Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Повышение стабильности рекомбинантного фага М13, содержащего гены rpiJL-upoBC Е.соll, путем снижения экспрессии встроенных генов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Повышение стабильности рекомбинантного фага М13, содержащего гены rpiJL-upoBC Е.соll, путем снижения экспрессии встроенных генов"

Г6 •'»

од

( г

ОРДЕНА ЛЕНША ТА ОРДЕНА ДРУ1БИ НАРОД Ш НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМIЯ НАУК УКРА1НИ 1НСТИТУТ М0ЛЕКУЛЯРН01 Б10Л0Г11 I ГЕНЕТИКИ

На правах рукопису УДК 677.21

Вудмаска Иар1я 1ван1вна

ВНВЧЕКНЯ ФАКТОР1В, 00 ВПЛНВАОТЬ НА СТАБ1ЛЫПСТЬ РЕКОГ-ЗШШГШ« К0НСТРУКЦ1Й, ЯК1 !ПСТЯТЬ ГЕНИ МР-ОПЕРОНА ЕНТЕР0ВАКТЕР1Й

03.00.03 - молекулярна б!олог1я

АВТОРЕФЕРАТ дисертацП на пошукання вченого ступеня кандидата б!олог!чних наук

Ки1в - 1995

ч

Роботу виконано у в1дд1л! структури та функцН нукле!нових кислот Гнституту молекулярной б!ологП 1 генетики HAH Украйни

Науковий кер1вник: доктор 61оЛог1чних наук б.Б.Патон

0ф1ц1йн1 опоненти: доктор б1олог1чних наук О.П.Соломко член-корреспондент HAH УкраЧни, доктор б1олог1чних наук Б.П.Мацелюх

Ведуча орган1зац!я: КиЧвський Нац1ональний Ун1верситет 1мен1 Тараса Шевченка

Захист дисертацП в1дбудеться _ грудня 1995року о _

годин1 на аас1данн! спец1ад1зовано1 ради Д 016.011.01 по за-хисту дисертац1й на пошукання вченого ступеня кандидата б1оло-г1чних наук при 1нотитут1 молекулярной б1ологП 1 генетики HAH

3 дисертац1ею можна оанайомитися у б!бл1отец!■1нсТитуту мо-лекулярно! б1ологП 1 генетики HAH Укра'1ни.

Украхни ва адресою: 252143, Ки1в-143, вул.Заболотного.150.

Автореферат роз!слано

/К

листопада 1995 року.

Учений секретар с!:ец1ап13овано1 ради, каяд.б1од.наук

Л.Л.Лукаш

АКТУАЛЬНЮТЬ ТЕМИ. Вивчення фактор1в, що визначаоть ста-б1льне п!дтримання в кл!тин1 чужер1дного генетичкого матер!а-лу, сьогодн1 актуальне для фундаментального та прикладного напрямку. 3 . погляду ..фундаментально'! науки íHTepec викликае взаемод1я власного геному кл!тини i чужор!дного генетичного матер1алу, який може змшюватись в результат! uie'í взаемодП. Не дивлячись на великий, об'ем отриманих даних про процеси, пов'язан! з п1дтрималням у кл1тин1 чужор!дного генетичного матер i алу, залежн1сть стаб1льност! рекомб!нант!в в!д впливу продукте, що експресуються, на регуляц1ю генно! експресП в кл1-THHi-xaaH'iHi мае виключно важливе значения для розум!ння цих процес!в. Вивчення причин нестаб!льност1 рекомб!нантних ДНК дозволяе зрозум1ти механ1зми 'роботи штучно сум1сних систем ге-híb та законом1рност! ix експресП, а також допомагае внайти п1дходи до р1шення проблеми нестаб1льност1.

BamiHßicTb фактору стаб!льност1 для прикладного напряму полягае в необх1дност1 забезпечувати п!дтримання експресП у кл1тин! ген1в, що кодують потр1бн! продукти.

Гени, що кодують синтез рибосомних б!лк!в E.coli, е прикладом досягнення гранично високо'1 експресП за допомогою при-родних механ1зм1в. 3 qieí причини вивчення нестаб!льност! • на дан!й модел1 ц1каве для створення систем з високим р!внем експресП необх1дного б1лку. При створен1 таких систем для дося-генння максимальн! експресП проводять злиття к!лькох ген!в, у яких регуляц1я експресП п1дпорядкована. Визначення фактор!в, що забезпечують стаб1льн!сть рекомб!нант!в, як1 м!стять гени rif-оперону, та дослхдження можливост1 п!двищення стаб!льност1 за рахунок введения елемент1в, причетних до експресП, а також вивчення можливост! регуляцП експресП L10 спор!дненого орга-н!зму у кл!тин1 E.coli вбагачуе наш! внання та сприяе розум!н-

юо цього феномену в таких штучно створюваних системах.

3 цього погляду пропонована робота становить науковий 1н-терес.

META I ЗАВЛАННЯ Д0СЛ1ДЖЕННЯ. Основною метою дано! роботи було вивчення вэаемозв'язку mík регуляц1ею експресП ген!в rlf-оперону ентеробактер1й та стаб1льн1стю конструкц1й, що несуть гени цього оперону.

Для досягнення поставлено! мети необх1дно було вир1шити наступн1 вадач1:

1) отримати рекомб1нантн1 конструкцП,як1 несуть фрагмент кластера rplA'JL-rpoBC оперону E.coli.

2) модиф1кувати отриман! рекомб1нанти введениям елемент1в генетичного регуляторного оточення та забезпеченням вар!ювання piBHiB експресП;

3) 180лювати ген rplJ Salmonella typhimurium та отримати рекомб1нанти,що несуть ген rplJ S.typhimurium;

4) вивчити можлив1сть перехресно! регуляцП експресП м1ж двома спор1дненими бактер1ями - E.coli та S.typhimurium.

НАУКОВА НОВИЗНА РОБОТИ. В дан1й робот1 отриман1 рекомб1-нантн1 конструкцП, як1 м!стять гени rif-оперона E.coli та досл1джен1 фактори, що впливають на стаб1льне п1дтримання цих рекомб!нант1в. Доведено, що нестаб1льн!сть рекомб!нантних молекул б касл!дком високого р1вня експресП гену rplJ E.coli.

Шляхом введения у кл1тини додаткових коп!й ген1в кластера rplA'JL вперие влечено 8в'явок м1ж "дозою ген1в" кластера rplA'JL та р1внем негативного впливу П на життездатн1сть нормально кл1тин E.coli.

Вперше клоновано ген rplJ S.typhimurium, що кодуе регуля-торноздатний б1лок L10. Встановдено, що регуляторноздатний 61-лок LIO S.typhimurium подавляв експрес1ю ген1в rplJL E.coli та

2

збереження регулятормо'1 функцП зумовлене високою гомолог1ею б1лк!в L10 Е.coll,та S.typhlmurlum. Проведене визначення пер-винно! структури гену rplJ S.typhlmurlum та проведений пор1в-няльний анал1з ам1нокислотно'£ посл1довност1 регуляторноздатно-го б1лку L10.

СТРУКТУРА I ОБ'бМ РОБОТИ. Дисертац1ю викладено на стор.130. машинописного тексту. Бона складаеться з встуну, ог-ляду л1тератури, методично! частини, опису результата та 1х обговорення 1 висновк1в. Роботу 1люстровано 15 рисунками 1 4 таблицями. Список цитовано! л1тератури м1стить 132 джерела.

АПР0БАЦ1Я. Матер1али дисертацП допов1дались на IUMS Congress: Bacteriology and Mycology (Осака, 1990), на м1кна-родн1й. пам'ят1 Х.Г.В1тмана, конференцП по трансляц1йному апарату (Берл1н,1992). За матер1алами дисертацП опубл1ковано 10 статей.

3MICT РОБОТИ

МАТЕРIАЛИ ТА МЕТОДИ. Bel використан1 у робот1 ферменти виробництва НВО "Ферментас", В1льнюс. Ферментативн! реакц11 проводили за рекомендац1ями та у буферних розчинах виробника. Отримання компетентних кл1тин E.coll та 1х трансформац1ю проводили. як описано у (Nashlmura et al.. 1990), визначення бета* галактозидазно! активност1 виконували sa методикою (М1л-лер,1976), плазм1дну ДНК для секвенування вид Шли як описано у (Saunders and Burke, 1990), реакцП секвенування виконува-лись, вц1лому, зг1дно 1нструкц11 набору "Т7 Сиквенс", НПО "Ферментас", Литва. Приготування, електрофорев, обробку та ви-сушування секвенсового бХ-ного розклиненого гелю виконували, зПдно 1нструкцП виробника. на прилад1 Macrophor Seguenclng System (ЬКВ.ШвеЩя).

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ÏX ОБГОВОРЕННЯ Для клонування гену гроВ в-субодиниц1 РНК-пол!мерази coll обрали ген гроВ з дом1нантною мутаШею ст1йкост1 до pi-фамп1цину, гроВЗ, що м!стився у фагов! Xrifdl8 та в сконстру-йован!й Д.Колл1нсом косм!д1 pJC703 (Collins J..1979) i який e частиною оперону, що м1стить гени рибосомних бЬчкЛв rplJ, rplL та частику гену rplA' ( вони в!дпов1дно кодують б1лки L10, L7/L12 та L1), а також гени гроВ та частково гек гроС', що кодують в- та В'-субодиниц! РНК-пол1мерази E.coll. Транскрипц1я вказаних ген!в спрямовуеться сильним промотором Pj (Рыо )•

Шсля анал1зу рекомб!нантних ДНК з р1фамп iцинст1йких кло-н1в виявилось, що ус! вони мЮтять клонований фрагмент лише в одн!й ор1ентац11; при як1й напрямок транскрипцП, що 1н1ц1-юеться з фагового промотору Piac та власного промотору клоно-ванбго фрагменту Рыо. однаковий (рис.1). При повтори!й транс-формацП кл!тин такими рекомб!нантами лше 65% колон1й були ст1йкими до р1фамп!цику, тобто, рекомб1нанти були нестаб1льни-ми.

Rtf'&îSï

, Ht "H;

- и fr-

Рис.1. Схема конструюгання рекомб1нантних Фаг1в на основ 1 М13 та фрагменту rplA'JL-rpcûC ДНК E.coli. У в1дсотках вкаэана стаб1льн1сть таких реком31нантних конструкШй.

Обидва виявлен! в робот! факти - ! однонаправлена ор!ен-тац!я фрагмента в рекомб1наь1'них фагах, 1 нестаб!льн!сть

rifr-03HaKH в них - вимагали встановити причину цих явищ, що дозволило б отримати стаб!льн1 рекомб!нанти необх1дн! для функц1ональних досл1джень.

В1домо, що клонування сильних промотор1в пов'язане з пев-ними труднощами; тому можна припустити, що одн!ею з причин, що викликае однонаправлену ор1ентац!ю клонованого фрагмента в ре-комб1нантних молекулах, е несприятливе для фагового генома по-еднання двох сильних однонаправлених промотор1в Piac та Pj, як! зумовлюють транскриптю в одному 1 тому ж напрямку.При де-лецп промотора Piac нам вдалось п1двшцити стаб1льн1сть реком-б!нантних фаг1в. Виявилось, що поеднання двох однонаправлених промотор^, HKi забезпечують високий р1вень експресП клонова-HOÍ ДНК, д1йсно несприятливо впливае на стаб!льн1сть рекомб1-нантних молекул. Це явище могли обумовити як занадто високий р1вень транскрипцП ген1в, що м1стяться у клонсваному фрагмен-Ti, так i iHnii нерозп1знан! фактори. В1домо, що одн1ею з причин нестаб!льност1 рекомб1нантно! ДНК може бути п1двищений pl-вень експресП чужор1дних ген1в (Бельков В.В.,1983). У випадку ген1в rplJL-rpoBC оперона E.coli в1домо, що в кл!тинах E.coli надпродукц!я як В-субодиниц1 РНК-пол1мерази, так 1 рибосомного б!лку L7/L12, який кодуеться генами гроВ та rplL в!дпов1дно, ц!лком можлива та не справляе негативного впливу на Ix життез-датн1сть (Zengel J.M. & Lindhai L.,1991). Щодо рибосомного б1лка L10, кодованого геном rplJ, навпаки, показано, що п1дви-щення його продукцП в кл1тинах E.coli блокуе синтез б1лка L7/L12, кодованого хромосомним геном rplL, та порушуе складан-ня рибосом, що е летальним для кл1тин (Zéngel J.M. & Lindahl L., 1993). 0ск1льки досл!джуваний фрагмент м!стив обидва гени rplL та rplJ 1, таким чином, синтез 61лк1в L7/L12 та LIO проходив узгоджено, ми припускали, що п1двищена експрес!й обох

ген1в може зумовловатись порушенням узгодженсн експресП даних ген!в 8 1ншими (хромосомними) генами/оперонами E.coli. Знизйти eKcnpeciio клоновансн ДНК мокна Ебудувавши сильний терм1натор транскрипцП п!сля Piac. Вибираючи терм i натори, ми скористува-лись.. такими, в1д яких очйсували високо'1 ефективност! In vivo. Як виявилось вставка терм!натор1в tB' та t0op д!йсно блокуе транскрипц1ю 1н1ц1йовану з промотора вектора;це дало змогу зб1льшити CTaôiJibHicTb рекомб!нант1в (рис.1).

3 викладеного вице випливае, що при клонувалHi фрагменту кластера ген!в rplA'JL-rpoBC' оперону E.coli в фагах М13 цей фрагмент клонуеться в единiй ор!ентацП таким чином, що напря-мок транскрипцП 8 промотор!в Pj (фрагменту) та lac (вектору) однонаправлекий. Так1 рекомб1нанти виявились нестаб!льними; одн!ею з причин такоЧ нecтaбiльнocтi, очевидно, е високий pi-вень експресП клонованого фрагмента ДНК, що забезпечуеться транскрипц!ю в одному напрямку з npoMOTopíB Pj та Рьас-

Ми досл!дили можлив!сть та ефективн1сть клонування в пдазы!дах з р!зною коп1йн1стю, коли piBHi окспресП клонованих ген!в вар1юють;було використано малокоп!йну pHSQ4l5 (3-5 ко-п!й/кл!тину), середньокоп!йну pBR322 (19-26 коп1й/кл1тину) та мультикоп1йну pUClS (155-175 коп1й/кл1тину) плазм1ди. Клонування проводили так само як у випадку фагових вектор!в.

Анал1з рекомб!нантних плазм!д на ochobí pHSG4l5 та pBR322 показав, що обидв1 плазм1ди можуть включати даний фрагмент в обох ор1ентац!ях. Виявилось, що так1 рекомб!нанти стаб!льн1.

При рестрикц!йному aHanisi рекомб1нант1в на основ! муль-тикоп1йно! плазм!ди pUC19 показано, що даний фрагмент вбуду-вався в един1й ор!ентац11; таким чином, що Pj 1н1ц1юе транскрипцП у эустр1чному напрямку (рис.2). Така ор!ентад1я проти-лежна ор!ентац11 . його в рекомб!нантних фагах. Причини цього

були не зрозум1лими. Як 1 у випадку перших обох рекомб1нантних плазм1д, рекомб1нанти на ochobI pUC були стаб1льн1.

0дн1ею з можливих причин едино!. але протилежноК ор1ента-цП фрагменту при клонуванн1 його у плазм1д1 pUC та фагах MÎ3, таким чином, може бути летальн1сть самих клонованих ген1в.

Беручи до уваги ц1 результата, ми клонували окремо гени. шр входять до складу фрагменту rplA'JL-rpoBC оперону E.coli. Для цього розбили даний фрагмент на субфрагменти, що включають структурн! частини ген1в rplJL, rplJ та rpIL в промоторами, як1 направляють ïx транскрипц1ю. Схема отримання таких реком-б1нантних плазм1д представлена на рис.2.

tx

frfcoЩ-f р JC 703

О Mtr.11 (Ae»IJ

♦ Hinlll(NUIli)

♦ HlrdHI О Pitt ■ Ec°97I 4 S«l

4 Tlhlä«

fr Oral

♦ t11»' В Soll

О Cco47M

• EcolOÎI(sr«ei)

Рис.2. Схема конетруювання рекомб1нантних плазм1д на основ! pUC та Фрагментов rplAJL ген1в E.coli. Жирною горизонтальною стрiлкою показана едино можливз ор1ентац1я клонованих ген!в.

При клонуваш! гену rpIL 8 власним промотором нам вдалось

отримати рекомб1нанти, що м!стили його в обох ор!ентац!ях. Ми переконались в тому, що експрес1я ген!в rplL не впливае негативно на життездатн1стЬ нормальних кл!тин E.coll нав1ть при надекспресП продукту цього гену за умов пря>ю'1 його ор!ента-цП.

Клонування гену rplJ в власним промотором Pli о в плазмШ pUC можливе т!льки в одн1й ор!ентацП, коли транскрипц1i , 1н1ц!йован1 в промотора вставки та. вектора, е зустр1чними (рЕР20). Клонування самого гену rplJ також можливе т1льки в одн1й ор1ентацП (рЕР8). Обидв! плазм!ди негативно впливади на життеадатн!сть кл!тин. Ймов!рно, що клонування гену rplJ в ор!ентацП, коли транскрипц1я однонаправлено !н!ц1йована з обох npoMOTopiB, неможливе, бо експрес1я цього гену п!двишу-еться в результат! додатково! транскрипцП з б!льш сильного промотору Piac, ефективн1шого за Plio в 3-4 рази. Якщо усунути промотор вектора Piac, то клонувати даний фрагмент неможливо. Це можна нояснити двома причинами: або зб!льшення дози ген!в на порядок в пор!внянн! з pBR322 мае летальний ефект, або транскрипщя s npoMOTopiB Piac та Pli о в зустр1чн!й opieHTam'i !н!ц!юе антисенсРНК, яка внижуе експресш клонованих ген1в.

Щоб встановити принципову можливость гальмування експре-сП гену rplJ антисмисловою РНК, використали котрансформац!ю Kaiтин E.coll парами плазм!д; одна з них мала п1д контролем lac- промотора антисмислову посл1довн!сть гену rplJ, друга ж метила детекторний ген rplJ'-lacZ. Причиною гальмування екс-npeciï гену його антисмислоьоюРНК на р!вн! трансляцП е утво-рення дупж-ксу смислового та антисмислового ланцюг1в РНК 8 ьтярненням в нього облает! 1н!ц!яцП трансляцП, який блокуе транрляц!» смислсвоЧ РНК (Green P.J; et al., 1986)). В1домо,

) APOlac — rplJ — puce V

fW

[POtae > — rpt J — pUC19 \

) lPOte£j>ljL_j pUCIO \ pAZ>20

шж.

glj'-tacZ—piK4

JgtJ-taeZ^V piK13

Рис.3.Схема ®рагмент1в плазм1Д; що м1стять посл1довнють гену_ rplJ в антисенс-ор1ентац11 п1д контролем lac промотора (рЕР8~ та PAZ20). контрольно! плаэм1ди' рЕР21 з "мовчазною" посл1-довн1стю та плазм1д pIK4 1 р1К1Э з репортерним геном rplJ'-lacZ.

Таблиця1

Вплив плазм1д. як! м1стять анти-грЫ-посл1довн1сть на експрес1ю гену rplJ'-lacZ

• I АктивнЮть З-галактозидази

Плазм1ди '

(од.М1ллера)

РЕР8

PAZ20

рЕР21

РЕР21

PAZ20

рЕР8

PAZ20

PËP21

р1К4 р1К4 PIK4 р!К4

PIK13 PIK13 рШЗ PIK13

250 250 280 300

26 3 Э1

за

що для направленого пригн1чення експресП ген1в найкраще ско-ристатись невеликими (порядку 100 нуклеотид1в) антисенс-РНК. Разом з тим описан1 випадки б1лыю! ефективност1 повнорозм1р-HOÏ антисмислово! РНК або 3'-к1нцево1 д1лянки гену (Takayama K.M.-et al..1987). Схема котрансформацП приведена на рис.3.

На ochobI рЕР8, що продукуе антисмислову rplJ РНК (рис.2), сконструювали плазм1ду pAZ20, де п1д контролем Piac транскрибувалась в антисмислов1й ор!ентацП 72 п.о. структурно! посл1довност1 гену rplJ. За контроль правила рекомб!нантна плазм1да рЕР21, яка завдяки делецП промотору lac м!стить "мовчазну" повну структурну посл1довн1сть rplJ, 1 не може,таким чином, служити продуцентом антисмислово! мРНК rplJ. Для виявлення експресП гену rplJ п1д впливом антисмислово'1 РНК використовувади плазм1ди р1К4 та р1К13, як1 дозволили судити про експрес!ю тестерного гену rplJ'-lacZ за активности о-га-лактозидааи, що кодуеться ним (Крупская И.В.и др.,1990). Щоб еабезпечити однакове к1льк1сне сп1вв1дношення смислово! та ан-тисмислово! rplJ РНК, вар1ювали ефективн1сть транскрипц!ï тестерного гену. Так, у плазм1д1 р1К4 транскрипц1я гену rplJ'-lacZ направляеться власним промотором Рыо. який в 1,5 рази перевищуе повн1стю 1ндукований Piac, а у плазмШ р1К13 -промотором Ра, на 2 порядки слабшим за Рыо- Як видно з табли-ц1 1 отриман1 експериментальн1 дан1 дають можлив1сть припусти-ти мсшшве гальмування експресП гену rplJ п1д д1ею його ан-тиомислово! РНК. При цьому 72 п.о. б'-к1нцево! посл1довност1 антисенс-РНК суттев1ше знижуе експрес1ю гену rplJ, н1ж його повнорозм1рна антисенс-РНК.

Отже, в описаного вида виходить, шр токс:1Чн1сть високого р1вня б1лкового синтезу, кодованого повним опероном rplJL, вкзначааться геном rplJ. Тому клонування в плазм1д1 plie фраг-

мент!в, як1 м1стять повн1 оперони rplJL, можливо у еднн1й opl-ентацП, коли експрес1я ген1в, що м1стяться у них знижуеться завдяки конвергентн1й транскрипцП, 1н1ц1йован1й Piac вектора. Це св1дчить про складну взаеморегуляц1ю цього оперону з 1ншими генами (оперонами) E.coli.

Зб1льшення коп1йност1 в ревультат1 введения ген1в в кл1-тину у склад1 рекомб1нантних плазм1д дае можлив1сть спостер1-гати ефект певно! !х дози.

Було ц!каво встановити чи 1снуе р1вень п!двищення, при якому дози ген1в повного оперону rplJL E.coli починають негативно впливати на нормальн! кл1тини E.coli. Клонування ген1в повного оперону rplJL E.coli показало, що п1двищення 1> дози, забезпечуване високою коп1йн1стю вектора pUC, производить до летачьних насл1дк1в. Про негативний вилив зб1льшення в нср-мальних кл!тинах E.coli дози ген!в повного rplJL-onepoiiy св!д-чать i особливост1 клонування цих ген1в у фагах на основ! М13. Клонування цього фрагменту ДКК виявилось можливим у фагах в един!й ор1ентацП, коли, на противагу pUC, напрям транскрипцП с Piас М13 сп1впадае в напрямком транскрипцП клонованих ген1в з промотору Pliо. В даному випадку, ймов1рно, причиною едино можливо'1 ор1ентацГ1 ДНК-вставки у вс1х рекомб!нантних фагах було те, що клонування сильного промотора Pli о в альтергатив-н!й ор1ентацП привело б до 1н1ц1ацП транскрипцП "o'rl" область фаг!в 1 до вагибел! остан1х.

Як вказувалось вище, при клонувани! даного фрагменту оперону в плазм!дах 8 низкою (pHSG415) та середньою (pBR322) ко-п1йн1стю ми не спостер!гали будь-яких негативних явищ. Вико-ристання вектора э б1льшою коп1йн1стю - pUC - показало, що п!двищення експресП завдяки 1ндукцП Piac у вс!х рекомб1нант-них плазм1дах ДНК-вставка клонуеться т1лъки в ор1ентацП, lipoid

тилежн1й напрямков1 1ас-промотора вектора. При делец!1 промотору вектора клонування даного фрагменту в плазмШ стае не-можливим. Цей факт вказуе, що п1двищення дози ген1в rplJL, зу-мовлене б1льшою коп1йн1стю вектора (приблизно у 8 раз!в pUC пор1внянн1 8 pBR322), виявляеться летальним. Можлив1сть клонування Бабезпечувалась синтезом 8 lac-промотору антисенс РНК,. яка внижувала експрес1ю клонованих ген1в.

Кластер ген1в rplKAJL у ентеробактер1й висококонсерватив-ний sa своею структурно-функц1ональною орган!зац1ею (Tlttawel-la I.P.B., 1984). Для б1лка L1 ентеробактер1й показана можли-BicTb регулювати експрес!ю ген1в rplKA оперону E.coll (Sor F. & Nomura M.. 1987). Нас ц1кавило, чи може б1лок LIO S.typhlmu-rlum эд1йсюовати трансляц1йну penpeccln ген1в rplJL оперону E.coll. Якщо б це Оуло так, то пор1вняти первинну структуру консервативних областей ген!в та 01лк1в, кодованих цими генами. Клонування гену rplJ S.typhlmurium в плазм1ду рис було можливим лише в един1й ор1ентац1!, протилежн1й Piac- Як 1 плазм1ди рЕР20 8 геном rplJ E.coll, pMWl2 негативно впливала на життед1яльн1сть нормальних кл1тин E.coll JM101 та стаб1льно п1дтримувалась в мутантному штам! JF3029. Використовуючи му-тантний штам E.coll JF3029, ми намагались отримати рекомб1нан-ти, як1 б м1стили фрагмент PLio-rplJ S.typhlmurlum в альтернативна ор1ентац1!. За допомогою цього штаму ми вмогли отримати плавм1ду (рШ12-1), под1бну плаам1д1 в геном rplJ E.coll (рЕР20-1). Однак плагм1да pMW12-i, як 1 рЕР20-1, характеризу-валась эниженням коп1йност1 та швидко ел1м1нувала з кл1тин. Отже, неаначне п1двищеиня р1вня експресП rplJ S.typhlmurlum еа рахунок додатково! участ! в транскрипцП гену rplJ промотору Piac при спонтанному, не1ндукованому р1вн1 транскрипцП ви-явилось критичним. Не св1дчило про можливост! регуляцП ген!в

rplJL E.coll б1лком LIO S.typhlmurium. Негативна д!я високого р1вня експресП гену грИ S.typhimurium св1дчить про здатн1сть цього гетеролог1чного б1лка регулювати експрес1ю ген!в rplJL оперону E.coll. Функц1ональна активн1сть б1лка L10 S.typhimurium в E.coll вумовлена високою консервативн!стю його первинно! структури та в1дпов1дно вторинно! структури, необ-х1дно! для взаемодП з л!дерною посл1довн1стю-м1шенню мРНК L10-L7/L12.

Пор1вняння нуклеотидно! посл1довност1 структурно! област1 гену; rplJ S.typhimurium виявило зам1ни в пор1внянн! з гомоло-Пчним геном E.coll в кодонач С6С45 -> CQT, CGÎ6i-> CGC. GCT110 ->GCA, CGT152 ->CGC, ACTi53">ACA, GCGi6O->GCA. ЯК1 He приводить до зам1ни ам!нокислот (рис.4). В!дм!нност1 в ген1 rplJ S.typhlmurlujn в пор1внянн! з E.coll, що призводять до ам1нокислотних 8ам1н, спостер!гались лише по кодснах ест62->бтс. CCG67->CAG, GCA74 -»ACQ. При зам1нах ам1нокислот Ala62->Val, Pro67->Sln, Ala74->Thr, отже, збер!гаеться здат-HicTb LIO б!лка S.typhimurium взаемод!яти з посл1довн!стю-м1-шенню на мРНК E.coll та гальмувати експрес!ю ген!в rplJL' оперону E.coll.

Виявивши спроможн!сть б1лка LIO s.typhimurium пригн1чува-ти експресс1ю ген!в rplJL E.coll. було ц1каво зробити к1льк!с-ну пор1вняльну оц1нку регуляторно! 8датност1 таких б1лк1в In vivo. К1льк1сна оц1нка регуляторно! 8датност1 б!лк1в L10 8 р1зними первинними структурами проводилась шляхом введения в мутантн1 кл1тини E.coll пар пла8м!д,одна 8 яких продукув L10, друга м!стить репортерний ген rplJ'lacZ', р1вень експресП якого-давав можлив1сть оц1нювати регуляторну ефективн!сть 61л-ка LIO. Сайт взаемодП з L10 внаходиться в л1дерн1й област1 мРНК L10-L12, тому репортерний ген rplJ'-LacZ для тестуваняя

I.Coli C5CCtCCGICGAAGACCGCA«HGTTTCGCiAGmCTIUKCCCICCGTAGilCGG!GACAG.UCCCTAAGA?IAITCTTTλTAHC!CCCÎIiTT!CTCCT S.typtimrlM ......................C--C........GG..........................................d.......С.................

CACCGTAATTAAGACGCTCTCTCCGTTTGGACGAGTGAAGTGAGTTCCAGAGATITTCT CTGGCAAACATCCAGGAGCAAAGCTA ......i.............ICI—GA--T................G--ACA-GAG-T-C........................

I.COll ATG GCI TIA AAI CTI CAA GAC AAA CAA GCG AU GIT GCT GAA GTC AGC GAA GTA GCC AAA GGC GCG CTG TCI GCA GIA

S.tipMiurliu ..............................................................................

1 10 20 I.COll KALlilQDIQAIVAlVSIVilGALSAV J.tjphliurlu» . - ........................

GTT GCG UT TCC CGT GGC GTA ACT GTA GAT AAA ATG ACT GAA CTG CGT AAA GCA GGT CGC GAA GCT GGC GTA TAC ATG CGT GTT GTT CGT

...........................................................T..............................

30 10 so

VAPSIG.VTVD INTllltAGIIAGVTKSVVl

MC ACC CTG CTG CGC CGT GCT GIT GAA GGT ACT CCG TIC GAG TGC CIG AAA GAC GCG til GTT GGI CCG ACC CTG ATI GCA TAC TCT ATG

to К T I. L t E A V t G T P 10 Г t С L 1 0 A !0 I V G P T I 1 A t S К

GAA CAC CCG GGC GCÎ GCT GCT CGT CTG TTC AAA GAG TTC GCG AAA GCG AAT GCA AAA TTT GAG GTC AAA GCC GCT GCC ITT GAA GGT GAS

.......................................................................I -A...............

)0 ICC 110

IH-'GAAARLIKIFAlAliAirGVIAAAFtG!

CTG АТС CCG GCG ICI CAG АТС M CGC CIG GCA ACT CTG CCG ACC TAC GAA GAA GCA ATT GCA CGC CTG ATG GCA ACC ATI AU GAA GCT

120 130 HO

I I t A S g I D I l A T l P T T I E A I A t L К A T К l i A ■

TCG GCI GGC AAA CIG GTT CGT ACT CTG GCT GCT GTA CGC GAT GCG AAA GAA GCT GCI TAA TCGCAGTTATCTTTTTAACGCATTCGCITACGTATAAK

150 160

3 i G « L V I T I A A V J О A I 1 A A

Рис.4. rioptBUHHHfl нуклеотидио1 лосл1довност! гену rplJ та дндукоиано! a.к. поел iдовноси б^лку LIO E.coli (Post J. et al..1S79) ia S.typhtmurlum.

регудяторно! адатностх б!лк!в LIO сконструювали 1з збереженням пряно'! дцдернсЛ пог'адовност!. Конструювання pAZ102 та плаа-MÍA, використаних для котрансформацП з pAZl02, схематично аобрэденх на рис.й. 11ла&м1да рЕР20 кодуе синтез нативного 61л-

ка LIO E.coll, pEP15 кодуе синтеэ б1лка LIO E.coli з делец1яо 20 С-к1нцевих ам1нокислотних залишк1в. а рЕР22 направляв синтез б1лка LIÓ Е.С011 в мутац1ею Lysi43Glui44->Gln, тод1 як плазм1да pMW12 кодуе нативний б1лок LIO S.typhlmurlum. Показа--но, що б1лков1 LIO, кодованому плазм1дою рЕР22. не притаманна регуляторна здатн1сть (Патон Е.В., 1989), тому дану плазм1ду використали як контроль. Вплив р1зних б1лк1в L10 на експрес1ю репортерного гену оц1нювали за активноетю кодовано! в-галакто-зидази, яку вим!рювали за методом Щллера.

Шс показало пор1вняння (таблиця 2), найб1льший гальм1вний вплив притаманний нативному LIO E.coll, що кодуеться плазм1дою рЕР20. Регуляторна активн!сть б1лку LIO E.coll з делещею 20 С-к1нцевих ам1нокислотних залишк1в була нижчою, н1ж у нативно-го б1лка LIO E.coli, однак вища, н1ж у нативного б1лка L10 S.typhlmurlum. Дуже ц1каво, що присутн1сть контрольно! плавм1-ди рЕР22 (без регуляторно! активност1) п1двищувала р1вень екс-npecil репортерного гену. Найб1льш ймов!рним пояснениям цього може бути 1нтерференц1я мутантого б1лку L10 з гомолог1чним б1лком, пю м!ститься в кл1тин1. Лог1чно вважати, що нативний L10, кодований хромосомним геном кл1тини-хазя1на, дещо пригн1-чуе експрес1ю репортерного гену. Показано, що комплекс 8 L7/L12. стабШзуе- L10. зб1льшуючи його регуляторну 8датн1сть (Petersen С., 1990). Для комплексоутворення 8 L7/L12 необх1д-ний С-к1нець, збережений у б1лка, кодованого рЕР22. Мутантний б!лок L10, синтезований у велик1й к1лькост! з рЕР22 , очевидно. в1дтитровуе L7/L12 з комплексу 8 нативним б1лком 1 в такий спос1б внижуе стаб1льн1сть останнього та його 1нг1буючий вплиз на експрес1ю репортерного гена. К1льк1сна оц1нка показала меныву ефективн1сть LIO S.typhlmurlum в пор1внянн! з його аналогом з E.coli. МожлИво, що L10 б1лок S.typhlmurlum меньш спо-

р»<|

,ЕР20 !

ЕсоШ ВаШ Ри(|

Рис.5.Схематична зображення плазмхд. виксристаних для котранс-ФормацП: плазм1ди э генами грЫ (а); схема отримання плазм¡дн рАг102 з репортерним геном грЫ'-1ас2 (б).

Таблица 2.

Пор1вняння експрвсП репортерного гену гри'-1ас2 в присутност 1 плазм1д з генами грЫ.

Плазм1ди

В1дносна активн!стъ

Зталактозидази. %

рдгюг рА2102+рЕР20 р/Ш02+рЕР15 рАг102+рШ12 'РА2102+РЕР22

100.0 33.9 37.9 47.5 111.9

ЛриШтка. середпе квадратична в1дхилення не перевищувало 5%

р!днений з гетеролоПчним сайтом м!шеи1, який в!др1знявться за первинною та редукованою вторинною структурою.

ВИСНОВКИ

1. Отримано cepira рекомб!нантних конструкц!й, як1 м!стять гени rplA'JL-rpoBC оперону E.coli та S.typhimuriurrv.

2. Виявлено, що клонування ген1в rplJL E.coli та S.typhimurium в кл!тинах E.coli супроводжуеться нестаб1льн1стю рекомб1нант!в.

3. Доведено, що нестаб!льн1сть цих рекомб!кантних конструкт й залежить в!д експресП гену rplJ та визначаеться II р!внем.

4. К1льк1сно оц1нено р!вень стаб1льност! рекомб!налтних фаг1в, що м!стять кластер ген!в оперона rplKAJL E.coli.

5. Визначена первинна структура гену rplJ та кодованого ким рибосомного 61лка L10 S.typhimurium.

6. Виявлена моялив!сть б1лка L10 S.typhimurium регулювати експрес!ю ген1в оперону rplJL E.coli.

0сновн1 результати дисертацП опублпсован! у таких роботах:

1. Вудмаска М.й., Живолуп А.Н., Патон Е.Б. Повышение стабильности рекомбинантного фага М13, содержащего гены rplJL-rpoBC' E.coli, путем снижения экспрессии встроенных ге-НОВ//Генетика.-1990.-Т.2б, N3.-C.657-559.

2. Вудмаска М.И., Патон Е.В. Клонирование 'участка rplJL-гроВС'оперона Escherichia coll в плазмидах pBR322 и PHSG415// Докл. АН УССР. Cep.B.-1987.-N10.-C.58-60.

3. The nucleotide sequence of gene rplJ encoding ribosomal protein L10 Salmonella typhimurium/ E.B.Paton.

S.B.Zolotukhln, M.I.Woodmaska et al.//Nucl.Acids Res. -1990. -V.18.N9.-P.2824.

4. Evidence for the ability of L10 Salmonella typhlmurium and Klebsiella pneumoniae to regulate rplJL gene expression in Escherichia coll/ E.B.Paton, M.I.Woodmaska. I.V.Kroupskaya et al.//FEBS Lett. -1990. -v.265. -N1.2. -P. 129-132.

5. Nucleotide sequence of the rplJL operon and the deduced primary structure of the encoded L10 and L7/L12 proteins of Salmonella tiphlmurlum compared to that of Escherichia coll/ A.N.Zhyvoloup,■ M.I.Woodmaska, I.V.Kroupskaya, E.B.Paton// Nucl.Acids Res.-1990.- v.18. N15.-P.4620.

6. Сравнение In vivo регуляторной способности рибосомных белков L10 с различной первичной структурой/ А.Н.Живолуп, И.В.Крупская, М.И.Вудмаска, Е.Б.Патон/Биополимеры- и клетка. -1992.-т.8.-N3.-С.39-42.

Studies of the factors influencing on the stability of the recombinants containing enterobacterial Rif-operon genes.

Conclusions of PhD thesis.

1. A series of recombinant DMAs construction containing rplA'JL-rpoBC' operon of E.coll and S.typhimurium has been obtained.

2. The cloned rplJL genes have been detected to form unstable recombinants being cloned in E.coll cells.

3. The recombinants instability has been shown to be the result of rplJ expression and to be determined by its level.

4. The stability level of recombinant phages carrying the cluster of E.coll rplA'JL operon has been quar.tltively estimated..

5. The primary structure of S.typhimurium rplJ gene and L10 protein coded by this gene have been sequenced.

6. The ability of S.typhimirium L10 protein to regulate the expression of E.coll rplJL operon genes has been detected.

f9

Зам. Формат 60x84 16. Обл-вид.арк. 1.0 ШЯписано др ",руку 16.11.1996 р. Тираж 100.

Лйд1грс?ф1Чча..д1данйця 1ТФ 1м. М.М.Боголюбова HAH Укра1ни