Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности контроля экспрессии генов rpIJL Escherichia coli на уровне трансляции

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Особенности контроля экспрессии генов rpIJL Escherichia coli на уровне трансляции"

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

КРУПСКАЯ Ирина Владимировна

УДК 577.21

ОСОБЕННОСТИ КОНТРОЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ rplJL Escherichia coli НА УРОВНЕ ТРАНСЛЯЦИИ

03.00.03 — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Е. Б. ПАТОН

Киев 1992

Работа, выполнена в отделе структуры к функции нуклеиновых кислот Института молекулярное биологии и генетики АН Украины.

*_Йаучный руководитель: доктор биологических наук

ПАТОН Е.Б.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

член-корреспондент АН Укракки, профессор ЕЛЬСКАЯ'А.В.; доктор биологических наук ПЕРУМОВ Л. А.

Ведущая организация: Институт бноорганическое химна

а нефтехимии АН Украины.

Заката состоится ~ (¿¿> " ¿¿¿¿3^/ ^ggg г часов

на заседании специализированного совета Я 016. II. 01 Института молекулярной биологии в генетика. АН Украины по адресу: 252627 Киев 143, ул. Заболотного. 150.

С диссертацией могно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии и генетика АН Украины.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

1 » 1992 г.

/

ЛУШ JL. Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение механизмов и особенностей регуляции экспрессии генов прокариот является одной из основных задач молекулярной биологии кап в фундаментальном, так и приклад-. ном аспекте. В настоящее время известны многочисленные общие для прокариотических оперонов способы контроля экспрессии генов, осуществляемые на различных уровнях. Шесте с тем, практически любая регуляторная единица имеет свои специфические структурно-функциональные особенности.

Гены, кодирующие синтез рибосомных белгав Е.coli, представляют собой пример достижения максимально высокой экспрессии с помощью природных механизмов. Общим практически для всех рибосомных белков является :*х кластрирование и организация в опероны, которые регулируются по принципу "обратной связи". Гены rplKAJL Е. coli кодируют синтез рибосомных белков LH, LI, LIO и L7/L12. Некоторые особенности регуляции этих генов уже охарактеризованы. Однако целый ряд особенностей до сих пор не ясен и поэтому представляет интерес для исследований. Уникальной чертой экспрессии генов rplJL-оперона является то, что белок L7/L12 (кодируемый геном rplL) синтезируется в клетке и присутствует в рибосоме в 4-кратном молярном избытке по сравнению, с белком LIO (ген rplj) и всеми остальными рибосомнкми белками. Актуальность изучения этого вопроса подтверждается многочисленными исследованиями' последних десяти лет.

На сегодня известны многочисленные факторы, влияющие на эффективность трансляции. Высокая эффективность инициации трансляции может определяться различными факторами. Для матричной РНК рибосомных белков характерна высокая эффективность инициации трансляции. С этой точки 'зрения гены rplJL являются удобной моделью для решения такой актуальной задачи, как изучение детерминант эффективности инициации трансляции и, следовательно, направленной регуляции экспрессии генов.

Таким образом, изучение детерминант высокой эффективности инициации трансляция мРНК риббсомных Селков (в том числе L10 и L7/L12) представляет одну из наиболее актуальных проблем в изучении экспрессии генов прокариот.

Дель исследования. Цель настоящего исследования заключалась в изучении особенностей регуляции экспрессии генов rplJL Е.coli, осуществляемой на уровне трансляции. v

Для выполнения данной работы необходимо было решить следую-, щие задачи:

1. Проанашзиррвать возможные механизмы регуляции неэквимолярного синтеза белкср LIO и L7/L12 in vivo с учетом известных к настоящему времени механизмов у прокариот.

2. Исследовать механизм, контролирующий избыточный синтез белка L7/L12 по сравнению с белком LIO с помощью техники белкового и оперонного слияния генов rplj и rplL с геном lacZ.

3. Создать серию плазмид с белковым и оперонным слиянием для контроля активности генов.

4. Изучить возможность участия антисмысловой РНК в регуляции экспрессии геков rplJL оперона Е.coll.

Б. Изучить влияние контекста сайта инициации трансляции на эффективность экспрессии генов rplj и rplL.

Научная новизна работы. На основе теоретического анализа известных к настоящему времени механизмов контроля экспрессии генов в прокариотических оперонах в данной работе изучалась возможность контроле неэквимолярного синтеза LIO и L7/L12 белков Е. coll на уровне транскрипции, трансляции (инициации и элонгации), а тшае посредством антисмысловой РНК. Доказано, что на уровне транскрипции (с участием PL12) избыточный синтез L12 не обеспечивается.

Впервые установлено, что ингибирование экспрессии гена rplj Е. col1 антисмысловой РНК принципиально возможно. Установлены факторы, влияющие'на эффективность ее действия. Однако доказано, чтс антисенс РНК не обеспечивает менызего уровня экспрессии гена rpl, по сравнению с rplL in vivo. •

Установлено, что инициация трансляции мРНК rplL также ш является более эффективной по сравнению с rplj, т.е. не являете; механизмом, обеспечивающим избыточный синтез белка L12 по сравне нию с LIO. С помощью белкового слияния с lacZ геном получены дай ные о том, что более высокий уровень экспрессии rplL не обеспечи вается более . эффективной инициацией трансляции, а скорее всег обусловлено структурными особенностями ¡¿РЕК и достигается на ста дии элонгации. Центральная область гена rplj по данным компьютер ного анализа содержит три области прочного спаривания. Данные белкового слияния подтверадах», что центральная область мРЮ LlO-оперона, по-видимому, является элементом, регулирую^ экспрессию генов rplJL. Этот вывод подтверждают также результат построения моделей мРНК как нативных, так и гибридных гене rplJL.

При изучении влияния контекста в сайте инициации трансляции на уровень экспрессии генов rplj и rplL получены результаты, свидетельствующие в пользу того, что последний в обоих случаях зависит от наличия области +'4 ... +25 мРНК сайта комплементарности 16S рРНК.

Показано отрицательное влияние на экспрессию гибридного гена lacZ редкого кодона GGG, находящегося вблизи (четвертый) от стартового.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы /129/. Работа изложена на 80 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 11 рисунков.

Апробация. Материалы диссертации докладывались на 5-й Конференции молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии (Пущино, 1988), Школе-конференции " Структура и функции биополимеров" (Киев, 1988), Ш Кубинском и международном семинаре по интерферону, П Кубинском и международном семинаре по биотехнологии, I Латиноамериканском конгрессе по биотехнологии (Гавана, 1989), Конгрессе "Prospects in Protein Engineering" (Гронинген, 1989), Международном симпозиуме "Регуляция трансляции", (Рига, 1939), X Симпозиуме СССР-Франция "Организации и экспрессия генома эукариот и прокариот" (Киев, 1990). Ib материалам диссертации опубликовано 8 статей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение компетентных клеток осуществляли как описано (Manítis et al. 1982)

Трансформация компетентных клеток производилась как описано (Maniatis et al. 1982)

Конструирование рекомбинантных плазмид. Для получения фрагментов rplJL- оперона Е. col i и последующего их клонирования в другие векторы использовали плазмиды pJC703 /Collins, 1979/ и pUC19/rpoB /Патон и др., 1986/. Электрофорез и элюцию ДНК проводили по /Maniatis et al. ,1982/. Реакцию лигирования выделенного фрагмента с вектором в случае тупых концов проводили при 4° С в течение ' 12-16 ч, в случае липких концов - при 20° С в течение 1-2 ч.

При конструировании рекомбинантных ДНК правильность встраивания фрагментов контролировали рестрикционным анализом с учетом

з;

нуклеотйдной последовательности генов rplJL /Post et al. ¿1979/. -Скрининг рекомбинантных плаамид проводили по методу (Blrnboim.Ä Doly, 1970).

Активность f-галактозидааы определяли по методу Миллера /Миллер, 1976/ с незначительными модификациями. Клетки подращивали при -37° С до 0Д-0,6-0,8 o.e. В случае необходимости производили ин-' дукцюо ИПТГ в течение 30 мин. Клетки 1,5 мл осаждали центрифугированием. К осадку добавляли 1 ил Z-буфера, ресуспендировали, добавляли 50 мкл хлороформа и 25 мкл 0,1 Х ДСЕ Тщательно перемешивали для разрушения клеток на гомогенизаторе типа "Vfortex". Добавляли 75 мкл (4 мг/мл) ОНФГ и инкубировали 15 мин при 28-30р С до появления желтого цвета. Реакцию останавливали добавлением 400 та 1 II Na2C03.

Стабильность гибридной ^-гадактозидазы. определяли по методу /Looman et al., 1985/ с некоторыми модификациями. Клетки наращивали до плотности 0Д-0,б-0,8 o.e. Все дальнейшие манипуляции производили как описано в методике по определению активности |?-галак-тозидааы, но перед добавлением ОНФГ проводили следующие: полученные лйзаты клеток инкубировали 2 мин при 420 С, отбирали аликво-ту (200 мкл), к которой добавляли 10 мкл (4 мг/мл) ОНФГ и проводили реакцию при 28-30° С в течение 15 мин, которую в дальнейшем - останавливали 55 мкл 1 U Na2C03, в то время как оставшаяся часть лизата инкубировалась дальше. -Черев 3 (после начала'инкубации) 10, 15 и 20 мин отбирались аликвоты и с ними проделывали те *в. манипуляции, что и после инкубации белка в течение 2 мин..

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Проверка возможности транскрипционного контроля регуляции экспрессии генов rplJL, Применение белкового и оперенного слияния генов rplJL E.ooli с геном lacZ для изучения механизма, обеспечивающего неэквимолярный синтез белков L10 и L7/L12 Е.coli

Для изучения механизмов, регулирующих экспрессию генов rplJL Е. coli мы. обратились к традиционному методу слияния отдельных фрагментов генов с детекторным геном lacZ.

1.1. Оперонное слияние с lacZ геном. Изучение роли PL12 пройотора в обеспечении 4-кратного молярного избытка белка L7/L12

При изучении механизма, контролирующего неэвимолярный синтез белковых продуктов rplJL оперона Е.coll, мы провели теорети ческий анализ и в последствии обратились к экспериментальной проверке нескольких предполагаемых механизмов.

Данные других авторов /An & Friesen, 1980; Railing & Linn, ' 1984/ не позволяли сделать однозначного вывода о роли PL12 промотора Полученные нами экспериментальные данные об одинаковом уровне экспрессии генов rplJ'-lacZ под контролем сильного промотора PL10 и rplL'-lacZ, транскрибируемого с PL12, легли в основу предположения, что на эффективность PL12 могут оказывать- положительное влияние фланкирующие последовательности. Для проверки этого предположения был сконструирован ряд гибридных генов rplL'-lacZ. 8 серии оперонных слияний (плазмидьс pIK8, р1К9, pIKlO, pIK12) (табл.1 и рис. 1) последовательно укорачивали область, лежащую выше промотора PL12. Положительного влияния на эффективность PL12 промотора вышележащей области обнаружено не было.

1.2. Белковое слияниё генов rplj и rplL с геном lacZ

Эксперименты других авторов свидетельствуют о том, что не-зквимолярный синтез L10 И L12 не обусловлен специфической деградацией в бивдстронной мРНК L10-L12 / Downing & Dennis, 1987/, а также высокой по сравнению с L12 /Petersen,1989/ степенью протео-лиза L10 в клетке. .

Исходя из этого мы предполагали, что контроль неэквимолярно-го синтеза контролируется разной эффективностью трансляции МРНК L10 и LI2. Для проверки регуляции на уровне трансляции мы прибег- . ли к методу белкового слияния с lacZ для генов rplj и. rplL. Ш считали, что более высокий уровень экспрессии гибридных генов rplj и rplL можно было бы зарегистрировать путем удлинения слива- . емого с. lac Z 5'-концевого фрагмента, если бы он контролировался неодинаковой эффективностью элонгации трансляции. Равная эффективность сайтов инициации трансляции была бы выявлена при слиянии с laoZ коротких фрагментов, содержащих инициаторную область генов

Таблицам Характеристика рекомбинантных плазмид, обеспечивающих синтез гибридных ^-галактозидаз, созданных на основе рММ481

Рекомби- Ген, Хаоактеоистика встсюенного фрагмента Активность

нантная сли- концевые наличие общая 5' -фраг ^-галакто-

плазмида вае- сайты промотора длина мент зидааы от-

мый с рестрикции (П. 0.) (п. 0.) носительно

1асг р1К7 (7.)

рЖЗ грИ Рзи-Рэи PL12 646 156 100

р1К8 • гр1Ь БтаЬРэи PL12 455 156 99

р1К9 грИ, Асу I-Реи PL12 362 156 101

pIKlO гр1Ь HindiIl-Pstl. PL12 287 156 98

pIK12 гр^ BspRI-BspRI PL12 882 131 101

р1К7 гр1Ь SnaBI-Pstl 190 156 100

р1К21 гр1Ь SnaBI-HlnfI - 302 267 105

р1К4 гри Ecoßl-Pstl PLIO 914 75 150

р1К13 грИ BspRI-Pstl- - 262 75 49

PIK16 гри Fokl-Pstl 106 75 44

р!К5. гри Fokl-Smal - - 297 266 9

PÍK23 гри BspRI-NruI - 325 137 33

р1К22 гри BspRI-Rsal - . 885 198 14

plKll гри BspRI-Smal - 453 266 13

pIK27 ,гРи pIK5+

+(EcoRI-EcoR I) Рц 1344 266 40

р1К28 гри plK5+

• +(EcoRI-EcoR I) 1352 266 6

р1К29 грИ. pIK7+

+(EcoRI-EcoR 1) 1232 156 150

PIK30 грИ, pIK7+ г

+(EcoRl-EooRI) 1232 156 120

DIK31 ГРИ dIK7+( Pstl-Pstr - 400 366 46

а Отклонение для 3-5 независимых измерений не превышало 5 X, что делает замеченную разницу в активности &-галактовидаБЫ достоверной.

rplj и rplL. Результаты белковых слияний представлены в 6

табл. ! и

Рщ ,_

) гр!К

>]К27 ТЖ

ч

>1кгз тж

Ч

гр! А

98 рЖЮ

У и—I—I—I р1К9 99 I . . I р1К8 .

10о 1 , . ] Р1КЗ

1011 I р 1Ш

р,» Р, Рр,, Гр"

р1Кй1—3 ' "

гр! 1 гр! ь ИН Гров \

Р1К231 Р1К22' р1КП

.<49-1 1=1 105

йкгь.юо

рЖК^ 44 -

р1К5 и—,

13!

93

1

¡Гр11/-1ос2. -* V

I Р1К31

Рис. 1. Схема конструирования гибридных генов грП'-1ас2 и

грИ'-1ас2 в плаэмиде рИМ481. Встроенные фрагменты обозначены двойными горизонтальными и вертикальными С по использованным для встраивания сайтам рестрикции ) линиям. Физико-генетическая карта р!чМ481 приведена слева.

рис. 1. Как можно заметить уровень экспрессии генов rplJ'-lacZ в отличие от rplL'-lacZ падал с удлинением 5'-концевого, присоединяемого к lacZ, фрагмента. Слияние коротких фрагментов (р1К13 и р1К7) свидетельствует о том, что преицрцество экспрессии гена rplL не обусловлено большей эффективностью инициации трансляции LI 2 цистрона по сравнению с L10. Падение уровня экспрессии rplJ'-lacZ (pIK13, р1К23, р!К22 и plKll) но сравнению о rplL'-laoZ (р!К7 И р1К21) могло объясняться не только сниманием эффективности трансляции гибридной мРНК rplJ'-lacZ, но и яеспецифическими причинами, которые были проверены в следующих экспериментах. Так, можно было предполагать о неодинаковой стабильности гибридных мРНК генов rplj'-lacZ и rplL'-lacZ. Для исследования этого били изменены сигналы контроля транскрипции: оба гена ставили под контроль промотора Р^,, путем конструирования р1К27 и р1К29. Преимущество уровня экспрессии rplL'-lacZ сохнанилось. Liu проверили также возможность образования перед геном rplL*-lacZ.B результате встраивания дополнительного промотора, которая экспериментами не подтвердилась. Мы убедились,. также, что меньший уровень экспрессии гена rplj не был обусловлен меньшей стабильностью гиб-риднойгалактозидазы, кодируемой геном rplJ'-lacZ. Сравнение стабильности гибридной галактозидазы, кодируемой геном rplJ'-lacZ не было ниже, чем для rplL'-lacZ и, следовательно, не коррелировала с более низким уровнем экспрессии и, следовательно, не является причиной изменения активности кодируемой , гибридной ^галактозидазы (рис. 2,3 ). Была измерена активность гибридных ^-галак- . тозидаз в штаммах JíAOl, TG-1, MCI061 дефектных по гену lacZ, однако отличий не было выявлено.

Сравнение первичной структуры мРНК цистронов L10 и L12 не выявляет преимуществ для L12. Таким образом, более эффективная трансляция его может быть объяснена особенностями вторичной структуры мРНК цистрона L10. Влияние области гена rplj (1791-1984) /Post et al., 1979/ проверялось путем встраивания ее в ген rplL'-lacZ (плазмвда р1К7). Встраивание этого фрагмента привело к снижению активности ^-галактозидазы, кодируемой р1К31 (табл.1, ' рис.1), в 2,2 раза по сравнению с р1К7. Закономерно предполагать, что указанная область гена rplj участвует в регуляции его экспрессии в интактном опероне rplJL Е.coli, дифференцируя уровень синтеза белков L10 и L7/L12. Имеются экспериментальные подтверждения того, что более прочная структура мРНК действительно явилась причиной менее эффективной трансляции на стадии элонгации

Время инкубации ( мин )

Рис.2. Зависимость активности гибридных белков от времени и температуры преинкубации (30 0С). 1- рЕЕН-Б; 2- рЕЕ14-В; 3- р1К7; 4- р1К20; 5~р1К13; б- р1К11; 7- р IК22; 8- К12 К802.

Рис.3. Зависимость активности гибридных белков от времени и температуры пре инкубации (42° С).

1- рЕЕ14-3; 2- рЕЕ14-В; 3- р1К7; 4- р1К20; 5-р1К13; 6- р!К11;. 7- р!К22; 8- К12 К802.

/Silsor» et al., 1986/. Компьютерным анализом были предсказаны три стабильные шпилечные структуры для мРНК Е.coli (I- 1789-1826, It-1804-1905 и Ш- 1965-2033) нумерация нуклеотвдов соответствует /Post et al., 1979/. Две из трех шпилек содержат последовательности Б'-UUCG и 5'-GAAA, которые предают чрезвычайно высокую стабильность спаренному участку / Heus & Pandi, 1991; Varan1 et al., 1991/. Таким образом, можно предположить, что замедление эффективности трансляции гена vrplJ происходит за счет замедления продвижения рибосом по матричной РНК вследствие преодоления аномально прочных участков. Предполагаемая регуляция на уровне трансляции подтверждается филогенетически. Исходя из установленной в нашей лаборатории первичной последовательности гена rplj S. typhimurium и данным моделирования, такие же прочные участки сохраняются для мРНК белка НО.

Таким образом, суммируя результаты слияния с lacZ закономерно предположить, что одним из наиболее вероятных механизмов контроля экспрессии генов rplJL является разная эффективность трансляции. Это связано с наличием структурированного участка в центральной части цистронаЫО. Это позволяет предположить, что, если механизмом дифференциации экспрессии генов rplj и rplL в ин-тактном опероне Е.coli является разная эффективность трансляции, причиной ее могут быть особенности вторичной структуры мРНК. Полученный результат можно было также связывать с возможностью влияния на экспрессию гена rplj антисмысловой РНК. .

• *

2. Изучение возможного механизма посттранскрипционной регуляции неэквимолярного синтеза белков L10 и L7/L12

В последнее время в литературе появляется все большее количество . данных об участии природных антисмыслових РНК в регуляции экспрессии генов in vivo /Inouye, 1988; Cole, Gonore, 1989/. Синтез такой РНК в опероне rplJL Е.coli мог быть природным механизмом, обеспечивающим неэквимолярность синтеза белков L10 и L7/L12. Синтез антисмысловой РНК для rplj с промотора, находящегося во встречном направлении в Lib цистроне, объяснял бы данные белкового слияния - снижение уровня экспрессии гибридного гена rplJ'-laoZ, наблюдаемое при удлинении 5'-конца гена rplj. Мы проверяли возможность влияния антисмысловой РНК на экспрессию ге-' на rplj. Для этого были проведены эксперименты по котрансформации клеток Е.coli JW101 парами плазмид (схема котрансформации приве-

Ю

дена на рис. 4), одна из которых продуцировала антисенс rplJ РНК, а другая содержала репортерный ген rplJ'-lacZ. Сравнивалось действие полноразмерной (плазмида рЕР8) и укороченной с 3'-конца (плазмида pAZ20 ) антисенс РНК В качестве контрольной в экспериментах использовали плазмиду рЕР21, где последовательность rplj явилась "молчащей" вследствие делеции из плазмиды промотора Plac. В качестве детекторной .для анализа экспрессии гена rplj под влиянием антисмысловой РНК были использованы плазмиды р1К4 и р1К13, позволяющие судить об экспрессии тестерного гена rplJ'-lacZ по активности кодируемой им гибридной р-галактовидазы. Длл обеспечения разного количественного соотношения смысловой и антисмысловой rplj РНК варьировали эффективность транскрипции тестерного гена Результаты котрансформации представлены в табл. 2. Показано /Izant, Weintraub, 1984/, что в ряде случаев заметного ингибиро-вания экспрессии гена антисенс-РНК удавалось достичь при ее 100-кратном превосходстве над смысловой. В наших опытах также количественное превосходство синтеза антисмысловой по сравнению со смысловой rplj РНК было обеспечено путем снимания транскрипции мРНК детекторного гена rplJ'-lacZ. Данные о сравнении силы промоторов в кластере генов rplKAJL-rpoBC /An, Frisen, 1980; Railing, Linn, 1984/, а также факт, что Р4 менее эффективен, чем минорный ' Р^ и сравнение эффективности PL10 и f^c помощь^"промотор-детекторной плазмиды pJAC4 показало, что соотношение их силы составляет примерно 100:1. Следовательно, превосходство эффективности транскрипции гена rplJ'-lacZ в р1К4 по сравнению с rplJ'-lacZ в р1К13 теоретически должно было быть примерно 100-кратным. Таким образом, эффект подавления экспрессии гена rplj антисенс РНК юг достигаться лишь при большом количественном превосходстве (100-кратном) антисмысловой РНК гена rplj по сравнению со смысловой. Исходя из этих 'данных для обеспечения регуляции экспрессии в rplJL опероне Е.coll антисенс промотор должен был бы быть сравним по силе со "смысловым" промотором гена rplj - PL10. Путем клонирования фрагментов rplJL оперона Е.coll в промотор-детекторную плазмиду pJAC4 "антисмысловой" промотор в клонированных фрагментах rplJL оперона обнаружен не был. Следовательно, в опероне rplJL отсутствует антиеенс промотор. Поэтому в отношении регуляции не-эквимолярнога синтеза рибосомных белков L10 и L7/L12 можно sa-'ключить, что анисмысловая РНК не является механизмом, снижающим уровень экспрессии гена rpl J в интактном rplJL опероне E.coli и . обеспечивающем, таким образом, избыточный синтез белка L7/L12,

Рио. 4 Физико-генетические карты плазмид, содержащих последовательность гена rplJ в антисенс-оринтации под контролем lac промотора С рЕР8 и pAZ20 ), контрольной плазмиды рЕР21 с "молчащей" последовательностью rplJ и плазмид р!К4 и рШЗ с репортерным геном rplJ'-lacZ.

Т а б л и ц а 2. Влияние плазмид, содержащих анти-rplj последовательности на экспрессию гена rplJ'-lacZ

Плазмидн, введенные Активность А-галакто8идазы (ед. Ыиллера)

в клетки Е.coli +ИПТГ -ипгг

рЕР8 + р1К4 250 240

PAZ20 + р1К4 250 260

рЕР21 + р1К4 280 270

р IК4 300 310

PEP21 - -

PAZ20 - -

PAZ20 + P1K13 . 3 10

рЕР21 + PIK13 31 28

рЖ13 38 35

РЕР21 - — —'

кодируемого дистальныы цистроном мРНК.' '

3. Изучение трансляционного контроля экспрессии генов rplJL, обусловленных контекстом сайтов инициации трансляции их мРНК

ГеЬы рибосомных белков Е.coll, в том числе и rplJL относятся к числу наиболее высокоэкспрессирукщихся, характеризующиеся сильными сайтами инициации трансляции. В связи с этим интерес представляло изучение специфических участков инициации, трансляции - детерминант эффективности трансляции для генов rplJL. Обычно в отношении влияния на эффективность инициации трансляции учитывай?, участок от -20.до +13.. Полученные в последнее время данные позволили значительно углубить наши знания о детерминантах эффективности СИТ. Недавно открыт ряд новых факторов, контролирующих эффективность инициации трансляции, например наличие на мРНК дополнительных сайтов комплементарности 16S ¡pPHK /Gold, 1988; Petersen et al., 1988; Thanaraj and Pandit, 1989/. Штерсен выявляет aa мРНК последовательность в области +4... +26, комплементарную аук-леотидам 1-18 16SPHK. Для rplj - это CUUCAA (+13... +16), для rplL - UCAAA (+18...+22).^

В отношении гена rplj нас интересовало влияние дополнительных детерминант эффективности инициации трансляции в облас.ти +4. ..+25 мРНК, комплементарной нуклеотилчч 1-18 16S рРНК. Для этой цели в плазмиде pNM481 клонировали фрагменты ДНК, содержащие участки инициации трансляции генов rplj и iplL, в результате были получены плаэмиды pEE12-S, рЕ£12-В, pEE14-S, рЕЕ14-В, нуклеотид-ная последовательность фрагментов гибридных генов rplJ'-lacZ изображена на рис.5, а. Экспрессию слитных генов оценивали по^-га-лагсгозидааной активности гибридных болков. Было обнаружено, что в случае плазмид pEE-S экспрессия генов rplJ'-lacZ в 10 раз ниже, чем в случае плазмид рЕЕ-В (табл. 3). (i-галактозидазная активность гибридных белков для pEE-12S, рШ4-В, pEE14-S составила 11,6; 2 и < 0,05 X, соответственно, по сравнению с рЕЕ12-В.

Сравнение уровней экспрессии гибридных генов rplJ'-lacZ по. казало, что в плазмидах, где сайг CUUCAA (+13. ..+18) сохранялся -плазмиды р1К4 с промотором PL10 и р1К13 с промотором Р4, экспрессия генов rplJ'-lacZ была выше, чем у генов, где этот участок отсутствовал - плаэмиды серии рЕЕ.

Известно влияние редких кодоков на экспрессию генов. Гены rplJ'-lacZ, плазмид рЕЕ12-В и рЕЕ14-В, отличаются от геноЕ плазмид pEE12-S и pEE14-S наличием в генах кодона GGQ в положении 4 после инициаторного кодона AUG. Кодой GGG не встречается в генах rplKAJL /Post et al, 1979/ и является редким для Е. coll /Izant, Veintraub, 1984/. Предполагая возможное изменение вторичной структуры 5'-конца гибридной мРНК в результате возникновения кодона GQ3, сравнивались модели вторичной структуры мРНК генов (рис.5, 6(1) и (II) соответственно). Судя по модели, появление GGG кодона не сказалось на спаривании нуклеотидов области SD и инициаторного кодона, что обычно является наиболее важной детер-минантой эффективности СИТ и могло бы оказать существенное влияние на уровень экспрессии генов. В то же время наличие GGG кодона привело к стабилизации вторичной структура Изменение свободной энергии (дб ), обусловленное появлением кодона GGG, составило -5,7 ккал/моль. Структура мРНК это тот ключевой фактор, определяющий эффективность инициации трансляции прокариот. Доказано, что изменение AG на несколько килокаллорий может приводить к 100-кратным отличиям в уровне экспрессии генов /Looman, 1985; de Smit 8с van Duin, 1990/. Исходя из этого, можно рассматривать изменение вторичной структуры мРНК в СИТ в качестве эффекта GGG кодона. Вместе с тем нельзя исключить, что эффект появления GGG кодона

I|.U ЫО«11»и1МШ!Пии ШШ l'i АН |>| и, , ,, ,„ CIA Ui

irtlllWfi!b| .„V-.i r-

(P, ;|( J !« f I ' " ' U ^ " ' "" " <"' ' • «■>• '-Л U. i,

(I', HIH. J---' B"l<u'»'»"i' «»'«M.M

i ■ c и

и с

с с « с

' и г, i! А

А " 1' ' г

г. - с Ь ■ с 0

и С с;

с • С 11 с .

/и - С i, . С

М A lj i. fl U С I L А i Т( И ' If Г ( и

л • с С» \ [ [¡jM, JL«], v ы n*t fJi Г;.л], J.

Рис.б. Нуклеотидная последовательность фрагментов гибридных генов грЦ'-1ао2(А) и модели вторичной структуры участка инициации трансляции мРНК этих генов (Б), образуемых при встраивании в ВашН1-(1) и Бта1-(2) сайты рШ81

Таблица 3. Сравнение уровней экспрессии гибридных генов грЦ' -1асг по активности кодируемых р. -галактозидаз

Рекомбинантная плазмида Промотор гена гри'-1асг Относительная активность р -галактоэидаэы,

pIK4 рио 326

рЕЕ12-В РЦЮ . 100

PEE12-S Р110 12

PIK13 Р4 106

pEEU-B. . Р4 2

PEE14-S Р4 0.05

свяван с изменением уже' самой по себе первичной структуры. Некоторые эксперименты указывают на то, что наличие редких кодонов снижает эффективность трансляции даже на стадии элонгации /Robinson et al., 1084; Bonekanp et al., 1985/. Учитывая это, можно предположить, что, находясь в начале структурной последовательности гена rplJ'-laoZ, редкий кодов GGG может явиться причиной замедления синтеза пептидной цепи вследствие паузы, необходимой для отбора соответствующей иаоакцепторной тРНК. Еще одной причиной снижения экспрессии гена под влиянием GGG цодона может быть ивменение им вторичной структуры мРНК в 6'-концевой области гена rplJ'-laoZ, что более всего вероятно.

Транскрипция гибридных генов rplJ'-laoZ обеспечивалась рав--ными промоторами - сильным PL10 и слабым Р4~ промотором плазмиды pNM46l (рис.б, а) и преимущество экспрессии Генов -"В" по сравнению с -"S" сохранялось при транскрипции как с более слабого, так и с сильного промотора. Это позволяет считать, что меньший уровень экспрессии не связан с более нюкой стабильность» гибридной мРНК в случае pEE14-S-H рЁЕ14-В. Известно, что стабильность гибридных р>-галактозидаз намного ниже, чем у нативной. Учитывая это обстоятельство, мы сравнили стабиль ность(5-галактозидаз, кодируемых рЕЕ12-В, pEE12-S, рЕЕ14-В и pEE14-S. Стабильность всех гибридных ^-галакгоэидаз при 30° С и 42° С была гораздо ниже, чем у нативной, кодируемой хромосомным геном laoZ в штамме E.coli К802 . (рис.2, 3). Стабильность гибридных р-галактозидаз, кодируемых плазмидами pEEl2-S и pEE14-S, оказалась не ниже, а даже выше, чем у кодируемых плазмидами рЕЕ12-В и рЕЕ14-В. Таким образом, больший . уровень экспрессии гибридных генов rplJ'-lacZ, кодируемых рЕЕ12-В и pEEl2-S, не обусловливался равной стабильность» гибридных белков. Для проверки возможного влияния протеолиэа использован пггамм Е.coli lon-/SG20050/, дефектный по Ion протеаге. Протеаза Ion вносит основной вклад в естественную протеолитическую деградацию белков в клетке ELcoli. Использов.ание ion- оггамма в качестве хозяина погашало,, что разный уровень экспрессии генов - "В" и -"S" не связан с протеолитической деградацией гибридных(J-галактозидаз. Кроме того следует отметить, что не было обнаружено влияния на уровень экспрессии гибридных генов rplJ'-lacZ вгаммов-ховяев Е. coli: MCI061, Т61, JMIOI. s .

В отношении гена rplL нас также интересовало влияние допол- . нительных детерминант эффективности инициации трансляции в области +4... +25 мРНК, комплементарной нуклеотидам 1-18 16SpPHK

. ЬИ А«-**''!** "ИТ Л1С «.( /Ал (А! 1Р\ МС АТГ ЦА ООк С17 ССА ОС? /(ГС ТСТ вН АТС (Ж 1*1

(рт ........... " " '' " "

* (■* * АЛАИ1АА 41.5 К 1 НС М ( АЛА 1Л1_<>5 СГГ «иС С1С СГТ

рин а ап* оапгаа м« аг <*.г аал саг гад ^н: мг оа осл сп «хд су; сн сс^сгс стс ст»

АиЛ^ШпИМ11

* . ' * • • > * * 1« II II 11 А* 1« 1<| 1« -

I

и

м К-?

£ ш I •

V I,:* ис^и ее )' • ! .соидши а].

РШ5-»

I /

•«А-и

^ ( О-А

ос

с » А I ииЗА

и сдои. \ _

И ."о

«и

.6 I!

? 8 8 с'

и £

игсс оОс с»

САД А

р и иосив

Рис. б. Первичная структура б'-крнцевьк фрагментов гибридных генов гр!1/ - (а) и модели вторичной структуры участка инициации трансляции мРНК этих генов (б). - '

/Petersen et al. 1988 /. При анализе большого числа генов установлено, что эффективность их уровня экспрессии находится в прямой зависимости от протяженности этого участка.

При сравнении уровней экспрессии гибридных генов rplL'-lacZ (рис.б, а) (4 -галактозидазная активность, кодируемая pEE15-S, составила 6 X относительно рЕЕ15-А, у которой она была равна р1К7. Различный уровень экспрессии генов rplL'-lacZ, как и rplJ'-lacZ, не зависел от штамма-хозяина Е. coll, используемого для поддержания рекомбинантной плазмиды, (Ь-галактозидаза, кодируемая pEE-15S не была менее стабильной по сравнению с рЕЕ15-А. Интересно, что сравнение вторичной структуры мРНК гибридных генов rplL'-lacZ (рис.6, б) не дает оснований для предположения о ее специфическом влиянии на уровень экспрессии генов. В данном случае одинаковыми для обоих генов были не только вторичная структура мРНК, но и вначениеДО. "Исходя из полученных экспериментальных данных логично предполагать, что меньший уровень экспрессии rplL'-lacZ (pEE15-S) обусловлен частичной делецией в нем последовательности UCAAA (+18...+25), т.е. сайта комплементарности 16S рРНК. В этом случае можно полагать, что наличие этого сайта вносит важный вклад в эффективность инициации трансляции и, следовательно, экспрессии гена rplL.

Таким образом можно заключить, что наличие в области от +4 до +25 мРНК как rplj, так и rplL, последовательности, комплементарной 16S рРНК, действительно является одним из детерминант эффективности инициации трансляции для обоих генов.

ВЫВОДЫ

1. Изучение возможных путей регуляции избыточного синтеза белка L7/L12 на уровне транскрипции показал, что: а) 4-кратный избыточный синтез белка L7/L12 по сравнению с L10 не обеспечивается промотором PL12, а также посредством антисмысловой РНК; б) на эффективность PL12 промотора не оказывают позитивного влияния окружающие его последовательности.

2. Впервые установлена принципиальная возможность ингибиро-вания экспрессии гена rplj Е.coll антисмысловой РНК. Установлено, что эффект подавления экспрессии гена rplj антисенс РНК достигается при большом количественном превосходстве (100-кратном) антисмысловой РНК гена rplj по сравнению со смысловой.

3. Проанализированы механизмы, контролируйте неодинаковый уровень экспрессии генов rplJL in vivo. Превосходство уровня экспрессии гена rplL нояет достигаться за счет более эффективной трансляции,цистрона L12 в бицистронной мРНК L10-L12, которая обусловлена более стабильной вторичной структурой «РНК LlO-цист-рона, центральная область которого содермгг 3 прочных участка спаривания. Предполагаемая регуляция на уровне трансляции подтверждается филогенетически. Такие, же прочные участки спаривания сохраняются для мРНК белка L10 S. typhi muri um.

4. Изучено влияние контекста сайта инициации трансляции на эффективность экспрессии генов rplj и rplL. Обнаружена четкая корреляция между высоким уровнем экспрессии генов rplj и rplL и наличием в области +4... +25 их мРНК последовательности комплементарной участку 1-18 16S рРНК. Шказано: а) отрицательное влияние редкого кодона GGG (в контексте сайта инициации трансляции) на уровень экспрессии гена rplj; б) возможность и целесообразность использования рШ-181 для сравнения эффективности сайтов инициации трансляции отдельных генов и преимущества этого вектора по сравнению с обычно используекм/н. ,

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Пат он Е. Б, , Крупская И. R , Живолуп A. It Внутренний прокготор rplJL-оперона Escherichia coll проявляет высокую эффективность в рекомбинантной плазмиде pNM481 // Генетика.- 1989.- Т. 25,

N 1.- С. 154-157.

2. Патон Е. Б. , Крупская И. Е , Живолуп А. Ii Изучение регуляции экспрессии гена rplL Escherichia coli методом слияния с геном lacZ в плазмиде pNM481 // Биополимеры и клетка - 1989.- Т. 5,

N 2. - С. 99-102.

3. Патон Е. В. , Крупская И. В., Живолуп "А. а Возможность клонирования гена регуляторного белка rplJL-оперона Escherichia coli в высококопийной плавмиде pUC обеспечивается конвергентной транскрипцией, инициируемой Plao вектора // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1989. - N 3. - С. 39-43.

4. Крупская И. В., Живолуп A. IL , Патон Е. Б. Конструирование гибридных генов lacZ для изучения механизмов регуляции экспрессии

. генов rplJL оперона Escherichia coli // Биополимеры и клетка. -1990.- Т. б, N 2.- С. 91-100.

5. Крупская И. а', Патон Е. R Влияние редких кодонов в 5'-кон-цевой области на эффективность экспрессии генов rplJ'-laoZ и

rplL'-lacZ // Там же.- 1090.- T.6, H 4.- С. 102-105.

6. ЖиволупА.Е, Крупская И. В., Патон 'Е. Б. Влияние рекомби-канхных плазмид, содержащих антисмысловую последовательность гена rplj Е. coli на экспрессию тестерного rplj'-lacZ // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - H 8. - С. 21-24.

7. Regulatory mechanisms of rplKAJL genes expression / E. B. Pat on, MI. Woodmaska, I.V. Kroupnkaya, A.N. Zhyvoloup // 20th FEBS itoet. : Abstr. - Budapest. 1900.- P. 06.

8. Патон E. Б., Кииолуп A. H. , Крупская И. В. Изучение возможности подавления экспрессии гена rplJL E.coli антисмысловой

РНК // Цитология и генетика. - 1990.- Т.'24, N 6.- С. 25-31.

9. Nucleotide sequence of the rpljl. operon and deduced prlmery structure of the encoded L10 and 1.7/1.12 proteins of Salmonella typhi murium compared to that of Fr.chor ichia coll / A. N. Zhivolo-up, M. I. Woodmaska, l.V. Kroupnknya, E. B. Paton// Nucl. Acids Res. - 1990. V. 18, N 16. - P. V'.; q.

Подп. в печ. 16.04.92. Формат 60x84/16. Бум. офс. й 2. Сфс. печ. Усл.печ.л. 1,16. Усл.кр.-отт. 1,39. Уч.-лзд.л. 0,99. Тираж 100 экз. Зан. 300. Бесплатно.

ИЭС дм. Е.О.Патона. 252650 Щ1ев 5, ГСП, ул. Горького, 69. ПШ ИЭС им. .Е О.Патона. 252650 Киев 5, ГСП, ул. Горького,'69.