Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Векторные системы на основе бактериофага М13

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Векторные системы на основе бактериофага М13"

Министерство здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"

Р Г Б ОД

На правах рукописи

- 2 ОКТ 1395

ИЛЬИЧЕВ АЛЕКСАНДР АЛЕКСЕЕВИЧ

ВЕКТОРНЫЕ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИОФАГА М13

03.00.03 - молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ

в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Кольцове, 1995 г.

НАУЧНЫЕ КОНСУЛЬТАНТЫ:

доктор биологических наук, профессор, академик РАН Л.С.Сандахчиев

доктор биологических наук, профессор, С.Н.Щелкунов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор химических наук, профессор, академик РАН Д.Г.Кнорре доктор химических наук, профессор Э.Г.Малыгин доктор биологических наук, профессор Н.А.Колчанов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт молекулярной биологии РАН им.В.А.Энгельгардта, г.Москва

Защита диссертации состоится & 1995 г

в 7 "— часов на заседании диссертационного совета Д 074.20.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии "Вектор" по адресу: 633159, Кольцово, Новосибирской обл.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ "Вектор".

Диссертация в виде научного доклада р—

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Нитевидный бактериофаг М13 сыграл существенную роль в становлении и развитии методологии рекомбинантных ДНК. Широкое использование бактериофага М13 в экспериментальной практике молекулярно-биологических исследований (сиквенс ДНК, получение радиоактивных проб ДНК для гибридизации, сайт-направленный мутагенез) связано прежде всего с особенностями его жизненного цикла. Этот бактериофаг входит вместе с fl и fd в группу близкородственных фагов под общим названием Ff. Он специфичен к клеткам Е. coli, несущим F фактор и имеющим половые ворсинки. Геном бактериофага представляет собой одноцепочечную ковалентно замкнутую кольцевую ДНК. В процессе воспроизводства геномная ДНК проходит стадию двухцепочечной реп-ликативной формы (РФ). Отличительной чертой морфогенеза нитевидных бактериофагов является то, что вирион собирается не внутри бактерии, а на мембране. По мере выхода из клетки одноцепочечная ДНК покрывается белками оболочки, и вновь собранные частицы секретируются во внеклеточное пространство. Зараженная клетка не лизируется фагом, продолжает расти, хотя и с несколько меньшей скоростью. Фаг не теряет жизнеспособность при широком варьировании размеров генома, что позволяет использовать его в качестве клонирущего вектора.

Несмотря на уникальные особенности нитевидных бактериофагов они не нашли должного применения в решении задач одного из важных направлений современной генной инженерии и биотехнологии - достижения эффективной экспрессии чужеродных генов в клетках бактерий. Проведение такого рода исследований дает не только новые возможности экспериментаторам, но и расширяет наши представления об используемом объекте.

В последнее время интерес к нитевидным бактериофагам существенно возрос в связи с новым активно развивающимся направлением генной инженерии, получившим название "пептидный дисплей на капсидах нитевидных бактериофагов" или просто "фаговый дисплей". Суть фагового дисплея заключается в экспонировании пептидов и белков на поверхности инфекционной частицы нитевидного бактериофага путем экспрессии чужеродного генетического материала в виде слитого с одним из его покровных белков единого полипептида. Физическая сцепленность анализируемого полипептида и кодирующего его генетического материала в составе одной

фаговой частицы обеспечивает возможность очень простого отбора и ан; лиза вариантов белковых молекул, эспонированных на поверхности bi риона. Данная техника открывает новые возможности в исследовании toi ких механизмов молекулярных взаимодействий и представляется весьм перспективной для создания вакцин и диагностических тест-систем.

До начала настоящей работы была известна лишь одна векторная cm тема экспонирования чужеродных пептидов на поверхности нитевидны бактериофагов, основанная на использовании минорного белка (А-белк; оболочки, представленного в вирионе только пятью копиями. Более npi влекательным для решения некоторых задач фагового дисплея может быт основной белок (В-белок) оболочки, представленный в вирионе тремя ть сячами копий. Однако до нашей работы в литературе не было описано пс лучения нитевидных бактериофагов даже с минимальными изменениям! такими, например, как единичные делеции или вставки аминокислотны остатков в В-белке без существенной или полной потери их инфекционнс сти.

Цель и задачи исследования. Основная цель настоящей работы заклк чалась в создании систем экспрессии клонированных в Е. сой генов с ис пользованием фага M13, и исследовании их характеристик на примере ря да генов, разработке способов получения жизнеспособных вариантов фаг M13 экспонирующих на своей поверхности чужеродные пептиды в состав основного белка оболочки.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить еле дующие основные задачи:

-клонировать в составе бактериофага М13 ген а2-интерферона чело века и ген РНК-полимеразы бактериофага Т7;

-изучить факторы, влияющие на экспрессию чужеродных генов, кло нированных в составе бактериофага M13;

-разработать векторную систему экспрессии чужеродной генетическо! информации, зависимой от РНК-полимеразы бактериофага Т7, с раздель ным введением в клетку целевого гена и гена РНК-полимеразы. Исследо вать факторы, влияющие на экспрессию генов различного происхожденш при использовании данной системы;

-на основе бактериофага M13 получить векторы для экспонированш на поверхности вириона чужеродных пептидов;

-исследовать возможность направленной реконструкции основного белка оболочки нитевидного бактериофага М13 для задач фагового дисплея и создания на его основе иммуногенно-активных частиц.

Научная новизна и практическая значимость работы. На примере синтетического ген-эквивалента а2-интерферона человека (HuIFa2) и гена РНК-полимеразы бактериофага Т7 исследованы возможности бактериофага М13 в качестве вектора экспрессии чужеродной генетической информации в клетках Е. coli. Продемонстрировано, что бактериофаг М13, несущий чужеродные гены, способен обеспечить высокую продукцию соответствующих полипептидов в инфицированных бактериях. Проведено сравнительное изучение экспрессии в клетках Е. coli гена а2-интерферона, находящегося в составе плазмидного вектора серии pBR или бактериофага М13. Впервые установлено, что более высокий уровень синтеза интерферона обеспечивает фаговый вектор. Получен высокоэффективный продуцент РНК-полимеразы бактериофага Т7, на основе которого в НПО "Вектор" налажено производство этого фермента.

Впервые предложен и экспериментально обоснован новый подход к экспрессии клонированных в Е. сой генов. Сконструирована и подробно исследована система для экспрессии генов, основанная на раздельном введении в клетки бактерий целевого гена, находящегося в составе плазмидного вектора под контролем позднего промотора ТФ10 бактериофага Т7, и гена соответствующей РНК-полимеразы, клонированной в составе бактериофага М13. В рамках исследования осуществлено молекулярное клонирование кДНК а 1-антитрипсина человека, установлены различия в клонированной последовательности от опубликованной ранее. Получены бактериальные штаммы-продуценты: 1) важного для медицины белка - al-анти-грипсина человека; 2) иммуногенно-значимых фрагментов белка Е2 вируса зенесуэльского энцефаломиелита лошадей, представляющих интерес для шагностики и создания молекулярной вакцины против указанного забо-гевания.

Впервые экспериментально доказана возможность использования основного белка оболочки нитевидных бактериофа гов для задач фагового хисплея. Получены жизнеспособные производные фага М13 со встройкой в эсновной белок оболочки чужеродных пептидов. Продемонстрирована зозможность создания искусственных иммуногенов при встройке антиген-шх детерминант в В-белок фага М13. Полученные результаты указывают

на возможность направленного изменения антигенных и иммуногенны свойств В-белка нитчатого фага М13 и его использование в качестве nocí теля пептидных антигенных детерминант.

Полученные в данной работе рекомбинантные плазмиды, штаммы фг гов, бактерий и синтезируемые ими продукты переданы в ряд научных ор ганизаций, где они нашли применение для научно-исследовательских прикладных целей: Институт биоорганической химии им. Шемякина РАБ Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН; Институт ци тологии и генетики СО РАН; Институт молекулярной биологии и генетик! АН Украины; Университет им. Каминского, Братислава, Словацкая рес публика; 2-ой Римский университет, Италия; Бостонский университет США; Институт молекулярной биофизики при университете штата Фло рида, США и др.

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты был1 доложены на различных конференциях и симпозиумах,в том числе: Всесо юзных конференциях "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1984 1988, 1990, 1992), Всесоюзной конференции "Гибридные плазмиды и экс прессия плазмидных генов" (Москва, 1984), Всесоюзном съезде микробио логического общества "Достижения микробиологии — практике" (Алма Ата, 1985), Всесоюзной конференции "Итоги и перспективы теоретических практических и клинических исследований по проблеме интерферона' (Тбилиси, 1985), Всесоюзном симпозиуме "Проблемы переноса генетиче ской информации" (Москва, 1985), Всесоюзных конференциях "Геном че ловека" (Москва, 1990, 1991), Международном симпозиуме "Symposium or . bioanalitical methods" (Прага, 1991), Международной конференции "Medical biotechnology immunization and AIDS" (Ленинград, 1991), Международной конференции "Phage display" (Cold Spring Harbor Laboratory Long Island, New York, 1992), Международном семинаре "VIII International Conference on AIDS/III STD World Congress" (Амстердам, 1992), Всероссийской отчетной конференции по направлению "Белковая инженерия' (Москва, 1993), VI конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1994), IV Научно - практической конференции врачей "Актуальные вопросы современной медицины" (Новосибирск, 1994), Международной конференции "Molecular biology at the border of XXI century. Genome structure and functional analysis" (Москва, 1994), а также на научных конференциях НПО "Вектор" и семинарах факультета естествен-

ных наук Новосибирского государственного университета, кафедры природоведения Университета Братиславы, кафедры физики Бостонского университета, кафедры биологии 2-го Римского университета, Института молекулярной биофизики при университете Талахаши Флорида, США, на презентации ГНЦ Вирусологии и Биотехнологии "Вектор" в Польше (Варшава - Гданьск, 1994).

Работа выполнена в 1984-1993 годах в НПО "Вектор" в рамках научных тем НПО "Вектор" и по грантам государственных научно-технических программ "Геном человека", "Новейшие методы биоинженерии", "Новейшие методы биотехнологии". На разных этапах ее выполнения в ней приняли участие 0.0. Миненкова, Н.В. Тикунова, Г.А. Кузмичева, у которых автор являлся научным руководителем диссертационных работ, а также С.Н. Щелкунов, С.И. Татьков, С.Я. Головин, В.Н. Красных, Н.В. Меламед, H.H. Микрюков, H.H. Карпышев, A.M. Ерошкин, Г.П. Кищенко и другие сотрудники НПО "Вектор", которым автор приносит искреннюю благодарность.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 43 работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ ECSERICHIA COLI ГЕНА а2-ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА КЛОНИРОВАННОГО В СОСТАВЕ БАКТЕРИОФАГА М13 и ПЛАЗМИДНОГО ВЕКТОРА pBR327

Интерфероны человека в силу их большого научного и практической значения входят в число наиболее популярных объектов приложения мето дов генной инженерии. Для клонирования и экспрессии генов этих белко] как правило использовались плазмидные векторы на основе ColEI репли кона (Kingsman and Kingsman., 1983). Наш интерес к бактериофагу МГ прежде всего был обусловлен тем, что копийность репликативной формь его ДНК составляет 200 молекул на клетку, обеспечивая более высокую i сравнении с плазмидными векторами серии pBR дозу клонированного ген; (Lerner, 1981). Кроме того, нитевидные фаги не лизируют клетку хозяина, í продукты его биосинтеза в виде зрелой частицы секретируются наружу, ш накапливаясь в клетке (Denhard et al., 1978).

Для нашей работы был взят искусственный ген-эквивалент лейкоцитарного интерферона - а2, синтезированный и клонированный совместными усилиями исследователей из ИБХ РАН и ВНИИ МБ (Колосов, Сандах-чиев и др., 1984). Так как последовательность гена включала в себя только кодирующую часть, необходимо было снабдить ее сигналом инициации трянсляции. С этой целью был получен фрагмент ДНК, включающий участок связывания рибосом гена trpD Е. coli, который синтезировали в виде четырех олигонуклеотидов, сшивали в дуплекс и объединяли со структурной частью HuIFcc2 (рис.1). Последовательность участка связывания рибосом предложена сотрудниками ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов и детально ими исследована при экспрессии другого гена из семейства лейкоцитарных интерферонов (Машко и др., 1987).

Для достижения экспрессиии в бактериальных клетках эукариотиче-ских кодирующих последовательностей необходимо состыковать их с эффективными для клетки реципиента промоторами. Чтобы оценить силу промотора, нужно измерить частоту, с которой инициируется синтез соответствующей мРНК. Однако, эту величину достаточно трудно определить в экспериментах in vivo. В то же время относительную эффективность

HuIF cx2

SalGI

AATTGGAACAGGAGACTTT CTGATGTG

ССТТСТССТСТСАААбАСТАСАСАТАС

I

Рис 1. Последовательность фрагмента ДНК, кодирующего участок связывания

рибосом, и схема его объединения с геном а2-интерферона. Стрелками указаны места сшивки олигонуклеотидов, подчеркнуты БО - участок и инициирующий кодон.

промотора можно оценить непрямым способом - по уровню синтеза определенного белкового продукта, кодируемого геном, находящимся под контролем исследуемого промотора. При этом важно иметь тест-систему, позволяющую достаточно просто оценивать эффективность функционирования промоторов in vivo, так как прямых методов тестирования синтезируемых в бактериях эукариотических белков, как правило, нет. Для преодоления данного затруднения нами опробована простая система отбора генетических конструкций, обеспечивающих эффективный синтез в клетках Е. coli человеческого а2-интерферона. С этой целью была сконструирована

плазмида рЕМВ101 (рис.2), в которой собран гибридный "оперон", состоящий из тандемно расположенных генов Ни1Ра2 и

Рис2. Схема конструирования плазмиды рЕМВЮ1 и ее промоторсодержащих производных

Каждая из кодирующих последовательностей имеет собственный учас-

ток связывания рибосом (11В81 и КВБ2 соответственно), что обеспечивает автономную трансляцию интерферона и 1е1-белка с единой химерной молекулы мРНК. При встройке в рЕМВ101 по участку рестрикции ЕсоМ промоторных фрагментов, способных направлять транскрипцию в сторону гена 1е1, можно легко отбирать клоны клеток с нужными гибридными плазмидами по признаку устойчивости их к тетрациклину.

Плазмиду рЕМВЮ1 использовали для получения генетических конструкций, в которых экспрессия гена интерферона контролировалась различными промоторами.

Таблица I

Противовирусная активность экстрактов клеток E.coli, содержащих плазмиды серии рЕМВ

Плазмида Промотор Активность Концентрация

интерферона. тетрациклина

МЕ/л культуры* мкг/мл***

pEMBlOl — — —

рЕМВ102 SP02 (6,1 ± 2,5) х 106 44 + 2

рЕМВЮЗ TRP1 (7,2 ± 1,8) хЮ4 18 ± 1

рЕМВ104 АТ7 (6,4 ±3,3) xi О5 27 + 3

рЕМВ104-2 АЛ** (1,3 ±0,4) хЮ6 67 ±6

рЕМВ!05 ВТ7 (1,5 ± 0,4) х 10s 33 ±3

рЕМВ105-2 ВТ7** (4,1 ±0,7) х 10« 50 ± 4

рЕМВЮб lacUV5 (4,8 ±0,9) хЮ5 25+ 1

рВР327 tet — 48 ±4

* Титр клеток в культуре = 2 х 108 кл/мл. ** Встроен тандемно дуплицированный промотор.

*** При указанной концентрации на агаризованной среде вырастает 50% колоний.

Для встройки применяли ранее охарактеризованные фрагменты ДНК, содержащие ранние промоторы А2 и В фага Т7, гена lacZ E.coli (Серпинский и др., 1982; Кравченко и др., 1984), гена TRP1 Saccharomyces cerevisiae (Tschumper and Carbon, 1980) и раннего промотора фага SP02 Bacillus subtilis (Williams et al., 1981). Каждый из используемых промоторов, будучи встроенным в плазмиду pEMBlOl в правильной ориентации, приводил к восстановлению экспрессии гена tet. Это сопровождалось при-

обретением трансформантами устойчивости к тетрациклину. Было получено несколько плазмид pEMBlOl со встройкой индивидуальных промотор-ных фрагментов (табл.1). Плазмиды рЕМВ104-2 и рЕМВ105-2 содержали по два тандемно расположенных фрагмента с промоторами А2 и В фага Т7 соответственно, ориентированных в сторону генов интерферона и tet.

Культуры E.coli, содержащие сконструированные гибридные плазмиды, исследовали на способность продуцировать биологически активный интерферон, а также определяли уровень их устойчивости к тетрациклину. Уровень продукции интерферона в бактериальных культурах как в этом случае, так и в последущих экспериментах определяли по подавлению ци-топатического действия вируса везикулярного стоматита штамма Индиана в культуре диплоидных фибробластов человека (Goeddel et al., 1980). Полученные результаты свидетельствуют о том, что все исследуемые промоторы могут участвовать в экспрессии in vivo как гена tet, так и гена интерферона (см. табл. 1).

При рассмотрении результатов, представленных в табл.1, видно, что существует корреляция между продуктивностью штаммов по интерферону и уровнем устойчивости их к тетрациклину. Выявленная закономерность позволяет предложить простой подход к отбору более продуктивных штаммов E.coli по интерферону: в плазмиду pEMBlOl можно встраивать промоторные фрагменты из ДНК любого происхождения и предварительный отбор гибридов осуществлять по детерминированному ими уровню устойчивости к антибиотику. Наиболее эффективно функционирующие по этому признаку гибриды можно затем тестировать по продукции интерферона. Важно подчеркнуть, что данный подход непрямой оптимизации транскрипции можно, по-видимому, распространить и на любые другие эукариотические гены. Из табл. 1 также видно, что наиболее эффективным является промотор фага SP02, а дупликация промоторов приводит к повышенному выходу целевого продукта. Аналогичные данные были получены и в работах других авторов при дупликации промоторов лактозного оперона (Goeddel et al.,1979,1980; Овчинников и др., 1982).

Для конструирования гибридных фагов М13, способных обеспечить экспрессию гена HuIFa2, мы воспользовались вектором М13шр8. Вначале в составе этого вектора был клонирован EcoRI-SalGI фрагмент ДНК из плазмиды рЕМВЮ (см. рис.1), включающий в себя структурную часть гена HuIFa2 с участком связывания рибосом. Гибридный фаг обозначили

М13шЫ2. На рис.3 представлена нуклеотидная последовательность области инициации трансляции гена НиШа2. Из рисунка видно, что рамки считывания гена интерферона и гена Р-галактозидазы, входящего в состав исходного фага М13шр8, не совпадают. Следовательно, синтез интерферона может осуществляться только при трансляции мРНК с искусственного участка связывания рибосом.

М13шр8

Met Thr Met lie Thr Asn Ser...Ser Val Asp...Gin Pro Ser Leu... atg acc atg att acg aat tcc. . . tcc gtc gac ■ . . cag cca agc ttg. . .

EcoRI SalGI Hindlll

M13mbl2

SD Met Суз Stop

atg acc atg att acg aat tcg aac agg aga ctt tct g atg tgt. . . tag. . .

EcoRI RBS1

Рис.3. Структура начала lacZ-области векторного фага M13mp8 и гибридного фага М13тЫ2, несущего искусственный ген инерферона человека. Стрелками указано начало и направление транляции мРНК генов lacZ и интерферона

Для исследования экспрессии гена интерферона первоначально нами был использован штамм JM103, широко применяемый в работе с векторами на основе фага М13. Этот штамм является суперпродуцентом репрессора 1ас-оперона (Messing, 1979), поэтому для эффективной транскрипции гена интерферона с 1ас-промотора фага M13mbl2 к инфицированным клеткам необходимо добавлять специфический индуктор - ИПТГ.

Из представленных в табл.2 данных видно, что уровень продукции интерферона, определенный в неочищенных экстрактах клеток JM103, инфицированных гибридным фагом М13тЫ2 в присутствии ИПТГ, равен 1,2x107 МЕ/л культуры. При этом мы не выявили существенной разницы в продукции интерферона в зависимости от того, был ли индуктор добавлен до, во время или после инфекции клеток гибридным фагом. Следует отметить, что заметный синтез интерферона наблюдается и без индуктора. Это свидетельствует, вероятно, о том, что транскрипция с промотора Piac по-

давляется не на всех молекулах ДНК фага вследствие недостаточно высо кого содержания молекул репрессора в клетке.

Таблица:

Экспрессия гена интерферона в клетках Е. coli, инфицированных гибридными фагами

Фаг Штамм E.coli Наличие ИПТГ Количество измерений Активность интерферона, МЕ/л культуры*

MI3mbl2 JM103 — 4 (5,8+ 1,3) х 10«

MI3mbl2 JM103 + 7 (1,2 +0,4) хЮ7

M13mbl2 CSH36 — 6 (1,1 + 0,2) хЮ7

MI3mbl5 JM103 — 5 (2,1 +0,3)хЮ7

Ml3mbl5 ' JM103 + 5 (5,1 + 0,7) хЮ7

M13mbl5 CSH36 — 5 (3,4 + 0,3) хЮ7

* Определялась через 4 ч после инфицирования клеток

Инфекция гибридным фагом клеток реципиента фактически является моментом запуска экспрессии гена интерферона, и в этом случае было интересно проверить, как экспрессируется исследуемый ген в безрепрессор-ном штамме. Проведение такого эксперимента диктовалось также тем, что использование ИПТГ может явиться нетехнологичным из-за его относительно высокой цены. Исходя из вышеизложенных соображений, в качестве хозяина для инфекции гибридным фагом был применен штамм Е.соП СБНЗб, у которого отсутствует синтез 1ас-репрессора. В этом случае транскрипция клонированного гена в гибридном фаге М13мЬ12 должна осуществляться конститутивно. Результаты анализа (см. табл.2) показали, что значения уровня экспрессии интерферона в штаммах СБН36 без индуктора и .Ш103 в присутствии ИПТГ сравнимы. При работе с плазмидой рЕМВ101 нами было показано, что тандем промоторов А2 или В фага Т7 приводит к повышению экспрессии гена интерферона (см. табл 1). Поэтому было решено сконструировать гибридный фаг, ДНК которого содержит ген интерферона с расположенным перед ним тандемом промоторов. Поскольку промотор фага БР02 В.эиЫШз обеспечивал наибольший по сравнению с другими изученными нами промоторами уровень продукции интерферона в клетках Е.соП, именно он был использован для конструирования желаемого фага.

EcoRI

EcoRI

EcoRl

psro2^V. HuIF a2

Hind III

Неполный гидролиз EcoRI Hind III

SPQ2

EcoRI EcoRI EcoRI+Hind III Щелочная фосфатаза

Hind III

ДНК-лигаза фага T4 EcoRI

Hind III

Рис.4. Схема конструирования бактерофага М13mb 15

По схеме, представленной на рис.4, создали фаг М13шЫ5, который использовали для инфицирования клеток Е.соП (штаммы .1М103 или СБНЗб). В лизатах этих клеток определяли уровень активности интерферона. Результаты тестирования показывают (табл.2), что тандем промоторов РыгРзрог по сравнению с одним Р|ас обусловливает увеличение экспрессии гена интерферона в штамме СБНЗб примерно в 3 раза. Анализ продукции интерферона в штамме ЛУПОЗ в присутствии индуктора и без него показал, что транскрипция гена интерферона осуществляется, очевидно, с обоих промоторов, а вклад каждого из них приблизительно одинаков.

На основании результатов проведенных экспериментов можно заключить, что введение структурного гена интерферона, соединенного последовательностью ДНК, кодирующей участок связывания рибосом, в многоко-пийный вектор М13шр8 позволяет получить более высокий уровень продукции эукариотического белка в клетках Е. coli, чем при использовании плазмидного вектора (см. табл. 1 и 2). Продемонстрирована эффективность использования тандема промоторов, состоящих из гетерологичных единиц инициации транскрипции.

Определенный интерес при работе с такого типа продуцентами вызывает возможность масштабирования процесса. С этой целью клетки Е. coli штамм CSH36 культивировали на ферментере Ultraferm в объеме 3 л жидкой питательной среды, г/л: пептон (отечественного производства, г. Семипалатинск) - 10; экстракт дрожжевой ("Биолар", Олайна) - 5; КН2Р04 -2; Na2HP04 - 6; NaCl - 5. В ранней экспоненциальной стадии роста (титр 23 х 10' кл./мл) клетки CSH36 инфицировали фагом M13mbl2 с множественностью 100. Через 4 часа после инфекции клетки осаждали центрифугированием, лизировали и неочищенные экстракты тестировали на наличие противовирусной активности интерферона. Проведено четыре независимых операции культивирования, и в экстрактах клеток выявлена активность интерферона, составившая (1,3 + 0,4) х 107 МЕ/л. Необходимо отметить, что получаемый в результате культивирования супернатант содержит исходный фаг М13гпЫ2 в высоком титре; он может быть использован для последующего инфицирования клеток Е. coli. Как видим, нитевидные фаги можно с успехом использовать для масштабирования процесса получения эукариотических белков, в частности, интерферона человека, с помощью микробиологического синтеза.

Глава 2. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ ESCHERICHIA COLI С ПОМОЩЬЮ СИСТЕМЫ, ОСНОВАННОЙ НА РНК-ПОЛИМЕРАЗЕ И ПОЗДНЕМ ПРОМОТОРЕ Ф10 БАКТЕРИОФАГА Т7

Достижение экспрессии гетерологичных генов, транскрипция которых осуществляется РНК-полимеразой бактериофага Т7, имеет ряд преимуществ в сравнении с РНК-полимеразой Е. coli. Во-первых, РНК-полимера-за Т7 отличается высокой селективностью в узнавании своих промоторов и не инициирует транскрипцию с промоторов, узнаваемых хозяйской РНК-полимеразой. Во-вторых, процесс элонгации, осуществляемый этим ферментом, происходит примерно в пять раз быстрее в сравнении с РНК-полимеразой E.coli (Golomb & Chamberlin, 1974; Tabor & Richardson, 1985, 1986; Dwarakanath et al., 1989).

Описано два типа векторных систем, в которых транскрипция клонированных генов регулируется поздним промотором бактериофага Т7. Первый тип характеризуется одновременным присутствием в бактериальной клетке как целевого гена, встроенного в многокопийную плазмиду, так и гена Т7 РНК-полимеразы, находящегося на той же плазмиде или хромосоме хозяина. Однако, такой подход не дает возможности индуцировать транскрипцию в заданный момент времени, поскольку имеющая место неполная репрессия гена РНК-полимеразы, находящегося под контролем любого индуцибельного промотора, даже при низком уровне синтеза фермента приводит к конститутивному синтезу целевого полипептида (Studier & Moffatt, 1986).

Второй тип основан на раздельном введении генов. Предварительно трансформируют клетки Е. coli плазмидой с экспрессируемым геном, затем инфицируют их бактериофагами Т7 или X, несущими ген РНК-полимеразы Т7 (Studier & Moffatt, 1986; Rosenberg et al., 1987). Однако, при использовании этих бактериофагов как носителей гена РНК-полимеразы возникает ряд трудностей, связанных прежде всего с быстрым лизисом инфицированных культур и накоплением в клетке продуктов биосинтеза носителя. Существенные преимущества для достижения экспрессии гетерологичных генов в системах такого типа могут обеспечить нитевидные бактериофаги, которые размножаются в клетках хозяина, не лизируя их, и не накаплива-

. - 16

ются внутри бактерии, секретируясь, в виде зрелых частиц, в культураль ную жидкость. (Denhard et al., 1978).

В этой связи нами была создана векторная система, позволяющая экс прессировать в Е. coli чужеродные гены под контролем позднего промото ра бактериофага Т7 с использованием в качестве носителя гена соответст вующей РНК-полимеразы нитчатого бактериофага М13. Конструировани элементов системы и исследование с ее помощью экспрессии полусинтети ческого гена ß-галактозидазы (ген lacZ), фрагментов гена белка Е2 вирус; венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) и гена а 1 -антитрипсин) (ААТ) человека приведено ниже.

2.1. Конструирование фагов М13, несущих в своем составе reu Т' РНК-полимеразы фага Т7, и исследование экспрессии клонированноп гена в клетка Е. coli

Первый этап работы заключался в конструировании бактериофаго! М13, способных обеспечить продукцию РНК-полимеразы Т7 в инфициро ванных ими клетках Е. coli. Было сконструировано два фага, которые по лучали путем встройки фрагментов (BamHI-BamHI или Sau3AI-BamHI) и: плазмиды pARI (Studier, Moffatt , 1986) в полилинкерную область векторг М13шр10 по участку рестрикции BamHI. Рестрикционные и генетически* карты сконструированных фагов, обозначенных М13ро1Т7-1 и М13ро1Т" соответственно, представлены на рис. 5.

. Ч ■

Как видно из рисунка, ген РНК-полимеразы Т7 в фаге М13ро1Т7-1 сонтролируется тандемом lac-промоторов. Один из них принадлежит век-ору, а второй промотор и полноценный ген 1ас-репрессора, разделяющий ix, ведут свое присхождение от плазмиды pARI. В случае фага М13ро1Т7 :онтроль транскрипции осуществляется только промотором вектора. 1роцесс инициации трансляции в обоих фагах обеспечивается участком :вязывания рибосом гена РНК-полимеразы.

Анализ экспрессии гена РНК-полимеразы в клетках Е. coli, инфициро-|анных фагами М13ро1Т7-1 и М13ро1Т7, показал, что оба фага обеспечи-¡ают синтез целевого продукта. При этом, в одинаковых условиях синтез 'НК-полимеразы в клетках, инфицированных фагом М13ро1Т7-1, был в [етыре-пять раз ниже. Этот факт скорее всего объясняется наличием в со-таве М13ро1Т7-1 гена 1ас-репрессора (см. рис.6), экспрессия которого мо-кет существенно снижать синтез целевого продукта. Кроме того, встроен-[ый фрагмент ДНК в геноме фага М13ро1Т7-1 был в отличие от М13ро1Т7 1естабилен. Так после выращивания бактериофага М13ро1Т7-1 в течение 1 часов примерно половина вирионов не содержала в своем геноме встро-нного фрагмента ДНК. Разница в стабильности объясняется, вероятно, >азмером встроенных фрагментов ДНК (в случае М13ро1Т7-1 - 4240 п.о., щя М13ро1Т7 - 2694 п.о.), что отмечается многими исследователями рабо-ающими с нитевидными фагами (Маниатис и др., 1988).

В этой связи уровень продукции РНК-полимеразы в клетках Е. coli де-ально исследовали на примере фага М13ро1Т7. Была проверена зависи-юсть выходов целевого продукта от множественности заражения клеток, реды культивирования и штамма-хозяина. Количество синтезируемого зермента в инфицированных клетках определяли денситометрией элек-рофореграмм гелей и по ферментативной активности. Результаты денси-1етрических измерений, проведенных на Chromoskan 400, суммированы в абл.З.

Как видно из таблицы, изменение множественности инфицирования с |Дной фаговой частицы до 100 существенно не сказалось на уровне проекции фермента. Изучение динамики биосинтеза целевого белка показа-:о, что при множественности 1:1 максимальный уровень продукции достается через 6-8 часов. Замена среды культивирования YTx 1 на YTx2 (в 2 1аза более богатую по содержанию триптона и дрожжевого экстракта) ¡риводила к полуторакратному увеличению выхода РНК-полимеразы Т7.

Заметный эффект на выход фермента наблюдался и при переходе с штамм; 1М109 на ЮШЬЕ', что вероятно связано с мытациями штамма 1М109 п< генам ответственным за синтез клеточной стенки (УашвсЬ-Реггоп « а1. 1985).

Таблица

Экспрессия гена РНК-полимеразы Т7 в клетках Е.соП инфицированных фагом М13ро1Т7

Штамм E.coli Среда культивирования* Множественность инфицирования культуры Количество фермента в % от общего белка клетки *

JM103 YTxl 1 10,2+2,0

10 (0,2+1,5

50 10,1 ± 1,4

100 9,8 ±0,8

JM109 YTx2 1 18,3 ±3,6

DH5LP YTx2 1 29,6 ±4,5

* Поскольку ген Т7 РНК-полимеразы в фаге М13ро1Т7 находится под контролем lac промотора, одновременно с инфицированием клеток в среду добавляли ИПТГ до ко нечной концентрации 5х КИМ. Количество фермента определялось через 8 час посл( инфицирования клеток, выращенных до плотности D590=0.6 o.e.

Таким образом, в результате проделанной работы было получено два рекомбинантных бактериофага M13, при инфекции которыми в клетках Е. coli синтезировалась РНК-полимераза Т7. Это обеспечивало возможность продолжения нашей работы по экспресии чужеродного генетического материала в системе, основанной на раздельном введении целевого гена и гена полимеразы. Кроме того, подобранные условия культивирования инфицированных клеток позволили разработать (совместно с лабораторией энзимологии НИКТИ БАВ НПО "Вектор") способ выделения соответствующего фермента, имеющего широкое применение в практике молекуляр-но-биологических исследований; (Reyes and Abelson, 1987; Szewczak et al., 1990; Compton. 1991).

2.2. Исследование экспрессии гена ß-галактозидазы

Кодирующая последовательность гена ß-галактозидазы Е. coli является наиболее популярным объектом для исследования закономерностей, влияющих на экспрессию чужеродной генетической информации в различ-

ных микроорганизмах, что объясняется простым и надежным методом определения ее ферментативной активности (Миллер, 1976) и довольно высокой устойчивостью к протеазам реципиентных клеток. Именно поэтому ген р-галактозидазы был выбран нами в первую очередь для изучения предлагаемой системы экспрессии.

Для конструирования плазмиды с геном Р-галактозидазы под контролем позднего промотора бактерифага Т7 из плазмиды р1^4 (Коробко и др., 1983) вырезали ЕсоШ-5аЮ1-фрагмент ДНК, содержащий ген lacZ с предшествующим ему участком связывания рибосом, и встраивали его в полилинкерную область плазмиды рОЕМ1 (коммерческий препарат фирмы "Ргоше§а", США). Схематическое изображение полученной плазмиды pGEMZ приведено на рис. 6. Мы полагали, что при наличии в клетке РНК-полимеразы фага Т7 клонируемый ген будет транскрибироваться, а участок связывания рибосом обеспечит трансляцию синтезируемой мРНК.

Т7 EcoRI Promoter

Sali

ori

Рис.6. Рестрикционная и генетическая карта плазмиды pGEMZ

Для проверки высказанных предположений клетки Е.соП ЛМ109, трансформированные плазмидой рвЕМг, выращивали до плотности О59о= 0.6, инфицировали фагом М13ро1Т7-1, через 30 минут вносили индуктор 1ас-оперона (ИПТГ) и определяли количество Р-галактозидазы. Полученные данные представлены на рис.7. Можно видеть, что уровень определяемого фермента при инфекции фагом М13ро1Т7-1 плазмидсодержащих клеток в отсутствие ИПТГ так же, как и бесплазмидных клеток в присутствии индуктора, существенно не раз-

личается и не меняется в процессе роста культур. После добавления в куль-туральную среду индуктора происходит резкое увеличение содержания е клетках р -галактозидазы, которое достигает максимума через 3 часа. При этом инфицирование культуры в интервале Огэд = 0,3-1,2 существенно не сказывалось на количестве синтезируемого фермента в пересчете на одну клетку.

Зависимость уровня синтеза Р-галактозидазы от множественности инфицирования плазмидсодержащих клеток фагом М13ро1Т7-1 представлена на рис. 7. Видно, что при множественности инфекции 100 фаговых частиц на клетку и выше продукция р-галактозидазы далее не усиливается, в то время как понижение кратности заражения до 10 фаговых частиц на клетку снижает уровень синтеза фермента, что, вероятно, связано с особенностями бактериофага М13ро1Т7-1, описанными в разд. 2.1.

Время в час

Рис.7. Кинетика синтеза Р-галактозидазы в клетках Е.соП, инфицированных

фагом М13ро1Т7-1: 1- бесплазмидные клетки; 2 - в отсутствие ИТПГ, множественность инфицирования 100; 3, 4, 5 - в присутствии ИПТГ с различной (10, 100 и 300 соответственно) множественностью инфицирования. Активность Р-галактози дазы приведена в единицах активности по Миллеру (Миллер, 1976)

Параллельно с определением активности р-галактозидазы пробы анализировали электрофорезом в 7,5% полиакриламидном геле. В лизатах кле-

ток .1М109, содержащих плазмиду рвЕМ2 и инфицированных фагом М13ро1Т7-1, при отсутствии ИПТГ в культуральной среде не наблюдали белка с молекулярной массой, соответствующей р-галактозидазе, в то время как в присутствии ИПТГ идентифицируются значительные количества этого фермента (рис. 8).

Рис 8. Электрофоретическое разделение белков из лизатов клеток E.Coli JM109, содержащих плазмиду pEMZ и инфицированных фагом М13ро1Т7-1: 1 - неиифицированные клетки; 2 - инфицированные клетки без добавления ИПТГ; 3, 4, 5 - инфицированные клетки с множественностью 10, 100 и 300 соответственно.

Таким образом, на примере гена lacZ мы показали принципиальную возможность экспресии в клетках Е. coli чужеродной генетической информации с помощью векторной системы, основанной на позднем промоторе ТФ10 и гене РНК-полимеразы бактериофага Т7 с использованием в качестве носителя РНК-полимеразы нитевидного бактериофага. В процессе работы нами были замечены недостатки бактериофага М13ро1Т7-1 как носителя (см. разд. 2.1), что побудило нас сконструировать М13ро1Т7. Этот бактериофаг, в отличие от М13ро1Т7-1, обеспечивал такой же уровень экспрессии гена lacZ при более низкой (10-20 частиц) множественности инфицирования клеток, а находящийся в нем ген РНК-полимеразы бактериофа-

га Т7 был стабилен. Поэтому в дальнейших исследованиях мы использова ли бактериофаг Ml Зро1Т7.

2.3. Изучение экспрессии фрагментов гена белка Е2 вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ)

Получение вирусных белков путем микробиологического синтеза яв ляется важным этапом решения ряда задач современной вирусологии Наиболее часто исследуются антигенные и иммуногенные свойства такго белков с целью создания на их основе вакцин и диагностических тест-систем. Однако, экспрессия генов, кодирующих вирусные белки и их фрагменты, в бактериальной клетке часто малоэффективна, что в ряде случаен связано с явлением токсичности чужеродного белкового продукта для клетки хозяина. Убрать указанное негативное явление можно при использовании векторных систем, в которых экспрессия клонируемого гена находится под строгим контролем (репрессией). Это позволяет в оптимальных условиях амплифицировать генетический материал, а затем запускать синтез его продукта. Наиболее полно этим требованиям отвечают системы, подобные предложенной и апробированной нами на гене ß-галактозидазы. В этом разделе приведены данные по изучению экспрессии фрагментов гена белка Е2 ВЭЛ.

Известно, что структурные белки альфавирусов, к которым относится и ВЭЛ, транслируются в виде единого полипротеинового предшественника с субгеномной 26S мРНК с его последующим процессингом, дающим El и Е2 белки, входящие в состав вириона (Kinney et al., 1986). Поэтому для изучения экспрессии гена-эквивалента белка Е2 вируса ВЭЛ в клетках Е. coli плазмида pGEMl была снабжена синтетическим рибосомсвязывающим сайтом, а также терминатором транскрипции РНК-полимеразы Т7, содержащим во всех трех рамках трансляционного считывания сигналы терми-нации трансляции (рис. 9). В полученный вектор был встроен полный ген белка Е2 (плазмида pGEME-18). Затем клетки E.coli JM109, несущие pGME-18, инфицировали фагом М13ро1Т7. Анализ экспрессии целевого гена проводили с помощью электрофореза белков из инфицированных клеток в SDS-полиакриламидном геле. Однако идентифицировать этот белок на электрофореграмме не удалось. Вероятно, это связано с тем, что белок Е2, являясь мембранным, имеет на С-конце два гидрофобных домена и за-

ряженную карбокси-концевую область, которая служит якорем этому гли-копротеину в мембране эукариотической клетки (Kinney et ai., 1986), что может препятствовать достаточно высокой продукции полноразмерного белка Е2 бактериальной клеткой.

5 ' -gatccaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggtttttt 3 ' - gttattgatcgtaxtggggaaccccggagatttgcccagaactccccaaaaaactag

BarnHI t Sau3A

а)

5' -aattcggaggaaaaaattatgg

3'- gcctccttttttaataccctag б)

EcoRI BamHI

Рис. 9. Нуклеотидная последовательность синтетических дуплексов ДНК, кодирующих:

а) терминатор транскрипции РНК-полимеразы фага Т7 (Тф)

б) участок связывания рибосом (RBS). Подчеркнуты: "stop" - кодоны в последовательности "а" и инициирующий кодон в последовательности "б"

Так как исследуемая система интересовала нас как основа для достижения приемлемого уровня продукции целевого полипептида клетками Е. coli, дальнейшие исследования были направлены на получение генетических конструкций, способных обеспечить необходимый уровень экспрессии. Исходя из этого, были сконструированы плазмиды с укороченным геном белка Е2. Для этой цели были взяты фрагменты, укороченные по PvuII, PstI и Smal-сайтам внутри гена Е2, которые должны были обеспечить синтез N-концевых фрагментов белка Е2 длиной 315, 232 и 170 аминокислотных остатков соответственно (полная длина белка Е2 - 423 аминокислотных остатка). Все конструкции получены на основе плазмиды pGEME-18 удалением различной длины 5'-концевых последовательностей полного гена белка Е2 и обозначены согласно сайту разрезания внутри гена: pGEME-Pvu, pGEME-Pst и pGEME-Sma (рис. 10).

Анализ данных литературы (Hunt et al., 1990, Razumov et al., 1991) показал, что первые два фрагмента белка Е2, подукты плазм ид pGME-Pvu и pGME-Pst, содержат все и большую часть эпитопов соответственно; в то время, как продукт плазмиды pGME-Sma вероятно лишен одного из основных антигенно активных районов.

ori

pGEME-18

EcoRI BamHI

'rbs!

EcoRI BamHI

pGEME-Pst

EcoRI BamHI

"rbsI

Smal PstI PvuII Smal Psti

Ir

Hind III

PvuII/

Smal PstI Smal PstI

|rbs| | III

1Ц1 III

Hind III

Smal PstI

Hind III

GEME-Sm

EcoRI BamHI

Smal PstI

Hind III

Рис.10. Схематическое изображение сконструированных плазмид (обозначение см. также в подписи к рис.9.)

Плазмиды рОЕМЕ-8та1 и рСЕМЕ-Рэ! были получены разрезанием плазмиды рОЕМЕ-18 (рис. 10) рестриктазами 5та1 и РэН с последующим сшиванием гидролизованной рОЕМЕ-18 Т4 ДНК-лигазой. В случае получения плазмиды рвЕМЕ-Бта удалялся только с-концевой 5ша1-8та1-фрагмент гена, терминатор транскрипции Т7 РНК-полимеразы сохранялся, обеспечивая терминацию трансляции БтаЬфрагмента гена Е2. При этом на С-конце синтезируемого белка должны присутствовать только три лишних аминокислотных остатка. В случае получения плазмиды рСЕМЕ-

лялся не только З'-концевой РБи-БтаЬфрагмент гена Е2, но н терминатор транскрипции. Терминирующий сигнал в этом случае возникает через девять кодонов, что должно приводить к наличию девяти лишних аминокислотных остатков на С-конце синтезируемого фрагмента белка Е2.

Для получения плазмиды рСЕМЕ-Руи необходимо было удалить из плазмиды рОЕМЕ-18 С-концевой РуиП-Бта! фрагмент гена Е2. Из-за наличия внутри гена второго, внутреннего сайта 5та1, из плазмиды рвЕМЕ-18 был вырезан фрагмент ВашНЬРуиП, кодирующий З'-концевую часть гена Е2 а затем встроен в эту же плазмиду, разрезанную рестриктазами ВашН1 и 5та1. Полученная плазмида рСЕМЕ-Руи сохраняет ТИ, что обеспечивает терминацию трансляции гена Е2 через пять кодонов после окончания фрагмента. Схематическое изображение всех полученных плазмид представлена на рис. 10. В результате были получены три плазмиды, способные обеспечить синтез фрагментов белка Е2 вируса ВЭЛ следующего состава:

Е2( 1 -170)-С1у-11е-01п

Е2(1-232)-Рго-Ьу8-Ьеи-Уа1-Р11е-Туг-Зег-Уа1-Т11г Е2( 1 -315)-С1у-С1у-5ег-Абп-Аэп

2 3 4

Рис. 11. Иммуноблотинг белков из клеток

Е.соП, содержащих рекомбинант-ные плазмиды и инфицированных фагом М13ро1Т7. Нитроцеллю-лозные фильтры с перенесенными полипептидами обработаны по-ликлональными антителами против вируса ВЭЛ:

1 - рвМ - Эта;

3 - рвМ - Рэ1;

4 - рвМ - Руи;

2 - лизат клеток Е.соП

Проверка экспрессии указанных фрагментов гена белка Е2 в исследуемой системе показала, что во всех случаях нарабатываются белки ожидаемого размера в количествах, заметных при электрофорезе клеточных бел-

ка, определенное денситометрией гелей, возрастало по мере уменьшения его размера (1, 4 и 15% соответственно). Возможно, это связано с изменением физико-химических свойств синтезируемых полипептидов. Так, например, самый большой - Руи-фрагмент белка Е2-содержит два района с более высокой гидрофобностью, более короткий - Р51-фрагмент - только один; и оба эти фрагмента включают область с повышенным положительным зарядом - а самый короткий - Бта-фрагмент белка Е2 - вообще лишен таких районов.

Рекомбинантные фрагменты белка Е2 были исследованы на способность взаимодействовать с поликлональными антивирусными антителами и панелью МКА к основным сайтам белка Е2 вируса ВЭЛ. Полученные результаты представлены на рисунках 11 и 12. Они показывают, что все три рекомбинантных полипептида взаимодействовали в иммуноблоттинге с

■ нейтрализация, РТГА и протекция

■ неизвестная функция

- РТГА, протекция и перекрестная реактивность с другими альфавирусами в РТГА

Рис.12. Антигенные карты фрагмента белка Е2(1-170) и нативного белка Е2 вируса ВЭЛ, штамм Trinidad Dankey а) рекомбинантный белок б) нативный белок

поликлональной антисывороткой против вируса ВЭЛ. Частично очищенный Sma-фрагмент был исследован в дот-анализе с панелью МКА к основным сайтам белка Е2 вируса ВЭЛ. Дот-анализ показал, что Sma-фрагмент имеет полноценные сайты Е2-1, Е2-2, Е2-4 и Е2-5, характерные для белка Е2 вируса ВЭЛ. Сравнение карт антигенной топографии белка Е2 вируса ВЭЛ, штамм Trinidad donkey, и Sma-фрагмента (рис. 12) позво-

ляет утверждать, что фрагмент сохраняет на своей поверхности четыре из шести основных антигенных детерминант белка Е2. С другой стороны, это позволило подтвердить локализацию Е2-1-, Е2-2-, Е2-4- и Е2-5- сайтов связывания МКА на молекуле белка Е2 в области 1-170 а.о. белка Е2. Из известных на настоящие время фрагментов белка Е2 вируса ВЭЛ Sma-фрэг-мент является наименьшим полипептидом, несущим большинство сайтов связывания моноклональных антител. Интересно отметить, что ранее были предприняты две неудачные попытки картирования мест связывания МКА к основным эпитопам белка Е2 вируса ВЭЛ при помощи химически синтезированных пептидов (Hunt etal., 1990, 1991).

МКА, распознающие сайт Е2-6, не взаимодействуют с Sma-фрагмен-том, что хорошо согласуется с данными теоретического анализа локализации антигенных детерминант, проведенного с помощью компьютерной программы, описанной ранее (Maksyutov and Zagrebel'naya, 1993). Он показал, что район 180-250 а.о. белка Е2 является типичной B-клеточной антигенной детерминантой и отсутствует в Sma-фрагменте. Это дополнительно подтверждается тем, что антигенные варианты вируса ВЭЛ, полученные путем селекции с МКА к сайту Е2-6, имеют точечные мутации в области 180-220 а.о. белка Е2 (Agapov et al., 1994). Сайт Е2-3 вируса ВЭЛ также не представлен на Sma-фрагменте. Он по всей вероятности формируется аминокислотными остатками не менее, чем двух районов (30-70 и 220240 а.о.) аминокислотной цепи белка Е2 (Разумов и др., 1991). Однако способность сайта Е2-2 формировать вируснейтрализующие и протективные антитела позволяет надеяться на возможность использования Sma-фраг-мента белка Е2 в исследованиях, связанных с изучением особенностей формирования противовирусного иммунитета против данного опасного заболевания. Таким образом, в настоящей работе продемонстрирована возможность применения экспрессионной системы, основанной на использовании РНК-полимеразы фага Т7 с раздельным введением в бактерию экспрессируемого гена и гена РНК-полимеразы для продукции фрагментов белка Е2 вируса ВЭЛ в клетках Е. сой. При этом достигнутые уровни продукции рекомбинантных полипептидов вполне достаточны для выделения и последующих исследований. Анализ их антигенной структуры с помощью МКА показал сохранение основных антигенных детерминант, характерных для белка Е2 вируса ВЭЛ. Это делает перспективным проведение

дальнейших исследований с целью получения субъединичной вакцины или диагностических тест-систем.

2.4 Изучение экспрессии гена al-антитрипсина человека

Альфа-1 антитрипсин (ААТ) человека является главным сывороточным ингибитором протеаз и служит для защиты эластической ткани нижних дыхательных путей от расщепления нейтрофильной эластазой (Kalsheker, 1989). ААТ продуцируется, главным образом, гепатоцитами; синтезируется в виде предшественника из 418 аминокислотных остатков. В плазму секретируется зрелый белок с молекулярной массой 52 кДа, содержащий 394 аминокислотных остатка и 3 боковых углеводных цепи. Результатом антитрипсиновой недостаточности организма является резкое снижение антиэластазной активности сыворотки, приводящее к разрушению альвеолярной паренхимы легких протеолитическими ферментами, выделяемыми лейкоцитами. У гомозиготных носителей дефицитных аллелей развивается стойкая панацинарная эмфизема и обструктивный бронхит, воспалительные процессы в других органах. Наиболее физиологичным методом терапии является применение чистого белка ААТ, выделенного из донорской крови (Wewers et al., 1987). Ограниченность этого источника и известный биологический риск, связанный с его использованием, сдерживают применение ААТ в клинической практике. В настоящее время разрабатываются способы получения ААТ методами микробиологического синтеза, поскольку известно, что получаемый таким способом негликозилиро-ванный ААТ обладает такой же антиэластазной активностью, как и натив-ный ААТ, выделенный из плазмы крови (Travis et al., 1985).

К началу нашей работы из литературных источников было известно, что экспрессия гена ААТ человека в клетках E.coli затруднена. Существенный уровень синтеза достигался только в том случае, если продуктом являлся гибридный белок ААТ, несущий на N-конце дополнительные аминокислотные остатки (Bailand et al., 1984), или если в 5'-конец гена вносились делеции или замены (Joahansen et al., 1987; Sutiphong et al., 1987). В этих работах транскрипция гена ААТ контролировалась термоиндуцибельными промоторами фага X - Pl или Pr. Наши попытки оптимизировать экспрессию гена а 1-антитрипсина под контролем промоторов лактозного и трип-тафанового оперонов Е. coli (Тикунова, 1993) дали результаты, ненамного

отличающиеся от уже опубликованных ранее. В связи с чем возникла необходимость исследовать возможности описанной выше системы экспрессии и на гене ААТ.

Мей Рго Бег Баг Уа1 Бег Тгр 7

О «К 003 СОв «М ОСв «30 ССв ТСС ТСС 52

51у~11в-Евй-£ёй-ьёй"А1а"51у~£5й"суз Суз £ей Уа1 Рго Уа1 §ег Ьей~А1а~с1й 25

ах атс стс стс сто оса ев; ста тсс тсс сю стс сст стс тсс сто йст йао юв

Азр Рго С1п 01у Аэр А1а А1а б1п Ьуз ТЬг Азр ТЬг Эег Шз Н1э Азр в1п Азр 43 вАТ ССС САв вЗА САТ <ЗСТ СЗСС САС ААв АСА ОАТ АСА ТСС САС САТ САТ САа САТ 160 ВатН1 Во11

Н1з САС Рго ССА ТЬг АСС РЬе ТТС Азп ААС Ьуз ААС 11е АТС ТЬг АСС Рго ССС Азп ААС Ьеи СТС А1а ССТ б1и ОАО РЬа ТТС А1а ССС РЬе ТТС Бег АТС Ьеи СТА 61 214

Туг ТАС Агд ссс С1п САС Ьеи СТС А1а ССА Н1з САС С1п САС Бег ТСС Азп ААС Бег АСС ТЬг АСС Азп ААТ 11е АТС РЬе ТТС РЬа ТТС Эег ТСС С1п САА Va.l ОТС 79 268

ваг АОС На АТС А1а ест ТЬг АСА А1а СХС РЬе ТТТ А1а ССА Мей АТС Ьеи СТС Бег ТСС Ьеи СТС й1у «36 ТЬг АСС Ьуз ААО А1а ССТ Азр САС ТЬг АСТ Щз САС 97 332

Аэр БАТ ЗДи гАА 11е АТС Ьеи СТС в1и ОАО С1у <ХС Ьеи СТС Азп ААТ РЬе ТТС Азп ААС Ьеи СТС ТЬг АСО С1и САО 11а АТТ Рго ССС С1и (ЗАО А1а ССТ 01п САО 115 386

Ив Н1з в1и С1у РЬе С1п С1и САА Ьеи СТС Ьеи СТС Агд СОТ ТЬг АСС Ьаи СТС Азп ААС С1п САО Рго ССА Азр (ЗАС Эег АйС Й1п САС 133 430

Ьеи СТС 01п САС Ьеи стс ТЬг АСС ТЬг АСС ау ах Азп ААТ С1у <хс Ьеи СТС РЬе ТТС Ьеи СТС Эег АСС 01и ОАО СТу азе Ьеи СТС Ьуз ААС Ьеи СТА \Га1 ЙТС 151 484

Азр <зат Ьуз ААС РЬа ТТТ Ьеи ТТС С1и САС Азр САТ V*! СТТ Ьуз Ьуз ААА ААС Ьеи ТТС Туг АТС Н13 САС Бег ТСА С1и САА А1а <ЗСС РЬе ТТС ТЬг АСТ Уа1 стс 169 538

Азп ААС РЬе ТТС С1у 0*35 Азр САС ТЬг АСС С1и САА С1и САС А1а ССС Ьуз ААС Ьуз ААА С1п САв 11е АТС Азп ААС Азр (ЗАТ Туг ТАС Уа1 ОТС С1и САО аКС 187 592

в1у сст ТЬг АСТ С1п САА 01у сой Ьуз ААА 11е АТТ Уа1 отс Азр САТ Ьеи ТТС Уа1 СТС Ьуз ААО С1и ОАО Ьеи СТТ Азр САС Агд АСА Азр ОАС ТЬг АСА Уа1 СТТ 205 646

РЬе ттт А1а ОСТ Ьеи СТС Уа1 СТО Азп ААТ Туг ТАС 11а АТС РЬе ТТС РЬе ТТТ Ьуз С1у Ьуз ААА ССС ААА тЗз Ии САО Агд АСА Рго ССС РЬе ТТТ Ии СЗАА 223 700

Уа1 стс Ьуз ААС Азр (ЗАС ТЬг АСС С1и САО С1и САА С1и САС Азр САС РЬе ТТС Н13 САС Уа1 СТС Азр СЗАС С1п САС Уа1 ТЬг СТС АСС ТЬг АСС Уа1 СТС Ьуз ААО 241 754

Уа1 отс Рго сст Мей АТС Мей АТС Ьуз лка Агд ССТ Ьеи ТТА С1у ССС Мей ТАС РЬе ТТТ Азп ААС 11е АТС С1п САС Н1з САС Суз Т&Т Ьуз ААС Ьуз ААО Ьеи СТС £ 259 808

Бег ТСС Бег А<ЗС тЗз Уа1 СТО Ьеи Ьеи Мей Ьуз Туг Ьеи 01у Азп СТС_СТС_АТС__ААА_ТАС^СТС_ОСС_ААТ А1а (ЗСС ТЬг АСС А1а ССС Х1е АТС РЬе ТТС РЬе ТТС 277 862

Ьеи СТС Рго сст Азр алт С1и САС С1у сой Ьуз ААА Ьеи СТА Ып САО Н13 САС Ьеи СТС 01и ОАА Азп ААТ С1и <ЗАА Ьеи СТС ТЬг АСС Шз САС Азр САТ 11е АТС 295 916

На АТС ТЬг АСС Ьуз ААС РЬе ТТС Ьеи СТС С1и вДА Азп ААТ аи йАА Азр САС Агд АСЗА Агд АОТ Бег ТСТ А1а <ЗСС Бег АСС Ьеи ТТА Н±з САТ Ьеи ТТА Рго ССС 313 970

Ьуз ААА Ьеи СТО Эег ТСС 11а АТТ ТЬг АСТ С1у СвА ТЬг АСС Туг ТАТ Азр САТ Ьеи СТС Ьуз ААО Бег АвС Уа1 СТС Ьеи СТС С1у оот С1п САА Ьеи СТС в1у ССС 331 1024

Не АТС ТЬг АСТ Ьуз ААС Уа1 СТС РЬе ТТС Бег АвС Азп ААТ С1у <зсй А1а ОСТ Азр вАС Ьеи СТС бег ТСС О в1у сое Уа1 етс ТЬг АСА Ии САО С1и вАв А1а ССА 349 1078

Рго ссс Ьеи СТО Ьуз ААС Ьеи СТС Бег ТСС Ьуз ААО А1а ТСС Уа1 стг Н1з САТ Ьуз ААС А1а ССТ Уа1 СТС Ьеи СТС ТЬг АСС 11е АТС Аэр САС С1и САС Ьуз ААА 367 1132

С1у «зй ТЬг АСТ С1и САА А1а йСТ А1а ест й1у <з<зс А1а (зсс Мей АТС РЬа ТТТ Ьеи ТТА С1и вАС А1а ССС 11е АТА Рго ССС Мей АТС Бег ТСТ 11е АТС Рго ССС 385 1186

Рго ссс 01и САв Уа1 етс Ьуз ААС РЬе ТТС Азп ААС Ьуз ААА Рго ССС РЬе ТТТ Уа1 СТС РЬе ТТС Ьеи ТТА Май АТС 11е АТТ С1и САА С1п САА Азп ААТ ТЬг АСС 403 1240

Ьуз АА<5 Бег ТСТ Рго ССС Ьеи СТС РЬе ТТС Мей АТС С1у ССА Ьуз ААА Уа1 ОТС Уа1 СТС Азп ААТ Рго ССС ТЬг АСС Ип САА Ьуз ААА_ *** ТАА СТС ССТ 418 1294

СТС ССТ ССТ ССС ССС ССС ССС СТО САО 1321

Рис. 13. Первичная структура кДНК ААТ человека. Штриховой линией выделена последовательность сигнального пептида; подчеркнуты фрагменты, комплементарные олигонуклеотидам, использованным в качестве прай-меров. Приведены замены нуклеотидов

Для получения гена ААТ в качестве источника мРНК использовал! печеночную ткань индивидуума, гомозиготного по М1-аллели. Это дикто валось тем, что M1-вариант является наиболее распространенным нор мальным аллелем гена ААТ человека (Kalsheker N., 1989). Суммарнук РНК из печеночной ткани выделяли гуанидин-изоционатным методо.\ (Ullrich et al., 1977). Олигонуклеотиды для праймирования реакций синтезе кДНК (рис. 13) синтезировали, исходя из опубликованной структурь кДНК ААТ (Long et al., 1984; Insley M. & Kawasaki., 1987).

Молекулы двухцепочечной кДНК встраивали коннекторным методом по Pstl-сайту в плазмиду pMG2, специально созданную для быстрого определения первичной структуры клонированных фрагментов кДНК (Микрюков и др., 1991). Рекомбинантными плазмидами трансформировали клетки E.coli DH5aF'. В процессе скрининга клонотеки была изолирована плазмида pMG-AAT, гибридизовавшаяся с обоими олигонуклеоти-дами, использованными в качестве праймеров, и содержащая встройку фрагмента ДНК более, чем в 1300 п.о. Секвенирование по методу Макса-ма-Гилберта показало, что pMG-AAT включает в себя фрагмент ДНК длиной 1278 п.о., кодирующий ААТ с сигнальным пептидом, а также 3' и 5'-нетранслируемые районы (рис. 13). В целом структура гена ААТ совпадала с последовательностью, опубликованной для М1-аллеля гена ААТ (Kolsheker, 1989), за исключением трех точечных мутаций, не приводящих к аминокислотным заменам (рис. 13).

Последовательность кДНК, кодирующая полный ААТ человека, была встроена в плазмиду pGEMl под контроль позднего промотора фага Т7 Ф10 с предшествующим промотору синтетическим фрагментом ДНК, включающим SD-сайт, сигнальную последовательность и первые 6 кодо-нов гена ompC Е. coli (рис. 14, 15). Синтез фрагмента ДНК, кодирующего участок связывания рибосом и сигнальную последовательность гена ошрС, проводили, исходя из опубликованной ранее первичной последовательности этого гена (Mizuno et al., 1983). С одной стороны, данный фрагмент ДНК мог бы обеспечить секрецию ААТ в периплазматическое пространство бактериальной клетки и как следствие - защиту целевого белка от цито-плазматических протеаз. А с другой стороны, участок связывания рибосом высокоактивного в клетках Е. coli гена ompC мог бы проявить себя и при экспресии кодирующей последовательности ААТ.

-21 -10 MetLysValLysValLeuSerLeuLeuValProAlaLeU а} aattcagagggttaataacatgaaagttaaagtactgtccctcctggtaccagctctg gtctcccaattattgtactttcaatttcatgacagggaggaccatggtcgagac

EcoRI

-1 +1

LeuValAlaGlyAlaAlaAspAlaAlaGluValTyrAsnLys ctggtagctggcgctgcagacgctgctgaagtttacaacaag gaccatcgaccgcgacgtctgcgacgacttcaaatgttgttcctag

BamHI

1 2 MetGlu

6) aattcagagggttaataacatggag

gtctcccaattattgtacctcctga gtcctccgcagatctacgtcctag

EcoRI BamHI

BamHI

1 2

MetGln

в) aattcaggaggcgtctagatgcag

EcoRI

Рис. 14. Нуклеотидная последовательность синтетических дуплексов ДНК, используемых для достижения экспресии гена ААТ человека; подчеркнуты последовательности ЭО участков

Клетки Е. coli, содержащие полученную плазмиду pGEM-omcAAT (рис. 15), выращивали до плотности D590 = 0.6 o.e., а затем инфицировали фагом М13ро1Т7, вносили индуктор 1ас-оперона и исследовали динамику синтеза ААТ на разных стадиях роста культуры и различной множественности ее инфицирования. Было покано, что количество рекомбинантного ААТ возрастает при увеличении множественности инфекции до 10 фаговых частиц на клетку и при дальнейшем повышении множественности инфицирования возрастает незначительно (рис. 16). Количество целевого белка возрастает с увеличением времени культивирования до 5-6 часов с момента инфицирования клеток гибридным фагом. Максимальный уроень синтеза ААТ достигал 20% суммарного клеточного белка (рис. 16). Методом иммуноблотинга было показано связывание рекомбинантного белка с

promoter

Рис.15. Схема конструирования плазмиды pGem-omcAAT

антителами кролика к ААТ, выделенному из сыворотки человека (рис. 17). Качественный анализ клеточных лизатов на способность ингибировать протеазную активность трипсина подтверждал наличие в клетках Е. coli антитрипсиновой активности.

го с;

1С

VD 16

о 12

0.

(О

1, 8

/

о /

х ф

о ; / _ - - о-----------<>" 3

Q- и. - - - - „ _ . --------

tz

с/

4 б

- -' - - о- — О-- __ - - А "i

0

0 1 2 3 4

5 6 Время в час

Рис. 16. Динамика продукции ААТ человека в клетках E.coli, содержащих плаз-миду pGEM-ошсААТ, индуцированных ИПТГ, инфицированных фагом МИро1Т7 (точка 0) с различной множественностью: а - I; б - 5; в - 10; г-20

Как видно из рис. 17 (дорожка 3), сигнальный пептид не отщепляется от химерного белка, синтез которого в клетках Е. coli детерминирует pGEM-amcAAT. Использование такого химерного полипептида в медицинской практике проблематично, так как он может иметь новые антигенные детерминанты, способные вызвать нежелательный иммунный ответ. Для получения ААТ без дополнительных аминокислотых остатков была сконструирована плазмида pGEM-AAT, в которой был сохранен SD-сайт гена отрС, но отсутствовал фрагмент ДНК, кодирующий сигнальный пептид и первые 6 аминокислотных остатков гена отрС (рис. 14 - линкер б). Клетки Е. coli, содержащие полученную плазмиду pGEM-AAT, наращивали до D590 = 0.6 o.e., инфицировали фагом М13ро1Т7 с множественностью 10, вносили ИПТГ и исследовали на способность продуцировать ААТ человека. При элекрофоретическом анализе лизатов клеток, содержащих плазмиду pGEM-AAT и инфицированных бактериофагом М13ро1Т7, не

было обнаружено заметного количества рекомбинантного ААТ (см. рис 17, дорожка 2).

1 2 3 4 5 1 2'3'

Рис. 17. Электрофореграмма лизатов клеток Е.соН (11%-ный пааг)-

а - окраска кумасси Я-250. Нанесены лизаты клеток, содержащих: I -рвЕМ 1; 2 - рОЕМ-ААТ; 3 - рОЕМ-ошс-ААТ; 4 - рОЕМ-ААТВ2; 5 - маркеры молекулярных масс, б - иммуноблотинг. Нанесены лизаты клеток, содержащих: 1 - рОЕМ1; 2 - рОЕМ-ААТВ2; 3 - рОЕМ-ошсААТ

Вероятно, это связано с тем, что линкер б (рис. 14) не обеспечивает эф фективной трансляции находящейся после него кодирующей последова тельности ААТ. Ранее при изучении влияния на экспрессию в клетках Е соИ кДНК ААТ ряда синтетических участков связывания рибосол (Тикунова, 1993) нами было показано, что линкер в (рис. 14) вместе с про мотором триптофанового оперона обеспечивали наибольший уровень син теза ААТ, достигающий 2% общего белка бактериальной клетки. В связи ( этим линкер б был заменен на линкер в (см. рис. 14), в результате чего был.

получена плазмнда, обозначенная нами как pGEM-B2AAT. Клетки Е. coli, трансформированные полученной плазмидой pGEM-B2AAT и инфицированные фагом М13ро1Т7 с множественностью 10, осуществляли синтез ре-комбинантного ААТ человека. Электрофоретический анализ показал наличие в лизатах этих клеток дополнительного белка с молекулярной массой около 45 кДа (рис. 17). С помощью иммуноблотинга было показано связывание этого белка с антителами кролика к ААТ человека (рис. 17). Уровень экспрессии рекомбинантного ААТ, измеренный методом денси-тометрии окрашенных полиакриламидных гелей, достигал 15% клеточного белка. Зависимость уровня биосинтеза ААТ от множественности инфицирования клеток Е. coli, несущих pGEM-AATB2 бактериофагом М13ро1Т7, и времени культивирования была практически такой же, как и для клеток, содержащих плазмиду pGEM-omcAAT.

Таким образом, исходя из полученных результатов, можно заключить, что система, основанная на РНК-полимеразе бактериофага Т7, с раздельным введением в клетку гена РНК-полимеразы и целевого гена, весьма перспективна для экспрессии чужеродной генетической информации. Особенно важным представляется использование системы для генов, продукты которых могут оказать негативное влияние на клетку хазяина. Известно, что регулируемые промоторы, узнаваемые РНК-полимеразой Е. coli, не обеспечивают полной репрессии контролируемого ими гена. Это, в некоторых случаях, приводит к невозможности получения бактериального клона с неободимой конструкцией (Studier and Rosenberg, 1900). Под контролем позднего промотора Т7 чужеродные гены не проявляют себя, что обеспечивает получение желаемых генетических конструкций и культивирование штаммов бактерий, содержащих их, даже в случае крайней токсичности продукта исследуемого гена. После того, как культура с токсичным геном достигнет определенной плотности, ее можно инфицировать бактериофагом М13, несущим ген РНК-полимеразы, и таким образом добиться продукции желаемого белка. Еще одним преимуществом системы является возможность достижения максимальных уровней продукции рекомбинантного белка за более короткое время (в случае Р-галактозидазы за - 2ч), что может привести к уменьшению времени экспонирования целевого полипептида протеазам клетки и как следствие - к снижению процента его деградации.

Необходимо отметить и возможные преимущества системы для задач биотехнологии. Известно, что используемые к настоящему времени варианты индуцибельной транскрипции имеют определенные недостатки. Так при запуске синтеза желаемого белка с помощью повышенной температуры происходит индукция экспресии не только целевого гена, но и ряда генов клетки-реципиента, в том числе и генов протеаз. Использование химических индукторов, как правило, ограничивается лишь лабораторным масштабом, так как удорожает процесс (Щелкунов, 1994). Наиболее простым выходом из этой ситуации может быть использование вариантов системы, описанной выше.

Подводя итог данной главе, можно сделать вывод, что системы, подобные описанной выше, найдут применение не только в лабораторной практике, но и проявят себя в решении задач практической биотехнологии.

Глава 3. ПОЛУЧЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ ВАРИАНТОВ ФАГА М13, ЭКСПОНИРУЮЩИХ НА СВОЕЙ ПОВЕРХНОСТИ ЧУЖЕРОДНЫЕ ПЕПТИДЫ В СОСТАВЕ ОСНОВНОГО БЕЛКА ОБОЛОЧКИ

В последнее время в ряде ведущих лабораторий мира активно разрабатывается весьма перспективное направление молекулярной биологии и биотехнологии, получившее в 1992 году на конференции в Нью-Йорке (Cold Spring Harbor Laboratory) название "фаговый дисплей" ("phage display"). Это направление, ведущее свое начало с пионерской работы Джорджа Смита (Smith, 1985), основано на возможности экспонировать пептид на поверхности инфекционной частицы нитчатого фага (Scott & Smith, 1990; Smith & Scott, 1993; Hoess, 1993; Barbas & Barbas, 1994). Экспонирование достигается путем слияния чужеродных пептидов с одним из поверхностных белков фага в результате генноинженерных манипуляций с его геномом (рис. 18). При этом в качестве белка слияния использовали минорный белок рШ, представленный в капсиде всего пятью копиями.

л

уо/--—л И

Х^<=>( Ъса

^С? - А-белок с дополнительными аминокислотами В- белок с дополнительными аминокислотами

Рис. 18. Схематическое представление структуры нитчатого бактериофага М13: А-дикого типа; Б и В - фагов с модифицированными белками оболочки

А-белок (рШ) —»-В-белок(рУШ) о - D-белок (pVI) еэ - С-белок (pVII,

pIX)

Однако, небольшое число молекул белка рШ в фаговой частице накладывает определенные ограничения на использование данной техники, в частности для получения на основе нитчатых фагов искусственных имму-

ногенов. Именно поэтому важно было исследовать экспонирование чужеродных пептидов с помощью основного белка оболочки (белок В или pVIII) нитчатых фагов, представленного приблизительно тремя тысячами молекул на вирион (Model & Rüssel, 1988; Marvin, 1990). Решение этой задачи могло бы дать возможность получения иммуногенных частиц значительных размеров и с высокой плотностью целевых эпитопов (рис. 18).

3.1. Выбор места в В-белке бактериофага М13 для встроек чужеродных пептидов

До настоящей работы в литературе не были описаны нитевидные бактериофаги с существенными изменениями в В-белке, такими, как делеции отдельных аминокислот или их вставки (Russel and Model., 1989). Очевидно, это связано с тем, что этот небольшой полипептид (50 аминокислотных остатков), играет важную роль в морфогенезе бактериофага M13: транслокация, в виде белка предшественника, в периплазматическое пространство бактериальной клетки, взаимодействие с ДНК в фаговой частице, а также обеспечение взаимодействия отдельных субъединиц В-белка в вирионе между собой. Таким образом, при планировании направленных изменений такого полифункционального белка необходимо учитывать, как эти изменения отразятся на структуре и функциях белка в целом.

При выборе участка в В-белке для встройки пептидов мы руководствовались следующими соображениями. В-белок состоит из кислого N-конца, основного С-конца и гидрофобной середины. Поскольку С-конец белка ориентирован внутрь вириона и взаимодействует с ДНК (Model & Rüssel., 1988), а его гидрофобная часть участвует в сборке фаговых частиц на мембранах клетки (Bayer & Feigenson.,1985), для встройки чужеродных пептидов наиболее подходящей представляется N-концевая область (см. рис. 19). ---+ - +++ +

М13 AEGD---DPAKAAJTNSLQASATEYIGIAWAMVVVIVGATIGIKLFKKFTSKAS

Ifl AD DAT—SQAKAAFDSLTAQATEMSGYAWALWbWGATVGIKLFKKFVSRAS IKe AEPNAATNYATEAMDSLKTQAIDLXSQTWgWTTVWAGLVIRLFKKFSSKAV

Рис.19. Выравненные последовательности зрелых форм В белка фагов М13, Ike и Ifl. Сверху отмечены заряженные аминокислоты. Подчеркнут кластер гидрофобных аминокислот

Известно, что в частице бактериофага М13 более 90% молекулы Ii-белка представлено а-спиралью, а-спиральная структура начинается с 5-ой аминокислоты зрелого В-белка, а самые крайние аминокислоты (4 с N- и 7 с С-конца) образуют нерегулярную структуру. Из сравнения родственных белков различных организмов известно, что делеции и вставки аминокислот локализуются обычно в петлевых и нерегулярных участках пространственной структуры (Rawlings et al ., 1983). В свете этих данных N-конец В-белка является наиболее подходящим местом для встройки пептидов.

В пользу возможности модификации этой области свидетельствует и значительная вариабельность N-концевой части основного белка оболочки родственных одноцепочечных фагов Ff (М13, fl, fd), If], IKe (Model & Russel.,1988).

3.2. Получение векторов экспонирования на основе бактериофага М13

Вначале нами был получен рекомбинантный бактериофаг М13В, несущий ген устойчивости к ампицилину (рис. 20). Такой бактериофаг можно поддерживать в селективных условиях в виде позитивных колоний даже при существенном снижении его инфекционности, которое может произойти в результате встройки в В-белок чужеродного пептида. Позднее другие исследователи показали преимущества данного подхода, воспользовавшись геном устойчивости к тетрациклину (Scott and Smith, 1990)

Определив район В-белка, который, с нашей точки зрения, можно было изменять, мы с помощью олигонуклеотиднаправленного мутагенеза последовательно ввели в район гена VIII, соответствующий N-концу В-белка, сайты узнавания рестриктаз BamHI, Smal и Pstl. В результате была получена серия векторов: М13В1, М13В1-2, и М13РВ (рис.21), которые можно было использовать и как векторы внедрения, обеспечивающие возможность введения дополнительных аминокислот, и как векторы замещения, позволяющие проводить замену различных участков В-белка на целевые. Структуру векторных ДНК подтверждали рестрикционным анализом и се-квенированием по Сенгеру.

ОП

BamHI

Haell

Haell

ДНК-лигаза фага T4

orí

Рис.20.

Схема конструирования бактериофага М13В

М13В (дикий тип гена VIII)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 AEGDDPAKAAFNSLQA

5 '......GCTGAGGGTGACGATCCCGCAAAAGCGGCCTTTAACTCCCTGCAAGCC

М13В1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 AEGEDPAKAAFNSLQA

5 ■......GCTGAGGGTGAGGATCCCGCAAAAGCGGCCTTTAACTCCCTGCAAGCC.

BamHI

М13В1-2

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 AEGEDPAKAAFNSLQA

5 •......GCTGAGGGTGAGGATCCCGCAAAAGCGGCCTTTAACTCCCTGCAGGCC .

BamHI Fstl

М13РВ

-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 AAEGEDPAKAAFNSLQA 5 ' . . . GCTGCAGAGGGTGAGGATCCCGCAAAAGCGGCCTTTAACTCCCTGCAAGCC . PstI BamHI

. .3'

Рис.21. Производные бактериофага M13B, полученные с помощью олигонуклео-тид-направленного мутагенеза

3.3. Получение бактериофагов с химерными вариантами В-белка

С этой целью синтетический фрагмент ДНК, кодирующий модельные пептиды, был проклонирован в РФ ДНК фага М13В1 (рис.22). Эти пептиды содержали по пять аминокислотных остатков, что обычно соответствует минимальной антигенной детерминанте (Reddchase et al., 1989).

Аминокислотный состав встраиваемых пептидов диктовался следующими соображениями. Для того, чтобы встроенный фрагмент не влиял на структуру и функцию белка носителя, его физико-химические свойства должны быть подобны свойствам близлежащей последовательности (Ерошкин и др., 1990). Выбранная нуклеотидная последовательность при встройке в одной ориентации кодировала аминокислоты, которые встречаются в N-концевых районах покровных белков родственных фагов, и удовлетворяла этим условиям. Обратная цепь ДНК кодировала аминокислоты L, М, Н, которые по своим физико-химическим свойствам отличаются от аминокислот N-концевого района покровного белка ( L, М, Н являются крупноразмерными остатками; L и М имеют высокую гидрофоб-ность; Н - положительно заряжен).

Синтетический дуплекс ДНК клонировали в составе вектора М13В1 по уникальному ВатН1-сайту. Рекомбинатную ДНК со встройкой в двух ориентациях отбирали путем гибридизации с одним из олигонуклеотидов дуплекса и ее структуру подтверждали секвенированием по Сенгеру. Фаги обозначили М13ВОМ1 и M13BOL1. При работе с фагом М13ВОМ1 по результатам секвенирования ДНК было отобрано два субклона М13ВОМ1 и М13ВОМ2. Один из них содержал в гене VIII встройку с запланированной структурой, а другой имел транзицию (А -» G), которая привела к замене аминокислотного остатка аспарагиновой кислоты на глицин в +5 положении В-белка.

После того, как была показана принципиальная возможность встроек пептидов в В-белок, мы попытались проклонировать в векторе М13В1 последовательность эпитопа вирусного белка. Была выбрана антигенная детерминанта вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) - белка р17 ( 6 аминокислот, с 14-ой по 19-ую ) (рис. 23), моноклональные антитела к которой нейтрализуют вирус (Papsidero et al., 1989). Несмотря на неоднократные попытки встроить такой фрагмент, мы потерпели неудачу. Это могло про-

изойти по нескольким причинам, в том числе и по рассмотренным в начале этой главы.

М13В1

1 2 3 4 5 6 7 А Е б Е й Р А .ест САЙ вйТ вАв йАТ ССС йСА...3'

ВашН1

о о а б с 5 ' -вАТСАбССАТСАеСТ

ТСССТАСТССАСТАв-5 '

М13ВОМ1

клонирование синтетического олигонуклеотидного дуплекса

й н ь м р 5 ' -САТСАССЮАТСССТ

ТССАСТАССОАСТАС-5'

1234 5 6 7

АЕбЕООАЗвОРА 5' . . .ест СУЮ бет бАв САТ САй вСА ТСА вОТ вАТ ССС БСА. . .3'

М13ВОЫ

1 2 3 4 5 6 7

АЕСЕОНЬМРОРА 5' . . .вСТ вАв вйТ бАв вАТ САС СТБ АТв ССТ вАТ ССС ЙСА. . .3'

М13ВОМ2

1 2 3 4 5 6 7

АЕСЕСОАЗСБРА 5' ...ест вАв вБТ вАв ввт СА(5 вСА ТСА ввТ вАТ ССС 6СА. . .3'

Рис. 22. Схема клонирования синтетического олигонуклеотидного дуплекса в составе гена VIII бактериофага М13В1

Eil

11 12 13 14 15 16 17 18 19 • • • GELDRWEKI • • ■

M13B0L1

5 6 7 8 9 DHLMPDPAKA... 5'...GCTGAGGGTGAGGATCACCTGATGCCTGATCCCGCAAAAGCG... 3' 3'-CCACTCCTAG G CTACGGAC-5' С АС

олигонуклеотид-

направленный

мутагенез

M13BOL2

1234 56789

А Е G_Е D R W М Р D Р А К А ...

5'...GCTGAGGGTGAGGATCGCTGGATGCCTGATCCCGCAAAAGCG...3'

Рис.23. Аминокислотная последовательность антигенной детерминанты gag-белка pl7. Конструирование бактериофага M13BOL2

Тем не менее, используя в качестве праймера-мутагена олигонуклео-тид 3'-CCACTCCTAGCGACCTACGGAC-5', сайт-локализованным мутагенезом нам удалось заменить 2 аминокислоты в последовательности фага M13BOL1 и получить бактериофаг M13BOL2, который нес неполную антигенную детерминанту ВИЧ 1 с пробелом (рис. 23). Наличие введенной мутации подтверждали секвенированием. Бактериофаг M13BOL2 сохранял инфекционность и образовывал бляшки на газоне клеток Е. coli.

Таким образом, в результате проделанной работы, было показано, что модифицированный В-белок способен сохранять свои функции и, несмотря на встройки в его состав чужеродных пептидов, успешно участвует в сборке инфекционных частиц гибридных бактериофагов.

В дальнейшем мы попытались встроить более протяженные (до 11 аминокислотных остатков) пептиды в состав В-белка бактериофага М13В1, однако не достигли желаемого результата. Позднее этот же район В-белка был использован другими авторами на двух других бактериофа-

гах, близкородственных, бактериофагу Ml3 - fd и fl (Felichi et al., 1991; Greenwood et al., 1991). Размер допустимой встройки в этих случаях оказался ограничен шестью аминокислотными остатками, что тем не менее является характерным размером линейного антигенного эпитопа (Feiseret al., 1991). Таким образом, бактериофаги, несущие встройки такого размера, могу быть персспективны для создания вакцин, селекции пептидных лигандов и для диагностических целей.

Известно, что у близкородственных белков замены фрагментов встречаются чаще, нежели вставки (Ерошкин и др., 1990). Поэтому замена N-концевого фрагмента могла бы стать эффективным способом встройки пептидов в В-белок оболочки нитевидных бактериофагов. Для этой цели использовали вектор М13В1-2 (см. рис. 21), который, являясь вектором замещения, позволяет заменять фрагмент в 14 аминокислотных остатков. Однако и в этом случае жизнеспособных бактериофагов с желаемыми встройками получить не удалось. Более удачным оказался вектор М13РВ. Недавно, использующие этот вектор исследователи из Института молекулярной биофизики при университете Талахаши, Флорида (США) показали возможность встроек чужеродных пептидов в В-белок длиной до восьми аминокислотных остатков (личное сообщение - Makowski, 1995).

3.4. Исследования биологических и физико-химических свойств гибридных фагов

3.4.1. Созревание предшественников В-белка в гибридных бактериофагах

Так как В-белок фага М13 синтезируется в клетках в виде предшественника, имеющего на N-конце сигнальный пептид, отщепляемый в процессе секреции, важно было выяснить, как влияют встроенные в В-белок чужеродные аминокислотные остатки на специфичность процессинга. Описанные в литературе мутации на N-конце В-белка в +2 положении очень сильно сказывались на скорости отщепления лидерного пептида, препятствуя образованию зрелых фаговых частиц (Rüssel & Model., 1981).

Было проведено определение N-концевой аминокислотной последовательности В-белка в фагах М13В, М13В1, М13ВОМ1, М13ВОМ2, M13BOL1 и M13BOL2. Для этого фаги концентрировали осаждением по-лиэтиленгликолем, и осадок без дальнейшей очистки использовали для се-

квенирования белков. Результаты определения последовательности К-кон-цевых участков зрелых В-белков в частицах различных фагов представлены на рис. 24. Можно видеть, что у большинства фагов со встройками сигнальный пептид отщепляется так же, как и у фага дикого типа. В то же время при созревании гибридного В-белка фага М13ВОЫ кроме сигнального пептида происходит отщепление четырех Ы-концевых аминокислотных остатков с сохранением встраиваемого пентапептида.

М13В А Е G D D Р А К А.. •

М13В1 А Е G Е D Р А К А..

М13ВОМ1 А Е G Е D Q А S G D Р А..

М13ВОМ2 А Е G Е G Q А S G D Р А..

M13BOL1 D Н L м Р D Р А..

M13BOL2 А Е G Е D R W м Р D Р А.,

Рис. 24. N-концевые аминокислотные последовательности зрелого В-белка ре-комбинантных фагов

Следует отметить, что до сих пор нет полной ясности в некоторых вопросах процессинга секретируемых белков. В частности, не известна специфичность сигнальной пептидазы и сайт узнавания для этого фермента. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что последовательность, несколько отдаленная от точки процессинга, может влиять на его специфичность. Можно предложить два возможных объяснения природы этого воздействия. Первое: случайно был создан новый, дополнительный сайт узнавания для сигнальной пептидазы Е. coli или для другого фермента; второе: изменилась пространственная структура белка и сигнальная пепти-даза расщепляет другой, доступный ей район.

Не отвергая первого объяснения, мы попытались представить, как изменение пространственной структуры может повлиять на место отщепления сигнального пептида.

Известно, что при встройке в мембрану предшественник В-белка имеет форму петли (Kuhn, 1990) (рис. 25). При этом гидрофобные участки, обозначенные на рисунке темным цветом, обеспечивают взаимодействие предшественника с мембраной. Известно также, что активность сигнальной пептидазы локализуется на наружной поверхности цитоплазматической мембраны.

А

Рис.25. А - схема встройки в мембрану предшественника В-белка дикого типа Б - встройка предшественников гибридных белков

( - встроенная последовательность,

( •''•*•! - гидрофобные последовательности)

При использовании для анализа белковой последовательности программы "OBR", составленной Ерошкиным А. М. на основе метода Гарнье (Gamier et al., 1978), была предсказана вторичная структура предшественников основного белка оболочки фагов М13, М13В1, М13ВОМ1, М13ВОМ2, M13BOL1, M13BOL2. На основе различий во вторичной структуре гибридных белков можно предложить возможное объяснение природы этого воздействия, а именно: в результате изменений структуры белка

меняется его расположение в мембране, и лидерная пептидаза ращепляет другой, доступный ей район (см. рис. 25).

3.4.2. Исследование структуры вирионов гибридных бактериофагов

Известно, что даже одиночные замены аминокислот в С-конце В-белка способны приводить к увеличению на 38% контурной длины частиц нитевидного бактериофага fd, что говорит о существенном снижении плотности упаковки В-белка в вирионе и о важной роли С-конца В-белка во взаимодействии с фаговой ДНК (Hunter et al., 1990). В этой связи весьма важным представлялось исследовать, как повлияют изменения, внесенные нами в N-концевую часть В-белка, на структурную организацию частиц бактериофага М13. В случае, если бы такие изменения наблюдались, их необходимо было бы учитывать при получении бактериофагов, экспонирующих на своей поверхности заданные пептиды.

Для изучения влияния изменений в N-концевой последовательности В-белка на взаимодействие между B-белком и ДНК мы измеряли с помощью электронной микроскопии контурные длины вирионов и спектрофотомет-рическим способом определяли отношение ДНК/белок (нуклеотиды к молекулам В-белка) в химерных фагах. Фотографии вирионов нитчатых фагов получали на электронном микроскопе "JEM-100C" после их распластывания на формваровой подложке и негативного контрастирования в 2% уранилацетате. Контурные длины вирионов на электронномикроскопиче-ских фотографиях измеряли на полуавтоматическом анализаторе МОР/АМ-ОЗ ("Reichert Jung"). Отношение ДНК/В-белок определялось из спектров поглощения щелочных лизатов фагов (Кищенко и др., 1991).

На рис. 26 представлены типичные электронномикроскопические фотографии вирионов различных штаммов. Измерения контурных длин вирионов показали, что все химерные бактериофаги практически не отличаются между собой по средней длине (отличие ±0,3%). В то же время они на 10% длиннее исходного штамма М13тр10, что объясняется удлинением фаговой ДНК из-за встройки гена устойчивости к ампициллину. Следовательно, изменения N-концевого района не повлияли на коэффициент упаковки ДНК в вирионе М13. Более того, отношение содержания молекул В-белка и нуклеотидов в вирионах, полученное из спектров поглощения ще-

лочного лизата вирусной суспензии, до 1,5%, у всех изученных штаммов.

оказалось одинаковым, с точностью

трЮ 6 61 ВОГ-И В0Гм2 ВОН

Рис.26. Электронно-микроскопические фотографии вирионов различных штаммов.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что встроенные олигопептиды не повлияли ни на компакт-ность упаковки ДНК, ни на плотность расположения молекул В-белка в вирионах. Так как с фаговой ДНК взаимодействует С-концевой участок, по-видимому, вставки в Ы-концевую область существенно не влияют и на конформацию С-концевого участка.

3.4.3. Исследование экспонируемости чужеродных пептидов на поверхности гибридных бактериофагов

Разрабатывая новый носитель на основе нитевидных бактериофагов для получения иммуногенных частиц, необходимо быть уверенным, что район, выбранный для введения чужеродных пептидов, находится на поверхности вириона.

Об экспонируемости чужеродных пептидов в выбранном районе могут свидетельствовать данные измерения флуоресценции триптофана (В-белок бактериофага дикого типа содержит триптофан в +26 положении). Полученные нами штаммы гибридных бактериофагов и М13трЮ были охарактеризованы по сдвигу флуоресценции триптофана в составе нативных вирионов путем отношения интенсивности флуоресценции на длинах волн

320 и 365 нм при возбуждении 296 нм. Обнаруженный небольшой сдвиг флуоресценции в штамме M13BOL1 показал, что триптофан в вирионе этого штамма находится в более полярном окружении по сравнению с другими фагами (табл. 4). Это можно было объяснить взаимодействием в вирионе N-концевого района одной молекулы В-белка с центральной частью другой молекулы, что подтверждается моделью структурной организации вирионов бактериофагов Ff, согласно которой центральные части белковых молекул каждого пентамера В-белка пространственно сближены с N-концами другого пентамера (Makowski L. and Caspar D.L., 1981).

Таблица 4

Результаты спектрофлуориметрии

320 365

Штамм фага I / I

296 296

М 13тр 10 1,91

M13BOLI 1,85

M13BOL2 1,25

Благодаря наличию дополнительного триптофана в +7 положении В-белка бактериофага М13ВОЬ2 (см. рис. 23) нам удалось более детально выяснить структуру этой области (табл. 4). Обнаруженный существенный сдвиг флуоресценции в длинноволновую область происходит за счет вклада в флуоресценцию 1Ч-концевого триптофана и свидетельствует о том, что этот аминокислотный остаток находится в гидрофильном окружении. Таким образом, можно было с высокой долей уверенности предположить, что эпитоп белка ВИЧ-1 экспонированный на поверхности бактериофага М13ВОЬ2 будет доступен для взаимодействия с компонентами иммунной системы.

3.3.4. Электрофоретическая подвижность фагов

Другой косвенный показатель экспонированности заряженных аминокислот на поверхность фаговой частицы - скорость движения фаговых частиц под действием электрического поля. Электрофорез целых вирионов проводили в 2% агарозном геле при рН 9.5. Расчетное значение суммарных зарядов белков при рН 9.5 приведено в табл. 5.

Табллица ^

Суммарный заряд покровных белков рекомбинантных фагов

Название Изоэлектрическая суммарный заряд штамма_точка_белка при рН 9.5

М13шрЮ 9.49 0

М13В 9.49 0

М13В1 9.49 0

М13ВОМ1 7.1 -1

М13ВОМ2 9.49 0

М13ВОЫ 9.9 + 1

М13ВОЬ2 9.48 0

Лг На электрофореграмме

(рис. 27) верхняя полоса соот-^у т ветствует полноразмерному V .. • фагу. Можно видеть, что наиболее отрицательно заряженный фаг М13ВОМ1 движется в геле быстрее осталь-

—- ных, а фаг с наименьшим за-

Рис.27. Электрофорез целых вирионов в 2% рядом М13ВОЫ - медленнее

агарозном геле 1 -М13шр10, 3-М13В1, 5- М13ВОМ2, 7-Ы13ВОЬ2

2-М13В,

4 - М13ВОМ1,

6-М13ВОЫ,

всех (4 и 6 дорожки). Однако, несмотря на одинаковые заряды фагов М13шрЮ, М13В, М13В1, М13ВОМ2, М13ВОЬ2 (дорожки -1,2,3,5,7), некоторые из них обладают различной электрофоретической подвижностью.

Несмотря на это, данные электрофореза хорошо согласуются с расчи-танным зарядом гибридных белков. Это может быть полезным для первичной характеризации нитевидных бактериофагов со встройками в В-белкок чужеродных пептидов.

3.4.5. Влияние встроенных в состав гена В-белка чужеродных последовательностей на образование в популяции бактериофагов мини-частиц. Сравнение инфекционности гибридных фагов

Известно, что среди популяции нитевидных фагов, полученных в результате многих пассажей после исходного посева из одной бляшки, встречаются мини-частицы, длина которых варьирует от 0,2 до 0,5 длины исходного бактериофага (АгЬег, \yauters-Willems., 1970). Мини-фаги содержат соответствующие им по размеру ДНК и способны размножаться только при смешанном заражении с нормальным бактериофагом. При этом преимущественно воспроизводятся мини-частицы. Один из возможных механизмов первого появления мини-фагов - необычное протекание процесса репликации, в результате которого происходит преждевременное замыкание синтезируемого фрагмента ДНК в кольцо (Корнберг, 1977). В связи с вышесказанным важно было выяснить, как повлияли модификации в В-белке на процесс образования мини-фагов. Кроме того, определение доли полноразмерных фаговых частиц в популяциях гибридных фагов обеспечивало бы сравнительный анализ их инфекционности.

Для определения доли минифагов в популяции гибридных бактериофагов (выращенных в течение 12 час из отдельно взятых негативных колоний) проводили их очистку с помощью ультрацентрифугирования. Из по-лученых препаратов бактериофагов выделяли одноцепочечную ДНК, фракционировали ее в полиакриламидном геле и с помощью сканирования геля на "СЬготоБкап 400" определяли процентное содержание полноразмерной ДНК к ее общему количеству. Исходя из полученных результатов, судили о реальном содержании в каждом препарате полноразмерных частиц (табл. 6).

Можно видеть, что накопление в культуральной жидкости минифагов происходит гораздо быстрее в случае гибридных бактериофагов. Объяснить полученные результаты можно влиянием на репликацию ДНК гибридных бактериофагов встроенных в их геном олигонуклеотидов. Однако, нельзя отрицать и возможного влияния на этот процесс химерных В-бел-ков при проникновении гибридных бактериофагов в клетку. Данное предположение диктуется тем, что при инфекции бактериальных клеток освобождение фагового нуклеопротеида от белковой оболочки тесно связано с репликацией ДНК (Корнберг, 1977).

Таблица 6

Содержание полноразмерной ДНК в препаратах гибридных бактериофагов и их относительная инфекционность

Название Содержание полноразмер-

штамм ной ДНК в препарате (%)

Относительная * инфекционность вирионов (%)

М13тр10

М13В

М13В1

М13ВОМ1

М13ВОМ2

М13ВОЫ

М13ВОЬ2

100

100

94

22

18.5

47.8

24.5

100 ±15 114 + 30 ПО ±38

80 ± 17

81 ±30 127 ±36 33 ± 10

♦Расчет производили на I мг полноразмерного фага, доля которого в препаратах определялась, исходя из доли полноразмерной фаговой ДНК. За 100% считали инфекционность фага М13 тр 10

Изучение влияния изменений в В-белке на инфекционность гибридных бактериофагов показывает (табл. 6), что только в одном случае (М13ВОЬ2) встройка приводит к заметному снижению инфекционности, а у остальных фагов значительных изменений не наблюдается. Отмеченное снижение титра М13ВОЬ2 может быть результатом того, что более мелкие бляшки этого бактериофага не все визуально регистрируются. Таким образом, можно сделать заключение о незначительном влиянии на инфекционность бактериофага М13 чужеродных встроек в исследуемый рйон В-белка.

3.4.6. Исследования антигенных и иммуногенных свойств гибридных фагов

Для того, чтобы использовать векторы на основе нитчатых фагов для получения иммуногенных и антигенных частиц, необходимо, во-первых, быть уверенным, что район встройки фрагментов в В-белке доступен антителам и, во-вторых, знать, как изменения в этой области влияют на антигенные свойства фаговых частиц.

Чтобы выяснить это, гибридные бактериофаги М13ВОЬ2 и М13тр10 были использованы для иммунизации кроликов. Затем проводили имму-

ноферментный анализ с использованием антител против этих бактериофагов. Оказалось, что вирусный белок р 17 и его предшественник р55 взаимодействуют с антителами к фагу М13ВОЬ2 и не взаимодействуют с антителами к М13тр10 (рис. 28). Следовательно, бактериофаг М13ВОЬ2 может быть использован для получения поликлональной сыворотки, связывающейся с конкретным эпитопом ВИЧ-1, а сама сыворотка - в тестах по нейтрализации этого вируса.

®>160 8Р120

рб5 р55/р5Э

«Р41 РЭ1

р24

Р17

Рис. 28. Реактивность вирусных белков с исследуемыми иммуноглобулинами. А - обработка ВИЧ-1-положитель-ной сывороткой человека в разведении I : 100; Б-обработ-ка анти - М13шр10 сывороткой в разведении 1 : 100; В-об-работка анти - М13ВОЬ2 сывороткой в разведении 1 : 100

А Б В

В дальнейшем мы исследовали антигенность фагов, иммобилизованных на нитроцеллюлозных фильтрах. К сожалению, оказалось, что все проверенные сыворотки, как ВИЧ-положительные, так и ВИЧ-отрицательные, реагируют со всеми фаговыми штаммами. Вероятно, это обусловлено взаимодействием антител с белком рШ, что согласуется с данными других авторов (Tsunetsugu-Yokota et al., 1991).

Следует отметить, что для хорошего иммунного ответа оказалось достаточно части антигенной детерминанты. Это не было неожиданным для нас и соответствует результатам, полученным другими авторами, в исследованиях которых было показано, что для эффективного связывания с антителами достаточно трех аминокислотных остатков (Scott & Smith., 1990; Felici et al., 1991).

Таким образом, мы выяснили не только принципиальную возможность экспонирования чужеродных пептидов на поверхности нитчатого фага с помощью основного белка оболочки, но и получили рекомбинант-ный бактериофаг, экспонирующий вирусный эпитоп. Позднее другие авторы показали, что подобные гибридные бактериофаги вызывают сильный иммунный ответ у животных даже без использования адьюванта (Willis et al., 1993). Все это свидетельствует о перспективности исследований по созданию на основе вирионов нитевидных бактериофагов вакцин против различных инфекционных агентов.

55

ВЫВОДЫ

1. Обоснована и впервые подтверждена экспериментально возможность использования основного белка оболочки нитевидных бактериофагов для задач фагового дисплея. В рамках исследования:

а) сконструирована серия векторов, обеспечивающая встройку чужеродных фрагментов ДНК в состав гена VIII, кодирующего основной белок оболочки нитевидных бактериофагов;

б) впервые показана возможность получения жизнеспособных частиц нитевидных бактериофагов со встройкой в N-конец основного белка оболочки чужеродных пентапептидов. При этом чужеродный пептид экспонирован на поверхности вириона более чем, 3000 раз. Установлено, что данные встройки существенно не сказываются на инфекционности бактериофага М13, а модифицированный В-белок успешно участвует в сборке частиц гибридных бактериофагов. Выявлено влияние введенных в ген В-белка модификаций на выход мини-частиц в популяциях гибридных бактериофагов;

в) обнаружен вариант фага М13 с измененным местом процессинга В-белка лидерной пептидазой Е. coli. Предложена гипотеза влияния встроенных аминокислот на точность процессинга за счет изменения вторичной структуры предшественника, удовлетворительно объясняющая полученные экспериментальные результаты и способствующая пониманию механизма процессинга и действия сигнальной пептидазы;

г) обнаружено, что встройки чужеродных пептидов в N-концевой район В-белка бактериофага MI3 не влияют на его взаимодействие с С-концевым участком ДНК бактериофага и на коэффициент упаковки ДНК в вирионе.

2. Впервые продемонстрирована возможность получения фаговых частиц, способных обеспечить специфический иммунный ответ на встроенный в основной белок оболочки чужеродный вирусный эпитоп. Это создает предпосылки к использованию нитевидных бактериофагов для создания компонентов искусственных вакцин, селекции пептидных лигандов и для диагностических целей.

3. Проведено сравнительное изучение экспрессии синтетического гена а2-интерферона, находящегося в составе плазмидного и фагового векторов. В ходе проведения данной работы:

а) охарактеризовано 5 промоторных фрагментов из различных микро-

организмов - два ранних промотора А2 и В фага Т7, промоторы 1ас-опе-рона Е. coli и гена TRP1 Saccharomyces cerevisiae, ранний промотор фага SP02 Bacillus subtilis. Показано, что наибольшей эффективностью обладает промотор SP02 и что тандем, как идентичных, так и гетерологичных промоторов приводит к увеличению экспрессии клонированного гена в 2-3 раза. При этом вклад каждого из них в данный процесс приблизительно одинаков;

б) показано, что введение структурного гена интерферона в векторный фаг М13шр8 при использовании одного и того же генетического элемента инициации трансляции позволяет в сравнении с плазмидой pBR327, на порядок повысить продукцию а2-интерферона человека в клетках Е. coli.

4. Сконструирован бактерифаг М13ро1Т7 способный обеспечить продукцию РНК-полимеразы бактериофага Т7 клетками Е. coli. Определены условия культивирования инфицированных бактерий полученным фагом для достижения высокоэффективного (до 30 % общего белка клетки) синтеза целевого продукта.

5. Впервые предложен и экспериментально обоснован подход к экспрессии клонированных генов, основанный на раздельном введении в бактериальную клетку целевого гена (находящегося в составе плазмидного вектора под контролем позднего промотора бактериофага Т7) и гена РНК-полимеразы Т7, находящегося в составе бактериофага М13. В рамках исследования:

а) осуществлено молекулярное клонирование кДНК al-антитрипсина человека и определена ее нуклеотидная последовательность. Установлено, что синтезированный фрагмент ДНК кодирует наиболее распространенный Ml-аллель гена ААТ и отличается от опубликованных нуклеотидны-ми заменами, не приводящими к изменениям аминокислотной последовательности. Сконструирован штамм-продуцент соответствующего белка;

б) получены штаммы-продуценты иммуногенно значимых фрагментов белка Е2 вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей; выявлено, что уровнь продукции клетками Е. coli фрагментов белка Е2 существенно снижается от наличия в исследуемых полипептидах гидрофобных и положительно заряженных аминокислотных кластеров;

в) путем сравнения антигенных структур белка Е2 вируса ВЭЛ, штамм Trinidad donkey, и рекомбинантного фрагмента 1-170 подтверждена локализация антигенной детерминанты Е2-6 в белке Е-2.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ильичев А.А., Беликов С.И., Пугачев В.Г., Тимофеев И.В., Зорин В.В., Попов С.Г., Щелкунов С.Н., Сандахчиев Л.С. Конструирование ре-комбинантной плазмиды, обеспечивающей подбор оптимального промотора для гена интерферона а2 человека // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. - 1986,- N7.- С.23-26.

2. Ильичев А.А., Миненкова О.О., Беликов С.И., Тимофеев И.В., Пугачев В.Г., Каргинов В.А., Попов С.Г., Щелкунов С.Н., Зорин В.В., Сандахчиев Л.С. Экспрессия искусственного гена лейкоцитарного интерферо-на-а2 человека, клонированного в фаге MI3mp8 // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. - 1986. - N8. -С. 19-23.

3. Ильичев А.А., Тикунова Н.В., Серпинский О.И., Тимофеев И.В., Щелкунов С.Н. Влияние дупликации промоторов в искусственном гене интерферона на уровень его экспрессии // Генетика.- 1987,- Т.23. - N2. - С. 197201.

4. Щелкунов С.Н., Ильичев А.А. Изучение экспрессии искусственного гена интерферона человека в клетках Escherichia coii II Биотехнология. -1988. - Т.4. - N6. - С.706-713.

5. Ильичев А.А., Меламед Н.В., Закабунин А.И., Петренко В.А., За-гребельный С.Н. Векторная система для экспрессии генов, основанная на использовании РНК-полимеразы бактериофага Т7 // Докл. АН СССР. -

1988. - Т.303. - N1,- С.496-498.

6. Щелкунов С.Н., Ильичев А.А. Оптимизация транскрипции искусственного гена интерферона в клетках Escherichia coli // Микробиологические исследования в Западной Сибири. Сборник научных трудов. - Новосибирск: "Наука" Сибирское отделение. - 1989.- С.5-8.

7. Щелкунов С.Н., Миненкова О.О., Ильичев А.А. Создание гибридных фагов М13, направляющих синтез интерферона человека в клетках Escherichia coli // Микробиологические исследования в Западной Сибири. Сборник научных трудов. - Новосибирск: " Наука" Сибирское отделение. -

1989.-С.8-11.

8. Ильичев А.А., Миненкова О.О., Татьков С.И., Карпышев Н.Н., Ерошкин A.M., Петренко В.А., Сандахчиев Л.С. Получение жизнеспособного варианта фага М13 со встроенным чужеродным пептидом в основной белок оболочки //Докл. АН СССР.- 1989. -Т.307. -N2. -С.481-483.

9. Ильичев А.А., Миненкова О.О., Татьков С.И., Карпышев Н.Н., Ерошкин A.M., Офицеров В.И., Акименко З.А., Петренко В.А., Сандахчи-ев JI.C. Использование нитчатого бактериофага М13 для белковой инженерии// Мол. биология. - 1990,- Т.24. - Вып.2. - С.530-535.

10. Кищенко Г.П., Миненкова О.О., Ильичев А.А., Груздев А.Д., Пет-ренкоВ.А. Изучение структуры вирионов фага М13, содержащих молекулы химерных В-белков II Мол. биология. - 1991. -Т.25. - Вып.6. - С. 1497-1503.

11. Petrenko V.A., Ilyichev А.А., Minenkova О.О., Tatkov S.I., Kishchenko G.P. Study of M13 bacteriophage as possible carrier of infective agent antigen epitopes // Proseeding of the Seventh International symposium on metabolism and enzymology of nucleic acids including gene and protein engineering. - Bratislava. - 1991. - P.97-103.

12. Тикунова H.B., Головин С.Я., Микрюков H.H., Хрипин Ю.Л., Черненко В.Ю., Иванов В.Г., Ильичев А.А., Петренко В.А. Синтез, клонирование и определение первичной структуры кДНК а 1-антитрипсина человека // Биоорган, химия. - 1991. - Т.17. - С.1694-1697.

13. Ilyichev А.А., Minenkova О.О., Kishenko G.P., Tat'kov S.I., Karpishev N.N., Eroshkin A.M., Ofitzerov V.I., Akimenko Z.A., Petrenko V.A. and Sandakhchiev L.S. Inserting foreing peptides into the major coat protein of bacteriophage M13 // FEBS Letters. - 1992. - V.301. - N3. - P.322-324.

14. Ильичев A.A., Тикунова H.B., Головин С.Я., Меламед Н.В., Хрипин Ю.Л., Вязовая Е.А., Петренко В.А., Сандахчиев Л.С. Применение "бинарной" системы экспрессии для продукции а-1-антитрипсина человека в клетках E.coli //Докл. РАН. - 1992. - Т.326. - N.4. - С.735-737.

15. Миненкова О.О., Ильичев А.А., Кищенко Г.П., Ильичева Т.Н., Хрипин Ю.Л., Орешкова С.Ф., Петренко В.А. Получение специфического иммуногена на основе бактериофага М13.//Молекул. биол,- 1993. -Т.27. Вып. З.-С.561-568.

16. Minenkova О.О., Ilyithev А.А., Kishenko G.P., Petrenko V.A. Design of specific immunogens using filamentous phage as the carier // Gene. -1993.-V.128. -P.85-88.

17. Ерошкин A.M., Миненкова O.O., Фомин В.И., Иванисенко B.A., Ильичев А.А. Анализ встроек пептидных фрагментов в основной белок оболочки бактериофагов М13, fl и fd. Взаимосвязь структурных характеристик белка оболочки и жизнеспособности мутантных фагов // Мол. биология. -1993.1.21. Вып.6. -С. 1345-1355.

18. Ильичев A.A., Меламед Н.В., Долгова И.Н., Хомов В.В., Сизов A.A., Петренко В.А. Использование бактериофага М13 для получения ре-комбинантных белков. Рекомбинантная ДНК фага М13ро1Т7, содержащая ген РНК-полимеразы фага Т7. Штамм E.coli DH5aF', инфицированный фагом М13ро1Т7 - продуцент РНК - полимеразы фага Т7 // Заявка на патент Российской Федерации. - 1994,- N 94014602.

19. Ильичев A.A., Меламед Н.В., Разумов И.А., Максютов А.З., Перебоев A.B., Закабунин А.И., Локтев В.Б. Изучение экспрессии фрагментов гена белка Е2 вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей в системе, основанной на РНК-полимеразе фага Т7 // Мол. биология. - 1995. В печати.

20. Loktev V.B., Il'ichev A.A., Eroshkin A.M., Karpenko L.I., Pokrovsky A.G., Pereboev A.V., Svyatchenko V.A., Ignat'ev G.M., Smolina M.I., Melamed N.V., Lebedeva C.D. and Sandakhchiev L.S. Design of molekular im-munogenes as components of a new generation of molecular vaccines. // J. Biotechnology. - 1995. In press.

21. Ильичев A.A., Миненкова O.O., Зорин В.В., Щелкунов С.Н. Конструирование гибридных фагов М13, направляющих синтез лейкоцитарного интерферона человека в клетках E.coli // Новые направления биотехнологии: Тез. докл. Всесоюзной конференции. - Пущино. - 1984. - С.37-38.

22. Ильичев A.A., Миненкова О.О., Щелкунов С.С. Клонирование гена а2-интерферона человека в составе векторного фага М13. // Гибридные плазмиды и экспрессия плазмидных генов: Тез. докл. Всесоюзн. совещ. по программе "Плазмида". - М. - 1984. - С.35-36.

23. Ильичев A.A., Тикунова Н.В., Беликов С.И., Пугачев В.Г., Тимофеев И.В., Щелкунов С.Н. Изучение экспрессии в клетках Escherichia coli гена а2-интерферона под контролем различных промоторов // Гибридные плазмиды и экспрессия плазмидных генов: Тез. докл. Всесоюзн.совещ. по программе "Плазмида". - М. - 1984,- С.36-37.

24. Ильичев A.A., Миненкова О.О. Оптимизация экспрессии в клетках E.coli гена интерферона-а2 человека II Достижения микробиологии - практике: Тез. 7-го съезда Всесоюзн. микробиол. общества 1985 г. - Алма-Ата. -1985.-T.3-C.32.

25. Ильичев A.A., Рязанкин И.А.. Беликов С.И., Попов С.Г., Щелкунов С.Н., Ямщиков В.Ф., Зорин В.В. Оптимизация продукции лейкоцитарного интерферона человека в клетках E.coli // Интерферон-85: Материалы

Всесоюзн, конф. "Итоги и перспективы теоретических и практических клинических исследований по проблеме интерферона",- Тбилиси.- 1985.-С.133.

26. Ильичев A.A., Щелкунов С.Н. Исследование экспрессии в E.coli химерного оперона // Проблемы переноса генетической информации: Тез. докл. Всесоюзн. симпоз. - М. - 1985. - С.76-77.

27. Тикунова Н.В., Ильичев A.A., Тимофеев И.В., Щелкунов С.Н. Влияние дупликации промоторов в искусственном гене интерферона на уровень его экспрессии // Проблемы переноса генетической информации: Тез. докл. Всесоюзн. симпоз. - М. - 1985. - С. 169.

28. Ильичев A.A., Щелкунов С.Н., Красных В.Н., Болдырев А.И., Тимофеев И.В., Жук Е.В. Экспрессия в E.coli гена лейкоцитарного интерферона, направляемая регуляторными элементами гена а-амилазы Bacillus amiloliquefaciens // Проблемы переноса генетической информации: Тез. докл. Всесоюзн. симпоз. - М. - 1985. - 183-184.

29. Ильичев A.A., Миненкова О.О., Татьков С.И., Карпышев H.H., Ерошкин A.M., Петренко В.А. Использование нитчатого бактериофага М13 для целей белковой инженерии И Новые направления биотехнологии: Всесоюзн. конф.: Тез. докл. - Пущино - 1988. -С.97-98.

30. Миненкова О.О., Татьков С.И., Карпышев H.H., Ерошкин A.M., Ильичев A.A., Петренко В.А. Получение и анализ нового вектора на основе фага М13 для клонирования и экспрессии антигенных детерминант // Актуальные проблемы биотехнологии: Материалы 1-ой отр. конф,-конкурса мол. ученых НПО "Вектор", ВНИИ МБ. - М. - 1989.- С.6-1.

31. Головин С.Я., Микрюков H.H., Пузырев А.Т., Тикунова Н.В., Романов В.П., Ильичев A.A., Петренко В.А. Конструирование плазмид pMgl и pMg2 и их использование при построении и анализе библиотек кДНК II Геном человека-90: 1-я Всесоюзн. конф. Тез. докл. - М. - 1990. - С.64.

32. Тикунова Н.В., Головин С.Я., Ильичев A.A., Петренко В.А., Гри-шаева О.Н., Косова Е.Ю., ЧерненкоВ.Ю., Полишук JI.A. Структурно-функциональный анализ локуса PI (al-ингибитора протеаз человека) П Геном человека-90: 1-я Всесоюзн. конф. Тез.докл. - М. - 1990. - С.183-184.

33. Petrenko V.A., Ilyichev A.A., Kipriyanov S.M. Design of gene engineered proteins as components of diagnostic test systems // Symposium on bioanalytical methods: Abstr. book. - Prague. - 1990. - P.105-106.

34. Меламед H.B., Ильичев A.A., Закабунин А.И., Коржов В.А., Локтев В.Б., Разумов И.А., Нетесов C.B., Петренко В.А. Получение иммуно-

геннозначимых фрагментов белка Е2 вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей // Новые направления биотехнологии: Всесоюзн. конф. Тез. докл. - Пущино. - 1990. - С.64-65.

35. Миненкова О.О., Кищенко Г.П., Ильичев А.А., Хрипин Ю.Л., Петренко В.А. Требования к алеинокислотной последовательности антигенных детерминант, встраиваемых в В-белок фага М13 // Новые направления биотехнологии: Всесоюзн. конф. Тез. докл. - Пущино. - 1990. - С.65.

36. Minenkova О.О., Kishchenko G.P.,Ilyichev A.,A., Khripin Yu.L., Petrenco V.A. A study of M13 bacteriophage as a possible carrier of antigenic determinants // Medical biotechnology immunization & AIDS: Intern, conf. -Leningrad. -1991.-P. 168.

37. Тикунова H.B., Головин С.Я., Черненко В.Ю., Ильичев А.А. Исследование тканеспецифицеской экспрессии гена а 1-антитрипсина (AT) человека в гепатоцитах и клетках макрофагального ряда. // Геном человека - 91: 2-я Всесоюзн. конф. Тез. докл. - М. - 1991. С. 187.

38. Тикунова Н.В., Головин С.Я., Меламед Н.В., Хрипин Ю.Л., Вязовая Е.А., Микрюков Н.Н., Петренко В.А., Ильичев А.А. Высокоэффективная экспрессия гена альфа!-антитрипсина человека в клетках E.coli // Новые направления биотехнологии: V конф. Российской Федерации. Тез. докл. - Пущино. - 1992. - С.44.

39. Миненкова О.О., Ильичев А.А., Петренко В.А., Ильичева Т.Н., Орешкова С.Ф., Хрипин Ю.Л. Рекомбинантные субъединичные вакцины могут быть получены на основе нитчатого бактериофага М13 // Новые направления биотехнологии: V конф. Российской Федерации. Тез. докл. -Пущино. - 1992. -С.65.

40. Тикунова Н.В., Закабунин А.И., Ильичев А.А., Татьков С.И. Ре-комбинантный альфа-1 антитрипсин - потенциальное противошоковое средство // Актуальные вопросы современной медицины: Тез. докл. Четвертой научно - практической конференции врачей. - Новосибирск. - 1994. -С.231 - 232

41. Ильичев А.А., Долгова И.Н., Меламед Н.В. Использование бактериофага М13 для получения рекомбинантных белков // Новые направления биотехнологии: VI конф. Российской Федерации. Тез. докл. - Пущино. -1994. - С.79.

42. Корепанова А.В., Кувшинов В.Н., Туманова О.Ю.,Ильичев А.А. Новая векторная система для экспонирования протяжённых полипептидов

на поверхности фага М13 // Новые направления биотехнологии: VI конф. Российской Федерации. Тез. докл. - Пущино. - 1994. - С.78.

43. Ильичев A.A. Нитчатый бактериофаг М13 как носитель чужеродных эпитопов // Новые направления биотехнологии: VI конф. Российской Федерации. Тез. докл. - Пущино. - 1994. - С.78.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Агапов Е.В., Лебедева С.Д., Разумов И.А., Фролов И.В., Колыхалов A.A., Локтев В.Б., Нетесов C.B., Сандахчиев Л.С.// Докл. АН СССР. 1991. Т. 320. С. 1485-1488.

2. Ерошкин A.M., Фомин В.И., Жилкин П.А., Куличков В. А. .// Мол. биология. 1990. Т. 24. С. 638-648.

3. Колосов H.H., Сандахчиев Л.С., Коробко В.Г. и др. // A.c. 1092176 С12 N15/00 (СССР). - Открытия, 1984, N18, с. 63.

4. Корнберг А. Синтез ДНК.М. Мир. 1977. С. 227-247.

5. Коробко В.Г., Добрынин В.Р., Нгуеа Куанг Винь., Подладчикова О.Н., Северцева И.В., Быстрое P.C., Болдырева Е.Ф., Чувпило С.А., Колосов М.Н. // Биоорган, химия. 1983. Т. 9, С. 1285-1289.

6. Кравченко В.В., Серпинский О.И., Плетнев А .Г.// Мол. биология. 1984. Т. 18. С.397-403.

7.Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д.Ж. // Методы генетической инженерии. М. Мир. 1984. С. 9-386.

8. Машко C.B., Лапидус А.Л., Трухан М.В., Лебедева М.И., Подковыров С.М., Кашлев М.В., Мочульский A.B., Еремашвили М.Р., Изотова P.C., Стронгин А.Я., Скворцова М.А., Стеркин В.Э., Лебедев А.Н., Ребен-тишБ.А., Козлов Ю.И., Монастырская Г.С., Царев С.А., Свердлов Е.Д., Дебабов В. Г.// Мол. биология. 1987. Т. 21. С. 1297-1309.

9. Микрюков H.H., Головин С.Я., Тикунова Н.В., Пузырев А.Т., Романов В.П., Ильичев A.A., Петренко В.А.// I Всесоюзная конференция "Геном человека". Переславль-Залесский. 1990. Сборник тезисов.

10. Миллер Дж. // Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир. 1976. С. 324-327.

11. Овчинников Ю.А., Свердлов Е.Д., Царев С.А., Ходкова Е.М., Монастырская Г.С., Соломатина И.С., Ефимов В.А., Чахмачева О.Г., Соло-

вев В.Д., Кузнецов В.П., Жданов В.М., Новохатский A.C., Аспетов Р.Д. II Докл. АН СССР. 1982. Т. 265. С. 236-242.

12. Разумов И.А., Агапов Е.В., Перебоев A.B., Протопопова Е.В., Лебедева С.Д., Локтев В.Б. // Вопр. вирусологии. 1991. Т. 36. С. 34-37.

13. Святченко В.А., Перебоев A.B., Агапов Е.В., Разумов И.А., Сабиров А.Н., Мизенко Г.А., Самуков В.В.,Локтев В.Б.// Вопр. вирусологии. 1993. Т. 38. С. 162-167.

14. Серпинский О.И., Каргинова Е.А., Микрюков H.H., Кравченко В.В., Зайчиков Е.Ф., Максимова Т.Г., Аникенко А.И., Плетнев А.Г., Митина Ю.Л. II Биоорган, химия. 1982. Т. 8. С. 840-843.

15. Тикунова Н.В. // Автореф. дис. канд. биол. наук. Новосибирск. Изд-во ВНИИ МБ. 1993. 22с.

16. Щекунов С. Н. // Генетическая инженерия. Издательство Новосибирского государственного университета. 1994. С. 186-195.

17. Axelrocl V.D. and Kramer F.R. // Biochemistry. 1985. V.24. P. 57165723.

18. Agapov E.V., Razumov I.A., Frolov I.V., Kolykhalov A.A., Netesov S.V., LoktevV.B.//Arch. Virology. 1994. V. 139 P. 173-181

19. Barbas S.M., BarbasC.F. // Fibrinolysys. 1994. V. 8. P. 245-252.

20. Bayer R., Feigenson G.W. II Biochim. Biophys. Acta. 1985. P. 369-379.

21. Cesareni G. // FEBS Lett. 1992. V. 307. P. 66-70.

22. Compton J. //Nature. 1991. V. 350. P. 91-92.

23. Courtney M., Buchwalder A., Tessier L., Jave M., Benavente A., Balland A., Kohli V., Lathe R., Tolstoshev P., Lecocq J. II Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1984. V. 81. P. 669-673.

24. Denhardt D.T., Dressler D., Ray D.S.//In: The singlestrandded DNA phages. Cold Spring Harbor. 1974. N.4.

25. Dwarakanath P., Visweswariah S.S., Subrahmanyam Y.V., Shanthi G., Jagannatha H.M., Balganesh T.S. // Gene. 1989. V. 81. P.219-226.

26. Felici F., Castagnoli L., Musacchio A., Jappelli R and Cesareni G. II J.Mol. Biol. 1991. V. 222. P. 301-310.

27. Gamier J., Osguthorpe D.J and Robson B.//J. Mol. Biol. 1978. V. 120. P. 97-120.

28. Golomb H., Chamberlin M. // J. biol. Chem. 1974. V. 249. P. 28582863.

29. Goeddel D.V., Hegneker H.L., Horumi T., Arentzen R., Itakura K., Ynsura D.G., Ross M.J., Miozarri G.,Seeburg P.H. // Nature. 1979. V. 281. P. 544-548.

30. Goeddel D.V., Shepard M.H., Yelverton E., Leung D., Crea R. // Nucl. Acids. Res. 1980. V. 8. P. 4057-4074.

31. Hoess R.H. // Current opinion in structural biology. 1993. V. 3. P. 572579.

32. Hunt A.R., Johnson A.J. and Roehrig J.T. // Virology. 1990. V. 179. P. 701-711.

33. Hunt A.R., Short W.A., Johnson A.J., Bolin R.A., Roehrig J.T. // Virology. 1991. V. 185. P. 281-290.

34. Insley M., Kawasaki G. // Pat.4711848 USA. Publ.08.12.87.

35.Johansen H., Sutiphong J., Sathe G., Jacobs P., Cravador A., Bollen A., Rosenberg M., Shatzman A. // Mol. Med. Biol. 1987. V. 4. P. 291-305.

36. Kalsheker N. // Bioscience Reports. 1989. V. 9. P. 129-138.

37. Kingsman S.H. and Kingsman A.J. // Interferons. Cambridge. 1983. P. 211.

38. Kinney R.M., Johnson B.J.B., Brown V.L. and Trent D.W. // Virology. 1986. V. 152. P. 400-413.

39. Kuhn A., Zhy H.Y. and Dalbey R.E. // EMBO J. 1990. V. 9. P. 29852989.

40. Lerner T.S. and Model P.// Virology. 1981. V. 115. P. 282-295.

41. Long G.L., Chandra T., Woo S.L.S., Davie E.W. and Kurachi K. // Biochemistry. 1984. V. 23. P. 4828-4837.

42. Marvin D.A. //Int. J. Biol. Macromol. 1990. V. 12. P. 125-138.

43. Makowski L. and Caspar D.L.D.// J. Mol. Biol. 1981. V. 145. P. 611617.

44. Maksyutov A.Z., Zagrebel'naya E.S. // Computer Applic. in the Biosciences. 1993. V. 9. P. 291-297.

45. Messing J. // Recombinant DNA Tech. Bull. 1979. V.2. P. 43-63.

46. Mizuno T., Chou M.Y. and Inouye M. A. // J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 6932-6940.

47. Model P. and Russel M. // In: Calendar R.(Ed.). The Bacteriophage, V. 2. Plenum, N.Y. 1988. P. 375-456.

48. Papsidero L. D., Sheu M. and Ruscetti F. W. // J. Virology. 1989. V. 63. P. 267-272.

49. Scott J.K. and Smith G.P. // Science. 1990. V. 249. P. 386-379.

50. Smith G.P. // Sciense. 1985. V. 228. P. 1315-1317.

51. Smith G.P. and Scott J.K. // Meth. Enzimol. V. 217. P. 228-257.

52. Studier F.W., Moffatt B.A. HL Mol. Biol. 1986. V.169. P. 113-130.

53. Sutiphong J., Johansen H., Sathe G., Rosenberg M., Shatzman A. // Mol. Med. Biol. 1987. V. 4. P. 307-322.

54. Szewczak A.A., White S.A., Gewirth D.T., MooreP.B. // Nucl. Acids Res. V. 18. P. 4139-4142.

55. Razumov I.A., Agapov E.V., Pereboev A.V., Protopopova E.V., Lebedeva S.D., Loktev V.B. // Biomed-Sci. 1991. V. 2. P. 615-622.

56. Reddehase HJ., Rothbord J.B., Koszinowski V.H. // Nature. 1989. V. 387. P. 651-653.

57. Reyes V.M. and Abelson J. // Analytical Biochemistry. 1987. V. 166. P. 90-106.

58. Rosenberg A.H., Lade B.N, Chui D.S., Lin S.W., Dunn J.J. and Studier F. W. // Gene. 1987. V.56. P. 125-135.

59. Rüssel M. and Model P. //J. Virol. 1989. V. 63. P. 3284-3295.

60. Tabor S., Richardson C.C. II Proc. natl. Acad. Sei. USA. 1985. V. 82. P. 1074-1078.

61. Tabor S., Richardson C.C. // Proc. natl. Acad. Sei. USA. 1986. V. 83. P. 3614-3618.

62. Travis J., Owen M., George P., Carrell R., Rosenberg S., Hallewell R.A. and Barr Ph.J. Hi. Biol. Cell. 1985. V. 260. P. 4384-4389.

63. Tshumper G., Carbon J. // Gene. 1980. V. 10. P. 157-166.

64. Tsunetsugu-Yokota Y., Tatsumi M., Robert V., Devaux Ch., Spire B.,Cherman J and Hirsch I. //Gene. V. 99. P. 261-265.

65. Ullrich A., Shine J., Chirgwin J., Pictet R., Tischer E., Rutter W.J., Goodman H.//Science. 1977. V.196. P. 1313-1318.

66. Wewers M., Casolaro M., Sellers S., Swayse S., McPhaul K., Wittes J. and Crystal R.G. //N. Engl. J. Med. 1987. V. 316. P. 1055-1062.

67. Williams D.M., Duvall E.J., Lovett P.S. II J. Bacteriol. 1981. V. 146. P. 1162-1165.

68. Willis A.E., Perham R.N and Wraith D. // Gene. 1993. V. 128. P. 79-83.

69. Yanisch-PerronC., Viera J., Messing J.//Gene. 1985. V. 33. P. 103-108.