, имеющей также прикладное значение для сельского хозяйства (производство шерсти, пушное звероводство), косметической медицины и дерматологии. Несмотря на интенсивные исследования в этой области, место и особенности экспрессии многих генов, контролирующих развитие волос, ещё недостаточно изучены, что препятствует пониманию механизмов генетического контроля формирования и роста волоса.

Четкая структура пространственной организации волосяного фолликула и существование моногенных мутаций, резко меняющих облик волосяного покрова или степень и характер окраски, делают волосяные фолликулы ценным модельным объектом для генетики развития.

Среди млекопитающих, используемых в экспериментальной биологии и медицине, важное место занимают лабораторные мыши, генетика которых наиболее изучена. Секвенирование генома мыши показало, что в геноме мыши содержится большое количество генов, имеющих ортологи в геноме человека: у мыши размер гаплоидного генома равен 3 млд. пар нуклеотидов, а у человека - 3 млд. 200 млн. пар нуклеотидов. Кроме того, у мыши и человека примерно по 30 тыс. генов, из них только 1 тыс. генов являются различными, остальные одинаковые или сходные (Mouse genome, 2002). Особый интерес представляют мутантные линии мышей, являющиеся носителями той или иной наследственной аномалии. Многие из них являются моделью для изучения аналогичных наследственных аномалий у человека. Анализ эффектов таких генов у мыши представляет большой интерес для понимания генетического контроля процессов формирования волосяного покрова.

Известно более 40 мутантных генов, нарушающих развитие волос у мыши (Mouse Genome Database, http://www.informatics.jax.org/). Эффекты многих из этих генов до настоящего времени недостаточно изучены. В их числе гены wellhaarig (we), waved alopecia (wal) и hairless (hr). Действие мутантного гена we приводит к возникновению характерного волнистого шерстного покрова у гомозиготных мышей в ходе развития первой генерации волос. Мутантный ген wal в гомозиготном состоянии также приводит к формированию волнистого шерстного покрова с последующим облысением. И, наконец, мутантный ген hr обусловливает полное отсутствие волос у гомозигот.

Изучение механизма действия гена начинается с выяснения особенностей экспрессии и места его действия. В таких исследованиях часто используют химерных животных. Химерными животными называют организмы, состоящие из генетически различных клеточных популяций, происходящих более чем от одной оплодотворенной яйцеклетки (Мак-Ларен, 1979). Метод экспериментальных химер получил широкое распространение как инструмент для изучения особенностей экспрессии генов и генетического контроля клеточных взаимодействий в онтогенезе млекопитающих. В частности, экспериментальные химеры, полученные в результате агрегации бластомеров мышей мутантного и нормального генотипов, используются для определения места действия мутантных генов в тех или иных типах дифференцирующихся клеток (McLaren, Bowman, 1969; Конюхов и др., 1988).

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы был феногенетический анализ эффектов мутантных генов we, wal и hr, нарушающих формирование шерстного покрова у мыши. Исходя из цели исследования были поставлены следующие задачи:

1) Исследовать особенности проявления эффектов мутантных генов we, wal и hr в постнатальном развитии у химерных мышей we/we <->+/+, wal/wal <-> +/+ и hr/hr+++/+.

2) Определить место действия мутантных генов we, wal и hr .

3) Изучить взаимодействие мутантного гена we с генами wal и hr у мыши.

Часть I.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Генетический контроль формирования волосяного покрова у млекопитающих

Волосы - одно из самых интересных производных эпидермиса по сложности организации и разнообразию процессов, протекающих в них. В эволюции живых организмов волосяной покров возник примерно 200 млн. лет назад с появлением первых видов млекопитающих. С тех пор произошла сильная дивергенция волосяного покрова у разных видов млекопитающих, как по строению волос, так и по их окрасу. Однако, гомологичные генные локусы сохранялись, очевидно, у всех млекопитающих, на что указывает наличие у них большого сходства в формировании волос и пигментации.

Волос является производной волосяного фолликула - обманчиво простой структуры, которая выполняет важную функцию продуцирования и закрепления волоса в коже. Наряду с этим, волосяной фолликул является такой биологической системой, которая может служить прекрасным модельным объектом для изучения многих проблем современной биологии таких как: эпителиально - мезенхимные взаимодействия, клеточная дифференциация, биология стволовых клеток, формирование паттерна, как самого волоса, так и волосяного покрова в целом, апоптоз, цикл роста органов и клеток, пигментация.

Основные механизмы процессов формирования фолликула и волоса сходны у всех позвоночных, а у млекопитающих известно много гомологичных локусов, контролирующих этот процесс.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Мартынова, Марина Юрьевна

ВЫВОДЫ

1.С помощью метода агрегационных химер впервые установлено, что ген we действует в клетках дермального сосочка волосяного фолликула мыши.

2. Впервые установлено, что местом действия мутантного гена wal является эктодермальный компонент волосяного фолликула. Показано, что присутствие клеток нормального генотипа оказывает компенсирующее действие и подавляет развитие алопеции у химерных мышей wal/wal<->+/+, даже со значительной долей (80%) мутантного компонента.

3. Установлено, что местом действия гена hr/hr являются эктодермальные клетки волосяного фолликула, что согласуется с данными, полученными другими авторами, о месте экспрессии этого гена. При этом показано, что на характер и степень экспрессии гена hr в химерном организме оказывают существенное влияние межклеточные взаимодействия, что приводит к искажению «эктодермального» паттерна шерстного покрова у химерных мышей.

4. Впервые установлено, что ген we является модификатором гена wal. Ген we усиливает эффекты гена wal, что выражается в более раннем появлении алопеции и её больших размерах у двойных гомозигот we/we wal/wal и мышей генотипа we/+wal/wal

5. Анализ эффектов мутантных генов we и hr у двойных гомозигот we/we hr/hr показал, что ген we не взаимодействует с геном hr при формировании шерстного покрова у мыши.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мартынова, Марина Юрьевна, Москва

1. Биология развития млекопитающих. Методы: Пер с англ./Под ред. М.Манк.- М.: Мир, 1990.406 с.

2. Бландова З.К., Душкин В.А., Малашенко A.M., Шмидт Е.Ф. Линии лабораторных животных для медико-биологических исследований./М.: Наука, 1983. 190 с.

3. Бердалиев А.С., Конюхов Б.В. Изучение места действия гена angora-Y и его взаимодействия с геном fuzzy Y у мыши // Извест. Акад. Наук, сер. биол. 1991. №3. С. 352-360.

4. Киндяков Б.Н., Конюхов Б.В., Малинина Н.А. Изучение экспрессии мутантных генов у агрегационных химер мыши. 1. Ген white //Онтогенез. 1984. Т.15. №2. С.153-162.

5. Конюхов Б.В. Генетика развития позвоночных /М:Наука,1980. 294 с.

6. Конюхов Б.В. Межвидовые химеры млекопитающих // Онтогенез. 1985. Т.16. №3. С.242-246.

7. Конюхов Б.В., Куприянов С.Д., Исабеков Б.С. Использование химерных и трансгенных животных для изучения экспрессии генов в онтогенезе / Успехи совр. генетики. М.: Наука, 1988. Вып.15. С.106-142.

8. Конюхов Б.В. Клональный анализ онтогенеза млекопитающих // Успехи совр. биол. 1989. Т. 107. Вып.2. С.274-288.

9. Конюхов Б.В., Куприянов С.Д., Мутантный ген wellhaarig нарушает дифференцировку клеток волосяных фолликулов мыши // Онтогенез. 1990. Т. 21. № 1.С. 56-62.

10. М.Конюхов Б.В., Всеволодов Э.Б., Сажина М.В. Ультраструктурный анализ клеток наружного корневого влагалища волосяных фолликулов у мышей мутантной линии wellhaarig II Онтогенез. 1993. Т. 24. № 1. С. 96102.

11. Конюхов Б.В. Биологическое моделирование наследственных болезней человека./М.: Медицина, 1969.303с.

12. Конюхов Б.В. Генетический контроль пигментации волосяного покрова / Успехи соврем, биологии. 1990. Т. 110. Вып. 1(4). С. 3-19.

13. Конюхов Б.В., Малинина Н.А., Сажина М.В. Экспрессия мутантного гена mi у мыши: паттерн белой пятнистости // Генетика. 1996. Т.32. №11. С.1521 1527.

14. Куприянов С. Д., Конюхов Б.В. Изучение экспрессии мутантных генов у агрегационных химер мыши.2.Ген dominant cataract-Fr //Онтогенез. 1984. Т. 15. №4. С.348-355.

15. Куприянов С. Д., Сажина М.В. Электронно-микроскопический анализ экспрессии мутантного гена wellhaarig у мыши // Извест. Акад. Наук, сер. биол. 1992. № 5. С. 710-715.

16. Мак-Ларен Э. Химеры млекопитающих. М.: Мир, 1979. 176 с.

17. Малинина Н.А., Мартынова М.Ю., Конюхов Б.В. Мутантный ген wal действует в клетках волосяных фолликулов мыши // Онтогенез. 1999. Т.30. № 5. С. 362 365.

18. Мартынова М.Ю., Исаев Д.А., Конюхов Б.В. Анализ действия мутантного гена wellhaarig у химерных мышей // Генетика. 2002. Т.38. №11. С.1511-1517.

19. Мартынова М.Ю., Исаев Д.А., Конюхов Б.В. Анализ эффектов мутантного гена hairless у химерных мышей // Генетика. 2003. Т.39. №9. С.1252-1257.

20. Соколов В.Е., Скурат JI.H., Степанова JT.B. и др. Руководство по изучению кожного покрова млекопитающих. М.: Наука, 1988. 279 с.

21. Сорокина Ю.Д., Бландова З.К. Наследственное изменение кожного и шерстного покрова у мышей BALB/c-vra/У /Биологическая характеристика лабораторных животных и экстраполяция на человека экспериментальных данных: Материалы Всесоюз. конф. М., 1980. с.79-80.

22. Abramczuk J., Solter D., Koprowski H. The beneficial effect of EDTA on development of mouse one-cell embryos in chemically defined medium // Develop. Biol. 1977. V. 61. P. 378-383.

23. Arase S., Sadamoto Y., Katoh S. et al. Co-culture of human hair follicles and dermal papillae in collagen matrix // J. Dermatol. 1990. V.17. P. 667-676.

24. Auber L. The anatomy of follicles producing wool-fibres, with special reference to keratinization.// Transact. Royal Soc. Edinb. 1952. V.52. P. 191254.

25. Brown N.A., McCarthy A., Wolpert L. The development of handed asymmetry in aggregation chimeras of situs inversus mutant and wild-type mouse embiyo //Development. 1990. V. 110. P. 949-954.

26. Brooke H. C. J. Hairless mice // J. Heredity. 1926. V.17. P.173-174

27. Cachon-Gonzalez M.В., Fenner S., Coffin J.M. et al Structure and expression of the hairless gene of mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V.91. P.7717-7721.

28. Cachon-Gonzalez M.B., San-Jose I, Cano A. et al. The hairless gene of the mouse: relationship of phenotypic effects with expression profile and genotype // Devel. Dynam. 1999. V.216. P. 113-126.

29. Combates NJ., Chuong СМ., Stenn KS.et al. Expression of two Ig family adhesion molecules in the murine hair cycle: DCC in the bulge epithelia and

30. NCAM in the follicular papilla // J. Invest. Dermatol. 1997. V.109. P. 672678.

31. Dickmann Z. Egg transfer / Methods in mammalian embryology. San Francisco: Frieman Co. 1971. P. 133-145.

32. Falconer D. S., Cauld I.K., Roberts R.C., Williams D.A. The control of body size in mouse chimaeras // Genet. Res. 1981. V.38 P.25-46.

33. Gardner R.L. Mouse chimaeras obtained by the injection of cells into the blastocyst//Nature. 1968. V.220. P.596-597.

34. Gilbert S.F. Developmental biology (5th ed.) / Sunderland, MA: Sinauer, 1997. p.543-590, p.883-918.

35. Godwin AR., Capecchi MR. Hox cl3 mutant mice lack external hair // Genes. Dev. 1998.V.12. P.ll-20.

36. Goldberg E.A., Hardy M.H. Heterotypic cell contacts and basal lamina morphology during hair follicle development in the mouse: a light, scanning and electron microscopic study at the site of tissue interaction //Can. J. Zool. 1983. V.61.P. 2703-2719.

37. Graff R.J., Simmons D., Meyer J. et al. Abnormal bone production associated with mutant mouse genes pa and we И J.Hered. 1986. V.77. P. 109-113.

38. Green M.C. Catalog of mutant genes and polymorphic loci // Genetic variants and strains of the laboratory mouse. / Eds. M.F.Lyon, A.G.Searle. N.Y.: Oxford Univ.Press. 1989. P. 12-404.

39. Handjiski B.K., Eichmuller S., Hofmann U. et al. Alkaline phosphatase activity and localization during the murine hair cycle // Br. J. Dermatol. 1994. V.131.P. 303-310.

40. Hebert J.M., Rosenquist Т., GotzJ., Martin G.R. FGF5 as regulator of the hair growth cycle: Evidence from targeted and spontaneous mutations // Cell. 1994. V.78. P.1017-1025.

41. Hertwig P. Neue Mutationen und Koppelungsgruppen bei der Hausmaus // Z. Indukt. Abstammungs Vererbmgsl. 1942. B. 80. S. 220-246.

42. Hogan В., Costantini F., Lacy E. Manipulating the mouse embryo: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory. 1986. p.332

43. Ito M, Sato Y. Dynamic ultrastructural changes of the connective tissue sheath of human hair follicles during hair cycle// Arch. Dermatol. Res. 1990. V. 282. P.434-441.

44. Johnson K.R., Lane P. W., Cook S.A. et al Curly bare {cub), a new mutation on chromosome 11 causing skin and hair abnormalities, and modifier gene (mcub) on chromosome 5 // Genomics. 2003. V.81. P.6 14.

45. Kamimura J., Lee D., Baden H.P. et al. Primary mouse keratinocyte cultures contain hair follicle progenitor cells with multiple differentiation potential // J. Invest. Dermatol. 1997.V.109. P.534-540.

46. Kanzler B, Viallet J.P., Mouellic H.L. et al.Differential expression of two different homeobox gene families during mouse tegument morphogenesis // Int. J. Dev.Biol. 1994. V.38. P.633-640.

47. Link R.E., Pans R., Stenn K.S. et al. Epithelial growth by rat vibrissae follicles in vitro requires mesenchymal contact via native extracellular matrix // J. Invest. Dermatol. 1990. V.95. P.202-207.

48. Luetteke N.C., Qiu Т.Н., Peiffer R.L. et al. TGFa deficiency results in hair follicle and eye abnormalities in targeted and waved-1 mice // Cell. 1993. V. 73. P. 263-278.

49. Luetteke N.C., Phillips H.K., Qiu Т.Н. et al. The mouse waved-2 phenotype results from a point mutation in the EGF receptor tyrosine kinase // Genes and Develop. 1994. V.8. N 4. P. 399-413.

50. Ma L., Liu J., Wu T. et al. «Cyclic alopecia» in Msx2 mutants: defects in hair cycling and hair shaft differentiation // Development. 2003. V.130. P. 379 -389.

51. Mann G.B., Fowler K.J., Gabriel A. et al Mice with a null mutation of the TGFa gene have abnormal skin architecture, wavy hair and curly whiskers and often develop corneal inflammation I I Cell. 1993. V. 73. P. 249-261.

52. Mansuy IM, Van Der Putten H., Schmid Pet al. Variable and multiple expression of protease nexin-1 during mouse organogenesis and nervous system development // Development. 1993. V. 119. P. 1119-1134.

53. Markert C.L. Genetic control of cell interactions in chimeras //Develop. Genet. 1984. V.4. P.267-279.

54. Mayer T.C., Larsson K.S. A simple method for non-surgical blastocyst transfer in mice // J. Reprod. Fert. 1974. V.37. P.393-398.

55. McLaren A., Bowman P. Mouse chimaeras derived from fusion of embryos differing by nine genetic factors //Nature. 1969. V.224. P.238-240.

56. McLaren A. Mammalian chimaeras. L.: Cambridge Univ. Press. 1976. 154 p.

57. Messenger A.G., Elliott K., Westgate G.E., Gibson W.T. Distribution of extracellular matrix molecules in human hair follicles // Ann. N.Y. Acad, of Sci. 1991. V. 642. P. 253-262.

58. Mintz B. Experimentai study of the developing mammalian egg: removal of the zonapellucidall Science. 1962. V.138.P.594-595.

59. Mintz B. Gene control of mammalian pigmentary differentiation. I. Clonal origin of melanocytes //Proc. Nat Acad. Sci. USA. 1967.V.58. P.344-351.

60. Mintz B. Allophenic mice of multi-embryo origin // Methods in mammalian embryology / Ed. Deniel J. C. San Francisco: Freeman. 1971. P. 186-214.

61. Mintz B. Control mechanisms of growth and differentiation /Eds Davies D.D., Balls M. Cambridge: Univ. press. 1971. P.345.

62. Mintz B.t Gearhart J. D.,Guymont A. O. Phytohemagglutinin mediated blastomere aggregation and development of allophenic mice // Develop. Biol. 1973. V. 31. P. 195-199.

63. Mintz В. Gene expression in allophenic mice // Control mechanisms in the expression of cellular phenotypes/Ed. Padykula H.A. N.Y.: Acad. Press. 1970. P. 15-42.

64. Monk M. Mammalian development: A practical approach /IRL Press. 1987.406р.

65. Moore K.J., Swing D.A., Copeland N.G., Jenkins N.A. Interaction of the murine dilute suppressor gene (dsu) with fourteen color mutations // Genetics. 1990. V.125 P.421 -430.

66. Mouse Genome //Nature.2002.V.420.P.456,457, 509-590.

67. Mouse Genome Database, http://www.informatics.jax.org/

68. Nadeau J.H. Modifier genes in mice and humans // Nat. Rev. Genet. 2001. V.2. P. 165- 174.

69. Nakayama H., Kuroda #., FujitaJ., Kitamura Y. Studies of Sl/Sl d <->+/+ mouse aggregation chimaeras. I. Different distribution patterns between melanocytes and mast cells in the skin // Development. 1988. V.102. P.107-116.

70. Nehls M., Pfeifer D., Schorpp M., Hedrich H., Boehm T. New member of the winged-helix protein family disrupted in mouse and rat nude mutations // Nature. 1994. V.372. P. 103-107.

71. Oliver R.F. Local interactions in mammalian hair growth // The skin of vertebrates / Ed. Spearman R.I.C., Riley P.A. London: Acad. Press. 1980. P. 199-210.

72. Ого АЕ., Scott Л/Р.Splitting hairs: dissecting roles of signaling systems in epidermal development// Cell. 1998. V.95. P.575-578.

73. Panteleyev A.A, Paus R., Ahmad W. et al. Molecular and functional aspects of the hairless (hr) gene in laboratory rodents and humans // Exp. Dermatol. 1998. V.7. P.249-267.

74. Panteleyev A.A, Botchkareva N. V., Sundberg J.P. et al. The role of the hairless (hr) gene in the regulation of hair follicle catagen transformation // Am. J. Pathol. 1999. V.155. P. 159-171.

75. Panteleyev A.A., Paus R., Christiano A.M. Patterns of hairless (hr) gene expression in mouse hair follicle morphogenesis and cycling // Am. J. Pathol. 2000. V.157. P. 1071-1079.

76. Papaioannou V.E., Dieterlen-Lievre F. Making chimeras // Chimeras in developmental biology. N.Y.: Acad. Press. 1984. P.3-37.

77. Peters J., Selley R. L., Cocking Y. Mouse gene list 1997 // Mouse genome. 1997. V.95. N2. P. 193-466.

78. Phillips R.J.S. Modification of c-locus alleles Mem. // Mouse News Lett. 1980. №62. P. 51 -52.

79. Philpott M., Paus R. Principles of hair follicle morphogenesis. In: Molecular basis of epithelial appendage morphogenesis, edited by Chuong C-M. Austin, TX: Landws. 1998. P.75-110.

80. Potter G. В., Beaudoin G. M.3rd, DeRenzo C. L.,at al. The hairless gene mutated in congenital hair loss disorders encodes a novel nuclear receptor corepressor// Genes Dev. 2001. Oct.15. P.2687-2701.

81. Reynolds A. J., Jahoda C.A.B. Inductive properties of hair follicle cells // Ann. N.Y. Acad, of Sci.1991. V. 642. P. 226-242.

82. Reynolds A/J., Jahoda C.A.B. Cultured dermal papilla cells induce follicle formation and hair growth by transdifferentiation of an adult epidermis // Development. 1993. V.l 15. P. 587-593.

83. Rugh R. The mouse: its reproduction and development./ Burgess Publishing Company. 1968. 430 p.

84. Schmidt GH., Blount MA., Ponder B.A.J. Immunochemical demonstration of the clonal organization of chimaeric epidermis //Development. 1987. V.l00. P.535-541.

85. Stenn K.S., Paus R. Control of hair follicle cycling I I Physiol. Rev. 2001. V.81. P.449-494.

86. Sweet И.О. Dilute suppressor, a new suppressor gene in the house mouse // J. Hered. 1983. V.74. P.305 306.

87. Tarkowski A.K. Mouse chimaeras developed from fused eggs //Nture. 1961 .V. 190.P.857-860.

88. Trigg M. Hair growth in mouse affecting coat texture // J. Zool. Lond. 1972. V.l68. P. 168-172.

89. West J.D. A theoretical approach to the relation between patch size and clone size in chimaeric tissue //J. theor. biol. 1975. V. 50. P.153-160.

90. West J.D. Chimaeras in developmental biology / Eds Le Douarin N., McLaren A.L.; N.Y.: Acad, press. 1984. P.39.

91. Whitten W. К. Nutrient requirements for the culture of preimplantation embryos in vitro //Adv. Biosci. 1971. V. 6. P. 129-141.

92. Yu D.W., Yang Т., Sonoda Т., Gaffiiey K. Message of nexin-1, a serine protease inhibitor, is accumulated in the follicular papilla during anagen of the hair cycle //J. Cell Sci. 1995.V.108. P. 3867-3874.