Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурнi основи миханiзму ауторегуляцii експресii генiв rpijL ентеробактерiй

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурнi основи миханiзму ауторегуляцii експресii генiв rpijL ентеробактерiй"

НАЦЮНАЛЬКА АКАДЕМ1Я НАУК УКРйПНИ 1НСТИТУТ KJIITHHHOÏ Biononï I rEHETHHHOÏ IHXEHEPIÏ

Л

Q На правах рукопноу

Живояуп одекспндр Миколайовнч

УДК 577.21

СТРУКТУРН1 ОСНОВН НЕХАН13НУ АУТОРЕГУЛШДХ EKCHPECIÏ ГЕН1В rplJL ЕКТЕРОБАКТЕР1Й

03.00.03 - колекудярна б!олог!я

АВТОРЕФЕРАТ диавртацЛХ ка пошукання пивного ступвня кандидата 61олог1чвих наук

KHÏB - 1994

Роботу виконано у лгбораторИ генетичноХ 1нженер1Х 1нституту кл!тинноХ б!олог11! 1 генетичноХ 1нженер1Х HAH У крайни.

Науковий к&р1вник: доктор бголог1чних наук е.Б.Патон.

0ф1ц1йн1 опоненти: доктор б1олог1чних наук С.С.Малота, доктор б!одог1чних наук Я.Б.Блюм.

Ведуча орган!зац1я: 1нститут м1кроб1олог1Х i BlpyconoriX 1к. академ1ка Заболотного HAH УкраХни.

\

Замист дисертацИ в!дбудеться травня 1994 року О1 'u годин! на эас1дакн! спец1ал1эованоХ ра^и Д 016.011.01 по аахисту дисерацЮ на пошукання вченого ступеня кандидата б!олог!чних наук при 1нсти-тут! молекулярноХ б!олог1Х i генетики HAH УкраХни за адресов: 252143, КиХв-143, вул.Заболотного, 150. .

3 дисертац!ео ножна ознайонитися у б1бл1отец1 1нституту нолеку-лярноХ б!олог1Х i генетики HAH УкраХни.

АКТУАЛЬШСТЬ ТЕНИ. Значка чаотина в!доних на cLcrnnm TwpoHiB прокар1от регулюеться за рахунох контролю трансляцхйних процес!в. Под1бна регуляц!я найб1льш пошнрена серед ген!в рибосонних б!лк!в, переважна частика яких поеднана у багатоцистронн! регуляторы! одимиц1 п1д контролен продукту одного з ген!в Ix складу (Lindahl and Zengel, 1993). Останне десятая i. ття механ1эки регуляцИ експресИ таких оди-ниць привертають пильну увагу науковц!в, демонструючи, на píbhí трансляцИ, р!зноман1тн1 вар1анти нехан1зн1в ауторегуляторного контроле продуктом експресИ гену. Зокрена, rplJL оперон, що розгля-даеться у пропонован!й робот!, е яскравим прикладок nofliÖHo! ау-торегуляторно* единиц!. Експрес1я обок ген!в цього оперону обернено аалежить в!д к!яькост! продукту першого з них у кл!тин1. Як i у б!ль-шост! в!домих механ!зн!в контролю eKcnpecil рибосонних ген!в Е.coli, paгyляцiя rplJL оперону досягаеься шляхон б1лково-нукле1ново1 взаенодИ б1лку-регулятору та c6nacTÍ-HÍmeHÍ на нРНК (yates et al., 1981). На CboroflHi BiflOHo, що механ!зки регуляцИ експресх! ген1в б1льшост! рибосонних б!лк!в базуються на конкурентна вэаенодН регу-ляторного б1лку з власною кРНК та областю зв'язування на рРНК. Для згаданого rplJL оперону в!доио, що регуляторон експресИ його ген1в с б!лок L10 - продукт першого гену. В1доно, що L10 взаемод1е з л1дерон б1цистронно£ нРНК цього оперону, у област1 на 180 нуклеотид1в вище в!д сайту 1н1ц1ац11 трансляцИ першого цистрону, викяикаючи транс-ляц1йннй блок обох цистрон!в матриц1 (Johnsen, et al., 1982). Досл1джено вторинну структуру област1 вэаемодИ л!деру з L10 та вторин! структури, що, можливо, забеэпечують пов'язан!сть трансляцИ обох цистрон!в ( Cllmie and Friesen, 1988; Petersen, 1989). Однак, на сьогодн1, немае точних уявлень про структуру нукле1ново1 н1шен! б!лку L10 та нехан!зни "дистанц1йиого" контролю трансляИ нРНК rplJL оперону.

в1доно, що серед прокар!от рибосонн1 б!лки та генатичн! локуси, що Ix кодують, в!др1зняоться викяючною консервативн1стю структури (Sor and Nomura, 1987; Tittavella, 1984). В окрених випадках, виявле-но м!жвидову-функц!ональну вэаеноэам1нн1сть в1дпов!диого генетичного матер!алу i/або продуктов його експресН. Так, эокрема, виявлено збереження функцИ регуляцИ eKcnpecil reHiB rplKA оперону E.coli б1лкон LI Р.vulgaris та S.roarcescens. (sor and Nomura, 1987). Виявлено, також, можлив!сть функц!онально£ зан1ни регуляторноК облает! S10 оперояу E.coli BÍflnoBÍflHo«3 д1лянкою э к!лькох 1нших ентеробактер1й ( Lindahl and Zengel, ' 1993). з огляду на це, застосування ф^огенетич-ного п!дходу до вивчення згаданого rplJL оперону ноже бути виключно ефективнйн 1нструменток для досл1дження регуляторно значущих структур РНК-н1шен1.

Отже, пор!вняльне вивчення структури нуклеинового компоненту РНК-б1лковоХ вэаенодН механ1зму аутоконтролю трансляцИ rplJL оперону с актуальною проблемою досл!джень excnpeciX ген!в прокар1от.

МЕТА I ЗАВДАКНЯ ДОСЛ1ДЖЕННЯ. Головною кетою пропонованоХ роботи було досл1дження спор1дненост! нехан1ану регуляцИ експрвс1Х ген!в rplJL оперон1в ряду ентеробактер!й та виявлення необх!дних для регу-ляторноХ функцИ рис структурно! орган!зац!£ л!дер1в ix нРНК, шляхом пор!вняльного анал1ау структури та функц!й цих регуляторних областей. Для виконання такого завдання було необх1дно:

1. Вивчити можлив1сть д!Х мехаHiэ ну аутоконтролю efccnpecil генХв rplJL за участю б1лку L10 гетеролог1чного (ентеробактер1ального) по-ходжеиня.

2. розробити 'систему к1льк1сноХ оц!нки in vivo функционально! здатност! б1лковоХ (1,10) та,> РНК-овоХ (л!дер) складових нехан1эну контролю eKcnpecii' гену rplJ.

3. Оц1иити регуляторну эдатн!сть лхдер1в нРНК ген!в rplJ та б1лк!в L10 ентеробактер!й у роэроблен!й систем!.

4. 1золювати 51-облает! rplJL оперон!в ентеробактер!й та провести пор!вняльний анал!з Хх нуклеотидних посл!довностей.

5. Розрахувати вторинн! структури л!дер!в нРНК rplJL onepoHiB ен-теробактер1й та провести Хх пор!вняльний анал!э.

НАУКОВА НОВИЗНА РОБОТИ. За результатами роботи вперше показано сп!льн!стъ механ!ану регуляцП, на piBHi трансляц1Х, excnpeciX ген!в rplJL оперону у семи ентеробактер!й: Escherichia coli, Salmonella typhymurium, Serratia narcescens, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris. Для згаданих орган!зк!в виявлено ножлив!сть перехресноХ регуляц!Х excnpeciX ген!в rplJL б!лкани LI0 гетерологхчного ентеробактер!ального походження. Встановлено сп!льн! принципи структурно! орган!зац!1 л1дерних регуляторних посл!довностей иРНК ген!в rplJL назааних орган!зн!в. Виявлено консервативн! структури! елементи л1дерноХ посл!довност1 rplJL ген!в, необх!дн! для забезпечення механ1эну ауторегуляцИ. До таких еле-KeHTiB в!днесено 5 одноланцюгових д1лянок л1деру та, переважно, стебла п'яти двосгиралъних. структур. Показано наявн1сть, аналог!чноХ E.coli, залежно п!дпорядкованоХ транспяцИ LI2 цистрону у Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium та, принаймн1, структурн1 передумови такоХ п!дпорядкованост! у Enterobacter cloacae, Serratia laarcescens, Proteus vulgaris. Визначе-ho нуклеотидну посл!довн!сть 5'-областей оперон!в rplJL у Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens та Proteus vulgaris. 1нформац1ю передано до к1жнародного банку посл!довностей EMBL.

Розроблеио метод к1льк1сно! оц!яки регуляторно! ефективност! складо-вих механ1зму контролю на р1вн! трансЛяцШ експресИ ген1в rplJL. Розроблеио ефективн! методи введения плазм!д у кл!тини ентеробактерШ шляхом електропорацИ.

СТРУКТУРА I ОБ'ем РОБОТИ. Дисертац1ю викладено на 90 стор. каши-нописного тексту. Бона складаеться з вотупу, огляду лхтератури, методично! частини, опису результат!в та 1х обговорення i bhchobkíb. Por боту 1люстровано 20 малюнками i 2 таблицяии. Список цитовано! л1тератури и!стить 145 джерел.

АПРОБАЦ1Я. Матер1оли дисертацН допов!дались на IUMS congress: Bacteriology and Mycology (Осака, 1990), на м!жнародн1й, пам'ят1 Х.Г.Вхтмана, конференцИ! по трансляц1йнону апарату (Берл1н, 1992). За натер!алаии дисертацИ опубл i ковано 15 статей.

ЗМХСТ РОБОТИ

МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ. Bei використан! у робот1 фермента - вироб-ництва ИБО "Ферментас11, В1льнюс. Ферментативн! реакцП проводили за рекомендац!яии та у буферних розчинах виробника. Отримання кокпетент-них кл1тин E.coli та ix трансформац!о проводили, як описано у (Nishimura et al., 1990), геномну ДНК бактер!й вид1ляли зг!дно (Ausubel et al., 1987), пол!иеразну ланцогову реакцию проводили за (Linz et al., 1990), визначення бета-галактозидазно! активност1 вико-нували за методикою (Minep, 1976), плаэн!дну ДНК для секвенування вид1ляли як описано у (Saunders and. Burke, 1990), реакцП .секвенування вйконувались, вц1яому, srifiHO iHCTpyKUil набору "Т7 Сиквенс", НПО "Ферментас", Литва. Пригятування, електрофорез, обробку та висушуван-ня секвенсового 6%-ного розклиненого гелю виконували, зг!дно iHCTpynuifl виробника, на прилад! Macrophor Sequencing System (LKB, Швеция). Атограф1ю гелю проводили на рентген!вськ!й opiíbhí РМ-В протягон 18 годин. Рад1оактнВНИй альфа-32Р dATP використовували виробництва ВО "1зотоп", Ташкент.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ.

Для вивчення можливост! д!1 мэхан1эму аутоконтролю експресН reHiB rplJL за участю б!лку L10 гетеролог!чного походження, початко-во, було використано ефект впливу надпродукцИ б!лку-регулятору L10 на кл1тину-хаэя!на. PaHiuie було виявлено, що клонування iHTaKTHoro гену rplJ з власник промотором PL10 у багатокоп1йн1й плазм!д1 рис можливе т1льки у opieHTauil, яка не дозволяс додатково! транскрипцН цього гену э Plac промотору вектору. Шдтримання у нормальних клейках E.coli таких плазм!д викликало пад!ння коп1йност! плазм!д, що несуть геи rplJ. Останне явище виявилось простим i эручним тестом на регуляторну эдатн!сть б!лк!в L10 р1зноХ первинноХ струхтури. Для такого анал!эу э н1чно! культури E.coli, трансформоваио! багатокоп!йноо

рекомб1нантною rplJ-експресувчою плазм!дов, стандартнин методом луж- • ного л!эису вид1ляють плаэм1дну ДНК i за результатами електрофорезу проводять в!зуальну оц!нку II коп!йност! (рис.1).

Для анал!зу можливост1 характерного негативного (а, отже, регуля-торного) впливу надпродукцИ б1лку L10 гетеролог!чного походженння на кл!тини ентеробактер 1й, було розроблено кетоди Ix трансформац!!. Пор1вняльне досл!дження методик трансформации виявило, цо для кл1тин ряду ентеробактер!й найб!лыа усп!шним е метод електропорацИ (Dower et al.( 1988). Було розроблено ефективну спрощену методику плази1дно1* трансформации кл1тин ентеробахтер1й за допомого» електропорацИ. Суть II полягала у використанн1 розб!рноХ камери для електрошоку кл!тинно1 суспенэН, де напруженн1сть електричного поля визначаеться товщинов к!льцево! прокладки м1ж площинаки верхнього i нижнього елехтродХв. Taxa конструкц1я дозволила використати для електропорацИ Найпрост1ший прилад лабораторного виконання. Була досягнута високое-фективна трансфорнац!я таких орган1зм1в як Salmonella typhiraurium, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii. Ефехтивн1сть складала: для-Salmonella typhimurium LT2 - 10 у степей! 7 - 10 у CTeneHi 8, для Klebsiella pneumoniae - 10 у степей! 7, для Citrobacter freundii -5x10 у CTeneHi 6 колон1й на KiKporpaH ДНК плазм1ди. Назван! орган!зми було трансформовано rplj-кодуючими плазм!дами. Виявлено, що Bei плазм1ди, ях! эабезпечувть синтез L10 з ауторегуляторними функц!ями (рЕР20, рЕР20-1, pMW12, pMW12-l), п1дтримувться у кл!тинах ентеробак-тер!й у суттево знижен!й коп1йност!. Плазм1ди з мутантними генами rplJ (рЕР12-1, рЕР14, рЕР22), цо на викликаоть характерного негативного ефекту в аутолог!чних ситуац!ях (плаэмздний rplJ E.coli - кл!ти-на E.coli, плазмадний rplJ S.typhimurium - кл!тина S.typhimurium), у гетеролог1чних орган!змах теж п1дтримуються без зниження KonifiHocTi (рис.1). Таким чином, ми виявили можлив!сть регуляцИ б1лкок L10 E.coli eKcnpecil ген!в rplJL оперону Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, а б!лкон L10 S.typhimurium - eKcnpecin згаданих ген!в Escherichia coli. Одночасно, результати експеримент!в e св1дченнян наявност! п!дпорядковано! трансляцП LI2 цистрону в ycix трансформованйх енгеробактер!ях.

Для подальшого досл!дження було розроблено метод к!льк!сно! оц!нки функц!онально1 сум!сност! та регуляторно! эдатност! мРНК-м!ше-ней та б!лк!в L10 гетеролог!чного походження. Розроблений in vivo метод грунтувався на техн1ц! сп!льного введения в кл!тину двох плаэм!д, одна з яких забезпечус продукц!в регуляторного В!лку ("ефекторна" плазм!да), а друга ("репортерна" плазм!да) - кодуе химерну бета-га-лахтозидазу, р!вень excnpecil яко! эалежить в!д здатност1 кодованого першов плазм!дов б!лху до регуляторно! взаемодН з л!дером мРНК хи-

Salmonella typhimurium

S

3 £

3 ~ 32= .

я sa -s« чай. 8 Ез

«а5 -is , , .

-^ Lac Hose —j— Lac host

s а ¿■as

Hi.

Uc* host —,— Lee" bost -

rxi

. ttlCipilö

:fJ)№W»

QpÄ^-i

Klebsiella pneumoniae

t.coli Ш E.coli Ut E.coli Lit

utite lyslll.fliW-MU del.« C-ten.i.i.

|рШ0| lfEII2] №12-11

I "U I \

Citrobacter freundii

Рио.Х. Пор!вняння хоп!йност! ДНК плаэн!д, що п1дтримуиться в кл!ти-нах ентеробактер!й. Плаэм!дну ДНК вид!ляли з 2 ил н!чно! культури стандартами методой. Електрофореэ нанесених проб проводили у О.7%-ному агароэному гел1. Bei використан! плазм!ди сконструйовано на основ! вектора рис.

мерного гену rplJ'-lacZ. Злитий ген rplJ'-lacZ плазн1ди-репортару зконструйовано таким чином, що його нРНК м!стить л!дерну область з ауторегуляторною послХдовнХстс - м1шенню 61лку L10, Це дозволяс б1лку, в pasi збереження регуляторно! здатност1, визначати р1вень трансляц!йно£ активност! химерно! натриц1. Здатн1сть та силу регуля-торно! вааеиодШ 6inxy LXO а його н1шенню на л!дер1 мРНК оц1нювали за 3MÍHOC покаэник!в бета-галактозйдазно! активност! котрансформованих клхтин, залежно в!д характеру rplJ "ефекторно!" плаэм!ди. Суттевим компонентом системи е иутантн! кл1тини-хазя!ни E.coli штаму JF3029 (Friesen, 1983), цо толерантн! до п1двищенного р!вня регуляторноэдат-ного б1лку L10. Для конструювання "репортерних" плазм!д було викорис-тано плаэи!ду pGA200. Бона складаеться з частини вектора pACYC184 з геном ст!йкост1 до хлорамфен!колу та кластеру ген1в lacZVA, перший э яких, ai збереженняк рамки траиоляц!!, злито a Pstl-Smal фрагментом гену rplJ E.coli (рис.2. А). Ун1кальний сайт для рестриктази Pstl дозволяв легко в!дновити експрес1ю lacZ гену шляхом пересадки, з Судь-якого джерела, д!лянки, яка оточена в1дпов1дними сайтани, забез-

ХЬ.1 ».ti

_РИ. _f"

(| tu»' ———Сш£]|

всеаа! [N»

i«M CZ{>

«в» nX>

isras-a. cfss&-al [Ч

Ollll»12' í3"®

Рис,2. Схеми конструювання "репортерних" та "ефекторних" плазм!д.

Плазм1да pGA200 м1стить ген резистентност1 до хлорамфен!колу Cm, гени Z, У, А лактозного оперону, ун!кальн1 сайти рестриктаз Pstl та Xbal. Шляхом вм!щення у перший сайт Biflnosiflux д1лянок rplJL оперону ентеробактер1й було отрима-но "репортерн1" ш:ази1ди. У ceKiiil! Б наведено схеии "ефекторних" плази1д. Горизонтально BiflpisKH 1люструють в!дпов1дн1 клоновзи! д!лянки rplKAJL оперону E.coli, S.typhirouriun та P.vulgaris. Позначено використан1 для цього сайти рестриктаз. Зафарбованою стр!лкою позначено пронотор PL10, незафарбованшш стр!лкак» зображено в!дносне положения Plac промотора плазн!ди рис. Позначкою "о" в1дм1чено мутац1ю в rplJ плазм1ди рКР22.

пачуе зб!г рамки трансляц1!£ i м!стить необх!дн! трансхрипц!йн1 та трансляц1йн1 сигнали. Такими д!лянкаки, у нашему випадку, були, в1дпов1дник чином клонован!, фрагменти rplA'-rplJ' оперон!в rplKAJL ентеробактер!й Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Enarobacter cloacae та Klebsiella pneumoniae. Плазк!ди-"вфектори" сконструйовано на баз! вектор!в pUC. Плазм!да рЕР12-1 м!стить у Smal-caflTi позбавле-ного 1ао промотору вектору pUC9, НаеШ фрагмент rplKAJL оперону E.coli з повноо посл1довн1сто гену rplj без власних снгнал!в транскрипц!! (рис.2, Б)- Це "мовчаэна" конструкц!я. PEP11 забезпечуе nin тандемом PL10 та Plac промотор!в експрес!ю вкороченого на 22 С-к1нцевих а.з. б1лку L10. Цю плазм!ду сконструйовано на основ! pUC18, шляхом вмещения по Ii рестрикц!йних сайтах BamHI та Pael, Bglll-Hinlll фрагменту rplKAJL оперону E.coli. Плазм1ди рЕР20, pMW12, рЕР22 нають аналог!чну конструкц!ю i м!стять Bglll-EcoRI фрагмент rplKAJL оперону, з повним rplJ геном та його промотором, у зустр1чн!й, до 1ас промотору вектору, opieHTauii. j)EP20 та pMW12, в!дпов1дно, м1стять фрагменти нативних оперон!в E.coli та S.typhimurium. рЕР22 к!стить у аналог!чному фрагмент! E.coli мутац!п Lysl43,Glul44->Gln гену rplJ. Транскрипц!я rplJ reHiB Bcix трьох плазм!д спряновуеться PL10 промотором. рЕР20-1 та PMW12-1 кодувть на-тивн! LI0 i вiдpiэняютьcя В1д названих рекомб!нантних конструкц1й зворотньоо ор!ентац!еп вм!щеного фрагменту, так що транехрития rplJ контролюеться тандемом PL10 та Plac. E.coli та S.typhimurium. для конструювання плазм1д pAZ21 (!нтактний rplJ Serratia marcescens) та pAZSl (1нтактний rplJ. Proteus vulgaris) використано рекомб!нантн1 фаги М13 018157 та М13 018155, що м!стять, в!дпов!дно, rplK1AJLrpoBC' та rplK'AJL' д!лянки reHOMiB цих орган!зм!в: pAZ21 м!стить Sali, фрагмент М13 018157, який охоплюе rplJLrpoB' д!лйнку Proteus vulgaris, плаэм!да pAZ21 м!стить Xbal фрагмент з' rplJL' областю Serratia marcescens. Обидв! хонструкц!! позбавлено PL10 промотору, i ейспрес!я L10 спрямовуеться 1ас промотором вектору. За результатами BHMipie у описан1й систем! було виявлено, що Enterobacter cloacae, Serratia marcescens та Proteus vulgaris, однозначно не охарактеризован! як!сннм тестом на можлив!сть гетерологгчноХ регуляцИ, мають таку здатн!сть. Результата вим!ру в!дносних р!вн1в зворотньо! негативно! регуляц!! eKcnpecii "репортерних" ген!в б!лками L10 наведено у таблиц!. в yeix випадках in vivo сполучення ' гетеролог!чного белкового (L10) та РНК-ового (гри-л!дер) компонент!в механ!эму регуляцИ експрес!! rplJL, показник в!дносного пригн!чення бета-галахтизодазно! активност1 продукту химерного гену rplJ'-lacZ Перевищував одиницю, що евхдчить про функц1ональну cyMicHicTb л1дерно1 MimeHi та б!лку-регу-лятору. Величина показника в!дносного пригн!чення. вхазус на регуля-

торну ефективн1сть взаемодИ в!дпов1дного б1лку та л!дерно! посл!дов-hoctI. В охрених випадках (л1дер S.typhimurium - L10 E.coli) ця ефек-тивн!сть перевищус показники вин!р!в для аутологХчних сполученъ (л!дер та L10 E.coli, л!дер та L10 S.typhimurium). Нев1дпов!дн1сть н!ж piBHflMH ефективност! регуляцИ ген!в E.coli б!лкон S.typhimurium i навпахи, дас можлив!сть зробити припущення, що б1лковий та нук-леХновий структурн! конпоненти механ1зму регуляц!! хр!м эагальних детерминант, як! забезпечуоть можлив1сть гетеролог!чноХ вэаемодИ, масть деяк! "видоспевд^чн!" структури, що нодулюоть регуляторну взаемод!» л1деру i L10. На п!дтвердження цього припущення також св1дчить непропорц!йна зм!на в!дносних piBniB регульовност! л1дер1в rplJL ентеробахтер!й,при зм!н! б1лх1в-регулятор!в.

Таблица. ВХдносн! piBHi зворотньо! негативно! регуляц!£ excnpecil ггн!в rplJL ентеробакте^й б!лками L10 pisHoro походження.

Джерело Л2деру для плазм!ди-"рёпортеру"

E.coli

S.typhimur ium S.marcescens С.freundii £.cloacae К.pneumoniae

Джерело гену, що кодуе L10 "ефекторно!" плази!ди

E.coli

5.6

8.3

4.7 1.7 1.2

1.4

S.typhimurium

3.6 4.0 2.4 2.2 1.4

P.vulgaris

2.1

2.4 2.7 1.7

1.5 2.0

Середне квадратичне в1дхилення п'яти BHMipiB не перевицувало 10%

Досл!ди з ях1сного та х!льх!сного визиачення можливост1 транс-ляц!йного контролю excnpecil reHie rplJL оперону ентеробактер!й, за участю хомпонент1в регуляторного механ!зму гетеролог!чного походженн-ня, виявили можлив!сть гетерологХчно! регуляцИ серед ряду орган!зм!в, а сане: Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris. Ми прийшли до висновху, що здатн!сть до фунхц1онування неханХзну трансляц!йного хонтроло екслрес!! ген!в rplJL оперону за участю компонент!в гетеролог!чного лоходженння, св!дчить про висоху под1бн1сть функцгональних принцтив нехан!зм!в ауторегуляц!! excnpecil ген!в rplJL оперон!в названих ен-теробактерЩ, та про певну консервативность структурно! орган1зац!1 комлонент1в згаданих механ!зн1в, эокрема, л1дер!в rplJ ген!в. з метоп виявити ц! функц!онально важлив! гомолог!I було проведено досл!дження

структури л!дерних областей L10-L12 мРНК означених орган1зн1в.

Для 1золяц!£ фрагкент1в, що м1стять 5'-облает! rplJ, э хромосо-нально! ДНК ентеробактер!й, було використано нетод пол1меразноХ лан-цогово! реакц!! (ПЛР) (Saiki et al.( 1985). Прийнаючи до уваги за-гальну високу под1бн!сть структурних областей rplKAJLrpoBC кластеру серед ентеробактер!й, як праймери в ПЛР, було використано ол!гонукле-ОТИДИ посл!довност! 51-GGTAGGTATGGAagatctGGCTGACCAG-3' та

5•-CCGCAACTActgcagACAG-3', перший з яких гоиолог!чний структурн1й облает! rplA (885-912), а !нший комплементарний проксимальн!й частин! rplJ (1805-1787) E.col! (нумерац!я за Post et al., 1979). Позначен! на ол1гонуклеотидах посл!довност! - сайти рестриктаз Bglll та Pstl, в!дпов!дно. Реакц!о анпл!ф!кац!5С проводили у стандартному буферному середовищ!, з дещо п!двищеною концентрате» хлориду нагн1ю. Викорис-товували Tag пол!меразу ф!рми Boehringer Mannheim. 25-30 цикл!в чергувань температур денатурац!1-г!бридизац11-пол!меризацИ проводили у режим!: 94град.С, 60 сек, 57град.С, 60 сек, 70град.С, 80 сек. У реакц!йному o6'eMi 25 мкл вих1д ДНК становив 2-3 мкг. На рис.3 наведено картину електрофорезу продук^в peaKttil ампл!ф!кац!1 э геномное ДНК Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Enerobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae та Escherichia coli, Отриман! фрагмента ДНК ви-

12 3 4-567

Рио.3. Картина

електрофорезу продукт!в ПЛР-ампл1ф1кац!£ фрагменте геяоку ентеробак-тер!й. Нанесено 1/5 в!д загального • об'ему реакц1йно! cyMimi.

Електрофорез проводили у 0.8%-ноку агарозному

гел!. Порядок нанесения: 1 - Есо471 фрагменти ДНК фага лямбда (маркер рух-ливост!), 2...7 в!дпов!дно, продукта

ПЛР-ампл!ф1кац!1 ДНК ге-ном!в E.coli (штам JF3028), С.freundii,

S.marcescens, E.cloacae, E.coli (Итам JF3029), К.pneumoniae.

• J"' t

ВГСяаиИМ

явились !дентичними або блиэькини за розм!рани. Продукта анпл1ф1кац11 було клоновано у багатокоп!йн!й плазм!д! pUC19. Реакц1йну суи!ш з ампл1ф!кованим фрагментом обробляли S1 нуклеазоп, очищали електрофорезом у araposi ! розщеплювали його рестриктазоо Bglll. П!сля ковалентно! "зшивки" Т4 л!газоп плазм!ди рОС19, розцеплено!

рестриктазами ВашНХ та Ecll36II, э отриманим фрагментом та наступно! трансформац!! л!гаэноо сум!шшю компетентних кл!тин, було в1д1брано клони з рекомб!нантними ллазм!дними конструкц1ями. Ор!снтац!ю клоно-ваного фрагменту в рекокб!нантних конструкц!ях було задано таким чином, що а боку Вд1Н-вм!сного прайнеру виявився Pstl сайт пол!кло-нально! облает! плаэм!ди. Разом з Pstl сайтом, який задано !ниим праймерон на протилежному к1нц! фрагменту, це дозволило легко перек-лонувати Pstl фрагмент п!д час конструювання "репортерних" плазм!д (див. рис.2,А).

Для визначення первинноХ структури методом ензнматичного секвену-вання плазм!дно1" ДНК необх!дно було субклонувати ампл!ф!кован! фраг-менти частинами. Було проведено часткове рестрикц!йне хартування ДНК рекомбЛнантних плазм1д. Bei продукта ампл!ф!кац!Х та Sali фрагмент з фагу М13 018157 було субклоновано частинами прийнятних, для методу плаэм1дного секвенуваня, розм!р!в. Нуклеотидну посл!довн!сть ДНК продукт1в акпл1ф1кац1Х визначали методом ензиматичного секвенування (Senger et al., 1977) набором реактив!в "Т7 Сиквенс", IfflO "Феркан-тас", Литва. Процедури виконували эг1дно кер!вництва виробника з нез-начними нодиф1кац1ями, пов'язаними з масштабним зменшенням вс1х об'см!в. 3 метою вихлючення можливих помилок визначення посл1дов-hoctI, секвенували ДНК трьох окремих клон!в, В окремих випадках, внасл!док особлиростей структури ДНК, на деяких д1лянках матриц! в1дбувасться неспециф!чна терм!нац!я роботи Т7 пол!нерази. Для подо-лання цього ефекту, як запропоновано Khambaty and Ely, (1990)« п!оля реакц!й секвенування було эастосовано додаткову обробку Tag пол!мераэою. Така реакц1я дозволяв повн!стю вир!шити эгадану проблему (рис.4).

Рис.4. Автограф

електрофорезу секвенуючо-го гелю з нанесеними продуктами ферментативного секвенування ДНК Э-тагсеасепа Т7

пол!мераэою (А), Т7 пол1меразою з наступною обробкою Тад пол!мераэою (Б). Порядок нанесення проб реакц1й тер»1нац11:

лет;

Species

Access, numbers

х№сае

x№aris x?^cescens

consensus

1520 1540 1560 1530

tttgttc.t.-.-ga.cltg.....-..I. .g..t..-I-g.......I...a.-ttclc..gaaa.. I. ..cc—____1.........1.c,

.g. .т. . ...6........

tttgttc.t.-.-ga.c.tg.....a.....g..t.....в........

..•.6.»T*

• *g* #T* • •«>6«

imurium

^-pneumoniae _

h«5 tttgtgc.g.-.-ga.c.gg.....-

TT.T.C.TT-.T.CT.....-

tttcg.t.-.-ga.t.tg.....-

rmrcG.T.-.-ga.e.TG......

G T G

I—

1600 a.gct—...

..c..ctc-.c..gagg..____cc—................c._ .a.gct— . ..

..t..ttc.t..gaaa......gc—................c.. .a.gct—.. .

..t..ttc.c..gaga......cc—................c... a.gct—...

.. т.. ttc.c.. gaaa...... cc— ......'..........c. . .a.gct—...

..t..aa-.t..-tta......t-tt................g...g.caata...

....g..t.-....c........

g с gccta tccag cc ccgtc aagaccgcagg gt > <-! i-

-...ттст

-...TT-T -...TT-T

T-T

..t..atc.c..gata......cctt................c...g.c-t—...

g aa cttaat cctgcgtagacggtga aga с aaga

V

-> <IV

1620

1640

ттт

7tt

ctg

tgg ..-t...gg-ctt.t.. ..g....

taa

ttt. .-aaagaatg...ttactg.a..

1660

-ctctc.g..t-gga-

1680

1700

A-...T-

AAATT...CTTT

TTA

->

III 1720

—gg.....a......t..a.a-ga.tttct.t..ca.ac..

—tg.....a......t..g.aaca.gagtt.c..ca.ac..

III

ata

<--

та

g tt ct ctcaccgt tt ag cgct

-cttct.g. .—gaga--

-ctctc.g. ,—gggg-----gg.....a......t. .g.aaca.gagtt.c. -ca.ac. .

-ctttt. g. . —gaat---tg____.a......t. .a. agca.aggct.t.. ca.ac..

-cttcc.g. . —gggt---—cg.....a......t. .g. aaca. gagtt.с.. ca. ac..

-tatac. a.. gtggtaa----та.....t......с.. -. agtt. ttact. -.. tt. — ..

С TT

agtga gtgagt cc g t -i !-> _

с gg a atccaggagcaa agctaatg

Рис.5. Пор'хвняяня послд-Довностей ладерних областей rplJL оперону ентеробактерЛй. Поряд э назвами орган1эн!в наведено peeCTpauiftHi нонери послд.довностей у EMBL Data Library. У порХвнюваних посл1довностях крап-каки позначено гоиолог1чнх нуклеотиди, буквами - вар1абелът. Тире позначено розриви посл1довностей для onTHMi3auiI Ix вирхвнювання. Рядок "consensus" кгстнть, спхльну для Bcix семи ентеробактер1й, консервативну посл1довн!сть. Над посл1довностями здпоеним пунктиром позначено rinoTGTHHHi област1 взаемодИ б1лку L10 з л1дероМ. Строками з латинськоо нумерацию позначено Mexci вторинних структур лхдеру мРНК rplJL оперону E.coli. Нумерац1я 3riflHO Post et al., (1979).

В результат! проведено! роботи, було визначено нуклеотидн! посл!довност! аипл!ф!ковапих фрагнент1в геномно! ДНК Enterobacter cloacae (271 bp), Citrobacter freund!! (292 bp), Klebsiella pneumoniae (315 bp), Serratia marcescens (550 bp) та д1лянку Sail фрагменту rplKAJLrpoBC Proteus vulgaris (293 bp). Пор!вняння цих посл!довностей э л!дерними областями rplJL оперону E.coli та S.typhimuriuQ виявипо високу гомологio i п!дтвердило, що анпл!ф!ко-ван! посл1довност! належать до л!дерних областей rplJL оперон1в в1дпов1дних орган!эм!в (рис.5). Пор1вняльний анал!з первинних структур, в!д позицН 1510 за нумерац!ею E.coli до стартового кодону, показав, що в!дсоток гомолог!! л1дер!в семи названих ентеробактер!й складае 64.5, 64.6, 64.8, 64.5, 64.5, 67.6 та 58.5 для E.coli, S.typhimurium, C.freundii, К.pneumoniae, Е.cloacae, P.vulgaris та S.marcescens, в!дпов!дно. Серед перших п'яти орган1зм!в т!льки S.typhimurium та C.freundii мають л!дери на 1 bp KopoTuii Bifl E.coli, у P.vulgaris та S.marcescens ця р!зииця складае -10 bp та +24 bp, в1дпов!дно. Bei г!потетичн! д!лянки специф!чно! взасмод!! б1лку L10 E.coli (Climie and Friesen, 1988; Christensen et al., 1984; рис.5, пунктирн! л!н!! над посл!довностями) припадають на област1 консерва-тнвн! в yeix ентеробактер!ях. Загальний вигляд областей гомолог!! пор!внюваних посл!довностей св!дчить про переважну эгрупован1сть кон-сервативних та вар!абельних д!лянок. ПорГвнюючи консенсусну посл!довн!сть та меж! вторинних структур, визначених для л!деру E.coli (Climie and Friesen, 1988), можна зробити висновок, що максимальна консервативн!сть спостер!гаеться на д!лянках стебел шпмльок IV, III та на одноланцюгових пром!жках Mi« структурами V-IV .та IV-III. Це добре узгоджуеться з структурнини та гекетичниии св!дчен-нями про важливу роль цього рег!ону для функц!! ауторегуляцН транс-ляц!1 L10-L12 мРНК E.coli (Cliraie and Friesen, 1987). Загальне пор!вняння первинних структур досл!джених ентеробактерИ виявляе !х розпод!л на 2 групи под!бност! (рис.6). До першо! групи належить E.col! разон з S.typhimurium, C.freundii, Е.cloacae та К.pneumoniae, До друго! - P.vulgaris та s.marcescens. ц1лком припустимо, що цей роэпод!л в!дображас ступ!нь ееолсц1йно! спор!дненост! вказаних opraHi3MiB, хоча, за ^снуючиии класиф!кац1ями. Bei вони р!внов!дда-neHi ! кожен з них е лредставником окремого роду. Пор1вняння отрима-них часткових нуклеотмдних посл!довностей кодуючих областей rplJ ■ ген!в семи ентеробактер!й виявило практично повну ix гомолог1ю на протяз! 46 нуклеотид!в, почииаючи з третього кодону (рис.7). т!льки посл1довн!сть p.vulgaris в!др1зняетьоя одним нуклеотидом. Саме на цю область припадав д1лянка першого циотрону L10-L12 иРНК E.coli, яка, эа рахунок г!патетичного в!ддаленого зпарования з проксимальною час-

Propra^' CLtlSTAL.

CFR DR

ECL LDH

SAL LOR

' ECO LCR

• SUA LDA

DendrogrAM оГ tlie alignment.

Рис.6. Дендрограма спор1дН6ност! посл!довностей л1дер!в иРНК rplJL оперон1в ентеробактер1й. Загальна довжина в1др1зк1в м!ж кожною парою означених посл!довностей е Hipon спорл.дненост! Ix первинних структур, обрсбку виконано у програм! CLUSTAL пакету PCGENE 6.50.

t.cojl АТС ССТ ТТЛ ААТ СП САЛ САС AAA САА ССС ATT СТТ ССТ САЛ СТС ЛСС САЛ СТА ССС AAA ССС ССС CTG ТСТ CCA СТа СП

S.typhlaurlta АТС ССТ ТТЛ ААТ СТТ САА САС АЛА САА ССС АП СТТ ССТ САА СТС АСС САЛ СТА ССС АЛЛ ССС ССС СТС ТСТ ССА СТА СТТ

C.freundli АТС ССТ ТТА ААТ СТТ САА САС АЛА САА ССС АГТ СТТ ССТ САЛ СТС АСС САЛ СТА ССС АЛЛ ССН НИМ |Тс TU ССЛ С|С аТ|

I.pIMUOOl» АТС ССТ ТТА ААТ СТТ СЛЛ САС АЛЛ САА ССС АГТ СТТ- ССТ САА СТС ЛСС САА СТА ССС АЛЛ ССС ССС СТС ТС

I.cloacae ' АТС ССТ ТТЛ АЛТ СТТ САЛ САС АЛЛ СЛЛ ССС АГТ СТТ ССТ САЛ СТС ЛСС САЛ CJA ССС AAA ССС ССС СТС ТС

F.vujiarls АТС ССа СТА АЛТ СТТ САЛ СЛС АЛЛ СЛЛ ССС ЛТТ СТа ССТ САА СТС АСС СЛЛ CTt ССС АЛЛ CGI »KM CTt ТСТ ССА Ott СТТ

S.earcalcena АТС ССа ITA ААТ СТТ САЛ САС АЛЛ СЛЛ ССС ЛИ СТТ ССТ САЛ СТС ЛСС СЛЛ СТА ССС МЛ ССС ССС СТС ТСТ CCl CTt СТТ

Рис.7. Пор1вняння нуклеотидних посл!довностей 5'-к1нцевих кодуечих областей rplj ген!в семи ентеробактер1й. В1др1эком п!д послхдовностяии позначено д!лянку rplJ E.coli, яка в L10-L12 мРНК, ймов!рно, залучена до в!ддаленого эпарсвання з проксимальною -области наступного цистрону. Вар1абельн1 нуклеотиди ими малими буквами. Невизначен! нуклеотиди позначено

LIO старт

CAAG

AUGGCWUAAAUCUUCA A AGACA i i: 11 UCUGU ***** A

*

G G С

AUUGUU CUGAA GUCAG :::::! t:::: •:::: UAACAA GACUU UAGUC U G A U

A A U

G *

AAGU :: ¡ : UUCA A *

482 nt *

U

LI 2 старт

* * *

*

*

*

*

Рис.8. Ппотетичне зпарювання в!ддалених посл1довностей мРНК rplJL оперону, яке забезпечуе п!дпорядховану залежн!сть трансляцИ L12 цистрону в!д трансляцИ попереднього цистрону.61лку LIO. Посл!довн!ст>. Шайн-Далгарно та стартов! кодони позначено контуром, Стр!лками позначено початок i напрямок ORF для в!дпов!дних б!лк!в.

тиною наступного L12 цистрону, забеэп.ечус ix узгоджену трансляц!ю (рис.8). Щкаво, цо за межами ц!е! майже !дентично! облает!, принайми! на прочитаних д!лянках ДНК, . гомояог!чн!сть Ix первинно! структури р!зко падае. Коисервативн!сть д!лянки 46 нуклеотид!в не мо-же бути пов'яэана т!льки з гомолог!ев функц!й Ы-к!нцевих областей б!лк!в L10 пор!внюваних ентеробактер!й, оск!льки, м1нлив!сть, за рахунок виродженост! генетичного коду, нуклеотидних посл!довностей без зм!н у пептидах, яка, переважно, спостер!гаеться за межами означено! облает!, припустима в такому випадку 1 в П межах. В!дсутн!сть альтерац!й, очевидно, в!дображае важливе, можливо регуляторне, значения саме нуклеотидно! поел!довност!, ! св!дчить на користь г!потези про механ!зи п!дпорядковано! трансляцИ (Petersen, 1989).

Подалылий анал!з посл!довностей л!дер!в ентеробактер!й винагав побудови Ix можливих вторинних структур. Такий розрахунок було вико-нано !з застосуванням комп'ютерно! программ RNAFOLD пакету PCGENE 6.50, спираючись на в!дому вторинну структуру л1дерно1 облает! LI0-LI2 нРНК E.coli. Роэрахован1 вторинн! структури л!дерних областей мРНК rplJL оперон!в досл!джувних ентеробактер!й показали, аналог!чно E.coli, наявн!сть п'яти д!лянок двосп!рально! структури (рис.9). Роз-, ташована на структур! VI можлива д!лянка взаемод!! мРНК a L10 вияви-лась повн!стю консервативною. Двосп!ральна структура VI у вс!х ен-теробактер!й м!стить чотиринуклеотидну шпильку посл1довност! GNRA, яка надае вторинним стуктурам п!двищенно! стаб!льност! (Varan!, 1991). На в!дм!ну в!д вар!абельних вершин, основи ве!х п'яти сп1ралей повн!стю консервативн!. Висококонсервативн! одноланцюгов! д!лянки м!ж сп!ралями V-VI, VI-III та II-I вс!х л!дер!в м!стять 5, 3 та 9 нуклео-тид!в, в!дпов!дно. Така ж д1пянка м!ж сп!ралями III та II у E.coli складаеться э 8 нуклеотид!в, тод! як х bcíx !нших анал!зованих ен-

tu

*-А

А-U

• и U-A *

• • A-U

V . * G-C A-U

и А IV »

•

и • А . _ . •

G-C в А C-G «

•-С . _ .

•-А C-G . _ . » _ » A-U G-C и

U-" A-U

ТА с °"С А • и U А и . _ . A-U с

•-С G-C » . * G-C

G-C G-C U-A

U-G A-U G-C

и C-G з-с

G-C G-C C-G

А А G А С С-° и А G A-U *

и-л

CrG G-U C-G

•G U G A G U

C-G C-G

Рис.9. "Консенсусна" вторинна структура л1дерно! облает! rplJL оперону семи ентеробактер!й. Буквами позначено консервативн1 нукяеотиди, з!рочками - вар1абельн!. Струхтури, аналог1чн! експериментально п!дтвердженин для E.coli, позначено римсь-кими цифрами.

теробактер!й - з 7. Можливо така строго визначена довжина одноланцю-гових д!лянок мРНК необх!дна для формування л1дер!в у под!бну третин-ну структуру, про наявн1сть яко! у E.coli св1дчать експерименти з магн!йзалежно! х1м!чно! иодиф!кац11 л!дерно1 нРНК (Climle and Friesen, 198В). Структурний анал!з in vitro (Clinie and Friesen, 1988), не п!дтвердив пропоновано! схени регуляцИ трансляц1йно! ак-THBHOCTi мРНК L10 E.coli шляхом конфорнац!йно1! перебудови л!деру, внасгЦдок взаемодИ з б1лкоМ-регуляторои (Christensen et al., 1984). Однак ц1каво, що чотирй клечов! для такого структурного переходу посл1довност1, виявились висохоконсервативниии (рис.10), збер!гаочи, таким чином, можлив!сть форнування альтернативно! конфорнац!!£ л!дер!в з блокованоо облаете посадки рибосом. У E.coli, S.typhinurium, C.freundii, E.cloacae та ^pneumoniae означен! клечов! посл!довност! 1дентичн1. У випадку S.marcescena та Р.vulgaris неэначн1 1нсерцП та альтерац!! в цих д1лянках, очевидно, не впливаоть на принципову мож-лив!сть утворення альтернативно! вторинно! структури ц!е! облает! лидеру (рио.11). BTiM, не виклечена 1нша функц1ональна роль означених ключових. д!лянок. Нуклеотиди G1515, С1548, G1590, G1594, С1634, G1640, АА1571-72, що, як BiflOHo з иутац!.йного анал!зу (Friesen, 1983»

да

}>СЛ

В©' ..,,.,,.««• С

Ь10

> I м * » •

I • I-« > • •

в-с

' • ■» д • * в

в » *-«

I

Схема моясливо! транэицИ "консенсусно!" вторинно! структуры л1дерних областей нРНК rpl.IL оперну семи ентеробактер1й. Буквами позначено консервативн1 нуклеотиди, зхрочками -вар1абельн1. Посл3.довност1, альтернативне спарювання яких забезпечуе переход м1ж .трансльова-ною та блокованою для трансвяцИ структурами мРНК, в!дт1нено. Контуром позначено посл1довнасть Шайн-Далгарно та стартовий кодон.

Рис.11. М0ЖЛИВ1

частков! вторинн! струхтури г1поте-тачно! транс-ляц1йно блокова-ноХ фории л1-деру rplJL

оперону вказаних ентеробахтер1й. Великими буквами позначено консервативно нукле-отиди, маленькими буквами вар1абельн1. Стартовий кодон та nocniflOBHicTb Шайн-Далгарно обведено.

Xgcll С

SiUDUtCVC

I . I I I Ipt-t-U

С О А * A Cl С А О I-

' Ш V А| А Ц 1 S А| '

Ж.coll.

S. cyphieurlue, С. fraundlí, С.elote«*, К.рпаиаоща*.

1 » и í

U 9 О

• Is и Al в А А

С

С U С

и и и

AAA JÓ А CL а

■ IQ V) A|

U 9 С

I ■ I

A U С

II и С I/ CUC

1111 irHn

А а 9 А [РАС I_^

I А С I 0л1 1

Christensen et al., 1984), грають важливу роль у эд1йсненн! регуля-торно! функцИ л!дером E.coli, теж виявились консервативними у вивче-них ентеробактер1й. Таким чинон, з проведеного поргвняльного анал1зу Л1дерних посл!довностей мРКК гену rplJ ентеробактерхй нами виявлено: а) гени rplJ bcíx досл!джених ентеробактер1й кають близьк1 за posHipaMH значн! некодуеч! (л!дерн1) посл!довност1; б) первинн1 структури цих областей виявляють високу гомолог!»; в) ходуюча область у нежах перших 20 кодон!в L10 цистрону, яка, за рахунох г1потетичного в!ддаленого зпарювання з проксимальною частиною наступного L12 цистрону, забезпечуе íx узгоджену трансляц!ю у E.coli, майже повн1стю 1дёнтична в ycix ентеробактер!й; г) експериментально досл1джена для E.coli та прогнозован! для íhuihx ентеробактер1й вторинн1 структури л!дерних областей мРНК reHiB rplJ сп1впадають за своею будовою; д) Bei посл!довност1, що визначають можлив!сть формування характерних вторинних структур - xoHcepBaTHBHi;е) до консервативних структур Належать також посл1довност!, що визначають в£дстан! м!ж сп!рал1зовани-ми д1лянкаки л!деру; с) повну консервативность виявляють також perioHH, як! у E.coli визначено як можливу область-м!шень взаемод!! «РНК э б!лкон НО; ж) в л1дерах ycix ентеробактер!й збер1гаються структура передумови для г!потетично! конформац1йно1 перебудови у нетрансльовану форму; з) за сумою ознак первинних та вторинних структур л!дер!в, досл1джен1 орган!зми роэпод1ляються на 2 спор!днон1 групи: E.coli, S.typhimuriura, C.freundii, Е.cloacae, К.pneumoniae та P. vulgar is, S.marcescens.

na.

висновки

1. вперше показано сп!льн1сть механ1зму регуляцН, на р!вн1 транс-ляц1Х, excnpeciX ген!в rplJL оперону у сени ентеробактер!й! Escherichia coll, ' Salmonella typhinurlim, Serratia marcescens, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae та Proteus vulgaris.

2. Для згаданих opraniaMis виявлено ножлив1сть перехресно! регуляцИ excnpeciX ген1в rplJL б!лкани L10 гетеролог1чного ентеробактер!ально-го походження.

3. Встановлено сп!льн! принципи структурно! орган1эацН л!дерних регуляторних посл!довностей мРНК reHiB rplJL названих ентеробактер!й.

4. Виявлено консерЬативн! структурн1 елененти л!дерних посл!довнос-тей rplJL ген!в эгаданих орган!зн1в, необх1дн1 для эабезпечення ие-хан!зну ауторегуляцН. До так»йс еленент!в в!днесено 5 одноланцюгових д1лянок л!деру та, переважно, стебла п'яти двосп!ральних структур.

5. Показано наявн!сть, аналог1чноХ E.coli, залежно п^порядкованоХ трансляцИ LI 2 цистрону у Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium та, принайми!, структурн1 переду-иови ' тахоХ . п!дпорядкованост! у Enterobacter cloacae, Serratia marcescens i Proteus vulgaris.

6. Визначено нуклеотидну посл!довн!сть 5'-областей оперон!в rfilJL у Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens та Proteus vulgaris. 1нформац1о передано до м1жнародного банку посл!довностей EMBL.

7. Розроблено метод к!льк1сноХ о ц in к и регуляторноХ ефективност1 6iflxoBoX (LI0) та РНК-овоХ (л!дер rplJL оперону) складових механ1эму трансляц1йного контроле excnpeciX ген!в rplJL.

8. Розроблено ефективн1 иетоди трансфорнац!Х, шляхом елехтропорацН, кл!тин ентеробахтер1й Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae та Salmonella typhimurium.

ПЕРЕЛ1К ГОЛОВНИХ ДРУКОВАНИХ РОБ1Т ЗА ИАТЕР1АЛАИИ ДИСЕРТАЦ11

1. Определение минимального сегмента рибосомного белка LIO E.coli, сохраняющего регуляторную функцию / Патон Е.Б., КрупсКая И.В., Живо-луп А.Н.- ДАН СССР, 1989, Т309, N2, с,493-496.

2. Patón Е.В., Woodmaska M.I., Zhyvoloup A.M., Kroupskaya I.V. The nucleotide sequence of gene rplj encoding ribosomal protein L10 of Salmonella typhimurium. Nucleic Acids Research, 1990, V18, N9, P2824.

3. Patón E.B., Woodmaska M.I.,;' Kroupskaya I.V., Zhyvoloup A.N., Matsuka O.Kh. Evidence for the ability of L10 ribosomal proteins of Salmonella typhimurium'and Klebsiella pneumoniae to regulate rplJL genes expression in E.coli. FEBS Letters, 1990, V265, N1,2, P129-132.

4. Zhyvoloup A.N., Woodmaska M.I., Kroupskaya I.V., Patón E.B. Nucleotide sequence of the rplJL óperon and the deduced primary structure of the encoded L10 and L7/L12 proteins of S. typhimurium compared to that of E.coli. Nucl. Acids Res., 1990, V18, N15, P4620.

5. Живолуп A.H., Кириченко И.В., Патон E.B... Рибосомный белок LIO Escherichia coli способен регулировать экспресию генов rplJ Salmonella typhimurium.- Биополимеры и клетка, 1992, т.8, N3, с.37-39.

6. Живолуп А.Н., Патон Е.Б. Возможность гетерологической регуляции экспрессии генов оперона rplJL Klebsiella pneumoniae белхом LIO Escherichia coli.- Там же, Í992, т.8, N3, с.51-53.

7. Живолуп A.H., Патон Е.Б. Регуляторная способность рибосомного белка L10 Escherichia coli выявлена в отношении экспрессии генов опёрона rplJL Citrobacter freundii.- Там же, 1993, т.9, N6, с.88-90.

8. Сравнение in vivo регуляторной способности рибосонних белков НО с различной первичной структурой / Живолуп А.Н., Крупская И.В., Вуд-маска'М.И., Патон Е.Б.- Там же, 1992, т.8, N3, с.39-42.

9. Comparison of nucleotide sequences of the rplJ leader in enterobacteria / Zhyvoloup A.N., Kroupskaya I.V., Lyaskovsky T.M., Patón E.B.- Там же, 1994, т.10, HI, с.37-40.

Structural bases of rplJL genes expression autoregulation mechanism in Enterobacteria.

Conclusions of summary of PhD thesis.

1. The similarity of regulation mechanism of rplJL gene operon expression at the level of translation has been shown among seven Enterobacteria: Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Citrobacter freundii,'Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae and Proteus vulgaris.

2. For organisms mentioned the plausibility of cross regulation of rplJL genes expression by L10 proteins of heterological bacterial origin has been discovered:

3. The similar principles of structural organization of the leader regulatory sequences of rplJL mRNA of mentioned Enterobacteria have been discovered.

4. Conservative structural elements of rplJL gene , leader sequences of mentioned organisms that are necessary for feedback regulatory mechanisms have been shown. For such an elements belongs the 5 single-stranded sites ' and preferably stems of 5 double-stranded structures of leader.

5. The coupled translation of L12 cistron, similar to E.coli one, has been shown for Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium, and at least structural prerequisites of such a coupling for Serratia marcescens, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae and Proteus vulgaris have also been shown.

6. The primary sequences of 5'-regions of rplJL Operons in Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae and Proteus vulgaris have been determined. The information has been sent to EMBL Data Library.

7. The in vivo method of quantitative estimation of regulatory effectivity of protein- (L10) and RNA- (rplJL leader) components of rplJL feedback expression mechanism has been developed.

8. The effective methods of transformation by electroporation for Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae have been developed.

Шдписано до друку I2.CW-.94p форцат 60x04/16 Пап1р друк. Умов, друк.л. 1.0. Тираж 100 прицГрник. Заказ

Надруковано ЦУОП ДНПП "Плодвинкомсерв" и. Ки1в , Саксаганського , X