Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Феногенетический анализ экспрессии мутантных генов, влияющих на формирование волос у мыши

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Феногенетический анализ экспрессии мутантных генов, влияющих на формирование волос у мыши"

" ' 1 ' АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им. Н. И. ВАВИЛОВА

На правах рукописи

БЕРДАЛИЕВ Арстанбек Саттарович

УДК 575.16;591

ФЕНОГЕНЕТИЧЕСКИЙ А1ШШЗ ЭКСПРЕССИИ ШТЖГНЫХ ГЕНОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА ФОРМИРОВАНИЕ ВОЛОС У МЫШИ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в лаборатории генетики развития Института общей генетики им. 11.И.Вавилова ЛИ СССР (директор - член-корреспондент ЛИ СССР С.В.Шестаков)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Б.В.Конюхов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В.Г.Митрофанов

кандидат биологических наук С.Н.Каштанов

Ведущее учреждение: Московский Государственный университет им.

М.В. Ломоносова, кафедра генетики

Защита диссертации состоится " '> " и \о h &_ 1991г.

в ¡4 час ЬТ; мин, на заседании специализированного Ученого Совета Д002.49.01 при Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова АН СССР по адресу: II7809 ГСП-I, Москва В-333, ул. Губкина,3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И.Вавилова АН СССР

Автореферат разослан " £ ff " ¿X it bp ft jj 1991г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

Г. Н. Полухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

—'"""Актуальность теми. Изучение реализации наследственной информации в онтогенезе млекопитающих является важной проблемой современной биологии. Деление клеток, их дифференцировка в ходе развития и морфогенез контролируются многими тысячами генов, которые вступают в действие в строго определенной последовательности. В основе атих процессов лежит дифференциальная экспрессия генов, проявляющаяся на всех уровнях реализации генетической информации (Тимофеев-Ресовский, Иванов, 1966; Астауров, 1968; Davidson , 1968; Конюхов, 1973, 1980; Корочшш, 1977; WTllkina , . 1906). Механизмы генетического контроля отдельных этапов онтогенеза можно выяснить через феногенетический анализ наследственных отклонений от нормы. Анализ эффектов мутантных генов, нарушающих определенные стадии развития, представляет большой интерес для понимания особенностей экспрессии нормальных аллелей. Экспериментальное изучение экспрессии мутантного гена позволяет определить место его действия, а следовательно.и месчо действия его нормального аллеля и таким образом установить роль данного ло-куса в генетическом контроле, того или иного морфогенетического процесса.1 У мыши известно около 70 докусов, контролирующих формирование волос. Волосяной фолликул - прекрасный модельный объект для изучения механизмов генетической регуляции, пролиферации, дифференцировки и миграции клеток« Генетический контроль процессов формирования волоса представляет большой интерес для широкого круга специалистов, особенно генетиков развития.'

Цель и задачи исследования.' Цель работы - феногенетический анализ экспрессии и взаимодействия двух мутантных генов, влияющих на формирование волею у мыши. Основные задачи псследовшшя состояли в следующем:

1. Изучить экспрессию мутантлого гена аадога-У у гомозигот в период формирования первой и третьей генерации волос.

2. Установить место действия мутантного гена апвога-у при помощи метода агрегационных химер.

3.- Исследовать взаимодействие эффектов мутантшх генов

апвога-У И Гиггу-У у ДВОЙНЫХ ГОМОЗИГОТ,-

Научная новизна работы.1 Изучена экспрессия мутантшх генов аг^ога-у (во*) и .установлено место действия гена

бо* , а та1сже исследовано взаимодействие этого гена с геном у мыши. Показано, что ген goY увеличивает продолжительность роста волос, не влияя на скорость их роста. При этом ген goY сильнее экспрессируется в ходе формирования первой генерации волос, чем в последующих генерациях. При помощи метода экспериментальных химер показано, что ген действует в эпидермалымх клетках волосяных фолликулов, причем его экспрессия проявляется локально (ци-тоавтономно).' Феногенетический анализ взаимодействия неаллельных мутантшх генов и , нарушающих рост и строение волос, показал, что гены и проявляют свои эффекты у двойных гомозигот. При этом ген частично подавляет эффект гена ео* при формировании первой генерации волос.' У взрослых животных ге- • нотипа ^о^/ъо* при формировании волос второй генерации

полностью проявляются эффекты обоих генов:.значительное увеличение длины волос - эффект гена во* и курчавость волос - эффект гена

Практическая ценность результатов исследования.'Данные настоящей работы имеют значение для выяснения генетического контроля роста волос' у млекопитающих.' В частности, полученные результат ты представляют большой интерес для понимания механизмов генетически обусловленной длийношеротнооти у сельскохозяйственных животных.* Анализ взаимодействия Мутантных генов во* и

указывает, что первая и последущие генерации волосяных фолликулов различаются между собой по разной степени экспрессии функционирующих генов. Эти данные представляют интерес для объяснения случаев различной экспрессии генов в разных генерациях волосяных фолликулов у млекопитающих.'

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Ш школе-семинаре по генетике и селекции животных (Новосибирск,

1989), на П Всесоюзном совещании "Генетика развития" (Ташкент,

1990), Международной конференции "Лабораторные животные для медико-биологических и биотехнологических исследований" (Москва, 1990), IX конференции молодых ученых ИОГен АН СССР (Москва, 1990) и межлабораторном семинаре "Генетика животных" ИОГен АН СССР (Москва, 1990).

Публикации. По теме диссертации опубликованыработ .

Объем работы. Диссертационная работа включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты собственных исследований, их обсуждение, выводы и список литературы. Диссертация изложена на 83 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 14 рисунков. Список литературы включает 112 работ, в том числе 73 на иностранных языках.

Глава I. МАТЕРИАЛ И МЕТОЛУ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Линии мышей, используемые в работе.' Для анализа экспрессии гена использовали мышей двух линий: С57ВЬ - £0У/в0У и С57ВЬ/6 (+/+). Место действия этого гена определяли с помощью метода агрегационных химер, для получения которых использовали мышей двух линий: С57вь - ео^/ео* и бва/1(+/+) » различающихся как по окрасу и длине шерсти, так и изоферментам глюкозофос-фатизомеразы (1ФИ).' Мыши линии С57ВЬ имеют черный окрас волрс (генотип аВБ ) и электрофоретически быстрый вариант 1ФИ (генотип

ipi- 1ЪЪ)_ У мышей линии DM/1 oicpuc волос светло-коричневый (ге-" нотип abd ) и для них характерен электрофоретически медленный вариант 1\&И ( Gpi-iaa ). Для изучения взаимодействия гена ango-ra-Y с геном fuzzy-Y мышей goY/goY и fzY/fzY скрещивали между

y y y y

собой для получения двойных гомозигот - go /go fz /fz (см. рис.1).

1.2. Получение агрегационных химер.' Химер goY/goY-«-*- +/+ по- \ лучали агрегационным методом, который был предложен Тарковским ( Tarkowski , 1961) и Минц ( Mintz , 1962 ). Спонтанно овулирукщих самок мутантного генотипа и самок мышей нормального генотипа осаживали на ночь с самцами соответствующих генотипов.1 На следущее утро по обнаружению вагинальной пробки судили о беременности.' Самок забивали на второй день беременности и зародышей вымывали из

»

яйцеводов неполной средой Дульбекко, не содержащей ионов Ca-14" и Mg++. Для агрегации отбирали 8-клеточные морулы, которых помещали в 0,5$ раствор проназы и после удаления zona pellucida морулы двух различных генотипов попарно приводили в контакт в 0,01% растворе фитогемагглютинина-Р ( Mintz et al ., 1973 ). После этого агрегированные морулы помещали для культивирования в каплю среда Виттена под слой вазелинового масла. Среду Виттена использовали в модификации Хоппе и Литтс ('Hoppe , Pitts , 1973 ).' Через сутки культивирования при 37°С в атмосфере смеси трех газов {5% С02 + 5/5 02 + 90$ n2) химерный зародыш достигал стадии блаотоцисты.' Химерных зародышей этой стадии развития транбплантировали в правый рог матки ложнобеременной самки-реципиента.' Реципиентами служили тетрагибридные самки мышей, у которых индуцировали ложную беременность, спаривая их со стерильными самцами за 2,5 суток до момента трансплантации зародышей.*

ЗуЗ.' Определение химеризма и процентного содержания клеток родительских генотипов в химерном организме.' Химеризм полученных 28-дневных мышей определяли по мозаичности окраоа й структуре 1

- Ь -

Рис.1. . Схема скрещиваний для получения мышей генотипа

ВО*/ва* £2*/£г*

Р: £ во /еа +/+ х о +/+ £2Г/£ъ 1

Р1!

ВС: <? х о го*/во* +/+

4-

Р2ВС: +/воУ +/+ ; +/еоУ +/£г*

у у у у у

Во1/во +/+; во /&о

ТС: о +/+ fzY/fzY х о во1/во1 +/£ъ* 4- *

+/воу £г*/£ъ*\ +/боу

Р2 х Р2: о во*/во* +/£ъ* х у во*/ ВО*/во* +/+; ВО*/во* +/£ъ*

ВО*/во* £ъ*/£ъ*

ПРИМЕЧАНИЕ: Р - родители, Р1 - первое поколение, ВС - возвратное скрещивание, Р2ВС - второе поколение от возвратного скрещивания, ТС - анализирующее скрещивание, | | - необходимый генотип.

шерстного покрова, а также по наличию разных изофермонтов №И в крови, головном мозге, сердце и почках. Для установления процентного соотношения клеток родительских генотипов в тканях и органах химер определяли содержание в них изоферментов ГОИ (см. Ма-линина и др.-, 1989). У химер волосы выщипывали с поперечных полосок, характеризующихся длинной или короткой (нормальной) шерстью и под бинокулярным микроскопом волосы классифицировали на четыре типа: направляющие первого порядка, направляющие второго порядка, остевые и пуховые (см. Соколов и др., 1988).' Измеряли длину направляющих волос первого порядка.

1.-4.' Анализ экспрессии мутантных генов. У 14-, 17,5-, 21-,

v v

24,5-, 28- и 31,5-дневных мышей генотипов +/+ +/+, в° /во +/+ , +/+ ¡г.*/*«* и выщипывали волосы первой генера-

ции (сл ) со средней области спины". У 8-нё'дельных животных +/+ +/+

у у

и во /во +/+ волосы второй генерации (в2) выщипывали на участке размером 5x5 мм в средней области спины и вокруг этого участка волосы подстригали. Затем отрастающие волосы третьей генерации (03) выщипывали через 14-, 17,5-, 21-, 24,5-, 28 и 31,5 дней. У 49-дневных мышей +/+ и воУ/еоУ 1т?выщипывали

волосы 62 со средней области спины. Выщипанные волосы , 02 и 63 помещали на предметное стекло, смазанное тонким слоем вазелинового масла, и под бинокулярным микроскопом изучали их строение и классифицировали на четыре типа, а также измеряли их длину.

Скорость роста волос, или относительный прирост их в длину за 3,5 дня (в %), определяли по формуле (Урбах, 1963).

1.'5,- Гистологические методу.' Изучали' строение фолликулов волос (¡3 у мышей генотипов +/+ +/+ и воу/воу +/+ , а также строе-

у у ^ у

ние фолликулов волос 01 у мышей генотипов +/+ и /во

на различных стадиях развития волосяных фолликулов (ана-

ген, катаген, телоген). Биопсией о'рали кусочки кожи размером

v v

5x5 мм с середшш спины у мышей +/+ +/+ и go /go +/+ через 14-, 17,5-, 21-, 24,5 и 28 дней после выщипывания волос G2 и у 11-дневных мышей генотипов +/+ fzY/fzY и goY/goY fzY/fzY. Кусочки кожи закрепляли иглами на пробковых плотах и фиксировали 70% этанолом ( Jarret, Hardy, 1957). Продольные и поперечные парафиновые серийные срезы через волосяные фолликулы толщиной 8 мкм окрашивали по Караччи с докраской эозином.

Измеряли диаметр волосяных луковиц направляющих волос первого порядка G3 у мышей +/+ +/+ и goY/goY +/+. С этой целью брали биопсией кусочки кожи, на которых отрастали волосы G3 через 14 дней после выщипывания волос G2 , и на серийных поперечных срезах через волосяные луковицы измеряли их максимальный диаметр на уровне середины волосяного сосочка.

Количествешше данные обрабатывали статистически по методу Фишера-Стьюдента.- Различия считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. Анализ экспрессии мутантного гена angora-Y.

Y

2.1. Экспрессия гена go в период формирования первой

9

генерации волос. Изучение четырех типов растущих волос первой генерации ( G1) у мышей, гомозиготных по мутантному гену angora-Y, показало, что у 14- и 17,5-дневных мышей goY/goY длина всех типов волос достоверно не отличается от нормы. В то же время у 21-дневных мышей goY/goY все типы волос'существенно длиннее по сравнению с нормой.' При этом наибольшее различие отмечено для направляющих волос первого порядка.' У 28-дневных мутантных мышей волосы этого типа в 2 раза длиннее по сравнению с контролем. Направляющие второго порядка, остевые и пуховые волосы у мутан-

- О -

тсв примерно б 1,5 раза длиннее, чем у мышей +/+ (табл. 1).

у у

Увеличение длиш пуховых волос у мышей во /во связано с образованием дополнительного пятого сегмента, а увеличение длины остевых волос обусловлено сильным удлинением базального сегмента.

Данше, представленные в табл.' 1 , показывают, что у мышей +/+ все волосы первой генерации, взятые со средней области спины, кроме направляющих волос первого порядка, прекращают рост через 17,5 дней после рождения, т.е. волосяные фолликулы вступают в стадию покоя, или телогена. Направляющие волосы первого порядка у мышей этого генотипа прекращают рост несколько позже -через 21 день после рождения. Однако направляющие волосы первого порядка у мутантных мышей прекращают свой рост только после достижения животными 28-дневного возраста, т.е.' волосяные фолликулы вступают в стадию телогена на 7 дней позже по сравнению с нормой. Другие типы волос (направляющие второго порядка, остевые и пухо- . вые) у мутантов прекращают свой рост примерно на 3 дня позже по сравнению с контролем.

2.2. Экспрессия гена ко* в период формирования третьей генерации волос.1 Изучение длины растущих волос третьей генерации (вз) показало, что длина волос всех типов у мышей во*/в°* через 14 и 17,5 дней после выщипывания волос статистически достоверно не отличается от нормы. Через 21 день после выщипывания волос в2 все типы волос вз у мышей в°*/в°* значительно ■ длиннее, чем в норме. Закончившие рост направляющие волосы первого порядка бз через 24,5 дня после выщипывания волос ъг в 1,5 раза длиннее, а направляющие волосы второго порядка, остевые и пуховые примерно на 30$ длиннее по сравнению с нормой (табл.'2). Достоверных отличий длины волос у самцов и самок одно-

V V

го и того же генотипа ( во /во и +/+) не обнаружено.'

Длина растущих волос 01 у самок V у

мышей генотипов во /во и +/+ (мм)

Возраст Направляющие Остевые Пуховые

после рождения, сут Генотип первого порядка второго порядка

14 V у ео /во 6,5±0,341 З.Т^ОДб1 З.б^ОДЗ1 З^.ОЗ1

+/+ 6,2±0,37 3,9±0,19 3,7±0,16 3,2±0,07

17,5 у у в° /во Ь.О^О.Зб1 б.г^о.гб1 б.гЬо.гз1 5,4-0,19"'"

+/+ 8,5±0,08 5,9±0,16 5,8^0,17 5,1-0,13

21 у V во /во 13,0±0,54 8,8^0,41 8,4±0,25 7,9^0,26

'+/+ 9,7±0,21 6,2±0,08 5,9±0,07 5,6-0,13

24,5 у у во /во 16,2±0,44 8,9±0,31 8,4±0,24 8,1-0,10

+/+ 9,6±0,25 5,9^0,16 5,8±0,09 5,4±0,15

28 у у во /во 18,6±0,26 9,0±0,56 8,5±0,19 8,3±0,33

+/+ 9,5±0,09 6,3±0,14 6,0±0,П 5,5±0,06

31,5 во*/воУ 19,0±0,55 8,8^0,25 8,6±0,15 8,6±0,16

+А 9,6±0,07 6,2±0,П 6,1±0,09 5,6±0,08

Примечание.« Использовали по пять животных в°У/в0У и +/+, у

которых измеряли по 10 волос каждого типа, выщипанных в средней части спины. 1=р> 0,1; в остальных случаях р<0,05

Длина растущих волос сз у самцов

' У X

мышей генотипов /в° и +/+ (мм)

Время после выщипывания волос, сут Генотип Направлящие Остевые Пуховые

первого порядка второго порядка

14 у у во /во б^^о.гэ1 4,0±0,271 4,0±0,121 3,7^0,17"''

+/+ 6,2±0,33 4,0±0,23 3,8±0,23 3,6±0,17

17,5 у V ВО /во Э^.ЗЭ1 б.г^.г!1 б.г^о.зг1 5,8^0,

+/+ 9,4±0,17 6,1±0,12 5,9±0,24 5,6-0,18

21 у у во /во 12,0±0,24 7,9±0,Ю 7,9±0,23 7,3±0,П

+/+ Ю,4±0,31 6,8^0,14 6,£¿0,19 6,4±0,03

24,5 у у Во /во 14,9±0,18 8,9^0,22' 9,1±0,23 8,4±0,14

+/+ Ю,2±0,41 6,9±0,26 6,9±0,21 6,4±0,14

28 у у во /во 15,2±0,38 9,0±0,24 9,2±0,20 8;4±0,20

+/+ Ю,3±0,44 6,7±0,23 6,8±0,20 6,5±0,15

Примечание см.< табл.;1

Данные, представленные в табл.2, показывают, что эффект у

гена во при формировании волос 03 , как и волос , проявляется в удлинении стадии анаген УТ, продолжительность которой у

у у

мышей во /во примерно на 3 дня больше, чем в норме.

Изучение скорости роста волос вз показало, что у мутант-шх мышей относительный прирост в длину (в %) всех типов волос за 3,5 дня в период от 14 до 17,5 дней после выщипывания волос 02 не отличается от нормы. Уменьшение скорости роста всех типов волос у мышей +/+ по сравнению с мутантами в период от 17,5 до 21 дня после выщипывания волос 02 обусловлено тем, что волосяные фолликулы мышей +/+ входят в стадию катагена. После 21 дня рост волос 03 у животных генотипа +А прекращается т.е. волосяные фолликулы вступают в стадию телогена (табл.3). Следовательно, удлинение волос

у у

вз , как и волос С1 , у мышей во /во не связано с изменением скорости их роста, а обусловлено увеличением периода продолжительности роста волос (стадии анаген У1). В связи с тем, что продолжительность стадии анаген II у мутантных животных больше, чем в норме, волосы у них растут дольше, в результате чего и возникают заметные различия в длине волос у мышей и а-/л- (рис.2).

Изучение гистологических срезов кусочков кожи, взятых биопсией через 14 дней после выщипывания волос 02 , показало, что строение волосяных фолликулов у мутантов не отличается от нормы. Данные, полученные при измерении максимального диаметра волосяных фолликулов на серийных поперечных срезах кожи на стадии анаген У1 указывают, 'что,размеры волосяных фолликулов у мутантных мышей не отличаются от контроля. Так, например, максимальные диаметры волосяных луковиц на уровне середины сосочка направляющих волос первого порядка у мутантных и нормальных мышей равнялись соответственно 10^2,71 и 102±1,12 мкм. Изучение

Относительный прирост в длину за 3,5 дня волос аз у самцов шаей генотипов воу/воу и +/+, %

Время после выщипывания волос сут Генотип Направляющие ■ Остевые. Пуховые

первого порядка ■ второго -порядка

14 - 17,5 у V во /во* бг.о^з.бэ1 Бб.О^З.Б!1 55,0^2,921 бб^З.ЗО1

+/+ 51,6±2,22 52,5±1,68 55,2±2,90 55,5±1,70

17,5 - 21 у у во /£0 23,7±2,16 27,4^1,25 27,4^2,50 25,9^1,87

+/+ 10,6±1,35 П,5±0,56 15,3±1,59 14,3±0,59

21 - 24,5 у у во /во 24.2i0.75 12,7±0,74 15,2-1,33 15,0±0,43

+/+ 0 0 0 0

I

го I

Примечание см.' табл.'1

- 1.3 -

г/.„г

«о*/«,

■I----1-■-- )

ж»1/«*

'1.1.1

14 21 28 35

Рис.2.- Рост направляющих волос первого порядка первой ) и третьей генерации (вз ) У шшей генотипов ео^/^ и +/+.

По оси ординат - длина волос в по оси абсцисс-время после рождения или после выщипывания волос сг ,сут

гистологических срезов кусочков ком, взятых биопсией через 21 день после выщипывания волос 02, показало, что волосяные фолликулы у мышей генотипа во^/ео* находятся на стадии анаген У1, а у мышей +/+ - на стадии телогена. Через 28 дней после выщипывания волос 02 фолликулы волос у мутантных мышей так же, как и в норме, находятся на стадии телогена. Эти данные свидетельствуют о том, что увеличение длины волос у мышей не связано с нарушением формирования волосяных фолликулов, а обусловлено увеличением продолжительности роста волоса.

Глава 3. Определение места действия гена ш^ога-у

методом агрогационпых- химер- - ■■

У всех изученных 28-дневных химер воУ/еоу *-+•+/+ отмечен мозаицизм окраса шерстного покрова: участки волос черного или светло-коричневого окраса разной ширины распространялись от позвоночника в латерадьно-вентральном направлении. Визуальное определение процентного соотношения черных и светло-коричневых участков шерстного покрова показало, -что светло-коричневые области у химер составляли примерно 40-45%. Во всех изученных тканях и органах химер (в эритроцитах, головном мозге, сердце и почках) обнаружены изоферменты ГФИ обеих родительских линий мышей, которые были представлены примерно в равном соотношении. Содержание изофермента Ср±-1В (клеточный маркер родительского компонента генотипа ) у химер № 1 и № з в среднем равня-

лось 50%, а у химеры № 2 - 40%. Следовательно, химеры № 1 и № 3 оказались сбалансированными, т.е. процентное соотношение клеток родительских генотипов в их тканях было одинаковым.

У всех трех полученных химер ее?/во* +/+ были обнару-

кош поперечные полоски коротких и длинных полос разной ширины и длины, которые распространялись от позвоночника в ллторально-вентральном направлении. Границы между поперечными полосками длинных и коротких волос были четкими. В некоторых случаях хорошо прослеживалось билатеральное распределение полосок.' Taie, у химеры Jfc 1 паттерн поперечных полосок с короткими или длинными волосами был следующим: область головы полностью была покрыта короткими волосами, в сродней области спины наблюдалось четкое билатеральное распределение полосок коротких волос, а правая и левая стороны задней области спины были покрыты длинной шерстью. В то 7ле время в передней области cmnni не отмечено такого била-

ных волос, а на правой - полоска коротких волос. У химеры № 2 билатеральное распределение полосок коротких и длинных волос наблюдали соответственно в передней и задней областях спины, а в средней области спины отмечено унилатеральное расположение полосок длинных и коротких волос. У химеры Jê 3 четко прослеживается билатеральность распространения полосок длинных и коротких волос в передней, средней и задней областях спины.

Анализ паттерна полосок с короткой и длинной шерстью показывает, что у исследованных химер, как правило, наблюдалось билатеральное распределение поперечных полосок с одинаковой длиной шерсти.-

Волосы, выщипанные с участков, характеризующихся длшшо-шерстностью, были примерно вдвое длиннее, чем волосы, выщипанные с короткошерстных полосок (табл.4).- Длина направляющих волос первого порядка, выщипанных у 28-дневных химер с длшшо-шерстных полосок, была такой же, как у мышей goY/goY соответ-

Длина направляющих волос первого порядка у 28-днезных химерных мышей ++ +/+ » мм

Таблица 4

химер Фенотип поперечных полосок волос Область спины

пеоелняя средняя задняя

л п л п л п

I Длинношерстные 17,9*0,34 19,8±0,20 20,5±0,30

Короткошерстные 9,7±0,Ю 9,7±0,Ю Ю,0±0,15

2 Длинношерстные 19,8±0,33 20,1±0,20 20,0±0,35

Короткошерстные Ю,0±0,Ю 9,8±0,07 9,6±0,15

3 Длинношерстные" 18,0±0,30 18,0,28 20,0±0,Ю 20,2±0,07

Короткошерстные 9,6±0,Ю 9,7*0,12

I

I

Примечание: л - левая сторона; п - правая сторона.

ствущего возраста. В то же время длина направляющих волос первого порядка короткошерстных полосок химер полностью соответствовала норме. Другие типы волос (направляющие второго порядка, остевые и пуховые), выщипанные с длинношерстных полосок, также были значительно длиннее, чем у мышей +/+, а длина этих типов волос, выщипанных с короткошерстных полосок, соответствовала норме.

Тот факт, что у химер наблюдаются полоски с короткой и длинной шерстью и четко выражены границы между ними, указывает на место действия мутантного гена в эпидермалышх клетках. Если бы ген ео* экспрессировался в дермальных клетках, которые в ходе развития сильно перемешиваются, то следовало бы ожидать у химер перемешивания коротких и длинных волос и не было бы таких хорошо выраженных поперечных полосок, характеризующихся короткой и длинной шерстью.

Глава 4. Изучение взаимодействия генов аг^ога-у и хиггу-У

у у

У мишей, гомозиготных по генам ео и , волосы 01 имеют

у у

такую же курчавость, как и волосы мышей +/+ /а?. . Длина направляющих волос первого порядка у 14-, 17,5- и 21-дневных мышей

у, у v, у о у у

ео /£о 12. такая же, как у мышеи +/+ ^ . В то же вре-

мя у 14-дневных мышей во^/во* +/+ волосы достоверно длиннее, чем у мышей +/+ fzY/fzY и ¡.ъ*-/!?? . Различие в длине

волос отмечено также у 17,5-, 21-, 24,5- и 20-дневных мышей

у у

ео /во +/+ по сравнению с длиной волос у двойных гомозигот (рис.3).

Данные, представленные в табл.5, показывают, что у мышей +/+ +/+ и +/+ в средней области спины направляющие

Рнс.З«' Йаправлявдие волосы первого порядка С1 (I) и 02

V V

шшай разных генотипов: +/+ +/+ (а), во /во +/+ +/+ (в) и воу/вох (г)

(П) (б).

Длина растущих направляющих волос первого порядка у гльгдей разных генотипов, мм

Генотип Возраст после рождения, сут

14 17,5 21 24,5 28 ЯТ Ц

. +/+ +/+ 6,2^0,37 8,5^0,08 9,7±0,21 9,6±0,25 9,5±0,09 9,6±0,Ц7

у у во /во +/+ 6,5±0,34 9,0±0,36 13,0^0,54 16,2^0,44 18,6±0,26 19,0±0,55

+/+ гъ 5,0±0,08 7,2±0,36 8,3±0,33 8,6±0,43 8,5±0,53 8,6±0,38

есР/вс? 4,6±0,10 7,0±0,32 8,6^0,30 12,0±0,20 15,3±0,25 15,3±0,30

I

к-: со

I

Примечание.' Использовали по пять нпвотных каждого генотипа, у которых измеряли по 20 волос, выщипанных в средней области спины.-

- -¿и -

волосы первого порядка прекращают рост к 21 дню после рождения, т.е. волосяные фолликулы вступают в стадию покоя, или телогена. Однако у мышей воу/ео* +/+ и воУ/во* ¿т^/Хъ* такие волосы прекращают рост только после достижения животными 28-дневного возраста, т.е. на 7 дней позже. В результате этого у 28-дневных мышей генотипа еоУ/воУ волосы значительно длитее, чем

у мышей +/+ и +/+ +/+, но короче по сравнению с дли-

у V

ной волос у мышей во /во +/+.

Таким образом, у мышей генотипа воУ/во* при фор-

мировании волос первой генерации наблюдается частичное подавление экспрессии мутантного гена в°у. У двойных гомозигот волосы как первой, гак и второй генерации, по своей структуре сходны с во-

у у

л.осами мышей +/+ £а /£г (рис. з ). Длина направляющих волос первого порядка у 7-неделышх мышей +/+ +/+, воУ/в°У +/+» +/+ в°¥/во¥ равняется соответствешю 9,7^0,25;

19,5^0,53;' 9,5^0,30 и 19,6^0,50 мм. Эти данные свидетельствуют о том, что у мышей +/+ длина направляющих волос перво-

го порядка 02 не отличается от нормы, а у двойных гомозигот во^/ео* 1дайна волос такая же, как у животных еоУ/воУ +/+. У Мышей генотипов воу/во* во*/воу +/+направля-

ющие волосы первого порядка в два раза длиннее, чем в норме, и у одинарных гомозигот по гену 12? Следовательно, у двойных гомозигот при формировании волос й2 в отличие от происходит полное проявление эффекта мутантного гена в°У. Мыши гено-у у у у

типа во /в° £21 в 7-недельном возрасте имеют длинные и

курчавые волосы, т.е.' у них проявляются полностью эффекты обоих у у

мутантных генов: во и £г .■

Исследование поперечных срезов кожи 11 - и 14-дневных мышей показало, что волосяные фолликулы у мышей воу/воу И +/+ сильно изогнуты в отличие от волосяных фолликулов

мышей генотипов +/+ +/+ и goY/goY +/+. Курчавость шорстпого

Y

покрова у гомозигот по гену fz , очевидно, связана, с ненормальным формированием волосяных фолликулов.

обсуждение

Полученные в настоящей работе данные об экспрессии мутант-ного гена angora-Y у гомозиготных мышей в период формирования первой и третьей генерации волос показывают, что закончившие рост волосы G1(пуховые, остевые и направляющие второго порядка)

у у

у мышей go /go в 1,5 раза, а направляющие волосы первого порядка в 2 раза длиннее, чем соответствующие волосы мышей +/+. Эти данные в основном согласуются результатами работы Поникуик

и Рафаэль (Pennycuik , Raphael , 1904). Следовательно, можно ут-

Y

верждать, что мутантныи ген go является повторной мутацией гена go

Однако между нашими данными и данными Пеникуик и Рафаэль (1984) имеются различия относительно длины направляющих волос первого порядка и продолжительности стадии анаген У1 для этих волос у мутантов.- Пеникуик и Рафаэль (1984) исследовали длину волос G1 у 3-недельных мышей.1 Полученные нами результаты измерений длины волос у мутантных и нормальных мышей этого возраста хорошо согласуются с данными австралийских исследователей.' Однако, как видно из результатов, представленных в диссертации,у мутантов направляющие волосы первого порядка продолжают расти до 28-дневного возраста, что приводит к значительному их удлинению по сравнению с такими же волосами у 3-недельных мышей этого генотипа.' Следует отметить, что австралийские авторы не учли тот факт, что у мыши направляющие волосы первого порядка растут значительно , дольше по сравнению с другими типами волос ( Ргааег,

Nay , 1955; Hale .Ebling , 1975).

Пеникуик и Рафаэль (1984) ввели в линию мышей ■ angora мутантшй ген naked ( N ) для исследования продолжительности цикла роста волос.' Однако взаимодействие генов go и N могло повлиять на эффекты гена go и тем самым привести к получению неточных данных о продолжительности цикла роста волос и,в частности, длительности стадии анаген У1 у мутантов.' Согласно данным этих авторов продолжительность роста направляющих волос первого порядка и соответственно стадии анаген У1 для этих волос увеличена, как и для волос других типов, на 3 дня по сравнению с нормой.1 В то же время полученные нами результаты свидетельствуют о том, что продолжительность роста направляющих волос первого порядка g1 .на 7 дней больше, чем в норме. Это приводит к существенному увеличению у мутантов длины направляющих волос первого порядка по сравнению с другими типами волос первой генерации.'

У полученных нами химер, методом агрегации бластомеров мышей, различающихся по маркерным генам, наблюдали чередование поперечных полосок вилос черного или светло-коричневого окраса. Визуальное определение процентного соотношения черных и светло-коричневых полосок волос у сбалансированных химер показало, что светло-коричневые области (генетический маркер меланоцитов родительского компонента - лиши DBA ) составляли примерно 45$. Анализ светло-коричневых полосок (генотип меланоцитов bd ) и черных полосок ( генотип меланоцитов bd ) волос показывает, что многие полоски довольно широкие, что указывает на наличие когерентных (единых или слитных) клонов меланобластов.: У химер c57bl- goY/goY dba (+/+) были обнаружены поперечные полоски длинных (генотип goY/goY) и коротких (нормальных, генотип +/+) волос.- Границы между полосками длинных и коротких волос были

четкими. У одной из химер (№з) било обнаружено IÜ полосок волос с разной длиной шерсти на каждой стороне тела, т.е. примерно по 20 поперечных полосок на обеих сторонах тела.

Полученные нами данные на агрегациошшх химерах и данные ряда авторов (Mintz , 1971, 1974;' Мак Ларен, 1979;' Малишша и др., 1984, 1989; Федоров И др., 1986;' Schmidt et al .', 1987) показывают, что клоны меланобластов и эпидермалышх клеток у млекопитающих могут представлять когерентные клеточные клоны, мигрирующие с дорсальной стороны зародыша в латерально-вентраль-ном направлении.

Клональный анализ с использованием маркерных генов показал у химерных мышей высокую степень корреляции в соотношении определенных клеточных клонов между билатеральными структурами,

ЧТО ЧННЙНЦ ori.ll, Г.КЬ'Ю_Kjifj^iii^

между правой и левой половинами зародыша (см.1 Конюхов, 1989).'

Накаяма с соавторами ( Nakayama et al , 1988) на химерных мышах установили, что, если эпидермис характеризуется чередованием клеточных полосок того или иного родительского генотипа, то дерма химеры представляет собой смесь клеточных элементов обоих родительских генотипов.' Следовательно, в ходе формирования дермы происходит интенсивное перемешивание её клеточных элементов.'

Тот факт, что у химерных мышей goY/goY -«->■+/+ наблюдаются четко выраженные полоски с длинной мутантной и короткой нормальной шерстью указывает, что мутантный ген goY экспрессируется в эпидермальных клетках волосяных фолликулов. Если бы ген goY действовал в дермальных клетках, которые сильно перемешиваются в ходе развития, то не возникли бы такие четко выраженные полоски с длинными и короткими волосами.- В таком случае короткие и длинные волосы были бы перемешаны между собой на всех участках

кожного покрова.1 Полученные нами на химерных мышах данные показывают, что клоны эпидермалышх клеток мигрируют в латерально-вентральном направлении когерентно, не смешиваясь друг с другом.'

Таким образом, результаты настоящей работы подтверждают данные Пеникуик и Рафаэль ( Pennycuik Raphael , 1984), показавших при помощи другого метода, а именно,дермально-эпидермальной рекомбинации кожи, что локус go действует в эпидермалышх клетках волосяных фолликулов.-

Проведенное нами изучение роста направляющих волос первого порядка G1 показало, что ген fzY в гомозиготном состоянии подавляет скорость роста этих волос,в результате чего их длина у 21-дневных мышей fzY/fzY значительно короче, чем в норме.' У двойных гомозигот goY/goY fzW до 21-дневного возраста темп роста направляющих волос первого порядка такой же, как у одинарных гомозигот по гену fzY . Однако, если у мышей +/+

у у

fz /fz рост волос прекращается по достижении животными 21-

Y Y Y Y

дневного возраста, то у мышей генотипа go /go fz /fz их

у у

рост продолжается, как у мышей go /go ,до 4-недельного возрас-

у

та. Следовательно, после прекращения экспрессии гена fz на-

V

блкщается проявление эффекта гена go , вследствие чего происходит значительное удлинение волос у двойных гомозигот по срав-

V V

нению с длиной волос у мышей +/+ fz /fz . В результате этого у 28-дневных мышей goY/goY fzY/fzY длина направляющих волос

I

первого порядка почти вдвое превышает длину таких же волос у одинарных гомозигот по гену fzY у Хотя следует отметить, что длина волос у двойных гомозигот меньше по сравнению с длиной волос у мышей goY/goY +/+ , что обусловлено подавлением скорости роста волос геном fzY в течение первых 3 недель постэмбрионального периода онтогенеза.' Таким образом,при формировании первой генерации волос у мышей goY/goY fzY/fzY наблюдается

неполное проявление эффектов гена go , что связано с подавлением роста волос мутантным геном fzY .

y

Ген fz в гомозиготном состоянии не влияет на рост волос второй генерации, хотя эффекты этого гена на морфологию волос 02 проявляются в такой же степени, как и волос первой генерации.1 Отсутствие влияния гена fzY на рост волос G2 приводит к тому , что длина направляющих волос первого порядка у 7-недель-

y y y y

ных животных go /go fz /fz не отличается от длины волос такого же типа у мышей генотипа goY/goY +/+» т.'е.' в этом случае имеет место полное проявление эффекта гена goY у двойных гомозигот.1

Таким образом, полученные в настоящей работе данные указывают, что у двойных гомозигот goY/goY fzY/fzY проявляются эффекты обоих мутантных генов: значительное увеличение длины волос по сравнению с нормой - эффект гена goY и курчавость -- эффект гена fzY .' Изучение роста направляющих волос первого порядка показало, что у двойных гомозигот при формировании волос G1 наблюдается неполное проявление эффектов гена goY , что связано с подавлением роста волос мутантным геном fzY . При формировании волос G2 ген fzY не подавляет рост волос и поэтому происходит полное проявление эффектов гена goY у мышей генотипа goY/goY fzY/fzY

Феногенетический анализ взаимодействия мутантных генов, нарушающих рост и строение волос показал, что фолликулы первой и последующих генераций волос различаются между собой по разной степени экспрессии функционирующих в них генов.* Следует отметить, что взаимодействие генов goY и fzY проявляется в период их наиболее интенсивной экспрессии, т.'е.' в ходе формирования первой

генерации волос.' Тот факт, что мутантные гены goY и fzY взаи-

i

модействуют при формировании первой генерации волос и не взаимен

*

действуют друг с другом в ходе формирования второй генерации волос,свидетельствуем о наличии определенных различий в экспрессии генов в периоды формирования волосяных фолликулов первой и последующих генераций волос.' Полученные данные указывают на целесообразность проведения анализа морфогенетических различий развития фолликулов первой и второй генерации волос.1

ВЫВОДЫ

I. Изучение экспрессии генов апеога-х ( ¿о* ) и ¿иггу-у

у

( £ъ ) у мыши показало, что эти мутантные гены являются повторными мутациями генов go и £ т.

2.1 Анализ экспрессии гена апеога-у . в ходе формирования первой генерации волос ( С1 ) показал, что продолжительность периода роста всех типов волос у мышей больше, чем в

норме.1 Рост направляющих волос первого порядка у мутантов продолжается дольше на 7 дней, а для остальных типов волос (направляющие второго порядка, остевые и пуховые) на 3 дня больше, чем в норме. Это приводит к тому, что у мышей закон-

чившие рост направляющие волосы первого порядка в 2 раза, а остальные типы волос на 50% длиннее, чем у мышей +/+.' Скорость роста волос у мышей не отличается от нормы.1

3.' Изучение экспрессии мутантного гена в ходе формирования третьей генерации волос (вз ) показало, что продолжительность периода роста всех типов волос у мутантов на 3 дня больше, чем в норме.- Это приводит к тому, что у мышей закончившие рост волосы в 1,5 раза длиннее, чем в норме.' Скорость роста и диаметр фолликулов волос вз у мышей не отличают-

ся от нормы.'

4. Анализ эффектов гена У химерных мышей /+/+ показал, что у них наблюдается четкий мозаищглм но структуре шерстного покрова: чередование поперечш!х полосок коротких и длинных волос.' Такие полоски разной ширины и длины распространяются от позвоночника в латералыю-вентральном направлении.' Волосы, выщипанные с участков, характеризующихся длинношерст-ностыо, имели такую же длину, как и волосы мышей воУ/воУ соответствующего возраста.' В то же время длина волос, выщипанных с полосок, характеризующихся короткошерстностью,полностью соответствовала норме. Эти дашше указывают, что ген действует в эпидермальных клетках волосяных фолликулов, причем,его экспрессия проявляется локально (цитоавтоиомно).'

5.' Изучение роста направляющих волос первого порядка у

V у У V

мышей во /во показало, что у животных такого генотипа

проявляются эффекты обоих мутантных генов: значительное увеличение длины волос по сравнению о нормой - эффект гена доУ и курчавость - эффект гена fzY . В ходе формирования волос первой

генерации ( ) наблюдается неполное проявление эффектов гена у

во , что связано с подавлением роста волос мутантным геном

у У У У У

,' У мышей во /во при формировании волос второй

генерации ( 62 ) ген не подавляет рост волос и происходит

полное проявление эффектов гена во*.'

6.' Феногенетический анализ взаимодействия мутантных генов, нарушающих рост и строение волос, показал, что фолликулы первой и последующих генераций волос у мыши различаются между собой

по разной степени экспрессии функционирующих в их клетках генов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

I* Бердалиев A.C., Конюхов Б.В. Изучение роста волос у мышей

мутантной линии angora-Y. - Тезисы докладов Ш школы-семинара по генетике и селекции животных. Изв. Сиб. отд. ЛИ СССР, сер.биол., 1909, вып. 2. с. 16.

2. Конюхов Б.В., Бердалиев A.C. Анализ экспрессии мутантного гена

angora-Y у мыши. - Онтогенез, 1990, т. 21, Jé 5, с. 502-507.

3. Бердалиев A.C., Конюхов Б. В. Мутантный ген angora-Y экспрес-

сируется в эпидерлальных клетках волосяных фолликулов.- Тезисы докладов международной конференции "Лабораторные животные для медико-биологических исследований". М., 1990, с. 7.

4. Konyukhov B.V., Berdaliev A.S, Analysis of the angora-Y gene

expression. - Mouse Genome, 1990, N 87, P. 94-95.

5. Бердалиев A.C., Конюхов Б.В. Феногенетический анализ взаимо-

действия мутантных генов go* и fz* у мыши. - Тезисы докладов II Всесоюзного Совещания "Генетика развития". Ташкент 1990, т. I, ч. II, с. 204-206.

6. Бердалиев A.C., Конюхов Б.В. Изучение места действия гена

angora-Y и его взаимодействия с геном fuzzy-Y у мыши. - Изв. АН СССР, сер.биол., 1991, й 2.

55 от 27.12.90 г. Объем I п.л. Тираж 120 экз. Заказ 10