Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕПОРТЕРНЫХ ГЕНОВ (GFP И LACZ) ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ЖИВОТНЫХ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕПОРТЕРНЫХ ГЕНОВ (GFP И LACZ) ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ЖИВОТНЫХ"

Л-35 ¿г {Г

На правах рукописи

ПОКРОВСКАЯ МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕПОРТЁРНЫХ ГЕНОВ (СРР и Ьнс£) ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ЖИВОТНЫХ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

* г ...

Дубровнцы - 2005

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства.

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук,

академик РАСХН Эрнст Лев Константинович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Дьяконов Лев Петрович; доктор биологических наук, профессор Народицкий Борис Савельевич

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский

институт сельскохозяйственной биотехнологии

Защита диссертации состоится иЮ^Я 2005 года, в #й?часов, на заседании диссертационного совета Д.006,013.01 во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубровицы.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНИИЖа. Автореферат разослан « » _2005 года.

Учёный секретарь диссертационного совета, / кандидат биологических Ыаук

В.П. Губанова

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1, Актуальность темы. Генная инженерия многоклеточных организмов является одной из областей современной биотехнологии.

Использование при создании трансгенных организмов генов маркерных (репорт^рных) белков, таких как р-галактозидаза кишечной палочки Escherichia coli или зелёный флуоресцирующий белок (green fluorescent protein, GFP) медузы Aequorea victoria, позволяет изучить эффективность генетической трансформации животных, установить функциональную активность различных клонированных промоторов.

В течение многих лет эксперименты по трансгепезу насекомых проводились ь основном на дрозофилах Drosophila melanogaster с помощью рекомбинантных Р-элементов - подвижных генетических структур (мобильных элементов, м. э.), обнаруженных у этого вида (Rubin et al, ] 982).

Успешная генетическая трансформация насекомых, не относящихся к семейству drosophilidae, в последние годы стала возможна в результате создания учёными генных конструкций на основе м. э., обнаруженных у насекомых разных видов (Handler А.М., 2001). Подвижный элемент комнатных мух Musca domestica L, - Mermes (Warren et al., 1994) - относится к группе транспозонов, которые наиболее часто используются в качестве вектора для генетической трансформации насекомых (Handler А.М., 2001).

При проведении экспериментов по созданию трансгенных насекомых наряду с выбором геннойнженерного вектора большое внимание уделяется таким генетическим маркерам, которые обеспечивают эффективный отбор трансгенных особей в потомстве микроинъецированных особей. В настоящее время наиболее эффективными прижизненными селективными маркерами являются гены флуоресцирующих белков, выделенные из медуз и кораллов, а также мутантные формы этих генов, в том числе улучшенный GFP (F.nhanced GFP, EGFP) (Handler Д.М., 2001).

Предварительным этапом получения трансгенных сельскохозяйственных млекопитающих (Брем и др., 1996; Эрнст Л.К., 2003, 2004) является анализ интеграции и тканеснецифической экспрессии чужеродных генов у модельных животных, в качестве которых, в основном, используют лабораторных мышей Mus Musculus L. Короткий промежуток времени, необходимый для смены генераций (65-70 дней) и высокая плодовитость мышей облегчают проведение

ЦНБ МСХА

1туры

экспериментов по трансгснезу этих животных, обуславливая получение достоверных результатов.

1.2, Цель н задачи исследований. Цель настоящей работы заключалась в создании новых моделей генетически трансформированных жнвотньпх на основе использования репортёрпых генов.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

— провести трансформацию клеток зародышевого пути Musca domestica методом мнкроинъекиии в ранние эмбрионы рекомбинантных Р и Hermes мобильных генетических элементов, содержащих в качестве маркерного гена ген бета-галактозндазы (LacZ) и ген зелёного флуоресцирующего белка (EGFP);

— провести анализ генегической трансформации в первом и втором поколении комнатных мух, подвергшихся микроинъекции, по наличию экспрессии указанных релортёрных белков;

— провести ПЦР-гшализ ДНК комнатных мух, микроикъецированных на эмбриональной стадии развития, и их потомков на наличие трансгена;

— провести ПЦР-анализ Д11К лабораторных мышей, полученных в результате микроинъекции в про нуклеусы зигот генетической конструкции, содержащей ген EGFP под контролем промотора гена белка промежуточных фила ментов кератина шерсти овец (К2.10), на содержание последовательностей трансгена;

— провести молекулярно-генетический анализ наследования трансгена в первом и втором поколении трансгенных мышей;

— исследовать экспрессию гена EGFP в клетках коркового вещества волос у полученных трансгенных мышей.

1.3. Научна» понизил работы. В ходе выполнения диссертационной работы впервые при проведении экспериментов по генетической трансформации комнатных мух с использованием гена улучшенного зелёного флуоресцирующего белка медузы A, victoria под контролем промотора гена hsp70 (гена белка теплового шока) Drosophila melanogaster подтверждена возможность селекции трансгснных особей на эмбриональной стадии развития.

При проведении исследований на мышах впервые получены трансгснные особи, экспрессируюшие зелёный флуоресцирующий белок под контролем последовательности промотора, контролирующего у овец ген белка промежуточных филаменгов кератина шерсти второго типа (К2.10).

1.4. Практическая значимость. Показана принципиальная возможность использования гена EGFP - мутаитной формы гена GFP медузы Aequorea victoria - в качестве селективного маркера для отбора трансгенных комнатных мух на эмбриональной стадии развития.

Определена функциональная активность последовательности промотора гена белка промежуточных фнламентов второго типа (IP II) кератина шерсти овец (К2.10) длиной 735 пар нуклестидов.

1.5. Основные положения, выносимые на защиту:

• Возможность использования репортёрного гена EGFP пол контролем промотора Кег5 и промотора гена bsp7û для изучения эффективности генетической трансформации модельных животных Mus Musculus L. и Musca domestica h.

• Локализация экспрессии гена ЕСРР в корковом веществе волос у мышей, трансгенных по Ker-EGFP.

• Отклонение фактического расщепления по трансгену Ker-EGFP в первом поколении и подтверждение мекделевского растепления по тому же трансгену во втором поколении трансгенных мышей.

1.6. Апробация работы. Материалы диссертации были изложены на 49-й научной конференции аспирантов и молодых учёных Достижения молодых учёных в области животноводства», проходящей б июля 2000 года в В ГНИ И Же; на отчётных научных конференциях отдела биотехнологии ВГНИИЖа 2001,2002,2003 и 2004 года.

1.7. Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

1.8. Структура н объём работы. Диссертация написана на 140 машинописных листах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы, который включает 249 источников, в том числе 197 на иностранных языках. Работа содержит 8 таблиц и 29 рисунков.

2. МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Схемы исследований.

Эксперименты но диетической трансформации комнатных мух проводились в отделе биотехнологии Всероссийского государственного НИИ животноводства в 1995, 1996 гг. и в 2000-2003 гг. в соответствии с планом научно-исследовательской работы. Принципиальная схема этих исследований представлена на рисунке 1,

Рис. 1. Схема исследований генетической трансформации комнатных

мух.

Для исследований использовали комнатных мух лабораторной популяции Ш'НИИЖа, в ранние эмбрионы которых (первые 60-90 мил развития) методом микроинъекции вводили 100-200 mci раствора ДНК, представляющего собой смесь вектора и плазмиды помощника в соотношении 5:1 и концентрации 0,2 мг/мл. Микрошгьекции проводились по методике, применяемой на дрозофилах Drosophila melanogaster (Santamaría Р., 1986) и нмеюшей некоторые изменения.

Исследования трансгенеза у мышей были выполнены в 2004-2005 гг. в отделе биотехнологии Всероссийского государственного НИИ животноводства. Первичные животные, полученные в результате микроинъекции генной конструкции Кег-ЕСРР в мужские про нуклеусы зигот мышей, были предоставлены Институтом биологии гена РАН. Этапы исследований схематично изображены на рис. 2.

Рис. 2. Схема исследований генетической трансформации лабораторн ых мышей.

2,2, Молекулярная характеристика генных конструкций.

Генетическая конструкция Ker-EGFP - линейная форма плазмиды PKERSH-1.TXT, предоставленная Луниным В.Г. (Всероссийский НИИ сельскохозяйственной биотехнологии, РАСХН). Она содержит ген улучшенного зеленого флуоресцирующего белка медузы (Enhanced GFP, EGFP) под контролем промотора (Кег5) гена белка IF II кератина шерсти овец (К2.10) длиной 735 пар нуклеотидов (Rogers G.E., Powell B.C., 1993).

При проведении экспериментов по генетической трансформации комнатных мух были использованы следующие генетические конструкции; pwLacZ, pjt25wc, предоставленные Корочкиньш J1.H, (Институт биологии гена РАН), и pHcrmNco-EGFP, pHjpHt, предоставленные Косоруковым B.C. (11ау4но-пропзводственным биотехнологический центр по животноводству РАСХН).

Вектор pwLacZ. сконструированный на основе Р элемента дрозофилы, содержит репортерный ген ß-галактозидазы Е. coli (LacZ) пол контролем промотора гена S-эстеразы (Esi-S) Drosophila virilis и укороченный ген white D, melanogaster с ei-o собственной роуляторной областью длиной 300 пн.

Пяагчида помощник on2Swc. В еб состав входит Р элемент D. melanogasier, содержащий ген Р транспозазы (гс25), и имеющий дслецию 3 концевого инвертированного повтора (Karess R.E., Rubin G.M, 1984; Ииррота В., 1991).

Генетическая конструкция pHermNeo-EGFP создана на основе м. э. Hermes, обнаруженного у комнатных мух (Warren el al., 1994). Она содержит бактериальный ген устойчивости к генетицнну (Neo1) и ген улучшенного зеленого флуоресцирующего белка (EGFP) Aequorca victoria под контролем промотора белка теплового тока hsp70 D. melanogoster.

Пяазмида помощник piïlpUî содержит ген транспозазы мобильного элемента Hermes под koi пролом промотора hsp70 t>. melanogoster.

2.3. Исследовании ншеграшш it экспрессии чужеродных генов.

Анализ интеграции ДНК, микроинъецированной в зародышевые клетки экспериментальных животных, проводили методом нолимеразной ценной реакции (НЦР) (Saiki et al., 1985; 1988; Санки н др., 1990; Зиновьева н др., Î998), Для проведения ПЦР-анализа высокомолекулярная ДНК выделялась методами, применяемыми в лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики животных ВГНИИЖа (Зиновьева и др., 1998; Гладырь и др., 2001). Выделение ДНК из взрослых комнатных мух осуществляли методом перхлоратной экстракции (Глашрь и др., 2001) с последующей преципитацией раствором полиэтиленгликоля: 24 % ПЭГ-6000, ЗМ NaCl (Ausubel et al., 1987). Для выделения ДНК из npoö кожи мышей (около 1 мм3), полученных из отсечённых кончиков хвостов, использовали метод Кавасаки (Kawasaki E.S., 1990; Зиновьева и др., 1998).

Для выявления экспрессии гена LacZ в семя выносящих луковицах у самцов Musca domestica L, с помощью субстрата, содержащего 0,2 % X-gal, использовали методику, применяемую у дрозофил (Bellen et а)., 1989),

' Анализ экспрессии трансгена EGFP у экспериментальных животных (комнатных мух и мышей) провода ли с помощью люминесцентного микроскопа OPTON с использованием соответствующего набора световых фильтров, имеющего «возбуждающий» фильтр - BP 450-490, «запирающий» фильтр - FT 510, LP 520.

' У мух исследовали кладки яиц микроинъецированных особей. Препараты готовили на поздней эмбриональной стадии развития. Материал, предварительно прогретый при 37 или 40 'С, заключали под вазелиновое масло.

"У мышей исследование экспрессии трансгена проводили на гистосрезах кожи и в образцах волос. Препараты готовили по обычно!) методике (Ромейс Б., 1953). Для выявления тканеслецифи ческой экспрессии гена зеленого флуоресцирующего белка в волосяных фолликулах трансгенных мышей дополнительно применяли имму но гистохимический метод окрашивания с использованием авидин - биотннового комплекса (Волкова H.A., 2003; Хериет Э.Р.; Галер К.С., 1999; Полак Д., Ван Норден С., 19S7).

Измерение интенсивности флуоресценции исследованных объектов, анализ гистологических препаратов проводили с помощью компьютерной программы ImageScope Color (ООО «Системы для микроскопии и анализа», Россия).

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1, Результаты генетической трансформации насекомых.

3.1.1. Результаты микроинъекции эмбрионов комнатных мух плазмидами pwLacZ и piü5wc.

В результате микроинъекшш 229 добластодермных эмбрионов комнатных мух плазмидами pwLacZ и pjt25wc было получено 11 первичных насекомых (F0) - 7 самок и 4 самца, которые кшшвидуально спаривались с контрольными особями лабораторной линии ВГНИИЖа. При дальнейшем разведении экспериментальных насекомых и скрещивании особей первого поколения межу собой среди особей второго поколения одной из самок F0, были обнаружены насекомые с закрученными вверх крыльями. При их скрещивании между собой, все насекомые первого поколения имели

изменённую форму крыльев. Такая форма крыльев ранее не наблюдалась у комнатных мух лабораторной линии ВГНИИЖа.

Обнаруженная нами мутация была выделена в линию и названа curly. Она характеризовалась полной пенетрантностью и неоднородной эксп рессивностью.

Среди спонтанных мутаций комнатных мух, затрагивающих форму крыла, загнутые вверх крылья (curly wings) является наиболее часто встречаемой мутацией (Hoyer R.F.,1966; Vanossi Este et al., 1967). В 1990 году она была обнаружена в стандартизированной немутантной линии Musca domestica Института зоологии швейцарского университета (г. Цюрих) и имела типичную локализацию в четвёртой хромосоме. Проведённый нами генетический эксперимент по изучению аллелизма мутаций «закрученные вверх крылья» у комнатных мух линии curly и швейцарской мутантной линии показал, что мутация curly является аналогом мутации curly wings, наблюдаемой в разные годы в других популяциях лабораторных комнатных мух.

При изучении наследования мутации curly с помощью критерия расхождения распределений (критерия согласия распределений) - у2 (хн-кваарат) мы обнаружили достоверное отклонение фактического расщепления (3,07:0,93) (л теоретически ожидаемого (3:1) (табл. 1). Это было обусловлено пониженной жизнеспособностью мутантных мух по сравнению ç особями, имеющими нормальную форму крыльев (табл. 2). Проведённый нами опыт показал, что в одинаковых условиях на 100 особей линии с нормальными крыльями, благополучно проходящих развитие от оплодотворённого яйца до превращения куколки в муху, в среднем приходится 60 мух линии с закрученными вверх крыльями.

Таблица I. Вычисление X2 (хи-кеадрат).

X^nïi

ФенотнпичсскиЙ класс (Ф> (Т) Ф-Т (Ф-Т)2 (Ф-'DVT Л«т Р - 0,05 о о я О о II fc.

Номальные крылья 2427 2375 52 2704 1,14 4,56 3,8 6,6 10,3

Загнутые вверх крылья 739 791 -52 2704 3,42

Примечание: Ф ~ фактическое число особей в каждом классе; Т -теоретически ожидаемое число особей в классе.

Таблица 2. Жизнеспособность комнатных мух.

Линия комнатных mvx П родолжительность яйцекладки, дни Выход куколок нзяиц.% Выход имаго из куколок, % Выход имаго из яиц. %

Прямокрылые 27 79,0*"±8,7 97,0"'±1,1 77,0"±9,0

curly 24 57,0*±8,7 81,0"'±5,3 •И,0"±8,3

Примечание: '" - средняя арифметическая достоверна при уровне вероятности (Р) > 0,Р99; " - средняя арифметическая достоверна при Р > 0,99.

При выявлении экспрессии гена бета-галактозидазы Е. cotí у экспериментальных насекомых исследовалась репродуктивная система самцов.

В результате окрашивания 50 препарированных особей первого поколения комнатных мух, микроннъецированных на эмбриональной стадии развития, к пяти самцов мутшгтной линии curly с использованием субстрата, содержащего 0,2 % X-gal, активность экзогенной р-галахтозндазы в сесмявы носящих луковицах исследованных экземпляров не была выявлена.

При проведении молекулярного анализа интеграции трансгена в хромосомы комнатных мух с помощью ПЦР мы столкнулись с некоторыми трудностями. ДНК, выделяемая нами первоначально из взрослых комнатных мух методом гтерхлоратной экстракции н осаждаемая 96 % этанолом, который обычно используется в лабораторной практике, была не пригодна для проведения полнмеразной цепной реакции. При замене этанола на раствор полиэтиленгликоля и хлорида нэтрия (24 % ПЭГ-6000, ЗМ NaCl) полученные пробы имели достаточную степень чистоты, необходимую для амплификации с помощью Taq-полимеразы в стандартных условиях ПЦР. В дальнейшем при выделении ДНК из имаго Musca domestica в качестве осаждающего агента мы использовали только указанный раствор полиэтиленгликоля.

С целью определения инсерцни введенных последовательностей вектора pwLacZ у комнатных мух линии curly нами был проведён ПЦР-анализ ДНК мутантных особей с использованием олигонуклеотидных прайм еров, подобранных к участку гена white Drosophila melanogaster. В качестве положительного контроля анализировалась ДНК, выделенная из клеток линии 67j25D дрозофилы D, melanogaster Oregon R. С.

Эле ктро форе грамм а продуктов ПЦР показала отсутствие экзогенной ДНК у насекомых с закрученными крыльями.

Таким образом, обнаруженная нами мутация комнатных мух curly (закрученные вверх крылья), не является результатом интеграции генно-инженерной конструкции pwLacZ в хромосомы указанных насекомых.

Поскольку мутация «закрученные вверх крылья» была нами обнаружена в ходе одного из экспериментов по трансформации комнатных мух с помощью рекомбинантного Р-элемента дрозофилы, мы предполагаем, что изменение в фенотипе экспериментальных насекомых было обусловлено мутагенным действием экзогенной ДНК. Транспозаза Р-элемента (плазмилы помощника), введённого вместе с вектором в добласгодермные эмбрионы, могла обеспечить транспозицию эндогенных перемещающихся элементов генома комнатных мух.

3.1.2. Результаты лшкрошгъекц ии эмбрионов комнатных .мух плазлшдами pHermNeo-EGFP и pHtpHL

Было проведено три эксперимента по микроинъекции эмбрионов комнатных мух смесью плазм ид pHermNeo-EGFP и pHlpHt (табл. 3).

В экспериментах fé 1 и Jfs 3 после микроинъекции эмбрионы культивировались до стадии куколки при темпералуре .25-27 'С.

При проведении эксперимента № 2, с целью индуцирования транспозиции рекомбинантных элементов Hermes из инъецированных плазмнд в хромосомы реципиента, мнкроинъецированные эмбрионы прогревались прн 37 °С в течение 60 минут. Затем они развивались до стадии куколки при 2527 'С.

Селекцию трансгенных комнатных мух среди потомков микроинъецированных особей мы проводили без применения генетицина G418, используя EGFP как самостоятельный маркер генетической трансформации.

Поскольку меланизированная кутикула комнатных мух на стадии имаго мешает обнаружению приобретённой флуоресценции — свечению EGFP, выявление трансгенного потомства F1 осуществлялось на поздней эмбриональной стадии. После предварительного двойного прогревания в термостате прн 37 °С и выдерживания 1 час при комнатной температуре между часовыми прогреваниями кладок яии, полученных от мух F0, экспрессия EGFP выявлялась в результате просмотра эмбрионов в синем свете люминесцентного микроскопа OPTON (эксперимент Xs 1 н № 2).

При проведении третьего эксперимента эмбрионы первичных насекомых (РО) перед выявлением приобретённой флуоресценции в течение 30 минут прогревались при 40

В результате исследований 320 кладок яиц экспериментальных особей у трёх эмбрионов, полученных от одного из плодовитых самцов ГО (эксперимент № I), на фоне естественного желто-зеленого свечения желтка, хориона и других структур были обнаружены отдельные скопления клеток, имеющих зелёную флуоресценцию.

При просмотре в люминесцентном микросколе яйцекладок, полученных от трёх контрольных самок, спаренных с единственным самцом Р1, выжившем из отобранных эмбрионов, зелёное свечение не наблюдалось.

Таблица 3. Трансформация комнатных мух плазмидами pHermNeo-EGFP и pHlpHL

Количество Количество имаго Р0 Количество

Номер инъецированных эмбрионов FI,

эксперимента эмбрионов Bceix> плодовитых трансформи- имеющих зеленую

рованных флуоресценцию

1 350 29 23 1 3

2 . 754 136 74 - -

3 762 44 26 - -

Итого 1866 209 123 ] 3

ПЦР-анализ тотальной ДНК, выделенной из взрослых мух F0, с использованием олигонуклеотидных прайм еров, подобранных к GFP, показал наличие экзогенных последовательностей у 30 плодовитых насекомых, микроннъецированных на эмбриональной стации генно-инженерной конструкцией pHermNeo-EGFP (табл. 4).

Исследование хромосомной ДНК комнатных мух первого и второго поколения показало наличие ре портерного гена EGFP Aequorea victoria у трансформированного самца FI, имеющего зелёную флуоресценцию на сгади» эмбриона, и отсутствие таковых у других проанализированных особей (см. табл. 4).

Таблица 4. Результаты ПЦР-аналта ДНК экспериментальных комнатных мух на содержание нуклеотидпых последовательностей гена ЕеРР(чДИК).

Номер эксперимента F0 FI F2

Всего проанализировано Количество особей, имеющих чДНК Всего проанализировало Количество особей, имеющих Всего проанализировано Количество особей, имеющих

особей всего плодовитых особей чДНК особей чДНК

1 29 9 S 52 1 50 -

2 136 2t 17 75 - - -

3 44 7 5 23 - - -

Итого 209 if 30 150 1 50 -

Клетки насекомых, содержащие мобильные элементы имеют специфические механизмы регуляции их подвижности. Эндогенная система репрессии может снижать частоту трансформации.

Анализ результатов ПЦР при исследовании ДНК комнатных мух лабораторной популяции ВГНИИЖа на содержание эндогенных мобильных элементов Hermes с помощью олигонуклеотидных праймеров, подобранных к гену Hermes транспозазы, показал, что все проверенные особи (279 голов) имели нуклеотидные последовательности этого элемента.

Таким образом, низкая частота трансформации комнатных мух с помощью рекомб инантного мобильного элемента Hermes (4,35 %), наблюдаемая в эксперименте № 1 (см, табл. 3), могла быть обусловлена негативным влиянием эндогенных копий данного элемента, обнаруженных у лабораторных насекомых.

Флуоресценция EGFP, выявленная у первого поколения на эмбриональной стадии развития и отсутствие зелёного свечения и чужеродных нуклеотидных последовательностей у особей F2, вероятно, были обусловлены инсерцией вектора pHermNeo-EGFP в ДНК митохондрий зародышевых клеток ми кро инъецированного самца F0. Похожие случаи экстрахромосом кой интеграции и экспрессии гена GFP наблюдались зарубежными учеными при получении трансгенных комнатных мух и трансгенных насекомых других видов (Ташига et а!., 2000; Handler A.M., Harreil R.A., 2001; Hediger et al„ 2001).

Высокая эффективность селекции трансформированных особей по наличию зелёной флуоресценции (100 %) свидетельствует о возможности

использования гена улучшенного зеленого флуоресцирующего белка Aequorea victoria (EGFP) в качестве маркера для отбора трансгенных комнатных мух на эмбриональной стадии развития и получения трансгенных линий насекомых этого вида.

3.2. Получение трансгенных мышей.

3.2.1. Получение первичных трансгенпых мышей.

В результате микроинъекций генноинженерной конструкции Ker-EGFP в мужские пронуклеусы зигот мышей было получено 99 первичных животных (F0), из которых 5 особей по результатам ПЦР-анализа ДНК оказались трансгенными.

Анализ волос трансгенных мышей F0, имеющих серую масть, в синем свете люминесцентного микроскопа показал отсутствие различий между спектром флуоресценции этих структур у трансгенных и нетрансгенных особей. Светло-серые волосы имели жёлтую люминесценцию, тёмно-серые -зеленоватую люминесценцию. С целью получения белых трансгенных особей, лишённых пигментации волос, первичные трансгенные мыши (F0) были спарены с белыми нелинейными животными. В дальнейшем мы исследовали волосы только белых мышей, полученных от скрещивания трансгенных сибсов первого поколения между собой или от скрещивания трансгенных и нетрансгенных особей первого поколения друг с другом.

3.2.2. Получение первого и второго поколения трансгенных мышей.

При проведении анализа наследования трансгена Ker-EGFP в первом

поколении первичных трансгенных животных, спаренных с нетрансгенными особями с помощью ГТЦР, нами было обнаружено отклонение фактической частоты наследования трансгена (21** % ± 4,5 %) от теоретически ожидаемой частоты 50 %. При скрещивании трансгенных особей первого поколения с нетрансгенными мышами, частота наследования трансгена у потомков второго поколения (47*** % ± 2,2 %) приближалась к прогнозируемой величине (табл. 5),

Статистическая обработка полученных данных наследования трансгена показала достоверность разности (Р > 0,99) между средней арифметической по доли трансгенных особей в первом поколении и средней арифметической

величиной по доли трансгенных ЬЬобей- во втором поколении первичных трансгенов. •мг^нг/. ч

При сопоставлении эмпиричесс&х и теоретических частот наследования трансгена Кет-Ев РР с помощькЗ? ■'критерия хи-квадрат (х1) отклонения расщепления в опыте от теоретически' Ожидаемого в первом поколении были достоверны (Р < 0,05), а во втором 'поколении были недостоверными и носили случайный характер (Р > 0,05) (см. табл! 5)- !

'./<¡7 л

Таблица 5. Наследование трансгена Кет^ЕСТР в первом и втором

зэ'.'^агп.-и

поколении трансгенных мышеи.

Номер и пол первичной трансген- Количество потомков первого поколения (F1), голов 'lit'i! Доля трансгенных особей в Ф ■■■■ Количество потомков второго поколения (F2), голов Доля трансгенных особей в F2, Л2

ной особи всего трансгенных % Í'.U: ■ ■' всего трансгенных %

780 cí 41 9 21,95--:'« 12,9 41 17 41,46 1,2

750 <? 50 17 34,00?» 51 26 50,98 0,02

161 <? 16 2 12,50 * - - - -

129 9 11 1 9,09 ТО... 38 18 46,31 0,1

177? 8 2 25,00 Н>|' -Г: 12 6 50,00 -

итого 126 31 24,6 Jl '' Jiri,3 142 67 47,18 0,5

~ ¡.i '.i - ■-■'

При спаривании гемизиготньшТ[34ЬК?г«нных сибсов первого поколения друг с другом доля трансгенных жиэотнцх во втором поколении потомков от самца № 780 и самца № 750 составила 86 % и 67,5 % соответственно, что подтверждает мекделевскнй характер наследования трансгена Кег-EG FP у экспериментальных животных.

3.2.3. Анализ экспрессии гена зелёного флуоресцирующего белка Aequorea victoria трансгенных мышей.

Среди 32-х трансгенных белых^мыш^й, полученных во втором поколении экспериментальных особей, у семи Яотойков самца № 780 были обнаружены отдельные ярко светящиеся волосы.*> (рис. 1, а). Спектр и интенсивность флуоресценции этих волос соответствовали оттенку и яркости

фотолюминесценции трансформированных бактерий Escherichia coli, экспрессируюших EGFP, которых мы использовали в качестве эталона флуоресценции EGFP.

При просмотре волос контрольных белых мышей в синем свете люминеснентного микроскопа была выявлена незначительная естественная люминесценция (рис. 1, б), которая существенно отличалась от флуоресценции трансформированных бактерий л ярко светящихся волос транс генных мышей.

Рис, I, Флуоресценция волос бе.пых траисгеачых (а) п белых иетрансгепимх (б) мышей (стрелками опимечены колош с интенсивной зелёной люминесценцией)

а б

При статистической обработке результатов измерений яркости 77 интенсивно флуоресцирующих и 157 слабо светящихся волос у трапе геи пых белых особей (рис. 2) были получены средине арифметические, которые достоверно (Р > 0,999) различались между собой. Эти величины с высокой степенью достоверности (Р > 0,999) превышали среднюю арифметическую но яркости естественной флуоресценции (аутофлуоресцешши) 199 волос контрольных мышей белой масти (рнс. 3).

При использовании зелёного цветового канала компьютерной программы ImagcScope Color интенсивность зелёного спектра флуоресценции слабо флуоресцирующих волос трансгснных по Kcr-EGFP и контрольных белых мышей, а так же ^трансформированных бактерий Escherichia coli была равна нулю (рис. 4, 3). Яркость зелёной флуоресценции трансформированных бактерий (рис. 4, 2) была достоверно (Р > 0,999) меньше интенсивности зелёного спектра флуоресценции волос у трансгенных белых мышей (рис. 4, }), что, вероятно, было обусловлено разными размерами исследованных объектов.

Рис. 2. Вариационные кривые интенсивности флуоресценции волос белых мышей.

35 Т

яркость флуоресщмцни волос (условных «линии) шиангчи распрчспни ч*с*от«яФо непцняп вод*с j трансгеннэй ги> Kct^i/iV Р wj4m ■ ¡тми) <jм ряспреяелмна чмтфт шгкиснано свствшихся вллку tp«»crtH кой а* KfrEG Г1' осой»», нолигон чеетету еиггреиптны*

Рис. 3. Гистограмма яркости флуоресценции трансформированных бактерий Escherichia coli (4), слабо (2) и интенсивно флуоресцирующих (3) волос трансгенной по Ker-EGFP белой особи, волос белых иетрансгенных мышей (I).

дот ISO 160 140

яркость ' -О флуоресценции 100 (условных единиц) go 60 ад 20 О

113 4

И донимаяыкое значение яркости флузрссишсия □ средняя арафметччссхая флупрссие1Гйим

■ максимальное значение ipkocra фяцоресцащня

Рис. 4. Гистограмма интенсивности зелёной флуоресценции (I -волосы трансгепных по Кег-ЕСГР мышей, 2 - трансформированные бактерии, 3 - контроль).

5

Рминкчум в срзднна ¿;>ифие*нчсе гая □максимум

При и м му н отнстох я м и чес ко м окрашивании серии парафиновых срезов кожи четырёх белых взрослых трап с генных особей специфическое связывание моноклопальных антител с антигеном (ЕС И') наблюдалось у трансгенного животного, на участке кожи, имеюшем старые и сменяющие нх ноиые волосы, в корневой части формирующегося волоса. Среди отобранных для и мму но гистохимических исследований трансгапшх животных именно у этой особи при просмотре препаратов волос в синем свете люминесцентного микроскопа были обнаружены экземпляры, имеющие интенсивную зелёную флуоресценцию.

Гены белков промежуточных филаментов кератина млекопитающих активируются в период формирования и роста волос, в функциональных дифференцированных клетках коркового вещества волосяною стержня. При рождении мышата не покрыты шерстью, и волосяной покров начинает формироваться с 4 дня после рождения. Для выявления экспрессии ЕОРР в фолликулах растущих волос трансгенных мышей, мы исследовали парафиновые срезы кожи трансгенных и нетрал стенных особей третьего поколения, полученные на 2, 4 и 6 день после рождения.

В результате проведённого исследования фолликулов растущих волос зелёная флуоресценция и специфическое иммуногистохимическое окрашивание внутри кожной части отдельных волосяных стержней были обнаружены только на срезах кожи, полученных от трансгенных мышат.

Таким образом, интенсивная зелёная флуоресценция отдельных волос, наблюдаемая нами у белых трансгенных мышей, была обусловлена мозаичностью экспрессии EGFP в волосяных фолликулах, что согласуется с полученными результатами по иммуногнстохимическому окрашиванию препаратов кожи трансгенных особей и опубликованными данными по трансгенезу мышей (Keough et al., 1995).

4. ВЫВОДЫ.

1. Ген зелёного флуоресцирующего белка медузы Aequorea victoria (EGFP) является эффективным маркером для селекции трансгенных комнатных мух на эмбриональной стадии развития. Результаты проведённого ПЦР-анализа подтвердили содержание гена EGFP в ДНК особи, отобранной по наличию зелёной флуоресценции на стадии яйца.

2. Отсутствие интеграции экзогенной ДНК у потомков экспериментальных насекомых (Musca domestica L.), микро инъецированных на стадии эмбриона рекомбинантными Р-элементами дрозофилы, указывает на нецелесообразность использования этих транспозонов в качестве векторов генетической трансформации для получения трансгенных комнатных мух.

3. Достоверное отклонение фактического генетического расшеиления трансгена Ker-EGFP (0,8 : 3,2) ст теоретически ожидаемого (1 : 1) у потомков первого поколения трансгенных мышей (Р < 0,05), полученных при спаривании трансгенных и нетрансгенных особей, свидетельствует об избирательном взаимодействии генной конструкции и реципиентных структур подопытных животных.

4. Соответствие эмпирической частоты наследования трансгена Ker-EGFP (47*" % ± 2,2 %) теоретической частоте (50 %) у потомков второго поколения мышей, полученных при спаривании трансгенных н нетрансгенных особей, свидетельствует о моногенном наследовании трансгена у исследованных животных.

5. Достоверное различие между средними арифметическими по яркости флуоресценции интенсивно светящихся волос белых трансгенных особей н

волос белых контрольных мышей: 154*** усл. ед. ± 1,5 усл. ед. и 60**' усл. сд. ± 1,0 усл. ед. соответственно (Р > 0,999), свидетельствует о наличии зелёного флуоресцирующего белка медузы Л. victoria в волосяном покрове трансгенных особей.

6. Обнаруженная тканеснецифичсская экспрессия гена EGFP в дифференцирующихся клетках коркового вещества волос трансгенных мышей подтверждает функциональную активность промотора Кег5 длиной 735 пар нуклеотидов, регулирующего ген белка промежуточных филаментов II типа кератина шерсти овец (К2.10).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Рекомендуем в биотехнологических лабораториях использовать последовательность промотора Ксг5, регулирующего ген белка IF II кератина шерсти овец (К2.10), для создания генно-инженерных конструкций и получения трансгенных млекопитающих, экспрессиругоших рекомбинаигные белки в корковом веществе волос.

2. Для м оле ку лярн о-ге н ети ч ее к их лабораторий рекомендуем с целью оптимизации условий выделения ДНК из насекомых при пер.хлоратном методе экстракции использовать раствор полиэтилен гликоля (24 % ПЭГ-6000, ЗМ NaCI) в качестве осаждающего агента.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Фролкина М.В., Клейко Н.Г., Барм ин пев В.А., Какпаков В .Т., Эрнст J1.K. Анализ ДНК комнатных мух Musca domestica L. мутантной линии curly на содержание экзогенных последоиательиостей // Материалы международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркирование признаков сельскохозяйственных животных»; Всерос. гос. науч.-исслед. ин-т животноводства. - Дубровины. 2001. - С. 121-122.

2. Фролкина М.В., Шихов И.-Я., Зиновьева H.A., Косоруков B.C., Эрнст Л.К. Использование гена зелёного флуоресцирующею белка (GFP) в качестве маркера для получения транстшых комнатных мух Musca domestica L. // Материалы конф. «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». - Быково. Моск. обл., 2001. - Выи, 7, - С. 204-205.

3. Эрнст Л.К., Злочевский Ф.И., Фомичёв Ю.П., Ерастов Г.М., Зиновьева H.A., Багиров В.А., Какпаков В.Т., Фролкина М.В. Энтомологическая переработка органических отходов свиноводства и птицеводства и использование её продуктов в сельском хозяйстве; Всерос, гос. науч.-исслед, ин-т животноводства. - Дубровины, 2004. - 136 с.

4. Покровская М.В., Кадулин С.Г., Лунин В.Г., Шнхов ИЛ., Зиновьева H.A., Эрнст Л.К. Анализ наследования и экспрессии гена зелёного флуоресцирующего белка EGFP Aequorea victoria у трансгепных мышей // Материалы 4-й международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных»; Всерос. гос. науч.-исслед. ин-т животноводства. - Дубровицы, 2004. - С. 8289.

Издательство РУЦ ЭЬТЖ 142132, Московская обл.. Подольский р-н, п. Дубровицы Тел. (8 - 27) 65-14-24, (К - 27) 65-14-07

Слано в набор 16.05.2005. Подписало в печать 16.05.2005 __Заказ Кг 14. Печ л, 1,1. Тираж90 экз